CN115466411B - 一种双硫键交联透明质酸水凝胶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双硫键交联透明质酸水凝胶的制备方法，包括透明质酸巯基化改性和双硫键交联透明质酸水凝胶合成两个步骤，其中，透明质酸巯基化改性包括三个反应阶段，第一反应阶段中，反应物和活化剂反应的pH值保持4.5‑5.0；第二反应阶段中，将反应体系的pH值调整至5.5‑6.5范围内，继续反应；第三反应阶段是将二硫键还原为自由巯基，最后纯化得到半胱胺修饰巯基化透明质酸衍生物。本发明胱胺与透明质酸侧链羧基偶联反应效率高，巯基化改性度高，有利于后续进一步交联形成双硫键交联透明质酸水凝胶，且本发明工艺简便，几乎无有机溶剂使用，安全性好，其制备的双硫键交联透明质酸水凝胶在医学中有良好的应用前景。

Description

一种双硫键交联透明质酸水凝胶的制备方法

技术领域

本发明涉及透明质酸水凝胶领域，特别涉及一种双硫键交联透明质酸水凝胶的制备方法。

背景技术

水凝胶是指能够在水中发生溶胀并能保持大量水分而又不会溶解的亲水交联三维聚合物网络，水凝胶是一类理想的生物材料，通过简单的改性，可以得到与天然细胞外基质类似且令人满意的物理和化学性质，其对于氧气、营养物质、细胞代谢和水溶性金属离子表现出良好的通透性。

透明质酸(Hyaluronic Acid，简称HA)，又名“玻璃酸”，广泛分布于动物和人体的细胞外基质中，是细胞基质和多种组织的重要组成成分，具有多种重要的生理学功能，例如：调节细胞增殖、迁移和分化，具有天然的保湿作用，润滑关节保护软骨，调节蛋白质合成，调节炎症反应，调节免疫功能，促进伤口愈合等。透明质酸以其独特的黏弹性、生物相容性和可降解性使其在生物医学领域有广泛的应用。然而，透明质酸在体内易被降解吸收，滞留时间较短，限制了其在生物医学领域的应用（Brown等，Exp Physiol 1991,76:125-134；Johns等，Fertil Steril 1997, 68:37-42）。

对透明质酸进行化学改性及交联形成透明质酸水凝胶，既能够赋予其更为优良的机械强度、流变学特性及抗酶解能力等，还能够有效克服透明质酸易被降解吸收及滞留时间短的缺点，可有效扩展透明质酸在生物医药领域的应用。由巯基化透明质酸衍生物为原料通过交联反应制备透明质酸水凝胶是一种重要的透明质酸水凝胶的制备方式，例如，巯基化透明质酸衍生物可以在氧气的作用下形成原位交联水凝胶，而无需交联剂，其生物相容性更好（Shu等，Biomacromolecules 2002, 3:1304-1311）；再如，巯基化透明质酸衍生物还可以与聚乙二醇二丙烯酸酯等生物相容交联剂实现快速原位交联，无反应杂质，可用于细胞的原位包埋，在组织再生修复领域具有重要前景（Shu等，Biomaterials 2004, 25:1339-1348）。

然而，巯基化透明质酸的制备依然存在一些需要解决的技术问题。例如，在先专利申请CN103910886A公开了一种半胱氨酸功能化的透明质酸结合物及其合成方法以及在可注射原位形成的水凝胶中的应用，该在先专利申请公开的合成方法是通过修饰透明质酸的羟基，得到具有稳定醚键的半胱氨酸功能化的透明质酸结合物，但其制备方法存在反应过程复杂、反应路线长、使用大量有机溶剂作为助剂等不足；再如，在先专利申请CN112842929A亦公开了一种巯基化透明质酸及其制备方法和应用，巯基化透明质酸是由透明质酸或其盐羟基位点的巯基化改性而得，在反应过程中使用了四丁基氢氧化铵、二甲基吡啶、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、二甲基亚砜等助剂，同样存在反应过程复杂、反应路线长、使用大量有机溶剂作为助剂等不足。

透明质酸钠的羧基可在水性条件下被1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)-碳化二亚胺盐酸盐（EDCI）催化，形成O-乙酰基异脲中间体，然后该O-乙酰基异脲中间体再与含有自由巯基的氨基试剂进行偶联反应，得到具有酰胺键连接结构（氨基修饰）的巯基化透明质酸衍生物；该制备方法具有反应路线短、反应过程简单、无需使用有机溶剂等优点。但是O－乙酰基异脲中间体易于水反应发生快速重排形成更稳定的N-乙酰基脲副产物，该N-乙酰基脲副产物不能继续与含有自由巯基的氨基试剂进行偶联反应，影响了终产物的合成效果，为了避免该重排反应的发生，通常需要加入活化剂以形成稳定的抗水解活性中间体，之后该抗水解活性中间体再与氨基进行偶联反应形成酰胺键，得到具有酰胺键连接结构（氨基修饰）的巯基化透明质酸衍生物，常用的活化剂包括N－琥珀酰亚胺（NHS）、N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo NHS）或羟基苯并三唑（HOBt）。Ding等（Acta Biomaterialia 2012, 8:3643-3651）公开了使用半胱胺盐来修饰合成巯基化透明质酸衍生物，在先专利申请CN101367884A、CN104892962A、CN109432496A、CN113185716A等亦公开了半胱胺、半胱氨酸等修饰合成的巯基化透明质酸衍生物，然而，该些已公开的方法中，均采用了含有自由巯基的氨基试剂来修改透明质酸的羧基，整个反应过程中对巯基基团无任何保护措施，而自由巯基亦可以与透明质酸的羧基发生EDCl催化偶联反应，因此，该些方法所得的终产物实际为巯基偶联和氨基偶联修饰的透明质酸混合物。Lee等（Journal of Controlled Release 2007, 119:245-252）公开了采用含有二硫键的氨基试剂作为反应物，可实现反应体系中仅有氨基偶联反应，氨基偶联反应结束后，再将二硫键还原为自由巯基即可；胱胺（Cystamine）是目前最常用的含有二硫键的氨基试剂，其来源广泛、价格便宜且毒性小。

EDCI催化活化羧基反应的适宜pH为弱酸性，而氨基具有较高的pKa（通常为8-11），在此弱酸性条件下，质子化的氨基亲核性降低，其与活化羧基的偶联反应活性也降低，导致胱胺与透明质酸侧链羧基偶联反应的效率也很低，进而影响其进一步合成双硫键交联透明质酸水凝胶。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种双硫键交联透明质酸水凝胶的制备方法，其制备过程中，胱胺与透明质酸侧链羧基偶联反应的效率高，巯基化改性度高，交联形成透明质酸水凝胶的效果更好，且工艺简便、反应效率高、试剂用量少、安全性好。

为解决上述技术问题，本发明提供的双硫键交联透明质酸水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

步骤S1，透明质酸巯基化改性，其包括如下反应阶段：

第一反应阶段：将反应物和活化剂溶于水中，调节pH值至4.5-5.0范围内，之后加入催化剂，保持pH值不变，反应一段时间；所述反应物包括透明质酸钠和胱胺，所述催化剂为1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)-碳化二亚胺盐酸盐；该反应阶段的主要目的是生成抗水解活性中间体；

第二反应阶段：将第一反应阶段产物的pH值调整至5.5-6.5范围内，继续反应一段时间；该反应阶段的主要目的是抗水解活性中间体与胱胺的自由氨基偶联反应生成胱胺修饰的透明质酸中间产物；

第三反应阶段：在第二反应阶段的产物中加入还原剂，将二硫键还原为自由巯基，最后纯化得到半胱胺修饰巯基化透明质酸衍生物；该反应阶段的主要目的是将胱胺修饰的透明质酸中间产物还原为半胱胺修饰巯基化透明质酸衍生物并将其纯化；

步骤S2，将步骤S1得到的半胱胺修饰巯基化透明质酸衍生物的溶液在氧化剂的氧化交联下得到双硫键交联透明质酸水凝胶。

例如，当第一反应阶段中活化剂选用Sulfo-NHS时，本发明透明质酸巯基化改性的化学反应过程可以表述为如下反应式：

其中，HA为透明质酸残基。

上述反应式中，在pH值范围为4.5-5.0的条件下，透明质酸的侧链羧基在EDCI的催化下，首先与Sulfo-NHS（活化剂）反应生成稳定的抗水解活性中间体（I）；然后在pH值范围为5.5-6.5的条件下，胱胺的自由氨基与该抗水解活性中间体（I）偶联反应生成胱胺修饰的透明质酸中间产物（II）；最后，使用还原剂将胱胺修饰的透明质酸中间产物（II）还原为半胱胺修饰巯基化透明质酸衍生物（III）。

本发明所提供的制备方法中，透明质酸巯基化改性时，由于EDCI催化活化羧基反应的适宜pH为弱酸性，因此，在第一反应阶段将pH值调节至4.5-5.0，以提高透明质酸的羧基的活化率，生成更多的抗水解活性中间体；但该pH条件下，胱胺的自由氨基绝大部分质子化，其亲核反应活性很低，生成胱胺修饰的透明质酸中间产物（II）的反应效率很低，抗水解活性中间体无法有效的与自由氨基结合生产终产物，因此，需要对反应体系的pH值范围进行调节，即进入第二反应阶段，升高pH值以使质子化的氨基重新转化为自由氨基，并与抗水解活性中间体反应生成胱胺修饰的透明质酸中间产物；虽然反应体系的pH值升高有利于质子化的氨基转化为自由氨基，但抗水解活性中间体的存在时间也受pH值的影响，pH值升高至7.0时，抗水解活性中间体的半衰期为4-5h，pH值升高至8.0时，抗水解活性中间体的半衰期缩短至1h，而pH值升高至8.6时，抗水解活性中间体的半衰期缩短至10min，将严重影响抗水解活性中间体与自由氨基的反应，因此，第二反应阶段的pH值范围一般为5.5-6.5，该pH值范围内，能够有足够的自由氨基参与反应，且抗水解活性中间体的存在时间足够长，最终，终产物的巯基化改性度更高；更佳地，pH值为pH=6.0。

较佳地，所述第一反应阶段的pH值为4.75-5.0。

较佳地，所述第一反应阶段的反应时间为15-120min；更佳地，所述第一反应阶段的反应时间为30-60min，最佳地，所述第一反应阶段的反应时间为30min。

较佳地，所述第一反应阶段所用的活化剂为N-羟基硫代琥珀酰亚胺；可理解地，活化剂还可以是N－琥珀酰亚胺或羟基苯并三唑。

较佳地，所述第二反应阶段的反应时间为8-16h。

较佳地，所述第三反应阶段所用的还原剂为二硫苏糖醇；可理解地，还原剂还可以是三(2-羰基乙基)-磷盐酸盐。

较佳地，所述步骤S2中的氧化剂为氧气。

较佳地，所述氧气是溶解于半胱胺修饰巯基化透明质酸衍生物溶液中的溶解氧。

较佳地，所述步骤S2中半胱胺修饰巯基化透明质酸衍生物溶液的浓度为3-30mg/ml。

较佳地，所述步骤S2中半胱胺修饰巯基化透明质酸衍生物溶液的pH值为6.8-8.0范围。

本发明在对透明质酸进行巯基化改性时，通过调节第一反应阶段和第二反应阶段反应体系的pH值，既保障了第一反应阶段中EDCI催化活化羧基生成充足的抗水解活性中间体，又保障了第二反应阶段中，抗水解活性中间体与自由氨基的偶联反应有较高的反应效率，还有效避免了第二反应阶段中抗水解活性中间体的水解；本发明胱胺与透明质酸侧链羧基偶联反应的效率高，巯基化改性度高，有利于后续进一步交联形成双硫键交联透明质酸水凝胶，且本发明工艺简便，几乎无有机溶剂使用，安全性好，其制备的双硫键交联透明质酸水凝胶在医学中有良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面对本发明所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例一中调节第一反应阶段pH值的终产物巯基化改性度的结果；

图2是本发明实施例二中调节第二反应阶段pH值的终产物巯基化改性度的结果；

图3是本发明实施例三中在调节第二反应阶段pH值的基础上，将第一反应阶段的时间延长至120min的终产物巯基化改性度的结果；

图4是本发明实施例四中调节第一反应阶段反应时间的终产物巯基化改性度的结果。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一

透明质酸钠（MW 200 KDa）1克（2.5 mmol）、Sulfo-NHS 1.63克（7.5 mmol）和胱胺二盐酸盐1.69克（7.5mmol）溶解于100ml蒸馏水。加入适量酸或碱（0.1 N盐酸或氢氧化钠）以调节溶液为特定pH值（pH为4.0、4.5、4.75、5.0、5.5、6.0或7.0）。然后加入EDCI固体0.26克（1.35 mmol），搅拌溶解，加入适量酸或碱（0.1 N盐酸或氢氧化钠）保持反应溶液的pH值稳定为前述特定值，搅拌反应过夜。加入1.0 N的氢氧化钠，调节反应溶液的pH为8.5，终止反应。然后加入二硫苏糖醇6克，搅拌溶解，反应4小时。然后加入1.0 N盐酸，调节上述反应溶液的pH值为3.0。将上述溶液装入透析管（截留分子量3500 Da）（Spectrum Labs，美国）；然后用0.001 N盐酸和0.2 N氯化钠的混合溶液进行透析纯化，采用凝胶渗透色谱（GPC）跟踪最终产物的纯化过程，直至杂质吸收峰不可见。最后再用0.001 N盐酸透析脱盐，收集透析管内溶液，冷冻干燥得到白色絮状固体。

采用Shu等报道的改进Ellman方法检测巯基含量并计算巯基化改性度（Biomacromolecules 2002, 3:1304-1311）。巯基化改性度是指引入巯基的数量占透明质酸侧链羧基总数量的百分比。

实验结果见图1。结果表明，反应溶液的pH为4.5、4.75、5.0时具有更高的巯基化改性度。其中，pH为4.75时的巯基化改性度分别比pH为4.0、5.5、6.0和7.0提高了25%、19%、41%和80%。

实施例二

透明质酸钠（MW 200 KDa）1克（2.5 mmol）、Sulfo-NHS 1.63克（7.5 mmol）和胱胺二盐酸盐1.69克（7.5mmol）溶解于100ml蒸馏水。加入适量酸或碱（0.1 N盐酸或氢氧化钠）分别调节溶液为特定pH=4.75。然后加入EDCI固体0.26克（1.35 mmol），搅拌溶解，加入适量酸或碱（0.1 N盐酸或氢氧化钠）保持反应溶液的pH值稳定为4.75，反应30分钟。然后加入适量0.1 N氢氧化钠，调高反应溶液的pH为特定值（pH为4.75、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5或8.0），搅拌反应过夜。加入1.0 N的氢氧化钠，调节反应溶液的pH为8.5，终止反应。然后加入二硫苏糖醇6克，搅拌溶解，反应4小时。然后加入1.0 N盐酸，调节上述反应溶液的pH值为3.0。将上述溶液装入透析管（截留分子量3500 Da）（Spectrum Labs，美国）；然后用0.001 N盐酸和0.2 N氯化钠的混合溶液进行透析纯化，采用凝胶渗透色谱（GPC）跟踪最终产物的纯化过程，直至杂质吸收峰不可见。最后再用0.001 N盐酸透析脱盐，收集透析管内溶液，冷冻干燥得到白色絮状固体。

采用Shu等报道的改进Ellman方法检测巯基含量并计算巯基化改性度（Biomacromolecules 2002, 3:1304-1311）。巯基化改性度是指引入巯基的数量占透明质酸侧链羧基总数量的百分比。

实验结果见图2。结果表明，调高反应溶液的pH为5.5、6.0、6.5时具有更高的巯基化改性度。pH为6.0时的巯基化改性度分别比pH为4.75、7.0、7.5和8.0提高了14%、34%、37%和47%。

实施例三

透明质酸钠（MW 200 KDa）1克（2.5 mmol）、Sulfo-NHS 1.63克（7.5 mmol）和胱胺二盐酸盐1.69克（7.5mmol）溶解于100ml蒸馏水。加入适量酸或碱（0.1 N盐酸或氢氧化钠）分别调节溶液为特定pH=4.75。然后加入EDCI固体0.26克（1.35 mmol），搅拌溶解，加入适量酸或碱（0.1 N盐酸或氢氧化钠）保持反应溶液的pH值稳定为4.75，反应120分钟。然后加入适量0.1 N氢氧化钠，调高反应溶液的pH为特定值（pH为4.75、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5或8.0），搅拌反应过夜。加入1.0 N的氢氧化钠，调节反应溶液的pH为8.5，终止反应。然后加入二硫苏糖醇6克，搅拌溶解，反应4小时。然后加入1.0 N盐酸，调节上述反应溶液的pH值为3.0。将上述溶液装入透析管（截留分子量3500 Da）（Spectrum Labs，美国）；然后用0.001 N盐酸和0.2 N氯化钠的混合溶液进行透析纯化，采用凝胶渗透色谱（GPC）跟踪最终产物的纯化过程，直至杂质吸收峰不可见。最后再用0.001 N盐酸透析脱盐，收集透析管内溶液，冷冻干燥得到白色絮状固体。

采用Shu等报道的改进Ellman方法检测巯基含量并计算巯基化改性度（Biomacromolecules 2002, 3:1304-1311）。巯基化改性度是指引入巯基的数量占透明质酸侧链羧基总数量的百分比。

实验结果见图3。结果表明，调高反应溶液的pH为5.5、6.0、6.5时具有更高的巯基化改性度。其中，pH为6.0时的巯基化改性度分别比pH为4.75、7.0、7.5和8.0提高了8%、18%、24%和69%。

实施例四

透明质酸钠（MW 200 KDa）1克（2.5 mmol）、Sulfo-NHS 1.63克（7.5 mmol）和胱胺二盐酸盐1.69克（75mmol）溶解于100ml蒸馏水。加入适量酸或碱（0.1 N盐酸或氢氧化钠）分别调节溶液为特定pH为4.75。然后加入EDCI固体0.26克（1.35 mmol），搅拌溶解，加入适量酸或碱（0.1 N盐酸或氢氧化钠）保持反应溶液的pH值稳定为4.75，分别反应15、30、60和120分钟。然后加入适量0.1 N氢氧化钠，调高反应溶液的pH为6.0，搅拌反应过夜。加入1.0 N的氢氧化钠，调节反应溶液的pH为8.5，终止反应。然后加入二硫苏糖醇6克，搅拌溶解，反应4小时。然后加入1.0 N盐酸，调节上述反应溶液的pH值为3.0。将上述溶液装入透析管（截留分子量3500 Da）（Spectrum Labs，美国）；然后用0.001 N盐酸和0.2 N氯化钠的混合溶液进行透析纯化，采用凝胶渗透色谱（GPC）跟踪最终产物的纯化过程，直至杂质吸收峰不可见。最后再用0.001 N盐酸透析脱盐，收集透析管内溶液，冷冻干燥得到白色絮状固体。

采用Shu等报道的改进Ellman方法检测巯基含量并计算巯基化改性度（Biomacromolecules 2002, 3:1304-1311）。巯基化改性度是指引入巯基的数量占透明质酸侧链羧基总数量的百分比。

实验结果见图4。结果表明，反应时间为30和60分钟时具有更高的巯基化改性度，尤其是反应时间为30min时的巯基化改性度最高。

实施例五

将实施例二中所制备的7种半胱胺修饰的巯基化透明质酸衍生物（白色絮状固体）分别溶解于含有0.01 N磷酸盐缓冲液的生理盐水(pH 7.0)得到澄清透明水溶液，巯基化透明质酸衍生物的浓度分别为5、7.5、10、15、20和30 mg/ml,溶液pH值用适量0.1 N 氢氧化钠或盐酸分别调节至6.8、7.4和8.0。取上述溶液1 ml置于5 ml玻璃瓶中，密封室温保存。两周后观察，密封于玻璃瓶中的溶液失去流动性、已经形成凝胶。凝胶不溶于水，但可溶于二硫苏糖醇溶液，证实为在玻璃瓶空气中的氧气及溶液中的溶解氧的氧化下形成了双硫键交联。

实施例六

将实施例三中调高反应溶液pH为5.5、6.0、6.5时所制备的3种半胱胺修饰的巯基化透明质酸衍生物（白色絮状固体）分别溶解于含有0.01 N磷酸盐缓冲液的生理盐水(pH7.0)得到澄清透明水溶液，巯基化透明质酸衍生物的浓度分别为5、10和20mg/ml,溶液pH值用适量0.1 N 氢氧化钠分别调节至7.4。取上述溶液1 ml灌入1 ml注射器，密封室温保存。一周后观察，密封于注射器中的溶液失去流动性、已经形成凝胶。凝胶不溶于水，但可溶于二硫苏糖醇溶液，证实为在溶液中的溶解氧的氧化下形成了双硫键交联。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。

Claims (9)

1.一种双硫键交联透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于，其由如下步骤组成：

步骤S1，透明质酸巯基化改性，其由如下反应阶段组成：

第一反应阶段：将反应物和活化剂溶于水中，调节pH值至4.5-5.0范围内，之后加入催化剂，保持pH值不变，反应15-120min；所述反应物包括透明质酸钠和胱胺，所述催化剂为1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)-碳化二亚胺盐酸盐；

第二反应阶段：将第一反应阶段产物的pH值调整至5.5-6.5范围内，继续8-16h；

第三反应阶段：在第二反应阶段的产物中加入还原剂，将二硫键还原为自由巯基，最后纯化得到半胱胺修饰巯基化透明质酸衍生物；

步骤S2，将步骤S1得到的半胱胺修饰巯基化透明质酸衍生物的溶液在氧化剂的氧化交联下得到双硫键交联透明质酸水凝胶，其中，半胱胺修饰巯基化透明质酸衍生物溶液的pH值为6.8-8.0范围。

2.如权利要求1所述的双硫键交联透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于，所述第一反应阶段的pH值为4.75-5.0。

3.如权利要求1所述的双硫键交联透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于，所述第一反应阶段的反应时间为30min。

4.如权利要求1所述的双硫键交联透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于，所述第一反应阶段所用的活化剂为N-羟基硫代琥珀酰亚胺。

5.如权利要求1所述的双硫键交联透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于，所述第二反应阶段的pH值为6.0。

6.如权利要求1所述的双硫键交联透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于，所述第二反应阶段所用的还原剂为二硫苏糖醇。

7.如权利要求1所述的双硫键交联透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中的所述氧化剂为氧气。

8.如权利要求7所述的双硫键交联透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于，所述氧气是溶解于半胱胺修饰巯基化透明质酸衍生物溶液中的溶解氧。

9.如权利要求1所述的双硫键交联透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中半胱胺修饰巯基化透明质酸衍生物溶液的浓度为3-30mg/ml。

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