CN101724164B - 交联透明质酸的制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制造交联透明质酸的方法，其包含在约10℃至约30℃的低温下使包含透明质酸的溶液进行交联反应超过约48小时，本发明的方法不需纯化步骤即可降低交联剂的含量。

Description

交联透明质酸的制造方法

技术领域

本发明涉及一种制造交联透明质酸(cross-linked hyaluronic acid，cross-linked HA)的技术。具体来说，本发明涉及一种降低产品中交联剂含量的交联透明质酸制造方法。

背景技术

透明质酸为一种多糖，其结构由β-1，3-葡萄糖乙酰胺(β-1，3-N-acetyl glucosamine)和β-1，4-葡萄糖酸(β-1，4-glucuronic acid)以β-1-4键结形成分子量约为400D的双糖重复单位，此双糖重复单位再以β-1-3键结重复连结，形成的直链高分子聚合物。其商业来源可由菌种如链球菌属的酦酵以及动物组织如鸡冠中萃取得到。

透明质酸、其盐类或其衍生物由于不具有种属特异性且具有良好的生物相容性、粘弹性、保湿性和生物可降解性，而广泛应用于化妆品、生物医学、医疗器材和制药上。

直链的透明质酸在生物体内易因酵素(如透明质酸水解酵素)和自由基的作用而发生降解，因而降低在生物体内的滞留时间，还因缺乏机械强度而限制其应用范围，故在实际应用时，常对透明质酸进行交联，制备成可溶于水的交联透明质酸溶液或不溶于水的交联透明质酸凝胶(hydrogel)或介于两者之间的物质，也可视需要混合两者使用。

然而，当通过交联剂进行透明质酸的交联反应以制备交联透明质酸时，常有大量交联剂残留于产物中，而不利于应用于生物体内，目前最常用以去除或降低残留交联剂的方法包括以透析法或以水或缓冲溶液清洗。但此类纯化方法效果有限，同时对于一端已是键结态而另一端仍为自由态官能团的交联剂而言，并无法以透析或清洗的方式去除，且此种含有自由态官能团的交联剂具有反应性，如美国发明专利第5808050号所示，在动物体中使用时具有风险。

另一方面，以透析或清洗交联透明质酸尚有不易放大工艺的问题，且因在中性或接近中性环境下纯化，无菌条件难以控制，再者，如果交联透明质酸为凝胶状态，交联程度低的交联透明质酸因膨润大，清洗不易，得到的产物的透明质酸含量低；交联程度高的交联透明质酸则因膨润低，残留的交联剂更加不易去除。再者，在清洗过程中，交联程度低的透明质酸易流失，而丧失润滑性质，对于需充填于针剂中的应用，需另外添加直链或交联的透明质酸溶液以增加其润滑性质。

美国发明专利第4716154号揭示一种无菌、不含热源的交联的透明质酸制法，可作为眼球的玻璃状液(vitreous humor)取代物。此合成方式是以多官能团交联剂，在碱存在下，在高温如50℃下进行交联反应2小时，反应后置于室温过夜，由于残留有未反应的交联剂，接着将所得胶体切成小块后，以蒸馏水清洗24小时，再以沸腾的生理食盐水清洗8小时，得到固含量0.23％～1.2％的胶体。所述专利文献强调因此方法残留有未反应的交联剂，彻底清洗所合成的胶体极端重要且不可缺少。此方法的缺点包括有：(1)需有复杂的胶体纯化步骤；(2)因以沸腾的生理食盐水去除交联剂，使胶体膨润而仅得到固含量偏低的胶体，如需提高固含量，则需额外步骤；(3)需重新在生理缓冲溶液中膨润，以调整其渗透压和酸碱值，不利于工业上使用。

美国发明公开第2006/0194758A1号将高、低分子量的透明质酸混合反应，产生一种单相的具良好机械性质的胶体，改良了可注射性，但此方法在50℃交联反应结束后，未经透析纯化前残留大量未反应的交联剂，其浓度超过300ppm以上，之后通过透析法以纯化试图去除交联剂，但其效果不佳，难以有效去除未反应且自由态的交联剂，也无法去除已为键结状态但交联剂的另一端尚具自由态官能团的交联剂。

美国发明公开第2005/0281880A1号揭示一种可注射凝胶的制备方法，其步骤包含：在一个密闭容器内，交联一种或多种聚合物形成胶体；清洗所述胶体；纯化所述胶体；均质所述胶体形成凝胶。所述方法使用了高浓度双官能团或多官能团交联剂，有上述键结态交联剂残留的问题。再者，胶体清洗、纯化的时间需2至3天，由于此时溶液的酸碱值已接近中性，产生微生物污染的风险。

美国发明公开第2007/0026070A1号揭示一种多糖交联凝胶的方法，包括在碱性溶液中，使多糖与二或多官能团环氧化物接触，以提供一种以环氧化物交联的多糖，其中环氧化物基本上是以醚键与多糖联结；在实质上未从碱性介质中移除环氧化物的情况下，干燥所述环氧化物交联的多糖；以水可溶的溶剂合理清洗交联的多糖；中和交联的多糖基质，形成交联的多糖凝胶。此方法同样具有已是键结状态但尚含自由态官能团的交联剂残留问题。

如要制备交联的透明质酸固态物，常用去除交联剂的方法是沉淀法，如美国专利第4716224号，但此方法仍有上述尚含自由态官能团的键结态交联剂残留的风险存在。

另一方面，在碱性环境下的交联反应时，透明质酸同时也被水解，故碱性环境下的反应是交联反应与水解反应相互竞争，如Y时田(Y.Tokita)与A.冈本(A.Okamoto)，“透明质酸的水解降解(Hydrolytic Degration of Hyaluronic Acid)”，聚合物降解与稳定性(Polymer Degration and Stability)，第48卷，第269-273页(1995)文献所述。在碱性环境反应初期，交联剂的浓度最高，故反应以交联反应为主，但当反应一段时间交联剂消耗一定量后，如果以同样温度继续进行反应，则反应以水解反应为主，同时也会破坏胶体的性质，使胶体性质劣化，造成发生胶体裂解、颜色变成深黄色或甚至变为褐色而无法使用，故在碱性环境反应时，进行一段时间的反应后就必须终止反应，虽然此时还残留有大量的交联剂。以双官能团或多官能团环氧化物在碱性条件下进行交联反应时，大多在25℃至60℃下进行，反应时间则在10分钟至24小时之间，但实际的反应时间与所使用的温度和碱浓度有关。而这些反应下所得的胶体，大多有去除交联剂的纯化步骤或虽无纯化的程序，但仍残留有相当量或大量的交联剂。

目前文献中已知的去除交联剂的方法都有其缺点，且都无法有效去除交联剂或降低交联剂含量，尤其无法去除一端已是键结态另一端仍为自由态官能团的交联剂。业界迫切需要一种降低产品中交联剂含量的交联透明质酸制造方法。

发明内容

本发明提供一种制造交联透明质酸的方法，其包含在约10℃至约30℃的低反应温度，使包含交联剂与透明质酸、其金属盐类、其衍生物或其混合物的溶液在碱性环境进行交联反应超过约48小时。

根据本发明的方法不需经由纯化步骤，即可制得在产物中交联剂含量低、生物相容性高且可供动物体应用的交联透明质酸，以克服常规技术中使用纯化步骤的缺点。

附图说明

无

具体实施方式

本发明提供一种制造交联透明质酸的方法，其包含在约10℃至约30℃的低反应温度下使包含交联剂与透明质酸、其金属盐类、其衍生物、或其混合物的溶液在碱性环境进行交联反应超过约48小时。

本发明所说的“透明质酸”又称为玻尿酸，是指一种多糖化合物，其结构由β-1，3-葡萄糖乙酰胺和β-1，4-葡萄糖酸以β-1-4键结形成分子量约为400D的双糖重复单位，此双糖重复单位再以β-1-3键结重复连结，形成的直链高分子聚合物。

本发明所说的“透明质酸金属盐类”是指由透明质酸与金属离子所形成的盐类，较佳地，其为钾盐、钠盐或锌盐。

本发明所说的“透明质酸衍生物”是指含有羟基的多糖类，例如但不限于羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose，CMC)、褐藻酸盐(alginate)、软骨素-4-硫酸盐(chondroitin-4-sulfate)、软骨素-6-硫酸盐(chondroitin-6-sulfate)、黄原胶(xanthane gum)、壳聚糖(chitosan)、果胶(pectin)、琼脂(agar)、鹿角菜胶(carrageenan)或瓜尔胶(guargum)。

本发明所说的“交联透明质酸”是指在含有交联剂存在下，使相同分子或不同分子的透明质酸、其金属盐类、其衍生物或其混合物间，发生部分交联或完全交联后，所形成的分子网状结构型态的交联透明质酸。其物理型态可为固态、液态(指溶于水或缓冲溶液的交联透明质酸)、凝胶(指被水或缓冲溶液膨润的交联透明质酸胶体)、介于液态和凝胶间的混合物或是水不溶的固体，此物理型态可由加入反应的交联剂含量和合成方法而定。

本发明所说的“交联反应”是指使两透明质酸、其金属盐类、其衍生物或其混合物直链间产生键结的反应。在碱性环境下，根据本发明的交联反应以醚键形成交联，不产生副产物，理论上反应可完全进行。

在本发明的一具体实施例中，碱性环境中碱浓度为约0.05N至约1.5N；较佳为约0.05N至约1N；更佳为约0.2N至约0.5N；尤佳为约0.25N至约0.5N。另一方面，碱性环境较佳是由无机碱提供，其中所述无机碱较佳选自由氢氧化钠和氢氧化钾所组成的群组，其中“碱浓度”的定义是指1升的反应物中的液体的体积(包含溶剂、碱和交联剂的体积，但不包含透明质酸、其金属盐类、其衍生物或其混合物的体积)中所含碱的当量数。

根据本发明的方法，使用交联剂进行所述交联反应。本发明中所说的“交联剂”是指可将两透明质酸、其金属盐类、其衍生物或其混合物直链间产生键结的物质。通常所述交联剂具有多个官能团可分别与多个的透明质酸、其金属盐类、其衍生物或其混合物直链产生键结，并进一步彼此进行交联反应。较佳地，所述交联剂为多官能团环氧化物；更佳为双官能团环氧化物。在本发明的一较佳具体实施例中，所述交联剂选自由1，4-丁二醇二缩水甘油醚(1，4-butanediol diglycidyl ether)、乙二醇二缩水甘油醚(ethylene glycoldiglycidyl ether)、1，6-己二醇二缩水甘油醚(1，6-hexanediol diglycidyl ether)、聚丙二醇二缩水甘油醚(polypropylene glycol diglycidyl ether)、聚丁二醇二缩水甘油醚(polytetramethylene glycol diglycidyl ether)、新戊二醇二缩水甘油醚(neopentyl glycoldiglycidyl ether)、聚甘油聚缩水甘油醚(polyglycerol polyglycidyl ether)、二甘油聚缩水甘油醚(diglycerol polyglycidyl ether)、甘油聚缩水甘油醚(glycerol polyglycidyl ether)、三羟甲基丙烷聚缩水甘油醚(tri-methylolpropane polyglycidyl ether)、季戊四醇聚缩水甘油醚(pentaerythritol polyglycidyl ether)、山梨糖醇聚缩水甘油醚(sorbitol polyglycidylether)、1，2，7，8-二环氧辛烷(1，2，7，8-diepoxyoctane)和1，3-二环氧丁烷(1，3-butadienediepoxide)以及其混合物所组成的群组。

本发明所属技术领域中具通常知识者可视所需的交联透明质酸的交联程度和交联剂种类选择合宜的交联剂浓度，在本发明的一较佳具体实施例中，交联剂的浓度为约0.05至约2w/v％；更佳为约0.1至约1.5w/v％；尤佳为约0.1至约1.0w/v％，最佳为约0.6至约1.0w/v％。

本发明的技术特征在于使用长时间的低温反应温度条件进行交联反应，根据本发明的低反应温度是指约10℃至约30℃；较佳为约15℃至约30℃；最佳为约20℃至约30℃。在此低反应温度下进行的交联反应，所形成的交联透明质酸不会因碱的水解作用而快速劣化，在使交联剂消耗至合理的含量后即终止反应。本发明中所说的低反应温度不限于以单一温度反应，也可为多种低反应温度的组合。本发明所说的“使交联剂消耗至合理的含量”是指在最后所得的交联产物中交联剂含量可为后续继续利用的浓度，例如1ppm以下、2ppm以下、5ppm以下、10ppm以下、15ppm以下或20ppm以下，但并不意谓限定本发明，根据本发明交联剂的消耗并不局限于因交联反应而消耗，也可能因水解作用而消耗，也可能交联作用和水解作用一起消耗。在本发明的具体实施例中，可控制所得的产物的未反应完全的交联剂含量为低于1ppm、2ppm、2至5ppm、5至10ppm、10至15ppm或15至20ppm。本发明所说“具有自由态官能团的交联剂”包含未与透明质酸、其金属盐类、其衍生物或其混合物反应的交联剂和部分官能团与透明质酸、其金属盐类、其衍生物或其混合物反应，使交联剂官能团与透明质酸、其金属盐类、其衍生物或其混合物间产生键结但部分官能团未反应而为自由态时的交联剂。较佳地，所述交联反应在交联透明质酸劣化前即停止，本发明所说“劣化”是指经交联反应后的所得的交联透明质酸，因为碱的水解作用变成深黄色或甚至深褐色，使其无法应用，或是指所合成的产物开始发生明显降解。通常交联反应的时间与交联反应的温度相关，温度越高，所需的时间越短，温度越低，所需的时间越长；反应时间也与交联剂的浓度和碱浓度相关，综合上述，根据本发明的反应时间超过48小时，较佳为约3至约28天，更佳为约3至约11天，最佳为约3至约7天。

根据本发明，包含透明质酸、其金属盐类、其衍生物或其混合物的反应溶液中透明质酸、其金属盐类、其衍生物或其混合物的浓度较佳为约2至约40wv％；更佳为约10至约30wv％；尤佳为约15至约20wv％。根据本发明的透明质酸、其金属盐类或其衍生物分子量理论上并未有限制，可单独为低分子量、高分子量，也可为两种高、低分子量的透明质酸、其金属盐类或其衍生物的任意混合。其分子量例如为10万以下、10至50万之间、50万至100万之间、100万至150万之间、150万至200万之间、250万至300万之间。较佳为混合高、低分子量的透明质酸、其金属盐类、其衍生物或其混合物进行交联反应，具有反应溶液粘度低和适合工艺放大的优点。

在本发明的一较佳具体实施例中，当使用1，4-丁二醇二缩水甘油醚1v/v％作为交联剂时，包含透明质酸、其金属盐类、其衍生物或其混合物溶液中透明质酸、其金属盐类、其衍生物或其混合物的浓度为20w/v％、碱浓度为0.25N时，所需的反应时间为3至28天。

根据本发明的方法较佳在无菌条件下进行，但不限于仅在无菌条件下进行，也可在一般的环境下进行，只要最终产物的交联剂可降低至合理的范围以下和具有良好的生物相容性即可，其中生物相容性的性质可通过细胞毒性试验进行测试。实际上，根据本发明在低反应温度下进行交联反应虽需较长的反样时间，但由于是在碱性的环境中，不容易有微生物的污染，也无现有技术中在中性缓冲溶液中清洗胶体所产生微生物的污染的高风险。

较佳地，根据本发明的方法在低反应温度中进行交联反应之前，另外包含在高反应温度下进行交联反应的步骤，其中所述高反应温度为约35℃至约60℃；较佳为约35℃至约50℃；更佳约35℃至约40℃。在此方面中，其在高反应温度进行交联反应一段时间，使透明质酸、其金属盐类、其衍生物或其混合物先进行部份的交联反应，在其性质尚未劣化，或未开始有明显降解发生前，再置于低反应温度继续进行反应，使交联剂消耗至合理的含量后终止反应。本发明中所说的高反应温度不限于以单一温度反应，也可为多种高反应温度的组合。

在本发明的较佳具体实施例中，当高反应温度为约35℃时，进行交联反应小于约72小时；较佳为约4至约48小时；更佳为约6至约12小时。当高反应温度为约40℃时，进行交联反应小于约48小时；较佳为约2至24小时；更佳为约3至约6小时。当高反应温度为约50℃时，进行交联反应小于约8小时；较佳为约0.1至约2小时；更佳为约0.2至约1小时。当高反应温度为约60℃时，进行交联反应小于约2小时；较佳为约0.1至约0.5小时；更佳为约0.2至约0.3小时。

较佳地，根据本发明的方法另外包含稀释步骤。其是将交联反应中所得的交联透明质酸含量，经稀释为所需的浓度和生理上可接受的渗透压或酸碱值。稀释的方法例如使用水、中性溶液、缓冲溶液、盐类溶液或其混合物加入反应液中而得。例如调整交联透明质酸的含量介于5mg/mL至60mg/mL之间，较佳介于10mg/mL至40mg/mL之间，最佳介于20mg/mL至30mg/mL之间，渗透压为280至340mOsm/kg之间。

较佳地，根据本发明的方法另外包含中和步骤，其是将交联反应中所需的非中性酸碱环境，中和为中性环境，较佳为pH值在6.5至7.5之间，使可利于动物体内应用。在本发明的一具体实施例中，稀释步骤与中和步骤可同时进行。

较佳地，根据本发明的方法另外包含均质步骤，其是将最后产物碾碎、压碎而均匀分散成颗粒或溶液者，例如可使用均质机或其它碾碎或压碎的机器进行均质。

根据本发明的方法所制得的交联透明质酸，依其型态可为溶液、凝胶、溶液与凝胶的混合物或进一步干燥或冷冻干燥为颗粒或固体，固体的形状可为但不限于海绵状、片状、条状、球状或椭圆状。根据本发明的方法不需经由纯化步骤，即可制得于产物中交联剂含量低、生物相容性高且可供动物体应用的交联透明质酸，以克服常规技术中使用纯化步骤的缺点。

现以下列实例来详细说明本发明，但其并不意谓本发明仅局限于此等实例所揭示的内容。

实例一：透明质酸钠浓度＝20w/v％HHA、碱浓度＝0.5N、反应温度＝30℃、交联剂浓度＝1v/v％的1，2，7，8-二环氧辛烷

取8.9mL的去离子水加入1mL的5N氢氧化钠水溶液和0.1mL交联剂1，2，7，8-二环氧辛烷，在磁石搅拌下加入2克(干重)平均分子量为135万的透明质酸钠(highmolecular weight hyaluronic acid，HHA)，室温下搅拌5分钟后，置于30℃恒温箱中反应如表1所示的反应时间。反应后，所得反应物中加入79.2mL的pH值为7.0±0.2的0.073M磷酸盐缓冲溶液和0.8mL的6N的氯化氢水溶液，以使得均质后至生理上可接受的pH值和渗透压，再将胶体溶液均质后，即可得交联透明质酸产物。

均质后的交联透明质酸产物的具有自由态官能团的交联剂含量测定是将产物经透明质酸水解酵素水解，再依据奈利斯(Nelis)和Sinsheimer所使用的方法(用于在生理学条件下测定脂肪族环氧化物的增敏荧光光度法(A Sensitive Fluorimetric for theDetermination ofAliphatic Epoxides under Physiological Conditions)，生物化学分析(Anal.Biochem.)，第115卷，第151-157页，1981)，在吸收波长为370nm下进行测定，此测定方法在具有自由态官能团的交联剂含量为1至300ppm时检量线具良好的线性关系；产物的交联透明质酸含量测定则先取精秤后的产物约0.1克置于50mL的定量瓶中，加入3mL的6N的硫酸水溶液先行溶解产物后，以去离子水稀释溶液至定量瓶刻度，再依据欧洲药典第四版(2002版)所使用的方法进行测定醛糖酸(glucuronic acid)含量后，再换算得交联透明质酸含量。不同反应时间下所得的产物其交联透明质酸含量和具有自由态官能团的交联剂含量如表1所示。

实施例二：透明质酸钠浓度＝20w/v％HHA、碱浓度＝0.5N、反应温度＝30℃、交联剂浓度＝1v/v％的1，3-二环氧丁烷

除交联剂改为1，3-二环氧丁烷外，其余反应条件和含量的测定方法同实施例一。不同反应时间下所得的产物其交联透明质酸含量和具有自由态官能团的交联剂含量如表1所示。

实施例三：透明质酸钠浓度＝20w/v％HHA、碱浓度＝0.25N、反应温度＝10℃、交联剂浓度＝1v/v％的1，4-丁二醇二缩水甘油醚

取9.4mL的去离子水加入0.5mL的5N氢氧化钠水溶液和0.1mL交联剂1，4-丁二醇二缩水甘油醚，在磁石搅拌下加入2克(干重)平均分子量为135万的透明质酸钠(HHA)，室温下搅拌5分钟后，置于10℃恒温箱中反应。反应后，所得反应物中加入79.6mL的pH为7.0±0.2的0.1M磷酸盐缓溶液和0.4mL的6N的氯化氢水溶液，以使得均质后至生理上可接受的pH值和渗透压，再将胶体溶液均质后，即可得到交联透明质酸产物。产物的交联透明质酸含量和具有自由态官能团的交联剂含量的测定方法同实施例一。不同反应时间下所得的产物其交联透明质酸含量和具有自由态官能团的交联剂含量如表1所示。

实施例四：透明质酸钠浓度＝20w/v％HHA、碱浓度＝0.25N、反应温度＝20℃、交联剂浓度＝1v/v％的1，4丁二醇二缩水甘油醚

除反应温度改为20℃外，其余反应条件与测定方法同实施例三。不同反应时间下所得的产物其交联透明质酸含量和具有自由态官能团的交联剂含量如表1所示。

实施例五：透明质酸钠浓度＝20w/v％HHA、碱浓度＝0.25N、反应温度＝30℃、交联剂浓度＝1v/v％的1，4丁二醇二缩水甘油醚

除反应温度改为30℃外，其余反应条件与测定方法同实施例三。不同反应时间下所得的产物其交联透明质酸含量和具有自由态官能团的交联剂含量如表1所示。

实施例六：透明质酸钠浓度＝20w/v％HHA、碱浓度＝0.2N、反应温度＝30℃、交联剂浓度＝1v/v％的1，4-丁二醇二缩水甘油醚

取9.5mL的去离子水加入0.4mL的5N氢氧化钠水溶液和0.1mL交联剂1，4-丁二醇二缩水甘油醚，在磁石搅拌下加入平均分子量为135万的透明质酸钠(HHA)2.0克(干重)，搅拌5分钟后置于可控制温度的恒温箱中以30℃反应一定时间后(反应时间如表1所示)，所得反应物中加入0.32mL的6N氯化氢水溶液和79.68mL pH为7.0±0.2的0.10M磷酸盐缓溶液，以使得均质后至生理上可接受的pH值和渗透压，再将胶体溶液均质后，即可得到交联透明质酸产物。产物的交联透明质酸含量和具有自由态官能团的交联剂含量的测定方法同实施例一。不同反应时间下所得的产物其交联透明质酸含量和具有自由态官能团的交联剂含量如表1所示。

由表1的结果可得知当于低反应温度进行交联反应超过2天时，其产品交联剂的含量低，可应用于生物体内。

表1：

^*不在检量线范围(1～300ppm)

实施例七：透明质酸钠浓度＝10w/v％HHA、碱浓度＝0.05N、高反应温度＝50℃、低反应温度＝30℃、交联剂浓度＝1v/v％的1，4-丁二醇二缩水甘油醚

取9.8mL的去离子水加入0.1mL的5N氢氧化钠水溶液和0.1mL交联剂1，4-丁二醇二缩水甘油醚，在磁石搅拌下加入平均分子量为135万的透明质酸钠(HHA)，搅拌5分钟后置于可控制温度的恒温箱中以50℃反应7小时后，再以30℃下反应一定时间后(反应时间如表2所示)，所得反应物中加入去离子水9.87mL、0.13mL的6N氯化氢水溶液和20mL pH为7.0±0.2的0.15M磷酸盐缓溶液，以使得均质后至生理上可接受的pH值和渗透压，再将胶体溶液均质后，即可得到交联透明质酸产物。产物的交联透明质酸含量和具有自由态官能团的交联剂含量的测定方法同实施例一。不同反应时间下所得的产物其交联透明质酸含量和具有自由态官能团的交联剂含量如表2所示。

实施例八：透明质酸钠浓度＝20w/v％HHA、碱浓度＝0.5N、高反应温度＝40℃、低反应温度＝25℃、交联剂浓度＝1v/v％的1，4-丁二醇二缩水甘油醚

取8.9mL的去离子水加入1mL的5N氢氧化钠水溶液和0.1mL交联剂1，4-丁二醇二缩水甘油醚，在磁石搅拌下加入平均分子量为135万的透明质酸钠(HHA)，搅拌5分钟后置于可控制温度的恒温箱中以40℃反应3小时后，再以25℃下反应一定时间后(反应时间如表2所示)，所得反应物中加入0.8mL的6N氯化氢水溶液和79.2mL pH为7.0±0.2的0.073M磷酸盐缓溶液，以使得均质后至生理上可接受的pH值和渗透压，再将胶体溶液均质后，即可得到交联透明质酸产物。产物的交联透明质酸含量和具有自由态官能团的交联剂残留量的测定方法同实施例一。不同反应时间下所得的产物其交联透明质酸含量和具有自由态官能团的交联剂含量如表2所示。

实施例九：透明质酸钠浓度＝20w/v％HHA、碱浓度＝0.5N、高反应温度＝40℃、低反应温度＝25℃、交联剂浓度＝1v/v％的1，2，7，8-二环氧辛烷

除交联剂改为1，2，7，8-二环氧辛烷，其余反应条件和含量的测定方法同实施例八。不同反应时间下所得的产物其交联透明质酸含量和具有自由态官能团的交联剂残留量如表2所示。

实施例十：透明质酸钠浓度＝20w/v％HA(10w/v％HHA+10w/v％LHA)、碱浓度＝0.25N、高反应温度＝40℃、低反应温度＝10℃、交联剂浓度＝0.6v/v％的1，4-丁二醇二缩水甘油醚

取9.44mL的去离子水加入0.5mL的5N氢氧化钠水溶液和0.06mL交联剂1，4-丁二醇二缩水甘油醚，在磁石搅拌下加入平均分子量为44万的透明质酸钠(low molecularweight hyaluronic acid，LHA)和平均分子量为135万的透明质酸钠(HHA)各1克(干重)，搅拌5分钟后置于可控制温度的恒温箱中以40℃反应4小时后，再以10℃下反应一定时间后(反应时间如表2所示)，所得反应物中加入0.4mL的6N氯化氢水溶液和79.6mL pH为7.0±0.2的0.10M磷酸盐缓溶液，以使得均质后至生理上可接受的pH值和渗透压，再将胶体溶液均质后，即可得到交联透明质酸产物。产物的交联透明质酸含量和具有自由态官能团的交联剂含量的测定方法同实例一。不同反应时间下所得的产物其交联透明质酸含量和具有自由态官能团的交联剂含量如表2所示。

实施例十一：透明质酸钠浓度＝30w/v％HA(15w/v％HHA+15w/v％LHA)、碱浓度＝0.25N、高反应温度＝40℃、低反应温度＝25℃、交联剂浓度＝0.6v/v％的1，4-丁二醇二缩水甘油醚

取9.44mL的去离子水加入0.5mL的5N氢氧化钠水溶液和0.06mL交联剂1，4-丁二醇二缩水甘油醚，在磁石搅拌下加入平均分子量为44万的透明质酸钠(LHA)和平均分子量为135万的透明质酸钠(HHA)各1.5克(干重)，搅拌5分钟后置于可控制温度的恒温箱中以40℃反应4小时后，再以25℃下反应一定时间后(反应时间如表2所示)，所得反应物中加入0.4mL的6N氯化氢水溶液和79.6mL pH为7.0±0.2的0.10M磷酸盐缓溶液，以使得均质后至生理上可接受的pH值和渗透压，再将胶体溶液均质后，即可得到交联透明质酸产物。产物的交联透明质酸含量和具有自由态官能团的交联剂含量的测定方法同实施例一。不同反应时间下所得的产物其交联透明质酸含量和具有自由态官能团的交联剂残留量如表2所示。

实施例十二：透明质酸钠浓度＝20w/v％LHA、碱浓度＝0.25N、高反应温度＝40℃、低反应温度＝25℃、交联剂浓度＝0.6v/v％的1，4-丁二醇二缩水甘油醚

除透明质酸改为低分子量透明质酸钠(LHA)2.0克(干重)外，其余反应条件和含量的测定方法同实施例十一。不同反应时间下所得的产物其交联透明质酸含量和具有自由态官能团的交联剂残留量如表2所示。

实施例十三：透明质酸钠浓度＝20w/v％HA(10w/v％HHA+10w/v％LHA)、碱浓度＝0.25N、高反应温度＝40℃、低反应温度＝25℃、交联剂浓度＝0.1v/v％的1，4-丁二醇二缩水甘油醚

取9.49mL的去离子水加入0.5mL的5N氢氧化钠水溶液和0.01mL交联剂1，4-丁二醇二缩水甘油醚，在磁石搅拌下加入平均分子量为44万的透明质酸钠(LHA)和平均分子量为135万的透明质酸钠(HHA)各1.0克(干重)，搅拌5分钟后置于可控制温度的恒温箱中以40℃反应4小时后，再以25℃下反应一定时间后(反应时间如表2所示)，所得反应物中加入0.4mL的6N氯化氢水溶液和79.6mL pH值为7.0±0.2的0.10M磷酸盐缓溶液，以使得均质后至生理上可接受的pH值和渗透压，再将溶液均质后，即可得到交联透明质酸产物。产物的交联透明质酸含量和具有自由态官能团的交联剂含量的测定方法同实例一。不同反应时间下所得的产物其交联透明质酸含量和具有自由态官能团的交联剂含量如表2所示。

实施例十四：透明质酸钠浓度＝20w/v％LHA、碱浓度＝0.2N、高反应温度＝40℃、低反应温度＝30℃、交联剂浓度＝1v/v％的1，4-丁二醇二缩水甘油醚

取9.5mL的去离子水加入0.4mL的5N氢氧化钠水溶液和0.1mL交联剂1，4-丁二醇二缩水甘油醚，在磁石搅拌下加入平均分子量为44万的透明质酸钠(LHA)2.0克(干重)，搅拌5分钟后置于可控制温度的恒温箱中以40℃反应4小时后，再以30℃下反应一定时间后(反应时间如表2所示)，所得反应物中加入0.32mL的6N氯化氢水溶液和79.68mLpH为7.0±0.2的0.10M磷酸盐缓溶液，以使得均质后至生理上可接受的pH值和渗透压，再将胶体溶液均质后，即可得到交联透明质酸产物。产物的交联透明质酸含量和具有自由态官能团的交联剂含量的测定方法同实施例一。不同反应时间下所得的产物其交联透明质酸含量和具有自由态官能团的交联剂含量如表2所示。

由表2的结果可得知当于高反应温度反应一段时间后继续进行低反应温度交联反应超过2天时，其产品具有自由态官能团的交联剂的含量低，可应用于生物体内。

表2

^*：不在检量线范围(1～300ppm)

上述实施例仅为说明本发明的原理和其功效，而非限制本发明。因此，所属领域的技术人员对上述实施例所做的修改和变化仍不违背本发明的精神。本发明的权利范围应如前述的权利要求书所列。

Claims (15)

1.一种制造交联透明质酸的方法，其包含在10℃至30℃的低反应温度下使包含交联剂与透明质酸、其金属盐类、含有羟基的多糖类或其混合物的溶液在碱性环境进行交联反应超过48小时，其中在低反应温度中进行交联反应之前，另外包含在高反应温度中进行交联反应的步骤，其中所述高反应温度为35℃至60℃，

其中所述交联剂为多官能团环氧化物，

其中所述含有羟基的多糖类选自由羧甲基纤维素、褐藻酸盐、软骨素-4-硫酸盐、软骨素-6-硫酸盐、黄原胶、壳聚糖、果胶、琼脂、鹿角菜胶和瓜尔胶所组成的群组。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述透明质酸的金属盐类为钾盐、钠盐或锌盐。

3.根据权利要求1所述的方法，其中碱性环境中碱浓度为0.05N至1.5N。

4.根据权利要求1所述的方法，其中碱性环境是由无机碱提供。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述无机碱选自由氢氧化钠和氢氧化钾所组成的群组。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述交联剂为双官能团环氧化物。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述交联剂选自由1，4-丁二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、1，6-己二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、聚丁二醇二缩水甘油醚、新戊二醇二缩水甘油醚、聚甘油聚缩水甘油醚、二甘油聚缩水甘油醚、甘油聚缩水甘油醚、三羟甲基丙烷聚缩水甘油醚、季戊四醇聚缩水甘油醚、山梨糖醇聚缩水甘油醚、1，2，7，8-二环氧辛烷和1，3-二环氧丁烷以及其混合物所组成的群组。

8.根据权利要求6所述的方法，其中交联剂的浓度为0.05至2w/v％。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述低反应温度为15℃至30℃。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述低反应温度为20℃至30℃。

11.根据权利要求1或3所述的方法，其中交联反应进行3至28天。

12.根据权利要求1所述的方法，其中包含透明质酸、其金属盐类、含有羟基的多糖类或其混合物的溶液中透明质酸、其金属盐类、含有羟基的多糖类或其混合物的浓度为2至40wv％。

13.根据权利要求1所述的方法，另外包含稀释步骤，其是将交联反应中所得的交联透明质酸稀释为所需的浓度和生理上可接受的渗透压或酸碱值。

14.根据权利要求1所述的方法，另外包含中和步骤，其是将交联反应中的碱环境中和为中性环境。

15.根据权利要求1所述的方法，另外包含均质步骤，其是将交联反应中所得的交联透明质酸碾碎、压碎而均匀分散成颗粒或溶液。