CN102805880A - 一种组织工程凝胶支架材料及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种组织工程凝胶支架材料及其制备方法和用途。本发明提供的组织工程凝胶支架材料是通过下述步骤制备得到:(1)将含有透明质酸或其盐的溶液和1,4-丁二酸缩水甘油醚混合,得到混合溶液1;和(2)将混合溶液1平铺、干燥,得到组织工程凝胶支架材料。本发明还公开了制备得到的组织工程凝胶支架材料的用途。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程领域,尤其涉及一种组织工程凝胶支架材料及其制备方法。
背景技术
生物材料和种子细胞是组织工程技术中的两大关键因素。作为种子细胞支架的生物可降解材料,是对细胞外基质的仿生,是保证组织工程化组织形成的前提。细胞与生物材料直接接触后,产生一系列在细胞和分子水平上的反应,因此支架材料的物化性质直接影响着细胞增殖和分化,进而影响体内和体外组织构建效果,最终影响组织工程化组织的形成。由于生物材料在组织工程中是起到负载细胞的支架的作用,一般需要具有相应组织、器官的复杂外形,高空隙率,合适的降解速率,良好的生物相容性,等等。相对于其他类型的支架材料,如通常用于软组织构建的纤维状或膜片式聚α-羟基酸(包括聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)及它们的共聚物PLGA),或是用于硬组织构建的磷酸三钙、羟基磷灰石、珊瑚、脱钙骨等,可注射的凝胶支架材料具有易塑形,且回植体内时无创伤等优点而深受科研人员的青睐。
透明质酸(Hyaluronic acid,简称HA)是由N-乙酰氨基葡糖-D-葡萄糖醛酸为双糖单位组成的天然直链高分子多糖(glycosaminoglycan;GAG),商品形式的HA主要以透明质酸钠的形式出售,本文中的HA如不特意指出即指透明质酸钠。HA的分子量可以高达1-2000,000Da,具有较好的粘弹性,广泛分布于哺乳动物结缔组织的胞外基质、鸡冠和链球菌的夹膜等地方。HA是黏多糖的一种,和细胞表面有密切的相互作用,由于参与了关节的润滑和胶状结缔组织的连接而被认为是生物“胶”。HA在骨骼演变的生长,发育和重建过程中发挥着多种功能,并且在很多重大的生物学过程中也有举足轻重的作用,如细胞迁移,增殖,组织形成,伤口愈合,血管化和器官形成等。最近的报道认为HA能作为配体被干细胞表面的受体CD44所识别,并通过与CD44的作用参与到细胞的黏附,增殖和分化以及受体介导的基因表达。综上所述,由于HA无种属及脏器特异性,在植入体内时显示出优良的机体生物相容性,是一种理想的制备组织工程注射型凝胶支架的天然生物材料。但是天然的HA容易被肌体组织中的酶降解,良好的水溶性使其在组织中容易被扩散,所以它在体内存留时间很短。根据文献HA在皮肤中的半衰期为1天,在眼睛中为1-1.5小时,在软骨中为1-3周,在玻璃液中的半衰期为70天。那么天然HA很难用作组织工程支架材料,因为其对细胞所起的支撑作用时间太短,来不及匹配组织的形成。通常需要对HA进行修饰和交联以得到凝胶状HA支架材料。
单纯HA凝胶的制备以及生产工艺已有较多报道,最为典型的是用于注射的美容除皱产品瑞蓝(Restylane)。根据美国专利(US Patent,5827937),HA凝胶的制备采用1,4-丁二醇二缩水甘油醚(1,4-butanediol diglycidylether,BDDE)为交联剂,分为两步法,第一步通过浓度来控制交联反应的进行程度使得到活化的HA多糖溶液;第二步增加反应物浓度使交联反应继续进行以得到黏性胶状物质。根据这样的两步法制备的HA凝胶,对生产工艺和过程很难精确控制,从而容易导致交联度和凝胶性能的不稳定,而用于组织构建时,支架材料性能的微小改变就会增加后续细胞行为的不可控性,影响组织形成,因此这样的方法不适合用作组织工程支架材料的制备。
因此本领域迫切需要提供一种简单易行、能够精确控制透明质酸交联度和凝胶性能的组织工程凝胶支架材料的制备方法。
发明内容
本发明旨在提供一种简单易行、能够精确控制透明质酸交联度和凝胶性能的组织工程凝胶支架材料的制备方法。
在本发明的第一方面,提供了一种组织工程凝胶支架材料的制备方法,所述的方法包括步骤:
(1)将含有透明质酸或其盐的溶液和1,4-丁二酸缩水甘油醚混合,得到混合溶液1;和
(2)将混合溶液1平铺使厚度为2-10mm(较优为2-8mm,最优为3-7mm)、干燥,得到组织工程凝胶支架材料。
上述制备方法中,以混合溶液1的总体积计,其中1,4-丁二酸缩水甘油醚的体积百分浓度为2-10%。
上述制备方法中,所述混合的时间为1-9小时。
上述制备方法中,所述干燥时间1-6天。
在另一优选例中,本发明提供的一种组织工程凝胶支架材料的制备方法包括步骤:
(1)将含有透明质酸或其盐的溶液和1,4-丁二酸缩水甘油醚混合1-9小时,得到混合溶液1;以混合溶液1的总体积计,其中1,4-丁二酸缩水甘油醚的体积百分浓度为2-10%;和
(2)将混合溶液1平铺于培养皿、干燥1-6天,得到组织工程凝胶支架材料;
其中混合时间优选2-8小时,更优选4-8小时;以混合溶液1的总体积计,其中1,4-丁二酸缩水甘油醚的体积百分浓度优选3-8%;更优选4-8%。
在另一优选例中,所述的方法还包括步骤:
(3)将得到的组织工程凝胶支架材料和磷酸盐缓冲液混合,溶胀后分别经水和PBS溶液透析;所述的透析为至少1天。
在本发明的第二方面,提供了一种组织工程凝胶支架材料,它是使用如上所述的本发明提供的制备方法制备所得;所述的支架材料为片状或颗粒状;并且以所述支架材料的总重量计,其中游离的透明质酸或其盐的重量百分含量为1-25%,交联的透明质酸或其盐的重量百分含量为75-99%。
在本发明的第三方面,提供了一种如上所述的本发明提供的组织工程凝胶支架材料的用途,用于制备组织工程移植物;较佳地所述的组织工程移植物包括软骨移植物和结缔组织移植物。
在本发明的第四方面,提供了一种如上所述的本发明提供的组织工程凝胶支架材料的使用方法,所述的方法包括步骤:
(a)使如上所述的本发明提供的组织工程凝胶支架材料成为粒径为能滤过35目筛网(粒径约为500μm以下)的凝胶颗粒;
(b)将步骤(a)得到的凝胶颗粒和含有游离透明质酸的溶液混合,所述含有游离透明质酸的溶液和步骤(a)得到的凝胶颗粒的体积比为1∶3至1∶1;和
(c)将含有种子细胞的细胞悬液和步骤(b)得到的混合物混合,得到细胞-支架复合物。
据此,本发明提供了一种简单易行、能够精确控制透明质酸交联度和凝胶性能的组织工程凝胶支架材料的制备方法。
附图说明
图1是本发明实施例2提供的组织工程凝胶支架材料的细胞毒性实验结果。
图2是本发明试验例中的第4.1部分提供的组织工程凝胶支架材料复合软骨细胞后猪皮下成软骨大体照(A)和组织学切片图(B×10倍;C×20倍)。
图3显示了游离HA和实施例2得到的HA凝胶支架以一定比例混合后和细胞混合形成的软骨组织块湿重情况。
图4显示了游离HA和实施例2得到的HA凝胶支架以不同比例混合并结合细胞组所获得的组织学切片图;其中
A为游离HA和凝胶HA以1∶2混合,A1(×40倍)和A2(×100倍);
B为游离HA和凝胶HA以2∶1混合,B1(×40倍)和B2(×100倍);
C为游离HA和凝胶HA以0∶3混合,C1(×40倍)和C2(×100倍)。
图5显示了本发明试验例中的第5部分提供的组织工程凝胶支架材料复合脂肪干细胞后形成的组织块湿重情况。
图6显示了本发明试验例中的第5部分提供的组织工程凝胶支架材料复合不同数量脂肪干细胞后形成的组织学显微拼图(×40倍);其中A表示1×107cells/ml;B表示2×107cells/ml;C表示4×107cells/ml。
图7A和图7B分别显示了实施例1所制备得到的凝胶颗粒的大体图和光镜下的显微图。
具体实施方式
发明人经过深入的研究,惊奇地发现在将透明质酸或其盐的溶液和交联剂混合时,如果控制好交联剂的使用量以及混合时间,并且能够将混合后的溶液进行平铺干燥形成膜状物质,再经过溶胀、透析和粉碎,便能简便地得到一种凝胶透明质酸支架材料。在此基础上,完成了本发明。
具体地,本发明提供了一种组织工程凝胶支架材料的制备方法,包括步骤:
第一步,将含有透明质酸或其盐的溶液和1,4-丁二酸缩水甘油醚搅拌混合1-9小时,得到混合溶液1;
第二步,将混合溶液1平铺于器皿,干燥1-6天,得到干燥的膜片;
第三步,将膜片用磷酸盐缓冲液溶胀后先后用水和PBS溶液分别透析至少1天,以除去未参加反应的交联剂1,4-丁二酸缩水甘油醚,得到组织工程凝胶支架材料。
在上述第一步中,所述含有透明质酸或其盐的溶液是氢氧化物溶液,所述氢氧化物中的金属离子同透明质酸盐的金属离子是同一种金属离子。
上述第一步中含有透明质酸或其盐的溶液和1,4-丁二酸缩水甘油醚的混合时间较佳地为2-8小时,更佳地为4-8小时或5-8小时,最佳地为5-6小时。所述的混合在40℃进行。
上述第一步所得到的混合溶液1,以其总体积计,其中1,4-丁二酸缩水甘油醚的体积百分浓度为2-10%,较佳地为3-8%,更佳地为4-8%,最佳地是4-6%。
上述第二步中用于平铺混合溶液1的器皿可以是本领域常规使用的器皿,只要其与混合溶液1的接触面是平整、光滑的,且该接触面的面积与混合溶液1的体积比是合适的,即可使混合溶液1铺于该接触面从而形成一厚度约为2-10mm(较佳地,厚度约为2-8mm;更佳地,厚度约为3-7mm)的液膜,所述接触面的材质可以是玻璃、塑料、陶瓷、不锈钢等。所述的器皿例如但不限于培养皿、烧杯等。
上述第二步中的干燥时间较佳地为2-5天,更佳地至少3天,最佳地为3-4天。
上述第二步中得到的干燥的膜片是透明的,膜片的厚度约为2-10mm(较佳地,厚度约为2-8mm;更佳地,厚度约为3-7mm)。
上述第三步中的磷酸盐缓冲液是pH为中性的PBS溶液,其中含有氯化钠、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠。
上述第三步中用于透析的水选自纯净水、蒸馏水、或去离子水;用于透析的PBS溶液可以是用于溶胀膜片的PBS溶液;透析在室温下进行。
本发明中提及的透明质酸的盐包括钠盐、钾盐、镁盐、和钙盐。
如本文所用,“组织工程”和“组织工程学”可以互换使用,都是指在体外构建一个有生物活性的种植体,植入体内修复组织缺损,替代器官功能;或作为一种体外装置,暂时替代器官功能,达到提高生存质量,延长生命活动的目的的上世纪80年代提出的一种新兴科学。
如本文所用,“支架材料”和“组织工程学支架材料”或“组织工程支架材料”是同一概念,都是指用于支撑细胞成长为一个完整的组织的框架材料。
如本文所用,“凝胶”是指溶胶或溶液中的透明质酸或其盐的胶体粒子在一定条件下互相连接,形成的空间网状结构,结构空隙中充满了作为分散介质的液体。
如本文所用,“室温”是指10-35℃,较佳地是15-30℃,更佳地是20-25℃。
通过本发明提供的制备方法,可以获得一种组织工程凝胶支架材料,本发明提供的组织工程凝胶支架材料是可注射凝胶支架材料,在室温下是细小的凝胶颗粒,可通过混合来负载活性细胞和治疗药物,通过注射可携带细胞到指定位置。
本发明提供的组织工程凝胶支架材料几乎不残留交联剂1,4-丁二酸缩水甘油醚,其中交联剂的残余量小于原交联剂总量的0.6%。
本发明提供的组织工程凝胶支架材料中游离透明质酸或其盐的含量为1-25%(以组织工程凝胶支架材料的总重量计),也就是说,以本发明提供的组织工程凝胶支架材料的总重量计,含有约75-99wt%的交联透明质酸或其盐和约1-25wt%的未交联的透明质酸或其盐。
本发明提供的组织工程凝胶支架材料可以用于制备组织工程移植物,例如但不限于,组织工程化软骨、脂肪或结缔组织移植物。本发明提供的凝胶也可以作为基础原料,进一步制备膜片、纤维、膏状、块状或粉末状物质等等。应用领域包括可皮下或真皮内注射的美容、除皱和保湿材料,日化原料或辅料,组织填充材料,药物载体或药物配料,皮肤膜辅料,组织工程用支架材料,关节症治疗用注射剂,防粘连和栓塞形成材料,或是代用玻璃体及眼科植入凝胶等。可以采用本领域常规的方法制备移植物,例如但不限于将种子细胞接种于本发明提供的组织工程凝胶支架材料上,在适宜条件下回植体内。细胞在本发明提供的组织工程凝胶支架材料上的细胞浓度为1×107-9×107cells/ml;优选1.5×107-8×107cells/ml;更优选2×107-7×107cells/ml。
本发明还提供一种使用本发明提供的组织工程凝胶支架材料的方法,包括步骤:
(a)使本发明提供的组织工程凝胶支架材料成为粒径为能滤过35目筛网的,粒径约为500μm以下的凝胶颗粒;
(b)将步骤(a)得到的凝胶颗粒和含有游离透明质酸的溶液混合,所述含有游离透明质酸的溶液和步骤(a)得到的凝胶颗粒的体积比为0∶3至1∶1;
(c)将含有种子细胞的细胞悬液和步骤(b)得到的混合物混合,得到细胞-支架复合物。
步骤(a)中使用本领域常规的方法使本发明提供的组织工程凝胶支架材料成为颗粒,例如但不限于,均质机粉碎,挤压等。
步骤(b)中所述步骤(a)得到的凝胶颗粒的体积是指各个单个的颗粒形成的颗粒集合的体积。
步骤(b)中含有游离透明质酸的溶液中所述游离透明质酸的浓度应当同步骤(a)中本发明提供的组织工程凝胶支架材料复原为游离透明质酸时,其中的透明质酸的浓度一致。
步骤(c)得到的复合物在适宜条件下回植体内以得到组织工程化移植物。
步骤(c)得到的复合物以其总体积计,其中的细胞有1-9×107细胞数/ml;较佳地为1.5-8×107细胞数/ml。
本发明涉及的种子细胞包括成体细胞和干细胞,干细胞包括胚胎干细胞和成体干细胞,例如但不限于,骨髓基质干细胞、脂肪干细胞、成纤维细胞、软骨细胞等。
本发明提到的上述特征,或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用,说明书中所揭示的各个特征,可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明,所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于:
1、本发明提供的组织工程凝胶支架材料制备方法简单易行,并且能精确控制HA交联度和凝胶性能。
2、本发明提供的组织工程凝胶支架材料具有较长的功效。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的,例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
下述实施例中使用的原料有:
透明质酸钠(sodium hyaluronic acid,HA,山东福瑞达生物医药有限公司);1,4-丁二醇缩水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether,BDDE,美国sigma公司);氢氧化钠,氯化钠,磷酸二氢钾,磷酸氢二钠(国药集团化学制药有限公司)。
实施例1
制备HA凝胶支架I
精确称取0.5g HA,将其置于5ml的1%氢氧化钠溶液中,直至完全溶解。向HA溶液中加入20μl BDDE(交联剂最终浓度为4%),将溶液置于40℃使其搅拌均匀混合4小时,然后把溶液平铺于培养皿,干燥3天,得到干燥的HA透明膜片。膜片用磷酸盐缓冲液(PBS:氯化钠(NaCl)9mg/ml,磷酸二氢钾(KH2PO4)0.03mg/ml,磷酸氢二钠(Na2HPO4×2H2O)0.14mg/ml,pH=7)溶胀后置于透析袋中先后在去离子水和PBS溶液中室温下分别透析一天,以除去未参加反应的交联剂。得到的凝胶状HA膜片再用PBS调成含20mg HA/ml溶液,最后用均质机(T10 basic,IKA,Germany)打碎成凝胶颗粒,过35目筛网,得到粒径约为500μm以下凝胶颗粒(大体图和光镜下的显微图见A和图7B)。透析完成后的材料置于4℃冰箱密封保存备用,如用于细胞和体内实验,则应置于高压蒸汽灭菌(120℃,20min)后使用。
实施例2
制备HA凝胶支架II
精确称取0.5g HA,将其置于5ml的1%氢氧化钠溶液中,直至完全溶解。向HA溶液中加入20μl BDDE(交联剂最终浓度为4%),将溶液置于40℃使其搅拌均匀混合5小时,然后把溶液平铺于培养皿,干燥3天,得到干燥的HA透明膜片。后续处理和实施例1类似,即用PBS溶胀后透析,均质机粉碎,密封保存或灭菌后密封保存。
实施例3
制备HA凝胶支架III
精确称取0.5g HA,将其置于5ml的1%氢氧化钠溶液中,直至完全溶解。向HA溶液中加入20μl BDDE(交联剂最终浓度为4%),将溶液置于40℃使其搅拌均匀混合8小时,然后把溶液平铺于培养皿,干燥3天,得到干燥的HA透明膜片。后续处理和实施例1类似,即用PBS溶胀后透析,均质机粉碎,密封保存或灭菌后密封保存。
实施例4
制备HA凝胶支架IV
精确称取0.5g HA,将其置于5ml的1%氢氧化钠溶液中,直至完全溶解。向HA溶液中加入30μl BDDE(交联剂最终浓度为6%),将溶液置于40℃使其搅拌均匀混合6小时,然后把溶液平铺于培养皿,干燥3天,得到干燥的HA透明膜片。后续处理和实施例1类似,即用PBS溶胀后透析,均质机粉碎,密封保存或灭菌后密封保存。
实施例5
制备HA凝胶支架V
精确称取0.5g HA,将其置于5ml的1%氢氧化钠溶液中,直至完全溶解。向HA溶液中加入40μl BDDE(交联剂最终浓度为8%),将溶液置于40℃使其搅拌均匀混合2小时,然后把溶液平铺于培养皿,干燥3天,得到干燥的HA透明膜片。后续处理和实施例1类似,即用PBS溶胀后透析,均质机粉碎,密封保存或灭菌后密封保存。
对比例1
精确称取0.5g HA,将其置于5ml的1%氢氧化钠溶液中,直至完全溶解。向HA溶液中加入10μl BDDE(交联剂最终浓度为2%),将溶液置于40℃使其搅拌均匀混合6小时,然后把溶液平铺于培养皿,干燥3天,得到干燥的HA透明膜片。膜片用磷酸盐缓冲液(PBS:氯化钠(NaCl)9mg/ml,磷酸二氢钾(KH2PO4)0.03mg/ml,磷酸氢二钠(Na2HPO4×2H2O)0.14mg/ml,pH=7)溶胀后置于透析袋中先后在去离子水和PBS溶液中室温下分别透析一天,以除去未参加反应的交联剂。
结果只形成微量可忽略的凝胶。
对比例2
精确称取0.5g HA,将其置于5ml的1%氢氧化钠溶液中,直至完全溶解。向HA溶液中加入20μl BDDE(交联剂最终浓度为4%),将溶液置于40℃使其搅拌均匀混合5小时。加入适量磷酸盐缓冲液(PBS:氯化钠(NaCl)9mg/ml,磷酸二氢钾(KH2PO4)0.03mg/ml,磷酸氢二钠(Na2HPO4×2H2O)0.14mg/ml,pH=7)溶胀后置于透析袋中先后在去离子水和PBS溶液中室温下分别透析一天,以除去未参加反应的交联剂。
结果没有观察到凝胶的形成。
对比例3
精确称取0.5g HA,将其置于5ml的1%氢氧化钠溶液中,直至完全溶解。向HA溶液中加入20μl BDDE(交联剂最终浓度为4%),搅拌几分钟后,把溶液平铺于培养皿,干燥3天,得到干燥的HA透明膜片。加入适量磷酸盐缓冲液(PBS:氯化钠(NaCl)9mg/ml,磷酸二氢钾(KH2PO4)0.03mg/ml,磷酸氢二钠(Na2HPO4×2H2O)0.14mg/ml,pH=7)溶胀后置于透析袋中先后在去离子水和PBS溶液中室温下分别透析一天,以除去未参加反应的交联剂。
对比例4
瑞蓝(Restylane),制法根据United States Patent(Patent Number5,827,937)
试验例
1.HA凝胶支架交联度的测定
将实施例1-5和对比例1-4得到的HA干燥膜片,分别置于烧杯,加入50ml去离子水,室温浸泡12小时后,提取15ml浸提液并过滤得到(A),再补充15ml新鲜去离子水加入上述混合物中;过12小时后再取浸提液15ml并过滤得到(B),重复上述过程,得到(C)、(D)、(E)和(F)。用咔唑显色法测定溶液A、B、C、D、E和F中HA的含量,从而推算出HA干燥膜片中能游离出来的未交联即游离HA量。如(F)中的HA含量还很高,再重复上述的浸泡过程,直至最后得到的过滤溶液(X)中未能用以下的咔唑法检测出HA。
咔唑显色法测定HA含量的方法原理为透明质酸钠水解后,葡萄糖醛酸与咔唑试剂作用产生红紫色,且颜色深浅与葡萄糖醛酸含量成正比。主要步骤如下:1.取0.1g咔唑,加无水乙醇100ml溶解,移至深棕色瓶;2.称取10mg葡萄糖醛酸(GA)于100ml容量瓶中,稀释至刻度,摇匀,得到GA标准溶液,再根据GA标准溶液配备GA系列浓度的标准液;3.称取9.54g的四硼酸钠(Na2B4O7·10H2O),加入1L浓硫酸中,加盖。不定时的振摇,直至四硼酸钠完全溶解,得到0.025mol/l的四硼酸钠硫酸溶液;4.将HA样品试管和步骤2中的各标准液试管一起置于冰水浴中,用酸式滴定管缓慢地向每管中加入0.025mol/l的四硼酸钠硫酸溶液5ml,边加边摇匀。混匀后置于沸水浴中煮沸20mi n取出,冷却至室温。向各试管内加入咔唑乙醇溶液0.2ml,充分摇匀,室温放置2小时。用分光光度计测定550nm处各标准管和样品管的吸光度,根据标准管绘制标准曲线并查处样品管内的葡萄糖醛酸浓度,最后换算成HA的浓度。
结果见表1。
表1不同反应条件对HA凝胶支架交联度的影响
交联剂浓度 | 混合时间 | 铺膜干燥时间 | 交联度 | |
实施例1 | 4% | 4小时 | 3天 | 79% |
实施例2 | 4% | 5小时 | 3天 | 90% |
实施例3 | 4% | 8小时 | 3天 | 94% |
实施例4 | 6% | 6小时 | 3天 | 89% |
实施例5 | 8% | 2小时 | 3天 | 78% |
对比例1 | 2% | 6小时 | 3天 | 10% |
对比例2 | 4% | 5小时 | 0 | 无凝胶产生 |
对比例3 | 4% | 0 | 3天 | 38% |
对比例4 | / | / | / | 78% |
交联反应的时间和浓度对最终形成的凝胶支架的交联度影响较大。时间过长或者交联剂浓度过高,则会使最终形成的凝胶过硬,用作支架材料时,不利于细胞的黏附。
本发明提供的方法的优点:高浓度的透明质酸其分子链以非常复杂的相互缠绕的状态存在,因此交联反应不是简单的把两个透明质酸分子连在一起,而是使透明质酸分子链之间最终形成一个无序的三维网状结构,分子链之间被互相立体的束缚,使网络结构牢固稳定,因此得到不溶于水的凝胶,由于交联后HA分子的吸水性还保留,因此凝胶支架具有极好的吸水溶胀性能。同时,以膜片法制备的透明质酸凝胶由于其相互缠绕的分子链被限制在一个狭窄的立体空间,能使HA分子链上的功能团与交联剂的功能团充分接触可以促使交联反应更为彻底,保证了交联剂能尽可能地彻底反应,几乎不会残留交联剂(采用高效液相色谱,HPLC分析,凝胶支架中交联剂的残余量均小于原交联剂总量的0.6%,即BDDE浓度<0.0024%)。从另一个角度也确保了选用较少的交联剂就可以制备出具有优异粘弹性的交联透明质酸凝胶,减少了未参加反应的交联剂残留而引起应用时的细胞和组织毒性。此外,交联反应得到的凝胶支架中含有适量的(1-25%)游离透明质酸,凝胶支架含有约75-99%左右的交联透明质酸和1-25%左右的未交联即游离透明质酸,主要是为保证注射后凝胶支架既有交联成份赋予的长久的填充或支架作用,又有游离成份的短期效应,使注射后支架对细胞的作用能起到降解的同时又维持在持续的状态,从而匹配细胞的生长和组织的形成速度。同时游离HA的存在使整体的凝胶更加润滑和柔和,进一步提高可塑性,增加和细胞的相容性。
以下的抗酶降解性能测试和细胞及体内实验均采用实施例2得到的HA凝胶支架II。
其中的w与英文“week”同义,表示“周”;其中的“cells/ml”表示“每毫升的细胞数”。
2.HA凝胶支架的抗酶降解性能测定
把实施例2得到的颗粒状凝胶支架置于一定浓度透明质酸酶溶液中一段时间,计算在一定时间内降解HA的量和降解前HA总量的比值(R),以表示抗酶降解性,R值越小表明凝胶支架的抗酶降解性越强。HA的量用上述咔唑显色法测定葡萄糖醛酸的量来换算。
实验步骤主要为:(1)配制60U/ml透明质酸酶的磷酸缓冲溶液(磷酸二氢钠2.5g,无水磷酸氢二钠1.0g与氯化钠8.2g,加水使成1000ml,pH6.3);(2)取实施例2中得到的经蒸汽灭菌后的HA凝胶支架颗粒1ml,放置于10ml具塞试管,加入60U/ml透明质酸酶的磷酸缓冲溶液3ml,再加入pH为6.3的磷酸缓冲溶液2ml,于37℃水浴分别放置1小时、2小时、2天和3天后迅速置于冰水中30min,取1.5ml过滤,室温放置后取1ml作为测试液,以30U/ml透明质酸酶的磷酸缓冲溶液为空白对照,按咔唑显色法测定酶解液中糖醛酸的量X;(3)另取实施例2中得到的经蒸汽灭菌后的HA凝胶支架颗粒1ml,置于10ml试管,加浓度为0.5mol/l硫酸1ml,加热至膜溶解,冷却后,加入浓度为1mol/l的NaOH溶液1ml和浓度为60U/ml透明质酸酶的磷酸缓冲溶液3ml,混匀,过滤后取1ml作为测试液,以30U/ml透明质酸酶的磷酸缓冲溶液为空白对照,按咔唑显色法测定酶解液中糖醛酸的量Y;(4)R值为X/Y。
结果见表2。
表2凝胶支架的抗酶降解件能比较
结果表明,在所测的时间点,通过本发明提供的方法制备的HA凝胶在同样的条件下抗酶降解性能R均低于商品瑞蓝,即其抗降解性要优于瑞蓝。在一个小时的透明质酸酶作用下,本发明提供的方法制备的凝胶只降解了10.1%,而瑞蓝的则已降解了34.4%;酶作用两个小时后,本发明提供的方法制备的凝胶的降解率为12%,而瑞蓝的则高达40.1%。因此,从降解性能可以看出,本发明提供的方法既实用又简单,而且能保证凝胶具有较长的功效。
3.HA凝胶支架的细胞毒性MTT实验
取成人包皮以无菌PBS溶液冲洗,去除皮下脂肪组织,剪成1-2mm3大的组织块。在新鲜配制的0.1%中性蛋白酶(dispase,R&D,Lakewood,NJ)4℃下消化过夜后去除表皮层,剩下的真皮层用含有0.1%的I型胶原酶(collagenase,Worthington,Freehold,NJ)的DMEM培养液(Dulbecco’s modification ofEagle’s medium,GIBCO Karlsruhe,Germany)于恒温摇床内消化3小时。消化后的细胞用细胞筛网(BD biosciences,USA)过滤后1500rpm离心5min,弃去上清液,用高糖DMEM(含有10%fetal bovine serum(FBS,Hyclone,Logan,UT),L-glutamine (300mg/mL),vitamin C (50mg/mL),penicillin (100U/mL),和streptomycin(100U/mL))收集细胞得到悬浮液,并接种于培养皿,24小时后用无菌PBS轻轻冲去未贴附的细胞。贴壁细胞继续培养,每隔3-4天后换新鲜培养液。当细胞达到90%融合时,用0.25%trypsin-0.02%EDTA消化细胞,传代继续培养。取第3代细胞用于评价HA凝胶支架的细胞毒性实验。
用DMEM把消化下来的成纤维细胞配成1×104cells/mL,取100μL置于96孔板的每孔,培养24小时后换成含1mg/ml或0.5mg/ml HA凝胶支架(实施例2中得到的经蒸汽灭菌后的HA凝胶支架颗粒)的DMEM培养液,单纯DMEM培养液作为阴性对照,含64g/L苯酚的DMEM培养液作为阳性对照,每个样本在每个时间点重复8个样。分别培养2,4和7天后,每个孔板加入100μL的0.5mg/ml的3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT)溶液。37℃孵育4小时后,吸弃每个孔板中的培养液,加入150μL的dimethylsulfoxide(DMSO)。96孔板在500rpm下摇晃5min后,把每个孔内的液体移至另一新96孔板,在免疫酶标仪上以490nm波长测定每孔的吸光值。
结果见图1。
结果表明,HA凝胶支架无细胞毒性,和阴性对照组即单纯DMEM的增殖在不同时间点均无显著性差别。随着时间的增加,HA凝胶组的细胞和阴性对照组一样,呈正常的增殖趋势。因此,本发明提供的HA凝胶支架可用于负载细胞的组织工程支架。
4.HA凝胶支架复合软骨细胞后的体内组织形成能力评价
4.1HA凝胶支架复合自体软骨细胞后猪皮下植入实验
软骨细胞的分离和培养:纯种贵州香猪,雌雄不限,8周龄,体重6~8kg,氯胺酮(2mg/kg)、戊巴比妥钠(0 2ml/kg)肌肉注射麻醉局部消毒后,取耳廓软骨,剥离软骨膜,切成5mm×5mm大小碎片,磷酸盐缓冲液(PBS,含penicillin(100U/mL)和streptomycin(100U/mL))冲洗2遍.加入2倍体积的3mg/ml的II型胶原酶(collagenase,Worhington,Freehold,NJ),置于37℃恒温摇床内消化8~12小时,150目尼龙网筛过滤离心,沉淀细胞用PBS冼2次,Ham F-12培养液(Gibco,Gland Island,NY)制成细胞悬液,含有10%fetal bovine serum.L-glutamine 300mg/mL),vitamin C(50mg/mL),penicillin(100U/mL),和streptomycin(100U/mL))。当细胞达到90%融合时,用trypsin-EDTA(0.025%和0.02%)消化细胞,用于后续实验。
HA凝胶支架复合自体软骨细胞后猪皮下植入实验:取0.3ml上述案例2制备的HA凝胶支架,和不同浓度的软骨细胞混合后植入猪腋窝和腹股沟部位的皮下,细胞在支架上的最终浓度分别为0;1×107cells/ml;2×107cells/ml;4×107cells/ml。两个时间点取材:2w和4w。每个时间点重复4个样本。
猪皮下植入实验:2w后猪皮下取材,细胞浓度为0组没有形成软骨组织;细胞浓度为1×107cells/ml的实验组得到的组织块平均湿重为23.5mg;细胞浓度为2×107cells/ml的实验组得到的组织块平均湿重为44.4mg;细胞浓度为4×107cells/ml的实验组得到的组织块平均湿重为44.2mg。4w后猪皮下取材,细胞浓度为0组没有形成软骨组织;细胞浓度为1×107cells/ml的实验组得到的组织块平均湿重为32.3mg;细胞浓度为2×107cells/ml的实验组得到的组织块平均湿重为58mg;细胞浓度为4×107cells/ml的实验组得到的组织块平均湿重为62.7mg。
图2所示是2周后猪皮下取材,细胞浓度为2×107cells/ml的实验组得到组织块的大体照片和组织学切片。2周后,如图2(C)所示,软骨陷窝已经清晰可见。随着体内植入时间的增加,各组形成的软骨组织逐渐成熟。此处实验证明,细胞浓度影响形成组织块的重量,但细胞来源限制了细胞浓度的进一步增加,所以细胞浓度为2×107cells/ml较为合适。
4.2HA凝胶支架复合软骨细胞后裸鼠皮下植入实验
取实施例2制备的HA凝胶支架和同样浓度的游离HA溶液以不同比例(3∶0;2∶1;1∶2;0∶3)混合,混合后取0.2ml不同支架分别和软骨细胞悬液(细胞终浓度为2×107cells/ml)混合。不同细胞-支架混合物植入裸鼠皮下,而不含细胞的相应支架材料0.2ml作为对照植入于同一裸鼠皮下。一个裸鼠作为一个时间点取材,取材时间为12w,重复3只裸鼠。此外,单纯软骨细胞悬液也相应地植于另一裸鼠皮下,作为另一对照,在同一时间取材,观察。12周后取材发现,不含细胞的各组支架中,未交联的HA均已吸收,仅剩皮肤,而交联的HA凝胶支架部分则形成透明空泡,无软骨组织形成。另一对照实验,即单纯软骨细胞悬液组也无明显的软骨组织块形成。此外,实验组HA凝胶和游离的HA溶液以0∶3混合组,和细胞进一步混合后植入体内12周后,仅形成微量可忽略的软骨组织。
对于凝胶支架和细胞混合的其他各实验组,我们在12周后取材发现都形成了均匀的软骨组织块。部分组织块的大体形状如图3所示。游离HA和凝胶HA以1∶2混合并结合细胞组,形成组织块的平均湿重为117mg;游离HA和凝胶HA以2∶1混合并结合细胞组,形成组织块的平均湿重为177mg;游离HA和凝胶HA以0∶3混合并结合细胞组,形成组织块的平均湿重为217mg。
图4A所示为游离HA和凝胶HA以1∶2混合并结合细胞组所获得的组织学切片图,A1(×40)和A2(×100)分别为不同放大倍数的组织学图,其中A2为A1中的局部放大图。可观察到清晰的软骨陷窝,组织块内部大部分已经形成相当成熟的软骨,并夹杂一些未降解的HA凝胶颗粒。
图4B所示为游离HA和凝胶HA以2∶1混合并结合细胞组所获得的组织学切片图,B1(×40)和B2(×100)分别为不同放大倍数的组织学图,其中B2为B1中的局部放大图。和图3的结果类似,此实验组也形成了一定数量的成熟的软骨细胞,但组织块内部有相当部分未成熟的软骨组织,和较大的孔隙,可能是由于较多的游离HA降解所造成的。
图4C所示为游离HA和凝胶HA以0∶3混合并结合细胞组所获得的组织学切片图,C1(40倍)和C2(100倍)分别为不同放大倍数的组织学图,其中C2为C1中的局部放大图。从C1和C2中可观察到所形成的具有清晰软骨陷窝结构的成熟软骨组织,和部分未降解的HA凝胶颗粒。
以上结果表明作为HA凝胶颗粒适合作为软骨细胞的组织工程支架材料。单纯游离HA由于降解太快,无法匹配细胞的生长和组织的形成。比较图4的A,B和C图,发现当凝胶颗粒和游离HA以2∶1混合时,形成的软骨组织中间孔隙最小,即形成最为致密的软骨组织。因此,我们认为适当的游离HA含量也能促进软骨细胞在凝胶支架内部的生长,减少中空组织的情况发生。
5.HA凝胶支架复合脂肪干细胞后的体内组织形成能力评价
脂肪干细胞的分离:脂肪组织均来自上海第九人民医院整形外科门诊行腹部脂肪抽吸术的健康患者(共6例)。脂肪抽吸物经PBS反复冲洗,加入等体积0.1%I型胶原酶(美国,WORTHINGTON公司),37℃恒温摇床消化1小时,300rpm/10min,弃上清,以4×104个有核细胞/cm2密度接种于100mm培养皿(美国,Franklin Lakes NJ公司),加入含10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)DMEM培养液(美国,GIBCO公司),置于37℃、5%CO2、100%饱和湿度的条件下培养。取原代细胞用于后续植入实验。或者细胞融合至70-80%传代,取体外培养第三代细胞用于后续植入实验。
HA凝胶支架复合第三代脂肪干细胞后裸鼠皮下植入实验:取以上实施例2得到的HA凝胶支架0.2ml,和不同浓度脂肪干细胞悬液(细胞终浓度分别为1×107cells/ml;2×107cells/ml;4×107cells/ml)混合。细胞-支架混合物植入裸鼠皮下。取材时间为12w。
12周后取材发现,不同细胞浓度的实验组均形成了一定重量的组织块,结果如图5所示。平均湿重分别为∶1×107cells/ml组50mg;2×107cells/ml组69mg;4×107cells/ml 48mg。图6A,B和C图分别显示了1×107cells/ml;2×107cells/ml和4×107cells/ml组所形成的组织学显微拼图(40倍)。我们发现1×107cells/ml和2×107cells/ml组内部基本无细胞生长和组织形成,只有4×107cells/ml组观察到内部有细胞的生长和结缔组织的形成。因此,作为脂肪干细胞的组织工程凝胶支架材料,其应用时必须达到一定的细胞浓度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并非用以限定本发明的实质技术内容范围,本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中,任何他人完成的技术实体或方法,若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同,也或是一种等效的变更,均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
Claims (10)
1.一种组织工程凝胶支架材料的制备方法,其特征在于,所述的方法包括步骤:
(1)将含有透明质酸或其盐的溶液和1,4-丁二酸缩水甘油醚混合,得到混合溶液1;和
(2)将混合溶液1平铺使厚度为2-10mm、干燥,得到组织工程凝胶支架材料。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,以混合溶液1的总体积计,其中1,4-丁二酸缩水甘油醚的体积百分浓度为2-10%。
3.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述混合的时间为1-9小时。
4.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述干燥时间1-6天。
5.如权利要求1-4任一所述的制备方法,其特征在于,所述的方法包括步骤:
(1)将含有透明质酸或其盐的溶液和1,4-丁二酸缩水甘油醚混合1-9小时,得到混合溶液1;以混合溶液1的总体积计,其中1,4-丁二酸缩水甘油醚的体积百分浓度为2-10%;和
(2)将混合溶液1平铺于培养皿、干燥1-6天,得到组织工程凝胶支架材料;
混合时间优选2-8小时,更优选4-8小时;以混合溶液1的总体积计,其中1,4-丁二酸缩水甘油醚的体积百分浓度优选3-8%;更优选4-8%。
6.如权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述的方法还包括步骤:
(3)将得到的组织工程凝胶支架材料和磷酸盐缓冲液混合,溶胀后分别经水和PBS溶液透析。
7.一种组织工程凝胶支架材料,其特征在于,使用如权利要求1-6任一所述的制备方法制备得到。
8.如权利要求7所述的组织工程凝胶支架材料,其特征在于,所述的支架材料为片状或颗粒状;并且以所述支架材料的总重量计,其中游离的透明质酸或其盐的重量百分含量为1-25%,交联的透明质酸或其盐的重量百分含量为75-99%。
9.一种如权利要求7或8任一所述的组织工程凝胶支架材料的用途,用于制备组织工程移植物。
10.一种如权利要求7或8任一所述的组织工程凝胶支架材料的使用方法,其特征在于,所述的方法包括步骤:
(a)使如权利要求7或8任一所述的组织工程凝胶支架材料成为粒径为能滤过35目筛网的凝胶颗粒;
(b)将步骤(a)得到的凝胶颗粒和含有游离透明质酸的溶液混合,所述含有游离透明质酸的溶液和步骤(a)得到的凝胶颗粒的体积比为1∶3至1∶1;和
(c)将含有种子细胞的细胞悬液和步骤(b)得到的混合物混合,得到细胞-支架复合物。
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