KR102162724B1 - 가교 히알루론산 겔 및 이의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 가교 히알루론산 겔 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 우수한 생체 적합성 및 안정성을 나타내며, 체내 주입 시 지속기간이 향상된다.
또한, 고점도의 가교 히알루론산 겔 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 순도가 높아 생체 적합성이 우수하여 체내 주입 시 거부 반응 또는 염증 반응이 나타나지 않고, 기계적 강도가 우수하며, 체내 지속 시간이 길어 조직 수복 효과가 우수하다.
또한, 고점도의 가교 히알루론산 겔 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 순도가 높아 생체 적합성이 우수하여 체내 주입 시 거부 반응 또는 염증 반응이 나타나지 않고, 기계적 강도가 우수하며, 체내 지속 시간이 길어 조직 수복 효과가 우수하다.
Description
본 발명은 가교 히알루론산 겔 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 고점도 및 고순도의 가교 히알루로산 겔 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
히알루론산은, β-N-아세틸-D-글루코사민과 β-D-글루쿠론산이 교대로 결합된 직쇄상의 고분자로 분자량이 보통 50,000 내지 10,000,000Da 또는 그 이상인 다당류이다.
히알루론산은 생체 결합조직의 기본물질로, 주로 포유동물의 피부, 관절의 활액(synovial fluid), 눈의 초자체액(vitreous humor), 탯줄(umbilical cord), 혈청(serum), 닭 벼슬(cock's comb) 등에 분포해 있으며, 연쇄상구균류의 협막 등에도 존재하는 것이 알려져 있다.
히알루론산을 얻기 위한 일반적인 방법으로는 닭 벼슬, 탯줄 등에서 추출하는 방법과, 연쇄상구균인 란스필드 그룹 A 및 C, 유전자 재조합된 고초균(B. subtilis)등을 배양한 후 이것으로부터 추출하여 정제하는 방법 등이 있다.
천연 히알루론산은 분자량에 비례한 다분(polydisperse) 산성이며, 종간 특이성을 갖지 않고 또한 조직이나 장기특이성을 갖지 않아, 그 유래에 관계없이 생체에 이식 또는 주입한 경우에 우수한 생체적합성을 나타내 안과용 주사제, 관절활액 보충제등으로 이용되고 있다.
그러나, 히알루론산은 체내에 존재하는 히알루로니다아제(Hyaluronidase)라는 효소에 의해 쉽게 분해되므로 생체조직 내에서의 반감기가 0.5 내지 3일 정도로 체내 체류시간이 비교적 짧아, 천연 고분자를 의용재료 등으로 직접 이용하기에는 한계가 있다.
따라서 이의 용도를 의용재료로 확장하기 위해, 히알루론산을 여러 종류의 화학수식제(chemical modifier)를 이용하여 가교결합(cross-linking)을 하거나 작용기를 붙이는 방법으로 변성하여 히알루로니다아제에 대한 저항성을 높임으로 체내 지속성을 향상시키는 것이 시도되어 왔다.
이 중 대표적인 것은, 디비닐술폰, 비스에폭시드 또는 포름알데히드와 같은 이작용성 가교제를 사용하여 수득한 고팽윤성의 가교된 히알루론산 겔이다.
히알루론산의 테트라부틸암모늄염이 디메틸 술폭시드(DMSO)와 같은 유기 용매에 용해하는 특징을 이용한 히알루론산의 화학적 변성 방법도 제안되고 있다.
히알루론산의 테트라부틸암모늄염을 디메틸 술폭시드 중에서, 트리에틸아민과 2-클로로-1-메틸피리디늄 요오드로 처리하여, 히알루론산의 카르복실기와 히드록실기 사이에서 에스테르 결합을 형성시키는 방법도 제안되었다.
공유 결합하는 화학 약품을 사용하지 않고, 히알루론산을 물에 불용화하는 접근으로서, 아미노기 또는 이미노기를 가지는 고분자와 히알루론산을, 히알루론산의 카르복실기와 고분자의 아미노기 또는 이미노기를 통해 이온 결합시켜 히알루론산-고분자 착화물을 제조하는 방법도 제안되었다.
또한, 가교제로 카보디이미드 또는 숙신이미딜활성에스테르를 사용한 방법이 제안되었다.
이러한 여러 방법으로 생체내 지속기간이 많이 높아졌음에도 불구하고 지속기간 연장은 제한적이다. 생체내 지속기간을 더 크게 높이기 위해 위의 방법들을 복합적으로 적용하거나 화학 수식제의 양을 과하게 적용하는 등의 시도들이 있으나, 예상치 못한 여러 문제들이 발생하기도 하였다.
가교제를 과하게 적용하는 경우, 히알루론산의 과도한 변성으로 생체내에서 이물 반응 또는 면역거부 반응을 일으키기도 하며, 일반적으로 널리 이용되는 비스에폭시드 계열의 가교제인 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르(1,4-Butanediol diglycidyl ether, BDDE)를 과하게 적용하는 경우 히알루론산에 대한 가교제 비율의 불균형으로 인해 불완전 가교된 가교제의 펜던트(pendant)를 형성하기도 하는데, 이러한 겔이 생체내에 주입될 경우에도 펜던트에 의한 면역거부반응이나 염증반응 등을 야기하기도 한다.
이에, 우수한 생체 적합성 및 안전성을 나타내면서도, 체내 지속 기간이 향상시킬 수 있는 고점도 및 고순도의 가교 히알루론산 겔의 개발이 필요하다.
본 발명의 목적은 가교 히알루론산 겔 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 우수한 생체 적합성 및 안정성을 나타내며, 체내 주입 시 지속기간이 향상된 히알루론산 겔 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 고점도의 가교 히알루론산 겔 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 순도가 높아 생체 적합성이 우수하여 체내 주입 시 거부 반응 또는 염증 반응이 나타나지 않고, 기계적 강도가 우수하며, 체내 지속 시간이 길어 조직 수복 효과가 우수한 가교 히알루론산 겔 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 고점도 및 고순도의 가교 히알루론산 겔은 가교 히알루론산 겔의 농도가 19 내지 21mg/ml이며, pH가 5.5 내지 8.5이며, 세포 독성이 없어 우수한 생체 적합성 및 안전성(Safety)을 나타낼 수 있다.
상기 가교 히알루론산 겔은 압출력이 60 내지 100N일 수 있다.
상기 가교 히알루론산 겔의 삼투압은 250 내지 350mOsm/kg일 수 있다.
상기 가교 히알루론산 겔은 체내 투여 후 4주 경과된 이후, 4 내지 12주의 경과 시에도 입자의 수직 직경 및 수평 직경의 변화가 0.2 내지 6mm이다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 고점도 및 고순도의 가교 히알루론산 겔의 제조방법은 1) 히알루론산 염을 알칼리 용액에 녹여 히알루론산 수용액을 제조하는 단계; 2) 상기 1) 단계에서 제조된 수용액에 가교제를 혼합하여 히알루론산의 가교 반응을 진행하는 단계; 3) 상기 히알루론산 가교물에 남은 미가교된 가교제 단량체를 양친매성 용매를 이용하여 1차 정제하는 단계; 3) 상기 정제된 가교 히알루론산 겔을 미세화 하는 단계; 4) 상기 미세화된 히알루론산 겔을 재수화하여 재수화된 가교 히알루론산 수용액을 제조하는 단계; 5) 상기 재수화된 히알루론산 겔 수용액에 가교제를 혼합하여 재가교 하는 단계; 6) 상기 재가교된 히알루론산 가교물에 남은 미가교된 가교제 단량체를 양친매성 용매로 2차 정제하는 단계; 및 7) 상기 정제된 히알루론산 겔의 삼투압 및 pH를 조정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 1) 단계 이후, 수용액의 pH를 12 내지 14로 조정하고, 수용액의 온도는 10 내지 50℃로 조정한 후, 2) 단계의 가교제를 혼합하는 것일 수 있다.
상기 가교제는 디비닐술폰, 비스에폭시드 및 이들의 혼합으로부터 이루어진 군으로 선택될 수 있다.
상기 양친성 용매는 2가 알코올 또는 3가 알코올을 정제수 또는 완충용액에 혼합하여 제조하는 것일 수 있다.
상기 3) 단계는 가교 히알루론산 겔을 2mm 이하로 미세화하는 것이다.
상기 4) 단계는 알칼리 수용액을 혼합하여 재수화하는 단계이다.
상기 4) 단계는 재수화된 가교 히알루론산 수용액에 불활성 기체를 분사하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 4) 단계 이후, 재수화된 가교 히알루론산 수용액은 5 내지 60℃로 온도를 조정하고, 재가교 단계를 진행하는 것이다.
상기 5) 단계는 가교 히알루론산 겔의 단위체 100몰 당 가교제를 20몰 미만으로 혼합하는 것이다.
상기 6) 단계의 양친매성 용매는 25 내지 60℃이다.
상기 3) 내지 6) 단계를 1 내지 2회 추가로 더 진행하는 것일 수 있다.
본 발명의 가교 히알루론산 겔 및 이의 제조 방법은 우수한 생체 적합성 및 안정성을 나타내며, 체내 주입 시 지속기간이 향상된다.
또한, 고점도의 가교 히알루론산 겔 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 순도가 높아 생체 적합성이 우수하여 체내 주입 시 거부 반응 또는 염증 반응이 나타나지 않고, 기계적 강도가 우수하며, 체내 지속 시간이 길어 조직 수복 효과가 우수하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 가교 히알루론산 겔의 제조 방법에 관한 순서도이다.
본 명세서 또는 출원에 개시되어 있는 본 발명의 실시 예들에 대해서 특정한 구조적 내지 기능적 설명들은 단지 본 발명에 따른 실시 예를 설명하기 위한 목적으로 예시된 것으로, 본 발명에 따른 실시 예들은 다양한 형태로 실시될 수 있으며 본 명세서 또는 출원에 설명된 실시 예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
본 발명에 따른 실시 예는 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있으므로 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 본 명세서 또는 출원에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명의 개념에 따른 실시 예를 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
제1 및/또는 제2 등의 용어는 다양한 구성 요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성 요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안된다. 상기 용어들은 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소로부터 구별하는 목적으로만, 예컨대 본 발명의 개념에 따른 권리 범위로부터 이탈되지 않은 채, 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소는 제1 구성요소로도 명명될 수 있다.
어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "연결되어" 있다거나 "접속되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되어 있거나 또는 접속되어 있을 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다. 반면에, 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "직접 연결되어" 있다거나 "직접 접속되어" 있다고 언급된 때에는, 중간에 다른 구성요소가 존재하지 않는 것으로 이해되어야 할 것이다. 구성요소들 간의 관계를 설명하는 다른 표현들, 즉 "~사이에"와 "바로 ~사이에" 또는 "~에 이웃하는"과 "~에 직접 이웃하는" 등도 마찬가지로 해석되어야 한다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 설시된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미이다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미인 것으로 해석되어야 하며, 본 명세서에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 예를 설명함으로써, 본 발명을 상세히 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조부호는 동일한 부재를 나타낸다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 가교 히알루론산 겔의 제조방법에 대한 순서도이다.
본 발명의 목적은 순도가 높으며, 생체 적합도가 높아 생체 내에서 거부반응이나 염증반응을 거의 일으키지 않으며, 기계적 강도가 높아 통상의 방법으로 제조된 히알루론산 겔과 비교할 때 생체 내 지속기간이 높은 고점도 히알루론산 겔 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
상기 본 발명의 고순도 및 고점도의 가교 히알루론산 겔은 하기의 단계에 의해 제조될 수 있다.
1) 히알루론산 염을 알칼리 용액에 녹여 히알루론산 수용액을 제조하는 단계(S100)는, 분자량이 100,000 내지 4,000,000 Da인 히알루론산 고분자의 알칼리 염을 pH 9.0 내지 14.0인 알칼리 용액에 녹여 1 내지 10 중량% 농도(w/v)의 수용액을 만드는 것이다.
이때 교반 시, 교반기를 이용하여 수용액을 잘 저어주어 히알루론산 고분자의 용해를 돕는다.
상기 히알루론산의 알칼리 염은 예컨대 히알루론산의 소듐염이나 포타슘염을 포함할 수 있으며, 상기 히알루론산의 알칼리 염이 물에 용해되기 위해서는 물과 히알루론산이 수소결합을 형성하여야 한다.
따라서 물의 pH를 알칼리 상태로 조정하면, 히알루론산과 결합하여 염을 이룬 소듐 또는 포타슘이 쉽게 해리되어, 물과 히알루론산의 수소결합이 더 잘 일어남으로써 히알루론산의 용해 속도가 빨라질 수 있다.
상기 용해하고자 하는 히알루론산의 농도와 비례하여 수용액의 알칼리도를 높일수록 히알루론산의 용해 속도가 증가하게 된다.
다만, pH가 너무 높으면 즉 알칼리성이 커질수록, 히알루론산이 가수분해될 수 있어, 알칼리 용액의 농도는 pH 9.0 내지 12.0 정도의 조건에서 용해하고 용해가 완료된 후 가교제를 첨가하기 직전에 농축 알칼리 용액을 첨가하여 pH를 12 내지 14 정도로 높이는 것이 바람직하다.
상기 농축 알칼리 용액의 종류는 제한되지 않으나, 예를 들어, 수산화소듐 또는 수산화포타슘 용액을 사용할 수 있으나, 상기 예시에 국한되지 않고 통상의기술자가 히알루론산 수용액의 pH를 조정하기 위해 사용할 수 있는 알칼리 용액은 제한 없이 모두 사용 가능하다.
상기 히알루론산 수용액의 pH를 12 내지 14로 조정한 후 수용액의 온도를 조정한다. 가교결합의 속도는 온도에 영향을 받으므로 가교속도를 조절하기 위해 수용액의 온도를 10 내지 50℃에서 조정할 수 있다. 온도가 높으면 반응속도가 높아지나 반대로 수용액 중의 히알루론산의 분해 속도 역시 높아질 수 있다.
상기 설정된 온도에 도달하면 가교제를 투입하여 가교를 진행한다(S200). 투입된 가교제의 양에 비례하여 가교도가 높아지게 된다. 다만, 가교제가 너무 많이 첨가되면, 가교 반응 이외에 펜던트 형성율도 높아질 수 있다.
상기 가교가 완료된 히알루론산 겔은 양친매성(amphiphilic) 용매를 이용하여 정제 및 희석한다(S300).
상기 양친매성 용매는 2가의 중/저분자 알코올 또는 3가의 중/저분자 알코올을 정제수 또는 완충용액과 혼합하여 제조하는 것이다.
상기 제조된 양친매성 용매의 친수도가 너무 낮을 경우 가교 히알루론산 겔의 침전이 발생하여 정제가 어려워지는 문제가 발생할 수 있다.
상기 정제 및 희석의 효율을 높이기 위해 용매의 온도를 조절할 수 있으며, 25 내지 60℃로 용매의 온도를 조정할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 40 내지 45℃로 용매의 온도를 조절하여 공정을 진행한다. 상기 온도 범위 내에서 1차 정제 및 희석의 효율을 증가시킬 수 있다.
상기 2가의 중/저분자 알콜은, 예를 들어, 헥산디올(hexanediol), 햅탄디올(heptanediol) 및 옥탄디올(octanediol)이지만, 상기 예시에 국한되지 않고 제한 없이 모두 사용이 가능하다.
3가의 중/저분자 알콜은, 옥탄트리올(octanetriol), 노난트리올(nonanetriol), 데칸트리올(decanetriol)이지만, 상기 예시에 국한되지 않고 제한 없이 모두 사용이 가능하다.
상기 완충용액은, 인산완충용액(phosphate buffered saline), 탄산완충용액(carbonate buffer)이지만, 상기 예시에 국한되지 않고 통상의 완충 용액은 제한 없이 모두 사용이 가능하다. 상기 완충용액은 양친매성 용매의 pH를 일정하게 유지하여 가교 히알루론산의 안정성을 높일 수 있다.
또한 양친매성 용매를 이용하면 친수성 용매만을 이용할 때에 비해 정제/희석 시간을 유의미하게 단축할 수 있다.
상기 양친매성 용매를 이용한 정제/희석이 완료된 가교 히알루론산 겔을 기계적인 방법으로 분쇄하여 미세화(micronization)한다(S400).
상기 미세화 방법은, 금속 망필터(net filter)를 이용하거나, 균질기(homogenizer)를 이용하거나, 동결분쇄(freeze mill)등의 방법을 이용할 수 있으나, 상기 예시에 국한되지 않고, 가교 히알루론산 겔의 입자 크기를 미세화할 수 있는 방법은 모두 사용이 가능하다.
상기 미세화 공정을 진행한 가교 히알루론산 겔의 크기는 2mm 이하이며, 바람직하게는 0.5mm 이하의 크기로 분쇄하여 미세화 한다.
상기 미세화된 히알루론산 겔은 pH 9 내지 12의 알칼리 수용액과 혼합하여 재수화(rehydration) 한다(S500).
상기 재수화된 가교 히알루론산 겔 용액은 농축 알칼리 용액을 첨가하여 pH를 12 내지 14로 조정한다.
상기 재수화된 가교 히알루론산 용액은 교반하면서 용액 내부로 비활성 가스를 분사하여 용액의 밀도를 낮출 수 있다.
이때 상기 비활성 가스는 질소가스 또는 아르곤 가스이지만, 상기 예시에 국한되지 않고 통상의 비활성 가스는 제한 없이 모두 사용 가능하다.
상기 비활성 가스를 분사 시, 작은 관창(nozzle)을 이용하거나 다공 분사관(sparger)을 이용할 수 있다. 상기 다공분사관을 이용하는 것이 용액내로의 가스 분포 속도가 빨라 용액의 밀도를 빠르게 낮출 수 있다.
상기 비활성 가스를 분사하면 용액의 밀도가 낮아져 가교 속도를 늦출 수 있다. 또한, 가교 속도를 조절하기 위해 용액의 온도를 5 내지 60℃에서 조정할 수 있다.
상기 공정에 의해, 용액의 밀도와 온도가 조정된 가교 히알루론산 용액은 가교제를 적용하여 재가교 반응을 진행한다(S600).
상기 재 가교시에 적용되는 가교제의 함량은, 가교 히알루론산 겔의 단위체 100몰 당 가교제를 20몰 미만으로 혼합하는 것이며, 바람직하게는 5몰 미만으로 포함한다.
상기 가교제는, 디비닐술폰, 비스에폭시드, 알데히드류 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 상기 예시에 국한되지 않는다.
상기 재가교가 완료된 히알루론산 겔은 양친매성(amphiphilic) 용매를 이용하여 2차 정제 및 희석한다(S700).
상기 양친매성 용매는 1차 정제 및 희석 공정에서 사용된 양친매성 용매와 동일한 용매를 사용한다. 상기 양친매성 용매는 정제 및 희석의 효율을 높이기 위해 용매의 온도를 조절하며, 이때 용매의 온도는 25 내지 60℃로 조정될 수 있으며, 바람직하게는 40 내지 45℃이다.
이후, 상기 S300 내지 S600의 단계를 1 내지 2회 추가로 더 진행할 수 있다.
상기 S700의 2차 정제 및 희석 과정이 완료된 가교 히알루론산 겔 용액은 산성도를 pH 5.5 내지 8.5로 조정하고, 가교 히알루론산 겔 용액의 삼투압을 250 내지 350mOsm/kg으로 조정한다(S800). 삼투압과 산성도를 조정하기 위해, 인산완충용액(phosphate buffered saline) 또는 탄산완충용액 등을 이용할 수 있으나 상기 예시에 국한되지 않고, 가교 히알루론산 겔 용액의 삼투압 및 산성도의 조절이 가능한 완충용액은 제한 없이 모두 사용 가능하다.
이하 본 발명의 실시예 및 비교예들을 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 본 발명이 이들 실시예들로만 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
1000ml 용량의 비이커에 0.1mol/l 농도의 수산화소듐 용액 200ml을 넣고 상온에서 기계식 교반기로 교반하였다. 상기 수산화 소듐 용액에 극한점도 값이 1.8 m3/kg이고, 환산 분자량이 1,300,000 Da인 히알루론산 소듐 12g을 넣어 농도가 6중량% (w/v)인 히알루론산 수용액을 제조하였다.
상기 히알루론산 수용액에 농축 수산화소듐을 첨가하여 pH를 13으로 조정하였다.
상기 비이커를 가열하여 히알루론산 수용액의 온도를 35℃로 조정하였다.
상기 수용액은 가교제로 디비닐술폰 0.4g을 첨가하고 10분간 교반하여 반응을 진행하였다. 교반을 멈추고 30분간 반응을 지속하여 가교 히알루론산 겔을 제조하였다.
상기 가교 히알루론산 겔은 옥탄디올(1,8-octanediol) 400ml 및 정제수 400ml를 혼합한 온도가 40℃로 가열된 양친매성(amphiphilic) 용매 800ml를 넣고 30분간 1차 정제 및 희석하여 미반응 가교제의 잔량을 제거하고 가교 히알루론산 겔의 순도를 높였다.
상기 공정을 1회 반복하고 상기 양친매성 용매를 제거하였다.
여기에 미리 온도를 40℃로 가열해 둔 옥탄디올(1,8-octanediol) 100ml 및 인산완충용액(phosphate buffered saline) 700ml가 혼합된 양친매성(amphiphilic) 용매 800ml를 넣고 30분간 정제 및 희석하여 미반응된 가교제 잔량을 제거하고 가교 히알루론산 겔의 순도를 높였다. 1회 반복하고 용매를 제거하였다.
상기 정제 및 희석이 끝난 가교 히알루론산 겔을 동결분쇄기(freeze mill)을 이용하여 동결 분쇄하였다.
상기 분쇄된 히알루론산 겔에 pH 10의 희박 수산화소듐 용액 150ml을 첨가하고 30분간 교반하여 재수화(rehydration)하였다. 이후, 농축 수산화소듐 용액을 이용하여 재수화된 가교 히알루론산 겔 용액의 pH를 13으로 조정하였다.
상기 재수화된 가교 히알루론산 겔 수용액에 다공분사관을 넣고 상기 다공분사관을 통해 수용액 내부로 공급압력이 0.6kgf/㎠으로 조정된 압축질소를 분사하여 히알루론산 수용액의 밀도를 낮췄다. 이때, 수용액의 온도는 25℃로 조정하였다.
상기 히알루론산 수용액은 가교제로 디비닐술폰 0.3g을 첨가하고 10분간 교반하여 반응을 진행하였다. 상기 교반을 멈추고 30분간 반응을 지속하여 재가교를 완료하였다.
상기 재가교된 히알루론산 겔에 온도를 40℃로 가열해 둔 옥탄디올(1,8-octanediol) 400ml 및 정제수 400ml가 혼합된 양친매성(amphiphilic) 용매 800ml를 넣고, 30분간 2차 정제 및 희석하여 미반응된 가교제 잔량을 제거하고, 가교 히알루론산 겔의 순도를 높였다. 상기 과정을 1회 반복하고 양친매성 용매를 제거하였다.
이후, 온도를 40℃로 가열해 둔 옥탄디올(1,8-octanediol) 100ml 및 인산완충용액(phosphate buffered saline) 700ml가 혼합된 양친매성(amphiphilic) 용매 800ml를 넣고 30분간 정제 및 희석하여 미반응된 가교제 잔량을 제거하고 가교 히알루론산 겔의 순도를 높였다. 1회 반복하고 용매를 제거하였다.
상기 재가교 히알루론산 겔을 동결분쇄기(freeze mill)을 이용하여 다시 한번 동결 분쇄하였다. 이후 재수화, 재가교, 정제 및 희석 과정을 추가로 진행하였다
상기 2회 재가교된 히알루론산 겔은 인산완충용액 및 정제수를 이용하여 산도를 pH 5.5 내지 8.5로, 삼투압은 250 내지 350mOsm/kg으로 조정하고 최종 부피를 600ml로 맞췄다.
상기 가교 히알루론산 겔은 체 크기 150㎛인 100메시 스테인레스 넷필터를 이용하여 분쇄한 후 1cc 용량의 유리 프리필드시린지(prefilled syringe, Becton Dickinson)에 넣고, 고압 증기 멸균기를 이용하여 121℃에서 18분간 멸균하였다.
상기 멸균이 완료된 가교 히알루론산 겔의 성능 등을 확인하기 위해 농도, 압출력(extrusion force), 산도(pH), 삼투압(osmolality) 및 세포독성을 측정하였으며 그 측정 결과는 하기 표 1과 같다.
본 실시예에 따라 제조된 가교 히알루론산 겔의 농도 측정 방법은 대한민국약전 의약품각조 제1부 히알루론산나트륨 안과용주사액의 확인시험법에 준하여 측정하였으나, 본 실시예에서는 가교 히알루론산 겔임을 고려하여 전처리 과정 중 20% 황산을 사용하여 완전히 용해시킨 후 농도를 측정하였다.
상기 농도는 표준액과의 흡광도를 비교하여 환산하였으며, 흡광도는 분광광도계(OPTIZEN POP, KLAB)를 이용하여 측정하였다.
본 실시예에 따라 제조된 가교 히알루론산 겔의 성능을 확인하기 위한 압출력(extrusion force) 측정방법은 하기와 같다.
주사기 손잡이(finger grip) 및 주사기 밀대(plunger rod)가 조립된 주사기에 27 gauge normal wall 주사침(Becton Dickinson)을 체결한 후 이 주사기 세트를 Mark-10사의 G1089 픽스처(ISO 7886-1 Syringe Compression Fixture)에 위치시키고, 압축인장 강도측정기(push full gauge, M7-100, 50kgf, Mark-10)를 측정대(test stand, ESM303, Mark-10)에 고정 설치하여 분당 12mm의 속도로 주사기 밀대를 밀어 측정하였으며, 최대값 도달 5초 이후부터 25초까지 20초간의 평균값으로 측정하였다.
압출력 값은 하기 표 1과 같다.
본 실시예에 따라 제조된 멸균된 가교 히알루론산 겔의 pH는 pH meter(ORION StarA211, Thermo Scientific)를 이용하여 측정하였으며, 측정 전 pH 4.01, 7.00 및 10.01 표준용액을 이용하여 3점 캘리브래이션을 수행하였다.
본 실시예에 따라 제조된 멸균 가교 히알루론산의 삼투압은 삼투압 측정기(Osmometer, OSOMMAT 3000-D, Gonotec, GmbH)를 사용하여 측정하였으며, 측정 전 삼투압 0 및 400의 표준용액으로 캘리브래이션을 수행하였다.
본 실시예에 따라 제조된 가교 히알루론산 겔의 세포독성 여부를 다음과 같이 확인하였다. 멸균이 완료된 가교 히알루론산 겔 0.2ml를 취한 후 이를 2ml의 세포배양 배지(10부피%의 우태혈청이 포함된 DMEM)에 혼합하여 냉장실(4℃)에 7일간 유지하여, 가교 히알루론산 겔의 성분이 충분히 추출될 수 있게 하였다.
7일 후 3500rpm으로 30분간 원심분리를 하여 침전물을 제거하고 상층액만 취하여 이를 각각 6-well dish의 well에 넣었다.
각각의 well에 1X104 Chinese hamster ovary 세포(CHO-K1)를 접종하여 배양을 시작하였으며, 배양 시작 후 2일, 4일, 6일, 8일 후에 현미경 상에서 세포 밀도를 관찰하여 세포독성 여부를 확인하였다.
히알루론산 겔에 노출되지 않은 10부피%의 우태혈청이 포함된 DMEM에서 증식하는 세포군을 대조구로 하였다.
또한 본 실시예에 따라 제조된 가교 히알루론산 겔의 생체조직내 지속 성능을 확인하기 위해 다음과 같이 시험하였다.
상기 시험은 토끼(New Zealand White Rabbit)를 이용하였으며, 9 마리의 수컷 토끼에 가교 히알루론산 겔을 각 동물 당 0.6ml씩 4군데에 피내 주사하고, 주사 후 4주, 8주 및 16주째에 3마리씩 안락사 시킨 후 부검을 실시하고 투여 부위를 적출하여 투여 부위의 가교 히알루론산 겔의 잔재 여부를 확인하였다.
잔존 가교 히알루론산 겔은 버어니어캘리퍼스(AND AD-5763-200)를 이용하여 크기를 측정하였다.
또한 전 시험기간 동안 일반증상을 관찰하여 이상 여부를 확인하였고, 4주, 8주 및 16주째에 부검 실시 전에 체중을 측정하였다.
투여 부위의 크기에 대한 자료는 one way ANOVA test를 실시하여 유의성 관찰 후 사후검정으로 Scheffe 다중검정을 실시하였으며 통계분석은 SPSS 통계프로그램을 사용하였다.
토끼 생체내 가교 히알루론산의 잔류물 크기, 일반증상 및 체중 변화에 대한 결과는 하기 표 2 내지 4와 같다.
[실시예 2]
옥탄디올(1,8-octanediol) 400ml와 정제수 400ml가 혼합된 양친매성(amphiphilic) 용매 800ml 대신 옥탄디올 300ml 및 정제수 500ml가 혼합된 양친매성 용매를 이용하였고, 옥탄디올(1,8-octanediol) 100ml 및 인산완충용액(phosphate buffered saline) 700ml가 혼합된 양친매성(amphiphilic) 용매 800ml에 대신 옥탄디올(1,8-octanediol) 200ml 및 인산완충용액(phosphate buffered saline) 600ml가 혼합된 양친매성(amphiphilic) 용매 800ml를 이용한 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 제조하였다.
[실시예 3]
옥탄디올(1,8-octanediol) 400ml 및 정제수 400ml가 혼합된 양친매성(amphiphilic) 용매 800ml 대신 헥산디올(1,6-hexanediol) 400ml 및 정제수 400ml가 혼합된 양친매성 용매를 이용하였고, 옥탄디올(1,8-octanediol) 100ml 및 인산완충용액(phosphate buffered saline) 700ml가 혼합된 양친매성(amphiphilic) 용매 800ml 대신 헥산디올 200ml 및 인산완충용액(phosphate buffered saline) 600ml가 혼합된 양친매성(amphiphilic) 용매 800ml를 이용한 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 제조하였다.
[실시예 4 내지 6]
실시예 1 내지 3에 있어서 재가교 및 정제 과정을 3회 실시한 것을 제외하고 실시예 1 내지 3과 동일한 방식으로 제조하였다.
[실시예 7 내지 9]
실시예 1 내지 3에 있어서 재가교 및 정제 과정을 1회 실시한 것을 제외하고 실시예 1 내지 3과 동일한 방식으로 제조하였다.
[비교예 1 내지 3]
실시예 1 내지 3에 있어서 재가교 및 정제 과정을 실시하지 않고 최초 가교만을 수행하였으며 가교제는 디비닐술폰 1.0g을 이용한 것을 제외하고 실시예 1 내지 3과 동일한 방식으로 제조하였다.
[비교예 4]
양친매성 용매 대신 인산완충용액을 사용한 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 제조하였다.
[비교예 5]
양친매성 용매 대신 인산완충용액을 사용한 것을 제외하고 실시예 4와 동일하게 제조하였다.
[비교예 6]
양친매성 용매 대신 인산완충용액을 사용한 것을 제외하고 실시예 7과 동일하게 제조하였다.
실시예 및 비교예의 히알루론산 겔의 농도, 압출력, 산도, 삼투압 및 세포독성을 평가한 결과는 표 1과 같다.
| 히알루론산 농도 (mg/ml) | 압출력(N) | pH | 삼투압 (mOsm/kg) | 세포독성 (O: 있음, X: 없음) | |
| 실시예1 | 19.9 | 82.2 | 7.2 | 296 | X |
| 실시예2 | 19.8 | 82.8 | 7.2 | 296 | X |
| 실시예3 | 20.1 | 80.7 | 7.3 | 299 | X |
| 실시예4 | 20.6 | 93.5 | 7.4 | 298 | X |
| 실시예5 | 19.8 | 94.8 | 7.2 | 302 | X |
| 실시예6 | 19.9 | 93.9 | 7.4 | 301 | X |
| 실시예7 | 20.2 | 72.7 | 7.2 | 295 | X |
| 실시예8 | 20.4 | 69.5 | 7.4 | 288 | X |
| 실시예9 | 20.4 | 70.1 | 7.3 | 296 | X |
| 비교예1 | 20.2 | 48.4 | 7.2 | 306 | X |
| 비교예2 | 19.7 | 49.8 | 7.1 | 287 | X |
| 비교예3 | 19.8 | 45.9 | 7.3 | 282 | X |
| 비교예4 | 20.7 | 81.9 | 7.2 | 296 | O |
| 비교예5 | 20.1 | 96.7 | 7.4 | 273 | O |
| 비교예6 | 20.3 | 72.2 | 7.2 | 285 | O |
상기 실험 결과에 따르면, 본 발명의 실시예 1 내지 9는 세포 독성이 나타나지 않고, 농도, 압출력 및 삼투압 조건이 우수함을 확인하였다.
반면, 비교예 1 내지 3은 세포 독성은 문제되지 않으나, 압출력 및 삼투압에서 실시예에 비해 효과가 떨어짐을 확인하였다.
또한, 비교예 4 내지 6은 압출력 및 삼투압에서 실시예와 비슷한 수준을 나타냈으나, 세포독성이 문제되어 체내 주입이 불가하다고 할 것이다.
본 발명의 가교 히알루론산 겔을 투여한 후, 투여 부위에 대한 시간의 경과 후, 입자의 크기를 확인한 결과는 하기 표 2와 같다.
| 크기 | ||||
| 부검일 | Vertical Diameter | Horizontal Diameter | ||
| 실시예1 | Group 1 | 4주 | 20.11±1.90a | 20.02 ± 2.59 |
| Group 2 | 8주 | 21.04 ± 3.10 | 20.42 ± 1.72 | |
| Gropu 3 | 16주 | 21.08 ± 2.58 | 20.50 ± 1.83 | |
| 비교예1 | 대조군1 | 4주 | 18.27 ± 1.84 | 18.65 ± 2.79 |
| 대조군2 | 8주 | 15.82 ± 2.46 | 16.08 ± 1.95 | |
| 대조군3 | 16주 | 11.68 ± 2.11 | 11.76 ± 2.44 | |
a: 평균값 ± 표준편차, 단위: mm상기 실험 결과에 따르면, 실시예 1은 16주 경과 후에도 입자의 직경에서 큰 차이가 나타나지 않음을 확인할 수 있어, 체내 가교 히알루론산의 주입에 의한 효과가 장시간 유지됨을 확인할 수 있으나, 비교예의 경우에는 16주 경과 후 직경이 급격하게 작아진 것을 확인할 수 있어, 체내에서의 분해 속도에서 차이가 현저히 나타남을 확인하였다.
본 발명의 가교 히알루론산 겔을 투여한 후, 이상 여부 및 일반증상을 확인한 실험 결과는 하기 표 3과 같다.
| 부검일 | Mortality (dead/total) | 일반증상 | ||
| 실시예1 |
Group 1 | 4주 | 0 (0/3) | NAD |
| Group 2 | 8주 | 0 (0/3) | NAD | |
| Gropu 3 | 16주 | 0 (0/3) | NAD | |
| 비교예1 |
대조군1 | 4주 | 0 (0/1) | NAD |
| 대조군2 | 8주 | 0 (0/1) | NAD | |
| 대조군3 | 16주 | 0 (0/1) | NAD |
NAD: No abnormality detected실시예 1 및 비교예 1의 가교 히알루론산 겔 모두 이상 여부 및 일반 증상은 나타나지 않는 것으로 확인되었다.
체중 변화 (단위: g)의 측정 결과는 하기 표 4와 같다.
| 체중 | |||||
| Group | 주사일 | 4주 | 8주 | 16주 | |
| 실시예1 |
1 | 2150 ± 82.1a | 2928.1 ± 131.6 | ||
| 2 | 2217.5 ± 31.6 | 2957.8 ± 143.6 | 3308.2 ± 248.9 | ||
| 3 | 2387.3 ± 109.3 | 2806.5 ± 89.1 | 3307.2 ± 89.1 | 3978.8 ± 133.5 | |
| 비교예1 |
대조군1 | 2204 | 2898 | ||
| 대조군2 | 2196 | 2933 | 3297 | ||
| 대조군3 | 2271 | 2984 | 3313 | 3929 | |
a: 평균값 ± 표준편차실시예 1 및 비교예 1의 가교 히알루론산 겔 모두 체중 변화에 큰 차이가 나타나지 않음을 확인하였다.
이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (15)
- 삭제
- 삭제
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- 삭제
- 1) 히알루론산 염을 알칼리 용액에 녹여 히알루론산 수용액을 제조하는 단계;
2) 상기 1) 단계에서 제조된 수용액에 가교제를 혼합하여 히알루론산의 가교 반응을 진행하는 단계;
3) 상기 히알루론산 가교물에 남은 미가교된 가교제 단량체를 양친매성 용매를 이용하여 1차 정제하는 단계;
3) 상기 정제된 가교 히알루론산 겔을 미세화 하는 단계;
4) 상기 미세화된 히알루론산 겔을 재수화하여 재수화된 가교 히알루론산 수용액을 제조하는 단계;
5) 상기 재수화된 히알루론산 겔 수용액에 가교제를 혼합하여 재가교 하는 단계;
6) 상기 재가교된 히알루론산 가교물에 남은 미가교된 가교제 단량체를 양친매성 용매로 2차 정제하는 단계; 및
7) 상기 정제된 히알루론산 겔의 삼투압 및 pH를 조정하는 단계를 포함하는
고점도 및 고순도의 가교 히알루론산 겔의 제조방법. - 제5항에 있어서,
상기 1) 단계 이후, 수용액의 pH를 12 내지 14로 조정하고, 수용액의 온도는 10 내지 50℃로 조정한 후, 2) 단계의 가교제를 혼합하는 것인
고점도 및 고순도의 가교 히알루론산 겔의 제조방법. - 제5항에 있어서,
상기 가교제는 디비닐술폰, 비스에폭시드 및 이들의 혼합으로부터 이루어진 군으로 선택되는
고점도 및 고순도의 가교 히알루론산 겔의 제조방법. - 제5항에 있어서,
상기 양친성 용매는 2가 알코올 또는 3가 알코올을 정제수 또는 완충용액에 혼합하여 제조하는 것인
고점도 및 고순도의 가교 히알루론산 겔의 제조방법. - 제5항에 있어서,
상기 3) 단계는 가교 히알루론산 겔을 2mm 이하로 미세화하는 것인
고점도 및 고순도의 가교 히알루론산 겔의 제조방법. - 제5항에 있어서,
상기 4) 단계는 알칼리 수용액을 혼합하여 재수화하는 단계인
고점도 및 고순도의 가교 히알루론산 겔의 제조방법. - 제5항에 있어서,
상기 4) 단계는 재수화된 가교 히알루론산 수용액에 불활성 기체를 분사하는 단계를 추가로 포함하는
고점도 및 고순도의 가교 히알루론산 겔의 제조방법. - 제5항에 있어서,
상기 4) 단계 이후, 재수화된 가교 히알루론산 수용액은 5 내지 60℃로 온도를 조정하고, 재가교 단계를 진행하는
고점도 및 고순도의 가교 히알루론산 겔의 제조방법. - 제5항에 있어서,
상기 5) 단계는 가교 히알루론산 겔의 단위체 100몰 당 가교제를 20몰 미만으로 혼합하는
고점도 및 고순도의 가교 히알루론산 겔의 제조방법. - 제5항에 있어서,
상기 6) 단계의 양친매성 용매는 25 내지 60℃인
고점도 및 고순도의 가교 히알루론산 겔의 제조방법. - 제5항에 있어서,
상기 3) 내지 6) 단계를 1 내지 2회 추가로 더 진행하는
고점도 및 고순도의 가교 히알루론산 겔의 제조방법.
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