KR20060008906A

KR20060008906A - 가교된 다당류 조성물

Info

Publication number: KR20060008906A
Application number: KR1020057019805A
Authority: KR
Inventors: 사이먼 샬롯 본윌러; 죠프리 케네쓰 헤버
Original assignee: 울트라슈티칼즈 알 앤드 디 프로프라이어터리 리미티드
Priority date: 2003-04-17
Filing date: 2004-04-16
Publication date: 2006-01-27
Also published as: US20070026070A1; US20140105852A1; WO2004092223A1; CN100509858C; DE602004028455D1; ATE476450T1; ES2349924T3; EP1613663B1; CN1774450A; JP2008133474A; US8877243B2; CA2522232A1; EP1613663A4; MXPA05011098A; CA2522232C; BRPI0409890A; AU2003901834A0; EP1613663A1; JP2006523731A

Abstract

본 발명은 염기성 조건 하에서 가교된 다당류 젤의 제조 방법을 제공한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 염기성 조건 하에서 가교된 히알루론산 젤을 형성하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 얻어진 젤은 분해 특성이 향상되고 다양한 의약 및 화장품 용도로 유용하다.

다당류 조성물, 가교, 염기성 조건, 히알루론산

Description

가교된 다당류 조성물{CROSS-LINKED POLYSACCHARIDE COMPOSITION}

본 발명은 가교된 다당류 조성물, 그의 제조 방법 및 화장품, 의약 및 약학 분야에 있어서의 그의 용도에 관한 것이다.

히알루론산(HA)은 글리코사미노글리칸으로 알려진 폴리머류에 속한다. HA는 장쇄 선형 다당류로서, 대개 (C₁₄H₂₀NA₁₁)_n(식 중, n은 HA 소스 및 HA의 분리 방법에 따라 달라질 수 있음)의 분자식을 갖는 나트륨염으로서 제공된다. 14 x 10⁶까지의 분자량을 갖는 HA가 보고된 바 있다.

HA와 이의 염은 사람의 제대(탯줄), 닭벼슬 및 척추동물의 거의 모든 연결 매트릭스를 비롯한 다양한 소스로부터 분리될 수 있다. HA는 또한 스트렙토코커스와 같은 세균의 캡슐 성분이기도 하기 때문에 미국특허 제 5,411,874 (Fermentech Ltd.)에 보고된 바와 같은 발효법에 의해 얻어질 수도 있다.

HA는 비면역원성이기 때문에 의약용으로 대단한 잠재력이 있다. HA의 점탄성으로 인해, 분자량이 큰 (100만 초과) HA는 상처 치료, 안과 수술, 소아 수술 및 약물 전달을 비롯한 다양한 임상 분야에 특히 유용한 것으로 알려져 왔다. HA는 또한 화장품 용도를 비롯한 다양한 비의학 분야에도 잠재적으로 유용하다.

그러나, 사람에게 HA를 투여하는데 있어서 한가지 단점은 HA가 히알루로니다제와 같은 효소에 의해 분해되어 인체 내에서 자유 라디칼로 발견된다는 것이다. 뿐만 아니라, HA는 실온의 물에서 녹는데, 이는 특정 용도에 대한 HA의 적합성을 저하시키는 요인이 될 수 있다.

가장 안정항 유형의 HA를 제조하기 위해 여러가지 시도, 특히 HA 분자를 가교시키려는 시도가 행해져 왔다. 예컨대, 히드록실기를 에테르 결합을 통해 가교시키고 카르복실기는 에스테르 결합을 통해 가교시켰다. HA는 pH 9 미만에서 가교시켜왔는데, 이 pH에서는 카르복실기를 통해 에스테르 결합이 형성되고, pH가 9를 초과할 경우에는 히드록실기를 통해 에테르 결합이 형성된다. 본 발명자들은 에테르 결합이 보다 적합하다는 것을 발견하였는데, 이는 에테르 결합이 생리적 분해에 대해 보다 큰 내성을 갖기 때문이다.

HA 젤을 가교시키는 다양한 방법이 여러가지 문헌에 보고되어 왔다. 예컨대, 미국 특허 4,582,865호 (Biomatrix Inc.)는 가교제로서 디비닐 설폰을 이용하여 HA를 가교시킴으로써 (자체적으로 또는 다른 친수성 폴리머와 혼합되어) 형성된 HA의 가교된 젤에 관해 설명하고 있다.

미국 특허 제 5,827,937호 (Agerup)는 다당류 수용액을 형성하고, 다관능성 가교제의 존재 하에 가교를 개시한 다음, 젤화가 일어나기 전에 가교 반응이 종결되는 것을 입체적으로 방해한 다음 (예컨대, 용액을 희석함으로써), 입체적 방해 조건을 재도입하여 (예컨대, 용액을 증발시킴으로써), 점탄성 젤이 형성되도록 계속 가교시키는 공정에 의해 제조된 다당류 젤 조성물을 보고하고 있다. 이 방법에 서 가교는 알칼리 조건 또는 산성 조건 하에서 수행될 수 있다.

WO00/46253 (Fermentech Ltd.)에는 두가지 다른 유형의 가교 결합에 의해 HA를 다른 폴리머와 가교시키는 것이 설명되어 있다. 여러가지 관능기를 통해 가교시킴으로써 다양한 종류의 결합이 형성된다. 예컨대, 한가지 결합 유형은 히드록실기를 경유한 가교에 의해 형성될 수 있고 다른 관능성 결합은 카르복실기를 통한 가교에 의해 형성될 수 있다.

WO98/07898호에는 다당류를 다관능성 에폭사이드와 반응시켜, 과량의 에폭사이드를 제거하고 건조 공정을 이용하여 다당류를 필름, 분말품 또는 유사한 건조품으로 가교시키는 것이 설명되어 있다.

미국특허 제4,963,666호 (Pharmacia)에는 알칼리 조건 하에서 다당류를 저농도의 가교제로 일치환시켜 (monosubstitued) 에테르 결합을 형성하는 공정이 보고되어 있다. 이 혼합물을 pH 5.5에서 세정하여 에스테르 결합을 유발한 다음, 일례에서는, 서서히 증발 농축시켜 에스테르 결합과의 가교를 종결시키고 있다. 또 다른 예에서는, 암모니아 첨가에 의해 pH를 증가시킨 다음, 서서히 증발시켜 주로 에테르 결합과 몇가지 에스테르 결합과의 가교를 완결하고 있다.

가교된 HA의 특성을 향상시키기 위한 여러가지 시도가 행해져왓지만, 환자에게 투여되었을 때 우수한 분해 특성을 나타내는 가교된 HA 젤을 제공한다면 매우 유리할 것이다.

발명의 개시

일례에서, 본 발명은 가교된 다당류 젤을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 먼저, 알칼리성 매질과 혼합된 다당류를 이관능성 또는 다관능성 에폭사이드와 접촉시켜, 에폭사이드가 실질적으로 에테르 결합에 의해 다당류에 결합된, 에폭시 가교된 다당류를 형성한다. 알칼리성 매질로부터 에폭사이드를 제거함이 없이, 이 에폭시 가교된 다당류를 건조시킨다. 얻어진 건조된 가교 다당류 매트릭스를, 물과 섞이는 적절한 용매로 세정하고 산성 용매로 처리하여 가교된 다당류 젤을 얻을 수 있다.

본 발명의 구체예에서는 다양한 다당류 출발 물질이 이용될 수 있다. 적절한 다당류로는 HA, 펙틴, 잔탄 또는 알긴산, 뿐만 아니라, 카르복시메틸 덱스트란, 카르복시메틸 전분 또는 카르복시메틸 셀룰로스의 음이온계 유도체를 들 수 있다. HA는 특히 적합한 출발 물질이다. 가교제로서 사용가능한 적절한 에폭사이드에는 1,4-부탄디올 에테르, 1,2-에탄디올 디글리시딜 에테르 및/또는 에폭시-치환된 펜타에리쓰리톨이 포함된다. 그러나, 다른 에폭사이드들 역시 본 발명에서 사용되는데 적합할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 설명된 방법으로 제조된 가교된 다당류 젤을 제공한다. 이러한 젤은 환자에게 투여될 경우 향상된 분해 특성을 나타낼 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 분해에 대해 내성을 나타내는데 충분히 가교된 1,4-부탄디올글리시딜 에테르와의 에테르 결합에 의해 실질적으로 가교된 HA를 비롯한 생체적합성 젤을 제공한다.

본 명세서에서, "분해에 대해 내성을 나타내는데 충분히 가교된 (sufficiently cross-linked to resist degradation)"이라는 표현은 장기간 동안 생리적 조건 하에서 히알루로니다제의 공격에도 젤이 비교적 안정하다는 것을 의미하거나, 또는 작은 게이지의 바늘로부터 사출 또는 추출되는 것도 관용할 수 있음을 의미하는 것이다. 일례에서, 본 발명자들은 15 mg/ml 농도의 젤 0.4 ml를 히알루로니다제 0.5 mg과 포스페이트 완충 염수 3 ml와 결합시켜 37℃ 이상에서 2일간 방치시켰을 경우, 우론산을 75 퍼센트 미만의 양으로 방출하는 생체적합성 젤을 생산할 수 있었다. 우론산 방출은 실시예에 보고된 UV 흡수 기술에 의해 측정하였다. 특정 구체예에서, 젤은 우론산을 70 퍼센트 이하로 방출시킬 수 있으며, 더욱 구체적으로는 전술한 조건 하에서 우론산을 65 퍼센트 이하로 방출시킨다.

첫번째 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 가교된 다당류 젤의 제조 방법을 제공한다:

(a) 알칼리성 매질에 혼합된 다당류를 이관능기 또는 다관능기 에폭사이드와 접촉시켜, 에테르 결합에 의해 에폭사이드가 실질적으로 다당류에 결합되어 있는, 기본적으로 에폭시 가교된 다당류를 제공하는 공정;

(b) 알칼리성 매질로부터 에폭사이드를 실질적으로 제거함이 없이, 에폭시 가교된 다당류를 건조시켜 가교된 다당류 매트릭스를 형성하는 공정;

(c) 가교된 다당류 매트릭스를 임의로, 물과 섞이는 용매로 세정하는 공정; 및

(d) 가교된 다당류 매트릭스를 산성 용매로 중화시켜 가교된 다당류 젤을 형성하는 공정.

두번째 측면에서 본 발명은, 본 발명의 첫번째 측면에 따른 방법으로 제조된 히알루로니다제 분해에 실질적으로 내성을 나타내는 가교된 다당류 젤을 제공한다.

세번째 측면에서 본 발명은 생체적합성 젤을 제공하는데, 이 젤은 실질적으로 에테르 결합에 의해 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르와 가교된 히알루론산을 함유함으로 해서, 젤이 실질적으로 분해되지 않도록 충분히 가교되어 있는 것이다.

네번째 측면에서, 본 발명은 본 발명의 두번째 측면에 따른 가교된 다당류 젤; 생물학적 활성 물빌; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학적 조성물을 제공한다.

다섯번째 측면에서, 본 발명은 본 발명의 세번째 측면에 따른 생체적합성 젤; 생물학적 활성 물질; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학적 조성물을 제공한다.

여섯번째 측면에서, 본 발명은 본 발명의 네번째 측면에 따른 젤의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하여 되는, 환자에 있어서 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

일곱번째 측면에서, 본 발명은 본 발명의 다섯번째 측면에 따른 약학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하여 되는, 환자에 있어서 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

여덟번째 측면에서, 본 발명은 질병의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상자에 있어서 그러한 질병을 치료 또는 예방하기 위한 의약을 제조하는데 있어서의, 본 발명의 세번째 측면에 따른 젤의 용도를 제공한다.

아홉번째 측면에서, 본 발명은 본 발명은 질병의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상자에 있어서 그러한 질병을 치료 또는 예방하기 위한 의약을 제조하는데 있어서의, 본 발명의 네번째 측면에 따른 약학적 조성물의 용도를 제공한다.

명세서 전반에 걸쳐, 달리 언급할 필요가 없는 한, "포함한다, 함유한다 (comprise)"라는 표현, 또는 "포함하다, 함유하다 (comprises)" 또는 "포함하는, 함유하는 (comprising)"와 같은 그의 변형 표현은 그와 관련하여 진술된 요소, 숫자 또는 공정이나 요소, 숫자 또는 공정의 그룹을 포함하면서, 그 밖의 다른 가능한 요소, 숫자 또는 공정, 또는 요소, 숫자 또는 공정의 그룹을 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에 포함된 문헌, 거동, 재료, 장치, 물품 등에 관한 모든 논의는 본 발명의 설명 목적을 위해 제공된 것이다. 이러한 사항들 모두 또는 이러한 사항중 어느 것이라도 본 출원발명의 각 청구항의 우선일 전 오스트레일리아에 존재하고 있던 본 발명 분야의 종래 기술의 기반이나 일반 상식에 속한다는 것을 인정하는 것으로 받아들여져서는 아니된다.

본 발명의 보다 명료한 이해를 돕기 위해, 바람직한 구체예를 첨부된 도면과 실시예를 참고로 이하에 제시한다.

일례에서, 본 발명은 다당류 가교 젤의 제조 방법을 제공한다. 이 방법은 일반적으로 다음의 공정, 즉:

(a) 에폭사이드가 실질적으로 에테르 결합에 의해 다당류에 결합되어 있는, 기본적으로 가교된 다당류를 형성하기 위하여, 알칼리성 매질 중에서 다당류 출발 물질을 이관능기 또는 다관능기 에폭사이드와 접촉시켜 에폭시 가교된 다당류를 형성하는 공정;

(b) 알칼리성 매질로부터 에폭사이드를 실질적으로 제거하지 않고, 에폭시 가교된 다당류를 건조시키는 공정;

(c) 건조된 에폭시 가교된 다당류를 물과 섞이는 용매로 임의로 세정하여 가교된 다당류 매트릭스를 형성하는 공정; 및

(d) 에폭시 가교된 다당류를 산성 매질로 중화시켜 가교된 다당류 젤을 형성하는 공정

을 포함하여 이루어진다.

에폭사이드 가교된 다당류 젤이 전술한 방식으로 형성될 경우, 종래의 가교된 다당류 젤에 비교할 때, 젤의 분해에 대한 내성이 향상되는 것으로 밝혀졌다.

다당류 출발 물질은 HA, 펙틴, 잔탄 또는 알긴산과 같은 광범위한 적절한 자연발생적 카르복실레이트 함유 다당류 뿐만 아니라, 카르복시메틸 셀룰로스, 카르복시메틸 덱스트란, 또는 카르복시메틸 전분과 같은 중성 다당류의 음이온성 유도체 중에서 선택될 수 있다.

일례에서, 다당류 출발 물질로서 HA를 사용한다. HA는 다양한 소스, 예컨대 닭벼슬로부터 추출할 수 있다. 어떤 구체예에서는, 다양한 분자량의 유기 물질을 추출하여 얻어지거나 그로부터 직접 얻어진, 내재성 산 (integral acids)의 히알루론산 구성 분자 분획을 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 분획들은 다양한 통상의 공정, 예컨대, 가수분해, 산화, 효소 화학약품 또는 기계적 또는 조사 공정과 같은 물리적 공정에 의해 얻을 수 있다. 얻어진 분자 분획들의 분리 및 정제는 분자 여과에 의해 달성될 수 있다. 적절한 정제된 HA 분획의 예로서, Balaza가 "Healon" -- A guide to its use in Ophthalmic Surgery -- D. Miller & R. Stegmann, 편집, John Wiley & Sons N.Y. 81983; p.5에 보고한 "비염증성-NIF-NaHA 소듐 히알루로네이트"를 들 수 있다.

기타 적절한 HA 출발 물질로는 "Hyalastine" 브랜드와 "Hyalectin" 브랜드 HA를 들 수 있다. Hyalastine 분획은 평균 분자량이 약 50,000 내지 100,000인 반면, Hyalectin 분획의 평균 분자량은 약 500,000 내지 730,000이다. 이들 두 분획의 결합 분획 역시 분리되어 약 250,000 내지 약 350,000의 평균 분자량을 갖는 것으로 특징화된 바 있다. 이러한 결합 분획은 특정 출발 물질 중에서 히알루론산 총 수율 80%로 얻어질 수 있는 반면, Hyalectin은 출발 HA의 30% 수율, Hyalastine 분획은 출발 HA의 50% 수율로 얻어질 수 있다. 이덜 분획들의 조제 방법은 유럽특허 공개 No. 0138572A3에 개시되어 있다. 기타 적절한 HA 출발 물질로는 후술되는 실시예에서 보고된 섬유상 및 분말상 HA 물질을 들 수 있다.

다당류는 저지방족 (lower aliphatic) 에폭사이드 또는 이들의 대응하는 에피할로히드린과 같이, 이관능기 또는 다관능기 에폭사이드를 비롯한 여러가지 적절한 다관능성 가교 에폭사이드에 의해 가교될 수 있다. 적절한 에폭사이드의 특정 예로는 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (BDDE), 1,2-에탄디올 디글리시딜 에테르, 에폭시 치환된 펜타에리트리톨 (예컨대, SHELL 162) 및 그의 에피할로히드린을 들 수 있다. 일례에서, 다관능기 가교제에는 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르가 포함된다.

다당류 출발 물질은 알칼리성 매질 중에서 가교제와 결합될 수 있다. 일례에서, 약 1 내지 약 5 w/v 퍼센트, 더욱 구체적으로는 약 4 w/v 퍼센트의 다당류를 알칼리성 매질에 첨가할 수 있다. 알칼리성 매질은 수산화나트륨 또는 기타 적절한 염기성 물질을 이용하여 형성될 수 있다. 수산화나트륨 또는 기타 염기성 물질의 농도는 총 혼합물의 약 0.1 내지 약 1 w/v 퍼센트, 더욱 구체적으로는 약 1%이다. 가교제는 가교제 농도가 약 0.05 내지 약 0.5%, 더욱 구체적으로는 약 0.1%가 되도록 알칼리성 혼합물에 첨가한다. 알칼리성 매질의 pH는 약 9 내지 12, 더욱 구체적으로는 약 9일 수 있다.

얻어진 알칼리성 혼합물을 다당류가 에폭사이드과 가교하는 것을 촉진하는 조건 하에서 인큐베이션시킬 수 있다. 예컨대, 이 혼합물은 약 45℃에서 약 2시간 수조 중에서 인큐베이션시킬 수 있다. 이러한 조건 하에서 가교된 HA는 산성 조건 하에서 형성된 에스테르 결합에 비해 생리적 분해에 일반적으로 더 큰 내성을 나타내는 에테르 결합을 실질적으로 포함한다.

인큐베이션 후, 가교 혼합물을 상법에 따라 건조시켜 다당류 매트릭스를 형성시킨다. 예컨대, 이 가교 혼합물을 격렬히 교반하고 약 35℃ 내지 약 45℃에서 약 1.5시간 동안 고압 하에서 물을 제거함으로써, 가교 혼합물을 건조시킬 수 있다. 건조 후, 다당류 매트릭스를 물과 섞이는 용매, 예컨대 이소프로필 알코올/물 공용매로 수신 동안 세정할 수 있다. 마지막으로, 이렇게 수세된 매트릭스를 산성 매질로 중화시켜 가교된 다당류 젤을 얻는다. 예컨대, 이 매트릭스를 물 중 1-2 퍼센트 아세트산 용액으로 처리하여 가교된 다당류 젤을 형성할 수 있다. 임의로, 가교된 다당류 젤을 포스페이트 완충염수 혼합물로 부가 처리함으로써, 젤의 점도를 조정할 수도 있다.

후술되는 실시예에 설명되겠지만, 전술한 방법에 의해 형성된 다당류 젤은 환자에게 투여될 경우, 분해되지 않을 중도로 충분히 가교되어 있다. 젤의 이와 같은 개선된 분해 특성으로 인해, 결과적인 가교된 다당류 젤은 다양한 용도로 사용될 수 있다. 일례로서, 가교된 다당류 젤을 조직 증가, 관절염 치료, 조직 부착 치료에 사용할 수 있고, 포유동물 세포를 피복하여 면역원성을 감소시키는데 이용할 수도 있다. 또 다른 예에서는, 가교된 다당류 젤을 화장 분야, 교정용 임플란트, 호르몬 대체요법, 호르몬 치료법, 피임, 관절 윤활, 및 눈수술에 이용할 수 있다.

유리하게도, 본 발명의 가교된 다당류는 좁은 게이지 바늘을 통해 사출된 후, 실질적으로 분해되지 않고 남아있다. 만일 젤이 전단 응력에 대한 저항을 갖지 못할 경우에는, 바늘을 통한 사출에 의해 젤이 보다 적은 입자들로 분해될 수 있다. 특히, 본 발명의 구체예의 가교된 다당류 젤은 27, 30, 또는 32 게이지 바늘과 같은 적은 게이지 바늘을 통한 사출 후에도 분해되지 않는다. 따라서, 이러한 젤은 용액이나 젤의 구조적 본질에 대한 실질적 훼손 없이 조직이나 피부 내로 주사하기에 특히 적합하다.

또 다른 구체예에서, 가교된 다당류 젤은 생물학적 활성 물질과 결합시켜 환자에게 투여할 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 생물학적 활성 물질로는 호르몬, 시토카인, 백신, 세포, 조직 증가 물질 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다.적절한 조직 증가 물질의 예로는 콜라겐, 전분, 덱스타노머, 폴리락티드, 폴리 베타 히드록시부티레이트, 및/또는 이들의 공중합체를 들 수 있다.

생물학저거 활성 물질의 부가적인 예가 미국특허 제5,676,964호에 예시되어 있으며 이 문헌은 적절한 생물학적 활성 물질, 이들 물질을 포함하는 가교된 다당류 젤의 제조 방법 및 생물학적 활성 물질의 투여 방법의 설명 목적을 위해 본문에 통합된다.

적절한 생물학적 활성 물질에는 다양한 알칼로이드, 펩타이드, 페노티아진 벤조디아제핀, 티오잔텐, 호르몬, 비타민, 항경련제, 항정신병제, 항구토제, 마취제수면제, 식욕감퇴제, 진정제, 근육이완제, 심장혈관확장제, 항신생물제, 항생제, 항균제, 항바이러스제, 항말라리아제, 카르보닐 안하이드라제 억제제, 비스테로이드계 항염제, 혈관수축제, 콜린성 촉진제, 콜린성 길항제, 아드레날린 촉진제, 아드레날린 길항제, 마약 길항제가 포함된다.

생물학적 활성 물질은 다당류 출발 물질과 생물학적 활성 물질을 물리적으로 혼합함으로써 본 발명의 저적한 가교된 다당류 젤과 결합시킬 수 있다. 이 생물학적 활성 물질은 고형으로, 예컨대 동결 건조된 분말 또는 용액 형태로 결합될 수 있다.

가교된 다당류 젤의 생물학적 활성 물질용 담체로서의 용도는 특히, 가교된 다당류 젤과 각막 상피 간에 특히 적합성 (compatibility)이 존재하는, 옵탈몰로지 (opthalmology)에 특히 유용할 수 있다. 생물학적 활성 물질을 점탄성 특성이 있는 농축 용액 형태로, 또는 고체 형태로 각막 상피 상에 투여할 경우, 균질하고 안정한 막이 형성되는데 이 막은 투명하며 부착성이어서 생물학적 활성 물질의 장기간 생체적합성을 부여해준다. 본 발명의 구체예의 가교된 다당류 젤 담체들 역시 점막 질환 (예컨대 입과 관련된 질환)의 치료 및 피부학적 질환을 치료하는데 적합할 수 있다.

어떤 구체예에서, 전술한 생물학적 활성 젤은 경구, 직장, 비경구, 피하, 국소 또는 피내용의 약학적 조제물 중에 조제될 수 있다. 적절한 약학적 조제물은 알약, 정제, 젤라틴 캡슐, 캡슐, 좌제 또는 연질 젤라틴 캡슐과 같은 고체 또는 반고체 형태일 수 있다. 비경구 및 피하 투여용의 경우, 근육내 또는 피내 용 또는 관주나 정맥 주사용으로 의도된 약학적 조제물을 사용할 수 있으므로, 활성 물질의 용액으로서 또는, 한가지 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제나 희석제로 희석될 활성 화합물의 동결 건조된 분말로서 제공될 수 있다. 또한, 국소용 제제 혀태의 약학적 제제, 예컨대, 국소용 용도를 위한 코 스프레이, 크림 및 연고 또는 피내 투여를 위해 특히 제조된 접착성 반창고가 적합할 수 있다.

이러한 제제는 사람이나 동물에게 투여될 수 있다. 일례에서, 가교된 다당류 젤은 용액제, 스프레이제 및 크림제의 경우 생물학적 활성 물질을 약 0.01% 내지 약 10%, 고체 형 제제의 경우 생물학적 활성 물질을 약 15% 내지 50%의 양으로 함유할 수 있다.

본 발명에서, "알칼리성 매질"이라 함은 물에 녹는 수산화물염, 바람직하게는 수산화나트륨을 의미하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서, "산성 매질"이라 함은, 물에 녹는 유기 또는 무기산, 바람직하게는 아세트산을 의미하나, 이에 한정되지 않는다.

도 1은 실시예에서 보고된 바와 같이 히알루론산 기질에 대한 히알루로니다제의 적정 곡선을 도시한 것이다.

도 2는 실시예에서 보고된 바와 같이 샘플 A와 샘플 B 사이에서의 우론산 (UV) 방출을 비교하여 도시한 것이다.

도 3은 실시예에서 보고된 바와 같이 1일 후 젤 중의 UA의 UV 흡수도를 도시한 것이다.

도 4는 실시예에서 보고된 바와 같이 1일, 2일 및 12일째 되는 날의 530 nm 에서의 UA의 UV 흡수도를 도시한 것이다.

도 5는 실시예에서 보고된 바와 같이 2일간 인큐베이션 후, 530 nm에서의 UA의 UV 흡수도를 도시한 것이다.

도 6은 실시예에서 보고된 바와 같이 여러가지 젤들을 비교한 것이다.

가교된 젤의 합성

섬유상 [Javenesh HTL (분자량 1.6-1.33 MD)] 및 분말상 히알루론산 [스트렙토코커스 에퀴 (Streptococcus equi)로부터 수득한 Fluka (분자량 1.69 MD)] (0.5 g)의 개별 샘플을 1시간 동안 격렬히 혼합하면서 1% NaOH (12.5 ml)에 용해시켰다. 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (BDDE) (12.5 ㎕)를 5분간 격렬히 교반하면서 첨 가한 다음, 얻어진 용액을 45℃에서 2시간 동안 교반없이 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 기간 말기에 혼합물을 수조로부터 제거하여 1분간 격렬히 교반한 다음 35-40℃에서 1.5시간 동안 고진공 하에 물을 제거하였다. 얻어진 투명한 다당류 매트릭스를 이소프로필 알코올과 물의 혼합물 (IPA/H₂O) (6:5, 25 ml)로 22시간 동안 세척한 다음, IPA/H₂O 혼합물을 제거한 다음, 물 (25 ml) 중 1.3 퍼센트 아세트산을 교반하면서 첨가하였다. 35분 후, 두가지 샘플 모두 "분말화된" 젤 ("샘플 B")에 비해 눈에 띄게 점성이 더 높은 "섬유상" 젤 ("샘플 A")을 갖는 완전히 팽윤된 젤을 생산하였다.

이어서 젤을 IPA (50 ml), IPA/H₂O (6:4, 25 ml), IPA/H₂O (8:2, 100 ml), 및 IPA (50 ml)로 연속 세척하였다. 얻어진 불투명한 고무 물질을 동결 건조시켜 불투명한 경질 시트를 얻었다. 다음의 실시예에서 사용하기위하여, 이 시트를 갓 제조한 포스페이트 완충 염수에서 24시간 동안 15 및 20 mg/ml의 농도로 재조성시켰다. 샘플 A를 500 ㎛ 메쉬를 통해 가압 하에 밀어 넣고 샘플 B는 300 ㎛ 메쉬를 통해 가압 하에 밀어 넣었다. 샘플을 3개월간 사용하였는데 보관시 분해되지 않았다.

카르바졸 분석

우론산과 카르바졸과의 반응은 여러가지 화합물에서 우론산의 양을 평가하는 만족스러운 방법이다. Bitter와 Muir에서 보고된 방법 [T. Bitter and H. M. Muir, Anal. Biochem. 4, 330-334 (1962)]에 따라 표준 적정 곡선을 구하였다.

시약:

A: 황산 98% 중 0.025 M 소듐 테트라보레이트 10 H₂O;

B: 무수 에탄올 중 0.125% 카르바졸 (4℃ 암실에서 12주일간 안정함);

C: 벤조산으로 포화된 탈이온수 중 0, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75 및 100 ㎍/m의l 11가지 글루쿠로노락톤 용액 (4℃에서 6개월간 안정함).

시약 A (5 ml)을 튜브 중에 넣고 -70℃로 냉각시켰다. 이어서 용액 C (1 ml)를 첨가하였다. 튜브를 밀봉하고 실온으로 될때가지 방치하였다. 이어서 튜브를 진탕하여 격렬히 끓는 비등수조에서 10분간 가열하였다. 이어서 튜브를 실온으로 냉각하였다. 시약 B의 분주액 (0.2 ml)를 첨가하였다. 튜브를 다시 진탕하고 15분간 가열하였다. 실온으로 되돌린 다음, UV 흡수도를 530 nm에서 측정하였다. 도 1은 글루쿠로노락톤의 농도의 함수로서 UV 흡수도의 적정 곡선을 나타낸 것이다.

샘플 A와 B의 히알루로니다제에 대한 내성

샘플 A 및 B로부터 히알루로니다제에 의해 방출된 우론산 (UA)의 농도를 측정하기 위하여, X.B. Zhao, J.E. Fraser, C. Alexander, C. Lockett, B.J. White, J. Mat. Science, Materials in Medicine 13, 11-16 (2002)에 보고된 방법에, 다음에 보고된 바와 같은 약간의 변형을 가하여 이용하였다.

여러가지 농도 (20 mg/ml 샘플 A, 15 mg/ml 샘플 A. 20 mg/ml 샘플 B 및 15 mg/ml 샘플 B)의 각각의 젤 1 ml를, 히알루로니다제 1 mg (1010U를 함유)을 함유하는 포스페이트 완충 염수 6 ml에 현탁시켜 37℃에서 인큐베이션시켰다. 5일 후, 각 각의 샘플 0.5 ml를 이소프로판올 2 ml에 희석하였다. 효소에 의해 파괴되지 않은 나머지 젤을 침전시켜 30분간 원심분리함으로써 제거하였다. 우론산을 함유하는 상등액 격렬히 끓는 비등수조에서 30분간 가열하여 효소를 변셩시키고 다시 30분간 원심분리하여 효소를 제거하였다. 각각의 튜브의 용량을 3.5 ml로 조정하였다. 히알루로니다제에 의해 방출된 UA의 농도를 530 nm에서의 UV 흡수도를 측정함으로써 도 1에 도시된 적정 곡선으로부터 구하였다. 도 2는 여러가지 UV 값을 비교 도시한 것이다.

더 낮은 농도의 바이오폴리머 (예컨대 20 mg/ml 샘플 A에 비해 15 mg/ml의 샘플 A)를 함유하는 젤에서는 UA 농도가 더 낮게 관찰되었다. 또한 샘플 A는 15 mg/ml와 20 mg/ml의 두가지 농도 모두에서 샘플 B보다 현저하게 덜 분해되었다.

인큐베이션 5일 후 UA의 농도 (젤 용액 1 ml 당 ㎍)를 적정 곡선 (도 1)으로부터 측정하였다. 희석 배수 7 (즉 3.5/0.5)을 취하여 0.5 ml 샘플을 분석을 위해 3.5 ml 부피로 희석하였다.

[UA]: 젤 상등액 중의 UA의 농도;

[UA_dil]: 적정 곡선으로부터 연역한 UA의 농도;

y = 0.0172[UA_dil] + 0.0215;

[UA_dil] = (y-0.0215)/0.0172 여기서 y=530 nm에서의 최대 흡수값;

[UA] = [UA_dil] x 7 = [(y-0.0215)/0.0172] x 7;

샘플 A, 20 mg: y=0.439, [UA]=170 ㎍/ml

샘플 A, 15 mg: y=0.3515, [UA]=134 ㎍/ml

샘플 B, 20 mg: y=0.559, [UA]=219 ㎍/ml

샘플 B, 15 mg: y=0.539, [UA]=211 ㎍/ml

샘플 A와 시판되는 젤 레스틸레인 (Restylane ^TM ) 및 펄레인 (Perlain ^TM )과의 비교

샘플 A와, 레스틸레인 (Restylane^TM) 젤 [Q-Med AB, 스웨덴, 웁살라) 및 펄레인 (Perlain^TM) (Q-Med AB, 스웨덴 웁살라]와의 비교를 다음 보고된 바와 같이 수행하였다.

각각의 젤의 샘플 (0.4 ml)을 히알루로니다제 (505 U) 0.5 mg을 함유하는 포스페이트 완충 염수 (pH=7.4) 3 ml에 현탁시켜 37℃에서 인큐베이션시켰다. 테스트된 젤은 20 및 15 mg/ml 농도의 Restylane^TM젤, 20 및 15 mg/ml의 Perlane^TM및 20 및 15 mg/ml 농도의 샘플 A였다. 1일 후, 각각의 젤 0.25 ml를 이소프로판올 2 ml에 희석시켰다. 효소에 의해 파괴되지 않은 잔여 젤을 침전시키고 30분간 원심분리에 의해 제거하였다. 이어서 각 튜브의 젤을 격렬히 끓는 비등수조에서 30분간 가열하여 효소를 변형시키고 다시 30분간 원심분리하여 효소를 제거하였다. 각 튜브의 부피를 2 ml로 조정하였다. 히알루로니다제에 의해 방출된 UA의 농도를 530 nm에서의 UV 흡수도를 측정함으로써 적정 곡선으로부터 구하였다. 제1일에 각 젤에 대한 UV 흡수도 곡선을 도 3에 나타내었다.

15 mg/ml와 20 mg/ml 시리즈 두가지 모두에 있어서, 샘플 A는 Perlane^TM과 Restylane^TM 젤에 비해, 향상된 분해 특성 (즉, 방출된 UA 농도가 더 낮음)을 나타내었다. 실제로 20 mg/ml 농도의 샘플 A는 15 mg/ml 농도의 Perlane^Tm 젤보다 덜 분해되었다.

젤 열화에 미치는 바늘 크기의 영향

젤의 분해에 미치는 바늘 크기의 영향을 평가하기 위하여, 32G 바늘을 통해 방출 또는 사출된 Restylane^Tm, 30G 바늘을 통해 방출 또는 사출된 Perlane^TM 젤; 및 32G 바늘 및 30G 바늘을 통해 사출된 샘플 A (500 ㎛)에 대하여 전술한 공정을 반복하였다. 젤 농도는 15 mg/ml으로 고정시켰다.

먼저, 공정 조건 (히알루로니다제 0.15 g/l)에서, 젤의 최대 분해 수준이 언제 관찰되었는지를 평가하기 위하여 시험 실험을 하였다.

2일 후 얻어진 값들은 1일 후 얻어진 값보다 약간 더 높았다. 결론적으로, 12일 후 세번째 측정치 세트를 취하였는데, 여기서는 UA의 방출은 젤이 가장 많이 분해된 처음 48시간에 비해 매우 낮았다. (도 4 참조). 이로부터, 2일의 인큐베이션 기간이면 여러가지 젤들의 UA 방출 (즉, 분해) 값을 비교하는데 충분한 것으로 평가되었다. 도 5는 각각의 실험 2일 후 530 nm에서의 UV 흡수도를 도시한 것이다.

표 1에 UV 최대값과 UA 농도를 실었다.

	최대 흡수도 (530 nm에서)	[UA] ㎍/ml^*
샘플 A	1.111	511
샘플 A, 바늘 30G	1.1193	549
샘플 A, 바늘 32G	1.24	571
Restylane^TM	1.482	683
Restylane^TM바늘 32G	1.617	647
Perlane^TM	1.302	600
Perlane^TM바늘 30G	1.466	676

* 희석배수: 2/0.25 = 8

표 1은 대체로 바늘 크기가 감소함에 따라 분해 수준이 증가함을 가리킨다. 도 6에 도시된 바와 같이, 심지어는 샘플 A를 32G 바늘을 통해 사출한 경우에조차, UV 농도는 Perlane^TM 젤과 Restylane ^TM 젤 두가지 모두에서 관찰된 값보다 낮은채로 유지되었으므로, 이는 샘플 A의 분해 특성이 향상되었음을 가리키는 것이다.

젤의 분해도 평가

먼저, 각각의 젤의 최대 분해 수준을 확립하였다. 히알루로니다제의 존재 하에서 1시간 동안 젤 용액을 환류시킴으로써 UA 추출을 수행하였다. 원심분리하지 않고 0.25 ml 샘플에 산성 처리 (카르바졸 분석 공정 참조)를 가하였다. 분석에 앞서, 용액의 부피를 2 ml로 조정하였다.

UV 스펙트럼과 적정 곡선으로부터 얻은 UA 농도를 표 2에 나타내었다.

	최대 흡수도 (530 nm에서)	[UA]_max ㎍/ml^*
샘플 A	1.6979	784
Restylane^TM	1.6985	784
Perlane^TM	1.6826	777

* 희석 배수:2/0.25 = 8

산출된 농도가 유사하다는 것은 최대 분해 수준이 보고된 조건 하에서 도달하였음을 가리키는 것이다.

다음, 표 1과 표 2의 결과는 각각의 젤에 대해 측정될 것으로 예상될 수 있는 최대 UA 방출에 대한 후술하는 실험 조건에서 방출된 UA 의 백분율을 산출하는 기준을 제공한다:

% UA = [UA]/[UA]_max x 100;

젤: 15 mg/ml에서 0.4 ml;

히알루로니다제: 0.5 mg

용매: PBS, 3 ml

	[UA] ㎍/ml^*	%UA
샘플 A	511	65
샘플 A, 바늘 30G	549	70
샘플 A, 바늘 32G	571	73
Restylane^TM	683	87
Restylane^TM, 바늘 32G	746	95
Perlane^TM	600	77
Perlane^TM, 바늘 30G	676	87

히알루로니다제 내성 연구 결과 본 발명의 구체예에 따른 샘플 A는 두가지 시판되는 가교된 다당류 젤보다 덜 분해되는 것으로 나타났다. 이 분석 방법은 연질 유동성 젤보다는 조밀한 경질 젤을 테스트하는데 일반적으로 사용되는 방법에 기초한 것으로서, 고농도 효소를 사용하는 방법임을 주목하여야 한다. 결과적으로, 모든 젤들은 2일 후에는 유의적인 수준으로 분해되었다. 그럼에도 불구하고, 이러한 결과는 본 발명의 구체예에 따라 형성된 가교된 다당류 젤이 시판되는 젤에 비해 향상된 분해 특성을 나타냄을 가리키는 것이다.

당업자라면 광범하게 설명된 본 발명의 정신이나 범위를 벗어나지 않고도, 특정 구체예에 제시된 바와 같은 본 발명에 대해 다양한 변화 및/또는 변형을 가할 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명의 구체예들은 모든 면에서 예시적인 것으로서 비제한적인 것으로 고려되어야 한다.

Claims

(a) 알칼리성 매질에 혼합된 다당류를 이관능기 또는 다관능기 에폭사이드와 접촉시켜, 에테르 결합에 의해 에폭사이드가 실질적으로 다당류에 결합되어 있는, 기본적으로 에폭시 가교된 다당류를 제공하는 공정;

(b) 알칼리성 매질로부터 에폭사이드를 실질적으로 제거함이 없이, 에폭시 가교된 다당류를 건조시켜 가교된 다당류 매트릭스를 형성하는 공정;

(c) 가교된 다당류 매트릭스를 임의로, 물과 섞이는 용매로 세정하는 공정; 및

(d) 가교된 다당류 매트릭스를 산성 용매로 중화시켜 가교된 다당류 젤을 형성하는 공정

을 포함하여 이루어지는, 가교된 다당류 젤의 제조 방법.
제1항에 있어서, 다당류가 히알루론산, 펙틴, 잔탄 또는 알길산인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 다당류가 카르복시메틸 덱스트란, 히알루론산 또는 카르복시메틸 전분 또는 카르복시메틸 셀룰로스의 음이온계 유도체인 방법.
제3항에 있어서, 다당류가 히알루론산인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 에폭사이드가 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르, 1,2-에탄디올 디글리시딜 에테르 또는 에폭시-치환된 펜타에리쓰리톨인 방법.
제5항에 있어서, 에폭사이드가 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 알칼리성 매질의 pH가 약 9 내지 12 범위인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 알칼리성 매질은 다당류 1 내지 5 wt/vol 퍼센트와 에폭사이드 0.05 내지 0.5 wt/vol 퍼센트를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 약 45℃의 온도에서 에폭사이드를 다당류와 접촉시키는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 다당류 매트릭스를 적어도 약 35℃의 온도에서 진공 건조시키는 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, (a) 내지 (c) 공정을 알칼 리성 조건 하에서 수행하는 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 임의의 세정 공정 (c)가 가교된 다당류 매트릭스를 아세톤으로 세정하는 것을 부가적으로 포함하는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 중화 공정 (d)가 가교된 다당류 젤을 동결 건조하고 젤을 재조성하는 것을 부가적으로 포함하는 방법.
제13항에 있어서, 동결 건조된 가교된 다당류 젤을 포스페이트 완충 염수 중에 재조성시키는 방법.
제1항 내지 제14항에 있어서, 다당류를 생물학적 활성 물질과 결합시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 따른 방법에 의해 제조된, 히알루로니다제 분해에 대하여 실질적으로 내성을 갖는 가교된 다당류 젤.
실질적으로 분해되지 않게끔 젤이 충분히 가교되도록, 실질적으로 에테르 결합에 의해 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르와 가교된 히알루론산을 포함하는 생체적합성 젤.
제17항에 있어서, 히알루로니다제 처리 시, 젤이 약 75 퍼센트 미만으로 우론산을 방출하는 젤.
제17항에 있어서, 히알루로니다제 처리시, 젤이 약 70 퍼센트 이하로 우론산을 방출하는 젤.
제17항에 있어서, 히알루로니다제 처리시, 젤이 약 65 퍼센트 이하로 우론산을 방출하는 젤.
제17항에 있어서, 32 게이지 바늘로 사출 또는 방출된 후, 젤이 약 75 퍼센트 미만으로 우론산을 방출하는 젤.
제17항에 있어서, 30 게이지 바늘로 사출 또는 방출된 후, 젤이 약 70 퍼센트 이하로 우론산을 방출하는 젤.
제17항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 이어서, 생물학적 활성 물질을 부가적으로 함유하는 젤.
제23항에 있어서, 생물학적 활성 물질이 호르몬, 시토카인, 백신, 세포, 조 직 증가 물질, 또는 이들의 혼합물인 젤.
제24항에 있어서, 조직 증가 물질이 콜라겐, 전분, 덱스트라노머, 폴리락티드, 폴리-베타-히드록시부티레이트, 또는 이들의 코폴리머인 젤.
제23항에 있어서, 생물학적 활성 물질이 알칼로이드, 펩타이드, 페노티아진 벤조디아제핀, 티오잔텐, 호르몬, 비타민, 항경련제, 항정신병제, 항구토제, 마취제, 수면제, 식욕감퇴제, 진정제, 근육이완제, 심장혈관확장제, 항신생물제, 항생제, 항균제, 항바이러스제, 항말라리아제, 카르보닐 안하이드라제 억제제, 비스테로이드계 항염제, 혈관수축제, 콜린성 촉진제, 콜린성 길항제, 아드레날린 촉진제, 아드레날린 길항제, 마약 길항제 또는 이들의 조합인 젤.
제16항에 따른 가교된 다당류 젤;

생물학적 활성 물질; 및

약학적으로 허용가능한 담체

를 포함하는 약학적 조성물.
제17항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 따른 생체적합성 젤;

생물학적 활성 물질; 및

약학적으로 허용가능한 담체

를 포함하는 약학적 조성물.
제27항 또는 제28항에 있어서, 제제가 알약, 정제, 캡슐제, 좌제, 스프레이제, 크림 연고 또는 접착성 반창고 형태인 약학적 조성물.
제16항 내지 제26항 중 하나 이상의 항에 따른 젤의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상자에 있어서 질병을 치료 또는 예방하는 방법.
제27항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 따른 약학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상자에 있어서 질병을 치료 또는 예방하는 방법.
제30항 또는 제31항에 있어서, 주사에 의해 대상자에게 투여하는 방법.
제30항 또는 제31항에 있어서, 대상자에게 국소 적용에 의해 투여하는 방법.
대상자의 질병을 치료 또는 예방하기 위한 의약을 제조하는데 있어서의 제16항 내지 제26항 중 어느 하나 이상의 항에 따른 젤의 용도.
대상자의 질병을 치료 또는 예방하기 위한 의약을 제조하는데 있어서의 제27항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 따른 약학적 조성물의 용도.