KR101866678B1 - 저온 가교 공정을 통한 점탄성과 체내지속성이 증진된 하이드로젤의 제조방법 - Google Patents

Abstract

생분해성 고분자를 알칼리성 수용액에 용해시킨 고분자 용액에 가교제를 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하는, 점탄성 및 체내지속성이 증진된 하이드로젤의 제조방법에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 히드록시기(OH), 카르복실기(COOH) 또는 둘 모두를 포함하는 것으로, 분자 내 분해반응에 대한 활성화 에너지는 상기 가교제에 의한 상기 생분해성 고분자의 분자간 가교반응에 대한 활성화 에너지보다 더 높고, 상기 반응 온도는 상기 알칼리성 수용액의 녹는점 이상 20℃이하인 것을 특징으로 가지는, 하이드로겔의 제조방법으로서, 상기 제조방법에 의한 하이드로젤은 점탄성 및 체내 지속성이 증진되어, 연조직용 필러에 적용할 수 있다.

Description

저온 가교 공정을 통한 점탄성과 체내지속성이 증진된 하이드로젤의 제조방법 {Method for preparing a highly viscoelastic and durable hydrogel through a fabricating process at low temperature}

본 발명은, 점탄성 및 체내 지속성이 증진된 하이드로젤의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 히드록시기(OH), 카르복실기(COOH) 또는 둘 모두를 포함하는 생분해성 고분자 및 가교제를 알칼리 수용액 상에서 반응시키되, 상기 알칼리 수용액의 녹는점 이상 20℃이하의 저온에서 반응시키는 것이 특징인 하이드로젤의 제조방법에 관한 것이다.

생체적합성이 우수한 하이드로겔과 같은 생체재료를 기반으로 하는 지지체를 이용하여 세포를 생체 외에서 배양하여 이식 가능한 조직으로 키우는 조직공학연구가 활발해짐에 따라 그 지지체로 사용가능한 생체재료 예컨대, 하이드로겔에 관한 연구도 활발히 진행되고 있다. 하이드로겔은 크게 히알루론산(hyaluronic acid), 알지네이트(alginate), 콜라겐(collagen), 알긴산(alginic acid), 헤파린(heparin) 및 헤파란(heparan) 등의 천연 하이드로겔과 폴리에틸렌글리콜(poly(ethylene glycol); PEG)나 폴리락트산-글리콜산 공중합체(poly(latic-co-glycolic acid); PLGA)를 기반으로 하는 합성 하이드로겔로 분류될 수 있으며, 상기 천연 하이드로겔은 체내에 존재하는 물질로 생체적합성이 우수하고 체내의 특이적인 효소에 의해 분해되어 자연적으로 흡수될 수 있는 생분해성 고분자이다.

이 중, 히알루론산은 가장 널리 이용되고 있는 천연 고분자로서 피부 결합조직(connective tissues of skin), 연골, 뼈, 윤활액(synovial fluid) 등에 존재한다. 히알루론산은 점탄성, 비 면역 반응(non-immunogenic response), 생분해성, 그리고 팽윤특성이 있어 생체재료로서 우수한 특성들을 지니고 있다. 그래서 점성보충(viscosupplementation), 약물전달, 및 상처치유를 위한 스캐폴드(scaffold for wound healing)와 같은 다양한 응용분야에서 사용이 가능하다.

필러는 상기 생분해성 고분자 물질을 포함하는 조성물을 주요성분으로 하는 것으로, 이를 코나 얼굴의 주름 부분에 주사하여 해당 부위를 인공적으로 채우는 것이다. 필러에는 다양한 종류와 등급이 있으며, 연조직 필러는 입술의 보강 및 유방의 확대 등 신체 연조직의 결핍을 보정하는데 사용된다. 연조직 필러는 연한 조직(soft tissue)에 사용된다는 점에서, 높은 점탄성을 가져야 하며, 동시에 체내 지속성이 요구된다.

하지만, 순수 히알루론산을 포함한 대부분의 생분해성 고분자는 체내에서 48시간 내에 대부분 생분해가 되기 때문에 의료용 생체재료로 쓰기 위해서는 반드시 히알루론산 고분자 사슬을 가교제로 연결시켜줘야 한다. 가교가 된 히알루론산은 다량의 물을 머금을 수 있는 하이드로젤이 되는데, 미국 Allergan 사의 Juvederm 이나 스웨덴 Q-Med 사의 Restylane과 같은 주름개선용 주입형 연조직 필러는 6개월에서 12개월까지 지속이 된다고 알려져 있다. 하지만 이 기간은 다른 합성고분자나 세라믹을 사용한 필러보다 훨씬 짧기 때문에 현재 가지고 있는 지속력보다 더 긴 지속력을 갖는다면 생체고분자 필러의 경쟁력을 더 높일 수 있을 것이다.

생분해성 고분자의 가교제는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디마이드 (EDC), N-히드록시석시마이드 (NHS), 글루타랄데히드 (GTA), 디바이닐 설폰 (DVS), 폴리(에틸렌글리콜) 디글리시딜 에테르 (PEGDE), 아디픽 디하이드라자이드 (ADH), 1,4-부탄디올-디글리시딜 에테르 (BDDE) 와 같은 것들이 있다. 가교제의 양쪽 끝이 모두 히알루론산과 연결이 되는 것이 이상적이나, 한쪽만 연결이 되거나 두 쪽 모두 연결이 안된 상태로 남아있을 수 있는데, 이럴 경우 가교제는 체내에서 염증이나 알러지 등의 부작용을 일으킬 수 있다. 따라서, 가교제를 많이 넣으면 가교도가 증가하여 강도와 지속력이 좋아지지만 완전히 반응하지 못한 가교제의 양도 증가하여 생체친화성이 나빠지므로 좋은 방법이 아니다. 다른 첨가물 없이 생체친화성이 좋은 하이드로젤을 만들기 위해서는 가교제의 양을 증가시키는 것보다 가교제의 반응 효율을 높여야 한다.

이에, 본 발명자는 상대적으로 적은 양의 가교제를 사용하되 공정변수를 조절하여 점탄성 또는 체내 지속성이 증진된 하이드로젤을 제조하기 위한 방법을 발굴하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 생분해성 고분자와 가교제를 사용하는 경우 낮은 온도에서 장시간 반응시킴으로서 많은 양의 가교제를 사용하지 않고도 점탄성 및/또는 체내 지속성이 증진된 하이드로젤을 제공할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

특히, 이러한 특징은 상기 생분해성 고분자의 분자 내 분해반응에 대한 활성화 에너지가 상기 가교제에 의한 상기 생분해성 고분자의 분자간 가교반응에 대한 활성화 에너지보다 높은 것에 기인한 특징이라는 점을 밝혀 내었다.

본 발명의 하나의 목적은 생분해성 고분자를 알칼리성 수용액에 용해시킨 고분자 용액에 가교제를 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하는, 점탄성 및 체내지속성이 증진된 하이드로젤의 제조방법에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 히드록시기(OH), 카르복실기(COOH) 또는 둘 모두를 포함하는 것으로, 분자 내 분해반응에 대한 활성화 에너지는 상기 가교제에 의한 상기 생분해성 고분자의 분자간 가교반응에 대한 활성화 에너지보다 더 높고, 상기 반응 온도는 상기 알칼리성 수용액의 녹는점 이상 20℃이하인 것을 특징으로 가지는, 하이드로겔의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된 하이드로젤을 포함하며, 상온 인산완충식염수(PBS)에서 팽윤이 평형에 도달한 것인, 주입형 연조직 필러용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 제 1양태는, 생분해성 고분자를 알칼리성 수용액에 용해시킨 고분자 용액에 가교제를 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하는, 점탄성 및 체내지속성이 증진된 하이드로젤의 제조방법에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 히드록시기(OH), 카르복실기(COOH) 또는 둘 모두를 포함하는 것으로, 분자 내 분해반응에 대한 활성화 에너지는 상기 가교제에 의한 상기 생분해성 고분자의 분자간 가교반응에 대한 활성화 에너지보다 더 높고, 상기 반응 온도는 상기 알칼리성 수용액의 녹는점 이상 20℃이하인 것을 특징으로 가지는, 하이드로겔의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제2양태는, 상기 제조방법에 의해 제조된 제1항에 의해 제조된 하이드로젤을 포함하며, 상온 인산완충식염수(PBS)에서 팽윤이 평형에 도달한 것인, 주입형 연조직 필러용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 생분해성 고분자를 이용한 하이드로젤의 제조방법으로서, 예컨대, 일반적으로 고분자의 분해반응 및 가교반응은 모두 반응 온도가 증가함에 따라 그 속도가 증가하는 경향을 갖는다. 그러나, 반응시키고자 하는 생분해성 고분자의 분자내 분해반응에 대한 활성화 에너지가 가교제에 의한 상기 생분해성 고분자의 분자간 가교반응에 대한 활성화 에너지보다 높을 때, 생분해성 고분자의 분자내 분해반응은 온도에 보다 민감하여 반응온도가 증가할수록 가교반응이 진행되는 것에 비해 고분자 자체의 분해가 빠르게 진행되어 오히려 보다 많은 양의 가교제를 사용하지 않는 한, 원하는 강도 및 탄성을 달성하기 어려울 수 있다.

본 발명에서는 저온에서 상기 생분해성 고분자의 분자내 분해반응속도에 비해 상기 가교제에 의한 분자간 가교반응속도가 높게 나타나, 즉 저온에서 가교 반응의 효율이 높게 나타나서 체내 지속성이 높을 뿐만 아니라 점탄성이 증진된 하이드로젤을 제조할 수 있음을 최초로 확인한 것에 특징이 있다.

구체적으로, 하이드로젤의 기계적 특성은 생분해성 고분자의 분해반응과 가교제에 의한 생분해성 고분자간 가교반응의 정도에 따라 결정이 되므로, 하이드로젤의 G' (탄성계수)값은 두 반응의 정도를 알 수 있는 기준이 될 수 있다. 가교 온도와 가교 시간에 따라 하이드로젤의 G' (탄성계수) 값을 측정하고 초기 탄성계수 G'₀값과의 비율인 G'/G'₀을 반응시간에 대한 함수로 나타내면 반응시간에 따라 기계적 특성이 변하는 경향을 알 수 있어 각 반응 온도별 최대의 물성을 가질 수 있는 최적의 반응시간을 예측할 수 있다.

특히, G'/G'₀값은 60 내지 100일 경우 우수한 기계적 물성을 나타내므로 이러한 값을 나타내는 가교반응 온도 및 가교반응 시간을 설정할 수 있다. 보다 바람직하게 G'/G'₀값은 80 내지 100일 수 있다.

한편, 생분해성 고분자의 분해반응 활성화 에너지가 상기 가교제에 의한 분자간 가교반응에 대한 활성화 에너지보다 높을 경우, 저온에서 반응시켜 G'(탄성계수)/G'₀(초기 탄성계수) 값을 높일 수 있다(도 2 참조). 즉, 하이드로젤이 주입형 연조직 필러용도로 사용하기에 적합할 정도의 물성을 갖게 하기 위하여, 저온에서 반응시킬 수 있다.

상기 생분해성 고분자는, 히드록시기(OH)나 카르복실기(COOH)를 포함하며 체내에서 일정시간이 경과한 뒤에는 분해되는 성질을 갖는 고분자이다. 바람직하게는 히알루론산, 콜라겐, 알지네이트, 녹말, 키토산, 젤라틴, 덱스트린, 및 셀룰로오스로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 것이다.

보다 바람직하게는, 상기 생분해성 고분자는 히알루론산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 상기 생분해성 고분자로서 히알루론산을 사용하는 경우, 3 내지 20℃의 저온에서 반응을 수행하여, 우수한 기계적 물성을 나타내는 하이드로젤을 제조할 수 있다. 상기 반응온도는 보다 바람직하게는 3 내지 10℃의 저온에서 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기의 반응온도는 통상적으로 사용되는 온도인 20도 내지 40도 보다 낮은 온도로서, 가교반응보다 분해반응의 활성화 에너지가 큼을 이용해 저온에서 가교 효율을 높이는 특징에 기인한다.

이 때, 반응 시간이 5일 내지 30일일 경우 우수한 기계적 물성을 나타내며, 바람직하게는 해당 온도에 따라 G'(탄성계수)/G'₀ (초기 탄성계수) 값이 최대로 나타나는 반응시간이다.

본 발명의 제조방법에서, 가교제는 에폭사이드를 포함하는 화학적 가교제를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 1,4-부탄디올-디글리시딜 에테르 (BDDE), 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르 (EGDE), 폴리에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르 (PEGDE), 글리세롤 폴리글리시딜 에테르, 디글리세롤 폴리글리시딜 에테르로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 사용할 수 있다. 상기 가교제는 1,4-부탄디올-디글리시딜 에테르 (BDDE)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 생분해성 고분자로서 히알루론산을, 가교제로 1,4-부탄디올-디글리시딜 에테르 (BDDE)를 사용하여 하이드로젤을 제조하였으며, 상기 생분해성 고분자의 분자내 분해반응 및 가교제에 따라 상기 생분해성 고분자간 가교반응의 활성화 에너지가 각각 82.6kJ/mol 및 59.3kJ/mol로 나타났고, 20℃, 10℃, 3℃로 반응 온도가 보다 낮아질수록 해당 조건에서 제조되는 하이드로젤은 보다 우수한 기계적 물성을 나타내는 것을 확인하였다.

본 발명의 제조방법 중 알칼리성 수용액은 NaOH 수용액 내일 수 있으며, 높은 pH를 갖는 알칼리 수용액이 바람직하다.

이는 1) 히알루론산의 긴 사슬을 끊어 녹일 수 있고, 2) 생분해성 고분자가 가진 NHCOCH₃가 NH₂가 되도록 디아세틸화를 야기해, 가교제와 강한 공유 결합을 할 수 있는 작용기로 만들며, 3) 가교제를 개환하여, 생분해성 고분자의 OH, COONa, NH2의 작용기들과 강한 공유결합을 하도록 할 수 있기 때문이다.

상기 제조방법의 생분해성 고분자의 알칼리 수용액에 대한 용해시간은 10시간 내지 14시간인 것이 바람직하며, 10시간 이하로 녹이면 균일한 용액이 되지 않으며, 14시간 이상으로 녹이면 높은 히알루론산의 사슬이 너무 많이 끊어져 가교를 해도 강도가 낮아진다. 본 발명의 실시예에서는 20℃에서 약 12시간 용해하였다.

본 발명의 제조방법은 상기 제조방법에 의해 얻어진 하이드로젤을 세척하고 입자화하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 단계를 통하여 잔류 가교제의 세척 및 하이드로젤의 pH를 중성화한 뒤 주입이 가능하도록 벌크 하이드로젤을 입자화할 수 있다. 입자화를 통해 수백 μm 수준의 하이드로젤 입자로 만들면, 27 내지 30G의 주사기의 작은 바늘을 통해 주입이 가능하여, 연조직 필러 주입에 사용될 수 있다.

본 발명의 제조방법에서, 상기 생분해성 고분자 1g당 상기 가교제는 10 내지 500μL일 수 있으며, 바람직하게는 100 내지 300μL이다.

상기 가교제를 50μL 미만으로 사용하는 경우, 충분한 가교가 이루어지지 못하여 원하는 탄성을 달성하기 어려울 수 있으며, 500μL 초과하여 사용하는 경우 과도한 가교결합으로 강도가 증가되어 오히려 탄성이 감소하여 연조직 필러로서 적합하지 않을 수 있다.

본 발명의 제조방법에 의해 제조된 하이드로젤은 점탄성 및 체내 지속성이 증진되어, 주입형 연조직 필러용 조성물로 사용될 수 있다. 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 하이드로젤을 상온 인산 완충 식염수(PBS)에서 팽윤이 평형에 도달하게 하여 상용화 할 수 있다. 이렇게 제조된 주입형 연조직 필러용 조성물은 2000 내지 4000Pa의 G'값을 가져, 우수한 점탄성을 가질 수 있다. 또한, 이렇게 제조된 주입형 연조직 필러용 조성물은 체내 주입 후 10주 경과 후에도 초기 주입 부피에 대해 90% 이상이 유지될 수 있다.

또한, 상기 제조방법에 의해 제조된 하이드로젤을 상온 인산완충식염수(PBS)에서 팽윤이 평형에 도달하게 한 하이드로젤을 분쇄하여 사용할 수 있다. 이 경우, 분쇄된 하이드로젤은 100 내지 700 μm 크기의 입자(0.5 내지 1 ml 양)를 가지며, 1000 Pa 이상의 G'값을 가질 수 있다.

본 발명의 제조방법은 저온에서 장시간 반응시킴으로서, 가교제가 활성화되는 염기조건에서 발생할 수 있는 생분해성 고분자 자체의 분자 내 분해반응을 최소화하고 가교제에 의한 가교반응의 효율을 높여 점탄성 및/또는 체내 지속성이 향상된 하이드로젤을 제공할 수 있으며, 이와 같이 제조된 하이드로젤은 연조직용 필러로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 히알루론산의 분자내 분해와 가교제에 의한 상기 히알루론산의 가교 양상과 이의 G'/G'₀을 개략적으로 나타내는 도이다. 도 1(A)는 히알루론산이 알칼리성 수용액인 NaOH와 가교제인 BDDE에 의해 분해와 가교되는 양상 도식화 한 것이고, 도 1(B) 분해와 가교에 따른 G'/G'0 의 변화를 예측한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 T에 따른 G'/G'₀의 값을 측정한 도이다.
도 3은 도 2에서 얻은 데이터를 통해 가교와 분해 거동을 ln k 와 1/T의 아레니우스 조사구(Arrhenius plot)로 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 HAc37, HAc20, 그리고 HAc10 하이드로젤의 (A) 탄성계수 G'과 (B) 팽윤율를 나타낸 도이다.
도 5은 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 효소에 의한 히알루론산의 분해거동을 평가한 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 (A) HAc37, (B)HAc20, 그리고 (C) HAc10 하이드로젤의 섬유세포의 부착특성과 (D) 섬유세포의 증식을 평가한 결과이다 (*p<0.05, **p<0.01)
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 (A) 시제품과 (B) HAc10 필러의 입자크기, (C) 점탄성, (D) 주입력을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 성형외과용 필러시제품과 HAc10의 지속력 비교 측정을 위한 (A) MRI 사진과 조직시편 사진과 (B) MRI를 통한 잔존 부피를 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 설계

본 발명자는 전술한 종래의 문제점을 해결하고자, 주입형 연조직 필러용도로 적합한 점탄성과 체내 지속성이 증진된 하이드로젤을 개발하고자, 먼저 하이드로젤과 가교제의 가교반응 효율을 높이기 위한 방안을 설계하였다.

히알루론산 하이드로젤의 화학적 가교가 산 또는 염기에서 진행되기 때문에 분해 반응과 가교 반응이 동시에 일어난다. 따라서 하이드로젤의 기계적 특성은 분해반응과 가교반응의 정도에 따라 결정이 되므로 하이드로젤의 탄성계수 G'은 두 반응의 정도를 알 수 있는 기준이 될 수 있다. 가교 온도와 가교 시간에 따라 하이드로젤의 G'값을 측정하고 초기 탄성계수 G'₀값과의 비율인 G'/G'₀을 반응시간에 대한 함수로 나타내면 반응시간에 따라 기계적 특성이 변하는 경향을 알 수 있어 각 반응 온도별 최대의 물성을 가질 수 있는 최적의 반응시간을 예측할 수 있다. 위에서 얻은 함수는 분해반응속도 상수 k1와 가교반응속도 상수 k2를 포함하는데, 이 두 상수의 자연로그 값(ln k1, ln k2)을 반응온도의 역수(1/T)와 plotting하여 두 반응의 활성화에너지 값을 계산하여 비교함으로써, 분해반응의 활성화 에너지가 가교반응의 활성화 에너지보다 높은 경우, 저온에서 반응시키는 것이 가교효율을 높이는 방법이 될 수 있을 것이라고 생각하였다.

이로서, 하이드로젤과 가교제의 가교반응과 분해반응 각각의 활성화 에너지를 측정하고자 하였다. 하이드로젤과 가교제의 가교반응과 분해반응은 온도가 증가함에 따라 반응속도가 빨라지는데, 아레니우스 플롯에 의하면 활성화 에너지가 큰 반응의 반응속도는 온도의 변화에 더 민감하게 변하기 때문에 어떤 온도에서 반응시키는 것이 더 유리한지 결정하고자 하였다.

하이드로젤의 예로서 히알루론산을 알칼리 수용액인 NaOH에 녹인 후 가교제인 BDDE를 첨가하면 히알루론산 작용기들이 BDDE에 의해 결합이 되어 하이드로젤이 만들어진다. 이를 도식화 하여 도 1에 나타내었다.

분해반응과 가교반응은 일차반응속도 모델(first-order kinetic) 이라는 가정하에 (1) 분해에 의한 G'/G'0 함수와 (2) 가교에 의한 G'/G'0 함수를 예측하고, 실제반응인 (3) 분해와 가교가 동시에 일어날 때 G'/G'0 함수를 다음과 같이 추정하여 도 1B 와 같은 그래프로 간주하였다.

(1)

(2)

(3)

여기서, y1, y2, y1y2는 각각 분해반응에의한 G'/G'0, 가교반응에 의한 G'/G'0, 분해와가교가 동시에 일어날때의 G'/G'0 이다. A, B, C 는 상수이고(A=1, -B + C = 1), k1, k2 는 각각 분해반응속도상수와 가교반응속도상수이다.

여기서, 분해반응이 일어나기 직전(t=0 일 때) 분해반응에 의한 G'/G'0 은 1 이므로 A=1 이어야 하고, 가교반응이 일어나기 직전(t=0 일 때) 가교반응에 의한 G'/G'0 은 1이므로 -B+C = 1 이어야 하고, C는 분해반응 없이 가교반응만 일어났을 때 도달하는 최대 G'/G'0 이므로 온도에 관계없이 일정한 값을 가져야 하고, -B+C = 1 이므로 B도 온도에 관계없이 일정한 값을 가져야 한다.

제조예

(1) 히알루론산을 알칼리 수용액에 용해하는 단계

1g 히알루론산 파우더에 0.2M NaOH 용액 10ml를 넣고 20℃ 에서 12시간 용해하였다.

(2) 히알루론산 용액에 가교제를 넣어 반응시키는 단계

상기 (2) 단계는 히알루론산의 사슬 사이를 가교제로 연결하여 하이드로젤 상태로 만드는 가교 단계이다. 이러한 가교 단계를 통하여 히알루론산의 작용기들과 BDDE가 강한 공유결합을 하게 된다.

녹은 히알루론산 용액에 BDDE를 200 μl (200 μl BDDE/1g 히알루론산의 비율) 넣고 섞어주었다.

BDDE와 잘 섞은 뒤 수분이 증발하지 않도록 밀봉을 한 후 37℃, 20℃, 10℃ 및 3℃의 반응온도를 유지하며 반응시켰다.

상기 반응온도에 따라 최적화된 히알루론산 하이드로젤을 HAc37, HAc20, HAc10, HAc3이라고 명명하였다.

(3) 반응이 끝난 하이드로젤을 세척하고 입자화하는 단계

온도별 반응시간이 지나면 하이드로젤을 꺼내서 DPBS 에 넣고 약 하루에 한번 갈아주면서 세척하였다.

약 3일이 지나면 히알루론산 하이드로젤의 팽윤이 DPBS에서 평형에 도달하고 균질기를 이용하여 약 7000 rpm 에서 5분간 분쇄하여 입자화 하였다.

입자화 된 히알루론산 하이드로젤을 팔콘튜브에 담고 121℃ 에서 30분간 autoclave를 하여 멸균하였다.

멸균된 히알루론산 하이드로젤을 주사기에 채워 넣으면 주입형 연조직 필러가 완성되었다.

실험예 1 - 본 발명 하이드로젤의 G'/ G' ₀ 그래프와 이를 통한 활성화 에너지 측정

제조예의 (2) 단계에 따라 제조된 하이드로젤을 온도와 시간별로 반응한 샘플의 G'을 측정하여, 반응 시간에 따른 G'/G'₀ 그래프를 3℃, 10℃, 20℃, 및 37℃의 반응온도에서 각각 얻었다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 알 수 있듯이, 반응온도가 낮아질수록 면적이 넓으며 높은 G'/G'₀의 그래프를 나타내는 것을 확인하였다. 즉, 반응시간은 보다 오래 걸리더라도 높은 정도의 G'/G'₀를 나타내므로, 저온에서 우수한 기계적 물성을 갖는, 높은 점탄성의 하이드로젤을 제조할 수 있음을 확인하였다.

한편, 이와 같은 특징이 나타나는 원인이 생분해성 고분자의 분자내 분해반응과 가교제에 의한 생분해성 고분자의 분자간 가교반응의 활성화에너지 차이에 기인한 것임을 증명하고자 하였다. 전술한 본 발명의 설계 과정에서 추정한 분해와 가교가 동시에 일어날 때의 G'/G'₀ 함수 식과, 도 2에 나타낸 실제 측정한 G'/G'₀ 값을 피팅 소프트웨어(fitting software)에 입력하여 하기의 표 1과 같이 가장 적합한 함수를 찾고 각 함수의 k1, k2 값을 정하였다.

310 K, 293 K, 283 K, 276 K 에서의 k1, k2 값을 이용해 도 3과 같이 아레니우스 조사구(Arrhenius plot)인 ln k1 vs 1/T 와 ln k2 vs 1/T 그래프를 그리고 피팅 소프트웨어(fitting software)를 이용해 두 그래프의 식을 구하고, 기체상수인 8.31 J/mol/K 를 각 그래프의 기울기에 곱하여, 분해반응의 활성화 에너지와 가교반응의 활성화 에너지를 구하여 하기의 표 2로 나타내었다.

이와 같이, 본 발명의 제조예에 따른, 하이드로젤은 분해반응의 활성화 에너지가 가교반응의 활성화 에너지보다 높음을 확인하였고, 이는, 저온에서 반응시킬 경우, 하기에서 설명하는 바와 같이 점탄성 및 체내 지속성이 증진되는 특성을 나타내는 하이드로젤을 제조할 수 있는 근본적인 원인임을 밝혀내었다.

실험예 2 - 하이드로젤의 G', G' 및 팽윤도 평가

기계적특성을 분석하기 위해 G', G" 및 팽윤도를 측정하였고 그 결과를 도 4에 도시하였다. 1Hz에서 G'과 G"을 측정한 결과 HAc37은 각각 약 700 Pa과 3 Pa, HAc20은 각각 약 1500 Pa과 4 Pa, HAc10은 각각 약 3500 Pa과 8 Pa로 저온에서 제작된 하이드로젤의 점탄성이 크게 증가하였다. 팽윤도는 HAc37이 약 45, HAc20이 약 37, HAc10에서 약 27로 저온에서 제작된 하이드로젤에서 크게 감소하였다. 이를 통해 저온에서는 가교 효율이 높아져 점탄성이 커졌고 이에 따라 팽윤에 대한 저항성도 커져 팽윤도가 감소한 것을 알 수 있었다.

실험예 3 - 하이드로젤의 효소에 의한 분해거동 평가

효소에 의한 분해거동을 분석하기 위해 PBS에 10 u/ml 농도의 히알루로니다아제 용액을 만들고 하이드로젤 1g당 10ml의 히알루로니다아제 용액에서 하이드로젤의 질량변화를 측정하였고 그 결과를 도 5에 도시하였다. HAc37은 하루만에 거의 모두 분해가 된 반면 HAc10은 5배 정도 더 오래 지속이 되었다. 가교효율이 높아 탄성계수가 커진 HAc10은 가교된 히알루론산이 많기 때문에 분해에 대한 저항성이 높고, 팽윤도가 작은 HAc10은 체액이 침투하는 양이 적기 때문에 그만큼 효소의 침투도 적어 분해 속도가 느린 것으로 볼 수 있다.

실험예 4 - 하이드로젤의 세포특성 평가

생체적합성을 분석하기 위해 섬유세포 부착과 증식 실험을 하였고 그 결과를 도 6에 도시하였다. 다른 샘플들과는 큰 차이를 보이며 HAc10에서 자란 섬유세포 수가 훨씬 많았다. 이는 저온에서 제조된 하이드로젤의 뛰어난 생체활성을 보여주는 데이터이다. 저온에서는 가교 효율이 높아 팽윤도가 감소하여 하이드로젤의 강도가 더 세고 단위부피당 히알루론산의 양이 많기 때문에 세포가 더 활발히 자랄 수 있게 되었다.

실험예 5 - 하이드로젤 필러의 물성평가 (타사제품인 히알루론산 필러와의 특성 비교)

저온에서 최적화 된 HAc10 하이드로젤을 입자화하여 필러로서의 특성을 평가하기 위해 시제품 히알루론산 필러인 Restylane과 특성을 비교평가하였고 그 결과를 도7에 도시하였다. 입자의 분포는 Restylane이 대략 200-500 μm였고 HAc10 필러는 대략 200-700 μm로, Restylane의 입자분포가 비교적 더 균일하였다. 점탄성을 비교하기위해 G'과 G"을 측정하였고 주입할 때 중요한 진동수인 1Hz에서의 G'과 G"은 Restylane이 약 600Pa과 90Pa, HAc10 필러가 약 1500Pa과 300Pa로 시제품보다 HAc10필러의 탄성이 약 2.5배, 점성이 약 3배 높았다. 27G 바늘은 통해 10mm/min의 속도로 주입력을 테스트한 결과 Restylane이 약 4N, HAc10필러가 약 9N정도로 HAc10필러를 주입하는데 들어가는 힘은 시제품보다 약 2배 높았다. 하지만 10N 근처의 주입력은 한손으로 주입하는데 아무 문제가 없는 정도의 힘으로 필러로서 적절한 주입력을 가졌다고 할 수 있다. 따라서, HAc10필러가 시제품보다 훨씬 뛰어난 물성과 적절한 주입력을 가지고 있는 것을 확인하였다.

실험예 6 - 하이드로젤 필러의 체내 지속성 평가(타사제품인 히알루론산 필 러와의 특성 비교)

저온에서 최적화된 HAc10 필러의 체내 지속성을 평가하기 위해 누드마우스의 등에 Restylane과 HAc10필러를 0.1cc씩 주입하여 MRI로 부피를 관찰하였고 필러입자 부분을 H&E 염색을 통해 관찰하였고 그 결과를 도 8에 도시하였다. MRI사진을 보면 0주에서는 두 필러의 부피가 거의 같았으나 10주 후에는 Restylane은 확연히 크기가 줄어든 반면 HAc10 필러는 크기가 거의 유지되었다. 필러입자부분 조직시편을 관찰한 결과, Restylane에서는 아무런 세포가 관찰되지 않았지만 HAc10필러입자 사이사이에 세포핵과 세포질이 염색된 섬유세포가 자라있는 것을 확인하였다. 이는, HAc10필러의 생체활성을 보여주고 필러입자주변을 감싸고 있는 조직들이 필러입자를 효소로부터 보호하여 필러의 분해를 늦춰주는데 도움을 준 것으로 생각할 수 있다. MRI로 계산된 필러부피 그래프에서 하루만에 Restylane은 주입량의 40%, HAc10필러는 주입량의 20%가 체온의 영향으로 팽윤이 된 것을 확인할 수 있는데, HAc10 필러의 팽윤도가 더 낮기 때문에 효소를 포함하는 체액의 침투가 적어 생분해속도가 지연되었고 10주후에 Restylane은 주입량의 40%밖에 남지 않은 반면, HAc10필러는 대략 주입량의 100%가 유지된 것을 확인할 수 있었다. 본 발명의 설계에 따라 저온에서 반응시키는 것에 의하여 실제 체내에서도 지속성이 유지됨을 확인하였다.

Claims (14)

1. 생분해성 고분자를 알칼리성 수용액에 용해시킨 고분자 용액에 가교제를 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하는, 점탄성 및 체내지속성이 증진된 하이드로젤의 제조방법에 있어서,
   상기 생분해성 고분자는 히드록시기(OH), 카르복실기(COOH) 또는 둘 모두를 포함하는 것으로, 분자 내 분해반응에 대한 활성화 에너지는 상기 가교제에 의한 상기 생분해성 고분자의 분자간 가교반응에 대한 활성화 에너지보다 더 높고, 상기 반응의 온도는 상기 알칼리성 수용액의 녹는점 이상 20℃ 미만인 것을 특징으로 가지는, 하이드로겔의 제조방법.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 생분해성 고분자는, 히알루론산, 콜라겐, 알지네이트, 녹말, 키토산, 젤라틴, 덱스트린, 셀룰로오스로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 것인,
   하이드로젤의 제조방법.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 히알루론산인 하이드로젤의 제조방법.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 반응의 온도는 3℃ 이상 20℃ 미만인 것인, 하이드로젤의 제조방법.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 단계는 5일 내지 30일 동안 수행하는 것인, 하이드로젤의 제조방법.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 알칼리성 수용액은 NaOH 수용액인 것인, 하이드로젤의 제조방법.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 단계에 의해 얻어진 하이드로젤을 세척하고 입자화하는 단계를 추가로 포함하는, 하이드로젤의 제조방법.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 가교제는 에폭사이드를 포함하는 화학적 가교제인 것인, 히알루론산 하이드로젤의 제조방법.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 에폭사이드를 포함하는 화학적 가교제는 1,4-부탄디올-디글리시딜 에테르 (BDDE), 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르 (EGDE), 폴리에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르 (PEGDE), 글리세롤 폴리글리시딜 에테르, 디글리세롤 폴리글리시딜 에테르로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것인, 하이드로젤의 제조방법.
   
10. 제8항에 있어서, 상기 에폭사이드를 포함하는 화학적 가교제는 1,4-부탄디올-디글리시딜 에테르(BDDE)인 것인, 하이드로젤의 제조방법.
    
11. 제1항에 있어서, 상기 생분해성 고분자 1g 당 상기 가교제는 10 내지 500μL인 것인, 하이드로젤의 제조방법.
    
12. 제1항에 의해 제조된 하이드로젤을 포함하며, 상온 인산완충식염수(PBS)에서 팽윤이 평형에 도달한 것인, 주입형 연조직 필러용 조성물.
    
13. 제12항에 있어서,
    상기 조성물의 G'값은 2000 내지 4000Pa인 것을 특징으로 하는, 주입형연조직 필러용 조성물.
    
14. 제12항에 있어서,
    상기 조성물은 체내 주입 후 10주 경과 후에도 초기 주입 부피에 대해 90% 이상이 유지되는 것을 특징으로 하는, 주입형 연조직 필러용 조성물.
    
    
    

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