KR20180040811A - 아민기가 포함된 생체 적합성 고분자로 가교시킨 히알루론산 조직수복용 생체 재료 및 이의 제조방법 - Google Patents

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소현숙
육경창
이용성
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Abstract

본 발명은 안면 주름을 개선하기 위한 히알루론산 조직수복용 생체 재료에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 아민기(-NH2)가 포함된 생체적합성 고분자를 가교제로 하여 알데하이드화 된 히알루론산과 결합시키는 것을 특징으로 하는, 히알루론산 생체수복용 재료 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 화학 가교제를 사용한 히알루론산 하이드로겔과 대비하여 주입력에는 차이가 없으나 주입후 생체내 잔존기간이 길고, 염증발생이 없는 효과가 있다.

Description

아민기가 포함된 생체 적합성 고분자로 가교시킨 히알루론산 조직수복용 생체 재료 및 이의 제조방법{Prosthesis biomaterial as hyaluronic acid coss-linked by biopolymer including amine and a method thereof}
본 발명은 안면 주름을 개선하기 위한 히알루론산 조직수복용 생체 재료에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 아민기(-NH2)가 포함된 생체적합성 고분자를 가교제로 하여 알데하이드화 된 히알루론산과 결합시키는 것을 특징으로 하는, 히알루론산 생체수복용 재료 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
피부는 표피와 진피로 구성되어 있다. 표피는 외부자극으로부터 피부를 보호하는 역할을 하고, 진피는 피부상태를 결정하는 층이다. 또한, 표피는 세라마이드, 진피는 히알루론산, 콜라겐 및 엘라스틴으로 구성되어 있다. 진피는 피부의 0.1~0.3mm 아래에 있는 층으로 두께가 0.6~4mm 정도인데 노화가 진행됨에 따라 진피의 두께가 얇아지게 된다. 한편, 진피의 구성성분 중 하나인 히알루론산은 콜라겐과 엘라스틴 섬유 사이에 채워져 있고, 노화가 진행됨에 따라 히알루론산이 소멸되면서 주름 발생의 원인이 된다.
피부의 노화가 진행됨에 따라 중력, 햇빛에 대한 노출등으로 인해 얼굴 주위에 많은 주름이 생기게 된다. 최근 아름다움에 대한 관심이 많아지면서 이러한 주름을 개선하고자 하는 요구가 점차 커짐에 따라 환자들은 부담이 적고 downtime 이 짧은 조직수복용 생체 재료를 이용하여 주름개선과 같은 미용적인 욕구를 해결하고자 하는 추세이다. 이에 따라 다양한 종류의 조직수복용 생체 재료가 연구 및 개발되고 있으며 그 수요가 점차 증가되고 있다.
대표적인 예로 히알루론산을 들 수 있는데 히알루론산(이하에서, "HA"로 약칭될 수 있음) 은, 하기 화학식 1에서와 같이 N-아세틸-D-글루코사민과 D- 글루쿠론산으로 이루어진 반복 단위가 선형으로 연결되어 있는 생체고분자 물질로, 히알루론산 유도체의 형태로 수술 후 유착방지용 필름 또는 겔, 주름개선용 삽입물, 성형 보조물 등 여러 용도로 사용되고 있다.
Figure pat00001
상기 식에서 n은 1 또는 그 이상의 정수이다.
종래의 히알루론산(HA) 조직수복용 생체재료들은 유지기간을 연장하는 방안으로 점성과 탄성을 높이기 위해 BDDE(1,4-Butanediol diglycidyl ether) 와 같은 단일성분 화학 가교제를 사용하여 가교 반응한 제품이 개발되어 왔다. 그러나, BDDE와 같은 합성 화학약품으로 가교할 경우 3가지 형태의 미반응 가교제로 인해 부작용이 발생하고 있다.
즉, BDDE의 양 말단기인 에폭시 그룹이 가수분해 되지 못하고 잔존하는 형태, 가수분해된 에폭시 그룹의 한쪽 말단만 히알루론산에 결합하는 형태로 인하여 염증, 부종, 발진과 같은 부작용이 발생하게 된다. 이러한 부작용 발생의 위험이 있음에도 불구하고, 제조된 히알루론산 조직수복용 생체 재료의 체내 유지기간은 보통 6개월에서 12개월 정도로 비히알루론산 조직수복용 생체재료보다 짧아서 반복적으로 시술해야 하는 불편함이 있다.
한편, 안면주름개선을 위한 조직수복용 생체재료는 단일상(monophasic)과 이중상(biphasic) 의 2가지 형태로 구성되어 있다. 단일상 형태의 조직수복용 생체 재료는 균질한 겔 형태로서 시술시 주입이 부드럽고 섬세한 모양을 가능케 하는 장점을 보유하고 있지만 형태 유지성이 낮다는 단점을 가지고 있다. 그에 비해 이중상 형태의 조직수복용 생체 재료는 히알루론산 용액에 입자형 겔이 혼합된 형태로 시술시 피부 볼륨감을 높일 수 있고, 형태 유지성이 높다는 장점을 보유하고 있다. 하지만, 단일상 형태의 조직수복용 생체 재료보다 주입시 주입력이 높다는 단점을 가지고 있다.
미국 공개특허 US-0175717 국제 공개특허 WO-0161085
본 발명은 단일성분 화학 가교제를 사용하지 않고, 아민기(-NH2) 를 포함하는 생체 적합성 고분자를 가교제로 사용하는 히알루론산 조직수복용 생체 재료 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은,
히알루론산 하이드로겔을 이용한 조직수복용 생체 재료에 있어서,
히알루론산을 과요오드산 나트륨을 사용하여 알데하이드화 한 히알루론산과 폴리 아민(polyamine)을 반응시켜 카르복실기에 아민기(-NH2)를 결합시킨 것을 특징으로 하는 히알루론산 조직수복용 생체 재료를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은,
히알루론산 또는 히알루론산 염에 폴리아민을 반응시켜 히알루론산 카르복실기에 아민기(-NH2)를 결합시키는 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 조직수복용 생체 재료는 단일성분 화학 가교제를 사용하지 않음으로서 시술시 발생되는 염증, 부종, 발진과 같은 부작용의 발생빈도를 기존 조직수복용 생체재료보다 줄일 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명에 따른 조직수복용 생체 재료는 이중상(biphasic) 형태의 조직수복용 생체재료로서 단일성분 화학 가교제를 사용한 이중상 형태의 조직수복용 생체 재료와 비슷한 형태의 주입력을 보유할 뿐만 아니라 단일성분 화학 가교제를 사용한 조직수복용 생체 재료보다 2배 이상 체내 유지기간이 긴 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 실시예 1 및 2와 비교예 1의 히알루론산 조직수복용 생체재료의 주입력(N)을 측정한 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 실시예 1 및 2와 비교예 1의 조직수복용 생체재료를 사용하여 생체조건하에서 측정한 분해율(DEGRADATION(%))을 측정한 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 실시예 1 및 2와 비교예 2, 양성대조군 및 음성대조군의 조직수복용 생체재료를 SD.rat 의 피내 조직에 주사하여 살펴본 염증반응유무를 시험한 이미지이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 아래와 같다.
본 발명은 히알루론산 하이드로겔을 이용한 조직수복용 생체 재료에 있어서,
알데하이드화 한 히알루론산(이하, A-HA로 표시함)에 아민기(-NH2)가 포함된 생체 적합성 고분자를 이용하여 가교결합 한 히알루론산 조직수복용 생체 재료를 제공하는 것이다.
본 발명은 히알루론산을 아민기가 포함된 생체 적합성 고분자와 가교 결합할 수 있도록 과요오드산나트륨(NaIO4)을 사용하여 알데하이드화 된 히알루론산(A-HA)을 수득하는 것을 포함한다.
본 발명에서 "히알루론산(hyaluronic acid)"은 아미노산과 우론산으로 구성된 뮤코다당류의 일종으로서, N-아세틸글루코사민과 글루쿠론산이 교대로 사슬모양으로 결합한 분자량이 20만 내지 40만 되는 고분자 화합물을 의미하는데, 점성이 크고 세균의 침입이나 독물의 침투를 막는 역할을 하며 본 발명의 목적상 하이드로겔을 형성하는 기본골격으로 사용된다.
본 발명에서 히알루론산의 종류는 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 순수한 히알루론산 또는 히알루론산 염을 사용할 수 있고, 상기 히알루론산 염에는 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 및 히알루론산 테트라부틸암모늄 중에서 1종 이상 선택될 수 있다.
본 발명에서 히알루론산의 분자량은 특별히 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 500Dka 내지 6,000Dka 가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1,000Dka 내지 3, 000Dka 이다.
본 발명에서 "폴리아민(polyamine)"은 생물계에 존재하는 생체아민으로서 제1급 아미노기를 2개 이상 가진 지방족 탄화수소를 의미하는 것으로, 단백질 및 핵산합성이 활발한 조직에 많이 존재한다.
본 발명에 따른 폴리아민은 특별히 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 생체유래의 천연 폴리아민을 사용할 수 있으며, 폴리스페르민(polyspermine), 폴리프트레신(polyputrescine), 폴리카다베린(polycadaverine) 및 폴리스페르미딘(polysperimidine) 중에서 1종 이상 선택될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예 및 비교예를 들어 더욱 상세히 설명하고자 하나, 본 발명이 하기 실시예에 의하여 제한적으로 해석되는 것은 아니다.
A-HA/ polyspermine 조직수복용 생체 재료
제조예 1
A-HA ( 알데하이드화 된 히알루론산) 제조
5g의 히알루론산 나트륨(분자량: 2.5×106Da)을 80㎖의 3차 증류수에 용해하여 12.5㎎/㎖의 농도인 히알루론산 나트륨 수용액을 제조하였다. 히알루론산 나트륨 수용액을 제조한 후 0.75g의 과요오드산나트륨을 25㎖의 3차 증류수에 용해하여 30mg/㎖ 농도의 과요오드산나트륨 수용액을 제조하였다.
그리고 피펫으로 25㎖의 과요오드산나트륨을 취하여 상기 히알루론산나트륨 수용액에 한 방울씩 떨어뜨리면서 고르게 퍼질 수 있도록 하였다. 그 후 빛이 없는 어두운 곳에서 2시간 동안 알데하이드화 반응을 하였다.
2시간 동안 반응 후 알데하이드화 반응을 중지하기 위해 5㎖의 에틸렌글리콜을 첨가하여 1시간 동안 실온에서 교반하였다.
또한 알데하이드화 된 히알루론산 나트륨 수용액을 MWCO 3500 투석막을 이용하여 3일 동안 투석하여 미반응물을 제거하였다. 그리고 99.7% 이상 에탄올을 사용하여 재결정화 한 후 3차 증류수로 3회 세척하였다.
미 반응물이 제거된 A-HA 를 -80℃에서 3시간 동안 동결한 후 -80℃조건하에서 3일 동안 동결건조하여 A-HA 분말을 수득하였다.
제조예 2
A-HA/ polyspermine 하이드로겔 제조
상기 제조예 1에서 수득은 2g의 A-HA를 100㎖의 PBS 용액(pH 7.0)에 용해하여 20mg/㎖의 농도로 제조하였다.
별도로 0.5g의 폴리스페르민(polyspermine)을 100㎖의 PBS 용액(p 7.0) 에 용해하여 5mg/㎖의 농도로 제조하였다. 각각 제조된 A-HA 용액과 폴리스페르민 용액을 혼합하여 하이드로겔을 제조하였다.
제조예 3
A-HA/ polyspermine 조직수복용 생체 재료
200㎛의 하이드로겔 입자를 제조하기 위하여, 상기 제조예 2에서 제조된 하이드로겔을 콜로이드밀로 분쇄하였다. 그리고 20mg/㎖ 농도인 하이드로겔이 포함된 분산 수용액을 제조하기 위하여 200㎛ 입자로 분쇄된 0.6g의 하이드로겔을 30㎖의 3차 증류수에 분산하였다.
한편, 히알루론산나트륨 수용액을 10mg/㎖ 농도로 제조하기 위하여 0.7g의 히알루론산 나트륨을 70㎖의 3차 증류수에 용해하였다.
그 후 증류수에 분산된 200㎛의 하이드로겔 입자가 포함된 30㎖의 수용액과 70㎖의 히알루론산나트륨 수용액을 혼합하여 30분 동안 50rpm/min의 속도로 교반하였다. 교반한 후 분산된 하이드로겔 입자 수용액이 포함된 히알루론산나트륨 수용액을 1㎖씩 채취하였다. 1㎖씩 채취된 수용액을 100개의 프리필드 실린지에 각각 충진한 후 프리필드 실린지를 오토클레이브(autoclave)에 넣고 고압증기멸균하였다.
A-HA/ polyputrescine 하이드로겔 및 조직 수복용 생체재료 제조
0.3g의 폴리프트레신을 100㎖의 PBS(pH 7.0) 용액에 용해하여 3mg/㎖의 농도로 제조하는 것을 제외하고는 실시예 1과 같은 방법으로 조직수복용 생체재료를 제조하여 증기 멸균하였다.
[비교예 1]
단일성분 화학가교제(BDDE, 부탄디올디글리시딜에테르)로 가교된 히알루론산(HA)조직수복용 생체 재료
2.5g의 히알루론산 나트륨(분자량 2.5×106Da)을 180㎖의 1% 수산화나트륨(NaOH) 수용액에 첨가하였다. 그 후 overhead stirrer를 사용하여 300rpm/min의 속도로 1시간 동안 교반함으로써 히알루론산 나트륨 수용액을 제조하였다. 한편, 943㎕의 BDDE를 17㎖의 1% 수산화나트륨 용액에 용해하여 상기 히알루론산 나트륨 수용액에 넣고 10분 동안 교반하였다. 교반한 후 50℃로 중탕된 bath 에 넣고 overhead stirrer를 사용하여 80rpm/min 속도로 2시간 30분 동안 교반함으로써 가교된 하이드로겔을 형성하였다.
그 후 200㎖의 PBS(pH 7.0, 5℃)용액에 넣어 하이드로겔을 팽윤시켰다. 팽윤시킨 하이드로겔을 MWCO(Molecular Weight Cutt-Off) 3500 투석막에 넣고, 3일 동안 투석하여 미 반응물을 제거하였다. 그리고 99.7% 이상인 에탄올을 사용함으로써 재결정화 하여 3차 증류수로 3회 세척하였다. 세척한 하이드로겔이 200㎛의 입자가 되도록 콜로이드밀을 이용하여 분쇄하였다. 또한, 20mg/㎖의 농도인 하이드로겔이 포함된 분산 수용액을 제조하기 위하여 200㎛ 입자로 분쇄된 0.6g의 하이드로겔을 30㎖의 3차 증류수에 분산하였다. 한편, 히알루론산 나트륨 수용액을 10mg/㎖ 농도로 제조하기 위하여, 0.7g의 히알루론산 나트륨을 70㎖의 3차 증류수에 용해하였다. 그런 후 증류수에 분산된 200㎛ 하이드로겔 입자가 포함된 30㎖의 수용액과 70㎖의 히알루론산 나트륨 수용액을 혼합하여 30분 동안 50rpm/min 속도로 교반하였다. 그리고 분산된 하이드로겔 입자 수용액이 포함된 100㎖ 히알루론산 나트륨 수용액을 1㎖씩 채취하였다. 1㎖씩 채취된 수용액을 100개의 프리필드 실린지에 각각 충진한 후 프리필드 실린지를 오토클래이브(autoclave)에 넣고 고압증기 멸균하였다.
상기 실시예 1 및 2와 비교예1에 의해 제조된 히알루론산 조직수복용 생체재료를 이용하여 아래의 시험을 실시한 후 평가하여 표로 나타내었다.
주입력 시험
본 발명의 주입력 평가는 AEF-2 모델인 push-pull gage(ALKOH M.H.M, 일본) 가 장착된 MV-1000N Ⅱ 모델인 push-pull gage stand 에서 실시하였다. 측정하고자 하는 시료액이 담긴 프리필드 실린지를 지그에 삽입한 후, 압축판에 프리필드 실린지의 밀대가 중앙에 위치하도록 조정하여 10mm/min 속도록 주입력 측정을 실시하였다. 주입력 측정은 실시예 1, 실시예 2 및 비교예 1을 각각 5회씩 측정하여 평균값을 계산한 후 표 1 및 도 1에 나타내었다.
최대주입력(N) 최저주입력(N) 평균주입력(N)
실시예 1 11.6 10.7 11.1
실시예 2 12.1 11.1 11.7
비교예 1 10.8 10.1 10.5
표 1 및 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 상기 실시예 1 및 2에 의한 조직수복용 생체재료의 주입력이 BDDE로 가교시킨 히알루론산 조직수복용 생체재료인 비교예1과 대비할 때 그 주입력 차이가 ±0.6N, ±1.2N 정도로 비슷한 수치인 것을 확인할 수 있었다. 즉, 이중상의 장점을 가지면서 주입력은 단일상과 비슷한 장점이 있다.
분해능 가속시험
본 발명에 따른 실시예 1 및 2에 의해 제조된 알데하이드화된 히알루론산(A-HA)/아민기(-NH2)를 포함하는 생체 적합성 고분자 하이드로겔의 생체내 지속시간을 예측하기 위하여 히알루로니다아제(TCI, bovine 유래)를 PBS 용액(pH 7.0)에 첨가하여 5 unit/㎖ 제조한 후 분해능 가속시험에 사용하였다.
상기 실시예 1 및 2 및 비교예 1의 하이드로겔 1㎖를 히알루로니다아제 용액 5㎖에 넣고 37℃로 설정된 오븐에서 1,3,5 및 7시간 동안 반응한 후 히알루로니디아제를 비활성화하기 위해 70℃에서 10분간 가열하였다. 가열하고 남은 잔존물질을 스크리닝하여 분리하였다. 분리한 후 분해능 가속시험을 2회 반복함으로써 평균값을 구하여 분해능(degradation)(%)을 측정하였다. 이때 분해능시험을 시작하기 전의 샘플무게 (mg), 일정한 시간 후 완전히 건조한 샘플무게(mg)를 기록한 후 표 1 및 도 2에 나타내었다.
A : 분해능 시험을 시작하기 전의 샘플무게(mg)
B : 일정한 시간 후 완전히 건조된 샘플무게(mg)
분해능(Degradation)(%) =(A-B/A)×100
시간(hr)
 분해능(dergradation %)
실시예 1 실시예 2 비교예 1
1 3.2 4.4 60.8
3 8.5 12.1 73.8
5 16.5 23.1 82.1
7 18.5 25.8 93.4
상기 표 2 및 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1 및 2에 의해 제조된 조직 수복용 생체 재료의 경우 화학가교제를 사용한 히알루론산 하이드로겔에 비해 분해능이 매우 낮아 체내 유지기간이 상대적으로 우수함을 알 수 있다.
유변학적 특성시험
상기 실시예 1 및 2에 의해 제조된 A-HA/polyspermine 하이드로겔과 A-HA/polyputresine 하이드로겔 및 비교예 1의 하이드로겔의 유변학적 특성 시험을 행하였다.
유변학적 특성은 저장탄성율(G'), 손실탄성율(G")과 % 탄성도를 레오미터(T.A. Instruments Ltd., 미국)를 이용하여 측정하였다. 25℃에서 40mm 2° 콘플레이트 지오미터(cone-plate geometer)를 사용하여 0.01~1 Hz 범위에서 실험을 3회 실시하였으며, 저장탄성률(G')과 손실탄성율(G")은 0.02Hz 에서 측정하였다. 이때 3회 측정한 저장탄성률(G')과 손실탄성률(G")의 평균값을 구하여 표 3에 나타내었다.
또한, 3회 측정한 저장탄성률(G')과 손실탄성률(G") 의 평균값을 사용함으로써 % 탄성도는 아래와 같은 식을 사용하여 계산한 후 표 3에 나타내었다.
percentage elasticity(%) = [G'/(G'+G")]×100
저장탄성률(G') 손실탄성률(G") 탄성도(%)
실시예 1 481.1 159.3 75.12
실시예 2 482.4 159.7 75.13
비교예 1 470.2 160.5 74.55
염증반응 유무시험
본 시험은 비교예 1에서 BDDE로 가교시킨 조직수복용 생체 재료와 실시예 1 및 2에 따른 생체 적합성 고분자를 가교제로 사용한 조직수복용 생체재료 1㎖를 SD.rat의 피내 조직에 주사하여 피부내 염증반응을 평가하였다. 이때 시험은 조직수복용 생체재료별 각각 쥐 7마리씩, 그리고 양성대조군(positive control-조직수복용 생체재료를 투입하지 않은 쥐)에 사용되는 쥐 3마리와 음성대조군(negative control-1㎖의 saline을 투입한 쥐)에 사용하는 쥐 3마리로 총 27마리의 쥐를 사용하여 시험을 행하였다.
그리고, 실험동물의 정맥 내에 케타민(ketamine) 및 실라진(silazane)을 투입하여 마취한 후 실험물질을 피내 주사하였다.
0일차 : AO군(비교예 1), BO군(실시예 1), CO군(실시예 2). DO군(양성대조군) 및 EO(음성대조군)
-쥐의 등을 면도한 후 시료의 주사(쥐 1마리당 1㎖의 조직수복용 생체 재료 또는 saline)
7일차 : A7군(비교예 1), B7군(실시예 1), C7군(실시예 2). D7군(양성대조군) 및 E7(음성대조군)
- 각 실험군의 염증발생 확인을 위하여 주사부위의 조직을 채취하였으며, 채취한 조직을 H & E (Hematoxylin and Eosin)stainning 하여 염증발생 유무를 확인하였다.
-피부 염증 발생에 대한 조직학적 분석을 하기 도 3에 나타내었다.
도 3에서 보여지는 바와 같이 BDDE로 가교시킨 조직수복용 생체 재료(비교예 1) A7군 (쥐7마리) 중 2마리에서 염증이 발생되었지만, 생체적합성 고분자의 가교제로 사용한 본 발명에 따른 실시예 1 및 2의 B7 및 C7에서는 염증이 발생되지 않은 것을 살펴볼 수 있었다.
또한, 상기 양성대조군인 D7과 음성대조군 E7 군의 염증 발생 여부를 살펴보았으나, 모두 염증이 발생되지 않음을 알 수 있었다.

Claims (8)

  1. 히알루론산 하이드로겔을 이용한 조직수복용 생체 재료에 있어서,
    히알루론산을 과요오드산나트륨을 사용하여 알데하이드화 한 히알루론산과 폴리아민(polyamine)을 반응시켜 카르복실기에 아민기(-NH2)를 결합시킨 것을 특징으로 하는, 히알루론산 조직수복용 생체 재료.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 히알루론산은 순수한 히알루론산 또는 히알루론산염이며, 상기 히알루론산염은 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 등의 무기염과 히알루론산 테트라부틸 암모늄 등의 유기염 중에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는, 히알루론산 조직수복용 생체재료.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 히알루론산 또는 히알루론산염의 분자량은 500kDa 내지 6,000kDa 인 것을 특징으로 하는, 히알루론산 조직수복용 생체재료.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 폴리아민은 제1급 아미노기를 2개 이상 가진 지방족 탄화수소로, 폴리스페르민(polyspermine), 폴리프트레신(polyputresceine), 폴리스페르미딘(polyspermidine), 폴리카다베린(polycadaverine) 중에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는, 히알루론산 조직수복용 생체재료.
  5. a) 히알루론산 또는 히알루론산염에 과요오드산나트륨을 반응시키는 단계;
    b) 어두운 곳에서 알데하이드화 반응을 시키는 단계;
    c) 투석을 통해 미반응물을 제거하는 단계;
    d) 에탄올을 이용하여 재결정화하는 단계;
    e) 증류수로 세척하는 단계;
    f)동결건조하여 히알루론산-알데하이드 유도체를 수득하는 단계;
    g) 폴리아민용액을 혼합하여 아민기(-NH2)가 결합된 하이드로겔을 수득하는 단계;
    를 포함하여 구성되는, 히알루론산 조직수복용 생체재료의 제조방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 히알루론산은 순수한 히알루론산 또는 히알루론산염이며, 상기 히알루론산염은 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 등의 무기염과 히알루론산 테트라부틸 암모늄 등의 유기염 중에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는, 히알루론산 조직수복용 생체재료의 제조방법.
  7. 제 5항 또는 제 6항에 있어서,
    상기 히알루론산 또는 히알루론산염의 분자량은 500kDa 내지 6,000kDa 인 것을 특징으로 하는, 히알루론산 조직수복용 생체재료의 제조방법.
  8. 제 5항에 있어서,
    상기 폴리아민은 제1급 아미노기를 2개 이상 가진 지방족 탄화수소로, 폴리스페르민(polyspermine), 폴리프트레신(polyputresceine), 폴리스페르미딘(polyspermidine), 폴리카다베린(polycadaverine) 중에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는, 히알루론산 조직수복용 생체재료의 제조방법.
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