KR20150140149A - 경피 또는 경점막 전달용 히알루론산 유도체-펩타이드 결합 컨쥬게이트, 이를 포함하는 면역 조절용 조성물 및 약물 전달체 - Google Patents
경피 또는 경점막 전달용 히알루론산 유도체-펩타이드 결합 컨쥬게이트, 이를 포함하는 면역 조절용 조성물 및 약물 전달체 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 히알루론산 유도체 및 활성성분인 펩타이드가 상기 히알루론산 유도체에 결합된 컨쥬게이트에 관한 것이다. 또한, 상기 컨쥬게이트를 포함하는 면역반응을 조절하는 면역 조절용 조성물 및 활성성분을 경피 또는 경점막을 통해 전달하는 약물 전달체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 컨쥬게이트는 경피 또는 경점막에 처리됨으로써 신체의 1차 방어막인 피부조직을 통과하여 체내로 들어갈 수 있고, 백신으로서의 효과가 나타날 수 있을 정도로 충분한 정도의 항원 특이적 면역반응을 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 효율적으로 유효 약효 성분을 체내로 전달할 수 있고, 비점막에 처리하는 경우 뇌까지 직접 유효 약효 성분을 우수하게 전달할 수 있다. 따라서, 본 발명의 컨쥬게이트는 면역 반응의 조절제, 단백질 치료제의 경피 전달 약물제제, 뇌로의 약물 전달 시스템 등으로 효과적으로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 히알루론산 유도체 및 활성성분인 펩타이드가 서로 결합된 컨쥬게이트에 관한 것이다. 또한, 상기 컨쥬게이트를 포함하는 면역반응을 조절하는 면역 조절용 조성물 및 활성성분을 경피 또는 경점막을 통해 전달하는 약물 전달체에 관한 것이다.
백신과 같은 항원성 약물의 송달 또는 투여는 경구, 경비, 근육 내(intramuscular), 피하(subcutaneous), 및 피내(intradermal)를 포함하는 다양한 투여 경로를 통하여 이루어지고 있다. 그 중에서도 대다수의 상업적 백신은 근육 내 또는 피하 경로로 주사기 및 바늘을 사용한 통상의 주사에 의해 투여되고 있다
상기 근육 내 또는 피하 주사를 통한 백신 접종은 가장 보편적인 방법이기는 하지만 환자의 불순응도(patient incompliance), 통증/두려움(pain/phobia) 등과 같은 다양한 한계를 가지며 이러한 한계들로 인해 백신 접종은 아이들과 성인 모두에게 스트레스로 받아들여지기도 한다.
이러한 단점들을 극복하기 위한 다양한 연구들이 이루어졌고 그 중 피부 및 점막을 통한 경피 및 경점막 백신 전달 방법은 피부 및 점막 조직의 넓은 면적과 이로 인한 접근의 용이성이 있으며, 피부 및 점막 조직에 널리 분포하고 있는 면역세포를 직접 표적할 수 있다. 나아가, 경구 전달과는 달리 소화관의 가혹한 환경을 피해가고 위장관 약물 대사를 거치지 않으며 1차 통과 효과를 감소시키고 소화 및 간 효소에 의해 불활성화될 가능성이 없는 등 여러 장점들로 인해 주목 받고 있다.
또한, 유효 약효 성분을 전달하는 시스템으로 경피 또는 경점막을 통한 전달 시스템을 이용하여 약물전달을 할 경우 고통이 없고 환자 스스로 약물의 투여가 가능하며, 시간과 장소에 구애 받지 않고 치료를 할 수 있다는 장점이 있다.
하지만 신체에서 외부 물질의 오염에 대한 1차 방어막인 피부조직을 통과하여 체내로 들어갈 수 있는 유효 약리 성분의 양이 적기 때문에 활발하게 응용되지 못하고 있었다.
피부는 신체를 외부의 위험으로부터 보호하는 물리적 장벽일 뿐만 아니라 면역계의 핵심적인 부분이기도 하다. 피부의 면역 기능은 총체적으로 피부 면역계로 알려진, 선천적 및 후천적 면역 기능을 갖는 생존하는 표피 및 진피의 주거 세포 및 체액 구성 성분들의 집합으로부터 발생한다.
따라서, 경피 또는 경점막을 통한 항원성 약물 또는 약물 전달 시스템의 성공 및 안정성은 피부 면역계에 대한 효과에 달려있다.
하지만 대부분의 비침습적 경피 및 경점막 전달은 충분한 정도의 항원 특이적 면역반응을 유도하지 못하거나 피부조직을 통과하여 체내로 들어갈 수 있는 유효 약리 성분이 적은 경우가 많아 보다 효과적인 경피, 경점막 흡수 및 항원특이적 면역반응의 유도가 가능한 비침습적 전달 시스템에 대한 개발이 필요한 실정이다.
이러한 문제점을 해소하기 위하여, 본 발명은 경피 또는 경점막을 통하여 충분한 항원 특이적 면역반응을 유도할 수 있고, 피부조직을 효율적으로 통과하여 체내로 유효 약효 성분을 전달할 수 있는 컨쥬게이트를 제공하는 것을 목적으로 한다. 보다 상세하게, 본 발명의 목적은 하기 화학식 1의 히알루론산 유도체 및 활성성분인 펩타이드가 상기 히알루론산 유도체에 결합된 컨쥬게이트를 제공하는 것이다.
[화학식 1]
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 컨쥬게이트로서, 상기 펩타이드가 면역원성 항원이며, 상기 컨쥬게이트를 포함하는 면역반응을 조절하는 면역조절용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 컨쥬게이트를 포함하고, 활성성분을 피부 또는 점막을 통해 전달하는 약물 전달체를 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1의 히알루론산(hyaluronic acid, HA) 유도체 및 활성성분인 펩타이드가 상기 히알루론산 유도체에 결합된 컨쥬게이트에 관한 것이다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 동일하거나 상이할 수 있으며, 알데히드기, 아민기, 바이닐그룹, 치올기, 알릴옥시그룹, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디치오)프로피오네이트(N- Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate, SPDP) 또는 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)이고,
m과 n의 합은 5 내지 50 미만의 정수이고, n은 1 내지 25의 정수이다.
바람직하게, 상기 등의 R1 및 R2를 포함하는 히알루론산의 유도체의 예로는, HA-디아미노부탄(HA-diaminobutane), HA-헥사메틸렌디아민(HA-hexamethylenediamine), HA-알데하이드(HA-aldehyde), HA-아디픽산 디하이드라지드(HA-Adipic Acid Dihydrazide, HA-ADH), HA-2-아미노에틸 메타크릴레이트 하이드로클로라이드(HA-2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride), HA-스페르민(HA-Spermine), HA-스페르미딘(HA-spermidine), HA-SPDP, HA-NHS 등을 들 수 있다. 또한, 환(ring) 구조를 개환하지 않고 카르복실 그룹을 변형하여 치환기를 도입하는 경우도 포함한다.
이러한 히알루론산 유도체는 히알루론산의 독특한 흡습 및 양친특성과 아울러 피부에 널리 분포하는 히알루론산 수용체를 통해 용매(solvent) 나 계면활성제(surfactant) 등 별도의 체내침투 촉진제(permeation enhancer) 의 도움 없이도 활성성분인 펩타이드를 경피 및 경점막 경로로 전달할 수 있다.
상기 m과 n의 합이 10 내지 50 미만의 정수이고, n은 1 내지 25의 정수일 경우의 히알루론산 유도체(이하, 저분자 히알루론산)는 m과 n의 합이 5000을 초과하는 히알루론산 유도체(이하, 고분자 히알루론산) 또는 m과 n의 합이 50초과 5000 미만인 중간 정도의 분자량을 갖는 히알루론산에 비하여 확산 계수(diffusion coefficient) 및 투과 계수(permeability coefficient)가 크기 때문에 보다 효과적으로 경피 및 경점막 경로로 전달될 수 있다.
나아가, 저분자 히알루론산은 고분자 히알루론산에 비하여 별도의 보조제 분자(adjuvant molecules)의 도움 없이 피부 및 점막 조직에 널리 분포한 랑게르한스 세포(Langerhans cell, LC) 등 면역능력이 있는 세포들의 세포 표면 수용체(TLR-2, TLR-4를 포함한 Toll Like Receptors (TLRs) 및 히알루론산의 주요 수용체인 CD44, RHAMM 등)를 통해 면역 세포를 활성화(activation), 자극(stimulation)함과 동시에 염증 세포(inflammatory cell)와 면역 세포(immune cell)들의 동원(recruitment)등의 작용을 촉진함으로써 보다 효과적인 항원 제시와 이에 따른 항원 특이적 면역반응 유도를 돕는 보조제(adjuvant)로의 기능을 할 수 있다.
이와 같이, 저분자 히알루론산을 포함하는 본 발명의 컨쥬게이트는 경피 또는 경점막 전달을 통해 특정 항원 펩타이드를 피부 및 점막 내 면역 제시 세포(immune presenting cell)에 효과적으로 전달하여, 우수한 항원 제시(antigen presenting)를 유도하는 항원 전달체(carrier)로의 기능을 할 수 있다.
또한, 저분자 히알루론산은 우수한 점막점착제(mucoadhesive)적인 특성을 갖고 있어 점막에 오래도록 머무를 수 있도록 할 뿐만 아니라 점막을 통하여 점막 내부로 원하는 약물을 효과적으로 투과(penetration) 시킬 수 있다.
일예로, 본 발명의 컨쥬게이트에서 히알루론산 유도체는 하기 화학식 2의 히알루론산-알데하이드일 수 있다.
[화학식 2]
상기 화학식 2에서,
m과 n의 합은 5 내지 50의 정수이고, n은 1 내지 25의 정수이다.
또한, 상기 히알루론산-알데하이드는 10 내지 50몰%의 알데하이드기 치환율을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 "히알루론산-알데하이드 치환율"은 전체 히알루론산 반복단위 중 셀룰로오스의 고리 구조가 오픈(open)되어 알데하이드기가 형성된 반복단위의 몰 비율로 정의되며, 치환율이 상기 범위에 미달할 경우, 결합 가능한 단백질의 양이 너무 적어 원하는 효과를 충분히 낼 수 없으며, 상기 범위를 초과할 경우 치환율이 지나치게 높아 히알루론산(HA) 수용체와 상호작용을 하기가 어려워 표적화(targeting) 효과를 기대하기 힘든 문제가 있어 바람직하지 않을 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 본 발명의 컨쥬게이트는 히알루론산 유도체 한 분자에 1 내지 10개 분자수의 펩타이드가 결합된 것일 수 있다. 상기와 같은 범위 내의 분자수의 펩타이드가 결합된 컨쥬게이트는 히알루론산 유도체의 치환율에 따라 체내에서 24시간 내지 96시간 이상 머무를 수 있으며, 이를 조절함으로써 약효장기지속성 시스템으로의 응용이 가능하다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 본 발명의 컨쥬게이트는 하기 화학식 3의 구조를 갖는 컨쥬게이트일 수 있다.
[화학식 3]
상기 화학식 3에서,
상기 R1 및 R2는 동일하거나 상이할 수 있으며, 각각 독립적으로 알데히드기, 아민기, 바이닐기, 치올기, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜치오)프로피오네이트, N-하이드록시숙신이미드기일 수 있고,
P 는 활성성분인 펩타이드이고,
m, n, 및 l의 총 합은 5 내지 50의 정수이고, n과 l의 합은 1 내지 25의 정수이고, l은 1 내지 25의 정수이다.
바람직하게, 상기 히알루론산의 유도체의 예로는, HA-디아미노부탄(HA-diaminobutane), HA-헥사메틸렌디아민(HA-hexamethylenediamine), HA-알데하이드(HA-aldehyde), HA-아디픽산 디하이드라지드(HA-Adipic Acid Dihydrazide, HA-ADH), HA-2-아미노에틸 메타크릴레이트 하이드로클로라이드(HA-2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride), HA-스페르민(HA-Spermine), HA-스페르미딘(HA-spermidine), HA-SPDP, HA-NHS 등이 될 수 있다. 또한, 링을 오프닝 하지 않고 카르복실 그룹을 변형하여 치환기를 도입하는 경우도 포함한다.
본 발명의 컨쥬게이트에서 상기 히알루론산 유도체에 생접합되는 펩타이드는 특별히 제한되지 않고 사용될 수 있으며, 히알루론산 1 분자수에 대해, 펩타이드 1 내지 10 분자수가 결합될 수 있다. 이러한 펩타이드는 장기간 주기적인 약물치료가 동반되는 질병 또는 피부질환을 전신 또는 국소적으로 예방, 치료하기 위한 펩타이드 약물일 수 있으며, 이러한 펩타이드 약물은 예컨대, CNS를 표적으로 한 펩타이드 혹은 펩타이드 기반 약물일 수 있으며 뇌혈류(cerebral blood flow)와 관련된 혈관활성 장펩타이드(vasoactive intestinal peptide), 전뇌허혈(Global brain ischemia)과 관련된 뇌유래 신경성장인자(Brain derived neurotropic factor), 소상성 뇌허혈(Focal brain ischemia)과 관련된 섬유아세포 성장인자(Fibroblast growth factor), 알츠하이머병과 관련된 베타-아밀로이드(β-Amiloid) 유래 합성 폴리펩타이드, 신경보호성 펩타이드, BH4-도메인 펩타이드와 같은 항-아폽토시스 펩타이드, LHRH 아고니스트와 같은 항암성 펩타이드, G-단백질 연관 수용체(G protein-coupled receptors, GPCR) 패밀리 안타고니스트 및 아고니스트와 같은 세포 표면 수용체에 대한 아고니스트 및 안타고니스트 펩타이드를 포함한 각종 생리활성을 갖는 합성 펩타이드 및 폴리펩타이드, 항체 또는 그의 단편(예를 들어, Fab 단편), 칼시토닌, 골형성인자, 콜로니자극인자, 인슐린, 성장호르몬, 렉틴, 인터페론, 에리스로포이에틴, 글루카곤 유사 펩타이드일 수 있다. 또한 상기 장기간 주기적인 약물치료가 동반되는 질병 또는 피부질환로서 바람직하게는 왜소증, 암, 당뇨병, 화상, 아토피, 건선, 습진, 피부염, 여드름, 탈모 또는 대상포진을 예방, 치료하기 위한 펩타이드 약물일 수 있다. 나아가, 바람직하게, 상기 생접합되는 펩타이드는 면역원성 항원 펩타이드일 수 있다. 예를 들어, DMD 와 같은 단백질 기능 이상으로 인한 유전질환 치료용 폴리 펩타이드 항원(예를 들어, 마이오스타틴 단백질에 대한 펩타이드 항원), 말라리아와 같은 기생충 질환의 원인이 되는 기생충에 대한 폴리펩타이드 항원 (예를 들어, 플라스모듐 기생충에 대한 펩타이드 항원), 및 C형 간염 바이러스(HCV)(예를 들어, HCV 코어 단백질의 단편 펩타이드), B형 간염 바이러스(HBV)(예를 들어, cytolytic T lymphocyte (CTL) epitope, HBV X protein derived epitope에 대한 합성 펩타이드), 인유두종 바이러스(HPV)(예를 들어, oncogenic viral protein 인 E7 에 대한 합성 peptide), 구제역 바이러스(FMD virus)(예를 들어, VP1 Proteind의 프래그먼트 펩타이드), 종양 관련 항원(tumor-associated antigens, TAAs) 펩타이드, 인간 백혈구 항원 한정 펩타이드(Human Leukocyte Antigen restricted peptide), 세포독성 T 세포(Cytotoxic T lymphocytes, CTL) 에피토프 펩타이드, HER2(human epidermal growth factor receptor 2)-유래 펩타이드, 텔로미어 역전사효소(telomerase reverse transcriptase, TERT) 서브유닛 펩타이드, MUC1 종양 항원 펩타이드, p53 또는 K-ras 펩타이드, 히트 쇼크 단백질 A 부분 펩타이드(Heat Shock Proteins A partial peptide) 및 흑색종 항원 유전자-1-유래 펩타이드(melanoma antigen gene-1-derived peptide)로 이루어지는 군에서 선택된 면역원성 항원 펩타이드일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 면역원성 항원 펩타이드가 상기 히알루론산 유도체와 결합된 본 발명에 따른 컨쥬게이트는 피부 조직 내 면역세포, 바람직하게는 랑게르한스 세포와 수지상 세포를 자극함에 있어 이들과의 상호작용을 증가시켜, 펩타이드만을 적용한 경우에 비해 보다 강력한 면역 반응을 일으킬 수 있다는 장점을 갖는다.
본 발명에 따른 컨쥬게이트는, 상기 화학식 1 또는 2의 히알루론산 유도체를 제조하는 제1단계; 및 상기 히알루론산 유도체를 펩타이드의 N-말단과 반응시키는 제2단계를 통해 제조될 수 있다. 바람직하게, 히알루론산 유도체를 제조하기 위한 제1단계에서는, 히알루론산 또는 이의 염을 물에 용해시킨 후, 산화제와 암(dark) 조건 하에 반응시켜 셀룰로오스의 환(ring) 구조를 여는 단계를 포함하여 수행될 수 있으며, 추가로 증류수로 투석하여 정제하는 공정을 수행할 수도 있다. 제2단계는 상기 제1단계에서 제조된 히알루론산 유도체를 펩타이드의 N-말단과 반응시켜 본 발명에 따른 컨쥬게이트를 제조하는 단계로서, 바람직하게, pH 5 내지 7의 완충용액에서 접합 공정을 수행하는 것으로 이루어질 수 있으나, 펩타이드와 히알루론산 유도체의 종류에 따라 적절히 조절 가능하다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 마이오스타틴 단백질에 대한 항원으로 서열번호 1의 아미노산 서열(MstnF; VFLQKYPHTHLVHQA)로 이루어진 펩타이드 항원을 사용하였다. 마이오스타틴은 골격근 발달의 음성 조절자(negative regulator)로 근원성 재생(myogenic regeneration)의 억제에 관련되어 있다. 마이오스타틴의 결손(knockout)은 골격근 무게의 증가와 함께 근섬유의 크기 및 증식의 증가를 나타낸다.
본 발명에 따른 컨쥬게이트는 피부 또는 점막을 통해(경피/경점막), 약물, 바람직하게는 펩타이드를 목적하는 세포 또는 조직에 효과적으로 전달할 수 있다. 이와 관련하여, 경점막 경로로 펩타이드를 투여하는 경우에는 점막 조직이 점막층으로 보호되어 있기 때문에, 면역 원성 항원 등과 같은 펩타이드들의 이동이 극히 제한된다. 이를 개선하기 위해, 종래, 나노입자와 같은 별도의 담체를 사용하고자 하였으나, 이 역시 점막층에 갇히거나 점막층의 보호 효과로 인해 잔존 시간이 매우 단축되어 효과적인 경점막 전달에는 한계가 있었다. 그러나, 본 발명에 따른 컨쥬게이트는 경점막, 특히 비(鼻)점막을 통해 인체 내로 흡수되는 경우, 효과적으로 점막을 이동하여, 펩타이드를 원하는 세포 또는 조직, 심지어 뇌혈관장벽(blood brain barrier)에 의해 약물의 이행이 극히 제한되는 뇌에까지 전달할 수 있어, 신경교종, 성상세포종, 핍지교종(Oligodendrogliomas), 상의세포종(Ependymomas), 뇌수막종(Meningiomas), 혈관모세포종(Hemangioblastomas), 청신경종(Acoustic neuromas), 두개인두종(Craniopharyngiomas), 림프종(Lymphomas), 생식세포 종양(Germ cell tumours) 등과 같은 암뿐만 아니라, 루게릭병(근위축성 축삭경화증, Amyotrophic lateral sclerosis), 알츠하이머병, 헌팅턴병 등과 같은 신경퇴행성 질환과 허혈성 뇌손상(ischemic brain injury)과 같은 다양한 신경성 질환을 선택적으로 치료할 수 있다.
또 하나의 양태로, 본 발명은 히알루론산 유도체와 면역 반응 관련 펩타이드가 결합된 컨쥬게이트를 포함하는 면역 조절용 약학 조성물에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 히알루론산 유도체는 화학식 1 또는 2의 히알루론산 유도체이며, 상기 컨쥬게이트는 화학식 3의 컨쥬게이트일 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 약학 조성물은 경피 또는 경점막을 통하여 효과적으로 체내로 들어간 후, 체내의 면역 관련 세포 등을 표적화시켜 이들 세포와 접촉시킨 후, 이들 세포와 상호작용하여 이들의 생리활성을 조절하는 등과 같은 다양한 기전에 의해 면역을 조절할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "면역 조절"은, 면역 반응 유발 및 면역 반응 억제를 모두 포함하는 개념으로서, 본 발명에 따른 약학 조성물이 면역 반응을 유발시킬 것인지 혹은 면역 반응을 억제할 것인지는 조성물 내의 컨쥬게이트에 존재하는 활성성분, 즉 면역 반응 관련 펩타이드의 작용에 따라 달라진다. 예를 들어, 알레르기 및 자가면역 질환 등 특정 항원에 의한 과민반응을 억제할 수 있는 펩타이드인 경우 면역반응을 억제할 수 있고, 조절자 T 세포(regulatory T cell)의 개시(initiation)를 통해 이와 관련된 질환의 치료를 위해 면역반응을 유발할 수 있다. 바람직하게는, 상기 면역 반응 관련 펩타이드는 면역원성 항원 펩타이드로, 면역 반응을 유발할 수 있다.
상기 약학 조성물은 다양한 경피 또는 경점막 투여 제제, 바람직하게는 패치제 또는 외용제 형태로 사용될 수 있다. 패치제는 본 발명의 화합물을 제어된 양으로 연속 또는 비연속 주입하기 위해 사용될 수 있다. 약학 제제를 전달하기 위한 패치제의 구조 및 사용은 업계에 널리 알려져 있으며, 연속, 박동적으로, 또는 약학 제제의 전달 요구에 따라 당업자에 의해 적절히 변형될 수 있다. 외용제는 피부에 직접 도포하는 등의 방식을 통해 적용되는 조성물을 의미하며, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 연고제, 겔제, 크림제, 로션제, 액제, 스프레이제 등으로 제제화될 수 있고, 그 구성 및 사용은 패치제와 같이 약학 제제의 전달 요구에 따라 당업자에 의해 적절히 변형될 수 있다.
본 발명의 실시예에서는, 본 발명에 따른 컨쥬게이트 및 조성물에 의해 효과적인 항원 펩타이드의 경피 또는 경점막 전달을 통한 질병 치료방법을 제공할 수 있음을 확인하기 위해, 마이오스타틴 단백질에 대한 특이적 펩타이드 항원인 마이오스타틴 단백질 단편(myostatin protein fragment, MstnF)을 사용하여 대표적 뒤셴근이영양(Duchen's Muscular Dystrophy, DMD) 모델 동물인 mdx 마우스에서 표적 단백질인 마이오스타틴(myostatin)의 기능을 경피 면역법(transdermal immunization)을 통해 억제시켜 mdx 마우스의 이영양증 표현형(dystrophic phenotype)를 개선하는 면역중화에 의한 면역치료요법을 제공할 수 있는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, 상기 마이오스타틴 단백질 단편을 내재적인 보조제(inherent adjuvant) 특성을 갖는 저 분자량의 히알루론산 유도체에 중합하고, 이를 1회 경피 전달 후 1주일 뒤 동량을 1회 경피전달을 통해 부스팅(boosting) 하는 방법으로 면역능력이 있는 피부 세포(immunocompetent skin-resident cell)에 의한 효과적인 경피 백신효과의 유도가 가능하며 이를 통해 형성된 마이오스타틴 특이적 항체가 mdx 마우스에서 이영양증 표현형을 해부학적(anatomical), 생리학적(physiological), 그리고 생화학적(biochemical) 척도에서 개선할 수 있음을 확인하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 활성성분인 펩타이드가 펩타이드 약물이고, 이 펩타이드 약물이 히알루론산 유도체와 결합된 컨쥬게이트를 포함하는, 경피 또는 경점막 전달용 약물 전달체에 관한 것이다.
상기 컨쥬게이트를 구성하는 요소 중 히알루론산 유도체는 상기 화학식 1 또는 1의 히알루론산 유도체를 의미하며, 사용가능한 펩타이드 약물의 종류는 앞서 본 발명의 컨쥬게이트에서 설명한 바와 같다. 바람직하게, 상기 컨쥬게이트는 화학식 3의 구조를 나타낸다.
구체적인 일 실시예로서, 본 발명에 따른 히알루론산 유도체에 형광표지된 MstnF 펩타이드를 이용하여 HA-MstnF-FITC 접합체를 제조하고 이를 털이 없는 마우스(hairless mouse)에 경피 흡수시키고 그 전달여부를 확인한 결과, 상기 컨쥬게이트가 매우 효과적으로 피부 속에 침투하였음을 확인하였다.
이와 같이, 본 발명에 따른 컨쥬게이트는 경피 또는 경점막을 통하여 체내로 전달되어, 백신으로서의 효과가 나타날 수 있을 정도로 충분한 정도의 항원 특이적 면역반응을 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 효율적으로 유효 약효 성분을 체내로 전달할 수 있고, 비점막에 처리하는 경우 뇌까지 직접 유효 약효 성분을 우수하게 전달할 수 있으므로, 기존에 비침습적 경로로 투여하기 매우 곤란하였던 펩타이드를 효과적으로 투여할 수 있게 하였다는 장점을 갖는다.
본 발명에 따른 컨쥬게이트는 경피 또는 경점막에 처리됨으로써 신체의 1차 방어막인 피부조직을 통과하여 체내로 들어갈 수 있고, 백신으로서의 효과가 나타날 수 있을 정도로 충분한 정도의 항원 특이적 면역반응을 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 효율적으로 유효 약효 성분을 체내로 전달할 수 있고, 비점막에 처리하는 경우 뇌까지 직접 유효 약효 성분을 우수하게 전달할 수 있다. 따라서, 본 발명의 컨쥬게이트는 면역 반응의 조절제, 단백질 치료제의 경피 전달 약물제제, 뇌로의 약물 전달 시스템 등으로 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 히알루론산 유도체(HA)-펩타이드 항원 접합체의 구조식 및 이를 이용한 경피 전달에 의한 능동면역화 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 HA-형광표지항원 접합체를 이용해 HA-항원 펩타이드 접합체의 경피 흡수 및 전달 효과를 이광자 형광현미경법을 통해 확인한 결과를 나타낸다. a)는 인-비보 z-스택 이미지(in vivo z-stack image), b)는 볼륨 3d-렌더링(volumetric 3d-rendering), c)는 엑스 비보 공초점 이미지(ex vivo confocal image)를 나타낸다. b)의 흰색 점선으로 된 사각형 안의 이미지는 녹색 시그널 강도만을 표시한 것이다.
도 3은 HA-형광표지항원(green) 접합체를 이용해 HA-항원 펩타이드 접합체가 경피 흡수 및 전달된 후 랑게르한스 세포(langerhance cell, LC)와 효과적으로 상호작용(interaction) 하는지 LC 특이적인 랑게린 항체(langerin antibody)(red)로 면역염색 후 공초점 현미경(confocal microscope)을 통하여 확인한 결과를 나타낸다. 큰 네모박스는 작은 네모박스를 확대한 것이고, 1; Blue(DAPI)채널, 2; Green(FITC labelled HA-peptide conjugate) 채널, 3; Red(RITC labelled Lagerin Antibody) 채널, 5; Phase contrast, 6; Merge를 의미한다.
도 4는 HA에 매개한 마이오스타틴 펩타이드 항원 경피 전달이 mdx 마우스에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸다. (a)는 mdx 마우스의 체중 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, (b)는 mdx 마우스의 운동능력에 미치는 영향을 로타-로드 검사(rota-rod test)를 통해 확인한 결과, (c)는 mdx 마우스 혈중 마이오스타틴 특이적 IgG 항체를 ELISA를 통해 역가(titer)를 측정한 결과, (d)는 mdx 마우스의 혈중 크레아틴 포스포카이네이즈(serum creatine phosphokinase, CPK) 수준(levels) 에 미치는 영향을 ELISA를 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 HA 에 매개한 마이오스타틴 펩타이드 항원을 경피전달한 실험동물 및 및 대조군 처리 실험동물을 희생하여 얻은 혈청에서 마이오스타틴에 특이적인 항체 존재여부를 확인한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. 상단 도면은 HA-MstnF 처리군에서 무작위 선별된 두 개체의 혈액 샘플을 이용해 각각 400 ng 과 800 ng 의 마이오스타틴 단백질이 트랜스퍼된 NC 멤브레인에서 재조합 마이오스타틴에 친화력을 보이는 항체가 있음을 확인한 예비실험 결과를, 하단 도면은 각 샘플 처리군에서 5 마리의 마우스 혈액의 pooling 샘플과 800 ng 의 마이오스타틴이 트랜스퍼된 NC 멤브레인을 이용해 각 군의 마우스 혈액 내에 마이오스타틴과 특이적 친화력을 갖는 항체를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6는 HA 에 매개한 마이오스타틴 펩타이드 항원 경피전달한 실험동물 및 및 대조군 처리 실험동물(18주령)을 희생 후 앞정강근(Tibialis anterior muscles) 샘플을 조직학적 분석(Histological analyses)한 결과를 나타낸다. (a)는 H&E 염색한 조직 부분(tissue section), (b)는 Masson's trichrome 염색한 조직 부분을 나타낸다.
도 7은 HA 에 매개한 마이오스타틴 펩타이드 항원 경피전달 한 실험동물 및 및 대조군 처리 실험동물의 앞정강근 샘플에서 관찰되는 근섬유(muscle fiber)의 최대 직경 분포(maximum diameter distribution)를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 8은 HA 에 매개한 마이스타틴 펩타이드의 코 점막을 통한 nose-to-brain 전달을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 9는 제조된 HA-펩타이드 항원 접합체를 (a) GPC(gel permeation chromatography) 및 (b) NMR(nuclear magnetic resonance) 분석한 결과이다.
도 2는 HA-형광표지항원 접합체를 이용해 HA-항원 펩타이드 접합체의 경피 흡수 및 전달 효과를 이광자 형광현미경법을 통해 확인한 결과를 나타낸다. a)는 인-비보 z-스택 이미지(in vivo z-stack image), b)는 볼륨 3d-렌더링(volumetric 3d-rendering), c)는 엑스 비보 공초점 이미지(ex vivo confocal image)를 나타낸다. b)의 흰색 점선으로 된 사각형 안의 이미지는 녹색 시그널 강도만을 표시한 것이다.
도 3은 HA-형광표지항원(green) 접합체를 이용해 HA-항원 펩타이드 접합체가 경피 흡수 및 전달된 후 랑게르한스 세포(langerhance cell, LC)와 효과적으로 상호작용(interaction) 하는지 LC 특이적인 랑게린 항체(langerin antibody)(red)로 면역염색 후 공초점 현미경(confocal microscope)을 통하여 확인한 결과를 나타낸다. 큰 네모박스는 작은 네모박스를 확대한 것이고, 1; Blue(DAPI)채널, 2; Green(FITC labelled HA-peptide conjugate) 채널, 3; Red(RITC labelled Lagerin Antibody) 채널, 5; Phase contrast, 6; Merge를 의미한다.
도 4는 HA에 매개한 마이오스타틴 펩타이드 항원 경피 전달이 mdx 마우스에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸다. (a)는 mdx 마우스의 체중 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, (b)는 mdx 마우스의 운동능력에 미치는 영향을 로타-로드 검사(rota-rod test)를 통해 확인한 결과, (c)는 mdx 마우스 혈중 마이오스타틴 특이적 IgG 항체를 ELISA를 통해 역가(titer)를 측정한 결과, (d)는 mdx 마우스의 혈중 크레아틴 포스포카이네이즈(serum creatine phosphokinase, CPK) 수준(levels) 에 미치는 영향을 ELISA를 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 HA 에 매개한 마이오스타틴 펩타이드 항원을 경피전달한 실험동물 및 및 대조군 처리 실험동물을 희생하여 얻은 혈청에서 마이오스타틴에 특이적인 항체 존재여부를 확인한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. 상단 도면은 HA-MstnF 처리군에서 무작위 선별된 두 개체의 혈액 샘플을 이용해 각각 400 ng 과 800 ng 의 마이오스타틴 단백질이 트랜스퍼된 NC 멤브레인에서 재조합 마이오스타틴에 친화력을 보이는 항체가 있음을 확인한 예비실험 결과를, 하단 도면은 각 샘플 처리군에서 5 마리의 마우스 혈액의 pooling 샘플과 800 ng 의 마이오스타틴이 트랜스퍼된 NC 멤브레인을 이용해 각 군의 마우스 혈액 내에 마이오스타틴과 특이적 친화력을 갖는 항체를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6는 HA 에 매개한 마이오스타틴 펩타이드 항원 경피전달한 실험동물 및 및 대조군 처리 실험동물(18주령)을 희생 후 앞정강근(Tibialis anterior muscles) 샘플을 조직학적 분석(Histological analyses)한 결과를 나타낸다. (a)는 H&E 염색한 조직 부분(tissue section), (b)는 Masson's trichrome 염색한 조직 부분을 나타낸다.
도 7은 HA 에 매개한 마이오스타틴 펩타이드 항원 경피전달 한 실험동물 및 및 대조군 처리 실험동물의 앞정강근 샘플에서 관찰되는 근섬유(muscle fiber)의 최대 직경 분포(maximum diameter distribution)를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 8은 HA 에 매개한 마이스타틴 펩타이드의 코 점막을 통한 nose-to-brain 전달을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 9는 제조된 HA-펩타이드 항원 접합체를 (a) GPC(gel permeation chromatography) 및 (b) NMR(nuclear magnetic resonance) 분석한 결과이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
HA
-
펩타이드
항원 접합체 제조
저 분자량 히알루론산(LMWHA; ~17kDa)을 10mg/ml의 농도로 물에 녹인 후 소듐퍼아이오딘산(sodium periodate, NaIO4)를 히알루론산 단위체당 1 mole 배로 첨가해 각각 3시간동안 빛을 차단한 상태로 반응시킨 후 분획 분자량(molecular weight cutoff)이 7000 Da인 투석막을 이용하여 증류수로 3일 동안 투석하여 정제한 후 3일간 동결 건조시켜 HA-알데하이드 유도체를 제조하였다.
상기에서 제조한 HA-알데하이드 유도체를 10mg/ml의 농도로 100mM, pH 5.5의 아세테이트 버퍼에 녹인 후, 마이오스타틴 단백질에 대한 펩타이드 항원 (MstnF; VFLQKYPHTHLVHQA) 또는 대조군 펩타이드(scrMstnF; TFHQVLQHKVAPYLH)를 HA 체인당 6개의 펩타이드가 결합되도록 첨가하였다. HA-알데하이드 유도체의 치환율 (치환율은 하기 실험예 1에서 분석)에 따라 알데하이드의 5 mole 배로 소듐 시아노보로하이드라이드(NaCNBH3)를 첨가하여 24시간 동안 반응시켜 히알루론산-펩타이드 항원 접합체 제조하였다. 이후 반응하지 않고 남아있는 알데하이드를 블로킹(blocking)하기 위하여 에틸 카바자이트(H2NNHCO2C2H5)를 알데하이드의 5 mole 배로 넣어준 후 24시간 동안 더 반응 시켰다.
본 실시예에서는 에틸 카바자이트를 사용하여 블로킹하였으나, 아미노 에탄올(amino ethanol)을 사용할 수도 있다. 이 경우 알데하이드의 5 mole 배로 아미노 에탄올을 넣어준 후 NaOH를 이용하여 pH를 8로 올린 후 12시간 동안 더 반응시켰다. 반응시킨 용액을 pH 7.4의 인산완충식염수(PBS) 에 대하여 투석한 후 -70℃에 보관하였다.
상기 방법으로 제조한 HA-펩타이드 항원 접합체를 GPC(gel permeation chromatography)와 NMR(nuclear magnetic resonance)을 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 9에서 볼 수 있듯이 펩타이드 피크의 retention time 감소를 통해 히알루론산과 펩타이드가 접합되었음을 확인할 수 있었고 반응하지 않은 펩타이드를 투석 과정으로 모두 정제한 후에도 NMR 분석에서 파란 상자로 표시한 HA의 특성 피크와 녹색 상자로 표시한 펩타이드의 특성 피크가 모두 나타나 HA-펩타이드 항원 접합체가 합성되었음을 확인할 수 있었다.
실시예
2. 이광자
형광현미경법
시험
형광 (FITC) 표지 된 MstnF 펩타이드를 이용해 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 HA-MstnF-FITC 접합체 샘플을 제조하여 동결건조 후 사용 전까지 -20℃에 보관하였다. 상기 동결건조 샘플 0.4 mg 을 300μl의 PBS 에 녹여 준비하고 대조군(control) 샘플 (HA 와 형광표지 된 MstnF 펩타이드의 혼합물) 또한 300μl의 PBS에 녹여 준비하였다.
털이 없는 마우스를 50 mg/kg의 케타민(Ketamine)과 5 mg/kg 자일라진(Xylazine)을 이용해 마취 후 동물의 등 쪽 피부(dorsal skin)를 멸균수와 거즈를 이용해 세척하고, 2 cm x 2 cm 면적의 세척된 등 쪽 피부에 형광 표지 된 각각의 샘플 300 μl을 피펫을 이용해 적하하였다. 상기 적하된 샘플을 상온에서 30분 가량 공기 건조(air-dry)하였다. 최초 처리 시간을 기준으로 4시간 경과 후 동물을 50 mg/kg 의 케타민과 5 mg/kg 자일라진을 이용해 마취한 후 이광자 형광현미경을 이용하여 형광표지된 펩타이드의 샘플의 경피 흡수 및 전달 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 2의 a)는 2양자 현미경을 이용해 얻어진 z stack 이미지로 이미지상의 파란색 형광 신호는 진피층에 포함된 콜라겐에 의한 second-harmonic generation signal을 나타내고, 초록색 형광 신호는 펩타이드에 표지 된 FITC 의 two-photon signal을 나타낸다. Z stack 이미지로부터 초록색 형광 신호와 파란색 형광 신호가 중첩되어 나타나는 구간을 HA-MstnF 처리 동물의 피부에서 확인할 수 있고, 반대로 컨트롤 샘플을 처리한 동물의 피부에서는 초록색 형광 신호와 파란색 형광 신호가 중첩되어 나타나는 구간이 나타나지 않았다.
도 2의 b)는 상기 z stack 이미지로부터 얻은 3d volumetric rendering 이미지 이며, 이를 통하여 형광 표지 된 MstnF 펩타이드가 표피 및 진피 전반에 고르고 깊게 침투해 있음을 확인하였다. 주로 모간(hair shaft)을 통해 효과적으로 침투가 이루어짐도 함께 확인하였다.
HA-MstnF-FITC의 경피전달을 보다 분명하게 확인하기 위해 상기 실험에 이용된 동물을 희생하여 샘플을 처리한 2 cm x 2 cm 넓이의 피부 조직을 절개(dissection)하고, 이를 OCT compound에 포매(embedding)하여 동결한 후 동결 절편을 cryotome을 이용해 절삭하여 2 μm 두께의 조직 단면(tissue cross-section)을 얻었다. 상기 조직 단면을 공초점 현미경을 통해 확인한 하였다. 그 결과를 도 2의 c)에 나타내었다.
도 2 c)의 파란색 형광 신호는 핵을 대비 염색(counterstaining)한 DAPI 의 신호이고, 녹색 신호는 MstnF 에 접합된 FITC의 신호이다. 상기 이미지를 통해 HA-MstnF 접합체가 매우 효과적으로 경피 전달 및 흡수 됨을 확인할 수 있다.
상기 2 c)의 조직 단면을 피부면역에 관여하는 대표적인 Antigen presenting cell 인 랑게르한스 세포 마커인 랑게린 (Langerin) 항체 (Abcam, Cambridge, Massachusetts, USA) 로 염색한 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3의 파란색 형광 신호는 핵을 대비 염색(counterstaining)한 DAPI 의 신호이고, 녹색 신호는 MstnF 에 접합된 FITC의 신호이고, 적색 신호는 랑게린 파지티브 세포 (랑게르한스세포) 이다. 상기 이미지를 통해 HA-펩타이드 접합체가 피부내로 경피전달된 이후 피부에 존재하는 면역세포인 랑게르한스세포와 효과적으로 상호작용함을 확인할 수 있다.
실시예
3. 동물실험
중량 20g 내외 8주령의 DMD 동물모델인 mdx 마우스(male, Jackson Laboratory)에 HA-MstnF 접합체를 등 쪽 피부를 통해 경피 전달을 하는 방법으로 마이오스타틴 특이적 항체 형성 및 실험 동물의 이영양증 표현형의 개선 여부를 확인 하였다.
동물 실험을 위해 총 40마리의 mdx 마우스를 4 그룹으로(n=10) 나누고, 경피 전달을 위해 동물의 등 쪽 피부의 털을 제거 후, 피부 표면을 증류수로 세척하였다. 세척된 등 쪽 피부 표면에 HA-MstnF 접합체 샘플 또는 대조군 샘플을 적하 후 상온에서 공기 건조하는 방법으로 경피 전달을 실시하였다. 각 그룹별로 처리한 샘플은 아래와 같다.
그룹 1) HA (0.5 mg/20g 체중(bodyweight))
그룹 2) HA와 MstnF 의 혼합물 (0.5 mg/20g 체중)
그룹 3) HA-MstnF 접합체 (0.5 mg/20g 체중)
그룹 4) HA-scrMstnF 접합체 (0.5 mg/20g 체중)
상기 샘플의 처리에 앞서 동물을 50 mg/kg 의 케타민-염산(Ketamine-HCl)과 5 mg/kg 자일라진-염산(Xylazine-HCl)을 복강 내 주사(intraperitoneal injection, IP injection)하여 마취하였다. 마취된 동물에 400 μl 볼륨의 PBS로 녹인 샘플을 각각 피펫을 이용해 2 cm x 2 cm 면적의 등 쪽 피부에 적하하고 공기 건조하였다.
실험 개시일로부터 1주일 후 동량의 샘플을 상기와 동일한 방법으로 각 동물의 등 쪽 피부에 처리하여 부스팅하였다.
실시예
4.
경피
전달(
Transdermal
immunization
)이
mdx
동물에 미치는 영향 확인
4-1. 체중변화에 미치는 영향 확인
실험 개시일로부터 각 그룹의 개체 별 체중을 이틀 간격으로 9주간 측정하여 경피 전달이 mdx 동물의 체증 증가에 미치는 영향을 확인하였다.
도 4의 (a)에서 확인할 수 있는 바와 같이, HA-MstnF를 이용해 경피 전달한 그룹의 동물에서 다른 대조군 동물과 비교해 유의한 체중증가 향상을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 마이오스타틴 단백질의 기능 억제를 통한 근육량(muscle mass) 증가와 근육의 비대(hypertrophy) 및 과다형성(hyperplasia)에서 기인하는 결과로 생각할 수 있다. 이러한 결과는 HA-MstnF 접합체를 이용한 경피 전달이 효과적으로 피부 면역시스템의 활성화를 통해 강한 항원 특이적 면역 반응을 유도 및 항원 특이적 항체 형성을 유도하였으며 이를 통해 선천적 마이오스타틴(innate myostatin)의 기능이 효과적으로 저해(inhibition)되었음을 의미한다 하겠다.
4-2. 기능적 평가 (
Functional
assessment
)
실험 개시일로부터 9주 후 각 동물을 희생하여 혈액 및 앞정강근 근육 샘플을 채취하였다. 로타-로드 장치(The Rota-rod apparatus)를 디자인하여 실험실 내에 설치하였다. 상기 장치는 6mm 직경의 빈 플라스틱 로드(hollow plastic rod) 와 로드에 부착된 직류 전동기(direct current motor)로 구성하였다. 회전 속도(Rotation speed)는 전위차계(potentiometer)와 스톱워치(stop watch)를 이용해 18rpm 로 설정하고 실험 개시일을 시작으로 5주 후부터 1주에 2회 로타 로드 시험을 실시하였다. 실험 개시일로부터 9주 째 각 그룹별로 로타 로드 시험을 1시간 간격으로 3회 실시하여 그 평균값을 측정하였다.
그 결과, 도 4의 (b)에서 알 수 있는 바와 같이, HA-MstnF 를 처리한 동물이 대조군 동물과 비교하여 우수한 로타 로드 수행 결과를 나타내는 것을 확인하였다. 이는 근육의 생성의 향상을 통한 근육량 증가 및 체중 증가로 귀결되는 실시예 4-1의 결과와 일치하는 것이다. 이를 통하여, 본 발명의 HA-항원 접합체는 신경근 조정(neuromuscular coordination)의 향상에 효과가 있음을 입증하였다.
4-3. 항체가(
Antibody
titer
)
96 well micro ELISA plate 를 well 당 50 μl 의 코팅 항원(coating antigen) (recombinant myostatin; 10 μg/ml) (Abcam, Cambridge, Massachusetts, USA)으로 처리하고 4℃ 에서 12시간 배양(incubation) 하였다. Plate 를 PBS 버퍼로 1회 세척하고 각 well을 1 % 농도의 PBS 에 녹인 BSA 용액으로 블라킹(blocking)하고 상온에서 2시간 배양(incubation)하였다. Plate를 0.05% 의 tween 20 이 포함된 PBS 로 세척하고, 50 μl의 희석한 항혈청(antisera)을 넣고 상온에서 1시간 배양(incubation)하였다. 배양 후 plate 를 tween 20 이 포함된 PBS로 3회 세척하고, 0.05% tween 20 이 포함된 PBS 에 1/20000으로 희석된 50 μl의 anti-mouse IgG alkaline phosphate conjugate (2차 항체) (Abcam, Cambridge, Massachusetts, USA) 로 처리한 후 상온에서 1시간 배양(incubation)하였다. 상기 plate 를 0.05% tween 20 이 포함된 PBS 로 3회 세척 후, 각 well에 50 μl의 4-nitrophenyl phosphate (pNPP)를 첨가 후 20 내지 30분 빛이 차단된 조건에서 상온 배양(incubation)하였다.
Traction 을 25μl의 3M NaOH로 정지 시킨 후, OD를 405 nm 파장에서 microplate reader를 이용하여 측정 하였다. Assay 는 3회 반복 실행하였고, 항원(antigen)이 코팅(coating)되지 않은 well을 비교 대조군(reference control)으로 사용하였다.
반복실행을 통해 얻은 평균 OD를 비교 대조군으로부터 얻은 OD를 이용해 보정한 후 absolute OD unit 을 항체가로 나타내었다. 그 결과를 도 4 (c)에 정리하였다.
도 4 (c)에서 알 수 있는 바와 같이, HA-MstnF를 처리한 그룹에서 강력한 능동 면역(strong active immunization)을 통해 마이오스타틴 특이적인 IgG 의 형성이 이루어진 것을 확인하였다. 이 결과로부터 경피 전달에 의해 형성된 항체는 마이오스타틴 단백질의 기능을 면역 중화(immune neutralization)를 통해 효과적으로 저해한다는 것을 입증하였다.
실시예
4-4.
Blood
CPK
test
Creatine Kinase (CK) Liqui-UV의 working reagent 를 사용 설명서(instruction manual)에 따라 제조하였다. 96 well plate의 각 well 에 상기 working reagent 50 μl씩을 첨가하고 37℃에서 4분간 배양(incubation)한 후, 혈청(serum) 샘플 또는 대조군 샘플 2μl를 well에 첨가하여 혼합하였다. 37 ℃ 에서 10분간 배양(incubation) 후 multi-plate reader 를 이용해 340 nm 에서 OD를 측정하여 비교 대조군으로부터 얻은 OD 를 이용해 보정한 후 표준 샘플(standard sample)의 OD를 이용해 absolute OD unit을 U/l 로 변환하여 이를 CPK 수준(level)으로 나타내었다. 그 결과를 도 4 (d)에 정리하였다.
도 4 (d)에서 알 수 있는 바와 같이, 경피 전달이 근육 분해(muscle degradation)를 효과적으로 억제함으로써 blood CPK 농도 증가를 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다. 이는 경피 전달에 의한 능동 면역에 의해 형성된 항체가 마이오스타틴 단백질의 기능을 효과적으로 저해함으로써 이영양증 근육의 변성(degeneration)을 억제할 수 있음을 입증하였다.
실시예
4-5. 면역 혈청의
웨스턴
블랏
확인
실험 개시일로부터 9주 실험 동물을 희생 하여 얻은 혈액 샘플을 4℃ 에서 3000rpm 으로 10분간 원심분리 하여 혈청(serum) 분리 후 사용 전까지 -20℃ 에 보관하였다.
각 그룹에서 5마리의 면역력을 갖춘(immunized) mdx 마우스의 혈청 샘플을 TBS buffer를 이용해 동일한 비율 (1/100)로 희석한 후 웨스턴 블랏 분석(western blot analysis)에서 1차 항체 대신 사용하였다.
15% 의 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) mini gel 을 제조하고 800 ㎍ 의 재조합 마이오스타틴(recombinant myostatin) 또는 동량의 BSA를 well 에 로딩(loading) 한 후 SDS-PAGE를 실시하였다. 이후 단백질들을 PVDF membrane 에 전기영동으로 이동(electrophoretically transfer)하고, 이동이 완료된 PVDF membrane 을 5% skim-milk 와 함께 4℃ 에서 12시간 배양(incubation)하여 블라킹(blocking)하였다. 후 상기 membrane 을 TBS buffer로 희석된 혈청 샘플과 상온에서 1시간 배양(incubation)하였다.
이후 PVDF membrane 을 TTBS 버퍼를 이용해 10분씩 3회 세척(washing)한 후 TBS 버퍼에 1/10000으로 희석한 alkaline phosphatase conjugated anti-mouse IgG 와 함께 상온에서 1시간 배양(incubation)하였다. 이후 membrane을 BCIP/NBT substrate로 develop 한 후 membrane 을 암 조건에서 1 내지 2 시간 공기 건조한 다음 image 를 Bio-Rad multi imager를 이용해 캡쳐하였다.
그 결과, 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 대조군에서는 혈청 내에 재조합 마이오스타틴에 특이적인 친화력(specific affinity)을 갖는 항체가 포함되어 있지 않은 반면 HA-MstnF를 처리한 그룹에서는 재조합 마이오스타틴에 특이적인 친화력을 보이는 항체가 포함되어 있음을 확인하였다. 상기 결과를 통해 경피 전달을 통해 효과적인 항원 특이적 능동 면역이 가능함을 입증하였다.
4-6. 조직학적 확인
실험 개시일로부터 9주 후 동물을 희생하여 앞정강근을 분리하고 분리한 근육 샘플을 OCT compound 에 담가 액체질소로 냉각한 아이소펜탄(isopentane)을 이용해 급속 동결 시켰다. OCT 에 포매(embedding)된 동결 조직 샘플을 Cryotome 을 이용해 1 μm 두께의 단면적(cross section)을 잘라 super-frost plus slide 에 흡착시켰다. 일반적인 조직검사는 H&E 염색을 통해 실시하였다. Masson's trichrome staining은 콜라겐을 시각화(visualize)하기 위해 사용하였다. 랑게르한스 세포를 시각화하기 위해 마우스 피부 샘플을 Alexa Fluor 647 conjugated Mouse CD207 (Langerin) Antibody를 이용하였다. 근섬유막(Muscle fiber membrane (sarcolemma))을 시각화하기 위해 Alexa Fluor 488-conjugated WGA이용 하였다.
그 결과, 도 6a, 6b 에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 두 결과를 통해 HA-MstnF를 처리한 그룹에서 대조군 샘플을 처리한 그룹과 비교해 조직학적 개선(histological improvement) 및 근육 변성(muscle degeneration)에 따른 섬유증(fibrosis)의 개선을 확인하였다. 이러한 결과를 통하여 경피 전달이 효과적인 능동 면역 반응(active immune response)을 유도할 수 있음을 보다 명확하게 입증하였다.
상기 조직학 검사 결과로부터 얻은 단면적 이미지를 그룹별로 무작위로 15 장씩 선별하여 근섬유막을 시각화하기 위해 Alexa Fluor 488-conjugated WGA를 이용하여 면역형광염색 하였다. 상기 염색된 조직 단면적들의 무작위 단면적을 형광현미경으로 이미징(imaging)하고 이미지상에 나타난 근섬유의 최대 직경(maximum diameter)을 image J 소프트웨어를 통해 측정하여 결과들을 크기 별로 그룹한 후 근섬유의 최대 직경 범위의 도수 분포(frequency distribution)를 확인하였다. 그 결과를 도 7에 정리하였다.
도 7에서 알 수 있는 바와 같이, HA-MstnF를 이용한 경피 전달에 의해 근섬유의 형성이 증가하고 이와 동시에 일정한 크기의 근섬유의 분포가 상대적으로 증가하는 양상을 확인하였다. 이러한 결과를 통하여 능동 면역을 통하여 마이오스타틴 기능의 억제할 수 있고 그에 따라 근이영양 표현형의 개선을 유도할 수 있음을 입증하였다.
4-6.
경점막
전달 확인
형광 표지된 MstnF 펩타이드 (0.4 mg), HA100k-형광표지된 MstnF 펩타이드 접합체 (0.4 mg peptide), HA17k-형광 표지된 MstnF 펩타이드 접합체 (0.4 mg peptide) 를 1 ml PBS 버퍼에 녹여 샘플을 준비하였다.
체중 22 g 내외의 ICR 마우스 (male, 오리엔트바이오) 를 마취하지 않은 상태로 파지하여 고정한 후 10 μl 부피의 상기 샘플을 각각 3마리의 마우스에 코를 통해 투여한 후 5분후 동일 볼륨을 다시 코를 통해 투여하였다. 투여 4시간 후 케타민 (80 mg/kg) 과 자이라진 (12 mg/kg)을 이용하여 동물을 마취한 후 PBS 를 이용한 cardiac perfusion 을 통해 혈액을 제거하고, 뇌를 샘플링 하였다. 샘플링한 뇌를 Optical in vivo imaging system (IVIS Spectrum, Caliper life science, USA) 이용하여 형광표지된 샘플의 분포 및 형광 시그널 강도를 분석하였다. 그 대표 결과를 도 8에 정리하였다.
도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 형광표지 된 MstnF 펩타이드는 코 점막을 통해 뇌로 전달이 이루어지지 않는 반면, HA-펩타이드 접합체의 경우 펩타이드와 HA의 접합을 통해 펩타이드를 코 점막을 통해 뇌로 효과적으로 전달할 수 있음을 입증하였다. 또한 펩타이드에 접합된 HA의 분자량이 낮을수록 더욱 우수한 전달효율을 보임을 입증하였다.
<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION
<120> Conjugate of hyaluronic acid-peptide conjugate for the
transdermal or transmucosal delivery and composition for
immunomodulation and drug delivery system comprising the same
<130> DPP20140770KR
<160> 1
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide antigen to Myostatin fragment (MstnF)
<400> 1
Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala
1 5 10 15
Claims (15)
- 하기 화학식 1의 히알루론산 유도체, 및
활성성분인 펩타이드가 상기 히알루론산 유도체에 결합된, 컨쥬게이트:
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 동일하거나 상이할 수 있으며, 각각 독립적으로 알데히드기, 아민기, 바이닐그룹, 치올기, 알릴옥시그룹, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디치오)프로피오네이트(N- Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate, SPDP) 또는 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)이고,
m과 n의 합은 5 내지 50의 정수이고, n은 1 내지 25의 정수이다.
- 제1항에 있어서, 상기 히알루론산 유도체는 하기 화학식 2의 히알루론산-알데하이드인, 컨쥬게이트:
[화학식 2]
상기 화학식 2에서,
m과 n의 합은 5 내지 50의 정수이고, n은 1 내지 25의 정수이다.
- 제2항에 있어서, 상기 히알루론산-알데하이드는 10 내지 50몰%의 알데하이드기 치환율을 갖는 것인, 컨쥬게이트.
- 제1항에 있어서, 상기 컨쥬게이트는 상기 히알루론산 유도체 한 분자에 1 내지 10개 분자수의 펩타이드가 결합된 것인, 컨쥬게이트.
- 제1항에 있어서, 상기 컨쥬게이트는 하기 화학식 3을 갖는 것인 컨쥬게이트:
[화학식 3]
상기 화학식 3에서,
상기 R1 및 R2는 동일하거나 상이할 수 있으며, 각각 독립적으로 알데히드기, 아민기, 바이닐그룹, 치올기, 알릴옥시그룹, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디치오)프로피오네이트(N- Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate, SPDP) 또는 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)이고,
P 는 활성성분인 펩타이드이고,
m, n, 및 l의 총 합은 5 내지 50의 정수이고, n과 l의 합은 1 내지 25의 정수이고, l은 1 내지 1 내지 25의 정수이다.
- 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 마이오스타틴 단백질 항원, 기생충에 대한 폴리펩타이드 항원, C형 간염 바이러스(HCV) 항원, B형 간염 바이러스(HBV) 항원, 인유두종 바이러스(HPV) 항원 및 구제역 바이러스(FMD virus), 종양 관련 항원(tumor-associated antigens, TAAs) 펩타이드, 인간 백혈구 항원 한정 펩타이드(Human Leukocyte Antigen restricted peptide), 세포독성 T 세포(Cytotoxic T lymphocytes, CTL) 에피토프 펩타이드, HER2(human epidermal growth factor receptor 2)-유래 펩타이드, 텔로미어 역전사효소(telomerase reverse transcriptase, TERT) 서브유닛 펩타이드, MUC1 종양 항원 펩타이드, p53 또는 K-ras 펩타이드, 히트 쇼크 단백질 A 부분 펩타이드(Heat Shock Proteins A partial peptide) 및 흑색종 항원 유전자-1-유래 펩타이드(melanoma antigen gene-1-derived peptide) 항원으로 이루어지는 군에서 선택된 면역원성 항원 펩타이드인, 컨쥬게이트.
- 제6항에 있어서, 상기 마이오스타틴 단백질 항원은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 컨쥬게이트.
- 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 혈관활성 장펩타이드(vasoactive intestinal peptide), 뇌유래 신경성장인자(Brain derived neurotropic factor), 베타-아밀로이드(β-Amiloid) 유래 합성 폴리펩타이드, 신경보호성 펩타이드, 항-아폽토시스 펩타이드, LHRH 아고니스트, 세포 표면 수용체에 대한 아고니스트 및 안타고니스트 펩타이드, 항체 및 그의 단편, 칼시토닌, 골형성인자, 콜로니자극인자, 인슐린, 성장호르몬, 렉틴, 인터페론, 에리스로포이에틴 및 글루카곤 유사 펩타이드, G-단백질 연관 수용체(G protein-coupled receptors, GPCR) 패밀리 안타고니스트 및 아고니스트로 이루어지는 군에서 선택된 펩타이드 약물인, 컨쥬게이트.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 컨쥬게이트로서, 상기 펩타이드가 면역원성 항원이며, 상기 컨쥬게이트를 포함하는 면역반응을 조절하는 면역조절용 약학 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 컨쥬게이트의 히알루론산 유도체가 랑게르한스 세포(Langerhans cell, LC)와 상호작용으로 면역반응을 유발하는 것인, 약학 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 컨쥬게이트를 포함하는, 면역반응을 억제하기 위한 약학 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 조성물은 경피 또는 경점막을 통해 전달되는 것인 약학 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 조성물은 패치제 또는 외용제인, 조성물.
- 제1항 내지 제5항 및 제8항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트를 포함하고, 활성성분을 경피 또는 경점막을 통해 전달하는 약물 전달체.
- 제14항에 있어서, 상기 컨쥬게이트의 펩타이드가 신경보호성 펩타이드, 항-아폽토시스 펩타이드, 항암 펩타이드, 세포 표면 수용체에 대한 아고니스트 및 안타고니스트 펩타이드, 항체 및 그의 단편이고, 비(鼻)점막에 흡수되어 뇌까지 전달되는 것인, 약물 전달체.
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| KR1020140068561A KR20150140149A (ko) | 2014-06-05 | 2014-06-05 | 경피 또는 경점막 전달용 히알루론산 유도체-펩타이드 결합 컨쥬게이트, 이를 포함하는 면역 조절용 조성물 및 약물 전달체 |
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