KR102417671B1 - 자가가교 시스템을 가지는 히알루론산 기반 연조직 충전 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자가가교 시스템을 가지는 히알루론산 기반 연조직 충전 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 분자 내부의 카르복실기에 카테콜 작용기가 도입된 히알루론산 유도체 및 생체 내 pH 조건을 가지는 용매를 포함하며, 별도의 화학 가교제를 사용하지 않고도 생체 내 pH 조건에서 자가가교가 가능한 것을 특징으로 한다.

Description

자가가교 시스템을 가지는 히알루론산 기반 연조직 충전 조성물 및 이의 제조방법{HYALURONIC ACID-BASED FILLER COMPOSITION HAVING SELF-CROSSLINKING SYSTEM AND METHOD FOR MANUFACTURING THE SAME}

본 발명은 연조직 충전 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 히알루론산 유도체를 포함하며, 별도의 화학 가교제를 사용하지 않고도 생체 내 pH 조건에서 자가가교되는 연조직 충전 조성물에 관한 것이다.

최근 들어 피부 미용에 대한 관심이 높아지면서 이러한 피부 주름을 개선하고 억제하기 위해 다양한 시도들이 행해지고 있다. 이 중에서도 필러 주입은 간단한 시술절차 및 빠른 회복시간과 같은 장점으로 인해 미용분야에서 널리 사용되고 있다.

필러란 흉터나 주름, 경우에 따라서는 얼굴 윤곽 등을 개선하기 위하여 피부 진피와 피하지방층과 같은 연조직에 주사기를 이용하여 주입하여 주름을 없애는 시술이다. 개발 초기에는 필러로서 파라핀 또는 액상실리콘 필러가 사용되었으나 안전성 문제로 사용이 중단되었으며, 1세대 필러로서 콜라겐 필러가 발명되었으나, 알레르기 테스트를 해야 할 뿐만 아니라 수명 또한 3~6개월로 많이 짧은 편이라는 단점을 가지고 있다.

한편, 필러와 같은 연조직 충전 조성물로서 다양한 고분자 소재가 활용되고 있으며, 합성 고분자의 경우 독성을 유발할 수 있기 때문에 생체 적합성을 갖는 천연 고분자를 이용한 개발이 행해지고 있다. 이러한 천연 고분자 중 히알루론산의 경우 피부 및 연골과 같은 세포외기질의 주요 구성성분으로 우수한 생체적합성, 보습성 및 생분해성 특성을 지니고 있어 미용 및 의약학 분야에서 다양하게 응용되고 있다.

그러나 히알루론산은 체내에 존재하는 효소인 히알루로니다제에 의해 수 시간 내에 분해되기 때문에, 화학적 가교결합을 통해 체내 지속성을 향상시키려는 연구가 진행되어 왔다. 구체적으로, 현재 시판되고 있는 히알루론산 기반 연조직 충전 조성물의 경우 구조적 안정성을 높이기 위해 디비닐술폰(DVS), 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르(BDDE)을 화학가교제로 사용하여 히알루론산을 가교결합시키는데, 이러한 화학가교제는 체내에 주입 시 잔존 가교제로 인한 염증 및 부종과 같은 부작용을 유발할 수 있다는 단점이 있다.

따라서, 생체적합성을 향상시키기 위하여 화학적 가교제의 사용 없이도 필러 재료로 적용이 가능한 가교결합된 히알루론산 하이드로젤의 개발이 요구된다.

한국공개특허 제10-2020-0004503호

본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위해 창안된 것으로, 별도의 화학 가교제를 사용하지 않고도 자가가교가 가능한 것을 특징으로 하는 히알루론산 기반 연조직 충전 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

하나의 예에서, 본 발명에 따른 연조직 충전 조성물은, 분자 내부의 카르복실기에 카테콜 작용기가 도입된 히알루론산 유도체 및 생체 내 pH 조건을 가지는 용매를 포함하며, 생체 내 pH 조건 하에서 자가가교된다.

구체적인 예에서, 상기 히알루론산은 히알루론산염이며, 염의 종류는 리튬, 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘 등의 무기염과 테트라 부틸 암모늄 등의 유기염 중에서 선택되는 1종이다.

구체적인 예에서, 상기 히알루론산의 분자량은 100,000 ~ 1,000,000 Dalton이다.

하나의 예에서, 상기 카테콜 작용기가 도입된 히알루론산 유도체의 치환도는 5 ~ 25%이다.

다른 하나의 예에서, 상기 용매는 PBS(phosphate buffered saline)이고,

상기 히알루론산 유도체의 함량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.5 ~ 2.0중량% 이다.

본 발명은 연조직 충전 조성물의 제조방법을 제공하는 바, 본 발명에 따른 연조직 충전 조성물의 제조방법은, (a) 히알루론산 또는 그 염을 포함하는 용액에 카보디이미드 화합물 및 하이드록시숙신이미드 화합물을 반응시키는 단계; (b) 카테콜 작용기 함유 화합물을 첨가하고 반응시키는 단계; (c) 투석을 통해 미반응 화합물을 제거하고, 건조하여 카테콜 작용기가 도입된 히알루론산 유도체를 수득하는 단계; 및 (d) 상기 히알루론산 유도체를 생체 내 pH 조건을 가지는 용매에 첨가하는 단계; 를 포함한다.

구체적인 예에서, 상기 카보디이미드 화합물은 EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide)이고, 하이드록시숙신이미드 화합물은 NHS(N-hydroxysuccinimide)이다.

구체적인 예에서, 상기 카테콜 작용기 함유 화합물은 도파민, 에피네프린, 노르에피네프린, 1,2-다이하이드록시벤조산 및 3,4-다이하이드록시벤조산을 포함하는 군에서 선택된 1종 이상이다.

구체적인 예에서, 상기 (a) 단계에서, 히알루론산 또는 그 염, 도파민, 카보디이미드 화합물 및 하이드록시숙신이미드 화합물은 각각 1:1:1:1 내지 1:2:2:2의 몰비로 첨가된다.

구체적인 예에서, 상기 (a) 내지 (c) 단계에서, pH는 5.0 내지 5.5로 유지된다.

구체적인 예에서, 상기 히알루론산 유도체는 조성물 전체 중량을 기준으로 0.5 내지 2.0중량% 첨가된다.

다른 하나의 예에서, 본 발명에 따른 연조직 충전 조성물의 제조방법은 (e) 상기 히알루론산 유도체를 상온에서 일정 시간 에이징하여 자가가교하는 단계; 를 더 포함한다.

본 발명에 따른 연조직 충전 조성물은 히알루론산에 카테콜기가 도입된 히알루론산 유도체를 기반으로 함으로써 화학적 가교제를 사용하지 않고도 체내 pH 조건에서 자가산화에 의해 가교됨으로써 간편한 방법으로 안전하게 하이드로젤을 제조할 수 있으며, 연조직에 충전되는 조성물의 구조적 안정성 및 생체적합성이 향상될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 카테콜기가 도입된 히알루론산 유도체를 포함하는 연조직 충전 조성물의 젤화 메커니즘을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 히알루론산 유도체의 분광학적 데이터를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 카테콜기가 도입된 히알루론산 유도체의 젤화거동 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 카테콜기가 도입된 히알루론산 유도체의 가교시간에 따른 기계적 강도 변화 및 접착강도를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 연조직 충전 조성물의 주입 결과를 나타낸 사진이다.
도 6은 본 발명에 따른 연조직 충전 조성물에 있어서, 히알루론산 유도체의 치환도에 따른 탄성도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 연조직 충전 조성물에 있어서, 히알루론산 유도체의 치환도에 따른 항산화 능력을 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 연조직 충전 조성물에 있어서, 히알루론산 유도체의 세포 생존률을 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따른 연조직 충전 조성물의 체내 주입 후 결과를 나타낸 사진이다.

본 발명은 다양한 변형을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 층, 막, 영역, 판 등의 부분이 다른 부분 "상에" 있다고 할 경우, 이는 다른 부분 "바로 위에" 있는 경우뿐만 아니라 그 중간에 또 다른 부분이 있는 경우도 포함한다. 반대로 층, 막, 영역, 판 등의 부분이 다른 부분 "하에" 있다고 할 경우, 이는 다른 부분 "바로 아래에" 있는 경우뿐만 아니라 그 중간에 또 다른 부분이 있는 경우도 포함한다. 또한, 본 출원에서 "상에" 배치된다고 하는 것은 상부뿐 아니라 하부에 배치되는 경우도 포함하는 것일 수 있다.

이하 본 발명에 대하여 자세히 설명한다.

본 발명에 따른 연조직 충전 조성물은 분자 내부의 카르복실기에 카테콜 작용기가 도입된 히알루론산 유도체 및 생체 내 pH 조건을 가지는 용매를 포함하며, 생체 내 pH 조건 하에서 자가가교된다.

도 1은 본 발명에 따른 카테콜기가 도입된 히알루론산 유도체를 포함하는 연조직 충전 조성물의 젤화 메커니즘을 나타낸 모식도이다.

도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 연조직 충전 조성물은 히알루론산의 카르복실기에 도입된 카테콜기가 생체 내 pH 조건에서 자가산화에 의해 가교될 수 있도록 함으로써, 별도의 가교제 없이도 자발적으로 하이드로젤을 형성할 수 있다는 장점이 있다. 특히 본 발명에 따른 연조직 충전 조성물은, 체내에 주입 시 체내의 용존 산소에 의해 자가산화 속도가 더욱 가속화됨에 따라, 빠른 자가가교 특성을 나타낸다. 또한 본 발명에 따른 연조직 충전 조성물은 가교시간에 따라 탄성 및 접착능력 등의 특성을 효율적으로 조절할 수 있으며, 카테콜기의 항산화 특성을 이용함으로써 추가적인 미용기능을 부여할 수 있다.

한편, 히알루론산(hyaluronate, hyaluronic acid: HA)은 β-D-N-아세틸글루코사민과 β-D-글루쿠론산이 β-1,3과 β-1,4 결합으로 교대로 결합한 곧은 사슬상의 천연 산성 뮤코다당류이다. 본 발명에 따른 연조직 충전 조성물에서, 상기 히알루론산은 히알루론산 염일 수 있으며, 구체적으로 상기 염은 리튬, 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘 등의 무기염과 테트라 부틸 암모늄 등의 유기염 중에서 선택되는 1종일 수 있다.

상기 히알루론산의 분자량은 100,000 내지 1,000,000 Dalton의 범위일 수 있으며, 상세하게는 500,000 내지 1,000,000 Dalton의 범위일 수 있다. 히알루론산의 분자량이 상기 범위일 때 카테콜 작용기의 가교 결합에 있어 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명에 따른 연조직 충전 조성물에 있어서, 상기 카테콜 작용기가 도입된 히알루론산 유도체의 치환도는 5 내지 25%의 범위일 수 있으며, 상세하게는 5 내지 10%의 범위일 수 있다. 카테콜 작용기가 도입된 히알루론산 유도체의 치환도가 상기 범위일 경우 체내에서 하이드로겔을 형성하기 위한 적절한 수준의 가교 결합이 가능하다. 카테콜 작용기가 도입된 히알루론산 유도체의 치환도가 5% 미만일 경우 체내 pH 조건에서 형성되는 가교 정도가 하이드로겔을 형성하기 부족할 수 있으며, 치환도가 25%를 초과할 경우 가교 정도가 지나치게 되어, 가공이 어려울 수 있다는 문제가 있다.

또한, 본 발명에 따른 연조직 충전 조성물에 있어, 상기 생체 내 pH 조건을 가지는 용매는 PBS(phosphate buffered saline)일 수 있다. PBS의 pH는 7.4 정도이므로 생체 내 pH 조건에 근접하는 바, 카테콜 작용기가 도입된 히알루론산 유도체를 PBS와 혼합하여 조성물을 형성할 경우, 상기 히알루론산 유도체가 자가가교될 수 있다.

아울러, 상기 히알루론산 유도체의 함량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.5 내지 2.0중량%일 수 있으며, 상세하게는 1.0 내지 2.0중량%일 수 있다. 히알루론산 유도체의 함량이 상기 범위일 때 안정적인 하이드로젤 형성이 가능하다. 히알루론산 유도체의 함량 0.5중량% 미만일 경우 겔화 이후 탄성 모듈러스 등의 충전 조성물의 물성이 감소하며, 히알루론산 유도체의 함량이 2.0중량%를 초과할 경우 조성물의 점도가 지나치게 증가하여 가공이 어렵다는 문제가 있다.

본 발명에 따른 연조직 충전 조성물은 카테콜 작용기가 도입된 히알루론산 유도체 외에 국소 마취제, 비타민 및 세포 성장인자를 포함하는 군에서 선택되는 1종 이상의 생리활성 인자를 더 포함하는 바, 시술의 목적에 따라 적절한 성분을 추가할 수 있다.

한편, 본 발명은 연조직 충전 조성물의 제조방법을 제공하는 바, 본 발명에 따른 연조직 충전 조성물의 제조방법은, (a) 히알루론산 또는 그 염을 포함하는 용액에 카보디이미드 화합물 및 하이드록시숙신이미드 화합물을 반응시키는 단계; (b) 카테콜 작용기 함유 화합물을 첨가하고 반응시키는 단계; (c) 투석을 통해 미반응 화합물을 제거하고, 건조하여 카테콜 작용기가 도입된 히알루론산 유도체를 수득하는 단계; 및 (d) 상기 히알루론산 유도체를 생체 내 pH 조건을 가지는 용매에 첨가하는 단계; 를 포함한다.

구체적으로, 상기 (a) 단계에서는 히알루론산 또는 그 염을 포함하는 용액에 카보디이미드 화합물 및 하이드록시숙신이미드 화합물을 첨가하여 1분 내지 30분간 교반할 수 있다. 상기 카보디이미드 화합물은 EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide)이고, 하이드록시숙신이미드 화합물은 NHS(N-hydroxysuccinimide)일 수 있다. EDC는 카르복실기와 아미노와의 탈수반응을 촉진시키는 화합물로 펩티드 형성반응, 즉 카르복실기를 아미노화합물에서 아미드화하는 반응에 사용된다. NHS의 경우 카복실산을 활성화시키는 물질(activating reagent)로 사용될 수 있으며, EDC와 주로 사용되어 반응효율과 안정성을 향상시킬 수 있다.

다음으로, 상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계의 용액에 카테콜 작용기 함유 화합물을 첨가하여 2시간 내지 24시간동안 반응시키는 단계이다. 상기 카테콜 작용기 함유 화합물은 도파민, 에피네프린, 노르에피네프린, 1,2-다이하이드록시벤조산 및 3,4-다이하이드록시벤조산을 포함하는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 연조직 충전 조성물의 제조방법에서, 히알루론산 또는 그 염, 도파민, 카보디이미드 화합물 및 하이드록시숙신이미드 화합물은 반응의 효율성 측면에서 각각 1:1:1:1 내지 1:2:2:2의 몰비로 첨가될 수 있다. 특히, 도파민, 카보디이미드 화합물 및 하이드록시숙신이미드 화합물은 동일한 몰비로 첨가될 수 있다.

반응이 완료되면, 투석을 통해 반응하지 않은 도파민, 카보디이미드 화합물 및 하이드록시숙신이미드 화합물을 제거하고, 건조를 동결건조 등의 건조방법을 사용하여 히알루론산 유도체를 수득할 수 있다. 이 때, 상기 (a) 단계 내지 (c) 단계에 있어서, 반응용액의 pH는 5.0 내지 5.5로 유지되는 것이 바람직하다. 이는 반응과정에서 히알루론산 유도체의 산화를 방지하기 위함이다.

이와 같이 히알루론산에 카테콜 작용기를 도입한 구조의 히알루론산 유도체를 수득하면, 이를 생체 내 pH 조건을 가지는 용매에 첨가함으로써 연조직 충전 조성물을 제조한다. 전술한 바와 같이, 상기 용매로는 PBS를 사용할 수 있으며, 히알루론산 유도체는 연조직 충전 조성물의 전체 중량을 기준으로 0.5 내지 2.0중량% 첨가될 수 있고, 상세하게는 1.0 내지 2.0중량% 첨가될 수 있다.

상기 제조된 연조직 충전 조성물은 체내에 주입되는데, 이 때 체내 주입 전 상기 (e) 히알루론산 유도체를 자가가교시키는 단계를 거칠 수 있다. 여기서, 히알루론산 유도체를 자가가교시킨다는 것은, 연조직 충전 조성물을 상온에서 일정 시간 방치 내지는 에이징하는 것을 의미한다. 즉 본 발명에 따른 연조직 충전 조성물은 제조 이후 체내에 주입 전 자가가교 속도를 제어함으로써 단일상 및 이성상 형태로 제조될 수 있다. 즉 본 발명에 따른 연조직 충전 조성물은 가교 속도를 조절함으로써 필러 조성물의 강도를 조절할 수 있어 강도가 약한 조성물의 경우에는 눈가나 입술과 같은 얕은 부위에, 강도가 강한 조성물의 경우에는 팔자주름과 같은 깊은 부위에 적용이 가능하다. 아울러 얼굴 외에도 가슴, 골반, 휜 다리 및 엉덩이 등에 주입하여 전체적인 바디라인을 교정할 수 있어 다양한 연조직 필러 조성물로서 적용이 가능하다.

또한 상기 연조직 충전 조성물은 시간에 따라 자가가교가 진행되는데, 이에 따라 연조직 충전 조성물을 제조 후 소정의 시간 내에 사용할 경우 조성물 내의 히알루론산 유도체의 가교가 거의 진행되지 않거나, 일정 정도만 진행된 상황이므로, 연조직 충전 조성물을 단일상 형태로 체내에 바로 주입할 수 있다. 반대로, 연조직 충전 조성물에 추가적인 가교시간을 부여할 경우 히알루론산 유도체는 강한 탄성의 하이드로젤을 형성하게 되는데, 이 경우 주입의 용이성을 위해 하이드로젤 상의 연조직 충전 조성물을 입자화하고, 가교되지 않은 히알루론산 용액을 윤활제로 첨가함으로써 이성상 형태의 연조직 충전 조성물을 제조할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명하면 다음과 같다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

카테콜 작용기가 도입된 히알루론산 유도체의 제조

분자량 53만 Dalton의 히알루론산을 pH 5.5의 MES 완충용액에 용해시키고 EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide)와 NHS(N-hydroxysuccinimide)를 첨가시킨 후, 도파민을 첨가하여 pH 5.0~5.5에서 24시간 동안 반응시켰다. 이 때 히알루론산, EDC, NHS 도파민의 몰비는 1:1:1:1이었다. 그 후 증류수에서 투석을 통하여 미반응 EDC, NHS 및 도파민을 제거하고, 동결건조를 통해 본 발명의 히알루론산 유도체를 제조하였다.

상기 히알루론산 유도체의 치환도를 H-NMR (proton Nuclear magnetic Resonance)과 UV-visible spectrophotometer를 통해 확인하였다. 구체적으로 도 2 (A)에 나타난 바와 같이 6.8~7.6ppm에서 도파민의 벤젠고리에 대응하는 피크가 발현함을 확인하였고 2.0ppm에서 발현하는 히알루론산의 고유 피크면적과의 상대적인 비로 치환도를 계산하였다. 한편 제조된 유도체 용액의 280nm의 (= 도파민의 흡광 피크) 흡광도를 측정한 결과 도 2 (B)에 나타난 바와 같이 두 가지 치환도의 유도체 용액 모두 280nm에서 흡광도를 나타냈으며 300nm 이후에서 피크가 발현되지 않는 것을 통해 반응 중 산화가 일어나지 않음을 확인하였다. 치환도를 측정한 결과, 히알루론산 유도체의 치환도는 5%였다.

히알루론산 유도체를 포함하는 연조직 충전 조성물의 제조

상기 히알루론산 유도체 2.0중량%를 98중량%의 PBS(pH 7.4)에 첨가하여 연조직 충전 조성물을 제조하였다.

[실시예 2]

히알루론산, EDC, NHS 도파민의 몰비는 1:2:2:2로 하여 히알루론산 유도체를 제조한 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 연조직 충전 조성물을 제조하였다. 이 때 히알루론산 유도체의 치환도는 10%였다.

[실시예 3]

히알루론산 유도체 1.5중량%를 98중량%의 PBS(pH 7.4)에 첨가하여 연조직 충전 조성물을 제조한 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 연조직 충전 조성물을 제조하였다. 이 때, 히알루론산 유도체의 치환도는 5%였다.

[실시예 4]

히알루론산 유도체 1.0중량%를 99중량%의 PBS(pH 7.4)에 첨가하여 연조직 충전 조성물을 제조한 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 연조직 충전 조성물을 제조하였다. 이 때, 히알루론산 유도체의 치환도는 5%였다.

[실시예 5]

히알루론산 유도체 0.5중량%를 99.5중량%의 PBS(pH 7.4)에 첨가하여 연조직 충전 조성물을 제조한 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 연조직 충전 조성물을 제조하였다. 이 때, 히알루론산 유도체의 치환도는 5%였다.

[비교예 1]

카테콜기가 도입되지 않은 히알루론산 2.0중량%를 98중량%의 PBS(pH 7.4)에 첨가하여 연조직 충전 조성물을 제조하였다.

[비교예 2]

히알루론산 유도체 2.5중량%를 97.5중량%의 PBS(pH 7.4)에 첨가하여 연조직 충전 조성물을 제조한 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 연조직 충전 조성물을 제조하였다. 이 때, 히알루론산 유도체의 치환도는 5%였다.

[비교예 3]

히알루론산 유도체 0.1중량%를 97.5중량%의 PBS(pH 7.4)에 첨가하여 연조직 충전 조성물을 제조한 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 연조직 충전 조성물을 제조하였다. 이 때, 히알루론산 유도체의 치환도는 5%였다.

[비교예 4]

기존에 시판되는 연조직 충전 조성물인 레스틸렌(Restylane lift)을 사용하였다. 레스틸렌은 히알루론산을 화학 가교제를 사용하여 가교시킨 후 입자화한 이성상 필러 제품으로, 400 내지 1000 마이크로미터로 입자화된 충전 조성물이다.

[실험예 1]

상기 실시예 및 비교예에 따른 연조직 충전 조성물에 대하여 히알루론산 유도체의 치환도 및 고분자 농도에 따른 젤화거동을 레오미터를 이용하여 측정하였다. 이 때 변형율과 주파수는 1%와 1rad/s 이었으며 37℃조건 하에서 측정되었다. 그 결과는 도 3에 도시되었다.

도 3의 (A)는 히알루론산 유도체의 치환도에 따른 젤화거동을 나타낸 결과이다. 도 3의 (A)를 참조하면, G'과 G"의 교차점은 젤화 지점을 나타내며, 치환도가 증가할수록 하이드로젤의 형성속도가 증가함을 보였으며 젤강도 또한 증가하는 것을 확인하였다.

한편 도 3의 (B)는 연조직 충전 조성물에 있어 히알루론산 유도체의 농도에 따른 젤화거동을 나타낸 결과이다. 도 3의 (B)를 참조하면, 히알루론산 유도체의 농도가 증가할수록 하이드로젤의 형성속도가 증가함을 보였으며 젤강도 또한 증가하는 것을 확인하였다. 다만, 히알루론산 유도체의 농도가 2.0%를 초과하는 비교예 2의 경우 조성물의 점도가 지나치게 증가하여 측정이 불가능하였으며, 반대로 히알루론산 유도체의 농도가 0.5중량% 미만인 경우 조성물이 거의 젤화되지 않아 측정이 어려웠다.

[실험예 2]

상기 실시예 1 및 실시예 2에 대하여 히알루론산 유도체의 치환도에 따른 기계적 강도를 측정하였으며, 실시예 1, 실시예 2 및 비교예 4에 따른 연조직 충전 조성물에 대하여 조직접착능력을 측정하였다. 그 결과를 도 4에 도시하였다.

도 4의 (A)는 히알루론산 유도체의 치환도에 따른 연조직 충전 조성물의 최대 압축강도를 측정한 것이며, 도 4의 (B)는 히알루론산 유도체의 치환도에 따른 연조직 충전 조성물의 조직접착능력을 측정한 것이다. 이 때, 연조직 충전 조성물의 조직 접착능력은 Texture analyzer를 이용하여 돼지껍데기 사이에서 하이드로젤을 가교시키고 상기 껍데기 간의 간격을 증가시키면서 기기에 가해지는 힘을 측정함으로써 평가하였으며, 최대 압축 강도는 Texture analyzer를 이용하여 압축 하중을 시험편의 단면적으로 나눈 값을 측정함으로써 평가하였다.

도 4를 참조하면, 카테콜기 치환된 실시예 1 및 실시예 2의 경우 자가가교 시간이 지남에 따라 기계적 강도가 더욱 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 아울러, 치환도가 높은 히알루론산 유도체를 사용한 실시예 1 및 실시예 2의 경우 비교예 4에 비해 접착 강도가 우수한 것이 확인되었다.

[실험예 3]

본 발명의 실시예에 따른 연조직 충전 조성물을 사용하여 주입 가능성 여부를 테스트하였으며, 그 결과를 도 5에 도시하였다.

도 5를 참조하면, 연조직 충전 조성물을 주입 시 끊어짐 없이 주입이 가능함을 확인하였고 체내 pH와 동일한 조건인 PBS 용액 내에 주입했을 경우에도 형태를 유지하는 것을 관찰할 수 있었다. 즉 본 발명에 따른 연조직 충전 조성물이 체내에 안정적으로 주입이 가능하며 체내 조건에서 자가산화에 의해 하이드로젤을 형성하며 형태학적 안정성을 유지하는 것을 확인하였다. 한편, 히알루론산 유도체의 농도가 2.0%를 초과하는 비교예 2의 경우 조성물의 점도가 지나치게 증가하여 연조직 충전 조성물의 주입이 불가능하였고, 히알루론산 유도체의 농도가 0.5% 미만일 경우 조성물의 겔화가 잘 일어나지 않았다.

[실험예 4]

상기 실시예 1, 실시에 2 및 비교예 4에 따른 연조직 충전 조성물에 대하여 연조직 충전 조성물의 치환도에 따른 탄성도를 레오미터를 통해 비교하였다. 구체적으로, 실시예 1 및 실시예 2에 따른 연조직 충전 조성물에 추가적인 가교시간을 부여하여 강한 탄성을 가지는 하이드로젤을 제조하고, 이를 입자화한 후 가교되지 않은 히알루론산 용액을 윤활제로 첨가하여 이성상의 연조직 충전 조성물을 제조하였다. 그 결과는 도 6에 도시하였다.

도 6을 참조하면, 치환도가 증가함에 따라 강도가 향상됨을 확인하였고 상용화 제품에 해당하는 비교예 4와 비교하였을 때에도 유사하거나 더 우수한 강도를 갖는다는 것을 확인할 수 있었는 바, 본 발명에 따른 연조직 충전 조성물이 우수한 물성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

[실험예 5]

상기 실시예 1, 실시예 2 및 비교예 1에 따른 연조직 충전 조성물에 대하여 히알루론산 유도체의 치환도에 따른 항산화 능력을 측정하였으며, 그 결과를 도 7에 도시하였다. 구체적으로, 히알루론산 유도체의 항산화 능력은 UV-Vis를 통해 DPPH 라디칼 소거능을 계산하였다.

도 7을 참조하면, 카테콜기가 도입된 히알루론산 유도체를 포함하는 실시예 1(치환도 5%, HA-DA 5로 표시) 및 실시예 2(치환도 10%, HA-DA 10으로 표시)는 농도 및 치환도가 증가함에 따라 더 높은 항산화 능력을 나타냄을 확인하였으나, 이와 달리 카테콜기가 도입되지 않은 히알루론산 유도체를 사용한 비교예 1(HA only)의 경우 농도가 증가함에 따라 라디칼 소거능이 변화하지 않는 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 6]

상기 실시예 1 및 실시예 2에 따른 연조직 충전 조성물에 대하여 하이드로젤의 세포독성을 정도를 측정하였다. 구체적으로 배양할 세포(NIH3T3 fibroblast)를 준비하고, 이를 히알루론산 유도체를 포함하는 연조직 충전 조성물에 시딩한 후에, 3일이 지난 후 세포생존율을 확인하였다. 그 결과는 도 8에 도시하였다.

도 8을 참조하면, 본 발명에 따른 연조직 충전 조성물을 사용한 경우, 실시예 1(치환도 5%, HA-DA 5로 표시) 및 실시예 2(치환도 10%, HA-DA 10으로 표시)는 배양 후 3일이 지난 후에도 90% 이상의 높은 세포생존율을 보였으며 이를 통해 제조된 하이드로젤은 세포독성을 발현하지 않음을 확인하였다.

[실험예 7]

상기 실시예 1, 실시예 2 및 비교예 4에 따른 연조직 충전 조성물에 대하여 조성물의 체내 안정성 및 생체적합성을 측정하였다. 구체적으로 연조직 충전 조성물의 체내 안정성 및 염증반응 유발 여부를 확인하기 위하여 200 μl의 하이드로젤을 마우스의 피하에 주입하였으며 H&E staining을 통해 조직학적 분석을 수행하였다. 그 결과는 도 9에 도시하였다.

도 9를 참조하면, 주입 후 4주가 지난 후에도 본 발명에 따른 하이드로젤은 체내에 구조를 유지하며 남아있음을 확인하였고 특이적인 염증 소견이 관찰되지 않음을 통해 상기 제조된 히알루론산 기반 연조직 충전 조성물은 우수한 체내 안정성 및 생체적합성을 가짐을 확인하였다.

이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 도면들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 도면에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (13)

1. 분자 내부의 카르복실기에 카테콜 작용기가 도입된 히알루론산 유도체 및 생체 내 pH 조건을 가지는 용매를 포함하며,
   생체 내 pH 조건 하에서 자가가교되는 연조직 충전 조성물에 있어서,
   상기 히알루론산은 히알루론산염이며, 염의 종류는 리튬, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 및 테트라 부틸 암모늄 중에서 선택되는 1종이고,
   상기 히알루론산의 분자량은 100,000 내지 1,000,000 Dalton이고,
   H-NMR 측정시 6.8∼7.6ppm에서 발현된 피크 면적과 2.0pppm에서 발현된 피크 면적의 상대적인 비로 계산되는 상기 카테콜 작용기가 도입된 히알루론산 유도체의 치환도가 5 내지 25%이고,
   상기 용매는 PBS(phosphate buffered saline)이고,
   상기 히알루론산 유도체의 함량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.5 내지 2.0중량% 인 연조직 충전 조성물.
   
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6. 제1항에 있어서,
   국소 마취제, 비타민 및 세포 성장인자를 포함하는 군에서 선택되는 1종 이상의 생리활성 인자가 더 첨가된 연조직 충전 조성물.
   
7. (a) 히알루론산 또는 그 염을 포함하는 용액에 카보디이미드 화합물 및 하이드록시숙신이미드 화합물을 반응시키는 단계;
   (b) 카테콜 작용기 함유 화합물을 첨가하고 반응시키는 단계;
   (c) 투석을 통해 미반응 화합물을 제거하고, 건조하여 카테콜 작용기가 도입된 히알루론산 유도체를 수득하는 단계;
   (d) 상기 히알루론산 유도체를 생체 내 pH 조건을 가지는 용매에 첨가하는 단계; 및
   (e) 상기 히알루론산 유도체를 상온에서 일정 시간 에이징하여 자가가교하는 단계를 더 포함하는 연조직 충전 조성물의 제조방법에 있어서,
   상기 카보디이미드 화합물은 EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide)이고, 하이드록시숙신이미드 화합물은 NHS(N-hydroxysuccinimide)이고,
   상기 카테콜 작용기 함유 화합물은 도파민, 에피네프린, 노르에피네프린, 1,2-다이하이드록시벤조산 및 3,4-다이하이드록시벤조산을 포함하는 군에서 선택된 1종 이상이고,
   상기 (a) 단계에서, 히알루론산 또는 그 염, 도파민, 카보디이미드 화합물 및 하이드록시숙신이미드 화합물은 각각 1:1:1:1 내지 1:2:2:2의 몰비로 첨가되고,
   상기 (a) 내지 (c) 단계에서, pH는 5.0 내지 5.5로 유지되고,
   상기 히알루론산 유도체는 조성물 전체 중량을 기준으로 0.5 내지 2.0중량% 첨가되는 연조직 충전 조성물의 제조방법.
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