KR102546437B1

KR102546437B1 - 생체적합성 고분자를 포함하는 파우더형 유착방지제 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR102546437B1
Application number: KR1020210033366A
Authority: KR
Inventors: 권오형; 이혜영
Original assignee: 금오공과대학교 산학협력단
Priority date: 2021-03-15
Filing date: 2021-03-15
Publication date: 2023-06-21
Also published as: WO2022196946A1; KR20220128790A

Abstract

본 발명은 생체적합성 고분자를 포함하는 파우더형 유착방지제 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 가교제를 사용해 천연고분자를 가교시켜 제조한 파우더형 유착방지제에 관한 것으로 생체적합성이 우수한 것에 특징이 있다. 또한 점착제를 도입함으로써 조직 점착성을 향상시킬 수 있으며, 유착방지능이 우수한 효과를 제공한다.

Description

생체적합성 고분자를 포함하는 파우더형 유착방지제 및 그의 제조방법{POWDER TYPE ANTI-ADHESION AGENT COMPRISING BIOCOMPATIBLE POLYMER AND METHOD FOR MANUFACTURING THE SAME}

외과수술에서 유착 형성은 거의 모든 복부 수술 후에 발생하는 가장 흔한 문제이다. 장기와 주변 조직 사이 혹은 장기끼리에서 섬유조직이 과도하게 생성되어 비정상적인 접착을 유착이라 한다. 수술 후 복강 내 유착은 67~93%로 환자에게서 빈번하게 발생되고 있고, 이는 여성 불임(female infertility), 만성 골반 통증(chronic pelvic pain), 소장 폐색(small bowel obstruction)과 같은 심각한 문제를 야기시킨다.

조직의 유착을 효과적으로 방지하는 방법으로는 수술 시 상처를 최소화하거나, 약물 보조제(pharmacological agents)를 복용하거나, 손상된 부위를 인접한 조직이나 장기로부터 물리적으로 분리하는 유착방지막(adhesion prevention barrier)을 사용하는 방법이 있다.

현재 상용화 되고 있는 용액, 젤, 필름 형태의 유착방지막은 주변 조직과 손상된 조직을 분리시킬 수 있으므로, 약물형태보다 임상에서 더 널리 사용되고 있다. 실제로 임상적으로 효과가 가장 뛰어나다고 입증되었기 때문에 상용화되고 있는 실정이지만, 내부 장기 적용 시 장기의 운동으로 상처부위에 지속적으로 정확하게 위치하지 못하는 문제점이 있다. 또한, 조직에서 이물질로 인식되기 때문에 서로 뭉쳐짐으로써 장기 유착방지 효과가 미흡한 것으로 보고되고 있다.

유착을 감소시키는 방법 중 비침습적인 접근법인 복강경 수술이 있다. 이는 개복수술 대비 40%의 유착방지 효과를 보이는 것으로 보고되고 있으나, 시판 되고 있는 유착방지막은 개복수술에 치중되어 있는 문제점이 보고되고 있다.

이와 관련하여, 대한민국 공개특허 제10-2005-0111419호는 베타글루칸 유도체를 이용한 유착방지제를 개시하고 있다.

본 발명은 상기한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로써, 가교제를 이용해 천연고분자를 가교시켜 생체적합성이 우수한 파우더형 유착방지제 및 그의 제조방법을 제공하는 것에 있다.

또한 점착제를 도입함으로써 조직 점착성이 우수하고, 유착방지능이 우수한 파우더형 유착방지제를 제공하는 것에 있다.

전술한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본 발명의 일 측면은,

생체적합성 고분자; 및 가교제;를 포함하고, 상기 생체적합성 고분자는 상기 가교제에 의해 가교결합된 것인 파우더형 유착방지제가 제공된다.

상기 생체적합성 고분자는 키토산, 녹말, 셀룰로오스, 알지네이트, 젤라틴, 히알루론산, 히알루론산 나트륨, 콜라겐, 폴리비닐알코올(PVA), 알긴산, 펙틴, 카라기난, 콘드로이틴(설페이트), 덱스트란(설페이트), 폴리라이신(polylysine), 카르복시메틸티틴, 피브린, 아가로스, 풀루란, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 히드록시프로필셀룰로스(HPC), 히드록시에틸셀룰로스(HEC), 히드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC), 나트륨카르복시메틸셀룰로스, 폴리알콜, 아라비아검, 시클로덱스트린, 덱스트린, 포도당, 과당, 트레할로스, 글루코스, 말토스, 락토스, 락툴로스, 프럭토스, 투라노스, 멜리토스, 멜레지토스, 덱스트란, 소르비톨, 크실리톨, 팔라티니트, 폴리락트산(polylactic acid), 폴리글리콜산(polyglycolic acid), 폴리에틸렌옥사이드, 폴리아크릴산, 폴리아크릴아마이드, 폴리메타아크릴산 및 폴리말레인산키토산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

상기 생체적합성 고분자는 히알루론산 나트륨을 포함할 수 있다.

상기 가교제는 글리옥살(glyoxal), 글루타알데히드(glutaraldehye), 시트르산(citric acid), 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르(1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE), 디비닐설폰(divinyl sulfone, DVS), 아디픽산 디히드라지드(adipic dihydrazide, ADH), N,N-메틸렌 비스아크릴아마이드(N,N-methylene bisacrylamide), 디알데하이드(dialdehyde), 옥살릭액시드(oxalic acid) 및 제니핀(genipin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

상기 파우더형 유착방지제는 점착제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 점착제는 폴리비닐피롤리돈(poly(vinyl pyrrolidone), PVP), 풀루란(pullulan), 나트륨카르복시메틸셀룰로스(sodium carboxymethylcellulose) 및 도파민(dopamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일 측면은, (a) 생체적합성 고분자를 포함하는 용액을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 용액에 가교제를 투입하고 동결건조한 후, 분쇄·세척과정을 통해 파우더형 유착방지제를 제조하는 단계;를 포함하는 파우더형 유착방지제의 제조방법이 제공된다.

상기 단계 (b)의 가교제 투입 전에, 상기 용액에 촉매를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 촉매는 산 촉매일 수 있다.

상기 촉매는 염산(HCl), 질산(HNO₃), 황산(H₂SO₄), 인산(H₃PO₄) 및 불산(HF)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

상기 단계 (a)의 용액은 점착제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 단계 (a)의 용액에서 생체적합성 고분자와 점착제의 중량비는 3:7 내지 7:3일 수 있다.

상기 용액에서 상기 생체적합성 고분자 및 점착제의 농도는 1 내지 10 wt%일 수 있다.

본 발명의 파우더형 유착방지제는 가교제를 이용해 천연고분자를 가교시켜 제조한 것으로 생체적합성이 우수한 효과가 있다.

또한 본 발명의 파우더형 유착방지제는 점착제를 도입함으로써 조직 점착성이 우수하고, 유착방지능이 우수한 효과가 있다.

도 1은 실시예 1 및 실시예 2에 따른 파우더형 유착방지제의 FTIR 분석 결과로, (a)는 x-HA-PVP(5:5), (b)는 x-HA, (c)는 PVP, (d)는 HA의 FTIR 스펙트럼이다.
도 2는 214 nm에서 glyoxal의 UV-vis standard curve이다.
도 3은 실시예 1 및 실시예 2에 따른 파우더형 유착방지제의 입자 크기에 따른 흡수율로, (a)는 x-HA, (b)는 x-HA-PVP (5:5)의 흡수율이다.
도 4는 HA, pullulan, CMC 및 PVP의 점착력을 나타낸 그래프이다.
도 5는 실시예 2에 따른 파우더형 유착방지제의 점착제 종류에 따른 점착력을 나타낸 그래프이다.
도 6은 실시예 1에 따른 파우더형 유착방지제의 고분자 농도(HA 농도)에 따른 점착력을 나타낸 그래프이다.
도 7은 실시예 2에 따른 파우더형 유착방지제의 HA와 PVP의 중량비에 따른 점착력을 나타낸 그래프이다.
도 8은 실시예 1 및 실시예 2에 따른 파우더형 유착방지제의 가교제 함량에 따른 점착력을 나타낸 그래프이다.
도 9는 실시예 1 및 실시예 2에 따른 파우더형 유착방지제의 반응 시간에 따른 점착력을 나타낸 그래프이다.
도 10은 비교예 1 및 비교예 2에 따른 파우더형 유착방지제의 점착력을 나타낸 그래프이다.
도 11은 실시예 1 및 실시예 2에 따른 파우더형 유착방지제의 흡수율을 나타낸 그래프이다.
도 12는 실시예 1에 따른 파우더형 유착방지제의 생분해거동 분석 결과이다.
도 13은 실시예 2에 따른 파우더형 유착방지제의 생분해거동 분석 결과이다.
도 14는 실시예 1 및 실시예 2에 따른 파우더형 유착방지제의 세포독성 분석 결과이다.
도 15는 실시예 1 및 실시예 2에 따른 파우더형 유착방지제의 Live/Dead 염색을 통한 세포성장거동 분석 결과이다.
도 16은 실시예 1 및 실시예 2에 따른 파우더형 유착방지제의 in vitro 유착방지 실험 결과이다.
도 17은 유착방지제를 적용하지 않은 대조군의 유착방지능 평가 결과이다.
도 18은 실시예 1에 따른 파우더형 유착방지제의 유착방지능 평가 결과이다.
도 19는 실시예 2에 따른 파우더형 유착방지제의 유착방지능 평가 결과이다.
도 20은 실시예 2에 따른 파우더형 유착방지제가 조직(tissue)에 부착된 이미지로, (a)는 간(liver) 조직, (b)는 맹장(cecum) 조직, (c)는 복부(abdomial) 조직이다.
도 21은 조직염색을 통한 유착방지능 확인 결과로, (a) 및 (b)는 각각 유착방지제를 적용하지 않은 대조군의 H&E 염색 및 masson's trichrome 염색 결과이고, (c) 및 (d)는 각각 실시예 1에 따른 파우더형 유착방지제의 H&E 염색 및 masson's trichrome 염색 결과이다.
도 22는 실시예 2에 따른 파우더형 유착방지제의 조직염색을 통한 유착방지능 확인 결과로, (a) 및 (b)는 각각 치유된 H&E 염색 및 masson's trichrome 염색 결과이고, (c) 및 (d)는 치유된 의 H&E 염색 및 masson's trichrome 염색 결과이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 의해 본 발명이 한정되지 않으며 본 발명은 후술할 청구범위의 의해 정의될 뿐이다.

덧붙여, 본 발명에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 발명의 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 '포함'한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.

이하, 본 발명의 파우더형 유착방지제에 대해 설명하도록 한다.

본 발명은 생체적합성 고분자; 및 가교제;를 포함하고, 상기 생체적합성 고분자는 상기 가교제에 의해 가교결합된 것인 파우더형 유착방지제를 제공한다.

상기 생체적합성 고분자는 키토산, 녹말, 셀룰로오스, 알지네이트, 젤라틴, 히알루론산, 히알루론산 나트륨, 콜라겐, 폴리비닐알코올(PVA), 알긴산, 펙틴, 카라기난, 콘드로이틴(설페이트), 덱스트란(설페이트), 폴리라이신(polylysine), 카르복시메틸티틴, 피브린, 아가로스, 풀루란, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 히드록시프로필셀룰로스(HPC), 히드록시에틸셀룰로스(HEC), 히드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC), 나트륨카르복시메틸셀룰로스, 폴리알콜, 아라비아검, 시클로덱스트린, 덱스트린, 포도당, 과당, 트레할로스, 글루코스, 말토스, 락토스, 락툴로스, 프럭토스, 투라노스, 멜리토스, 멜레지토스, 덱스트란, 소르비톨, 크실리톨, 팔라티니트, 폴리락트산(polylactic acid), 폴리글리콜산(polyglycolic acid), 폴리에틸렌옥사이드, 폴리아크릴산, 폴리아크릴아마이드, 폴리메타아크릴산 및 폴리말레인산키토산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 히알루론산 나트륨(sodium hyaluronate, HA)을 포함할 수 있다.

HA는 β-1,4-D-glucuronic acid와 β-1,3-N-acetyl-D-glucosamine으로 결합한 이당류 반복 단위를 가진 선형 다당류로서, 주로 생체 내 세포외기질의 주요 구성성분이고 염의 형태인 hyaluronate로 존재한다. HA의 생물학적 기능은 관절 활액 및 안구 유리액과 같은 액체형태의 결합조직의 탄성을 유지하고, 세포외기질에서 프로테오글리칸(proteoglycan)의 초분자 조립, 세포의 이동, 분화, 세포들 사이의 신호전달 등의 역할을 한다. 구체적으로는, 결합조직, 상피조직, 신경 조직에 걸쳐 널리 분포하고 있고, 비면역성, 생체적합성, 생분해성이 뛰어난 생체고분자물질이다.

HA 분자에서 가교를 주로 담당하고 있는 작용기는 hydroxyl 그룹과 carboxyl 그룹이다. Hydroxyl 그룹은 ether 결합과 acetal 결합으로 가교될 수 있고, carboxyl 그룹은 ester 결합을 통해 가교될 수 있다.

상기 가교제는 글리옥살(glyoxal), 글루타알데히드(glutaraldehye), 시트르산(citric acid), 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르(1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE), 디비닐설폰(divinyl sulfone, DVS), 아디픽산 디히드라지드(adipic dihydrazide, ADH), N,N-메틸렌 비스아크릴아마이드(N,N-methylene bisacrylamide), 디알데하이드(dialdehyde), 옥살릭액시드(oxalic acid) 및 제니핀(genipin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 글리옥살을 포함할 수 있다.

Glyoxal은 현존하는 가장 작은 dialdehyde 그룹을 가지고 있으며, 다당류에 존재하는 hydroxyl 그룹과 산 촉매하에 acetal 결합이나 hemiacetal 결합을 형성하고, primary amine과 shiff base 결합을 형성하는 가교제이다. Glyoxal은 동일한 dialdehyde 그룹을 가진 glutaraldehyde보다 독성이 적고, 100 ppm이하의 농도를 유지하면 세포가 손상되지 않고 높은 생체적합성을 유지할 수 있다.

상기 점착제는 폴리비닐피롤리돈(poly(vinyl pyrrolidone), PVP), 풀루란(pullulan), 나트륨카르복시메틸셀룰로스(sodium carboxymethylcellulose) 및 도파민(dopamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 PVP를 포함할 수 있다.

PVP는 FDA 승인을 받은 대표적인 생흡수성 및 생체적합성 특징을 가진 amorphous한 합성 고분자로써, 여러 의약 및 제약분야에 사용되고 있다. 또한, PVP는 HA와 poly(vinyl alcohol)과 같은 hydroxyl 그룹을 가진 고분자와 수소결합을 형성하여 다양한 화합물과 복합체를 형성할 수 있다.

본 발명의 파우더형 유착방지제는 체내에서 유착을 일으킬 수 있는 염증반응, 면역반응을 발생시키지 않으면서 생체적합성이 뛰어나고, 조직 치유기간 동안 자연적으로 분해되어 제거하는 2차 수술이 필요 없는 효과가 있다.

취급 편의성을 갖춘 본 발명의 파우더형 유착방지제는 복강경 수술에도 적용이 가능하며 공기분사(air spraying)에 의해 쉽게 결함부위를 효과적으로 덮을 수 있다.

이하, 본 발명의 파우더형 유착방지제의 제조방법에 대해 설명하도록 한다.

먼저, 생체적합성 고분자를 포함하는 용액을 제조한다(단계 a).

상기 단계 (a)의 용액은 점착제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 단계 (a)의 용액에서 생체적합성 고분자와 점착제의 중량비는 3:7 내지 7:3일 수 있으며, 바람직하게는 4:6 내지 6:4일 수 있다.

상기 용액에서 상기 생체적합성 고분자 및 점착제의 농도는 1 내지 10 wt%일 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 4 wt%일 수 있다.

상기 용액이 생체적합성 고분자만 포함하는 경우, 상기 용액에서 상기 생체적합성 고분자의 농도는 1 내지 10 wt%일 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 4 wt%일 수 있다.

다음으로, 상기 용액에 가교제를 투입하고 동결건조한 후, 분쇄·세척과정을 통해 파우더형 유착방지제를 제조한다(단계 b).

상기 파우더형 유착방지제는 상술한 본 발명의 파우더형 유착방지제에서의 설명과 동일하므로 구체적인 내용은 그 부분을 참조하기로 한다.

상기 촉매는 산 촉매일 수 있다.

상기 촉매는 염산(HCl), 질산(HNO₃), 황산(H₂SO₄), 인산(H₃PO₄) 및 불산(HF)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 염산을 포함할 수 있다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

< 실시예 >

실시예 1: Glyoxal 가교제로 가교된 HA를 포함하는 파우더형 유착방지제(x-HA)의 제조

히알론산나트륨(HA, MW: 약 1,000 kDa, Bloomage Freda Biopham Co.)을 4℃의 3차 증류수에 넣고 24시간 동안 교반시켜 3 wt% HA 용액을 제조하였다. 이후, 산 촉매인 1 N HCl을 이용하여 pH 4~5로 맞추고 40 wt% glyoxal 용액(in H₂O, Sigma-Aldrich社) 0.13 ml를 첨가하여 상온에서 2시간 동안 mechanical stirrer를 이용하여 100 rpm으로 교반시킨 후, 48시간 동안 상온에서 후가교를 진행하였다. 1 N NaOH를 이용하여 pH 7로 맞추어 반응을 종결시키고, 반응이 끝난 용액을 예비동결 시킨 뒤, 3일 간 동결건조하였다. 동결건조 후, 막자 사발을 이용하여 파우더로 빻고 acetone을 이용하여 미반응 가교제를 세척하였다. 이때, 3시간 마다 한번씩 새로운 acetone으로 교환해주고, 총 6시간 세척을 진행하였다. 세척이 끝나면 acetone을 제거하여 파우더형 유착방지제(x-HA)를 제조하였다.

실시예 2: Glyoxal 가교제로 가교된 HA 및 PVP를 포함하는 파우더형 유착방지제(x-HA-PVP)의 제조

히알론산나트륨 및 폴리비닐피롤리돈(PVP, average MW: 1,300 kDa, Sigma-Aldrich社)을 4℃의 3차 증류수에 넣고 24시간 동안 교반시켜 3 wt% HA-PVP 용액을 제조하였다. 이때, HA와 PVP의 중량비는 5:5이다.

실시예 1에서 HA 용액을 사용하는 대신에 상기 HA-PVP 용액을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 파우더형 유착방지제(x-HA-PVP)를 제조하였다.

비교예 1: BDDE 가교제로 가교된 HA를 포함하는 파우더형 유착방지제(x-HA-BDDE)의 제조

1% (v/v) BDDE가 든 0.25 M NaOH 용액에 3% (w/v) HA를 녹이고 40℃에서 6시간 동안 반응을 진행한 다음, 반응물을 3차 증류수를 이용하여 3번 세척하여 하이드로젤 형태를 얻었다. 미반응 가교제를 세척하기 위해 PBS, 3차 증류수를 이용하여 차례대로 24시간마다 투석을 진행하였다. 투석을 마친 BDDE로 가교된 용액을 얼음 틀에 넣고 deep freezer (-80℃)에서 예비동결을 시킨 다음 동결건조기를 이용하여 2일간 동결 건조시키고, 막자사발을 이용해 분쇄하여 파우더형 유착방지제(x-HA-BDDE)를 제조하였다.

비교예 2: BDDE 가교제로 가교된 HA 및 PVP를 포함하는 파우더형 유착방지제(x-HA-PVP-BDDE)의 제조

비교예 1에서 1% (v/v) BDDE가 든 0.25 M NaOH 용액에 3% (w/v) HA를 녹이 대신에 3% (w/v) HA 및 PVP를 녹이는 것을 제외하고는 비교예 1과 동일한 방법으로 파우더형 유착방지제(x-HA-PVP-BDDE)를 제조하였다.

< 실험예 >

실험예 1: FTIR을 이용한 가교 확인

실시예 1 및 실시예 2에 따른 x-HA와 x-HA-PVP(5:5)가 가교된 것을 확인하기 위해서 fourier transform infrared spectroscopy (FTIR, 300E, Jasco)를 이용하였다. 파우더를 potassium bromide (KBr) 펠렛으로 제조하였고, 스캔 수는 64, 파장은 4000-600 cm^-1 범위에서 측정하였다.

FTIR 분석 결과를 도 1에 나타내었으며, 도 1의 (a)는 x-HA-PVP(5:5), (b)는 x-HA, (c)는 PVP, (d)는 HA의 FTIR 스펙트럼이다. HA의 hydroxyl 그룹은 glyoxal의 aldehyde 그룹과 반응하여 acetal 결합을 형성한다. 도 1을 참조하면, acetal 결합의 형성을 알 수 있는 -C-O-C- 그룹이 1140, 1050 cm^-1에서 관찰되었다. PVP의 C-N stretching peak인 1290 cm^-1와 HA의 1050 cm^-1에서 -C-O-C- peak가 x-HA-PVP(5:5)에서 관찰되었다. 이를 통해, x-HA-PVP(5:5)는 HA와 PVP의 특성 작용기를 동시에 가지고 있음을 알 수 있었다. 이는 세척 과정이 지난 후에도 PVP가 남아있음을 알 수 있다. HA의 hydroxyl 그룹은 glyoxal의 aldehyde 그룹과 서로 공유 결합하여 acetal 결합을 형성한다. 이때 PVP는 반응에 참여하지 않고, HA의 OH 그룹과 약한 수소결합을 형성한다.

실험예 2: 잔여 가교제 함량 확인

미반응 가교제가 남아있을 경우, 체내 염증반응을 일으키고, 이는 유착을 일으키는 원인이 된다. 실시예 1 및 2에 따른 x-HA 및 x-HA-PVP (5:5)에 잔존한 glyoxal 가교제의 양을 확인하기 위해 UV-Visible spectrometer(Shimadzu, Japan)를 이용하여 200-700 nm 파장범위에서 1 cm^-1 quartz cell을 이용하여 샘플의 흡광도를 측정하였다.

40 wt%의 glyoxal 가교제를 standard solution으로 정하고 표준곡선을 그리기 위해 일정 농도로 희석하여 100~2000 ppm 범위에서 UV 흡광도를 측정하였다. 도 2는 214 nm에서 glyoxal의 UV-vis standard curve이다. 실시예 1 및 실시예 2에서 아세톤으로 6시간 세척을 마친 용액 3 ml 덜어 감압증류로 용매를 날린 후 증류수 3 ml를 넣어주었다. UV 장비를 사용하여 흡광도를 측정한 결과, x-HA와 x-HA-PVP (5:5) 파우더 세척용액은 각각 0.009, 0.012의 흡광도를 보였으며 이는 41, 56 ppm으로 100 ppm 이하임을 알 수 있었다. Glyoxal 가교제는 100 ppm 이하일 경우, 생체적합하다는 연구 결과가 있기 때문에 x-HA와 x-HA-PVP (5:5) 파우더는 인체에 무해한 농도까지 미반응 가교제가 세척됨을 알 수 있었다.

실험예 3: 파우더형 유착방지제의 입자 크기에 따른 흡수율 측정

실시예 1 및 실시예 2에서 고분자 농도 3 wt%, 가교제의 양은 0.26 ml, 반응시간은 48 h으로 가교반응을 진행하였고, 입자 크기에 따른 수분 흡수율 측정을 위해 크기별 mesh를 이용하여 파우더를 500 ㎛ 이상, 250~500 ㎛, 125~250 ㎛, 125 ㎛ 이하의 크기로 분리하였다. 입자 크기별 흡수율을 아래 식 1과 같이 계산하여 최적의 입자크기를 결정하였다. 흡수율 평가는 입자 크기별 파우더 0.1 g에 증류수를 50 ㎕씩 가하여 더 이상 흡수하지 못할 때의 무게를 측정하여 흡수율(W_A)을 계산하였다.

[식 1]

상기 식 1에서, W_initial는 파우더의 최초 무게, W_absop는 최대로 흡수했을 때의 파우더 무게이다.

입자 크기에 따른 흡수율을 도 3에 나타내었으며, 도 3의 (a)는 x-HA, (b)는 x-HA-PVP (5:5)의 흡수율이다. 도 3을 참조하면, x-HA와 x-HA-PVP 파우더 모두 250~500 ㎛의 입자크기에서 최대 흡수율을 보임을 알 수 있었다. 가교된 x-HA 파우더는 250~500 ㎛의 입자크기에서 640%의 흡수율을 보였고, x-HA-PVP 파우더는 250~500 ㎛의 입자크기에서 769%의 흡수율을 보였다.

실험예 4: 파우더형 유착방지제의 점착력 측정

가교된 x-HA와 x-HA-PVP 파우더에 일정량의 증류수를 가하여 젤을 형성한 후 고분자의 농도, 가교제의 농도, 반응시간에 따른 점착력을 측정하기 위해 rheometer를 이용하였다. Discovery Hybrid Rheometer (DHR-Ⅱ TA instruments, USA)장비로 tack adhesion mode를 사용하였다. 레오미터의 상단에 20 mm parallel plate (peltier plate steel, 110258)를 장착하고, 20~30 mm 두께의 돼지피부를 붙이고, 하단의 plate에는 샘플을 두었다. 샘플은 x-HA와 x-HA-PVP 파우더 20 mg당 50 ㎕의 물을 가해주어 젤을 만들어 점착력을 비교하였다. Compression 모드를 이용하여 돼지피부가 붙은 plate를 0.01 N의 힘을 가해 샘플과 접촉시킨 후, tension 모드를 이용하여 50 ㎛/s의 일정한 힘을 주어 돼지 피부와 샘플 표면의 negative force를 측정하였다(35℃, gap: 3000 ㎛, n=5).

실험예 4-1: 점착제 종류에 점착력 측정

점착제로써 조직의 점착성을 향상시키는 것으로 알려진 고분자 3가지를 실험군으로 정하였다. 대조군은 HA로, 실험군은 carboxymethylcellulose (CMC, Na salt), pullulan과 PVP로 정하여 점착력 테스트를 진행하였고, 먼저 가교반응을 시키지 않은 채 측정하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4를 참조하면, 평균적인 HA의 negative force는 -0.89 N, pullulan은 -0.3 N, CMC는 -1.0 N, PVP는 -2.34 N으로 나왔다. 이 중 PVP가 큰 negative force를 나옴으로써 점착력이 가장 큰 물질임을 알 수 있었다.

HA가 glyoxal과 반응 시 HA의 반응할 수 있는 작용기의 몰수를 계산하여 1:1로 반응한다고 가정하고 실시예 2에서 glyoxal의 양을 0.26 ml 넣어주었고, 최종 용액 3 wt%의 농도로 진행하였다. 반응시간은 48시간으로 고정하고, 점착제로 HA, pullulan, CMC, PVP를 넣어 HA와 함께 5:5의 비율로 가교 반응하여 점착력을 비교하였고, 이를 각각 3 wt% x-HA, 3 wt% x-HA-pullulan, 3 wt% x-HA-CMC, 3 wt% x-HA-PVP로 표기하였다. 점착제 종류에 따른 점착력을 도 5에 나타내었다.

도 5를 참조하면, HA는 가교반응 시 점착력이 떨어지는 것으로 보아 self crosslinking이 일어남을 알 수 있었고, 혼합한 파우더의 평균적인 negative force는 3 wt% x-HA는 -0.74 N, 3 wt% x-HA-pullulan은 -0.14 N, 3 wt% x-HA-CMC는 -0.5 N, 3 wt% x-HA-PVP는 -1.29 N임을 관찰하였다. 이를 통해 HA와 혼합된 PVP 파우더가 가장 negative force가 높아 점착력이 큰 것을 알 수 있고, 가교된 HA의 3차원 망상구조 사이로 침투하여 semi-IPN 구조를 형성하면서 수소결합을 통한 시너지 효과가 나타남을 알 수 있었다.

실험예 4-2: 고분자 농도에 따른 점착력 측정

실시예 1에서 가교제 양을 0.26 ml, 반응시간을 48시간으로 고정한 조건에서 가교된 HA의 고분자 농도를 1, 2, 3, 4, 5, 6 wt%로 달리하여 점착성을 측정하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6을 참조하면, 고분자(HA) 농도를 1, 2, 3, 4, 5, 6 wt%로 증가시킴에 따라 -0.75, -0.75, -0.74, -0.55, -0.30, -0.14 N으로 점착성이 떨어지는 것을 알 수 있었고, 이는 가교반응 시 HA의 점착성이 떨어짐을 입증한다. 1 wt%에서 3 wt%까지는 점착성의 차이가 거의 없는 것을 알 수 있었고, 3 wt% 이상의 고분자 농도에서는 가교 시 점착성이 감소되는 것을 관찰하였다. 고분자 농도가 커질수록 반응할 수 있는 작용기의 수가 많아지고 같은 양의 가교제를 투입하더라도 네트워크가 더 조밀해지고 고분자 사슬간의 결합을 단단하게 만든다. 이에 따라 표면의 점착력이 줄어들었을 것이라 판단하였다.

실험예 4-3: HA와 PVP의 비율에 따른 점착력 측정

실시예 2에서 가교제 양을 0.26 ml, 반응시간을 48시간으로 고정하고 HA와 PVP의 비율을 각각 7:3, 5:5, 3:7로 하고 최종 가교반응된 고분자 용액의 농도는 1, 3, 6 wt%로 달리하여 최고의 점착성을 띄는 비율을 측정하였으며, 그 결과를 도 7 및 표 1 내지 3에 나타내었다.

1 wt%	x-HA	x-HA-PVP (7:3)	x-HA-PVP (5:5)	x-HA-PVP (3:7)
Negative force	-0.75 N	-0.76 N	-1.09 N	-1.33 N

3 wt%	x-HA	x-HA-PVP (7:3)	x-HA-PVP (5:5)	x-HA-PVP (3:7)
Negative force	-0.74 N	-0.79 N	-1.29 N	-1.37 N

6 wt%	x-HA	x-HA-PVP (7:3)	x-HA-PVP (5:5)	x-HA-PVP (3:7)
Negative force	-0.14 N	-0.56 N	-0.67 N	-0.99 N

도 7 및 상기 표 1 내지 3을 참조하면, PVP를 도입하고 점착성이 향상되었음을 모든 실험군에서 확인할 수 있었고 PVP 함량이 많아질수록 점착성도 크게 향상되었음을 관찰할 수 있었다. 또한 1 wt%에 PVP를 도입한 점착력보다 3 wt%에 PVP를 도입한 점착력이 높게 나온 것을 확인할 수 있었다.

실험예 4-4: 가교제 함량에 따른 점착력 측정

실시예 1 및 실시예 2에서 고분자 농도를 3 wt%, 6 wt%로, 반응 시간을 48시간으로 고정한 조건에서 가교제의 비율별, HA와 PVP의 비율별 점착성 평가를 진행하였다. 가교제의 양은 반응할 수 있는 HA의 작용기 몰수를 계산하여 1:1을 기준으로 0.065, 0.13, 0.26, 0.52, 1.3 ml를 넣어 점착성을 비교하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8을 참조하면, 각 고분자의 농도마다 가교제 함량이 많아질수록 점착성은 떨어지는 것을 알 수 있었고, 가교 반응 시 가교제의 함량은 주요하게 작용한다고 판단하였다. 또한, 3 wt%와 6 wt%의 고분자 농도 모두 0.13 ml의 가교제 양이 들어간 파우더가 높은 negative force를 띄는 경향을 알 수 있었다. 6 wt%로 제조한 파우더의 경우 사슬 내 entanglement가 많아지면서 표면에 있는 사슬의 유동성이 줄어들고, 표면과 표면이 접촉할 때 밀착도가 떨어져 점착력이 감소되었을 것이라 판단되었다.

실험예 4-5: 반응 시간에 따른 점착력 측정

실시예 1 및 실시예 2에서 가교제 양을 0.13 ml, 고분자 농도를 3 wt%로 고정한 후 HA와 PVP의 비율과 반응시간을 달리하여 파우더를 제조하고 점착성을 측정하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9를 참조하면, HA와 PVP의 비율을 다르게 한 파우더 모두 48시간 동안 진행한 반응에서 높은 점착력을 띄는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 5: BDDE로 가교한 파우더형 유착방지제의 점착력 측정

대표적인 hydroxyl 그룹을 가교시키는 가교제로 알려진 BDDE를 비교군으로 정하여 가교를 진행하고 동일한 조건에서 PVP를 도입하여 점착력을 관찰하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10을 참조하면, PVP를 도입함으로써 점착력이 향상되었음을 알 수 있었다. 하지만, 그 수치는 glyoxal 가교제를 사용한 것과 비교했을 때(도 7의 (b) 참조) 떨어지는 결과가 나왔고, 이를 통해 glyoxal 가교제를 사용하여 점착성을 향상시킨 것이 보다 효과적임을 알 수 있었다.

실험예 6: 파우더형 유착방지제의 흡수율 측정

수술 후 조직 자가 치유과정에서 염증성 삼출물이 나오게 된다. 삼출물을 흡수하면서 정확한 목표부위에 잘 부착되는지 평가하기 위해 실시예 1 및 2에 따른 가교된 x-HA 및 x-HA-PVP 파우더의 흡수율을 계산하였으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다.

가교하지 않은 HA 파우더의 흡수율을 측정한 결과, 1061%가 나왔으며, 가교하지 않은 PVP의 흡수율은 254%가 나왔다. 실시예 2에서 HA와 PVP의 중량비를 달리하여 흡수율을 측정하였다. 도 11을 참조하면, 가교시킨 HA 파우더는 흡수율이 감소됨을 알 수 있었다. PVP 비율에 따른 흡수율은 7:3이 가장 높았고, PVP 함량이 많아질수록 감소됨을 알 수 있었다. 하지만, 7:3과 5:5의 흡수율 차이는 대략 5% 차이로 적음을 알 수 있었고, 점착성은 34% 차이로 5:5의 비율이 우수함을 알 수 있었다(도 7의 (b) 참조). 파우더형 유착방지제는 복막과 조직에 파우더를 뿌리고 증류수를 도포함으로써 점착성 특성이 우세하게 적용된다. 따라서 흡수율은 7:3의 비율과 미세한 차이가 있지만 5:5의 비율이 점착성이 우수함으로 PVP와의 최적조건은 5:5이다.

실험예 7: 파우더형 유착방지제의 생분해거동 분석

실시예 1 및 실시예 2에 따른 x-HA와 x-HA-PVP 파우더를 37℃에서 HAase와 함께 배양하여 Bitter-Muir 방법으로 carbazole assay를 이용하여 효소안정성 평가를 진행하였다. 표준물질과 HA, x-HA, x-HA-PVP 파우더(20 mg)를 10 ml HAase 용액(10 U/ml, in PBS)과 함께 넣고 37℃에서 배양하였다. 일정 시간(3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, 144 h)이 지난 후 상층액 0.5 ml를 꺼내고, 새로운 HAase 용액 0.5 ml (10 U/ml)로 대체하였다. 상층액 0.5 ml를 미리 vial에 준비해둔 3 ml의 0.025 M sodium tetraborateㆍ10H₂O (in sulfuric acid) 용액에 층 분리가 되도록 신중하게 넣어주었다. Vial을 닫고 천천히 흔들어준 후, 4℃에서 냉각시켰다. 냉각시킨 vial을 끓는 water bath에 10분 동안 가열하여 효소를 비활성화 시킨 후, 상온에서 냉각시켰다. 0.1 ml의 0.125% carbazole (in absolute ethanol) 용액을 vial에 더하고 4℃에서 냉각시켰다. 다시 끓는 water bath에 15분간 vial를 가열하고 상온에서 냉각시킨 후, 샘플과 standard 용액의 흡광도를 530 nm에서 측정하였다.

표준물질로써 D-glucuronic acid lactone을 사용하였고, 4-60 ㎍/ml의 농도로 표준곡선을 그려 샘플의 uronic acid 양을 정량화하였다. 상층액의 glucuronic acid의 농도를 C₁, 상층액의 최종 glucuronic acid의 농도를 C₂라고 표시하여 아래 식 2와 같이 분해율(W_D)을 계산하였다.

[식 2]

대조군은 가교하지 않은 HA로 실험군은 실시예 1에서 가교된 x-HA의 농도를 1, 3, 6 wt%로 달리하여 생분해실험을 진행하였고, 3, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144 h 시간 간격으로 꺼내어 히알루론산 효소에 의해 분해되어 생성된 uronic acid의 양을 정량화하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12를 참조하면, 가교하지 않은 HA는 3 h만에 98%로 모든 분해가 이루어졌음을 확인할 수 있었다. 가교된 x-HA의 농도가 클수록 작용기의 수가 증가하여 가교도가 증가하게 된다. 이는 생분해 속도에 영향이 있는 것으로 판단되고 결과를 보았을 때, 1 wt%의 x-HA는 120 h, 즉 4일만에 분해가 되고, 3 wt%의 x-HA는 144 h, 5일만에 분해되고, 6 wt%의 x-HA는 168 h, 6일만에 분해가 됨을 알 수 있다. 6 wt%의 x-HA는 144 h 일 때 약 90%의 분해로 3 wt%와 유사한 생분해속도임을 알 수 있었다. 이를 통해, 가교하지 않은 HA와 x-HA는 생분해거동이 확연히 차이나는 것으로 보아 glyoxal 가교제를 이용한 가교결합이 이루어졌음을 입증하였다.

실시예 2에서 HA와 PVP의 함량비를 다르게 하여 생분해거동을 분석한 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13을 참조하면, PVP 함량이 가장 많은 3:7의 비율이 48 h만에 분해되었고, 흡수율과 점착성이 최적비율인 5:5는 120 h, 즉 4일만에 분해가 됨을 알 수 있었다. HA의 함량이 더 많은 7:3과의 차이가 적음을 알 수 있는데 이는 가교된 HA의 망상구조 사이로 PVP가 침투하여 수소결합을 함으로써, HAase의 효소에 대한 저항성을 가지는 것으로 판단된다. 제조한 3 wt%의 x-HA와 x-HA-PVP 파우더는 유착방지 파우더로 적용 시 조직 치유 기간인 3~4일간은 효소에 대한 저항성을 가짐을 알 수 있었다.

실험예 8: 파우더형 유착방지제의 in vitro 생체적합성 분석

실험예 8-1: 세포독성 분석

실시예 1 및 실시예 2에 따른 가교된 x-HA와 x-HA-PVP (5:5)의 유착방지제로써의 안전성을 평가하기 위해 in vitro 세포독성평가를 진행하였다. 생체재료가 독성을 가질 경우, 주변 세포 괴사와 염증을 유발하기 때문에 생체재료의 생체적합성 평가는 필수적이다. NIH3T3 (mouse fibroblast)을 이용하여 파우더가 세포에 어떠한 영향을 미치는지 평가하기 위해 MTT-formazan assay를 GB/T 16886.5-2003(ISO 10993-5)에 의거하여 진행하였다.

먼저, 12-well plate에 well당 2.5 Х 10⁴ cells를 seeding한 후, 3 ml DMEM을 넣고, 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 24시간 배양시켰다. 동시에 24시간 동안 샘플을 용출하여 검출 용출물을 준비하였다. 1, 3, 5, 10% 용출액으로 세포독성을 진행해 주었다. DMEM 5 ml에 샘플 0.2 g을 준비하여 24시간 동안 용출한 뒤, 그 용출액을 24시간 동안 세포가 배양된 12-well plate에 30, 90, 150, 300 ㎕로 각각 교체한 후, 3 ml까지 배양액을 넣었다. 추가로 48시간 동안 배양시킨 후, serum free DMEM:MTT=4:1로 제조한 용액 500 ㎕를 각 well에 넣고, 추가로 1시간 동안 염색하였다. 염색된 세포를 DMSO로 녹여내어 보라색 용액으로 만들어 준 후, 96-well plate에 각각의 용액을 100 ㎕씩 옮겨 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

대조군은 아무런 처리를 하지 않고 실험군과 동일한 시간으로 배양한 세포를 사용하였고, 이를 세포 생존율 100%로 하여 x-HA와 x-HA-PVP (5:5) 파우더의 세포 생존율을 계산하였으며, 그 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14를 참조하면, x-HA 파우더 용출물을 1, 3, 5, 10%로 가할 경우, 세포 생존율은 112, 117, 117, 110%로 나타났고, 이는 세포독성 1등급을 나타내는 수치임을 알 수 있었다. 또한, x-HA-PVP (5:5) 파우더 용출물을 1, 3, 5, 10%로 가하여 배양할 경우, 세포 생존율은 128, 110, 94, 90%로 나타났고, 이는 세포독성 1등급을 나타내는 수치임을 알 수 있었다.

세포독성 1등급은 >80%에 해당하는 수치로 가교반응 시킨 x-HA와 x-HA-PVP (5:5) 파우더 모두 해당 등급에 해당함을 알 수 있고, 낮은 세포 독성을 보여준다. 나아가 유착방지 파우더로 적용하기에 생체적합성이기 때문에 낮은 염증반응을 유발하고, 인체 내에 무해하다는 것은 보여준다.

실험예 8-2: Live/Dead 염색을 통한 세포성장거동 분석

실시예 1 및 실시예 2에 따른 x-HA와 x-HA-PVP(5:5)에 대한 세포성장거동을 파악하기 위해 Live/Dead 염색을 이용하여 시각적으로 세포의 성장거동을 평가하였다. 35 mm petri dish에 5.0 Х 10⁴ cells를 각각 seeding 하고 4시간 배양하여 세포를 접착시킨 뒤 그 위에 샘플 용출물을 직접적으로 세포와 접촉하게 하였다. 그 후, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 1, 3, 5일간 배양하여 세포 성장 거동을 관찰하였다. Live/Dead 염색은 2 μM calcein AM (Live staining)과 4 μM ethidium homodimer-1 (EthD-1, Dead staining)을 이용하여 30분간 염색하여 살아있는 세포는 녹색으로 죽은 세포는 적색으로 염색하였고, 형광현미경을 이용하여 염색된 생존세포와 사멸세포를 관찰하였다.

실험군은 실시예 1 및 실시예 2에 따른 가교시킨 x-HA와 x-HA-PVP(5:5) 파우더를 이미 접착된 세포 위에 올려 세포성장거동을 확인하였다. 대조군은 아무런 처리를 하지 않고 실험군과 동일한 시간 동안 배양한 세포를 관찰하였으며, 그 결과를 도 15에 나타내었다.

도 15를 참조하면, 1일차에는 대조군과 유사하게 녹색으로 관찰된 생존세포가 보임을 알 수 있었고, 사멸세포는 모두 관찰되지 않았다. 5일차에는 실험군 모두 대조군보다 녹색으로 관찰된 생존세포가 많이 보이는 것을 알 수 있고, 적색으로 염색된 사멸세포는 관찰되지 않아 생체적합하다는 것을 시각적으로 확인할 수 있었다.

실험예 8-3: In vitro 유착방지 실험

시간이 지남에 따라 생분해되는 유착방지제에 세포가 부착하고 성장하게 되면 조직회복 과정이 일어나 유착이 일어날 수 있다. 따라서, x-HA, x-HA-PVP (5:5) 파우더 용출물을 배양하고 세포의 형태를 관찰하여 유착방지 효과가 있는지 확인하였다.

실험에서 사용한 샘플은 앞선 세포실험과 동일한 NIH3T3 (mouse fibroblast) 세포를 이용하였고, 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin을 함유하는 DMEM 배지에 배양하였다. 35 mm petri dish 바닥면에 용출물(2 ml)를 도포하였으며, NIH3T3 섬유아세포 (5.0 Х 10⁴ cells)를 접종하였다. 24시간 동안 배양한 후, 35 mm petri dish를 현미경으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 16에 나타내었다.

도 16을 참조하면, 용출물을 바닥에 도포하지 않은 대조군(control)은 바닥면에 세포가 부착, 성장하고 세포의 형태가 뾰족한 삼각형 모양으로 바뀌었다. 세포는 소수성인 환경에서 성장하고 부착이 잘되는 반면, 친수성인 x-HA와 x-HA-PVP (5:5) 파우더 용출물로 배양한 세포는 부착이 되지 않고, 형태가 원형임을 알 수 있었다. 이러한 결과로 x-HA와 x-HA-PVP (5:5) 파우더 용출물은 유착방지 효과를 가지고 유착방지제로서 응용이 될 수 있음을 알 수 있다.

실험예 9: 파우더형 유착방지제의 유착방지능 분석

실험예 9-1: In vivo 유착방지능 평가

실시예 1 및 실시예 1에 따른 x-HA 및 x-HA-PVP (5:5) 파우더의 유착방지능을 평가하기 위해 실험대상으로 8주령의 male Sprague Dawley rats(효창사이언스, 250~300 g)를 이용하여 동물실험을 진행하였다. 실험 대조군은 아무 처리를 하지 않았고, 실험군은 x-HA와 x-HA-PVP (5:5) 파우더를 유착방지제로 사용하였다. 개체수는 실험 대조군과 실험군 모두 각각 5마리로 하여 실험을 진행하였다. 실험은 다음과 같은 과정으로 진행되었다.

(1) 동물용 마취제인 Zoletil^® 50과 Rompun^®으로 4:1 부피비율로 섞은 후 SD rat의 허벅지근육에 0.15 ml의 양을 근육주사하여 마취시킨다.

(2) 마취가 되면 복부의 털을 제모한다.

(3) 털을 제모한 SD rat을 수술대로 옮기고 복부 부위를 povidon-iodine을 이용하여 소독하고, 복부 중앙에 10번 메스를 이용하여 복부를 절개한다.

(4) SD rat의 복강막을 메스를 이용하여 1 Х 1 cm²의 크기로 출혈이 일어날 정도로 상처를 내고, 상처낸 복강막과 맞닿은 맹장을 사포로 출혈이 일어날 정도로 손상을 가한다.

(5) 대조군은 (4)의 과정을 거친 뒤, 별도의 처치를 하지 않았으며, 실험군은 상처 낸 복강막과 맹장에 파우더 0.1 g을 뿌리고 300 ㎕ 생리식염수를 뿌려주었다.

(6) 절개한 복강막은 생분해성 수술용 봉합사로, 진피층은 비분해성 수술용 봉합사로 봉합한다.

(7) 항온항습을 유지하면서 먹이와 물을 충분히 주면서 4주간 사육한 후에, potassium chloride (KCl)을 주사하여 안락사 시킨 후 유착 정도를 평가하였다.

(8) 조직염색을 진행하기 위해 채취한 유착부위와 조직을 10 v/v% formalin 용액으로 고정시킨다.

유착방지제를 적용하지 않은 대조군과 x-HA 및 x-HA-PVP(5:5) 파우더를 적용한 실험군의 4주간의 사육과정이 끝난 후 재개복하여 유착발생 상태를 관찰하였다. 등급은 0에서 4까지 총 5등급으로 분류하였다. 0 등급 = 유착 발생이 없는 경우, 1 등급 = 맹장과 복강막사이에 매우 약한 힘으로도 쉽게 분리되는 하나의 가늘고 필름형 유착, 2 등급 = 맹장과 복강막 사이에서 분리되는 2개 이상의 유착, 3 등급 = 다수의 넓은 내장의 유착으로 압력을 상당히 걸어야 뗄 수 있는 유착, 4 등급 = 매우 두껍고 혈관이 형성된 유착으로 분류하였다.

도 17은 유착방지제를 적용하지 않은 대조군의 유착방지능 평가 결과이고, 도 18은 실시예 1에 따른 파우더형 유착방지제의 유착방지능 평가 결과이고, 도 19는 실시예 2에 따른 파우더형 유착방지제의 유착방지능 평가 결과이다.

도 17을 참조하면, 대조군은 3등급 2두, 4등급 3두로 총 100%의 유착을 보였다. 도 18을 참조하면, 실험군 중 x-HA 파우더를 적용하였을 때, 2등급 1두, 4등급 2두로 평가하였고, 평균 2등급, 총 60%의 유착이 되었다. 도 19를 참조하면, 가교된 x-HA-PVP (5:5) 파우더를 적용하였을 때, 0등급 5두로 평가하였고, 총 0%의 유착이 되었다. 심한 유착 등급을 보이는 대조군과 달리 전반적으로 x-HA와 x-HA-PVP (5:5) 파우더는 낮은 유착점수를 보여주었다. 이를 통해 유착방지제로서 x-HA 및 x-HA-PVP (5:5) 파우더가 우수한 유착방지 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

도 20은 실시예 2에 따른 파우더형 유착방지제가 조직(tissue)에 부착된 이미지로, (a)는 간(liver) 조직, (b)는 맹장(cecum) 조직, (c)는 복부(abdomial) 조직이다. 도 20을 참조하면, HA에 PVP를 도입함으로써 조직이나 장기에 파우더가 잘 부착됨을 알 수 있었다. 실험군 중에서도 점착성을 향상시키는 PVP의 유무가 유착의 정도와 발생에 영향이 있음을 알 수 있었다.

본 발명은 생체 유래 고분자로서 HA을 주재료로 사용하였고, 낮은 기계적인 성질로 인해 glyoxal로 가교반응을 시켰다. 하지만, 이를 단독으로 사용 시 낮은 점착성으로 원하는 자리에 위치하지 못하여 제 기능을 발휘하지 못할 수 있다. 점착성을 향상시키기 위하여 PVP를 도입하였다. In vitro HAase 효소 분해 실험을 통해 x-HA-PVP(5:5) 파우더는 PVP를 도입하지 않은 파우더 보다 24 h 먼저 분해된다. 하지만, in vivo SD rat 실험을 통해 알 수 있듯이, x-HA 파우더를 넣은 SD rat은 유착을 60% 발생시키는 반면, x-HA-PVP(5:5) 파우더를 적용한 모든 SD rat은 유착이 발생되지 않음을 알 수 있었다. PVP를 도입함으로서, 수술 후 유착이 발생되는 기간 동안 위치한 자리에서 움직이지 않고, 4주가 지난 후 개복하였을 때, 부산물 없이 완전히 분해되는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 9-2: 조직 염색을 통한 조직유착 관찰

SD rat의 염증반응과 육아조직형성과 같은 조직유착 미세구조를 평가하기 위해 x-HA와 x-HA-PVP(5:5) 파우더를 도입한 후 4주가 지난 시점의 상처낸 복강막과 맞닿은 맹장부위를 채취하여 hematoxylin-eosin (H&E)과 masson's trichrome staining을 하였다.

먼저, H&E staining은 hematoxylin과 eosin이라는 두 가지의 염료로 염색하는 기법이다. H&E staining의 원리는 조직과 염료사이의 화학적인 상호작용이며, 염기성 염료인 hematoxylin이 산화제인 mercuric oxide에 의해 산화되어 hematein을 형성한다. Hematain은 매염제인 alum과 결합하여 가염상태인 alum-hematein lake를 형성한다. 이러한 hematein lake는 양이온을 띄며 음전하를 띄는 DNA의 인산기와 결합하여 보라색을 띈다. 반대로 산성 염료인 eosin은 음이온을 띄며, 양이온을 띄는 세포질이나 세포외기질, 콜라겐과 이온결합을 하여 분홍색으로 염색된다.

Masson's trichrome staining은 염료 분자의 크기와 조직 구조 내의 세공의 차이와 염료 투과성의 차이로 보는 방법이다. 3가지 염료로 아교섬유, 섬유소, 근육 및 적혈구를 선택적으로 염색하는 방법이다. 조직의 투과성에 따라 투과성이 낮은 조직은 작은 염료분자에 의해 착색되고 큰 염료분자는 투과성이 높은 조직에 침투된다. 염료분자의 크기에 따른 염료투과성의 원리에 따라 아교섬유는 가장 큰 염료분자인 anilin blue에 의해 청색으로 염색되고, 중간 크기의 염료분자인 acid fuchsin과 가장 작은 크기의 염료분자인 biebrich scarlet를 혼합한 염색용액으로 근섬유와 세포질을 적색으로 염색한다. 또한, 내산성이 있는 weigret's hematoxylin은 세포핵을 흑갈색으로 염색한다.

도 21의 (a) 및 (b)는 각각 유착방지제를 적용하지 않은 대조군의 H&E 염색 및 masson's trichrome 염색 결과이고, (c) 및 (d)는 각각 실시예 1에 따른 파우더형 유착방지제(x-HA)의 H&E 염색 및 masson's trichrome 염색 결과이다.

도 22는 실시예 2에 따른 파우더형 유착방지제 (x-HA-PVP (5:5))의 조직염색을 통한 유착방지능 확인 결과로, (a) 및 (b)는 각각 치유된 복강막의 H&E 염색 및 masson's trichrome 염색 결과이고, (c) 및 (d)는 치유된 맹장의 H&E 염색 및 masson's trichrome 염색 결과이다.

먼저 H&E 염색 결과인 도 21의 (a) 및 (c), 도 22의 (a) 및 (c)를 참조하면, 복강막과 맹장에 인위적인 상처를 낸 후, 아무런 조치를 취하지 않은 대조군과 가교된 x-HA 파우더를 적용한 실험군은 분홍빛의 복강막과 보랏빛의 맹장의 근육층 사이에 복잡한 섬유층으로 연결되어 연한 분홍빛으로 새로운 조직이 염색되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 가교된 x-HA-PVP (5:5) 파우더를 적용한 실험군의 경우 복강막과 맹장의 장막 사이에 새로운 조직이 형성되지 않음을 확인할 수 있었다. 각각 푸른빛과 분홍빛으로 새로운 중피세포층을 확인할 수 있었고, 유착 없이 완전히 회복됨을 알 수 있었다.

masson's trichrome 염색 결과인 도 21의 (b) 및 (d), 도 22의 (b) 및 (d)를 참조하면, 대조군과 x-HA 파우더를 적용한 실험군은 복강막과 맹장이 복잡한 섬유층으로 연결되어 있음을 확인할 수 있었다. 반면, x-HA-PVP (5:5) 파우더를 적용한 실험군의 유착이 형성되지 않음을 알 수 있었고, 복강막과 맹장은 각각 청색으로 콜라겐 섬유가 염색된 것으로 보아 중피층이 형성되었음을 알 수 있었다.

이를 통해 대조군과 x-HA 파우더를 적용한 실험군은 새롭게 생긴 두터운 세포층이 생겨 유착이 형성됨을 확인할 수 있었다. 반면, 실험군인 x-HA-PVP (5:5) 파우더를 적용하면 표면에 세포가 접착과 성장이 어려워 조직유착 방지 효능이 있음을 알 수 있었다. 또한, 적용한 위치에서 벗어나 유착이 발생하는 x-HA 파우더의 단점을 보완한 x-HA-PVP (5:5) 파우더는 유착이 발생하는 기간 동안 적용한 위치에서 제 기능을 나타냄을 알 수 있었다. 2가지의 조직염색을 통해 제조한 x-HA-PVP (5:5) 파우더는 유착이 완전히 일어나지 않고, 손상된 복강막과 맹장이 완벽히 회복됨을 확인할 수 있고, 유착방지능이 우수함을 조직학적으로 입증하였다.

이상, 도면을 참조하여 바람직한 실시예와 함께 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였으나, 이러한 도면과 실시예로 본 발명의 기술적 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 다양한 변형예 또는 균등한 범위의 실시예가 존재할 수 있다. 그러므로 본 발명에 따른 기술적 사상의 권리범위는 청구범위에 의해 해석되어야 하고, 이와 동등하거나 균등한 범위 내의 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

생체적합성 고분자; 점착제; 및 가교제;를 포함하고,
상기 생체적합성 고분자는 히알루론산 나트륨을 포함하고,
상기 점착제는 폴리비닐피롤리돈(poly(vinyl pyrrolidone), PVP)를 포함하고,
상기 가교제는 글리옥살(glyoxal)이고,
상기 생체적합성 고분자와 점착제의 중량비는 5:5이고,
상기 생체적합성 고분자 및 점착제의 농도는 3 wt%이고,
상기 생체적합성 고분자는 상기 가교제에 의해 가교결합된 것인 파우더형 유착방지제.
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(a) 생체적합성 고분자 및 점착제를 포함하는 용액을 제조하는 단계; 및
(b) 상기 용액에 가교제를 투입하고 동결건조한 후, 분쇄·세척과정을 통해 파우더형 유착방지제를 제조하는 단계;를 포함하고,
상기 생체적합성 고분자는 히알루론산 나트륨을 포함하고,
상기 점착제는 폴리비닐피롤리돈(poly(vinyl pyrrolidone), PVP)를 포함하고,
상기 가교제는 글리옥살(glyoxal)이고,
상기 생체적합성 고분자와 점착제의 중량비는 5:5이고,
상기 생체적합성 고분자 및 점착제의 농도는 3 wt%인 것 을 특징으로 하는 파우더형 유착방지제의 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 단계 (b)의 가교제 투입 전에, 상기 용액에 촉매를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 파우더형 유착방지제의 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 촉매는 산 촉매인 것을 특징으로 하는 파우더형 유착방지제의 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 촉매는 염산(HCl), 질산(HNO₃), 황산(H₂SO₄), 인산(H₃PO₄) 및 불산(HF)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 파우더형 유착방지제의 제조방법.
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