JP2002536466A - 多重に架橋したヒアルロン酸誘導体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 生物安定性の高いヒアルロン酸誘導体を調製する。 【解決手段】 本発明は架橋したヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体、特に多重に、例えば二重に架橋したヒアルロン酸誘導体の製造方法に関する。本発明は新規な架橋したＨＡ誘導体、それを含む生産物を提供する。本発明はまた医学、薬学及び化粧品への適用におけるそれらの使用をも提供する。本発明で得られたヒアルロン酸誘導体は水に不溶性であり、水中でも安定である。またヒアルロニダーゼなどの酵素に対する抵抗性が高く、また遊離基による分解に対しても抵抗性がたかい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明はヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体、とりわけ多重に、例えば二重に架橋し
たヒアルロン酸誘導体の製造方法に関し、そしてこのようにして得られる新規な
架橋した誘導体、それらを含む生産物、及び化粧品、医薬品及び調合薬への適用
におけるそれらの使用に関する。

【０００２】 ＨＡはグリコサミノグリカンとして知られるポリマーの一クラスの構成員であ
る。ＨＡは長い直鎖状多糖類であり、通常分子式（Ｃ₁₄Ｈ₂₀ＮＮａＯ₁₁）_n を有
するナトリウム塩として存在する。ここで、ｎはその起源、単離方法及び測定法
により異なる。しかしながら、１４×１０⁶ までの分子量が報告されている。

【０００３】 ＨＡ及びその塩はヒトの臍帯、雄鶏の鶏冠、及び脊椎生物のほとんど全ての結
合組織などの多くの起源から単離することができる。ＨＡはケンドールら（１９
３７）Biochem. Biophys. Acta, 279, 401-405により示されたように、ストレプ
トコッカスなどの細菌の莢膜成分でもある。従って、それは発酵法により得るこ
ともできる。例えば、本出願人の米国特許第５，４１１，８７４号はストレプト
コッカス・イクイの連続発酵によりヒアルロン酸を製造する方法を記述する。

【０００４】 ＨＡは、免疫原性がなく、従って医薬において大きな可能性がある。その粘弾
性により、高分子量（１００万以上）のＨＡは創傷治療、眼病手術及び整形外科
手術といった種々の臨床分野において特に有用であることがわかってきた。また
ＨＡは化粧用への適用といった医薬以外の種々の分野においても有用である可能
性がある。

【０００５】 しかしながら、これらの適用の一部におけるＨＡの使用は、ヒトへの投与後に
ＨＡがヒアルロニダーゼなどの酵素及び遊離基により容易に分解されるという事
実により制約される。さらに、ＨＡは室温で水に可溶性であり、このことがＨＡ
を一定の適用に適さなくすることもある。従って、ＨＡのより安定な形を製造す
るための種々の試み、特にＨＡ分子を架橋することによる安定化の試みがなされ
てきた。

【０００６】 こうして、米国特許第4,582,865号（バイオマトリックス・インク）には、架
橋剤としてジビニルスルホンを用いて、単独でか又は他の親水性ポリマーと混合
してＨＡを架橋することにより形成されるヒアルロン酸の架橋ゲルの製造が記載
されている。この場合、架橋はＨＡのヒドロキシル基を介して起こるようである
。

【０００７】 米国特許第5,550,187号（コラーゲン・コーポレーション）には、好ましくは
コラーゲンであるが、ヒアルロン酸を含む他のポリマーから選択してもよい生物
適合性ポリマーを、合成親水性ポリマーなどの滅菌乾燥架橋剤と混合する工程を
含む、架橋した生物材料組成物を製造する方法が記載されている。

【０００８】 米国特許第5,578,661号（ネペラ・インク）には、三つの主成分から形成され
る外傷用医薬材料として使用するためのゲル形成システムであって、第一は水溶
性ポリマーであり、第二は酸含有ポリマーであり、そして第三はヒアルロン酸な
どの多糖又はアミノ含有ポリマーであるシステムが記載されている。この場合、
架橋はイオン結合を介しているようである。

【０００９】 米国特許第5,644,049号（イタリアン・ミニストリ・フォア・ユニバーシティ
ズ・アンド・サイエンティフィック・アンド・テクノロジー・リサーチ）には、
ポリマー成分の一つがヒアルロン酸などの酸性多糖であり、第二ポリマー成分が
合成化学ポリマーであればよい内部浸透ポリマーネットワーク（ＩＰＮ）を含む
生物材料が記載されている。これらの二つの成分は架橋してもよい（が、必要で
はない）。

【００１０】 トミハタ及びイカダは架橋剤として水溶性カルボジイミドを用いるＨＡの架橋
を報告した。架橋はエステル基を介して行われると仮定された。また架橋反応は
、Ｌ−リジンメチルエステルの存在下でも行われ、これはリジンエステルへのア
ミド結合を介してさらなる架橋を行わせるようであった（J. Biomed. Mater. Re
s., 37, 243-251, 1997）。

【００１１】 米国特許第5,800,541号には、多段階反応を用いて調製されるコラーゲン合成
ポリマーマトリックスが記載されている。第一工程は、コラーゲンと合成親水性
ポリマーとを反応させる工程を含む。生ずるマトリックスを次に第二反応工程で
修飾する。この第二反応工程は、該マトリックスを合成ポリマーと架橋又は結合
させる工程、生物活性分子又はグリコサミノグリカンを該マトリックスに結合さ
せる工程、通常の化学的架橋剤を用いて該マトリックスを架橋する工程又は化学
反応により該マトリックス中のコラーゲンを修飾する工程を含みうる。この方法
では、初めのコラーゲン合成ポリマーマトリックスは一つのタイプの結合のみに
より架橋されているようであり、該方法のさらなる工程は異なるタイプの結合を
形成しうるさらなる化学物質を導入するのに役立つ。しかしながら、生産物を形
成する二つの物質のいずれも二つ以上のタイプの結合により互いに連結されるこ
とはないようである。

【００１２】 国際特許出願第WO97/04012号（アガーラップ）には、多糖（とりわけ、ヒアル
ロン酸であってもよい）ゲル組成物であって、多糖の水溶液を形成し、多機能架
橋剤の存在下に架橋を開始し、ゲル化が起こる前に架橋反応が停止するのを立体
的に阻止し（例えば、溶液を希釈することにより）、次に立体的に阻止されない
条件を再度導入して（例えば、溶液を蒸発させることにより）架橋を続行するこ
とにより粘弾性ゲルを調製することにより調製される組成物が記載されている。
この出願には、異なるタイプの結合が二つの架橋段階で形成されるという示唆は
ない。

【００１３】 前記文献のいずれにおいても、ＨＡ分子が二つの異なるタイプの架橋結合によ
り相互に連結される生産物は記載されていない。

【００１４】 本発明者らは、ヒアルロン酸が二つの異なるタイプの架橋結合により架橋して
「二重架橋」を形成することを見いだした。異なるタイプの結合の形成は、異な
る官能基を介して架橋を行うことにより達成される。従って、このようにして形
成される結合は官能基結合と記述しうる。こうして、例えば一つのタイプの結合
はヒドロキシル基を介する架橋により形成され、異なる官能基結合は例えばカル
ボキシル基を介する架橋により形成されるであろう。このような多重架橋は架橋
の程度を高め、ＨＡの生物安定性を改良するに至ることがわかった。

【００１５】 従って第一の側面では、本発明はヒアルロン酸の多重に架橋した誘導体の製造
方法であって、二つ以上の異なる官能基を介してＨＡを架橋する工程を含む方法
を提供する。

【００１６】 各タイプの官能基の架橋は、以下に一層詳細に記載するように、ＨＡを一つ以
上の架橋剤と、同時に又は逐次的に接触させることにより行われるであろう。

【００１７】 本明細書中、「多重に架橋したＨＡ」とは、ＨＡ分子が二つ以上の異なるタイ
プの官能基結合により別のＨＡ分子に架橋しているヒアルロン酸誘導体を指す。
同様に、「二重に架橋したＨＡ」とは、ＨＡ分子が二つの異なるタイプの官能基
結合により別のＨＡ分子に架橋しているヒアルロン酸誘導体を指し、「単一架橋
したＨＡ」とはＨＡ分子が一タイプの官能基結合のみにより別のＨＡ分子に架橋
したヒアルロン酸誘導体を指す。

【００１８】 ＨＡ分子の架橋に主として関与する官能基は、ヒドロキシル基及びカルボキシ
ル基である。ヒドロキシル基はエーテル連結を介して、及びカルボキシル基はエ
ステル連結を介して架橋しうる。望ましい場合は、架橋の前にＨＡを化学的に修
飾し、他の化学的反応基を形成させてもよい。こうして、例えばＨＡを酸又は塩
基で処理して少なくとも部分的脱アセチル化を行い、遊離アミノ基が存在するよ
うにしてもよい。前記アミノ基は、アミド（−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）、イミノ（−
Ｎ＝ＣＨ−）又はアミン結合（−ＮＨ−ＣＨ−）を介して架橋しうる。イミノ結
合はアミン結合の前駆体であり、イミノ連結は還元剤の存在下にアミン連結に変
換できる。

【００１９】 本発明の方法に用いられうる架橋剤としては、当該技術分野で良く知られてい
るものが挙げられ、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ジビニルス
ルホン、ポリアンハイドライド、ポリアルデヒド、多価アルコール、カルボジイ
ミド、エピクロロヒドリン、エチレングリコール ジグリシジルエーテル、ブタ
ンジオール ジグリシジルエーテル、ポリグリセロール ポリグリシジルエーテ
ル、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール ジグリシジルエーテ
ル、又は１，２，３，４−ジエポキシブタン若しくは１，２，７，８−ジエポキ
シオクタン等のビス−若しくはポリ−エポキシ架橋剤が挙げられる。

【００２０】 エーテル連結を形成するための架橋剤は、ホルムアルデヒド、グルタルアルデ
ヒド、ジビニルスルホン並びにアルカリ条件下でのビスエポキシド及びポリエポ
キシドから選択することが好ましい。該架橋剤は、疎水性炭化水素部分、例えば
１，２，３，４−ジエポキシブタンを含むことが好ましく、又は１，２，７，８
−ジエポキシオクタンを含むことが最も好ましい。

【００２１】 エステル連結を形成するための架橋剤は、多価アルコール、カルボジイミド、
ポリアンハイドライド、カルボン酸塩化物並びに酸性条件下でのビスエポキシド
及びポリエポキシドから選択することが好ましい。該架橋剤は、疎水性炭化水素
部分、例えば１，２，３，４−ジエポキシブタンを含むことが好ましく、又は１
，２，７，８−ジエポキシオクタンを含むことが最も好ましい。

【００２２】 アミド連結は、アミン、カルボン酸無水物及びカルボン酸塩化物（脱アセチル
化ＨＡを伴う）、並びにジイソシアン酸塩の存在下でのカルボジイミドから選択
される架橋剤を用いて形成することが好ましい。

【００２３】 アミン連結は、脱アシル化ＨＡのアミノ基の存在下、還元剤を用いるエポキシ
ド又はグルタルアルデヒドから選択される架橋剤を用いて形成することが好まし
い。

【００２４】 イミノ連結（シッフ塩基結合）は、脱アシル化ＨＡのアミノ基の存在下にグル
タルアルデヒドを用いて形成されうる。

【００２５】 スルホン連結は、塩化スルホニルを用いて形成することが好ましい。

【００２６】 本発明の一実施態様では、異なる官能基結合が多段階操作において逐次的に形
成されてもよい。これは各段階において異なる架橋剤を用いるか又は各段階で同
じ架橋剤を用い、且つ要求される特定の架橋反応を制御するように反応条件を調
整することにより達成されうる。

【００２７】 このように、本発明の段階的方法における多重、例えば二重の架橋を達成する
には、第一架橋反応を、例えば以下に述べる方法のいずれかを用いて行う。これ
が完了すれば、又は必要な限度まで進行すれば、さらなる架橋剤を反応混合物に
加えて第二の架橋を行う。さらなる架橋剤は第一と同じでもよく、又は異なって
いてもよい。異なる架橋剤を採用する場合は、一般に反応条件を変更することな
く該架橋剤が異なるタイプの官能基結合を形成するように該異なる架橋剤が選択
される。しかしながら、同じ架橋剤を採用して両方の架橋を形成する場合は、異
なるタイプの結合を形成するように、反応条件をそれに応じて調整するべきであ
る。当該技術分野の熟練者には、適切な架橋剤及び所望の結合を形成させるため
の適切な反応条件を容易に選択できるであろう。

【００２８】 疑問を避けるため、仮に同じ架橋剤を各工程で同じ反応条件下で用いれば、一
つのタイプの連結のみが生じ、すなわちたとえ二以上の段階で製造したとしても
一重に架橋された生産物を得ることになることを強調しておく。

【００２９】 本発明に従って二つ以上の官能基結合を逐次的に、すなわち多重段階反応で形
成する場合、反応の第一段階で形成された架橋は第二又は後の架橋を形成するの
に必要な反応条件に耐える程の充分な強さを持つべきだと解される。こうして、
二つ（又はそれより多くの）の結合のうちのより強い方がまず形成されるべきで
ある。このことは熟練者には容易に理解され、必要であれば機械的実験により決
定されうる。

【００３０】 こうして、架橋がヒドロキシル基及びカルボキシル基を介して形成される場合
は、第一段階の架橋はヒドロキシル基を介して行われてエーテル連結を与え、第
二段階架橋はカルボキシル基を介して行われてエステル連結を与えるべきである
ことが認識されるであろう。

【００３１】 エーテル結合は、アルカリ条件下で、好ましくはｐＨ１０以上でエポキシド架
橋剤を用いて形成されうる、又はＨＡが遊離のアミノ基を含まないならば、酸性
条件下で、例えばｐＨ４以下で架橋剤としてグルタルアルデヒドを用いて形成さ
れうる。エステル結合は、酸性条件下、例えばｐＨ４以下でエポキシド架橋剤を
用いて形成するとよい。

【００３２】 このようにして、例えば、エーテル連結を形成するための第一の架橋反応は１
，２，７，８−ジエポキシオクタン等のエポキシドを用いてアルカリ条件下で、
好ましくはｐＨ１０以上で、例えばｐＨ１０〜ｐＨ１２の範囲で行うとよい。エ
ステル連結を形成するための第二の架橋反応は、同じ架橋剤を採用し且つｐＨ４
以下、例えばｐＨ４〜ｐＨ２の範囲に反応培地のｐＨを調整することによりその
後に行いうる。代替的には、各工程で異なる架橋剤を用いてもよく、この場合に
は反応条件を調整する必要がないであろう。こうして、例えば第一の架橋反応は
酸性条件下グルタルアルデヒドを用いて行ってエーテル連結を形成し、その後、
同じく酸性条件下でエポキシド架橋剤を用いた反応によりエステル連結を形成し
てもよい。

【００３３】 本方法の各段階で用いられるＨＡに対する架橋剤の割合は、重量比で一般に１
：１０〜１０：１の範囲となる。

【００３４】 個々の架橋反応は当技術分野で一般に知られた方法に従って行われる。

【００３５】 こうして、出発物質として用いられるＨＡはフィルム又は溶液の形状でありう
る。

【００３６】 ＨＡフィルムが用いられる場合、これは架橋剤と共に適切な溶媒に懸濁されう
る。この反応媒体は酸性又はアルカリ性水溶液と混合した、アセトン、クロロホ
ルム、又はエタノール若しくはイソプロパノールなどのアルコールといった有機
溶媒を含むことが好ましい。酸性溶液はｐＨ４以下を有することが好ましく、ア
ルカリ性溶液はｐＨ１０以上を有することが好ましい。架橋反応は１５〜３０℃
の範囲、例えば周囲温度で行うことが好ましい。

【００３７】 出発物質としてＨＡフィルムを用いる場合、アルカリ条件下でのエポキシドか
、又は遊離のアミノ基が存在しないならば、酸性条件下でのグルタルアルデヒド
を用いてエーテル架橋をまず形成し、その後、酸性条件下でのエポキシドを用い
てエステル架橋を形成させることが好ましい。ＨＡがデアセチル化され遊離のア
ミノ基が生じたときは、酸性条件下でのグルタルアルデヒドと反応させることに
より、イミノ連結を持つシッフ塩基を形成できる。イミノ結合は還元剤を用いて
アミノ結合に変換できる。

【００３８】 ＨＡは酸性又はアルカリ性水溶液として使用することもでき、これに架橋剤が
添加される。酸性条件下では、出発溶液のｐＨはｐＨ４以下であることが好まし
く、アルカリ性溶液の場合は、ｐＨは１０以上であることが好ましい。ＨＡの濃
度は１〜１０％ｗ／ｗの範囲であることが適当である。この反応は１５〜５０℃
の温度範囲で行われうる。架橋反応の完了の時間は一般に約１時間から数日まで
変動しうる。

【００３９】 ＨＡ溶液が用いられる場合、アルカリ性条件下でのエポキシドを用いてまずエ
ーテル架橋を形成し、その後、酸性条件下でのエポキシド（好ましくは第一工程
と同じエポキシド）を用いてエステル架橋を形成させることが好ましい。

【００４０】 または、ＨＡ溶液を第一の架橋反応に供し、中間生産物を乾燥してフィルムを
形成し、このフィルムを上記のようにさらなる架橋反応に供して二重に架橋した
生産物をフィルムの形状で得ることもできる。この手順に従って、二重に架橋し
たＨＡを得るために、アルカリ性条件下でのエポキシドを用いてまずエーテル架
橋を形成し、その後、酸性条件下でのエポキシド（好ましくは第一工程と同じエ
ポキシド）を用いてエステル架橋を形成することが好ましい。

【００４１】 本発明の別の実施態様では、ＨＡの多重架橋、とりわけ二重架橋は、同じ条件
下で二つの異なる官能基を架橋するのに適切な二つの異なる架橋剤とＨＡを同時
に接触させることにより、単一工程反応で行われうる。こうして、例えば、単一
工程でエーテル基とエステル基の両方を形成するため、グルタルアルデヒドと１
，２，７，８−ジエポキシオクタンの混合物とＨＡを接触させうる。

【００４２】 この方法の各段階で採用されるＨＡに対する架橋剤の割合は、一般に重量比で
１：１０〜１０：１の範囲である。

【００４３】 生産物の正確な性質は、架橋の程度従って生産物の特性を制御するように反応
条件を適当に選択することにより変えることができる。架橋の程度、従って生産
物の性質に影響を与える因子としては、採用する出発物質ＨＡの形態、ＨＡに対
する架橋剤の添加割合、反応時間、温度及びｐＨが挙げられる。生産物はゲル又
はフィルムの形態で得ることができ、透明又は不透明でありうる。水吸収能及び
生物学的安定性は、生産物の正確な性質により変わる。

【００４４】 本発明の生産物は、ＨＡ出発物質を溶液、フィルム又はシートの形態で用い、
且つ撹拌せずに操作を行うことにより、フィルム又はシートの形態で得ることが
できる。ＨＡをフィルム又はシートの形態で用いる場合、ＰＢＳ緩衝液などの水
溶液中に置くと、水を吸って、膨張し、ゲルを形成すると解される。望ましい場
合は、前記のように中間体フィルムを第一架橋工程の後に任意選択的に形成して
もよい。この生産物は、生ずる架橋の程度により透明又は不透明となりうる。高
度に架橋したＨＡ生産物は、一般に不透明であり、白く着色していることさえあ
る。

【００４５】 ゲルの形態の本発明の生産物は、例えば前記のように調製しうるフィルムの水
和により得られうる。必要であれば、このフィルムを小片に小分けし、水吸収を
助けてもよい。

【００４６】 不透明なゲルの形態で本発明の生産物を得るには、ＨＡ出発物質を溶液、フィ
ルム又はシートの形態で用い、そして全操作を撹拌しながら、且ついかなる段階
においてもフィルムを形成させずに行えばよい。

【００４７】 どの架橋方法を用いても、反応の完了は当分野でよく知られた方法により機械
的に制御することができ、例えば反応混合物中和することにより及び溶媒沈殿を
行うことにより反応を終結させ、所望の程度にまで架橋した生産物を得ることが
できる。

【００４８】 最終生産物は、通常の手順により、反応培地から単離しうる。

【００４９】 好ましい実施態様では、本発明は、二重に架橋したＨＡの製造方法であって、
ＨＡ分子間で二つの異なる結合が形成するのに適切な条件の下で、ＨＡを一以上
の架橋剤と接触させる工程を含む方法を提供する。この架橋反応は逐次的に行わ
れることが好ましい。こうして、本発明の二段階方法は、 （ａ）ＨＡを、第一官能基を介して架橋する工程、及び続いて （ｂ）（ａ）の生産物を、第二官能基を介してさらに架橋する工程であって、該
第一及び第二の官能基が異なる化学的実体を表すものである工程、 を含む。

【００５０】 三つ以上の異なる架橋が要求される場合は、これは上記のような逐次的若しく
は同時の架橋反応の適当な組合せにより調製されうることが理解できよう。

【００５１】 本発明に従って調製された架橋したＨＡは、少なくとも二つの異なるタイプの
架橋結合、例えばエーテル結合及びエステル結合の両者を含む。

【００５２】 本発明に従って調製された多重（例えば、二重）に架橋したＨＡ誘導体はそれ
自体新規であると信ずる。こうして、さらなる側面では、本発明は本明細書中の
前記方法により得られうる多重に架橋したＨＡ（すなわち、二以上の異なる官能
基結合を介して架橋したＨＡ）を提供する。好ましくは、本発明は本明細書に前
記した方法によって得られうる二重に架橋したＨＡを提供する。

【００５３】 さらなる側面では、本発明はそれ自体（すなわち、ＨＡのさらなる分子）に架
橋したＨＡであって、ＨＡが少なくとも二つの異なるタイプの結合により架橋し
ているものである架橋したＨＡを提供する。このＨＡは二重に架橋したＨＡであ
ることが好ましい。

【００５４】 本発明の二重に架橋したＨＡは、１０〜５０％、例えば１５〜３０、好ましく
は２０〜２５％の範囲の架橋の程度（１００％は、Ｃ６位の全てのＯＨ基及びＣ
５位の全てのＣＯＯＨ基の架橋を表す）を有しうる。架橋の程度は、元素分析又
は固体状態ＮＭＲ分析により測定されうる。

【００５５】 生産物における異なる官能基結合の割合は、存在する官能基結合のタイプ及び
それらを形成するために使用された反応条件により変わる。エーテル結合及びエ
ステル結合を含む二重架橋生産物については、これらの結合の割合はエーテル結
合：エステル結合として５０：５０から９５：５、例えば６０：４０から８０：
２０のまで変動しうる。

【００５６】 一般に、本発明の生産物は、より高度の架橋、一重に架橋したＨＡよりいわば
より稠密な架橋ネットワークを有する。より高度の架橋は、架橋ＨＡの水吸収能
を減少させ、その結果水溶液中における安定性を増大させることが分かった。さ
らに二重に架橋したＨＡは、ヒアルロニダーゼによる分解に対し、かつ遊離基に
よる分解に対し、より大きな安定性を示し、より高い生物安定性を示すことが分
かった。

【００５７】 本発明の不透明生産物は、透明な生産物より、一般により高度の架橋を有し、
従ってより低い水吸収能及びより高い安定性を有する。このような生産物は長期
間の移植に適する。

【００５８】 本発明の透明な生産物、例えば透明なフィルムは、不透明な生産物より高い水
吸収能を有し、そしてこのような生産物は皮膚移植、創傷治癒（滲出物の吸収）
及び再吸収可能な短期移植に特に適する。

【００５９】 前記の多段階法は、低い水吸収能を持つ高度に架橋した生産物を望む場合に好
ましい。同時架橋は、一般に水不溶性生産物を生ずるが、同様の条件下での多段
階（例えば、二段階）法を用いて調製された生産物より高い水吸収能を有する生
産物を生ずる。

【００６０】 さらに、第二架橋工程のため第一架橋ＨＡを用いることにより、同様の架橋条
件（すなわち、中間体フィルム形成がない）下でＨＡ溶液から調製された二重架
橋ＨＡよりより低い水吸収能を有する生産物（フィルム状でありうるし、又はゲ
ルに変換されうる）が提供されることが見出された。実際、得られた生産物の水
吸収能は、出発物質がフィルム及びゲルのそれぞれについて４００％から１００
０％まで変りうることが見出された。

【００６１】 本発明の架橋したＨＡ誘導体は、種々の薬学用、医学用（外科を含む）及び化
粧用の適用に用いられうる。

【００６２】 こうして、これらは例えば創傷治癒を促進する際に、例えば外傷用医薬材料と
して有用であろう。

【００６３】 またこれらは、癒着を防ぐため、例えば手術後の臓器間の組織成長を防ぐため
にも有用であろう。

【００６４】 また本発明の架橋したＨＡ誘導体は、例えば硝子液の交換のため、目への薬物
送達のための角膜保護として又はレンズとしてなどの眼科分野においても適用を
見出すであろう。

【００６５】 また本発明の架橋ＨＡ誘導体は、外科において、例えば軟骨又は骨の修復又は
交換などの硬組織拡大のため又は軟組織拡大のための固体移植片として、乳房の
移植物として、又は乳房移植、カテーテル、カニューレ、骨プロテーゼ、軟骨取
り替え、ミニポンプ及び他の薬物送達装置、人工臓器及び血管、組織再強化のた
めのメッシュ等、体内での長期使用を目的とする移植物の被覆材料としても、有
用であろう。該誘導体はまた、関節炎の治療の際の関節潤滑剤として用いること
もできる。

【００６６】 本発明の誘導体のさらなる使用は、前記適用のいずれかを含む治療上活性な薬
物の送達にある。治療上活性な薬物は、化学療法剤又は生物学的活性因子（例え
ば、サイトカイン）であってもよく、抗炎症剤、抗生物質、鎮痛剤、麻酔剤、創
傷治癒促進剤、細胞成長抑止剤、免疫刺激剤、免疫抑制剤及び抗ウイルス剤が挙
げられる。

【００６７】 治療上活性な因子は、当該技術分野でよく知られる方法により架橋したＨＡ誘
導体に結合しうる。

【００６８】 架橋したＨＡ誘導体は、膜、ビーズ、スポンジ、チューブ、シート及び形成さ
れた移植片といった種々の形態で用いてもよい。

【００６９】 ここで以下の限定的でない実施例により、本発明をさらに説明する。

【００７０】 以下の手順を、該生産物の安定性を測定するために使用した。

【００７１】方法 水吸収能評価 各乾燥架橋試料２０ｍｇ（Ｗｄ）をＰＢＳ処方緩衝溶液に２４時間浸し、完全
に膨潤したゲルを得た。湿ったゲルを濾過し、表面の残りの水をティシューペー
パーを用いて除去した。湿ったゲルの重さを量り、Ｗｓで示す。こうして水吸収
能（ＷＡＣ）（％）は、以下の式、すなわち ＷＡＣ（％）＝（Ｗｓ−Ｗｄ）／Ｗｄ×１００ により計算される。

【００７２】ヒアルロニダーゼ消化に対する抵抗性 架橋したＨＡの２０ｍｇをヒアルロニダーゼ１０００Ｕを含むＰＢＳ緩衝溶液
６ｍｌ（ｐＨ＝７．２）に懸濁し、３７℃で２４時間インキュベートした。その
後、このフィルムを除去し、ＰＢＳ緩衝液を用いてリンスし、リンスした溶液全
てを集めて全体で１０ｍｌの溶液を得た。この溶液を３０分間煮沸し、ヒアルロ
ニダーゼを沈殿させた。次に、この溶液を４０００ｒｐｍ／１０分間遠心分離し
た。上清溶液を容量フラスコの中で、ＰＢＳを用いて２５ｍｌにした。ＨＡの濃
度をカルバゾール検定を用いて測定した。

【００７３】 ヒアルロニダーゼ消化によるＨＡ重量損失は、以下の式、すなわち ＨＡ重量損失（％）＝［ＨＡ］×２５／［ＨＡ］ｏ×１００ （式中、［ＨＡ］はＨＡの濃度であり、［ＨＡ］ｏはもとのＨＡの含量（ｍｇ）
である） を用いて計算できる。

【００７４】遊離基に対する抵抗性 ＰＢＳ溶液５ｍｌ中の０．１のアスコルビン酸２５μｌ及び０．１ＭのＨ₂Ｏ₂ ０．２５μｌから形成されるＦｅｒｔｏｎ試薬を用いて遊離基を作成した。乾燥
試料２０ｍｇを消化のためにこの溶液に加えた。消化時間は３７℃で２４時間で
あった。この後、このフィルムを除去し、ＰＢＳ緩衝液を用いてリンスし、容量
フラスコの中にリンスした溶液全てを集めて、ＰＢＳを用いて全体を２５ｍｌの
溶液とした。ＨＡの濃度をカルバゾール検定を用いて測定した。ＨＡの重量損失
は、ヒアルロニダーゼ消化と同じ式を用いて計算できる。

【００７５】 実施例１ ＨＡフィルムから出発する二重に架橋したＨＡフィルムの形成 ５ｍｌのＨＡ（１％）を容器に注ぎ室温に４日間置いてＨＡフィルムを得た。
得られたフィルムをＣＨＣｌ₃ 溶媒／酸性若しくはアルカリ性溶液／１，２，７
，８−ジエポキシオクタン若しくはグルタルアルデヒド架橋剤の混合液中に懸濁
した。架橋反応を、室温で一定時間（２４時間）行った。さらなる量の架橋剤を
加え、必要な場合はｐＨを調整し、そして混合物を室温にさらに２４時間放置し
て第二架橋反応を行った。詳細な架橋条件を表１に示す。架橋後、試料をＩＰＡ
及びアセトンで３回洗浄し、ＩＰＡ／脱イオン水（６０／４０）に一晩浸し、次
にアセトンで洗浄し、そして一定重量となるまで３７℃のオーブンで乾燥した。

【００７６】

【表１】

【００７７】 ＊添加割合：架橋剤に対するＨＡの重量比 Ｅ：＝１，２，７，８−ジエポキシオクタン、Ｇ：＝グルタルアルデヒド Ｈ＋は、ｐＨ約４をあらわす。 ＯＨ−は、ｐＨ約１０をあらわす。 ＣＨＡ−１、ＣＨＡ−４、ＣＨＡ−７は、それぞれ各架橋工程についてエーテル
結合のみを与える同じ条件を用いて調製した（一重架橋）。

【００７８】 実施例２ ＨＡ溶液からの二重に架橋したＨＡゲルの形成 ０．１ｇのＨＡを０．２５ＮのＮａＯＨ溶液若しくは０．２５ＮのＨＣｌ溶液
に溶解して１０％若しくは２．５％濃度のＨＡ溶液を得た。架橋剤を添加し、そ
の混合物を機械的に攪拌した。第一架橋反応は４０℃で約２時間の間行った。第
二架橋反応は同じ架橋剤のさらなる量を用い、反応条件を調整して行った。詳細
な反応条件は表２に示す。架橋の後、生成したゲルをＩＰＡ、アセトンで洗浄し
、ＩＰＡ／水で一晩抽出し、次いで、ＩＰＡとアセトンでそれぞれ３回洗浄した
。この試料を一定の重量を得るまで３７℃オーブンで乾燥した。その生産物は不
透明なゲルとして得られた。

【００７９】

【表２】

【００８０】 Ｅ：１，２，７，８−ジエポキシオクタン Ｈ＋は、約４のｐＨをあらわす。 ＯＨ−は、約１０のｐＨをあらわす。

【００８１】 実施例３ ＨＡフィルムを介するＨＡ溶液からの二重に架橋したＨＡ（ＣＨＡ）の形成 ０．１ｇのＨＡを０．２５ＮのＮａＯＨ溶液若しくは０．２５ＮのＨＣｌ溶液
に溶解して１０％若しくは２．５％濃度のＨＡ溶液を得た。架橋剤を添加した。
その反応はペトリ皿中でほとんど又は全く攪拌せずに行った。第一架橋反応は室
温で約４８又は約７２時間行った。中間生産物を乾燥して（厚さに依存して）フ
ィルム又はシートを得た。第二架橋反応は実施例１に記述した方法を用いて行っ
た。詳細な反応条件は以下の表３に示す。架橋の後、生産物をＩＰＡとアセトン
で（３回）洗浄し、ＩＰＡ／水で一晩抽出し、次いでアセトンで洗浄した。この
試料を一定の重量になるまで３７℃オーブン中で乾燥して、フィルム又はシート
の形状の生産物が得られた。

【００８２】

【表３】

【００８３】 Ｅ：１，２，７，８−ジエポキシオクタン、Ｅ−１：エピクロロヒドリン Ｈ＋は約４のｐＨをあらわす。 ＯＨ−は約１０のｐＨをあらわす。

【００８４】

【表４】

【００８５】 実施例４ ０．１ｇのＨＡを１ＮのＮａＯＨ溶液２ｍｌ中に一晩溶解して５％ＨＡアルカ
リ性溶液を得た。この溶液に０．２ｍｌの１，２，７，８−ジエポキシオクタン
を添加した。次いで４０℃で３０分間攪拌しながら、０．２ｍｌのクロロホルム
を添加した。このエーテル架橋の形成の後、２．２ｍｌの１ＮのＨＣｌを添加し
てその溶液の，ｐＨを３〜４の間に変えた。さらく、０．２ｍｌの１，２，７，
８−ジエポキシオクタンを添加し、次いで０．２ｍｌのクロロホルムを添加し、
４０℃で３０分間攪拌した。このエステル架橋の後、生成したゲルを２０ｍｌア
セトンで沈殿させ、実施例２で詳述したと同じ手順に従って精製した。

【００８６】 実施例５ ５ｍｌのＨＡ／ＮａＯＨ（１Ｎ）溶液に、０．５ｍｌのエピクロロヒドリンと
０．２ｍｌのクロロホルムを添加し、室温で１０分間混合した。この溶液をペト
リ皿に注ぎ、乾燥させて架橋したＨＡ（ＣＨＡ−１８）のフィルムとした。１Ｎ
のＨＣｌで中和した後、このＣＨＡ−１８試料を２０ｍｌのクロロホルム／０．
１Ｎの酸性水溶液（３／１ｖ／ｖ）に懸濁し、そして０．２ｍｌの１，２，７，
８−ジエポキシオクタンを添加して室温で２４時間反応させた。得られた試料、
ＣＨＡ−１９を実施例１に詳述したと同じ手順で精製した。

【００８７】 実施例６ ２０ｍｌの２．５％ＨＡ／ＮａＯＨ（１．０Ｎ）溶液を種々の容量の１，２，
７，８−ジエポキシオクタンと５分間攪拌しながら混合した。次いでこの混合液
を７ｃｍ寸法のポリスチレン非コラーゲン被覆ペトリ皿に広げ、カバーをした。
室温に２４時間置いた後、そのカバーを取り、架橋ゲルを４８時間乾燥させた。
制御可能な厚さを持ったこの乾燥フィルムをアセトン／ＨＣｌ溶液で中和し、ア
セトン／水、アセトン及びＩＰＡで精製した。次いで、第一架橋したシート様物
質をｐＨ５のアセトン／ＨＣｌ溶液と０．４ｍｌの１，２，７，８−ジエポキシ
オクタン中に入れ、室温でさらに２４時間架橋反応を行った。得られたシートを
アセトン／水、アセトン及びＩＰＡ／水、ＩＰＡで数回精製した。

【００８８】 得られた二重架橋ＨＡシートは水に不溶性であり、１０倍の水を吸い上げて透
明なゲルを形成することが見出された。それは、組織工学にとって重要な特性で
ある、極めて良好な機械的強度をも示す。

【００８９】ＨＡ試料の固体状態¹³Ｃ・ＮＭＲ分析 ヒアルロン酸及び二重に架橋した試料の固体状態¹³Ｃ・ＮＭＲ分析は、アドバ
ンス２００スペクトロメータを用いて５０ＭＨｚで行った。標準的クロス・ポー
ラリゼーション（ＣＰ）パルス順序で１ｍｓの接触時間を用いて得られたスペク
トルを図１〜図３に示す。内部標準、テトラキス（トリメチル）シラン（ＴＫＳ
、化学シフト，３．２ｐｐｍ）を含む試料番号３のスペクトルは５ｍｓの接触時
間を用いても得られた（図４）。ＴＫＳを参照してなされたピーク割当は以下の
とおりである。

【００９０】

【外１】

【００９１】

【表５】

【００９２】 試料２（図２）は、実施例３の方法に従って調製されたが、第二架橋は行って
いない。添加割合は１，２，７，８−ジエポキシオクタンに対するＨＡの量であ
る。形成されたフィルムはＮＭＲ分析用に細かいメッシュに切断された。 試料３（図３及び図４）は実施例２の方法に従ってゲル状に調製された。これ
はＮＭＲ分析用に微細粉末に粉砕された。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、修飾を受けていない純粋なヒアルロン酸の固体状態¹³Ｃ・ＮＭＲ分析
で得られた¹³Ｃ・ＮＭＲスペクトルを示す図である。

【図２】 図２は、試料２（その調製法は表５に示す）の固体状態¹³Ｃ・ＮＭＲ分析で得
られた¹³Ｃ・ＮＭＲスペクトルを示す図である。

【図３】 図３は、試料３（その調製法は表５に示す）の固体状態¹³Ｃ・ＮＭＲ分析で得
られた¹³Ｃ・ＮＭＲスペクトルを示す図である。

【図４】 図４は、試料３について、５ｍｓの接触時間を用いて得られた固体状態¹³Ｃ・
ＮＭＲスペクトルを示す図である。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年１月１８日（２００１．１．１８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１６

【補正方法】変更

【補正の内容】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｌ 15/16 Ａ６１Ｌ 27/00 Ｄ 27/00 Ｐ Ｖ Ｚ 29/00 Ｔ 29/00 31/00 Ｔ 31/00 Ａ６１Ｐ 17/02 Ａ６１Ｐ 17/02 19/02 19/02 25/00 25/00 27/02 27/02 29/00 29/00 31/04 31/04 31/12 31/12 35/00 35/00 37/04 37/04 37/06 37/06 41/00 41/00 Ａ６１Ｌ 15/01 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4C076 AA95 AA97 CC01 CC04 CC07 CC10 CC19 CC26 CC32 CC35 EE37 EE59 FF31 FF36 FF57 4C081 AB02 AB13 AB22 AB31 AB38 AC03 BA16 BB01 BB06 BB08 CD081 DA01 DA02 DA03 DA12 EA11 EA12 4C083 AD331 AD332 DD01 DD02 DD41 EE01 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA20 EA21 EA22 EA25 EA26 MA01 MA04 NA03 NA12 NA13 ZA33 ZA90 ZA96 ZB11 ZB15 4C090 AA02 AA04 AA05 AA09 BA67 BB02 BB05 BB17 BB18 BB22 BB33 BB35 BB36 BB53 BB55 BB63 BB65 BB69 BB72 BB81 BB92 BB94 BB95 BB97 BB98 BD03 BD18 BD36 BD41 CA36 CA38 DA09 DA22 DA23 DA26

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒアルロン酸の多重に架橋した誘導体の製造方法であって、
   二つ以上の異なる官能基を介してＨＡを架橋する工程を含む方法。
2. 【請求項２】 該官能基がヒドロキシル、カルボキシル及びアミノから選ば
   れるものである、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 該架橋が、エーテル、エステル、スルホン、アミン、イミノ
   及びアミドの諸結合から選ばれる二つ以上の異なる結合により行われるものであ
   る、請求項１又は請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 該架橋剤が、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ジビ
   ニルスルホン、ポリアンハイドライド、ポリアルデヒド、多価アルコール、カル
   ボジイミド、エピクロロヒドリン、エチレングリコール ジグリシジルエーテル
   、ブタンジオール ジグリシジルエーテル、ポリグリセロール ポリグリシジル
   エーテル、ポリエチレングリコール ジグリシジルエーテル、ポリプロピレング
   リコール ジグリシジルエーテル、又はビス−若しくはポリ−エポキシ架橋剤か
   ら選ばれるものである、請求項１〜請求項３いずれか１項に記載の方法。
5. 【請求項５】 エーテル結合が、アルカリ性条件下におけるビスエポキシド
   及びポリエポキシドから選ばれる架橋剤を用いて形成されるものである、請求項
   １〜請求項４いずれか１項に記載の方法。
6. 【請求項６】 エステル結合が、酸性条件下におけるビスエポキシド及びポ
   リエポキシドから選ばれる架橋剤を用いて形成されるものである、請求項１〜請
   求項４いずれか１項に記載の方法。
7. 【請求項７】 該架橋剤が１，２，３，４−ジエポキシブタン及び１，２，
   ７，８−ジエポキシオクタンから選ばれるものである、請求項５又は請求項６記
   載の方法。
8. 【請求項８】 エーテル結合が酸性条件下でグルタルアルデヒド架橋剤を用
   いて形成されるものである、請求項１〜請求項４いずれか１項に記載の方法。
9. 【請求項９】 各タイプの官能基の架橋が逐次的に行われるものである請求
   項１〜請求項８いずれか１項に記載の方法。
10. 【請求項１０】 第一の官能基を介してＨＡを架橋する工程及び続いてその
    生産物を第二の官能基を介してさらに架橋する工程を含む請求項９記載の方法で
    あって、該第一及び第二の官能基が異なる化学的実体を表すものである方法。
11. 【請求項１１】 ＨＡがヒドロキシル基を介するエーテル結合の形成により
    まず架橋され、続いてカルボキシル基を介するエステル結合の形成により架橋さ
    れるものである、請求項９又は請求項１０記載の方法。
12. 【請求項１２】 各タイプの官能基の架橋が同時に行われるものである請求
    項１〜請求項８いずれか１項に記載の方法。
13. 【請求項１３】 二重に架橋したＨＡを調製するための請求項１〜請求項１
    ２いずれか１項に記載の方法。
14. 【請求項１４】 請求項１３記載の方法であって、 （ａ）第一の官能基を介してＨＡを架橋する工程、及び （ｂ）続いて第二の官能基を介して（ａ）の生産物をさらに架橋する工程であっ
    て、該第一及び第二の官能基が異なる化学的実体を表すものである工程、 を含む方法。
15. 【請求項１５】 請求項１〜請求項１４いずれか１項に記載の方法によって
    得られうる多重に架橋したＨＡ。
16. 【請求項１６】 ＨＡが少なくとも二つの異なるタイプの結合により架橋さ
    れているものである、それ自体に架橋したＨＡ。
17. 【請求項１７】 請求項１５又は請求項１６記載の架橋したＨＡであって、
    該架橋結合が二つ以上のエーテル、エステル、スルホン、アミン、イミノ及びア
    ミドの諸結合から選ばれるものである架橋したＨＡ。
18. 【請求項１８】 フィルムの形状である請求項１５〜請求項１７いずれか１
    項に記載の多重に架橋したＨＡ。
19. 【請求項１９】 ゲルの形状である請求項１５〜請求項１７いずれか１項に
    記載の多重に架橋したＨＡ。
20. 【請求項２０】 二重に架橋したＨＡである請求項１５〜請求項１９いずれ
    か１項に記載のＨＡ。
21. 【請求項２１】 請求項１５〜請求項２０いずれか１項に記載の多重に架橋
    したＨＡを含む生産物。
22. 【請求項２２】 薬学用、化粧用又は医学用の生産物の調製における請求項
    １５〜請求項２０いずれか１項に記載のＨＡの使用。
23. 【請求項２３】 請求項１５〜請求項２０いずれか１項に記載のＨＡ又は請
    求項２１記載の生産物の内科又は外科における使用。