CZ2016826A3 - Léčivý prostředek s nosičem na bázi hyaluronanu a/nebo jeho derivátů, způsob výroby a použití - Google Patents

Léčivý prostředek s nosičem na bázi hyaluronanu a/nebo jeho derivátů, způsob výroby a použití Download PDF

Info

Publication number
CZ2016826A3
CZ2016826A3 CZ2016-826A CZ2016826A CZ2016826A3 CZ 2016826 A3 CZ2016826 A3 CZ 2016826A3 CZ 2016826 A CZ2016826 A CZ 2016826A CZ 2016826 A3 CZ2016826 A3 CZ 2016826A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
hyaluronic acid
group
carrier
derivatives
dmf
Prior art date
Application number
CZ2016-826A
Other languages
English (en)
Inventor
Sergej Karel
Martin Flegel
Romana Šuláková
Roman Fryčák
Jana Šógorková
Jiří Běťák
Josef Chmelař
Vojtěch Zápotocký
Vladimír Velebný
Original Assignee
Contipro A.S.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Contipro A.S. filed Critical Contipro A.S.
Priority to CZ2016-826A priority Critical patent/CZ2016826A3/cs
Priority to EP17838172.9A priority patent/EP3558385B1/en
Priority to KR1020197016861A priority patent/KR20190099402A/ko
Priority to PCT/CZ2017/050061 priority patent/WO2018113802A1/en
Priority to RU2019122336A priority patent/RU2019122336A/ru
Priority to JP2019534706A priority patent/JP2020502251A/ja
Priority to BR112019011880A priority patent/BR112019011880A2/pt
Priority to US16/472,635 priority patent/US20190328891A1/en
Publication of CZ2016826A3 publication Critical patent/CZ2016826A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6953—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a fibre, a textile, a slab or a sheet
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A61K9/006—Oral mucosa, e.g. mucoadhesive forms, sublingual droplets; Buccal patches or films; Buccal sprays
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Řešení se týká léčivého prostředku s nosičem na bázi hyaluronanu a jeho derivátů, který je charakterizován tím, že obsahuje konjugát kyseliny hyaluronové a/nebo jejího derivátu s léčivou látkou, dle obecného vzorce A-S-N (X), ve kterém A je léčivá látka, S je způsob spojení léčivé látky s nosičem, N je nosič na bázi kysleiny hyaluronové a/nebo jejích derivátů, m je 10 až 1250, n je 100 až 12500. Nový léčivý prostředek je použitelný v medicíně a kosmetice.

Description

Řešení se týká léčivého prostředku s nosičem na bázi hyaluronanu a/nebo jeho derivátů, kdy použitý nosič přímo nese účinnou látku a je v různých formách. Řešení se také týká způsobu výroby a použití uvedeného léčivého přípravku.
Dosavadní stav techniky
Je známo, že kyselina hyaluronová (hyaluronan, HA) je nesulfatovaný glykosaminoglykan, který je složený ze dvou opakujících se jednotek D-glukuronové kyseliny a A-acetyl-D-glukosaminu, spojených β( 1 —>4) a β(Ι—>3) glykosidickými vazbami, viz Obr. 1. Molekulová hmotnost nativní kyseliny hyaluronové se pohybuje v rozsahu 5.104 až 5.106 g.mol' '. Tento značně hydrofilní polysacharid tvoří součást pojivových tkání, kůže, synoviální tekutiny kloubů a hraje významnou roli v řadě biologických procesů, jako je organizace proteoglykanů, hydratace a diferenciace buněk. Vzhledem k tomu, že se jedná o biokompatibilní polymer, který je tělu vlastní, a je zároveň degradovatelný, stává se vhodným substrátem pro tkáňové inženýrství nebo jako nosič biologicky aktivních látek.1
Využití hyaluronanu a jeho derivátů s pozměněnými a vylepšenými vlastnostmi v medicíně je dosti rozsáhlé. Chemická modifikace hyaluronanu se provádí většinou na dvou reakčních centrech: Na karboxylové skupině a na primární hydroxylové skupině. Aminoskupina může být rovněž využita po odštěpení A-acetylové skupiny. Není jasné, který z hydroxylů sacharidové jednotky se účastní reakce, mnoho výsledků ukazuje na preferování primárního hydroxylů (C6) na A-acetylglukosaminové jednotce z důvodu nejvyšší reaktivity této skupiny.
Karboxylovou skupinu lze převést na amid nebo ester. K převedení karboxylové skupiny na amid lze využít aktivačních činidel běžných při chemické přípravě peptidů, jako jsou např. karbodiimidy2'5 a jiná činidla, jako 2-chlor-l-methylpyridinium jodid6, 2-chlordimethoxy-1,3,5-triazin7, karbonyldiimidazol8 atd. Po zvýšení reaktivity karboxylu převedením na reaktivnější intermediát následuje přídavek aminu, který kondenzační reakcí poskytne amid. V případě tvorby esteru lze využít alkylační reakce s alkylhalogenidy9,10, syntéza methylesteru reakcí s diazomethanem11,12, využití epoxidů13'16 aj.
• · · · · · · · « · · • · · · · · · · * · · · · · · • · · · · * ···♦ ···· ··· ···· ··· ··
Modifikace hydroxylové skupiny vede ke vzniku etherové nebo esterové vazby. Ether lze snadno připravit reakcí s epoxidy17’20, divinylsulfonem21’23, ethylensulfidem24 nebo tvorbou hemiacetalu pomocí glutaraldehydu25,26. Pro syntézu esterů se využívají symetrické či směsné anhydridy27'29, případně se využívá O-acyl-O'-alkylkarbonát30 jako aktivační činidlo. Tyto změny struktury vedou ke kroslinkační reakci za tvorby hydrogelů.
Syntéza peptidů na pevné fázi (Solid Phase Peptide Synthesis, SPPS) je metoda, kdy jsou jednotlivé aminokyseliny postupně připojovány kpolymemímu nosiči. Všechny aminokyseliny využívají (permanentních nebo dočasných) chránících skupin, aby bylo sníženo riziko vedlejších reakcí a vznik nežádoucích sekvencí. Nejčastěji se využívají chránící skupiny Fmoc a Boc, přičemž Fmoc-chránící skupina je štěpitelná v bazickém prostředí, zatímco Bocchránící skupina je kysele štěpitelná. Syntéza peptidů v pevné fázi zahrnuje opakování cyklů „kondenzace - promytí - štěpení chránících skupin - promytí“. Syntetizovaný peptid zůstává ukotvený k polymemímu nosiči do chvíle, než je získána jeho požadovaná sekvence. Následně se provádí odštěpení z nosiče a čistění.
V současné době je snaha používat nosiče, které mohou být biokompatibilní a případně biodegradabilní. Byly popsány nosiče na bázi polysacharidů z alginátu, agaru, chitinu, hyaluronanu či bavlny. Peptid byl však zatím vždy z nosiče odštěpován. Jeho výhodné biologické vlastnosti, které se mohou vzájemně positivně ovlivňovat s biologickými vlastnostmi na nosiči syntetizovaného či ukotveného peptidů31,32, nebyly využívány.
Nejčastěji používaným nosičem pro reakce peptidů a aminokyselin s póly sacharidy jsou algináty. Alginát je lineární negativně nabitý polysacharid z opakujících se monomemích jednotek kyseliny β-D-mannurové a kyseliny α-L-guluronové spojených (1—>4) Oglykosidickými vazbami, jak znázorňuje strukturní vzorec alginátu na Obr. 2.
Využití alginátu jako lékové formy pro léčiva bylo popsáno, nejčastěji však byly využívány postupy k nekovalentnímu ukotvení těchto léčiv v matrici nebo gelu. Alginátový gel se také využíval pro analytické postupy, které zachycovaly vysokomolekulámí peptidy, zejména enzymy, buněčné organely nebo celé buňky.33,34
Kovalentní navázání peptidů a léčiv nabízí možnost použití jako sofistikovaných systémů dávkování, které zlepšují farmakokinetiku a biologickou dostupnost, což zvyšuje klinický potenciál léčiva. Konjugát alginát-peptid vzniká vytvořením amidické vazby mezi karboxylovou skupinou alginátu a aminoskupinou peptidů.33’35
Algináty s kovalentně vázanými peptidy lze využít při léčení zranění. Hojení rány je reakce tkáně na její poškození. Jedná se o složitý biologický proces, který zahrnuje chemotaxi, buněčnou proliferaci, produkci extracelulámích proteinů, neovaskularizaci, atd. Jednou z léčebných možností pro hojení ran je ovlivnění procesu hojení pomocí přirozeně se vyskytujících stimulačních činidel, jako je například růstový faktor.35
Byly připraveny materiály na bázi alginátů, které byly modifikovány peptidem, a jejich účinnost při procesu hojení ran byla studována in vivo na poškozené kůži. Králíci ošetření alginátovým obvazem s hybridním peptidem Ser-Ile-Arg-Val-X-Val-X-Pro-Gly (kde X = Ala nebo Gly) vykazovali významně větší epitelizaci a větší objem regenerované tkáně ve srovnání s jinými peptidy Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val a Val-Pro-Val-Ala-Pro-Gly také ukotvenými na alginátovém obvazu.35
Celulóza ve formě papíru byla pro přípravu peptidů také využita. Chemicky je celulóza lineární polysacharid skládající se z opakujících se monomemích jednotek D-glukózy spojených β(1—>4) O-glykosidickými vazbami, jak znázorňuje strukturní vzorec na Obr. 3. Peptidy lze získat pouze v relativně nízkém výtěžku, což je nežádoucí. Nevýhodou papíru je také nízká mechanická stabilita.31,36
Bavlna je nejčistší formou celulózy, s výjimkou mikrobiální celulózy, a je možné ji získat v rozličných formách a tvarech, bylo studováno možné využití vláken bavlny jako nosiče pro SPPS. Ukotvení peptidu v tomto případě bylo provedeno prostřednictvím esterové vazby mezi hydroxylovou skupinou bavlny a karboxylovou skupinou peptidu. Syntéza byla nejčastěji prováděna v prostředí DIC/HOBt/DMAP v DMF.31,37,38
V současné době jsou již dostupné nosiče na bázi hyaluronanu ve formě vláken39'42, tenkých filmů43,44 či netkaných textilií.40 Využití těchto perspektivních forem by mohlo odstranit některé popsané nedostatky již využitých polysacharidových nosičů. Vhodných nosičů pro léčivé látky je stále nedostatek.
Výhodou nové metodiky popsané v tomto vynálezu je využití nosiče na bázi hyaluronanu ve formě vláken, tenkých filmů či netkaných textilií pro syntézu na pevné fázi. Tento nosič se v průběhu reakce nemění, tj. zůstává neustále ve formě vláken, tenkých filmů či netkaných textilií. Jedná se tedy o syntézu na pevné fázi, kdy se peptid konstruuje po jednotlivých aminokyselinách nebo připojuje jako celek k materiálu z hyaluronanu. Doposud se využíval hyaluronan tak, že modifikace probíhala v roztoku, tj. hyaluronan se rozpustil a provedla se reakce. Pak se teprve tento derivát využil k přípravě materiálu. Rozdíl v syntéze v kapalné a na pevné fázi je ten, že v případě roztokové syntézy a následného vláknění je peptid i uvnitř vlákna a je tedy hůře dostupný. Syntézou na pevné fázi se tedy nejen sníží náklady, kdy je peptid pouze na povrchu, ale ušetří se optimalizace zvlákňovacích procesů, které jsou pro jednotlivé deriváty různé.
Podstata vynálezu
Výše uvedené nevýhody odstraňuje léčivý prostředek s nosičem na bázi hyaluronanu a jeho derivátů, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje konjugát kyseliny hyaluronové a jejích derivátů s léčivou látkou obecného vzorce
A-S-N (X), neboli
ve kterém
A je léčivá látka
S je způsob spojení léčivé látky s nosičem
N je nosič na bázi kyseliny hyaluronové a/nebo jejích derivátů m je 10 až 1250 n je 100 až 12500
Léčivý prostředek podle vynálezu je charakterizován tím, že nosič je ve formě nekonečného vlákna, nitě, textilie, tenkého filmu, staplového vlákna a/nebo netkané textilie.
Léčivý prostředek podle vynálezu je dále charakterizován tím, že léčivá látka je navázána na nosič v pozici 6 glukosaminové části konjugátu kyseliny hyaluronové a jejích derivátů obecného vzorce X.
Léčivá látka je s výhodou ukotvena ke kyselině hyaluronové a jejím derivátům esterovou vazbou (Schéma 1) nebo reduktivní aminací (Schéma 2).
Schéma 1 - esterifikace, R-COOH je aminokyselina nebo peptid
Schéma 2 - reduktivní aminace, R je peptid nebo aminokyselina a R1 je amid nebo methylester •< ·v « *· * • *· · · · · · « 4k · • · · · ···« • ·« · · · · · • · · · · · ♦ ·*·· ··»· ··· ··«· ··· ··
Nosičem je s výhodou kyselina hyaluronová, palmitoyl hyaluronan nebo formyl hyaluronan, přičemž nosič má molekulovou hmotnost s výhodou v rozmezí 1,5.104 až 2,5.106 g.mol1.
Léčivý prostředek podle vynálezu je dále charakterizován tím, že nosič umožňuje připravit na sobě vázaný konjugát, aniž by se nosič rozpustil.
Podstatou vynálezu je i způsob přípravy léčivého prostředku s nosičem na bázi hyaluronanu a jeho derivátů, který je charakterizovaný tím, že karboxylová skupina aminokyseliny nebo peptidu v léčivé látce A, kde léčivá látka současně obsahuje i A-terminální chránící skupinu, je aktivována kondenzačním činidlem v aprotickém polárním rozpouštědle za vzniku reaktivního intermediátu I, který reaguje s nosičem v přítomnosti organické báze a katalyzátoru za vzniku konjugátu kyseliny hyaluronové a jejích derivátů s léčivou látkou. Poté je terminální A-chránící skupina léčivé látky odštěpena v bazickém prostředí, s výhodou vybraném ze skupiny 20% piperidin v A,A-dimethylformamidu, 2% l,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en v A,Adimethylformamidu, 30% /er/-butylamin v Α,Α-dimethylformamidu, s výhodou ve 20% piperidinu v Α,Α-dimethylformamidu.
Způsob podle vynálezu je charakterizován tím, že tvorba konjugátu kyseliny hyaluronové a jejích derivátů je provedena při teplotě 20 °C až 40 °C, s výhodou při teplotě 22 °C až 25 °C, po dobu 2 h až 48 h, s výhodou po dobu 24 h.
Způsob podle vynálezu je dále charakterizován tím, že použité kondenzační činidlo je s výhodou vybráno ze skupiny 4-nitrofenol, A-hydroxysukcinimid, 2,4,5-trichlorfenol, 2,3,4,5,6pentafluorfenol, 2,3,4,5,6-pentachlorfenol, Α,Α'-diisopropylkarbodiimid, N,N'dicyklohexylkarbodiimid, l-[bis(dimethylamino)methylen]-l H-l,2,3-triazolo[4,5b]pyridinium3-oxid hexafluorofosfát, l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid, ethyl chloroformiát,2-( 1 A-benzotriazol-1 -yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorofosfát, benzotriazol-1 -yl-oxy-tris(dimethylamino)-fosfonium hexafluorofosfát, O-(benzotriazol-1 yl)-AA,A',A'-tetramethyluronium tetrafluoroborát, 4-triethylamino-dicyclohexylkarbodiimid p-toluensulfonát, anhydrid kyseliny propylfosfonové, s výhodou Α,Α'-diisopropylkarbodiimid.
Způsob podle vynálezu je dál charakterizován tím, že použité aprotické polární rozpouštědlo je vybráno ze skupiny obsahující Α,Α-dimethylformamid, dimethylsulfoxid, Amethyl-2-pyrrolidon, acetonitril, dichlormethan, s výhodou Α,Α-dimethylformamid.
Způsob podle vynálezu je také charakterizován tím, že použitá organická báze je vybrána ze skupiny obsahující triethylamin, pyridin, morfolin, A-methylmorfolin, A,A'diisopropylethylamin, imidazol.
• w ·» « ·· 9 »r
9 9 » 99 9 · · · Λ • · · * · 999
9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9
9999 99 99 9 9 9 9999 999 C. ·
Způsob podle vynálezu je ještě charakterizován tím, že použitý katalyzátor je vybrán ze skupiny obsahující ethyl (hydroxyimino)kyanoacetát, hydroxybenztriazol, N,Ndimethylaminopyridin nebo l-hydroxy-7-azabenzotriazol, s výhodou kombinace ethyl (hydroxyimino)kyanoacetát a N,N- dimethylaminopyridin.
Způsob podle vynálezu je též charakterizován tím, že množství použité aminokyseliny nebo peptidů odpovídá 1 až 5 ekvivalentům, s výhodou 3 ekvivalenty, vztaženo na dimer kyseliny hyaluronové nebo jejího derivátu, množství použitého aktivačního činidla odpovídá 0,1 až 5 ekvivalentům, s výhodou 3 ekvivalenty, vztaženo na dimer kyseliny hyaluronové nebo jejího derivátu, množství použité báze odpovídá až 10 ekvivalentům, vztažených na dimer kyseliny hyaluronové nebo jejího derivátu a množství použitého katalyzátoru odpovídá 0,1 až 5 ekvivalentům, s výhodou 3 ekvivalenty ethyl (hydroxyimino)kyanoacetát a 0,3 ekvivalenty /VjV-dimcthylarninopyridin, na dimer kyseliny hyaluronové nebo jejího derivátu.
Léčivý prostředek ve formě konjugátu podle vynálezu je pro použití při medicínských aplikacích jako léková forma účinného peptidů nebo aminokyseliny, přičemž se jedná o dermální, sublinguální, orální, bukální nebo lokální podání do otevřené rány.
Léčivý prostředek podle vynálezu při dermálním podání může obsahovat jako léčivou látku například peptid Dalargin. Léčivý prostředek podle vynálezu v bukálním nebo sublinguálním podání může obsahovat jako léčivou látku například peptid, který je vybrán ze skupiny Desmopressin, Lysipressin nebo Glypressin. Léčivý prostředek podle vynálezu při bukálním podání může obsahovat jako léčivou látku například peptid, který je vybrán ze skupiny virostatik a adjuvans nebo releasing faktoru pro luteizační a folikuly stimulující hormon. Léčivý prostředek podle vynálezu při použití přímo do otevřené rány může obsahovat jako léčivou látku například peptid, který je vybrán ze skupiny Glypressin, Dalargin nebo AdDP jako immunostimulans.
Předmětem vynálezu jsou tedy nové sloučeniny obecného vzorce
A-S-N (X), kde pevný nosič N je vytvořený z hyauronanu a jeho derivátů ve formě nekonečného vlákna, nitě, textilie, tenkého filmu, staplového vlákna a netkané textilie, obsahující připojenou léčivou látku A prostřednictvím spojení S a způsob přípravy tohoto komplexního systému postupem v pevné fázi nebo navázáním léčivé látky do komplexního systému, jak je dále uvedeno v příkladech provedení.
• fr · 99 * *r • ·· · · 99 » • · · · · ··<
r * · ···+· • · · · · 9 9
MM 4··· Μ» »··· 4»· «»
Způsob spojení léčivé látky s nosičem je provedeno esterovou vazbou nebo reduktivní aminací. Tento biokompatibilní a biodegradabilní pevný nosič se vyznačuje tím, že ho není nutno při použití v různých, zejména léčebných aktivitách, odštěpovat od léčivé látky a může dále s výhodou sloužit jako moderní a neinvazivní léková forma, usnadňující průstup biologicky aktivních peptidů nebo aminokyselin navázaných na uvedený biokompatibilní nosič sliznicemi a pokožkou a slouží tedy jako komplexní a vhodný materiál používaný při léčebných aplikacích v humánní a veterinární medicíně. Léčivý prostředek podle vynálezu se při biologické aktivitě projevuje jako celek a může docházet k pomalému a protrahovanému uvolňování léčivé látky z nosiče, který je pak přirozeným a organizmu vlastním způsobem eliminován. Nosič také může působit na celkový účinek na něm navázané léčivé látky a usnadňovat její použití.
V přiložené Tabulce 1 jsou uvedeny peptidy s jejich léčebným účinkem a způsobem jejich léčebného podání.
Vyplývá s ní, že léčivý prostředek podle vynálezu při dermálním podání obsahuje jako léčivou látku peptid Dalargin, který má hojivé účinky, nebo Oxytocin, který má hormonální účinek. Pro orální, bukální nebo sublinguální podání obsahuje léčivý prostředek podle vynálezu jako léčivou látku peptid Desmopressin, který vykazuje antidiuretický účinek, vliv na srážení krve zvýšením koncentrace faktoru VIII, dále Lysipressin s presorickým účinkem zejména v zubní chirurgii nebo Glypressin (Terlipressin) s protrahovaným presorickým účinkem vhodným pro zástavu krvácení. Pro bukální podání obsahuje léčivý prostředek podle vynálezu jako léčivou látkou peptid, který je používaný jako virostatikum a adjuvans, např. AdDP, nebo releasing faktor pro luteizační a folikuly stimulujících hormonů (Fertirelin, Lecirelin). Léčivý prostředek podle vynálezu pro lokální použití do otevřené rány obsahuje jako léčivou látkou peptid, který je používaný pro zástavu krvácení (Terlipressin) a Dalargin pro urychlení hojení rány, případně AdDP pro lokální stimulaci imunitního systému.
• · ·
ΟΊ
Tabulka peptidů > Λ
CA
'>
,s
-ΰ υ >
>
o 03
o3
> I) N ^03 Z .g 'za
ZA (D
O
S
ZA g S _g čS
-S ”5 t’o o g
ZA .g
ZA
ZA O Lh
Q
• · « « 9 · · · · ♦ · • · · · · · · ···· ···· ··· ···· ··· ··
Přehled obrázků na výkresech
Na přiloženém výkresu je na Obr. 1 znázorněn hyaluronan, ve kterém je R = H+ nebo
Na+ a n je rovno 100 až 12500.
Na Obr. 2 je znázorněn strukturní vzorec alginátu
Na Obr. 3 je znázorněn strukturní vzorec celulózy
Na Obr. 4 je znázorněn strukturní vzorec léčivého prostředku podle vynálezu, ve kterém
A je léčivá látka, S je způsob spojení léčivé látky s nosičem, N je nosič na bázi kyseliny hyaluronové a jejích derivátů, m je 10 až 1250, n je 100 až 12500.
Na Obr. 5 je znázorněn strukturní vzorec kyseliny hyaluronové nebo derivátu kyseliny hyaluronové s navázaným peptidem, kde HYA je kyselina hyaluronová nebo její derivát, a peptid obsahuje 7 lysinových jednotek uspořádaných v dendrimemí struktuře.
Na Obr. 6 jsou znázorněny buňky NHDF obarvené Dii, které adherovaly k vláknu nativní HYA obsahujícím RGD motivy. Snímky byly pořízeny fluorescenčním mikroskopem po 48 h kultivace.
Na Obr. 7 jsou znázorněny změny v zastoupení populace naadherovaných buněk NHDF obarvených Dii. Snímky byly pořízeny fluorescenčním mikroskopem po 1, 2, 4 a 7 dnech kultivace.
Konjugát peptidů s materiálem na bázi hyaluronanu podle vynálezu byl původci s úspěchem připraven a odzkoušen v prostorách přihlašovatele, kterým je Contipro a. s., Dolní
Dobrouč, CZ.
Příklady provedení
Vlákno nativní HYA a netkaná textilie z nativní HYA bylo připraveno dle postupu uvedeného v patentu WO/2013/167098. Vlákno palmitoyl HYA bylo připraveno dle postupu uvedeného v patentu WO/2014/082611.
V následujících příkladech používaný výraz ekvivalent (ekv.) se vztahuje na opakující se jednotku příslušné formy hyaluronanu. Procenta se uvádějí jako objemová, pokud není uvedeno jinak.
Molekulová hmotnost výchozích forem hyaluronanu je hmotnostně střední a byla stanovena pomocí metody SECMALLS.
V příkladech se vždy pouze pro účely následné analýzy nejprve navázal norleucin jakožto neesenciální aminokyselina, aby bylo možné u výsledného produktu snadno stanovit poměrná zastoupení aminokyselin. Vázání norleucinu však není podmínkou a nemá představovat žádné omezení rozsahu vynálezu.
Příklad 1
Ukotvení Fmoc-Nle-OH k vláknu nativní HYA
Do 2ml reaktoru ve tvaru injekční stříkačky opatřené fritou byl vložen 1 m vlákna nativní HYA (12 mg, 0,03 mmol, Mw = 3.105 g.mol'1), vlákno bylo opakovaně promyto DMF. Mimo reaktor byl připraven roztok 3 ekv. Fmoc-Nle-OH, 3 ekv. OxymaPure a 0,3 ekv. DMAP v 0,5 ml bezvodého DMF, po rozpuštění všech komponent byly přidány 3 ekv. DIC pro aktivaci karboxylové skupiny aminokyseliny. Tento roztok byl převeden do reaktoru k vláknu. Reakce probíhala za teploty 18 až 23 °C dalších 20 h a byla ukončena odfiltrováním reakčního roztoku. Vlákno bylo následně promyto 3 x 1,5 ml DMF, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml IPA, 3 x 1,5 ml DCM, 3x 1,5 ml DEE.
Výtěžek kondenzační reakce byl stanoven pomocí Fmoc-release testu jako substituce S = 0,01862 mmol/g.
Příklad 2
Příprava H-Nle-O-HYA
Do 2ml reaktoru ve tvaru injekční stříkačky opatřené fritou byl vložen 1 m Fmoc-NleO-HYA připravený podle Příkladu 1, vlákno bylo opakovaně promyto DMF. Bylo provedeno odštěpení Fmoc-chránící skupiny - do reaktoru k vláknu bylo přidáno 1,5 ml 20% roztoku piperidinu v DMF. Reakce probíhala 5 min za teploty 18 až 23 °C. Reakce byla opakována s prodloužením doby štěpení na 20 min a pak byla ukončena odfiltrováním reakčního roztoku. Vlákno bylo následně promyto 3 x 1,5 ml DMF, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml IPA, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml DEE.
Reakce je kvantitativní. Uvolnění aminoskupiny bylo potvrzeno provedením ninhydrinové důkazové reakce (Kaiser test).
Příklad 3
Příprava Fmoc-[Lys(Boc)J4-Nle-O-HYA
Do 2ml reaktoru ve tvaru injekční stříkačky opatřené fritou byl vložen 1 m H-Nle-OHYA připravený podle Příkladu 2, vlákno bylo opakovaně promyto DMF. Mimo reaktor byl připraven roztok 3 ekv. Fmoc-Lys(Boc)-OH a 3 ekv. OxymaPure v 0,5 ml bezvodého DMF, po rozpuštění všech komponent byly přidány 3 ekv. DIC pro aktivaci karboxylové skupiny aminokyseliny. Tento roztok byl převeden do reaktoru k vláknu. Reakce probíhala za teploty 18 až 23 °C dalších 20 h a byla ukončena odfiltrováním reakčního roztoku. Vlákno bylo následně promyto 3 x 1,5 ml DMF, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml IPA, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml DMF. Bylo provedeno odštěpení Fmoc-chránící skupiny - do reaktoru k vláknu bylo přidáno
1,5 ml 20% roztoku piperidinu v DMF. Reakce probíhala 5 min za teploty 18 až 23 °C. Reakce byla opakována s prodloužením doby štěpení na 20 minut a pak byla ukončena odfiltrováním reakčního roztoku. Vlákno bylo následně promyto 3 x 1,5 ml DMF, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml IPA, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml DMF. Postup byl opakován 4x.
Výtěžek kondenzační reakce byl stanoven pomocí Fmoc-release testu jako substituce v mmol/g. Složení produktu (nnaiezeno) bylo potvrzeno aminokyselinovou analýzou, jak je uvedeno v následující Tabulce 2. Jedná se o sériovou syntézu probíhající step-by-step metodou, nicméně byl tento postup opakován pro všechny zmíněné deriváty. Jednotlivé řádky ukazují složení připraveného konjugátu po ukončení daného cyklu, tj. po ukončení postupu popsaného v příkladu 3 získáme produkt o složení popsaném na prvním řádku. Pak postup zopakujeme a získáme produkt popsaný na druhém řádku, atd.
Tabulka 2
Látka S [mmol/g] Hvypočteno [nmol] nnaiezeno [nmol]
H-Lys(Boc)-Nle-O-HYA 0,01839 0,290 0,295
H-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Nle-O-HYA 0,01863 0,576 0,584
H-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Nle-O-HYA 0,01888 0,870 0,876
H-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Nle-O-HYA 0,01856 1,189 1,194
»··* · ·· · • ·· · ··· · ···
Příklad 4
Příprava peptidu obsahujícího 7 lysinových jednotek uspořádaných v dendrimerní struktuře - využití vlákna nativní HYA
Do 2ml reaktoru ve tvaru injekční stříkačky opatřené fritou byl předložen 1 m H-NleO-HYA připravený podle Příkladu 2, vlákno bylo opakovaně promyto DMF. Mimo reaktor byl připraven roztok 3 ekv. Fmoc-Lys(Fmoc)-OH a 3 ekv. OxymaPure v 0,5 ml bezvodého DMF, po rozpuštění všech komponent byly přidány 3 ekv. DIC pro aktivaci karboxylové skupiny aminokyseliny. Tento roztok byl převeden do reaktoru k vláknu. Reakce probíhala za teploty 18 až 23 °C dalších 20 h. Reakce byla ukončena odfiltrováním reakčního roztoku. Vlákno bylo následně promyto 3 x 1,5 ml DMF, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml IPA, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml DMF. Bylo provedeno odštěpení Fmoc-chránící skupiny - do reaktoru k vláknu bylo přidáno
1,5 ml 20% roztoku piperidinu v DMF. Reakce probíhala 5 min za teploty 18 až 23 °C. Reakce byla opakována s prodloužením doby štěpení na 20 min. Reakce byla ukončena odfiltrováním reakčního roztoku. Vlákno bylo následně promyto 3 x 1,5 ml DMF, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml IPA, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml DMF. Postup byl opakován 2x.
Průběh reakce byl sledován pomocí Fmoc-release testu. Výtěžek byl stanoven pomocí Fmoc-release testu. Složení produktu, který je znázorněn na Obr. 5, bylo potvrzeno aminokyselinovou analýzou, jak je uvedeno v Tabulce 3. Jedná se o sériovou syntézu probíhající step-by-step metodou, nicméně byl tento postup opakován pro všechny zmíněné deriváty. Jednotlivé řádky ukazují složení připraveného konjugátu po ukončení daného cyklu, tj. po ukončení postupu popsaného v příkladu 3 získáme produkt o složení popsaném na prvním řádku. Pak postup zopakujeme a získáme produkt popsaný na druhém řádku, atd.
Tabulka 3
Látka S [mmol/g] Hvypočteno [nmol] Π nalezeno [nmol]
H-Lys-Nle-O-HYA 0,03381 0,25 0,262
H-Lys3-Nle-O-HYA 0,07169 0,77 0,799
H-Lys7-Nle-O-HYA 0,14211 1,84 1,876
• «
Příklad 5
Příprava peptidů obsahujícího 7 alaninových jednotek na vlákně nativní HYA
Do 2ml reaktoru ve tvaru injekční stříkačky opatřené fritou byl předložen 1 m H-NleO-HYA připraveného podle Příkladu 2, vlákno bylo opakovaně promyto DMF. Mimo reaktor byl připraven roztok 3 ekv. Fmoc-Lys(Boc)-OH a 3 ekv. OxymaPure v 0,5 ml bezvodého DMF, po rozpuštění všech komponent bylo přidáno 3 ekv. DIC pro aktivaci karboxylové skupiny aminokyseliny. Tento roztok byl převeden do reaktoru k vláknu. Reakce probíhala za teploty 18 až 23 °C dalších 20 h. Reakce byla ukončena odfiltrováním reakčního roztoku. Vlákno bylo následně promyto 3 x 1,5 ml DMF, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml IPA, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml DMF. Bylo provedeno odštěpení Fmoc-chránící skupiny - do reaktoru k vláknu bylo přidáno
1,5 ml 20% roztoku piperidinu v DMF. Reakce probíhala 5 min za teploty 18 až 23 °C. Reakce byla opakována s prodloužením doby štěpení na 20 minut a byla ukončena odfiltrováním reakčního roztoku. Vlákno bylo následně promyto 3 x 1,5 ml DMF, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml IPA, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml DMF. Postup byl opakován 7x pro Fmoc-Ala-OH.
Výtěžek kondenzační reakce byl stanoven pomocí Fmoc-release testu jako substituce v mmol/g. Složení produktu bylo potvrzeno aminokyselinovou analýzoujako poměr zastoupení jednotlivých aminokyselin. Čistota materiálu byla stanovena pomocí MS-HPLC po degradaci materiálu. Výsledky jednotlivých analýz jsou uvedeny v následující Tabulce 4:
Tabulka 4
Látka S [mmol/g] Aminokyselina Čistota [%]
Ala Lys Nle
H-(Ala)7-Lys(Boc)-Nle-O-HYA 0,01798 7,28 1,03 1 86
Příklad 6
Ukotvení Fmoc-Nle-OH k vláknu palmitoyl HYA
Do 2ml reaktoru ve tvaru injekční stříkačky opatřené fritou byl vložen 1 m vlákna palmitoyl HYA (15 mg, 0,03 mmol, Mw = 3.105 g.mol’1), vlákno bylo opakovaně promyto DMF. Mimo reaktor byl připraven roztok 3 ekv. Fmoc-Nle-OH, 3 ekv. OxymaPure a 0,3 ekv. DMAP v 0,5 ml bezvodého DMF, po rozpuštění všech komponent byly přidány 3 ekv. DIC pro aktivaci karboxylové skupiny aminokyseliny. Tento roztok byl převeden do reaktoru k vláknu. Reakce probíhala za teploty 18 až 23 °C dalších 20 h a byla ukončena odfiltrováním reakčního roztoku. Vlákno bylo následně promyto 3 x 1,5 ml DMF, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml IPA, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml DEE.
Výtěžek kondenzační reakce byl stanoven pomocí Fmoc-release testu jako substituce S = 0,01029 rnmol/g.
Příklad 7
Příprava H-Nle-O-palmitoylHYA
Do 2ml reaktoru ve tvaru injekční stříkačky opatřené fritou byl vložen 1 m Fmoc-NleO-palmitoyllAYK připravený podle Příkladu 6, vlákno bylo opakovaně promyto DMF. Bylo provedeno odštěpení Fmoc-chránící skupiny - do reaktoru k vláknu bylo přidáno 1,5 ml 20% roztoku piperidinu v DMF. Reakce probíhala 5 min za teploty 18 až 23 °C. Reakce byla opakována s prodloužením doby štěpení na 20 min a pak byla ukončena odfiltrováním reakčního roztoku. Vlákno bylo následně promyto 3 x 1,5 ml DMF, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml IPA, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml DEE.
Reakce je kvantitativní. Uvolnění aminoskupiny bylo potvrzeno provedením ninhydrinové důkazové reakce (Kaiser test).
Příklad 8
Příprava Fmoc-[Lys(Boc)] 4-Nle-O-palmitoylHYA
Do 2ml reaktoru ve tvaru injekční stříkačky opatřené fritou byl vložen 1 m H-Nle-OpalmitoyllAW připravený podle Příkladu 7, vlákno bylo opakovaně promyto DMF. Mimo reaktor byl připraven roztok 3 ekv. Fmoc-Lys(Boc)-OH a 3 ekv. OxymaPure v 0,5 ml bezvodého DMF, po rozpuštění všech komponent byly přidány 3 ekv. DIC pro aktivaci karboxylové skupiny aminokyseliny. Tento roztok byl převeden do reaktoru k vláknu. Reakce probíhala za teploty 18 až 23 °C dalších 20 h a byla ukončena odfiltrováním reakčního roztoku. Vlákno bylo následně promyto 3 x 1,5 ml DMF, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml IPA, 3 x 1,5 ml DCM, 3x1,5 ml DMF. Bylo provedeno odštěpení Fmoc-chránící skupiny - do reaktoru k vláknu bylo přidáno 1,5 ml 20% roztoku piperidinu v DMF. Reakce probíhala 5 min za teploty 18 až 23 °C. Reakce byla opakována s prodloužením doby štěpení na 20 minut a pak byla ukončena odfiltrováním reakčního roztoku. Vlákno bylo následně promyto 3 x 1,5 ml DMF, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml IPA, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml DMF. Postup byl opakován 4x.
• · ·
Výtěžek kondenzační reakce byl stanoven pomocí Fmoc-release testu jako substituce v mmol/g. Složení produktu (nnaiezeno) bylo potvrzeno aminokyselinovou analýzou, jak je uvedeno v následující Tabulce 5. Jedná se o sériovou syntézu probíhající step-by-step metodou, nicméně byl tento postup opakován pro všechny zmíněné deriváty. Jednotlivé řádky ukazují složení připraveného konjugátu po ukončení daného cyklu, tj. po ukončení postupu popsaného v příkladu 3 získáme produkt o složení popsaném na prvním řádku. Pak postup zopakujeme a získáme produkt popsaný na druhém řádku, atd.
Tabulka 5
Látka S [mmoIZg] Bvypočteno |nmol| Ilnalezeno [nmol]
H-Lys(Boc)-Nle-O-/z<7Zmz7oyZHYA 0,01044 0,157 0,152
H-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Nle-O-paZmz7oyZHYA 0,01057 0,314 0,318
H-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Nle-O-paZmz7oy/HYA 0,01061 0,478 0,469
H-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Nle-O-/>aZmz7oyZHYA 0,01053 0,631 0,619
Příklad 9
Příprava peptidů obsahujícího 7 lysinových jednotek uspořádaných v dendrimerní struktuře - využití vlákna palmitoyl HYA
Do 2ml reaktoru ve tvaru injekční stříkačky opatřené fritou byl předložen 1 m H-NleO-paZmz7oyZHYA připravený podle Příkladu 7, vlákno bylo opakovaně promyto DMF. Mimo reaktor byl připraven roztok 3 ekv. Fmoc-Lys(Fmoc)-OH a 3 ekv. OxymaPure v 0,5 ml bezvodého DMF, po rozpuštění všech komponent byly přidány 3 ekv. DIC pro aktivaci karboxylové skupiny aminokyseliny. Tento roztok byl převeden do reaktoru k vláknu. Reakce probíhala za teploty 18 až 23 °C dalších 20 h. Reakce byla ukončena odfiltrováním reakčního roztoku. Vlákno bylo následně promyto 3 x 1,5 ml DMF, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml IPA, 3 x
1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml DMF. Bylo provedeno odštěpení Fmoc-chránící skupiny - do reaktoru k vláknu bylo přidáno 1,5 ml 20% roztoku piperidinu v DMF. Reakce probíhala 5 min za teploty 18 až 23 °C. Reakce byla opakována s prodloužením doby štěpení na 20 min. Reakce byla ukončena odfiltrováním reakčního roztoku. Vlákno bylo následně promyto 3 x 1,5 ml DMF, 3 x
1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml IPA, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml DMF. Postup byl opakován 2x.
Průběh reakce byl sledován pomocí Fmoc-release testu. Výtěžek byl stanoven pomocí Fmoc-release testu. Složení produktu, který je znázorněn na Obr. 5, kde HYA v tomto případě • « • · • · * · · • · · · ··· · · · · · znamená palmitoyl hyaluronan, bylo potvrzeno aminokyselinovou analýzou, jak je uvedeno v Tabulce 6. Jedná se o sériovou syntézu probíhající step-by-step metodou, nicméně byl tento postup opakován pro všechny zmíněné deriváty. Jednotlivé řádky ukazují složení připraveného konjugátu po ukončení daného cyklu, tj. po ukončení postupu popsaného v příkladu 3 získáme produkt o složení popsaném na prvním řádku. Pak postup zopakujeme a získáme produkt popsaný na druhém řádku, atd.
Tabulka 6
Látka S [mmol/g] nvypočteno [nmol] nnalezeno [nmol]
H-Lys-Nle-O-pa/mz7oy/HYA 0,00984 0,16 0,154
H-Lys3-Nle-O-pa/mz7oy/HYA 0,02130 0,49 0,501
H-Lys7-Nle-O-pa/zwz7o)'/HYA 0,04265 1,12 1,113
Příklad 10
Ukotvení Fmoc-Lys-NFF k vláknu formylHYA
Do 2ml reaktoru ve tvaru injekční stříkačky opatřené fritou byl vložen 1 m vlákna/ormy/HYA(l 1 mg, 0,028 mmol, Mw = 3.105 g.mol'1), vlákno bylo opakovaně promyto DMF. Mimo reaktor byl připraven roztok 3 ekv. Fmoc-Lys-NJh v 0,5 ml bezvodého DMF, který byl převeden do reaktoru k vláknu. Reakce probíhala za teploty 18 až 23 °C dalších 20 h. Následně bylo přidáno 3 ekv. picBH3 Reakce probíhala za teploty 18 až 23 °C dalších 24 h, pak byla ukončena odfiltrováním reakčního roztoku. Vlákno bylo následně promyto 3 χ 1,5 ml DMF, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml IPA, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml DEE. Bylo provedeno odštěpení Fmoc-chránící skupiny - do reaktoru k vláknu bylo přidáno 1,5 ml 20% roztoku piperidinu v DMF. Reakce probíhala 5 min za teploty 18 až 23 °C. Reakce byla opakována s prodloužením doby štěpení na 20 min a pak byla ukončena odfiltrováním reakčního roztoku. Vlákno bylo následně promyto 3 x 1,5 ml DMF, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml IPA, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml DEE.
Uvolnění aminoskupiny bylo potvrzeno provedením ninhydrinové důkazové reakce (Kaiser test).
Příklad 11
Ukotvenípeptidu s RGD motivem k vláknu nativní HYA
Do 2ml reaktoru ve tvaru injekční stříkačky opatřené fritou byl předložen 1 m vlákna nativní HYA (12 mg, 0,03 mmol, Mw = 3.105 g.mor1), vlákno bylo opakovaně promyto DMF. Mimo reaktor byl připraven roztok 3 ekv. peptidu příslušné sekvence, 3 ekv. OxymaPure a 0,3 ekv. DMAP v 0,5 ml bezvodého DMF, po rozpuštění všech komponent byly přidány 3 ekv. DIC pro aktivaci karboxylové skupiny aminokyseliny. Tento roztok byl převeden do reaktoru k vláknu. Reakce probíhala za teploty 18 až 23 °C dalších 20 h. Reakce byla ukončena odfiltrováním reakčního roztoku. Vlákno bylo následně promyto 3 x 1,5 ml DMF, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml IPA, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml DEE.
Výtěžek kondenzační reakce byl stanoven pomocí Fmoc-release testu jako substituce v mmol/g. Složení produktu bylo potvrzeno aminokyselinovou analýzou jako poměr zastoupení jednotlivých aminokyselin. Čistota materiálu byla stanovena pomocí MS-HPLC po degradaci materiálu. Výsledky jednotlivých analýz jsou uvedeny v následující Tabulce 7:
Tabulka 7
Látka S [mmol/g] Aminokyselina Čistota [%]
Ahx Asp Gly Nle Arg
Ac-Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Nle-O-HYA - - 1,04 3,89 1 1,03 90
H-Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Nle-O-HYA 0,01802 - 1,01 3,91 1 0,97 82
H-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Nle-O-HYA 0,01832 - 1,04 4,07 1 1,08 85
Ac-Arg-Gly-Asp-Ahx-Ahx-Nle-O-HYA - 2,20 1,04 1,06 1 1,01 95
H-Arg-Gly-Asp-Ahx-Ahx-Nle-O-HYA 0,01843 2,27 0,93 1,05 1 1,00 90
Ac-Ahx-Ahx-Arg-Gly-Asp-Nle-O-HYA - 2,21 1,03 1,26 1 1,01 86
H-Ahx-Ahx-Arg-Gly-Asp-Nle-O-HYA 0,01831 2,31 0,98 1,05 1 1,02 89
Příklad 12
Ukotvenípeptidu s RGD motivem k netkané textilii nativní HYA
Do 2ml reaktoru ve tvaru injekční stříkačky opatřené fritou bylo předloženo 5 čtverců netkané textilie z nativní HYA o hraně 5 mm (10,5 mg, 0,03 mmol, Mw = 1,04.106 g.mor1), materiál byl opakovaně promyt DMF. Mimo reaktor byl připraven roztok 3 ekv. peptidu příslušné sekvence a 3 ekv. OxymaPure v 0,5 ml bezvodého DMF, po rozpuštění všech
komponent bylo přidáno 3 ekv. DIC pro aktivaci karboxylové skupiny aminokyseliny. Tento roztok byl převeden do reaktoru k materiálu. Reakce probíhala za teploty 18 až 23 °C dalších 20 h. Reakce byla ukončena odfiltrováním reakčního roztoku. Textilie byla následně promyta 3 x 1,5 ml DMF, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml IPA, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml DEE.
Výtěžek kondenzační reakce byl stanoven pomocí Fmoc-release testu jako substituce v mmol/g. Složení produktu bylo potvrzeno aminokyselinovou analýzou jako poměr zastoupení jednotlivých aminokyselin. Čistota materiálu byla stanovena pomocí MS-HPLC po degradaci materiálu. Výsledky jednotlivých analýz jsou uvedeny v následující Tabulce 8:
Tabulka 8
Látka S [mmol/g] Aminokyselina Čistota l%]
Ahx Asp Gly Nle Arg
H-Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Nle-O-HYA 0,01802 - 1,04 3,94 1 1,01 85
H-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Nle-O-HYA 0,01832 - 1,06 4,14 1 1,07 76
Ac-Arg-Gly-Asp-Ahx-Ahx-Nle-O-HYA - 2,17 0,96 1,05 1 1,04 95
H-Arg-Gly-Asp-Ahx-Ahx-Nle-O-HYA 0,01843 2,15 1,01 1,12 1 1,06 88
Příklad 13
Ukotvenípeptidu Fmoc-(VPGLG)2-OH k vláknu nativní HYA
Do 2ml reaktoru ve tvaru injekční stříkačky opatřené fritou byl předložen 1 m vlákna nativní HYA (12 mg, 0,03 mmol, Mw = 3.105 g.mol·1), vlákno bylo opakovaně promyto DMF. Mimo reaktor byl připraven roztok 3 ekv. peptidu Fmoc-(VPGLG)2-OH, 3 ekv. OxymaPure a 0,3 ekv. DMAP v 0,5 ml bezvodého DMF, po rozpuštění všech komponent bylo přidáno 3 ekv. DIC pro aktivaci karboxylové skupiny aminokyseliny. Tento roztok byl převeden do reaktoru k vláknu. Reakce probíhala za teploty 18 až 23 °C dalších 20 h a byla ukončena odfiltrováním reakčního roztoku. Vlákno bylo následně promyto 3 x 1,5 ml DMF, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml IPA, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml DEE.
Výtěžek kondenzační reakce byl stanoven pomocí Fmoc-release testu jako substituce v mmol/g. Složení produktu bylo potvrzeno aminokyselinovou analýzou jako poměr zastoupení jednotlivých aminokyselin. Čistota materiálu byla stanovena pomocí MS-HPLC po degradaci materiálu. Výsledky jednotlivých analýz jsou uvedeny v následující Tabulce 9:
• ·
Tabulka 9
Látka S [mmol/g] Aminokyselina Čistota I%]
Gly Leu Pro Val
H-(Val-Pro-Gly-Leu-Gly)2-O-HYA 0,01809 2,37 1,26 1,13 1 85
Příklad 14
Ukotveni Dalarginu k vláknu nativní HYA
Do 2ml reaktoru ve tvaru injekční stříkačky opatřené fritou byl předložen 1 m vlákna nativní HYA (12 mg, 0,03 mmol, Mw = 3.105 g.moT1), vlákno bylo opakovaně promyto DMF. Mimo reaktor byl připraven roztok 3 ekv. peptidu Fmoc-Dalargin, 3 ekv. OxymaPure a 0,3 ekv. DMAP v 0,5 ml bezvodého DMF, po rozpuštění všech komponent bylo přidáno 3 ekv. DIC pro aktivaci karboxylové skupiny aminokyseliny. Tento roztok byl převeden do reaktoru k vláknu. Reakce probíhala za teploty 18 až 23 °C dalších 20 h a byla ukončena odfiltrováním reakčního roztoku. Vlákno bylo následně promyto 3 x 1,5 ml DMF, 3 x 1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml IPA, 3 x
1,5 ml DCM, 3 x 1,5 ml DEE.
Výtěžek kondenzační reakce byl stanoven pomocí Fmoc-release testu jako substituce v mmol/g. Složení produktu bylo potvrzeno aminokyselinovou analýzoujako poměr zastoupení jednotlivých aminokyselin. Čistota materiálu byla stanovena pomocí MS-HPLC po degradaci materiálu. Výsledky jednotlivých analýz jsou uvedeny v následující Tabulce 10:
Tabulka 10
Látka S [mmol/g] Aminokyselina Čistota [%]
ala Arg Gly Nle Leu Phe Tyr
H-Tyr-ala-Gly-Phe-Leu-Arg-Nle-O-HYA 0,01894 0,99 0,99 0,96 1 0,98 0,96 0,99 93
Příklad 15
In vitro buněčná adheze na vlákně obsahující RGD motiv
Vlákno nativní HYA, které obsahuje RGD motiv, připravené podle postupu uvedeného v Příkladu 10, a kontrolní vlákna byla nastříhána na lem úseky a byla přenesena do 24-jamkové destičky neadhezivního panelu. Primární lidské fibroblasty (NHDF) byly předem označené pomocí fluorescenční barvy Dii (Exmax/Emmax 549/565) a v množství 105 buněk nasazeny do jamek s testovanými vzorky. Panel byl poté třepán na třepačce (5 h/ 160 rpm) za kultivačních • · · podmínek (37 °C, 5% CO2), pro zachování buněk ve vznosu. Po 24 hod kultivace byla vlákna přenesena do jamky s čerstvým kultivačním médiem. Buňky byly poté pozorovány a zaznamenány pomocí fluorescenčního mikroskopu Nikon Ti-Eclipse za pomocí TRITC filtru (Exmax/Emmax, 549/565). Proliferace fibroblastů byla sledována v rámci sedmidenní kultivace.
Lidské dermální fibroblasty adherovaly a v čase proliferovaly pouze na vlákně s peptidem H-Arg-Gly-Asp-Ahx-Ahx-Nle-OH vázaným k HYA přes 2 jednotky kyseliny 6aminohexanové, které tvoří pevný a ohebný linker a zpřístupňují tak RGD peptid pro adhezivní receptory buněk. Oproti tomu peptid H-Ahx-Ahx-Arg-Gly-Asp-Nle-OH, stejně tak jako připojení peptidů H-Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Nle-OH a H-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-NleOH přes triglycinový linker nepodporovalo buněčnou adhezi, jak je patrné z Obr. 6. Z těchto dat lze předpokládat, že buněčnou adhezi podporuje právě RGD motiv, který je minimální doménou rozpoznatelnou buněčnými receptory, popřípadě Ahx-linker. Pozitivní vliv Ahxlinkeru byl následně vyvrácen testováním vláken s vázaným peptidem obsahujícím RGD nebo RDG motiv, kdy NHDF adherovaly výhradně na peptid s RGD.
Příklad 16
In vitro buněčná adheze na netkané textilii nativní HYA obsahující RGD motiv
Netkaná textilie HYA s ukotveným peptidem H-Arg-Gly-Asp-Ahx-Ahx-Nle-OH připravená podle postupu uvedeném v Příkladu 7 a kontrolní textilie byla nastříhána čtverce o hraně 0,5 cm a byla přenesena do 24-jamkové destičky neadhezivního panelu. Primární lidské fibroblasty (NHDF) byly předem označené pomocí fluorescenční barvy Dii (Exmax/Emmax 549/565) a v množství 105 buněk nasazeny do jamek s testovanými vzorky. Panel byl poté třepán na třepačce (5 h/ 160 rpm) za kultivačních podmínek (37 °C, 5% CO2), pro zachování buněk ve vznosu. Po 24 hod kultivace byla textilie přenesena do jamky s čerstvým kultivačním médiem. Buňky byly poté pozorovány a zaznamenány pomocí fluorescenčního mikroskopu Nikon Ti-Eclipse za pomocí TRITC filtru (Exmax/Emmax, 549/565). Proliferace fibroblastů byla sledována v rámci sedmidenní kultivace, jak je zřejmé z Obr. 7.
NHDF rovnoměrně adherovaly na povrch textilie a po 48 hod došlo k jejich charakteristickému prodloužení.
Průmyslová využitelnost
Nový léčivý prostředek s nosičem na bázi hyaluronanu a jeho derivátů může být využit jako vhodná léková forma při léčbě připojenou léčivou látkou. Tato nová léková forma způsobí lepší protrahované působení léčiva vázaného na pevný nosič komplexního systému. Vhodné formy hyaluronanu s navázanými léčivými látkami lze s výhodou využít v humánní a veterinární medicíně.
Seznam zkratek
Boc tert-butyloxykarbonyl
Castro reagent benzotriazol-1 -yl-oxy-tris(dimethylamino)fosfonium hexafluorofosfát
DBU 1,8-diazabicyclo[5,4.0]undec-7-en
DCC N,N '-dicyklohexylkarbodiimid
DCM dichlormethan
DEE diethylether
DIC N,N '-diisopropylkarbodiimid
Dii chloristan 1,1 '-dioktadecyl-3,3,3 ',3 '-tetramethylindokarbokyanin
DIPEA ,V,/V'-diisopropylethylamin
DMAP ΛΆ-dimethylaminopyridin
DMF N, V-dimethylformamid
EDC l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid
Fmoc fluorenylmethyloxykarbonyl
HATU l-[bis(dimethylamino)methylen]-l/7-l,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxid hexafluorofosfát
HBTU 2-(l//-benzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetramethyluronium hexafluorofosfát
HOAt 1 -hydroxy-7-azabenzotriazol
HOBt jV-hydroxybenztriazol
HOSu A-hydroxysukcinimid
1PA isopropylalkohol
OxymaPure picBEE T3P ethyl (hydroxyimino)kyanoacetát picolin borane complex anhydrid kyseliny propylfosfonové
TBTU O-(benzotriazol-1 -yl)-A Ν,Ν ’,N '-tetramethyluronium tetrafluoroborát
WSCD 4-triethylaminodicyclohexylkarbodiimid p-toluensulfonát
• · ♦ • · «4 · · · • ·· · · · · · • · · · • ·· ····« • · · ♦ · · · ···· ···· ··· ···· ··· ·♦
Seznam použité literatury
1. Schanté C. E. et al.: CarbohydPolym 85, 469 (2011).
2. Danishefsky I., Siskovic E.: CarbohydRes 16 (1), 199 (1971).
3. Bulpitt P., Aeschlimann D.: JBiomedMater Res 47(2),152(1999).
4. Foullain N., Montanari S., Jeacomine I., Gambarelli S., Vignon M.: CarbohydPolym (3), 333 (2008).
5. Oh E., Park K., Kim K., Kim J., Yang J., Kong J.: J Control Release 141 (1), 2 (2010).
6. Magnani A., Rappuoli R., Lamponi S., Barbucci R.: Polym Advan Technol 11 (8-12),
488 (2000).
7. Bergman K., Elvingson C., Hilbom J., Svensk G., Bowden T.: Biomacromolecules 8 (7),2190 (2007).
8. Bellini D., Topai A.: WO/2000/001733 (2000).
9. Della Valle F., Romeo A.: US4851521 (1986).
10. Pelletier S., Hubert P., Lapicque F., Payan E., Dellacherie E.: CarbohydPolym 43 (4),
343 (2000).
11. Jeanloz R., Forchielli E.: JBiol Chem 186 (2), 495 (1950).
12. Hirano K., Sakai S., Isshikawa T., Avci F., Linhardt R., Toida T.: CarbohydRes 340 (14), 2297 (2005).
13. Leach J., Bivens K., Patrick Jr. C., Schmidt C.: Biotechnol Bioeng 82 (5), 578 (2003).
14. Bencherif S., Srinivasan A., Horkay F., Hollinger J., Matyjaszewski K., Washbum N.:
Biomaterials 29 (12), 1973 (2008).
15. Weng L., Gouldstone A., Wu Y., Chen W.: Biomaterials 29 (14), 2153 (2008).
16. Prata J., Barth T., Bencherif S., Washbum N.: Biomacromolecules 11(3), 769 (2010).
17. Laurent T., Hellsing K., Gelotte B.: Acta Chem Scand 18 (1), 274 (1964).
18. Yui N., Okano T., Sakurai Y.: J Control Release 22 (2), 105 (1992).
19. Tomihata K., Ikada Y.: Biomaterials 18 (3), 189 (1997).
20. Zhao X.: WO/2000/046253 (2000).
21. Balazs E., Leshchiner A.: US4582865 (1986).
22. Ramamurthi A., Veselý I.: JBiomedMater Res 60 (1), 196 (2002).
23. Eun J., Kang S., Kim B., Jiang G., II H., Sei K.: JBiomedMater Res-A 86 (3), 685 (2008).
24. Serban M., Yang G., Prestwich G.: Biomaterials 29 (10), 1388 (2008).
25. Tomihata K., Ikada Y.: JPolym Sci Pol Chem 35 (16), 3553 (1997).
• · ·
26. Crescenzi V. et al.: CarbohydPolym 53 (3), 311 (2003).
27. Velebný V, Hrdina R., Šuláková R., Mlčochové P., Holas T., Krčmář M.: CZ302856 (2006).
28. Smejkalová D. et al.: WO/2014/082609 (2014).
29. Huerta-Angeles G., Bobek M., Příkopová E., Smejkalová D., Velebný V: Carbohyd Polym 111, 883 (2014).
30. Buffa R., Velebný V, Pospíšilová L., Příkopová E., Pravda M., Nikodým P., Pálek L.: WO/2010/105582 Al (2010).
31. Eichler J. et al.: Cotton-carrier for solidphase peptide synthesis (1991).
32. Robert Marks: WO/2012/101612 Al (2012).
33. Palmieri G., Cassani G., Fassína G.: J Chromatogr B 664, 127 (1995).
34. Morgan S. M., Al-Shamkhani A., Callant D., Schacht E., Woodley J.F., Duncan R.: Int JPharm 122, 121 (1995).
35. Hashimoto T., Suzuki Y., Tanihara M., Kakimaru Y., Suzuki K.: Biomaterials 25, 1407 (2004).
36. Frank R., Doring R., Tetrahedron 44, 6031 (1988).
37. Eichler J., Bienert M., Stierandova A., Lébl M.: Pept Res 4 (5), 296 (1991).
38. Eichler J. et al.: Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis. Birmingham, UK: SPCC, 337 - 343 (1990).
39. Burgert L., Hrdina R.. Mašek D., Velebný V: WO/2012/089179 Al (2012).
40. Burgert L et al.: WO/2013/167098 A2 (2013).
41. Běťák J. et al.: WO/2014/082610 Al (2014).
42. Ščudlová J. et al.: WO/2014/082611 Al (2014).
43. Foglarová M. et al.: WO/2016/141903 (2016).
44. Foglarová M. et al.: Carbohydr Polym 144, 68 (2016).

Claims (25)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Léčivý prostředek s nosičem na bázi hyaluronanu a/nebo jeho derivátů, vyznačující se tím, že obsahuje konjugát kyseliny hyaluronové a/nebo jejích derivátů s léčivou látkou, podle obecného vzorce (X):
    A-S-N (X), neboli ve kterém
    A je léčivá látka,
    S je způsob spojení léčivé látky s nosičem,
    N je nosič na bázi kyseliny hyaluronové a/nebo jejích derivátů, m je 10 až 1250, n je 100 až 12500.
  2. 2. Léčivý prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že nosič N je ve formě nekonečného vlákna, nitě, textilie, tenkého filmu, staplového vlákna a/nebo netkané textilie.
  3. 3. Léčivý prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že léčivá látka A je vybrána ze skupiny zahrnující aminokyseliny a peptidy.
  4. 4. Léčivý prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že léčivá látka A je ukotvena ke kyselině hyaluronové a jejím derivátům esterovou vazbou přes atom O nebo reduktivní aminací přes atom N.
  5. 5. Léčivý prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že nosičem N je kyselina hyaluronová, palmitoyl hyaluronan nebo formyl hyaluronan o molekulové hmotnosti v rozmezí 1,5.104 až 2,5.106 g.mol'1.
  6. 6. Způsob přípravy léčivého prostředku s nosičem na bázi hyaluronanu a/nebo jeho derivátů, podle nároku 1, vyznačující se tím, že léčivá látka A obsahující terminální A-chránící skupinu a karboxylovou skupinu se nejprve podrobí aktivaci karboxylové skupiny kondenzačním činidlem v aprotickém polárním rozpouštědle za vzniku reaktivního • » · · ··· ·»· • ·· · ··· · ··« • · · · ···· • · · · · · · 9 • · · · · · « ···· ···· ♦ ·· ·*·· ··· ·«>
    intermediátu I, který poté reaguje s nosičem N, kterým je kyselina hyaluronová a/nebo její derivát, v přítomnosti organické báze a katalyzátoru za vzniku konjugátu kyseliny hyaluronové a/nebo jejích derivátů s léčivou látkou A, načež se terminální A-chránící skupina léčivé látky A navázané na nosiči odštěpí v bazickém prostředí.
  7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že tvorba konjugátu kyseliny hyaluronové a jejích derivátů je provedena při teplotě 20 °C až 40 °C po dobu 2 až 48 hodin.
  8. 8. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že tvorba konjugátu kyseliny hyaluronové a jejích derivátů je provedena při teplotě 22 °C až 25 °C po dobu 24 hodin.
  9. 9. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se dále konjugát nechá opakovaně reagovat s reaktivním intermediátem I, který může být stejný nebo odlišný od reaktivního intermediátu I z předcházejícího kroku.
  10. 10. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že nosičem je kyselina hyaluronová a/nebo její palmitoyl derivát a/nebo její formyl derivát a léčivá látka je vybrána ze skupiny zahrnující aminokyseliny a peptidy.
  11. 11. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že kondenzační činidlo je vybráno ze skupiny
    N,N '-diisopropylkarbodiimid, N,N '-dicyklohexylkarbodiimid, 1 -[bis(dimethylamino)methylen]-lH-l,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxid hexafluorofosfát, l-ethyl-3-(3dimethylaminopropyljkarbodiimid, anhydrid kyseliny propylfosfonové, 2-(127benzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetramethyluronium hexafluorofosfát, ethyl chloroformiát, benzotriazol-1 -yl-oxy-tris(dimethylamino)fosfonium hexafluorofosfát, O-(benzotriazol-1 yY)-N,N,N',N '-tetramethyluronium tetrafluoroborát, 4-triethylamino-dicyclohexylkarbodiimid/2-toluensulfonát, 4-nitrofenol, A-hydroxysukcinimid, 2,4,5-trichlorfenol, 2,3,4,5,6pentafluorfenol, 2,3,4,5,6-pentachlorfenol.
  12. 12. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že aprotické polární rozpouštědlo je vybráno ze skupiny obsahující Α,Α-dimethylformamid, dimethylsulfoxid, A-methyl-2-pyrrolidon, acetonitril, dichlormethan.
  13. 13. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že organická báze je vybrána ze skupiny obsahující triethylamin, pyridin, morfolin, A-methylmorfolin, A,A'-diisopropylethylamin, imidazol.
    • · · · · · · · <
    • · · · · · · · · * • · · · · · ·· • · · · » · « · • · · · « · · ··· ···· ··· ···· ··· ··
  14. 14. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že katalyzátor je vybrán ze skupiny obsahující ethyl (hydroxyimino)kyanoacetát, hydroxybenztriazol, l-hydroxy-7-azabenzotriazol nebo
    N, /V-dimethy lam i nopyri di n.
  15. 15. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že bazické prostředí, v němž je odštěpěna Nterminální chránící skupina, je vybráno ze skupiny zahrnující 20% piperidin v DMF, 2% DBU v DMF, 30% ter/-butylamin v DMF.
    15. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že kondenzační činidlo je N,N’diisopropylkarbodiimid, aprotické polární rozpouštědlo je /V,/V-dimethylformamid, katalyzátor je kombinace ethyl (hydroxyimino)kyanoacetát a A, A-dimethylaminopyridin a bazické prostředí je 20% piperidin v N,N-dimethylformamidu.
  16. 16. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že množství léčivé látky A odpovídá 1 až 5 ekvivalentům, vztaženo na dimer kyseliny hyaluronové nebo jejího derivátu.
  17. 17. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že množství kondenzačního činidla odpovídá
    O, 1 až 5 ekvivalentům, vztaženo na dimer kyseliny hyaluronové nebo jejího derivátu.
  18. 18. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že množství organické báze odpovídá až 10 ekvivalentům, vztaženo na dimer kyseliny hyaluronové nebo jejího derivátu.
  19. 19. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že množství katalyzátoru odpovídá 0,1 až 5 ekvivalentům, s výhodou 3 ekvivalenty ethyl (hydroxyimino)kyanoacetát a 0,3 ekvivalenty Α,Α-dimethylaminopyridin, na dimer kyseliny hyaluronové nebo jejího derivátu.
  20. 20. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že množství léčivé látky A odpovídá 3 ekvivalentům, množství kondenzačního činidla odpovídá 3 ekvivalentům a množství katalyzátoru odpovídá 3 ekvivalentům, vztaženo na dimer kyseliny hyaluronové nebo jejího derivátu.
  21. 21. Léčivý prostředek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 pro použití při medicínských aplikacích jako léková forma účinného peptidů nebo aminokyseliny, přičemž se jedná o dermální, sublinguální, orální, bukální nebo lokální podání do otevřené rány.
  22. 22. Léčivý prostředek podle nároku 21 pro dermální podání, obsahující jako léčivou látku peptid Dalargin.
    ·* • « « ·· • ·· v • · «· · · ·· · • • · « • 9 9 • * · • • • · • · · «·· ··▼· ·»*· «e
  23. 23. Léčivý prostředek podle nároku 21 pro orální nebo sublinguální podání, obsahující jako léčivou látku peptid, který je vybrán ze skupiny Desmopressin, Lysipressin nebo Glypressin.
  24. 24. Léčivý prostředek podle nároku 21 pro bukální podání, obsahující jako léčivou látku peptid, který je vybrán ze skupiny virostatik a adjuvans nebo releasing faktor pro luteizační a folikuly stimulujících hormonů.
  25. 25. Léčivý prostředek podle nároku 21 pro použití přímo do otevřené rány, obsahující jako léčivou látku peptid, který je vybrán ze skupiny Glypressin Dalargin nebo AdDP.
CZ2016-826A 2016-12-22 2016-12-22 Léčivý prostředek s nosičem na bázi hyaluronanu a/nebo jeho derivátů, způsob výroby a použití CZ2016826A3 (cs)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2016-826A CZ2016826A3 (cs) 2016-12-22 2016-12-22 Léčivý prostředek s nosičem na bázi hyaluronanu a/nebo jeho derivátů, způsob výroby a použití
EP17838172.9A EP3558385B1 (en) 2016-12-22 2017-12-19 Method of preparation of a medical preparation with a carrier based on water insoluble hyaluronan conjugated to amino acids or peptides
KR1020197016861A KR20190099402A (ko) 2016-12-22 2017-12-19 아미노산 또는 펩타이드에 접합된 비수용성 히알루로난 기반 담체를 갖는 의약 제제, 그 제조 방법, 및 용도
PCT/CZ2017/050061 WO2018113802A1 (en) 2016-12-22 2017-12-19 Medical preparation with a carrier based on water insoluble hyaluronan conjugated to amino acids or peptides, method of preparation and use thereof
RU2019122336A RU2019122336A (ru) 2016-12-22 2017-12-19 Медицинский препарат с носителем на основе гиалуронана и/или его производных, способ его изготовления и его применение
JP2019534706A JP2020502251A (ja) 2016-12-22 2017-12-19 アミノ酸又はペプチドに結合した水不溶性ヒアルロナンをベースとするキャリアーを用いた医薬製剤，その調製法及びその使用
BR112019011880A BR112019011880A2 (pt) 2016-12-22 2017-12-19 método de preparação de uma preparação médica à base de hialuronano e/ou palmitoil hialuronano ou formil hialuronano e preparação médica com um veículo à base de hialuronano e/ou palmitoil hialuronano ou formil hialuronano
US16/472,635 US20190328891A1 (en) 2016-12-22 2017-12-19 Medical preparation with a carrier based on hyaluronan and/or derivatives thereof, method of preparation and use thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2016-826A CZ2016826A3 (cs) 2016-12-22 2016-12-22 Léčivý prostředek s nosičem na bázi hyaluronanu a/nebo jeho derivátů, způsob výroby a použití

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ2016826A3 true CZ2016826A3 (cs) 2018-07-04

Family

ID=67807865

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2016-826A CZ2016826A3 (cs) 2016-12-22 2016-12-22 Léčivý prostředek s nosičem na bázi hyaluronanu a/nebo jeho derivátů, způsob výroby a použití

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20190328891A1 (cs)
EP (1) EP3558385B1 (cs)
JP (1) JP2020502251A (cs)
KR (1) KR20190099402A (cs)
BR (1) BR112019011880A2 (cs)
CZ (1) CZ2016826A3 (cs)
RU (1) RU2019122336A (cs)
WO (1) WO2018113802A1 (cs)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3715374A1 (en) 2019-03-23 2020-09-30 Ablevia biotech GmbH Compound for the sequestration of undesirable antibodies in a patient
US11986536B2 (en) 2019-03-23 2024-05-21 Ablevia Biotech Gmbh Compound for the sequestration of undesirable antibodies in a patient
KR102719543B1 (ko) 2019-06-03 2024-10-17 아이홀 코포레이션 히알루로난 접합체 및 이의 용도
CN115417914B (zh) * 2019-10-11 2024-10-01 润辉生物技术（威海）有限公司 一种乙酰透明质酸寡肽及其制备与应用方法
US11458204B2 (en) 2020-06-02 2022-10-04 Aihol Corporation Method for improving substitution rate and/or substitution efficiency of hyaluronan-drug conjugates
IT202000014017A1 (it) * 2020-06-11 2021-12-11 Fidia Farm Spa Nuovi derivati ottenuti da acido ialuronico e carnosina
JP7623668B2 (ja) 2020-08-07 2025-01-29 真人 中村 機能性微粒子
EP4522663A1 (en) * 2022-05-13 2025-03-19 University of Vermont and State Agricultural College Antioxidant derivative of hyaluronic acid
CN120484250B (zh) * 2025-07-15 2025-09-23 四川大学 一种用于穿透纤维软骨的阳离子纳米载体及其制备方法与应用

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4582865A (en) 1984-12-06 1986-04-15 Biomatrix, Inc. Cross-linked gels of hyaluronic acid and products containing such gels
US4851521A (en) 1985-07-08 1989-07-25 Fidia, S.P.A. Esters of hyaluronic acid
US4937270A (en) * 1987-09-18 1990-06-26 Genzyme Corporation Water insoluble derivatives of hyaluronic acid
US5356883A (en) * 1989-08-01 1994-10-18 Research Foundation Of State University Of N.Y. Water-insoluble derivatives of hyaluronic acid and their methods of preparation and use
ITPD980169A1 (it) 1998-07-06 2000-01-06 Fidia Advanced Biopolymers Srl Ammidi dell'acido ialuronico e dei suoi derivati e processo per la loro preparazione.
GB9902412D0 (en) 1999-02-03 1999-03-24 Fermentech Med Ltd Process
CZ302856B6 (cs) 2006-09-27 2011-12-14 Cpn Spol. S R. O. Zpusob prípravy derivátu polysacharidu
EP2360188B1 (en) * 2008-11-05 2014-09-17 National University Corporation Tokyo Medical and Dental University Hyaluronic acid derivative and pharmaceutical composition thereof
CZ2009168A3 (cs) 2009-03-17 2010-07-21 Contipro C, A.S. Zpusob prípravy derivátu kyseliny hyaluronové pomocí O-acyl-O´-alkylkarbonátu v prítomnosti substituovaného pyridinu
WO2011097342A1 (en) * 2010-02-04 2011-08-11 University Of Utah Research Foundation Hydrophobically-modified hyaluronan and methods of making and using thereof
CZ20101001A3 (cs) 2010-12-31 2012-02-08 Cpn S.R.O. Hyaluronová vlákna, zpusob jejich prípravy a použití
WO2012101612A1 (en) 2011-01-30 2012-08-02 The National Institute for Biotechnology in the Negev Ltd. Fmoc solid phase peptide synthesis on biodegradable support and uses thereof
CZ304651B6 (cs) 2012-05-11 2014-08-20 Contipro Biotech S.R.O. Způsob přípravy mikrovláken, způsob výroby krytů ran, kryty ran a zařízení pro přípravu polysacharidových vláken
EP2870538B8 (en) 2012-07-03 2019-11-27 Violin Systems LLC Synchronization of a dispersed raid group
CZ304654B6 (cs) 2012-11-27 2014-08-20 Contipro Biotech S.R.O. Nanomicelární kompozice na bázi C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy nanomicelární kompozice a stabilizované nanomicelární kompozice a použití
CZ2012843A3 (cs) 2012-11-27 2014-02-05 Contipro Biotech S.R.O. Nekonečná vlákna na bázi hyaluronanu, selektivně oxidovaného v poloze 6 N-acetyl-D-glukosaminové části, jejich příprava, použití, nitě, střiže, příze, textilie a způsob jejich úpravy
CZ304303B6 (cs) 2012-11-27 2014-02-19 Contipro Biotech S.R.O. Vlákna založená na hydrofobizovaném hyaluronanu, způsob jejich přípravy a použití, textilie na jejich bázi a použití
CZ309295B6 (cs) 2015-03-09 2022-08-10 Contipro A.S. Samonosný, biodegradabilní film na bázi hydrofobizované kyseliny hyaluronové, způsob jeho přípravy a použití

Also Published As

Publication number Publication date
RU2019122336A (ru) 2021-01-22
EP3558385B1 (en) 2021-08-11
BR112019011880A2 (pt) 2019-11-26
JP2020502251A (ja) 2020-01-23
RU2019122336A3 (cs) 2021-03-02
US20190328891A1 (en) 2019-10-31
EP3558385A1 (en) 2019-10-30
WO2018113802A1 (en) 2018-06-28
KR20190099402A (ko) 2019-08-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ2016826A3 (cs) Léčivý prostředek s nosičem na bázi hyaluronanu a/nebo jeho derivátů, způsob výroby a použití
US20230190864A1 (en) Purified amphiphilic peptide compositions and uses thereof
AU733716B2 (en) Polymers containing polysaccharides such as alginates or modified alginates
KR100849185B1 (ko) 키토산 또는 히알루론산-폴리에틸렌옥사이드 및키토산-히알루론산-폴리에틸렌옥사이드를 기저로 하는하이드로젤과　 이의 제조방법
CA2723824C (en) Biocompatible and biodegradable elastomeric polymers
JP5059787B2 (ja) セルロース誘導体およびその製造方法
ES2708929T3 (es) Membrana de colágeno de superficie activa por péptido
CN103384537A (zh) 与多糖交联的蛋白质的制备和/或制剂
CN103608353A (zh) 肽交联生物活性聚合物材料
JP6460978B2 (ja) 糖鎖−ポリペプチド複合体
Karel et al. Stabilization of hyaluronan-based materials by peptide conjugation and its use as a cell-seeded scaffold in tissue engineering
JP5406281B2 (ja) 多糖類誘導体およびそのハイドロゲル
EP2236522A1 (en) Cellulose derivative and hydrogel thereof
EP1806367A2 (en) Polymers containing polysaccharides such as alginates or modified alginates
JP4911523B2 (ja) 温度応答性配列を含むデプシペプチド構造と親水性高分子構造からなるブロック共重合体
CN101817873A (zh) 一种促进细胞黏附的多肽及其制备方法
Thijssen et al. Nature-inspired dual purpose strategy toward cell-adhesive PCL networks: C (-linker-) RGD incorporation via thiol-ene crosslinking
Uysal Peptide hydrogels containing cell attachment molecules
Hassert et al. On‐resin synthesis of an acylated and fluorescence‐labeled cyclic integrin ligand for modification of poly (lactic‐co‐glycolic acid)
KR100493461B1 (ko) 접착분자가 부착된 천연고분자, 그의 제조방법 및 그의 용도
Baek Design of self-assembling nucleo-peptide hydrogels for molecular self-assembly study and functional biomaterials development
DK3031466T3 (en) PURIFIED AMFIFILE PEPTIME COMPOSITIONS AND APPLICATIONS THEREOF
WO2024248084A1 (ja) 樹脂組成物、医療用材料、及び、樹脂組成物を生産する方法
AU2014388585B2 (en) Hemostatic pharmaceutical composition