BR112019011880A2 - método de preparação de uma preparação médica à base de hialuronano e/ou palmitoil hialuronano ou formil hialuronano e preparação médica com um veículo à base de hialuronano e/ou palmitoil hialuronano ou formil hialuronano - Google Patents

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Flegel Martin
Sulakova Romana
Frycak Roman
Sogorkova Jana
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Zapotocky Vojtech
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Abstract

a invenção se refere a uma preparação médica com um veículo à base de hialuronano e seus derivados, caracterizado pelo fato de compreender um conjugado de ácido hialurônico e/ou seus derivados com uma substância médica, de acordo com a fórmula geral a-s-n (x), em que a é a substância médica s é o meio de ligação da substância médica com o veículo n é o veículo à base de ácido hialurônico e/ou seus derivados m é 10 a 1250, n é 100 a 12500, e ao seu respectivo uso e produção. a nova preparação médica pode ser utilizada no campo da medicina e cosméticos.

Description

MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UMA PREPARAÇÃO MÉDICA À BASE DE
HIALURONANO E/OU PALMITOIL HIALURONANO OU FORMIL
HIALURONANO E PREPARAÇÃO MÉDICA COM UM VEÍCULO À BASE DE
HIALURONANO E/OU PALMITOIL HIALURONANO OU FORMIL
HIALURONANO
CAMPO DA INVENÇÃO
[001 ] A invenção se refere a uma preparação
médica com veículo à base de hialuronano e/ou seus
derivados, em que o veículo utilizado transporta
diretamente o agente ativo e se apresenta de várias formas.
A invenção também se refere ao método de produção e ao uso
da referida preparação médica.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] O ácido hialurônico (hialuronano, HA) é conhecido como um glicosaminoglicano não sulfatado composto de duas unidades repetidas de ácido D-glucurônico e Nacetil-D-glucosamina, ligado por ligações glicosídicas β(1^4) e β(1^3), vide a Figura 1. O peso molecular do ácido hialurônico nativo está na faixa de 5.104 a 5.106 g.mol-1. Este polissacarideo significativamente hidrofílico faz parte dos tecidos conjuntivos, da pele, do liquido sinovial das articulações e desempenha um papel importante em muitos processos biológicos, como a organização de proteoglicanos, a hidratação e a diferenciação celular. Considerando que este polímero é biocompatível, inerente ao corpo e degradável, torna-se um substrato adequado para a engenharia de tecidos ou como um veículo de substâncias bioativas1.
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2/40 [003] O uso de hialuronano e seus derivados com propriedades modificadas ou melhoradas no campo da medicina é bastante amplo. A modificação química do hialuronano é normalmente realizada em dois centros de reação: no grupo carboxil e no grupo hidroxil primário. Um grupo amino também pode ser utilizado após divagem do grupo N-acetil. Não está claro qual dos grupos hidroxil da unidade sacarídea participa da reação; muitos resultados indicam a preferência do hidroxil primário (C6) da unidade Nacetilglucosamina devido à maior reatividade deste grupo.
[004] O grupo carboxil pode ser convertido em amido ou éster. Agentes ativadores convencionalmente usados para preparação química de peptideos, como carbodumidas ou outros agentes, tais como iodeto de 2-cloro-lmetilpiridiniomio6, 2-cloro-dimetoxi-l,3,5-triazina7, carbonildiimidazol8, etc. pode ser utilizado para a conversão do grupo carboxil em amida. Depois de aumentar a reatividade de carboxil devido à sua conversão em um intermediário mais reativo, adiciona-se amina para proporcionar amida pela reação de condensação. Pode ser formado éster por uma reação de alquilação com alquilhalogenetos9'10, síntese de éster metílico por uma reação
ΊΊΊΟ Ί ”5 Ί com diazometano ' , uso de epóxidos ~ etc.
[005] A modificação de um grupo hidroxil leva à formação de uma ligação éter ou éster. Éter pode ser facilmente preparado pela reação com epóxidos1/_2°, divinilsulfona , etilenossulfeto , ou pela formação de hemiacetal com o uso de glutaraldeído25'26 . Podem ser usados anidridos simétricos ou mistos para uma síntese de O O ester, ou e usado 0-acil-0 -alquilcarbonato como agente
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3/40 ativador. Essas modificações estruturais levam a uma reação de reticulação para formar hidrogéis.
[006] A Síntese de Peptídeos em Fase Sólida, SPPS, é um método em que os grupos amino individuais são gradualmente ligados ao veículo polimérico. Grupos protetores (permanentes ou temporários) são utilizados para todos os aminoácidos para diminuir o risco de reações secundárias e a formação de sequências indesejáveis. Grupos protetores como Fmoc e Boc são os mais utilizados, onde o grupo protetor Fmoc pode ser clivado em um ambiente básico e o grupo protetor Boc pode ser clivado em um ambiente ácido. A síntese de peptídeos em fase sólida compreende a repetição dos ciclos de condensação - lavagem - divagem dos grupos protetores - lavagem. O peptídeo sintetizado permanece ancorado ao veículo polimérico até se obter a sua sequência desejada. Em seguida, são realizadas divagem do veículo e purificação.
[007] Atualmente, existe um esforço para usar os veículos que podem ser biocompatíveis e, opcionalmente, biodegradáveis. Foram descritos os veículos baseados em polissacarídeos de alginato, ágar, quitina, hialuronano ou algodão. Até agora, o peptídeo foi sempre clivado a partir do veículo. Não foram utilizadas suas propriedades biológicas benéficas que podem influenciar positivamente as o-ι Ó 9 propriedades biológicas do peptídeo ' sintetizados ou ancorados no veículo.
[008] Os alginatos são os veículos mais comuns utilizados para a reação de peptídeos e aminoácidos com polissacarídeos. 0 alginato é um polissacarídeo linear carregado negativamente, consistindo em unidades
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4/40 monoméricas repetidas de ácido β-D-manúrico e ácido a-Lgulurônico, ligado por ligações O-glicosidicas (1^4), como é mostrado na fórmula estrutural do alginato da Figura 2.
[009] Foi descrito o uso de alginato como forma de fármaco para fins farmacêuticos; no entanto, os processos foram mais frequentemente utilizados para ancoragem não covalente destes fármacos numa matriz ou num gel. O gel de alginato tem sido usado também para procedimentos analíticos de captura de peptídeos de alto peso molecular, principalmente enzimas, organelas celulares ou células inteiras [010] A ligação covalente de peptídeos e fármacos permite a sua utilização como regimes de dosagem sofisticados que melhoram a farmacocinética e a biodisponibilidade, o que aumenta o potencial clínico de um fármaco. O conjugado peptídeo-alginato é formado por uma ligação amídica entre o grupo carboxil do alginato e o o o_ o c grupo ammo do peptídeo [011] Os alginatos com peptídeos ligados covalentemente podem ser utilizados no tratamento de uma lesão. A cicatrização de feridas é uma reação tecidual à sua lesão. É um processo biológico complicado que compreende quimiotaxia, proliferação celular, produção de proteínas extracelulares, neovascularização etc. Uma das possibilidades do tratamento de cicatrização de feridas é influenciar o processo de cicatrização por agentes de o c estimulação naturais, como o fator de crescimento .
[012] Foram preparados materiais à base de alginatos, modificados por um peptídeo, e sua efetividade no processo de cicatrização de feridas foi estudada na pele
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5/40 lesada in vivo. Os coelhos tratados com o curativo de alginato contendo o peptídeo híbrido Ser-Ile-Arg-Val-X-ValX-Pro-Gly (em que X = Ala ou Gly) apresentaram epitelização significativamente maior e maior volume de tecido regenerado em comparação com outros peptídeos Ser-Ile-LysVal-Ala-Val e Val-Pro-Val-Ala-Pro-Gly que também foram o c ancorados no curativo de alginato .
[013] A celulose na forma de papel também foi usada para a preparação dos peptídeos. Do ponto de vista químico, a celulose é um polissacarídeo linear que consiste em unidades monoméricas repetitivas de d-glicose ligadas por ligações O-glicosídicas β (1^4 ) , de acordo com a fórmula estrutural da Figura 3. Os peptídeos podem ser obtidos com baixo rendimento apenas o que não é desejável. O papel também tem a desvantagem de baixa estabilidade
31,36 mecanica [014] O algodão é a forma mais pura de celulose, exceto a celulose microbiana, e pode ser obtido em várias formas e formatos; tem sido estudada a possibilidade do uso de algodão como veículo de SPPS. Neste caso, a ancoragem do peptídeo foi realizada por meio de uma ligação de éster entre o grupo hidroxil do algodão e o grupo carboxil do peptídeo. A síntese foi mais frequentemente realizada em DIC/HOBt/DMAP em DMF31'37'38 .
[015] Atualmente, estão disponíveis veículos à base de hialuronano na forma de fibras39-42, películas finas43'44 , ou tecidos não tecidos40. A utilização destas formas de perspectiva podería afastar algumas das desvantagens descritas dos veículos de polissacarídeos
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6/40 utilizados até agora. Há ainda a falta de veículos adequados de drogas farmacêuticas.
[016] O novo modo descrito nesta invenção tem a vantagem da utilização de um veículo à base de hialuronano na forma de fibras, películas finas ou tecidos não tecidos para a síntese em fase sólida. Este veículo não se altera durante a reação, isto é, permanece na forma de fibras, películas finas ou tecidos não tecidos. Assim, é uma síntese em fase sólida em que o peptídeo é construído por aminoácidos individuais ou está ligado, como um todo, ao material de hialuronano. Até agora, o hialuronano foi utilizado para a modificação em solução, isto é, o hialuronano foi dissolvido e a reação realizada. Então a derivada foi usada para a preparação do material. A diferença entre a síntese em fase líquida e em fase sólida é que, no caso de síntese de solução e posterior fiação, o peptídeo também está presente dentro da fibra, portanto, é menos disponível. A síntese em fase sólida não só economiza os custos, quando o peptídeo está apenas na superfície, como também poupa da otimização dos processos de fiação que são diferentes para derivados individuais.
RESUMO DA INVENÇÃO [017] As desvantagens acima mencionadas são resolvidas pelo método de preparação da preparação médica com um veículo à base de hialuronano e/ou seus derivados, e pela preparação médica com o veículo à base de hialuronano e seus derivados, definidos nas reivindicações anexas.
[018] A preparação médica de acordo com a invenção compreende o conjugado de ácido hialurônico e seus derivados com uma substância medicinal de fórmula geral:
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A-S-N (X), ou
em que
A é a substância médica selecionada a partir do grupo que consiste em aminoácidos e peptídeos,
S é o método de ligação da substância médica com o veículo e é selecionado a partir do grupo que consiste em -O- ou -NH-,
N é o veículo à base de ácido hialurônico e/ou seus derivados, m é 10 a 1250, n é 100 a 12500.
]019: ] A preparação médica de acordo com a
invenção é caracterizada por ser insolúvel em água e
biodegradável.
:02o: ] A preparação médica de acordo com a
invenção é ainda caracterizada pelo fato de o veículo
permitir a preparação do conjugado ligado a este, sem que o veículo seja dissolvido. Em outras palavras, o veículo permanece insolúvel durante todo o processo de preparação, isto é, na fase sólida, em que ao mesmo tempo mantém a sua biodegradabilidade.
[021] A preparação médica de acordo com a invenção é caracterizada pelo fato de o veículo ter a forma
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de uma fibra sem fim, fio, tecidos, película fina, fibras
descontínuas e/ou tecidos não tecido.
[022] A preparação médica de acordo com a
invenção é ainda caracterizada pelo fato de a substância
médica estar ligada ao veículo na posição 6 da parte
glucosamina do conjugado de ácido hialurônico e seus
derivados de fórmula geral X.
[023] A substância médica é preferencialmente
ancorada a ácido derivados por uma hialurônico e seus ligação de éster (Esquema ou por aminação redutiva (Esquema
R-COOH
Esquema 1 - Esterificação, R-COOH é aminoácido ou peptídeo
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9/40
Esquema 2 - Aminação redutiva, R é peptídeo ou aminoácido, e R1 é amida ou metil éster [024] 0 veículo é de preferência ácido hialurônico, palmitoil hialuronano ou formil hialuronano, em que o veiculo tem preferencialmente o peso molecular na faixa de 1,5 x 104 a 2,5 x 106 g.mol-1.
[025] O objeto da invenção também é um modo de preparação da preparação médica com um veiculo à base de hialuronano e seus derivados caracterizado pelo fato de o grupo carboxil do aminoácido ou peptídeo na substância médica A, em que a substância médica também compreende um grupo N-terminal protetor, ser ativado com um agente de condensação num solvente polar aprótico para formar um intermediário reativo I, que reage com o veiculo na presença de uma base orgânica e um catalisador para formar um conjugado de ácido hialurônico e seus derivados com a
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10/40 substância médica. Em seguida, o grupo N-terminal protetor da substância médica é clivado num meio básico, de preferência selecionado a partir do grupo de 20% de piperidina em N,N-dimetilformamida, 2% de 1,8-diazabiciclo [ 5.4.0]undec-7-eno em N,N-dimetilformamida, 30% de tertbutilamina em N,N-dimetilformamida, preferencialmente em 20% de piperidina em N,N-dimetilformamida.
[026] A substância médica A é selecionada a partir do grupo que consiste em aminoácidos e peptideos, sendo ligada ao veiculo diretamente ou por um ligante linear à base de peptideos formados pelos aminoácidos hidrofóbicos Xaa, preferencialmente Xaa-Ahx-Ahx-Xaa.
[027] O método de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de a formação do conjugado de ácido hialurônico e seus derivados ser realizada à temperatura de 20°C a 40°C, preferencialmente à temperatura de 22°C a 25°C por 2 a 48 horas, preferencialmente por 24 horas.
[028] O método de acordo com a invenção é ainda caracterizado pelo fato de o agente de condensação utilizado ser preferencialmente selecionado a partir do grupo de 4-nitrofenol, N-hidroxisuccinimida, 2,4,5triclorofenol, 2,3,4,5,6-pentafluorofenol, 2,3,4,5,6pentaclorofenol, N, Ν'-diisopropilcarbodiimida, N,N'diciclohexilcarbodiimida, hexafluorofosfato de ΙΕ bis (dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazol[4,5-b] piridinio-3-óxido, l-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida, etilcloroformiato, hexafluorofosfato de 2(IH-benzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio, hexafluoro fosfato de benzotriazol-l-il-oxi-tris(dimetilamino)fosfônio, tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-l-il)
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Ν, Ν, Ν' , Ν' - tetrametHuron!o, 4-trietilamino-diciclohexil carbodiimida p-toluensulfonato, anidrido de ácido propilfosfônico, de preferência Ν,Ν'diisopropilcarbodiimida.
[029] O método de acordo com a invenção é ainda caracterizado pelo fato de o solvente aprótico polar utilizado ser selecionado a partir do grupo que consiste em N,N-dimetilformamida, dimetilsulfóxido, N-metil-2pirrolidona, acetonitrila, diclorometano, tetraidrofurano, 1,4-dioxano, preferivelmente N,N-dimetilformamida.
[030] O método de acordo com a invenção é ainda caracterizado pelo fato de a base orgânica utilizada ser selecionada a partir do grupo que consiste em trietilamina, piridina, morfolina, N-metilmorfolina, N,N'diisopropiletilamina, imidazol.
[031] O método de acordo com a invenção também é caracterizado pelo fato de o catalisador utilizado ser selecionado a partir do grupo que consiste em cianoacetato de etil(hidroxiimino), hidroxilbenzotriazol, N,Ndimetilaminopiridina ou l-hidroxi-7-azabenzotriazol, preferencialmente as combinações de cianoacetato de etil(hidroxiimino) e N,N-dimetilaminopiridina.
[032] O método de acordo com a invenção é também caracterizado pelo fato de a quantidade de aminoácidos ou peptídeos utilizada, isto é, a substância médica, corresponder a 1 a 5 equivalentes, de preferência 3 equivalentes, com base no dímero de ácido hialurônico ou seus derivados, a quantidade do agente de ativação (condensação) utilizado corresponder a 0,1 a 5 equivalentes, de preferência 3 equivalentes, com base no
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12/40 dimero de ácido hialurônico ou seus derivados, a quantidade da base utilizada corresponder até 10 equivalentes, com base no dimero de ácido hialurônico ou seus derivados e a quantidade do catalisador utilizado corresponder a 0,1 a 5 equivalentes, de preferência 3 equivalentes de cianoacetato de etil(hidroxiimino) e 0,3 equivalentes de N,Ndimetilaminopiridina, por dimero de ácido hialurônico ou seus derivados. Na configuração preferida da invenção, a relação molar da substância médica, agente de condensação, catalisador e dimero de ácido hialurônico é 1:1:1:1.
[033] A preparação médica na forma do conjugado de acordo com a invenção é para uso médico como uma forma de dosagem de um peptídeo ou aminoácido ativo, destinado à administração dérmica, sublingual, oral, bucal ou local numa ferida aberta.
[034] A preparação médica de acordo com a invenção para administração dérmica pode conter, por exemplo, o peptídeo Dalargin como substância médica. A preparação médica de acordo com a invenção para administração oral ou sublingual pode conter, por exemplo, o peptídeo selecionado a partir do grupo de Desmopressin, Lysipressin ou Glypressin, como substância médica. A preparação médica de acordo com a invenção para administração oral pode conter, por exemplo, o peptídeo selecionado a partir do grupo de medicamentos antivirals e adjuvantes, ou fator de liberação para hormônio luteinizante e folículo estimulante. A preparação médica de acordo com a invenção para a administração direta a uma ferida aberta pode conter, como substância médica, por
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13/40 exemplo, o peptídeo selecionado a partir do grupo de Glypressin, Dalargin ou AdDP como um imuno-estimulante.
[035] Assim, o objeto da invenção consiste nos novos compostos da fórmula geral
A-S-N (X), em que o veículo sólido N é feito de hialuronano e seus derivados na forma de uma fibra sem fim, fio, tecido, película fina, fibra cortada e tecido não tecido compreendendo a substância médica A ligada por meio da ligação S, e o método da preparação deste sistema complexo pelo procedimento em fase sólida ou ligando a substância médica a um sistema complexo, conforme descrito nos exemplos abaixo.
[036] O método de ligar a substância médica ao veículo é realizado por uma ligação de éster ou por aminação redutiva. Este veículo sólido biocompatível e biodegradável é caracterizado pelo fato de não necessitar de ser clivado da substância médica durante as suas várias atividades, principalmente médicas e de poder, de preferência, atuar ainda como forma de dosagem moderna não invasiva facilitando a penetração dos peptídeos ou aminoácidos biologicamente ativos ligados ao referido veículo biocompatível através da mucosa e pele, e assim serve como um material complexo e adequado utilizado para aplicações médicas em medicina humana e veterinária. A preparação médica de acordo com a invenção atua como um todo durante a atividade biológica e a substância médica pode ser liberada lentamente do veículo, de um modo prolongado, que é subsequentemente eliminado naturalmente e
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14/40 intrinsecamente. O veiculo também pode afetar o efeito total da substância médica ligada a ele e facilitar seu uso.
[037] A Tabela 1 apresenta os peptideos e seus efeitos médicos e o método de sua administração.
[038] Ela mostra que a preparação médica de acordo com a invenção para administração dérmica compreende o peptídeo Dalagrin como substância médica tendo um efeito de cura, ou oxitocina tendo efeito hormonal. Para administração oral, bucal ou sublingual, a preparação médica de acordo com a invenção compreende o peptídeo Desmopressin mostrando um efeito antidiurético, a influencia na coagulação do sangue pelo aumento do fator VIII, Lysipressin tendo efeito pressórico, principalmente em cirurgia dentária, ou Glypressin (Terlipressin) com um efeito pressórico prolongado adequado para parar o sangramento. Para administração oral, a preparação médica de acordo com a invenção compreende um peptídeo como substância médica, utilizado como agente antiviral e adjuvante, por exemplo AdDP, ou fator de liberação para luteinização e hormônios folículo-estimulantes (Fertirelin, Lecirelin). A preparação médica de acordo com a invenção para administração local numa ferida aberta compreende o peptídeo como a substância médica utilizada para parar o sangramento (Terlipressin) e Dalargin para acelerar a cicatrização de feridas, opcionalmente AdDP para estimulação local do sistema imunológico.
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TABELA 1 - Tabela de peptídeos
Possível efeito farmacológico Afeta a atividade de ejeção de leite Afeta a diurese e as condições de sangramento Efeitos de cura Afeta fator de liberação para luteinização e hormônios foliculo estimulantes Afeta o fator de liberação para luteinização e hormônios foliculo estimulantes Afeta a pressão arterial Afeta a pressão arterial Agente antiviral e adjuvante Afeta propriedades adesivas (in vitro)
Sequência n- SEQ ID 1 SEQ ID 2 SEQ ID 3 SEQ ID 4 SEQ ID 5 SEQ ID 6 SEQ ID 7 SEQ ID 8 SEQ ID 9 SEQ ID 10 SEQ ID 11 SEQ ID 12 SEQ ID 13 SEQ ID 14 SEQ ID 15
Sequência peptídica s >1 0 l to 3 >! Φ O 1 1 h 0 to U| >i Q-l O to Φ O 1 T1 £ to Λ 1 1--1 'Ή 0 X! 1 a r-H H to ui Ό Eh 1 to O K 1 0 i 0 to < o 1 1 Q 1 s-1 o ô S4 S pj 1 ra tn >< 75 O -H l s-i Õ 42 ra u a to Cb -H 1 U Eh 1 u Λ s H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg-OH pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-tertLeu-Leu-Arg-Pro-NHEt pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NHEt Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2 (disulphide bridge Cys1-Cys6) Γ4 K s >1 0 1 to to >! >1 O l 1 H 0 to U| >1 Q-l 0 to Φ Ο Ό 1 T1 £ to Λ l 1--1 'Ή 0 45 i a 0 gj 4=1 p_, to UI Ό Eh 1 to O Ala-igln-NH-Ad Ac-Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Nle-OH Fmoc-Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Nle-OH Ac-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-OH Fmoc-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-OH Ac-Arg-Gly-Asp-Ahx-Ahx-Nle-OH Fmoc-Arg-Gly-Asp-Ahx-Ahx-Nle-OH Ac-Ahx-Ahx-Arg-Gly-Asp-OH Fmoc-Ahx-Ahx-Arg-Gly-Asp-OH
Nome do peptídeo Oxitocin Desmopressin Dalargin Lecirelin Fertirelin Terlipressin (Glipressin) Lisipressin (8-Lysvasopressin) AdDP
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BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[039] A Figura 1 anexa mostra o hialuronano em
que R = H+ ou Na+ e n é igual a 100 a 12500.
[040] A Figura 2 mostra a fórmula estrutural do
alginato •
[041] A Figura 3 mostra a fórmula estrutural da
celulose •
[042] A Figura 4 mostra a fórmula estrutural da
preparação médica de acordo com a invenção, em que A é a
substância médica, S é o meio de ligação da substância
médica a um veículo , N é o veículo à base de ácido
hialurônico e seus derivados, m é 10 a 1250, n é 100 a 12500.
[043] A Figura 5 mostra a fórmula estrutural do ácido hialurônico ou seus derivados com o peptídeo ligado, em que HYA é o ácido hialurônico ou seus derivados e o peptídeo compreende 7 unidades de lisina dispostas numa estrutura de dendrimero.
[044] A Figura 6 mostra células NHDF coloridas com Dil aderentes a uma fibra de HYA nativo compreendendo motivos RGD. As imagens foram obtidas por meio de microscópio de fluorescência após 48 horas de cultivo.
[045] A Figura 7 mostra alterações na presença de população de células NHDF coloridas com Dil não aderentes. As imagens foram obtidas por meio de microscópio de fluorescência após 1, 2, 4 e 7 dias de cultivo.
[046] O conjugado de peptídeo com o material à base de hialuronano de acordo com a invenção foi preparado e testado com sucesso pelos autores nas instalações do requerente - Contipro a.s., Dolni Dobruc, CZ.
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CONFIGURAÇÕES PREFERIDAS DA INVENÇÃO [047] A fibra da HYA nativo e o tecido não tecido de HYA nativo foram preparados de acordo com o processo descrito na patente WO/2013/167098. A fibra de palmitoil HYA foi preparada de acordo com o processo descrito na patente WO/2014/082611.
[048] Nos exemplos seguintes, o termo equivalente (eq.) refere-se a uma unidade repetitiva da respectiva forma de hialuronano. A porcentagem é por volume, se não for indicada de outra forma.
[049] O peso molecular das formas de partida de hialuronano é o peso molecular médio ponderado determinado pelo método SEC-MALLS.
[050] Nos exemplos, apenas para fins de análise subsequente, a norleucina, como aminoácido não essencial, foi primeiro ligada para determinar facilmente a ocorrência proporcional de aminoácidos. No entanto, a ligação de norleucina não é condição necessária e não se destina a limitar o âmbito da invenção.
Exemplo 1
Ancoragem de Fmoc-Nle-OH na fibra de HYA nativo [051] 1 m da fibra de HYA nativo (12 mg, 0,03 mmol, Mw = 3.105 g.mol-1) foi colocada num reator de seringa de 2 ml equipado com frita; a fibra foi repetidamente lavada com DMF. A solução de 3 eq. de Fmoc-Nle-OH, 3 eq. OxymaPure e 0,3 eq. de DMAP em 0,5 ml de DMF anidra foi preparada fora do reator; depois de dissolver todos os componentes 3 eq. de DIC foram adicionados para ativar o grupo carboxil de um aminoácido. Esta solução foi
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18/40 transferida ao reator para a fibra. A reação prosseguiu à temperatura de 18 a 23°C durante as 20 horas seguintes e
foi encerrada . por filtração da solução da reação. A fibra
foi então lavada com 3 x 1,5 ml de DMF, 3 x 1,5 ml de DCM,
3 x 1,5 ml de IPA, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de DEE.
[052] 0 rendimento da reação de condensação foi
determinado pelo teste de liberação de Fmoc como a
substituição S = 0 ,01862 mmol/g.
Exemplo 2
Preparação de H-Nle-O-HYA [053] 1 m da fibra de Fmoc-Nle-O-HYA preparada de acordo com o Exemplo 1 foi colocada num reator de seringa de 2 ml equipado com frita; a fibra foi repetidamente lavada com DMF. O grupo protetor Fmoc foi clivado por meio da adição de 1,5 ml de solução a 20% de piperidina em DMF ao reator da fibra. A reação prosseguiu durante 5 minutos à temperatura de 18 a 23°C. A reação foi repetida enquanto se prolongava o tempo de divagem para 20 minutos e depois foi encerrada por filtração da solução da reação. A fibra foi então lavada com 3 x 1,5 ml de DMF, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x
1,5 ml de IPA, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de DEE.
[054] A reação é quantitativa. A liberação do grupo amino foi confirmada pela realização da reação de confirmação da ninidrina (teste de Kaiser).
Exemplo 3
Ancoragem de Fmoc-Nle-OH na fibra de HYA nativo [055] 1 m de fibra de HYA nativo (12 mg, 0,03 mmol, Mw = 3.105 g.mol-1) foi colocada num reator de seringa de 2 ml equipado com frita, a fibra foi lavada
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19/40 repetidamente com THF. Uma solução de 3 eq. de Fmoc-Nle-OH, 3 eq. OxymaPure e 0,3 eq. de DMAP em 0,5 ml de THF; depois de dissolver todos os componentes, 3 eq. de DIC foram adicionados para ativar o grupo carboxil do aminoácido. Esta solução foi transferida ao reator com a fibra. A reação prosseguiu à temperatura de 18 a 23°C durante as 20 horas seguintes e foi encerrada por filtração da solução da reação. A fibra foi então lavada com 3 x 1,5 ml de THF, 3 x
1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de IPA, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x
1,5 ml de DEE. O rendimento da reação de condensação foi
determinado pelo teste de liberação de Fmoc como a
substituição S = 0 ,01759 mmo1/g.
Exemplo 4
Ancoragem de Fmoc- Nle-OH na fibra de HYA nativo
[056] 1 m da fibra de HYA nativo (12 mg, 0,03
mmol, Mw = 3.105 g.mol-1) foi colocada num reator de seringa de 2 ml equipado com frita; a fibra foi repetidamente lavada com DMF. Uma solução de 1 eq. de Fmoc-Nle-OH, 1 eq. OxymaPure e 0,3 eq. de DMAP em 0,5 ml de DMF anidra foi preparada fora do reator; depois de dissolver todos os componentes, 1 eq. de DIC foi adicionado para ativar o grupo carboxil do aminoácido. Esta solução foi transferida ao reator para a fibra. A reação prosseguiu à temperatura de 18 a 23°C durante as 20 horas seguintes e foi encerrada por filtração da solução da reação. A fibra foi então lavada com 3 x 1,5 ml de DMF, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de IPA, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de DEE.
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20/40 [057] O rendimento da reação de condensação foi determinado pelo teste de liberação de Fmoc como a substituição S = 0,01804 mmol/g.
Exemplo 5
Preparação de Fmoc-[Lys (Boc) ] 4-Nle-O-HYA [058] 1 m de H-Nle-O-HYA preparado de acordo com o Exemplo 2 foi colocada num reator de seringa de 2 ml equipado com frita; a fibra foi repetidamente lavada com DMF. A solução de 3 eq. de Fmoc-Lys(Boc)-OH e 3 eq. de OxymaPure em 0,5 ml de DMF anidra foi preparada fora do reator; depois de dissolver todos os componentes, 3 eq. de DIC foram adicionados para ativar o grupo carboxil do aminoácido. Esta solução foi transferida ao reator para a fibra. A reação prosseguiu à temperatura de 18 a 23°C durante as 20 horas seguintes e foi encerrada por filtração da solução da reação. A fibra foi então lavada com 3 x 1,5 ml de DMF, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de IPA, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de DMF. O grupo protetor Fmoc foi clivado por meio da adição de 1,5 ml de solução a 20% de piperidina em DMF ao reator com a fibra. A reação prosseguiu durante 5 minutos à temperatura de 18 a 23°C. A reação foi repetida enquanto se prolongava o tempo de divagem para 20 minutos e depois foi encerrada por filtração da solução da reação. Em seguida a fibra foi lavada com 3 x 1,5 ml de DMF, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de IPA, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de DMF. Este procedimento foi repetido 4 vezes.
[059] O rendimento da reação de condensação foi determinado pelo teste de liberação de Fmoc como a
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21/40 substituição em mmol/g. A composição do produto (nencontrado) foi confirmada por análise de aminoácidos como apresentado na Tabela 2. É uma síntese em série realizada por um método passo a passo; no entanto, este procedimento foi repetido para todos os referidos derivados. As linhas individuais mostram a composição do conjugado preparado após o término do referido ciclo; isto é, após terminar o procedimento descrito no Exemplo 3, obtém-se o produto com a composição descrita na primeira fila. Em seguida, o procedimento é repetido e o produto descrito na segunda linha é obtido etc.
TABELA 2
Composto s [mmol/g] ^calculado [nmol] ^encontrado [nmol]
Η-Lys(Boc)-Nle-O-HYA 0,01839 0,290 0,295
Η-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Nle-O-HYA 0,01863 0,576 0,584
Η-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Nle-O-HYA 0,01888 0,870 0,876
Η-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)Nle-O-HYA 0,01856 1,189 1,194
Exemplo 6
Preparação de um peptídeo contendo 7 unidades de lisina dispostas em uma estrutura de dendrlmero - uso de uma fibra de HYA nativo [060] 1 m de H-Nle-O-HYA preparado de acordo com o Exemplo 2 foi colocada num reator de seringa de 2 ml equipado com frita; a fibra foi repetidamente lavada com DMF. A solução de 3 eq. de Fmoc-Lys (Fmoc)-OH e 3 eq. de OxymaPure em 0,5 ml de DMF anidra foi preparada fora do reator; depois de dissolver todos os componentes, 3 eq. de DIC foram adicionados para ativar o grupo carboxil do
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22/40 aminoácido. Esta solução foi transferida para o reator com a fibra. A reação prosseguiu à temperatura de 18 a 23°C durante as 20 horas seguintes. A reação foi encerrada por filtração da solução da reação. A fibra foi então lavada com 3 x 1,5 ml de DMF, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de IPA, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de DMF. O grupo protetor Fmoc foi clivado por meio da adição de 1,5 ml de solução a 20% de piperidina em DMF ao reator com a fibra. A reação prosseguiu durante 5 minutos à temperatura de 18 a 23°C. A reação foi repetida enquanto se prolongava o tempo de divagem para 20 minutos. A reação foi encerrada por filtração da solução da reação. A fibra foi então lavada com 3 x 1,5 ml de DMF, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de IPA, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de DMF. Este procedimento foi repetido 2 vezes.
[061] A reação foi monitorada pelo teste de liberação de Fmoc. O rendimento foi determinado pelo teste de liberação de Fmoc. A composição do produto, mostrada na Figura 5, foi confirmada por uma análise de aminoácidos, como apresentado na Tabela 3. É uma síntese em série realizada pelo método passo a passo; no entanto, este procedimento foi repetido para todos os referidos derivados. As linhas individuais mostram a composição do conjugado preparado após o término do referido ciclo; isto é, após terminar o procedimento descrito no Exemplo 3, obtém-se o produto com a composição descrita na primeira fila. Em seguida, o procedimento é repetido e o produto descrito na segunda linha é obtido, etc.
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TABELA 3
Composto s [mmol/g] ^calculado [nmol] ^encontrado [nmol]
H-Lys-Nle-O-HYA 0,03381 0,25 0,262
H-Lys3-Nle-O-HYA 0,07169 0,77 0,799
H-Lys7-Nle-O-HYA 0,14211 1,84 1, 876
Exemplo 7
Preparação de um peptídeo contendo 7 unidades de alanína na fibra de HYA nativo [062] 1 m de H-Nle-O-HYA preparado de acordo com o Exemplo 2 foi colocada num reator de seringa de 2 ml equipado com frita; a fibra foi repetidamente lavada com DMF. Uma solução de 3 eq. de Fmoc-Lys (Boc)-OH e 3 eq. de OxymaPure em 0,5 ml de DMF anidra foi preparada fora do reator; depois de dissolver todos os componentes, 3 eq. de DIC foram adicionados para ativar o grupo carboxil do aminoácido. Esta solução foi transferida ao reator para a fibra. A reação prosseguiu à temperatura de 18 a 23°C durante as 20 horas seguintes. A reação foi encerrada por filtração da solução da reação. Em seguida a fibra foi lavada com 3 x 1,5 ml de DMF, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de IPA, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de DMF. A divagem do grupo protetor Fmoc foi realizada adicionando 1,5 ml de solução a 20% de piperidina em DMF ao reator na fibra. A reação prosseguiu durante 5 minutos à temperatura de 18 a 23°C. A reação foi repetida enquanto se prolongava o tempo de divagem para 20 minutos e foi encerrada por filtração da solução da reação. A fibra foi então lavada com 3 x 1,5 ml de DMF, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de IPA, 3 x 1,5 ml
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24/40 de DCM, 3 x 1,5 ml de DMF. Este procedimento foi repetido 7 vezes para Fmoc-Ala-OH.
[063] O rendimento da reação de condensação foi determinado pelo teste de liberação de Fmoc como a substituição em mmol/g. A composição do produto foi confirmada por uma análise de aminoácidos como a ocorrência proporcional de aminoácidos individuais. A pureza do material foi determinada por meio de MS-HPLC após a degradação do material. Os resultados da análise individual são mostrados na Tabela 4 seguinte:
TABELA 4
Composto S [mmol/g] Aminoácido Pureza [%]
Ala Lys Nle
H-(Ala)7-Lys(Boc)-Nle-O-HYA 0, 01798 7,28 1, 03 1 86
Exemplo 8
Ancoragem de Fmoc-Nle-OH na fibra de palmitoil HYA [064] 1 m da fibra de palmitoil HYA (15 mg, 0,03 mmol, Mw = 3.105 g.mol-1) foi colocada num reator de seringa de 2 ml equipado com frita; a fibra foi repetidamente lavada com DMF. Uma solução de 3 eq. de Fmoc-Nle-OH e 3 eq. OxymaPure e 0,3 eq. de DMAP em 0,5 ml de DMF anidra foi preparada fora do reator; depois de dissolver todos os componentes, 3 eq. de DIC foram adicionados para ativar o grupo carboxil do aminoácido. Esta solução foi transferida ao reator para a fibra. A reação prosseguiu à temperatura de 18 a 23°C durante as 20 horas seguintes e foi encerrada por filtração da solução da reação. Em seguida a fibra foi lavada com 3 x 1,5 ml de DMF, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de IPA, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de DMF.
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25/40 [065] O rendimento da reação de condensação foi determinado pelo teste de liberação de Fmoc como a substituição S = 0,01029 mmol/g.
Exemplo 9
Preparação de H-Nle-O-palmítoíl HYA [066] 1 m de Fmoc-Nle-O-palmitoil HYA preparado de acordo com o Exemplo 8 foi colocada num reator de seringa de 2 ml equipado com frita; a fibra foi repetidamente lavada com DMF. O grupo protetor Fmoc foi clivado por meio da adição de 1,5 ml de solução a 20% de piperidina em DMF ao reator da fibra. A reação prosseguiu à temperatura de 18 a 23°C durante 5 minutos. A reação foi repetida enquanto se prolongava o tempo de divagem para 20 minutos e depois foi encerrada por filtração da solução da
reação . Em seguida a fibra foi lavada com 3 x 1,5 ml de
DMF, 3 x 1, 5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de IPA, 3 x 1,5 ml de
DCM, 3 x 1,5 i ml de DEE.
[067 ] A reação é quantitativa. A liberação do
grupo amino foi confirmada pela realização da reação de
confirmação da ninidrina (teste de Kaiser).
Exemplo 10
Preparação de Fmoc-[Lys (Boc)]4-Nle-O-palmítoíl HYA [068] 1 m de H-Nle-O-palmitoil HYA preparado de acordo com o Exemplo 9 foi colocada num reator de seringa de 2 ml equipado com frita; a fibra foi repetidamente lavada com DMF. Uma solução de 3 eq. de Fmoc-Lys (Boc)-OH e 3 eq. de OxymaPure em 0,5 ml de DMF anidra foi preparada fora do reator; depois de dissolver todos os componentes, 3 eq. de DIC foram adicionados para ativar o grupo carboxil
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26/40 do aminoácido. Esta solução foi transferida ao reator para a fibra. A reação prosseguiu à temperatura de 18 a 23°C durante as 20 horas seguintes e foi encerrada por filtração da solução da reação. A fibra foi então lavada com 3 x 1,5 ml de DMF, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de IPA, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de DMF. A divagem do grupo protetor Fmoc foi realizada adicionando 1,5 ml de solução a 20% de piperidina em DMF ao reator na fibra. A reação prosseguiu durante 5 minutos à temperatura de 18 a 23°C. A reação foi repetida enquanto se prolongava o tempo de divagem para 20 minutos e depois foi encerrada por filtração da solução da reação. A fibra foi então lavada com 3 x 1,5 ml de DMF, 3 x
1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de IPA, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x
1,5 ml de DMF. Este procedimento foi repetido 4 vezes.
[069] O rendimento da reação de condensação foi determinado pelo teste de liberação de Fmoc como a substituição em mmol/g. A composição do produto (nencontrado) foi confirmada por análise de aminoácidos, como apresentado na Tabela 5 abaixo. É uma síntese em série realizada pelo método passo a passo; no entanto, este procedimento foi repetido para todos os derivados. As linhas individuais mostram a composição do conjugado preparado após o término do dito ciclo; isto é, após terminar o procedimento descrito no Exemplo 3, obtém-se o produto com a composição descrita na primeira fila. Em seguida, o procedimento é repetido e o produto descrito na segunda linha é obtido etc.
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TABELA 5
Composto s [mmol/g] ^calculado [nmol] ^encontrado [nmol]
Η-Lys(Boc)-Nle-O-palmitoil HYA 0,01044 0,157 0, 152
Η-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Nle-O-paidtoil HYA 0,01057 0,314 0,318
Η-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Nle-Opalmitoil HYA 0,01061 0,478 0, 469
Η-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)Nle-O-paidtoil HYA 0,01053 0,631 0, 619
Exemplo 11
Preparação de um peptídeo contendo 7 unidades de lisina dispostas em uma estrutura de dendrlmero - uso da fibra de palmitoil HYA [070] 1 m de H-Nle-O-palmitoil HYA preparado de acordo com o Exemplo 9 foi colocada no reator de seringa de 2 ml equipado com frita; a fibra foi repetidamente lavada com DMF. Uma solução de 3 eq. de Fmoc-Lys (Boc)-OH e 3 eq. de OxymaPure em 0,5 ml de DMF anidra foi preparada fora do reator; depois de dissolver todos os componentes, 3 eq. de DIC foram adicionados para ativar o grupo carboxil do aminoácido. Esta solução foi transferida ao reator para a fibra. A reação prosseguiu à temperatura de 18 a 23°C durante as 20 horas seguintes. A reação foi encerrada por filtração da solução da reação. A fibra foi então lavada com 3 x 1,5 ml de DMF, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de IPA, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de DMF. A divagem do grupo protetor Fmoc foi realizada adicionando 1,5 ml de solução a 20% de piperidina em DMF ao reator na fibra. A reação prosseguiu durante 5 minutos à temperatura de 18 a 23°C. A reação foi repetida enquanto se prolongava o tempo de divagem para 20 minutos. A reação foi encerrada por
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28/40 filtração da solução da reação. A fibra foi então lavada com 3 x 1,5 ml de DMF, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de IDA, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de DMF. Este procedimento foi repetido 2 vezes.
[071] A reação foi monitorada pelo teste de liberação de Fmoc. O rendimento foi determinado pelo teste de liberação de Fmoc. A composição do produto, mostrada na Figura 5, onde HYA denota palmitoil hialuronano, foi confirmada por análise de aminoácidos, como apresentado na Tabela 6. É uma síntese em série realizada pelo método passo-a-passo; no entanto, este procedimento foi repetido para todos os referidos derivados. As linhas individuais mostram a composição do conjugado preparado após o término do referido ciclo; isto é, após terminar o procedimento descrito no Exemplo 3, obtém-se o produto com a composição descrita na primeira linha. Em seguida, o procedimento é repetido e o produto descrito na segunda linha é obtido etc.
TABELA 6
Composto s [mmol/g] ^calculado [nmol] ^encontrado [nmol]
H-Lys-Nle-O-palmí toil HYA 0,00984 0, 16 0,154
H-Lys3-Nle-O-palmí toil HYA 0,02130 0, 49 0,501
H-Lys7-Nle-O-palmí toil HYA 0,04265 1, 12 1,113
Exemplo 12
Ancoragem de Fmoc-Lys-NH2 na fibra de formil HYA [072] 1 m de fibra de formil HYA (11 mg, 0,028 mmol, Mw = 3.105 g.mol-1) foi colocada num reator de seringa de 2 ml equipado com frita; a fibra foi repetidamente
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29/40 lavada com DMF. A solução de 3 eq. de Fmoc-Lys-NH2 em 0,5 ml de DMF anidra foi preparada fora do reator e transferida para o reator da fibra. A reação prosseguiu à temperatura de 18 a 23°C durante as 20 horas seguintes. Então 3 eq. de picBH3 foram adicionados e a reação prosseguiu à temperatura de 18 a 23°C durante as próximas 24 horas, depois foi encerrada por filtração da solução da reação. A fibra foi então lavada com 3 x 1,5 ml de DMF, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de IDA, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de DEE. A divagem do grupo protetor Fmoc foi realizada adicionando 1,5 ml de solução a 20% de piperidina em DMF ao reator da solução. A reação prosseguiu durante 5 minutos à temperatura de 18 a 23°C. A reação foi repetida enquanto se prolongava o tempo de divagem para 20 minutos e depois foi encerrada por filtração da solução da reação. A fibra foi então lavada com 3 x 1,5 ml de DMF, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x
1,5 ml de IDA, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de DEE.
[073] A liberação do grupo amino foi confirmada pela realização de uma reação de confirmação de ninidrina (teste de Kaiser).
Exemplo 13
Ancoragem do peptídeo com o motivo RGD na fibra da HYA nativo [074] 1 m de fibra de HYA nativo (12 mg, 0,03 mmol, Mw = 3.105 g.mol-1) foi colocada num reator de seringa de 2 ml equipado com frita; a fibra foi repetidamente lavada com DMF. Uma solução de 3 eq. de um peptídeo tendo a sequência adequada, 3 eq. de OxymaPure em 0,3 eq. de DMAP em 0,5 ml de DMF anidra foi preparada fora do reator;
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30/40 depois de dissolver todos os componentes 3 eq. de DIC foram adicionados para ativar o grupo carboxil do aminoácido. Esta solução foi transferida ao reator para a fibra. A reação prosseguiu à temperatura de 18 a 23°C durante as 20 horas seguintes. A reação foi encerrada por filtração da solução da reação. Em seguida a fibra foi lavada com 3 x
1,5 ml de DMF, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de IPA, 3 x
1,5 ml de DCM , 3 x 1,5 ml de DEE.
[075] 0 rendimento da reação de condensação foi
determinado pelo teste de liberação de Fmoc como a
substituição em mmo1/g. A composição do produto foi
confirmada por análise de aminoácidos como a proporção de aminoácidos individuais. A pureza do material foi determinada por meio de MS-HPLC após a degradação do material. Os resultados das análises individuais são mostrados na Tabela 7 seguinte:
TABELA 7
Composto s [mmol/g] Aminoácido Pureza [%]
Ahx Asp Gly Nle Arg
Ac-Arg-Gly-Asp-Gly-GlyGly-Nle-O-HYA - - 1, 04 3, 89 1 1,03 90
H-Arg-Gly-Asp-Gly-GlyGly-Nle-O-HYA 0,01802 - 1, 01 3, 91 1 0,97 82
H-Gly-Gly-Gly-Arg-GlyAsp-Nle-O-HYA 0,01832 - 1, 04 4,07 1 1,08 85
Ac-Arg-Gly-Asp-Ahx-AhxNle-O-HYA - 2,20 1, 04 1, 06 1 1,01 95
H-Arg-Gly-Asp-Ahx-AhxNle-O-HYA 0,01843 2,27 0, 93 1, 05 1 1,00 90
Ac-Ahx-Ahx-Arg-Gly-AspNle-O-HYA - 2,21 1, 03 1,26 1 1,01 86
H-Ahx-Ahx-Arg-Gly-AspNle-O-HYA 0,01831 2,31 0, 98 1, 05 1 1,02 89
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Exemplo 14
Ancoragem do peptídeo com motivo RGD ao tecido não tecido de HYA nativo [076] 5 quadrados do lado de 5 mm feitos de tecido não tecido de HYA nativo (10,5 mg, 0,03 mmol, Mw = 1,04 χ 106 g.mol-1) foram colocados num reator de seringa de 2 ml equipado com frita; o material foi repetidamente lavado com DMF. Uma solução de 3 eq. de um peptídeo com a sequência adequada e 3 eq. de OxymaPure em 0,5 ml de DMF anidra foi preparada fora do reator; depois de dissolver todos os componentes, 3 eq. de DIC foram adicionados para ativar o grupo carboxil do aminoácido. Esta solução foi transferida ao reator para o material. A reação prosseguiu à temperatura de 18 a 23°C durante as 20 horas seguintes. A reação foi encerrada por filtração da solução da reação. Em seguida o tecido foi lavado com 3 x 1,5 ml de DMF, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de IPA, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de DEE.
[077] O rendimento da reação de condensação foi determinado pelo teste de liberação de Fmoc como a substituição em mmol/g. A composição do produto foi confirmada por uma análise de aminoácidos como a ocorrência proporcional dos aminoácidos individuais. A pureza do material foi determinada por meio de MS-HPLC após a degradação do material. Os resultados da análise individual são apresentados na seguinte Tabela 8.
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TABELA 8
Composto s [mmol/g] Aminoácido Pureza [%]
Ahx Asp Gly Nle Arg
H-Arg-Gly-Asp-Gly-GlyGly-Nle-O-HYA 0,01802 - 1,04 3, 94 1 1,01 85
H-Gly-Gly-Gly-Arg-GlyAsp-Nle-O-HYA 0,01832 - 1,06 4,14 1 1,07 76
Ac-Arg-Gly-Asp-Ahx- Ahx-Nle-O-HYA - 2,17 0,96 1, 05 1 1,04 95
H-Arg-Gly-Asp-Ahx-Ahx- Nle-O-HYA 0,01843 2,15 1,01 1, 12 1 1,06 88
Exemplo 15
Ancoragem do peptídeo Fmoc- (VPGLG) 2~OH em uma fibra de HYA nativo [078] 1 m de fibra de HYA nativo (12 mg, 0,03 mmol, Mw = 3.105 g.mol-1) foi colocada num reator de seringa de 2 ml equipado com frita; a fibra foi repetidamente lavada com DMF. Uma solução de 3 eq. do peptídeo Fmoc(VPGLG)2_OH, 3 eq. de OxymaPure e 0,3 eq. de DMAP em 0,5 ml de DMF anidra foi preparada fora do reator; depois de dissolver todos os componentes, 3 eq. de DIC foram adicionados para ativar o grupo carboxil do aminoácido.
Esta solução foi transferida ao reator para a fibra. A reação prosseguiu à temperatura de 18 a 23°C durante mais 20 horas e foi encerrada por filtração da solução da reação. Em seguida a fibra foi lavada com 3 x 1,5 ml de DMF, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de IPA, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de DEE.
[079] O rendimento da reação de condensação foi determinado pelo teste de liberação de Fmoc como a substituição em mmol/g. A composição do produto foi confirmada por uma análise de aminoácidos como a ocorrência
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33/40 proporcional dos aminoácidos individuais. A pureza do material foi determinada por meio de MS-HPLC após a degradação do material. Os resultados da análise individual são mostrados na seguinte Tabela 9.
TABELA 9
Composto s [mmol/g] Aminoácido Pureza [%]
Gly Leu Pro Vai
H-(Val-Pro-Gly-LeuGly) 2-0-HYA 0,01809 2,37 1,26 1,13 1 85
Exemplo 16
Ancoragem de Dalagrín na fibra de HYA nativo [080] 1 m de fibra de HYA nativo (12 mg, 0,03 mmol, Mw = 3.105 g.mol-1) foi colocada num reator de seringa de 2 ml equipado com frita; a fibra foi repetidamente lavada com DMF. Uma solução de 3 eq. do peptídeo Fmoc-Dalagrin, 3 eq. de OxymaPure e 0,3 eq. de DMAP em 0,5 ml de DMF anidra foi preparada fora do reator; depois de dissolver todos os componentes, 3 eq. de DIC foram adicionados para ativar o grupo carboxil do aminoácido. Esta solução foi transferida ao reator para a fibra. A reação prosseguiu à temperatura de 18 a 23°C durante mais 20 horas e foi encerrada por filtração da solução da reação. Em seguida a fibra foi lavada com 3 x
1,5 ml de DMF, 3 x 1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de IPA, 3 x
1,5 ml de DCM, 3 x 1,5 ml de DEE.
[081] O rendimento da reação de condensação foi determinado pelo teste de liberação de Fmoc como a substituição em mmol/g. A composição do produto foi confirmada por uma análise de aminoácidos como a ocorrência
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34/40 proporcional dos aminoácidos individuais. A pureza do material foi determinada por meio de MS-HPLC após a degradação do material. Os resultados da análise individual são mostrados na Tabela 10 seguinte.
TABELA 10
Composto S [mmol/g] Aminoácido Pureza [%]
ala Arg Gly Nle Leu Phe Tyr
H-Tyr-alaGly-Phe-LeuArg-Nle-O-HYA 0,01894 0,99 0,99 0,96 1 0,98 0,96 0,99 93
Exemplo 17
Adesão celular in vitro na fibra composta por motivo RGD [082] A fibra de HYA nativo compreendendo o motivo RGD, preparado de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 14, e as fibras de controle foram cortadas em pedaços de 1 cm e transferidas para um painel não adesivo com 24 poços. Fibroblastos humanos primários (NHDF) foram pré-marcados com o corante fluorescente Dil (Exmax/Ernmax 549/565) e inoculados, na quantidade de 105 células, nos poços preenchidos com as amostras testadas. Em seguida, o painel foi agitado por um agitador (5h/160 rpm) para manter as células em suspensão, sob condições de cultivo (37°C, 5% de CO2) . Após 24h de cultivo, as fibras foram transferidas para um poço com meio de cultivo fresco. Em seguida, as células foram observadas e detectadas pelo microscópio de fluorescência Nikon Ti-Eclipse com o uso do filtro TRITC (Exmax/Ernmax, 549/565) . A proliferação de fibroblastos foi monitorada por 7 dias de cultivo.
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35/40 [083] Os fibroblastos dérmicos humanos aderiram e proliferaram durante o tempo apenas na fibra com o peptídeo H-Arg-Gli-Asp-Ahx-Ahx-Nle-OH ligado a HYA através de 2 unidades de ácido 6-aminohexanóico que formam um ligante firme e elástico, e assim, tornam o peptídeo RGD acessível para receptores de adesão celular. Ao contrário, o peptídeo H-Ahx-Ahx-Arg-Gli-Asp-Nle-OH, bem como a ligação dos peptídeos H-Arg-Gli-Asp-Gli-Gli-Gli-Nle-OH e H-Gli-Gly-GlyArg-Gly-Asp-Nle-OH via ligante de triglicina não suportaram a adesão celular, como pode ser visto na Figura 6. Com base nestes dados, podemos presumir que é o motivo RGD que suporta a adesão celular, sendo o domínio mínimo que pode ser reconhecido pelos receptores celulares, eventualmente, o Ahx-linker. O efeito positivo de Ahx-linker foi então deslocado testando as fibras com o peptídeo ligado compreendendo o motivo RGD ou RGD, em que o NHDF aderiu exclusivamente ao peptídeo com RGD.
Exemplo 18
Adesão celular in vitro em um tecido não tecido de HYA nativo compreendendo o motivo RGD [084] Tecido não tecido de HYA com um peptídeo ancorado H-Arg-Gli-Asp-Ahx-Ahx-Nle-OH preparado de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 14 e um tecido de controle foram cortados em quadrados do lado de 0,5 cm e foram transferidos para placa de 24 poços de painel não adesivo. Fibroblastos humanos primários (NHDF) foram prémarcados com o corante fluorescente Dil (Exmax/Ernmax 549/565) e inoculados, na quantidade de 105 células nos poços preenchidos com as amostras testadas. Em seguida, o
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36/40 painel foi agitado por um agitador (5h/160 rpm) para manter as células em suspensão, sob condições de cultivo (37°C, 5% de C02). Após 24h de cultivo, o tecido foi transferido para um poço com um novo meio de cultura. Em seguida, as células foram observadas e detectadas pelo microscópio de fluorescência Nikon Ti-Eclipse com o uso do filtro TRITC (Exmax/Ernmax, 549/565) . A proliferação de fibroblastos foi monitorada por 7 dias de cultivo, como pode ser visto na Figura 7.
[085] O NHDF aderiu uniformemente à superfície do tecido e após 48 horas alongou-se de uma maneira característica.
APLICABILIDADE INDUSTRIAL [086] A nova preparação médica com um veículo à base de hialuronano e seus derivados pode ser utilizada como um fármaco adequado para o tratamento com a substância médica anexa. Esta nova forma de dosagem apresenta uma atividade prolongada melhorada da substância médica ligada ao veículo sólido do sistema complexo. Formas adequadas de hialuronano com as substâncias médicas ligadas podem ser preferencialmente utilizadas na medicina humana e veterinária.
LISTA DE ABREVIATURAS
AdDP 1-adamantilamida-(L)-alanil-(D)isoglutamina
Ahx ácido aminohexanóico
Boc tert-butoxicarbonil
Reagente Castro hexafluorofosfato de benzotriazol-l-il- oxi-tris(dimetilamino)fosfônio
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DBU l,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno
DCC N,Ν'-diciclohexilcarbodiimida
DCM diclorometano
DEE dietiléter
DIC N,Ν'-diisopropilcarbodiimida
Dil perclorato de 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'- tetrametil-indocarbocianina
DIPEA N,Ν'-diisopropiletilamina
DMAP N,N-dimetilaminopiridina
DMF N,N-dimetilformamida
EDC l-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida
Fmoc fluorenil-metiloxi-carbonila
HATU hexafluorofosfato de 1- [bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3triazol[4,5-b] piridinio-3-óxido
HBTU hexafluorofosfato de 2-(IH-benzotriazol-l- 11)-1,1,3,3-tetrametilurônio
HOAt l-hidroxi-7-azabenzotriazol
HOBt N-hidroxibenzotriazol
HOSu N-hidroxisuccinimida
IPA álcool isopropílico
OxymaPure cianoacetato de etil(hidroxiimino)
picBH3 complexo de picolin borano
T3P anidrido de ácido propilfosfônico
TBTU tetrafluoroborato de 0-(benzotriazol-l-yl)- N,N,Ν',Ν' -tetrametilurôniο
WSCD 4-trietilamina-diciclo-hexilcarbodiimida p- toluensulfonato
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Reivindicações originalmente depositadas - PCT/CZ2017/050061

Claims (23)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. PREPARAÇÃO MÉDICA COM UM VEÍCULO À BASE DE HIALURONANO E/OU SEUS DERIVADOS caracterizada por compreender um conjugado de ácido hialurônico e/ou seus derivados com uma substância médica, de acordo com a fórmula geral (X):
    A-S-N (X) , ou
    em que
    A é uma substância médica selecionada a partir do grupo que compreende aminoácidos e peptideos,
    S é selecionada a partir do grupo que compreende -0ou -NH-,
    N é um veiculo selecionado a partir do grupo que compreende ácido hialurônico, palmitoil hialuronano, ou formil hialuronano de peso molecular na faixa de 1,5 x 104 a 2,5 x 106 g.mol-1, m é 10 a 1250, n é 100 a 12500.
    e que é insolúvel em água e biodegradável.
  2. 2. PREPARAÇÃO MÉDICA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo veiculo N apresentar-se na forma de fibras sem fim, fios, tecidos, películas finas, fibras descontínuas e/ou tecidos não tecido.
  3. 3. PREPARAÇÃO MÉDICA de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pela substância médica A ser ancorada ao ácido hialurônico e seus derivados por meio do O-átomo por uma ligação éster ou por aminação
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    Reivindicações originalmente depositadas - PCT/CZ2017/050061 redutiva por meio de N-átomo, diretamente ou através de um ligante linear baseado em um peptídeo consistindo em aminoácidos hidrofóbicos Xaa.
    MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE
    UMA PREPARAÇÃO
    MÉDICA À BASE DE HIALURONANO E/OU SEUS DERIVADOS, caracterizado pela substância médica A, selecionada a partir do grupo que compreende aminoácidos e peptídeos e em um grupo N-terminal protetor e um grupo carboxil, ser primeiro submetida à ativação do grupo carboxil por um agente de condensação em um solvente polar aprótico para formar o intermediário reativo I, que posteriormente reage com um veículo N que é o ácido hialurônico, palmitoil hialuronano ou formil hialuronano de peso molecular na faixa de 1,5 χ 104 * a 2,5 χ 106 g.mol-1, na presença de uma base orgânica e um catalisador para formar o conjugado de ácido hialurônico e/ou seus derivados com a substância médica A, de acordo com a fórmula geral (X) :
    A-S-N (X) ou
    OH em que
    A, S, N, m a n são conforme definidos acima, e, em seguida, o grupo N-terminal protetor da substância médica A ligada ao veículo é clivada num ambiente básico, em que o veículo N está em fase sólida durante toda a preparação, é insolúvel no ambiente de reação e é biodegradável.
  4. 5. MÉTODO de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela substância médica A estar diretamente
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    Reivindicações originalmente depositadas - PCT/CZ2017/050061 ligada ao veículo, ou através de um ligante linear baseado em um peptídeo formado por aminoácidos hidrofóbicos Xaa.
  5. 6. MÉTODO de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela substância médica A estar ligada ao veículo através de um ligante linear Xaa-Ahx-Ahx-Xaa.
  6. 7. MÉTODO de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pela formação do conjugado de ácido hialurônico e seus derivados ser realizada à temperatura de 20°C a 40°C por 2 a 48 horas.
  7. 8. MÉTODO de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela formação do conjugado de ácido hialurônico e seus derivados ser realizada à temperatura de 22°C a 25°C por 24 horas.
  8. 9. MÉTODO de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, caracterizado pelo conjugado reagir repetidamente com o intermediário reativo I, que pode ser igual ou diferente do intermediário reativo I da etapa anterior.
  9. 10. MÉTODO de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 9, caracterizado pelo agente de condensação ser selecionado a partir do grupo de N,N'diisopropilcarbodiimida, N,N'-diciclohexilcarbodiimida, hexafluorofosfato de 1-[bis(dimetilamino)metileno]-1H1,2,3-triazol[4,5-b] piridinio-3-óxido, l-etil-3-(3dimetilaminopropil) carbodiimida, anidrido de ácido propilfosfônico, hexafluorofosfato de 2-(IH-benzotriazol-lil)-1,1,3,3-tetrametilurônio, etilcloroformiato, hexafluoro fosfato de benzotriazol-l-il-oxi-tris(dimetilamino) fosfônio, tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-l-il)Ν,Ν,Ν',N'-tetrametil, 4-trietilamino-diciclo-hexil carbodiimida p-toluensulfonato, 4-nitrofenol, Nhidroxisuccinimida, 2,4,5-triclorofenol, 2,3,4,5,6pentafluorofenol, 2,3,4,5,6-pentaclorofenol.
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    Reivindicações originalmente depositadas - PCT/CZ2017/050061
  10. 11. MÉTODO de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 10, caracterizado pelo solvente polar aprótico ser selecionado a partir do grupo que compreende N,N-dimetilformamida, dimetilsulfóxido, N-metil-2pirrolidona, acetonitrila, diclorometano, tetraidrofurano, 1,4-dioxano.
  11. 12. MÉTODO de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 11, caracterizado pela base orgânica ser selecionada a partir do grupo que compreende trietilamina, piridina, morfolina, N-metilmorfolina, N,N'diisopropiletilamina, imidazol.
  12. 13. MÉTODO de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 12, caracterizado pelo catalisador ser selecionado a partir do grupo que compreende cianoacetato de etil(hidroxiimino), hidroxibenzotriazol, l-hidroxi-7azabenzotriazol, ou N,N-dimetilaminopiridina.
  13. 14. MÉTODO de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 13, caracterizado pelo ambiente básico no qual o grupo N-terminal protetor é clivado ser selecionado a partir do grupo que compreende piperidina a 20% em DMF, DBU a 2% em DMF, tert-butilamina a 30% em DMF.
  14. 15. MÉTODO de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 14, caracterizado pelo agente de condensação ser N,Ν'-diisopropilcarbodiimida, o solvente polar aprótico ser N,N-dimetilformamida, o catalisador ser a combinação de cianoacetato de etil(hidroxiimina) e N,Ndimetilaminopiridina e o ambiente básico ser piperidina a 20% em N,N-dimetilformamida.
  15. 16. MÉTODO de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 15, caracterizado pela quantidade da substância médica A corresponder a 1 a 5 equivalentes, com relação ao dimero de ácido hialurônico ou seus derivados.
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    Reivindicações originalmente depositadas - PCT/CZ2017/050061
  16. 17. MÉTODO de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 16, caracterizado pela quantidade do agente de condensação corresponder a 0,1 a 5 equivalentes, com relação ao dimero de ácido hialurônico ou seus derivados.
  17. 18. MÉTODO de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 17, caracterizado pela quantidade da base orgânica corresponder a até 10 equivalentes, com relação ao dimero de ácido hialurônico ou seus derivados.
  18. 19. MÉTODO de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 18, caracterizado pela quantidade de catalisador corresponder a 0,1 a 5 equivalentes, com relação ao dimero de ácido hialurônico ou seus derivados, preferencialmente 3 equivalentes de cianoacetato de etil(hidroxiimina) e 0,3 equivalente de N,Ndimetilaminopiridina.
  19. 20. MÉTODO de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 19, caracterizado pela quantidade da substância médica A corresponder a 3 equivalentes, a quantidade do agente de condensação corresponder a 3 equivalentes e a quantidade de catalisador corresponder a 3 equivalentes, com relação ao dimero de ácido hialurônico ou seus derivados.
    21 . MÉTODO de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 19 , caracterizado pela quantidade da substância médica A corresponder a 1 equivalente, a quantidade do agente de condensação corresponder a 1
    equivalente e a quantidade do catalisador corresponder a 1 equivalente, com relação ao dimero de ácido hialurônico ou seus derivados.
  20. 22. PREPARAÇÃO MÉDICA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por ser para utilização em aplicações médicas como a forma de dosagem de
    Petição 870190053672, de 12/06/2019, pág. 72/74
    Reivindicações originalmente depositadas - PCT/CZ2017/050061 um peptídeo ou aminoácido ativo, em que é administrada por via dérmica, sublingual, oral ou localmente numa ferida aberta.
  21. 23. PREPARAÇÃO MÉDICA de acordo com a reivindicação 22, caracterizada por ser para aplicação dérmica, compreendendo o peptídeo Dalargin como substância médica.
  22. 24. PREPARAÇÃO MÉDICA de acordo com a reivindicação 22, caracterizada por ser para aplicação oral ou sublingual, compreendendo, como substância médica, o peptídeo selecionado a partir do grupo de Desmopressin,
    Lysipressin ou Glypressin. 25. PREPARAÇÃO MÉDICA de acordo com a reivindicação 22, caracterizada por ser para aplicação oral, compreendendo, como substância médica, o peptídeo
    selecionado a partir do grupo de antiviróticos e adjuvantes, ou fator de liberação para hormônios luteinizantes e folículo estimulantes.
  23. 26. PREPARAÇÃO MÉDICA de acordo com a reivindicação 22, caracterizada por ser para aplicação direta em ferida aberta, compreendendo, como substância médica, o peptídeo selecionado a partir do grupo que compreende Glypressin, Dalargin e AdDP.
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