CN118146313A - 自组装短肽及其在止血、损伤修复中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种自组装短肽及其在止血、损伤修复中的应用，涉及自组装短肽领域，目的在于解决如何更加快速止血、快速修复组织、快速修复脏器等的问题，其短肽的氨基酸序列：RQDLKTEI RYDFKADE(Arg‑Gln‑Asp‑Leu‑Lys‑Thr‑Glu‑Ile‑Arg‑Tyr‑Asp‑Phe‑Lys‑Ala‑Asp‑Glu)，该种自组装短肽提高了传统短肽三维支架的机械强度，可用于药物、生物大分子、蛋白质的载体及佐剂；可联合活性分子或者蛋白质或单独使用应用用快速止血、快速修复组织、快速修复脏器等。

Description

自组装短肽及其在止血、损伤修复中的应用
技术领域
本发明属于自组装短肽技术领域，涉及短肽RQDL-Ai+及其结构在器械和生物医学等领域的应用，从物理层面，构建的材料，具有特殊的物理结构和空间结构，特别是从微观结构等领域出发，从原理上创造的解决如何更加快速止血、快速修复组织、快速修复脏器等重要问题。
背景技术
主动脉/静脉随机、不确定的主动或者被动破裂等复杂伤口所引发的难以控制性出血止血是生物材料领域的重大科学难题。出血是创伤后频发的临床表现，出血失控是出现死亡的首要原因，往往存在于车祸、自然灾害和外科手术等紧急情况，在部分外科手术中，大面积出血和渗血不仅使得外科医生手术操作难度增大，甚至会导致手术失败。快速、优效于现有解决方案(包括但不限于灼烧法、止血纱布压迫止血法、止血海绵、可吸收止血生物膜等方法)的、可有效解决脑部、眼睛、胃壁、肝脏、肠道等脏器出血渗血的止血生物材料在临床上有较大的需求。脏器大面积渗血和出血目前在临床是难以解决甚至无解，有望创造一个止血材料的百亿级增量市场。2021年止血材料流体胶市场容量有接近150亿人民币增量市场。另外40亿左右的存量市场，竞争格局尚属蓝海。
综上，在以下四种情形下，止血难度较大：(1)在毛细血管、静脉和细小动脉等出血而依靠其他传统方法控制无效或不可行时的手术辅助止血；(2)对急性创面以及血管快速止血，可用于体内直视下或腔镜下清创后创面喷涂，对器官、组织创面渗血的封闭和止血；(3)对脏器止血；(4)其它应急状况止血等。因此，有必要加强这几方面的止血研究。
短肽在自然界中无处不在，可以作为支架水凝胶材料应用。目前，许多不同的应用已经从简单的自组装短肽发展这些设计的自组装肽支架水凝胶，并在商业上应用。例子包括：(1)真正的3D组织细胞培养不同的组织细胞和各种干细胞，(2)修复和再生医学以及组织工程，(3)3D组织打印，(4)持续释放小分子，生长因子和单克隆抗体，(5)加速伤口愈合皮肤和糖尿病溃疡等。
结合短肽的应用范围越来越广，短肽的止血研究还鲜有报道、研究，如何将短肽应用于止血，尤其是上述四种疑难情形的止血，就显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于：为了解决如何更加快速止血、快速修复组织、快速修复脏器的技术问题，本发明提供一种自组装短肽及其在止血、损伤修复中的应用。
本发明为了实现上述目的具体采用以下技术方案：一种自组装短肽，其氨基酸序列为：短肽RQDL-Ai+：Arg-Gln-Asp-Leu-Lys-Thr-Glu-Ile-Arg-Tyr-Asp-Phe-Lys-Ala-Asp-Glu。
即，该自组装短肽的氨基酸序列，采用大写字母表示为：RQDLKTEI RYDFKADE。
本申请的技术方案中，提供了一种新的自组装短肽，提供了新型外科用可吸收快速收止血材料优势：(1)不完全依赖于人体内正常的凝血机制，而是通过多重作用协同，迅速促使血液凝固，有效控制出血，止血速度较竞争对手快数十倍以上。(2)无刺激性，无免疫原性、无感染风险、生物相容性极好。(3)具有保护组织T-PA活性，减少血液与组织液的渗出，保护隔离和润滑组织，促进创面愈合。(4)术中可保持视野的液体透明，止血性能高，吸收无肿胀。在渗透出血，脏器止血优势明显，且未观察到血栓形成。(5)使用方法简单，应用方便快捷。(6)质量安全，纯度单一，性能稳定、常温保存，易于运输。该生物材料类的其他产品会兼具快速止血、快速修复、快速再生等多功能。
本申请的技术方案中，提供了一种新的自组装短肽，有几个创新点：(1)本发明在原理上有创新突破，设计原理：本结构采用生物信息学特别是Ai+的一些设计算法，按照氨基酸酸碱性质、氨基酸电荷分布、“Bottom-up自组装策略”、设计本序列短肽，控制电荷(netcharge)在不同pH下动态变化，具有极强的生理相容特性；(2)本发明在材料的止血机制及原理也有创新是：该材料结合仿生学和微观生物力学原理，依据其全新的独特结构，可瞬间自我组装成为氨基酸短肽电荷小球体，且具有双亲性(亲水和亲油)，这些小短肽球体可以自我组装形成小纤维，粘附捕获止血因子和活性物质、快速激活瀑布学说及相关止血机制，进一步自我组织形成一个三维空间网络支架屏障，使创面处血液流速变慢进而快速凝结形成透明水凝胶从而止血，上述止血过程为物理止血过程，如线性脏器划伤创面止血一般就1-3秒，小动脉出血3-5秒；(3)本发明在材料的结构上，有突破性创新，从小纤维组装纤维片，纤维片进一步空间组合，形成特异性的空间结构，该结构具有极大的孔隙，且随着浓度有一定的变化。
本申请的技术方案中，提供了一种新的自组装短肽，是一种新型创新材料，该材料可以申报创新医疗器械。
进一步的，本申请的技术方案中，提供了一种新的自组装短肽，它们都可以与PBS混合后自组装为可注入的水凝胶，作为细胞的三维培养支架，该支架模拟了细胞外基质，不单单是作为一个物理支架，还促进了细胞生长，对细胞没有毒性；本发明以一种新的自组装短肽的降解产物为氨基酸残基，可作为作为创新材料的载体材料中的应用；
进一步的，该自组装短肽在制备止血材料中的应用。
进一步的，该自组装短肽在制备止血材料中作为载体材料的应用。
进一步的，该自组装短肽在制备脏器止血材料中的应用。
进一步的，该自组装短肽在制备损伤修复材料中的应用。
进一步的，该自组装短肽在制备伤口愈合材料和/或皮肤损伤修复材料中的应用。
进一步的，该自组装短肽在制备细胞、组织或者器官或者类器官的三维培养支架材料中的的应用。
进一步的，自组装短肽中的氨基酸可以为L型，D型或DL型中的一种或多种。
进一步的，自组装短肽中的氨基酸均为L型。
进一步的，自组装短肽的碳端酰胺化。
进一步的，自组短肽形成二级结构，二级结构包括α螺旋、β折叠、β蜷曲和无规则卷曲中的一种或多种，但主要是β折叠为主。
进一步的，上述自组装短肽的碳端为酰胺化，酰胺化后的序列为：
Arg-Gln-Asp-Leu-Lys-Thr-Glu-Ile-Arg-Tyr-Asp-Phe-Lys-Ala-Asp-Glu-NH2。
一种水凝胶，含有上述的自组装短肽。
所述的水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、将短肽加入灭菌去离子水中配制成母液；
步骤2、向母液中加入离子或PBS制备成自组装短肽水凝胶。
进一步的，离子包括Na+、Mg2+、K+、Al3+、Ca2+、Zn2+、Fe3+、Fe2+、H+、NH4 +、Cl-、SO4 2-、NO3 -、CO3 2-、CH3COO-、HCO3 -、OH-、PO4 3-、HPO4 2-、H2PO4 -、HSO4 -中的一种或多种。
进一步的，制备成的水凝胶中，自组装短肽的浓度为1ppM及以上。
更进一步的，制备成的水凝胶的浓度为1-10mg/ml。
具体的：将10mg自组装短肽加入1ml灭菌去离子水中配置母液，再取1ml加入3mlPBS制备为水凝胶，浓度为2.5mg/ml，根据以上方法制备水凝胶，浓度可调整为1-10mg/ml。
本发明所述短肽在金属盐离子、细胞培养基等环境下，能进行自组装形成纤维。
原子力显微镜、冷冻扫描电镜下所形成的纤维网状结构可应用于日化妆械等领域，作为其中的缓释剂、抗菌剂、持久保湿剂、润滑剂、流变调节剂、抗氧化剂、成膜剂、润肤剂、稳定剂、缓冲剂等。
本发明所述自组装短肽形成的纤维，细胞能在其上进行三维依附、生长，所以此自组装短肽可应用到人、动、植物细胞三维培养中。
本申请中，以蛋白质分子(TFF3)作为模型，显示可作为药物、蛋白质、大分子佐剂、载体及佐剂，所述的集合包含多种结构不同的化合物通过范德华力、氢键、疏水键等连接相互作用。
本申请中，作为药物、蛋白质、大分子佐剂、载体的应用，可作为任何化合物的集合的载体及佐剂，其中所述的化合物具体而言包含且不限于天然存在的分子如：如凝血酶，蛋白质分子、抗体、糖、氨基酸、肽、抗体、受体、核酸等，脂质、类固醇、糖肽、糖蛋白、蛋白聚糖等或天然存在的分子类似物和衍生物或通过化学合成技术生成的小分子化合物。
本发明所述的自组装短肽可以作为任意化合物组成的药物、大分子、蛋白质等的载体及佐剂。术语“核苷酸”或“核酸”指mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。该术语包括单链和双链形式的DNA。
本申请中的“大分子”指相对分子质量在5000以上，甚至超过百万的生物学物质，如大分子包括蛋白药物、免疫球蛋白、血清白蛋白、P53蛋白、P21蛋白、IgG、SIgA、糖、单糖、低聚糖、多糖、氨基酸、肽、寡肽、多肽、蛋白质、受体、核酸、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸中一种或多种等。
本申请中，R-LIFE-1三维培养细胞，其中“细胞”包含不限于：DC细胞(树突状细胞)、NK细胞(自然杀伤细胞)、淋巴细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、肌肉卫星细胞、皮肤表皮干细胞、肠上皮干细胞、视网膜干细胞、胰腺干细胞等，还包含不限于扁桃体、肾上腺、胆管、膀胱、骨、骨髓、脑、胸、子宫颈、结肠直肠、食管、眼睛、头部和颈部、肾、肝、肺、淋巴结、神经系统、卵巢、胰腺、前列腺、皮肤、软组织、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、子宫等器官中的原代及传代细胞、或者以上细胞或组织的类器官的其中一种或多种。
以上所有细胞的种属包含不限于：包括单细胞真核生物如酵母和真菌以及多细胞真核生物如动物，非限制性例子包括无脊椎动物(例如，昆虫、腔肠动物、棘皮动物、线虫等)；真核寄生体例如，疟疾寄生体，如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、蠕虫等)；脊椎动物(例如，鱼类、两栖类、爬行类、鸟、哺乳动物)；和哺乳动物(例如，啮齿类、灵长类如人类和非人灵长类)。
本申请中，术语“三维培养”是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞－载体复合物，改变或减少细胞在培养的过程贴壁的特性，使细胞在空间上获得更多的生存空间，减少细胞接触抑制，细胞附着与自组装短肽上，在显微镜下一般呈现为圆形。
本发明所有所述包含自组装短肽字样，且包含自组装短肽功能的，其宏观表现均为水凝胶。
本发明的所述的序列为多肽，在这里称为“自组装短肽”。
本发明的所述的短肽简称：RQDL-Ai+，或含其大小写如Rqdl-Ai+(图8、图9、图10、图11、图12中的图示)等，都是指的同一条序列。
本发明涉及几个创新点：(1)本发明在原理上有创新突破，其设计原理：本结构采用生物信息学特别是Ai+的一些设计算法，按照氨基酸酸碱性质、氨基酸电荷分布、“Bottom-up自组装策略”、设计本序列短肽，控制电荷(net charge)在不同pH下动态变化，具有极强的生理相容特性；(2)本发明在材料的止血机制及原理，也有创新是：该材料结合仿生学和微观生物力学原理，依据其全新的独特分子结构，自我组装成为氨基酸短肽电荷小球体，且具有双亲性(亲水和亲油)，这些小短肽球体进一步自我组装形成小纤维，粘附捕获止血因子和活性物质等、快速激活瀑布学说及相关快速止血机制，进一步自我组织形成三维空间网络支架及屏障，使创面处血液流速变慢进而快速凝结形成透明水凝胶进而瞬间止血，上述止血过程为物理止血过程。如实验测试线显示，性脏器划伤创面止血一般就1-3秒，小动脉出血3-5秒；(3)本发明在材料的结构上，也有突破性创新，微观一级结构，到小纤维组装纤维片，纤维片进一步空间组合，形成特异性的空间结构，该结构具有极大的孔隙，且随着浓度有一定的变化。
本发明的有益效果如下：
1、提供了一种新型自组装短肽，增加自组装短肽类型。
2、提供了一种新型自组装短肽，能够形成稳定的纤维，能够应用于各类干细胞、体细胞的三维培养，模拟细胞内的生存环境，提供细胞体外三维微环境。
3、提供了一种新型自组装短肽，该水凝胶能够作为各类皮肤紫外线损伤修复成分的载体，控释其释放，延长其半衰期，协同各类抗炎、抗氧化药物增强其疗效。
4、按照实施例及推广，可实现脏器的快速止血。如在线性脏器划伤创面止血一般就1-3秒，小动脉出血3-5秒。
附图说明
图1是本发明的短肽的冷冻扫描电镜组合图；
图2是本发明自组装短肽的色谱图；
其中，A图为质谱图(MS)，B图为高效液相图谱(HPLC)；
图3是本发明自组装短肽的圆二色光谱图；
图4是本发明自组装短肽的5mg/ml冷冻扫描电镜图；
图5是本发明自组装短肽的10mg/ml冷冻扫描电镜图；
图6是本发明自组装短肽的染色图；
其中，A图是组装0、12、24、48小时的刚果红染色，B图是组装0、12、24、48小时的苯胺蓝染色；
图7是本发明自组装短肽在二维、三维环境中的增殖与毒性测定图；
其中，A图是增殖测定图，B图是毒性测定图；
图8是本发明中不同浓度自组装短肽水凝胶对TFF3的体外控释曲线示意图；
图9是标记蛋白在本发明肽为载体时的裸鼠活体胃内成像图，以及标记蛋白在本发明肽为载体时在胃内的控制释放时间图；
其中，A图标记蛋白在本发明肽为载体时的裸鼠活体胃内成像图；B图是标记蛋白在本发明肽为载体时在胃内的控制释放时间图；
图10是本发明中水凝胶在肝脏出血模型中的止血效果图；
图11是本发明中水凝胶在胃脏动脉出血损伤模型中的止血效果图；
图12是本发明中自组装短肽减小乙酸诱导的大鼠胃溃疡面积的示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本申请中，若实施例中没有说明某物质的具体浓度，则该浓度均为5-10mg/ml。
实施例1
本实施例提供由L-氨基酸构成的自组装短肽RQDL-Ai+序列的制备。
材料：
按照氨基酸序列备好原料的合成前保护，以Arg为例：Fmoc-L-Arg-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-精氨酸-γ-叔丁氧羰酰基)、其他的如：Fmoc-L-Gln-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-谷氨酰胺-γ-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-L-Asp-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-天冬氨酸)、Fmoc-L-Leu-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-亮氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-L-Lys-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-赖氨酸-γ-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-L-Thr-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-苏氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-L-Glu-OH(芴甲氧羰酰基-L-谷氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-L-Ile(OtBu)-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-异亮氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-L-Tyr-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-酪氨酸-γ-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-L-Phe-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-苯丙氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、Ala Fmoc-L-Ala-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-丙氨酸-γ-叔丁氧羰酰基)等保护；其他的合成辅助材料包括不限于如：TBTU(O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯)、HBTU(O-苯并三唑-1-基-N、N、N、N-四甲基尿六氟磷酸脂)和HOBT(1-羟基苯并三氮唑)、哌啶、六氢吡啶、醋酸酐、二氯甲烷；溶剂：DMF(N、N-二甲基甲酰胺)、TFA(三氟乙酸)、ACN(乙腈)、冰乙醚、NMM(N-甲基吗啡啉)等。
采用Fmoc(芴甲氧羰基)保护的固相合成法，工艺步骤简述如下：
(1)称取0.5mmol/g Rink amide resin 20g于肽合成器中，用200mlDCM(二氯甲烷)浸泡树脂30分钟后，再用400inIDMF分三次清洗树脂，每次清洗时间为3min，抽滤干洗涤液。经过10-20分钟用100ml 20％哌啶/DMF震荡反应30分，反应结束后，抽滤干洗涤液，用400mIDMF清洗树脂5次，每次清洗3min，洗完后取少许树脂做前三酮检査，树脂呈阳性，然后向反应器中加入原料：Fomc-L-Arg-OH 16.06g,HBTU 15.35g,HOBT 9.96g,NMM
8.18ml,DMF296ml等，上述原料加完后，反应50min，抽滤，用50ml DMF洗涤树脂5次，每次4分钟，取少许树脂做前三酮检査，树脂呈阴性。
(2)再用40mlDMF分4次洗涤树脂，然后在取少许树脂做前三酮检查，树脂呈阳性，向反应器皿中加入以下原料：(a)Fmoc-L-Gln-OH 14.926g,(b)HOBT 9.60g,(c)NMM
7.36ml,(d)DMF 268ml；等，上述原料加完后，震荡反应40分钟，反应结束后，用30mlDMF分4次洗涤，每次3分钟，取少许树脂做前三酮检査，树脂呈阴性。
(3)变换步骤⑵中(a)原料，(b)、(c)、(d)原料及加入量不变，重复步骤⑵的操作：步骤(2)中(a)原料替为对应的一级结构序列的氨基酸。
再重复一次⑴、⑵、⑶步骤的操作，各步骤的原料及用量不变，根据RQDL-Ai+序列合成；最后一个结朿后，脱出Fmoc-保护基，20％哌啶/DMF(体积浓度)反应30分钟，洗净树脂，加入200ml 50％醋酸酐/DMF(醋酸酐的体积浓度)反应30分钟，用50mlDMF洗净树脂，再用甲醇洗涤树脂4次，抽滤干，真空干燥12小时。将100ml 90％ TFA/DCM(TFA的体积浓度)加入盛有肽树脂的容器中，反应3小时，抽滤，浓缩滤液，向残留液中加乙醚，析出白色固体，抽滤固体，即得到粗肽，通过HPLC(高效液相色谱法)纯化，经冷冻干燥，即得本发明所述短肽RQDL-Ai+氨基酸序列为序列表中所述。
实施例2
本实施例对自组装短肽RQDL-Ai+序列的测试HPLC和MS测试。
1.实验材料：对合成的短肽粉末进行测试。
2.测试方法：采用通用的方法及过程，采用HPLC仪器和MC仪器测试。
3.测试结果：结果显示分子量(摩尔质量)在2026.2，纯度为97.40％(图2A，B)。
实施例3
本实施例对自组装短肽RQDL-Ai+测试二级结构。
如图3所示，自组装短肽RQDL-Ai+自组装24h的圆二色谱(CD)，在37℃环境下自组装24小时后的自组装短肽在圆二色谱仪中显示，在组装24小时之后，短肽R-LIFE-1均可自组装形成纤维交织的膜状结构，二级结构呈现β折叠结构。
实施例4
自组装短肽RQDL-Ai+自组装24h的冷冻扫描电镜(Cryo-SEM)。
1、实验材料：RQDL-Ai+，主要溶液有：去离子水H2O；PBS溶液(Na+、K+、Cl、PO4 3-、HPO4 2-、H2PO4 -等)。
2、主要的实验仪器：冷冻扫描电镜(Cryo-SEM,Hitachi SU8010,Japan)
3、实验方法重要过程：(1)PBS配制RQDL-Ai+至终浓度为5mg/ml和10mg/ml的工作液，用于观察；(2)Cryo-SEM的样品制备相对快速和简单，有4个主要步骤：1.冷冻，2冷冻样品的转移，3样品表面的升华以暴露出感兴趣的结构，4镀导电膜或不镀。4、实验结果。
在37℃环境下自组装24小时后的自组装短肽在冷冻电镜中显示，在组装24小时之后，短肽RQDL-Ai+在5mg/ml(图4)时，可自组装形成纤维交织的膜片状结构，且为多层，膜片里可以清晰的观察到纤维结构，大片且致密。短肽RQDL-Ai+在10mg/ml(图5)时，短肽有较多小球聚集自组装形成纤维，也可交织的膜片状结构，可以清晰的观察到纤维结构，大片且致密。表明，RQDL-Ai+在不同浓度自组装时，能形成支架为主体的微观结构。这些结构，有孔隙，有一定力学性能，可以有效地负载细胞，为细胞生长提供了三维物理支架，其物理形态支撑了该短肽在替代透明质酸制备各种涂抹及填充类医疗美容产品中的应用；一种自组装短肽的水凝胶，自组装短肽水凝胶浓度为1ppM及以上。为如图4、图5显示观察到纤维网状结构。
实施例5
如图6所示，自组装短肽RQDL-Ai+自组装48h刚果红染色。
1、实验材料：短肽RQDL-Ai+溶液(10mg/ml)，染色液：刚果红染色液，苯胺蓝染色液。
2、实验方法：将10mg/ml的短肽溶液母液用PBS溶液稀释为2.5mg/ml置于37℃环境中分别自组装0、12、24、48小时后进行刚果红染色检测。吸取15μl短肽溶液于载玻片上，滴加刚果红染色液染色约30s，于光学显微镜下观察、拍照。
3、实验结果
加入配制定浓度，刚果红染色和苯胺蓝结果都显示RQDL-Ai+在显微镜下呈现纤维膜片状结构，可形成透明的水凝胶。在0小时已开始组装，在12h基本完成组装、24h完全组装成功、48小时组装后也很稳定。图6A是自组装短肽组装0、12、24、48小时的刚果红染色；图6B是自组装短肽组装0、12、24、48小时的苯胺蓝染色。
更进一步表明，可广泛用于生物医学领域，为制备医美产品，化妆品或保健品提供物理上的支架、药物载体等，为负载细胞提供了理论基础，一种自组装短肽在制备细胞三维培养支架材料中的应用，一种自组装短肽的水凝胶，自组装短肽水凝胶浓度为1ppM及以上。
实施例6
RQDL-Ai+的生物相容性。
1、实验材料：RQDL-Ai+，人胃黏膜上皮细胞(GES-1)，DMEM细胞培养基、PBS、CCK8试剂。
2、主要仪器：酶标仪。
3、实验方法：
(1)取细胞密度为80％-90％左右的GES-1细胞，弃旧培养基，PBS冲洗两次。0.25％胰酶消化后离心，得到细胞沉淀，弃上清液，加入1mL完全培养基重悬细胞，显微镜下进行计数，并把按实验要求调整细胞浓度。
(2)根据实验要求，取100μL细胞悬液(5x104个/mL)，接种于96孔板中，形成二维培养。
(3)三维培养：取100μL细胞悬液，接种于96孔板中，加入25μL RQDL-Ai母液，加入25μL PBS，轻柔吹打混匀，使GES-1细胞包裹进RQDL-Ai水凝胶中。
(4)将GES-1细胞悬液按照二维和三维培养方法接种于96孔板中，细胞增殖实验接种细胞数：5x103个/孔，细胞毒性实验接种细胞数为2x104个/孔。每个组重复6次，在培养箱中分别培养1、2、3天。
(5)在相应天数进行CCK-8检测，每个孔避光加入CCK-8 10μL，轻轻晃动96孔板，使其混匀，放入培养箱。
(6)2小时后取出96孔板，在450nm处用酶标仪检测吸光度值。
(7)
4、实验结果
细胞增殖结果：二维培养的GES-1细胞在前3天均持续生长；在RQDL-Ai+水凝胶基质中，GES-1细胞的增殖速度虽然较慢，但其仍处于缓慢增殖状态，细胞活性无下降的趋势(图7A)。细胞毒性结果：二维培养环境下的GES-1细胞在第1天细胞活性最高，随后细胞活性开始下降，三维环境中的GES-1细胞活性处于相对稳定，且呈现微小的上升趋势(图7B)。表明GES-1细胞可在RQDL-Ai+水凝胶构成的三维环境中生长，RQDL-Ai水凝胶拥有良好的生物相容性，可广泛应用于生物医学领域。以GES-1细胞作为其他细胞的模型和代表，其中“细胞”包含不限于：DC细胞(树突状细胞)、NK细胞(自然杀伤细胞)、淋巴细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞、白细胞、吞噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、肌肉卫星细胞、皮肤表皮干细胞、肠上皮干细胞、视网膜干细胞、胰腺干细胞等，还包含不限于扁桃体、肾上腺、胆管、膀胱、骨、骨髓、脑、胸、子宫颈、结肠直肠、食管、眼睛、头部和颈部、肾、肝、肺、淋巴结、神经系统、卵巢、胰腺、前列腺、皮肤、软组织、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、子宫等器官中的原代及传代细胞、或者以上细胞或组织的类器官的其中一种或多种。
为制备细胞、组织或者器官或者类器官提供物理上的支架等，可以作为一种自组装短肽在制备细胞、组织或者器官或者类器官的三维培养支架材料中的应用。
实施例7
RQDL-Ai+对TFF3的控释作用。
1、实验材料：RQDL-Ai，重组人三叶因子3(TFF3)、PBS、TFF3 ELISA检查试剂盒。
2、主要仪器：酶标仪。
3、实验方法
(1)用无菌PBS配置浓度为2μg/mL TFF3溶液备用；用无菌ddH2O配置20mg/mLRQDL-Ai母液备用。
(2)TFF3溶液，RQDL-Ai+母液，无菌PSB按照1：1：0混合静置24h让其自组装形成水凝胶。RQDL-Ai水凝胶包裹TFF3制备为TFF3@RQDL-Ai，TFF3@RQDL-Ai+中RQDL-Ai+浓度10mg/mL，TFF3浓度1μg/mL。
(3)TFF3溶液，RQDL-Ai+母液，无菌PSB按照4：3：1混合，静置24h让其自组装形成水凝胶，TFF3@RQDL-Ai+中RQDL-Ai+浓度7.5mg/mL，TFF3浓度1μg/mL。
(4)TFF3溶液，RQDL-Ai+母液，无菌PSB按照2：1：1混合混合，静置24h让其自组装形成水凝胶，TFF3@RQDL-Ai+中RQDL-Ai+浓度5mg/mL，TFF3浓度1μg/mL。
(5)取100μL不同浓度的TFF3@RQDL-Ai置于96孔板底部，然后每孔加入200μL PBS，将孔板在37℃下孵育并放在摇床上轻微水平晃动。
(6)为了保持相同的初始条件，同时制备不同时间点的所有取药孔。在指定的时间点(0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、32h、40h、48h)，从单一孔中收集上清液(每个时间点n＝3)，而其他孔不受影响。
(7)将收集到的上清液使用TFF3 ELISA KIT试剂盒测试TFF3浓度，计算TFF3累积释放量，绘制释放曲线。
4、实验结果
如图8所示，虽然不同浓度的RQDL-Ai+水凝胶对TFF3的控释存在略微差异，但是基本在第24h时，所有浓度的TFF3@RQDL-Ai+溶液都基本完成对TFF3的控释作用。在第24h时，5mg/mL的RQDL-Ai+对TFF3的控释率达到了92.3％；7.5mg/mL的RQDL-Ai+对TFF3的控释率达到了87.2％；10mg/mL的RQDL-Ai+对TFF3的控释率达到了81.1％。这表明不同浓度的RQDL-Ai+都可完成对TFF3的控释，保证TFF3的持续作用。以蛋白质分子(TFF3)作为模型，显示可作为药物、蛋白质、大分子佐剂、载体及佐剂，这结果表面RQDL-Ai+能作为一种理想的药物递送载体，对多肽类药物进行缓慢控释。
实施例8
Cy5-TFF3和FITC-RQDL-Ai+和的裸鼠活体成像。
1、实验材料:RQDL-Ai+，Cy5-TFF3，FITC-RQDL-Ai+，BALB/c裸鼠。
2、主要仪器:活体成像系统。
3、实验方法
(1)BALB/c裸鼠禁食24h，禁饮12h。
(2)BALB/c裸鼠用戊巴比妥钠(腹腔注射，50mg/kg)麻醉，行中线上腹切口，充分暴露胃组织。
(3)依次将100μL Cy5.5-TFF3、FITC-RQDL-Ai+水凝胶(10mg/mL)、Cy5.5-TFF3@RQDL-Ai+注射到胃腔内，使其尽可能的黏附于胃黏膜上，缝合切口。
(4)在注射后指定时间点(0h、12h、24h、36h)麻醉裸鼠，并通过活体成像系统进行测量。
4、实验结果
在体内实验中，FITC-RQDL-Ai+以及Cy5.5-TFF3@RQDL-Ai+中的Cy5.5-TFF3在被注射后0h至36h内均可被检测到保留在胃腔(图9A)。然而，单独注射的Cy5.5-TFF3在注射12h后就不能检测到其信号(图9B)。这表明RQDL-Ai+能良好的黏附于胃黏膜表面，使用RQDL-Ai+作为TFF3的递送载体能持续缓慢的释放TFF3。RQDL-Ai+水凝胶能够作为一种胃黏膜腔内的药物递送载体，它能良好的黏附于胃黏膜表面，并能对所负载药物缓慢控释。以蛋白质分子(TFF3)作为模型，显示可作为药物、蛋白质、大分子佐剂、载体及控释剂等。
实施例9
短肽RQDL-Ai+在制备快速止血后续创新材料或者器械中的应用示范：肝脏出血。
1、实验材料：RQDL-Ai+溶液(10.0mg/ml)，SD大鼠。
2、主要仪器：相机。
3、实验方法：本实施例中实验用动物为SD大鼠6-8周，重量在～180-250g，雌雄，12只，由重庆**大学动物实验中心提供。所有实验测严格试遵循动物伦理法则和法律规章制度，实验测试后的动物按照对应程序处理、安乐死或者救济。实验SD大鼠分为以下测试组，对照组为生理盐水组(n＝6),在不同的肝页中部上观察、生理盐水组是止不住血，同时是小鼠的启动自然凝血都很难，统计止血时间～90±30秒。肝叶中上部造线性创伤模型，短肽测试组(n＝6)，以肝脏做为众多其它脏器代表，线性创伤造模测试主要过程如下：SD大鼠被2％戊巴比妥钠溶液麻醉后剃腹毛消毒后，开腹腔露肝叶中上部造线性创伤模型：长度为1.0cm，宽度为0.1cm，深度为0.2cm，出血后，形成肝脏线性创伤模型，见图10)，用洁净纱布擦血后，在创面处加10.0mg/ml的短肽RQDL-Ai+溶液0.25ml；肉眼观察止血情况(见图10)，统计止血时间，取平均值。
实验结果见图10A，B，可以看出，加入RQDL-Ai+溶液1秒后，肝脏线性创面上出血瞬间停止，肝脏划伤的创面处出现一透明短肽水凝胶，视野透明清晰，组织粘附性好且不容易脱落；实验结果见图10C，可以看出，加入RQDL-Ai+溶液2秒后，肝脏线性创面上出血未几乎未见新增，肝脏划伤的创面处依然一透明短肽水凝胶，视野透明清晰；实验结果见图10D，可以看出，加入RQDL-Ai+溶液3秒后，肝脏线性创面上出血也未见新增，肝脏划伤的创面处依然一透明短肽水凝胶，视野透明清晰；实验结果见图10E，可以看出，加入RQDL-Ai+溶液4秒后，肝脏线性创面上出血也未见新增，肝脏划伤的创面处依然一透明短肽水凝胶，视野透明清晰；实验结果见图10F，可以看出，加入RQDL-Ai+溶液5秒后，肝脏线性创面上出血也未见新增，肝脏划伤的创面处依然一透明短肽水凝胶，视野透明清晰；8只SD大鼠创伤的止血时间约在：～1秒到3秒，平均止血时间～1.6秒,为超快瞬间止血。实验测试结束后，缝合腹部，饲养等，继续存活。
实施例10
短肽RQDL-Ai+在制备快速止血后续创新材料或者器械中的应用示范：胃脏动脉出血损伤模型。
1、实验材料：RQDL-Ai+溶液(10.0mg/ml)，SD大鼠。
2、主要仪器：相机。
3、实验方法：本实施例中实验用动物为SD大鼠6-8周，重量在～180-250g，雌雄，13只，由重庆**大学动物实验中心提供。所有实验测严格试遵循动物伦理法则和法律规章制度，实验测试后的动物按照对应程序处理、安乐死或者救济。实验SD大鼠分为以下测试组，对照组为生理盐水组(n＝5),在不同的胃部贲门上部处动脉观察、生理盐水组是止不住血，同时是小鼠的启动自然凝血都很难，统计止血时间大于120±30秒。胃脏动脉出血损伤模型(图11A，B)，短肽测试组(n＝8)，以胃脏周围动脉做为其它脏器或软组织动脉的出血模型代表，线性创伤造模测试主要过程如下：SD大鼠被2％戊巴比妥钠溶液麻醉后剃腹毛消毒后，开腹腔开腹腔露胃部(贲门)见小动脉，模拟造急性胃外部穿孔动脉出血，在胃部贲门处一小动脉处造创面，用手术刀尖轻轻划破血管，长度为0.1cm，宽度为0.1cm，深度为0.2cm，出血后，形成胃脏动脉出血线性创伤模型，见图(9)，用洁净纱布擦血后，在创面处加10.0mg/ml的短肽RQDL-Ai+溶液0.25ml(图11C)；肉眼观察止血情况(见图11)，统计止血时间，取平均值。
实验结果见图11D，可以看出，加入RQDL-Ai+溶液1秒后，胃脏动脉出血瞬间大部分停止，但创面底部有微微渗血，创面处出现一透明短肽水凝胶，视野透明清晰，组织粘附性好且不脱落；实验结果见图11E，可以看出，加入RQDL-Ai+溶液2秒后，但创面底部还有微微渗血，透明短肽水凝胶依然存在，无膨胀，无脱落；实验结果见图11F，可以看出，加入RQDL-Ai+溶液3秒后，胃脏动脉出血未见新增，透明短肽水凝胶依然存在，无膨胀，无脱落；实验结果见图11G，可以看出，加入RQDL-Ai+溶液4秒后，创面上出血已经止住，透明短肽水凝胶依然存在，无膨胀，无脱落；实验结果见图11H，可以看出，加入RQDL-Ai+溶液5秒后，创面上出血已经止住，透明短肽水凝胶依然存在，无膨胀，无脱落，视野清晰；8只SD大鼠创伤的止血时间约在：～3秒到4秒，平均止血时间约为～3.6秒,为胃部的小动脉快速瞬间止血。实验测试结束后，缝合腹部，饲养等，继续存活。
上述实验表明，本发明所述自组装短肽RQDL-Ai+，具有快速止血功能，是一个可以快速止血的创新材料，未来可在制备止血试剂、器材中应用。
上述实验表明，本发明所述自组装短肽RQDL-Ai+，具有快速止血功能，是一个可以快速止血的创新材料，未来可在制备止血试剂、器材中应用。
实施例11
TFF3@RQDL-Ai+促进大鼠胃黏膜乙酸损伤后的愈合。
1、实验材料：RQDL-Ai+，TFF3，SD大鼠，乙酸。
2、主要仪器：相机。
3、实验方法：(1)选择体重为200-250g的成年健康雄性SD大鼠纳入实验，并且随机分组为对照组、AcOH组，AcOH+TFF3组，AcOH+RQDL-Ai+组，AcOH+TFF3@RQDL-Ai+组；(2)术前对SD大鼠禁食不禁饮24小时，腹腔注射3％戊巴比妥钠麻醉(40mg/kg)大鼠，大鼠四肢肌张力降低，使用尖镊刺激大鼠后肢皮肤无明显反应表明麻醉成功；(3)延续剑突下0.5cm纵向切开腹壁约2cm,自肝后找出胃,轻轻移出腹腔,将直径约为10mm的圆形EP管紧贴胃窦部浆膜，向其内注入100％冰乙酸0.1mL，保留60s，随后吸出乙酸，用PBS冲洗浆膜2次，胃窦前后壁各造模一次，形成两个大小位置对称的损伤，前壁作为AcOH组使用，后壁作为实验组使用，对照组开腹后不做任何处理；(4)冲洗后，AcOH组向损伤处注射100μLPBS，AcOH+TFF3组向损伤处注射100μL TFF3溶液、AcOH+RQDL-Ai+组注射100μLRQDL-Ai+组水凝胶、AcOH+TFF3@RQDL-Ai+组注射100μL TFF3@RQDL-Ai+；操作完毕后覆盖网膜,间断缝合腹膜、腹壁各层组织、皮肤。其后单笼饲养；(5)在5天后，对大鼠进行腹腔麻醉后处死；(6)将各组大鼠的胃组织取出后沿胃大弯切开，生理盐水将其冲洗干净，滤纸擦干水分，展开胃组织后肉眼观察胃粘膜损伤情况，并用尺子测定黏膜损伤部位的长度、宽度；(7)用ImageJ进行处理和分析。
4、实验结果
采用大鼠乙酸胃黏膜损伤模型来模拟胃黏膜的慢性损伤过程。在大鼠胃窦部形成两个大小相等位置对称的溃疡来探讨TFF3@RQDL-Ai+促进胃黏膜损伤修复的能力。如图12A所示，通过肉眼观察，AcOH组由乙酸引起的胃粘膜损伤主要呈现为边界清楚，周围黏膜充血水肿严重的近圆形溃疡。相较于TFF3组、RQDL-Ai+组、TFF3@RQDL-Ai+组大鼠胃粘膜水肿情况较轻，溃疡面积略缩小。对溃疡面积定量分析的结果表明：TFF3@RQDL-Ai+和RQDL-Ai+能够有效的减小溃疡的面积(p<0.05)，然而单独使用TFF3并不能有效的减少溃疡面积(p>0.05)(图12B)。这些结果表明RQDL-Ai+水凝胶不仅能够作为药物递送载体，还能作为一种有效的生物医学材料，通过黏附于受损胃黏膜表面阻挡胃酸对受损胃黏膜的持续刺激为胃黏膜的愈合创造良好的环境，从而促进胃黏膜的创伤修复。RQDL-Ai+水凝胶在再生修复领域具有巨大应用潜力。

Claims (10)

1.一种自组装短肽，其特征在于，该自组装短肽的氨基酸序列为：
Arg-Gln-Asp-Leu-Lys-Thr-Glu-Ile-Arg-Tyr-Asp-Phe-Lys-Ala-Asp-Glu。
2.如权利要求1所述的一种自组装短肽，其特征在于，
上述自组装短肽的碳端酰胺化，酰胺化后的序列为：
Arg-Gln-Asp-Leu-Lys-Thr-Glu-Ile-Arg-Tyr-Asp-Phe-Lys-Ala-Asp-Glu-NH2。
3.如权利要求1或2所述的一种自组装短肽在制备止血材料中的应用。
4.如权利要求3所述的一种自组装短肽在制备止血材料中作为载体材料的应用。
5.如权利要求3所述的一种自组装短肽在制备脏器止血材料中的应用。
6.如权利要求1或2所述的一种自组装短肽在制备损伤修复材料的应用。
7.如权利要求1或2所述的一种自组装短肽在制备伤口愈合材料或皮肤损伤修复材料中的应用。
8.如权利要求1或2所述的一种自组装短肽在制备细胞、组织或者器官或者类器官的三维培养支架材料中的应用。
9.一种水凝胶，其特征在于，含有如权利要求1或2所述的自组装短肽。
10.如权利要求10所述的一种水凝胶，其特征在于，水凝胶中自组装短肽的浓度为1ppM及以上。
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