JP6460978B2 - 糖鎖−ポリペプチド複合体 - Google Patents

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Description

本発明は、糖鎖がポリペプチドに結合した糖鎖−ポリペプチド複合体に関する。
ヒドロゲルやフィブリン糊などのバイオゲルは、三次元培養等の研究用基材、術中／術後の止血剤や創傷治癒シート等の外科用基材、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）などに利用されている。
しかし、これらの多くは生物由来材料を用いたものであることから、使用の際には、ウイルス等の微生物の感染、免疫原性、疾患の伝搬等のリスクが存在する。例えば、フィブリン糊は手術時の止血剤として利用価値が高いが、原料がヒト血液由来であるため、実際に手術時に使用した際に、患者がフィブリン糊に混入していた肝炎ウイルスに感染する事故が多発し、大きな社会問題となっている。また、生物由来のバイオゲルでは、必ずしも均質な品質のゲルを供給できないという問題点も存在する。
生物由来のバイオゲルに対し、化学合成によって製造されたバイオゲルは、感染のリスクがなく、均質な品質のゲルが提供できることが知られている（特許文献１）。しかし、これまでに知られているバイオゲルは、ゲルを形成させる際にバッファー交換や置換、多剤混合などの手順が必要であり、操作が複雑である。また、ｐＨ域によっては難溶解性となるため、併用する試薬や溶媒が限定されるだけでなく、適用できる部位（患部）が限られることや、使用時にシリンジやチューブが詰まってしまうなどの問題がある。また、特に生体のｐＨに近い、中性域において難溶解性（すなわち、透明でない）であると、例えば手術野などの視認性を必要とする場面において、用いることが困難である。
米国特許第５６７０４８３号
本発明は、広範囲なｐＨにおいて透明で均質なヒドロゲルを形成し得る糖鎖−ポリペプチド複合体を提供することを課題とした。
発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基が交互に配置されたアミノ酸配列を含むポリペプチドに、糖鎖を結合させることによって製造された糖鎖−ポリペプチド複合体が、驚くべきことに、広範なｐＨ域、特に中性域において高い水溶性を示し、透明で均質なヒドロゲルを形成することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、糖鎖−ポリペプチド複合体であって、前記ポリペプチドが、極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基が交互に配置された、８〜３４個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドに１または複数の糖鎖が結合していることを特徴とする、糖鎖−ポリペプチド複合体を提供する。
また、本発明の一実施形態においては、前記糖鎖−ポリペプチド複合体が、ｐＨが中性付近の水溶液中において自己集合することにより、βシート構造を含むヒドロゲルを形成しうるものであることを特徴とする。
また、本発明の一実施形態においては、前記各極性アミノ酸残基が、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、アルギニン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、チロシン残基、セリン残基、トレオニン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、および、システイン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であることを特徴とする。
また、本発明の一実施形態においては、前記各非極性アミノ酸残基が、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、プロリン残基、および、グリシン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であることを特徴とする。
また、本発明の一実施形態においては、前記各極性アミノ酸残基が、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、アルギニン残基、および、トレオニン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、前記各非極性アミノ酸が、アラニン残基であることを特徴とする。
また、本発明の一実施形態においては、前記アミノ酸配列が、「ＲＡＤＡ」の繰り返し配列、または、「ＲＡＴＡＲＡＥＡ」の繰り返し配列であることを特徴とする。
また、本発明の一実施形態においては、前記アミノ酸配列が、ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ（配列番号１）、ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ（配列番号２）、および、ＲＡＴＡＲＡＥＡＲＡＴＡＲＡＥＡ（配列番号３）からなる群から選択されるアミノ酸配列であることを特徴とする。
また、本発明の一実施形態においては、前記ポリペプチドに結合している１または複数の糖鎖に存在する糖残基の数の合計が５以上であることを特徴とする。
また、本発明の一実施形態においては、前記ポリペプチドに結合している糖鎖の数が、１、２、または、３本であることを特徴とする。
また、本発明の一実施形態においては、前記ポリペプチドのＮ末端に位置するアミノ酸残基から数えて、ｘ番目までの全てのアミノ酸、および、Ｃ末端に位置するアミノ酸残基から数えて、ｙ番目までの全てのアミノ酸（ここで、ｘおよびｙは整数であり、ｘ≧０であり、ｙ≧０であり、ｘ＋ｙは、ポリペプチドに結合している糖鎖の数の合計である）に糖鎖が結合していることを特徴とする。
また、本発明の一実施形態においては、前記ポリペプチドに結合している糖鎖の数が、１、２、または３本であり、前記ポリペプチドに結合している糖鎖の数が１本の場合には、当該１本の糖鎖は、前記ポリペプチドのＮ末端に位置するアミノ酸残基、または、Ｃ末端に位置するアミノ酸残基と結合しており、
前記ポリペプチドに結合している糖鎖の数が２本の場合には、当該２本の糖鎖は、次の（１）〜（３）からなる群から選択されるアミノ酸残基と結合しており、
（１）前記ポリペプチドのＮ末端に位置するアミノ酸残基から数えて１番目および２番目のアミノ酸残基
（２）前記ポリペプチドのＣ末端に位置するアミノ酸残基から数えて１番目および２番目のアミノ酸残基
（３）前記ポリペプチドのＮ末端に位置するアミノ酸残基、および、前記ポリペプチドのＣ末端に位置するアミノ酸残基
前記ポリペプチドに結合している糖鎖の数が３本の場合には、当該３本の糖鎖は、次の（１）〜（４）からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸残基と結合していることを特徴とする。
（１）前記ポリペプチドのＮ末端に位置するアミノ酸残基から数えて１番目、２番目、および、３番目のアミノ酸残基
（２）前記ポリペプチドのＣ末端に位置するアミノ酸残基から数えて１番目、２番目、および、３番目のアミノ酸残基
（３）前記ポリペプチドのＮ末端に位置するアミノ酸残基から数えて１番目および２番目のアミノ酸残基、ならびに、前記ポリペプチドのＣ末端に位置するアミノ酸残基
（４）前記ポリペプチドのＮ末端に位置するアミノ酸残基、ならびに、前記ポリペプチドのＣ末端から数えて１番目および２番目に位置するアミノ酸残基
また、本発明の一実施形態においては、前記糖鎖が、分岐を有する糖鎖であることを特徴とする。
また、本発明の一実施形態においては、前記糖鎖が、ジシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖、ジマンノース糖鎖、グルクナック糖鎖、マルトトリオース糖鎖、マルトース糖鎖、マルトテトラオース糖鎖、マルトヘプタオース糖鎖、β−シクロデキストリン、および、γ−シクロデキストリンからなる群から選択される糖鎖であることを特徴とする。
また、本発明の一実施形態においては、本発明の糖鎖−ポリペプチド複合体を含む、ヒドロゲル形成用組成物であることを特徴とする。また、このようなヒドロゲル形成用組成物は、止血用医薬組成物であってよく、徐放担体用組成物であってよく、培養基材用組成物であってよい。
また、本発明の一実施形態においては、本発明の糖鎖−ポリペプチド複合体を含む組成物であって、前記組成物が、ヒドロゲルの状態にあることを特徴とする。また、このような組成物は、止血用医薬組成物であってよく、徐放担体用組成物であってよく、培養基材用組成物であってよい。
以上述べた本発明の一又は複数の特徴を任意に組み合わせた発明も、本発明の範囲に含まれることを、当業者であれば理解するであろう。
本発明に係る糖鎖−ポリペプチド複合体は、中性域を含む広範なｐＨ域において高い水溶性を有し、均一で透明なヒドロゲルを形成することから、併用する試薬や溶媒の制限を受けにくく、様々な用途に用いられ得る。また、広範なｐＨ域において用いられ得ることから、適用部位（患部）が制限されにくい。
また、本発明に係る糖鎖−ポリペプチド複合体は、中性域を含む広範なｐＨ域において高い水溶性を有し、均一で透明なヒドロゲルを形成することから、中性ｐＨにおいてゾル状態とゲル状態が可逆的に存在し得る。すなわち、糖鎖−ポリペプチド複合体は、一旦ゲル状態を形成した後に、機械的撹拌によってゾル状態になっても、再びゲル状態となることができる。したがって、ゲル状態（すなわち、Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｕｓｅの状態）で流通させることができ、他のペプチド性のゲルのように、ゲル化に適したｐＨ（例えば、酸性ｐＨ）でゲルを形成させた後に、中性ｐＨにするためのバッファー交換（または置換）を行うなど、煩雑な操作を必要としない。すなわち、本発明に係る糖鎖−ポリペプチド複合体は、他のペプチド性のゲルと比較して、操作性に非常に優れている。また、本発明に係る糖鎖−ポリペプチド複合体は、使用できるｐＨ域が広いため、使用時にシリンジやチューブが詰まってしまうなどの問題が生じにくい。
また、本発明に係る糖鎖−ポリペプチド複合体は、動物の生体内に存在する糖鎖によって修飾されているため、なんら修飾を有しないペプチドと比較して、抗原性が低減されている。また、本発明に係る糖鎖−ポリペプチド複合体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などによって修飾された化合物で見られるような毒性が生じる危険性もほとんどない。したがって、本発明に係る糖鎖−ポリペプチド複合体は、生体への使用に際して安全性が高い。
また、本発明に係る糖鎖−ポリペプチド複合体は、ＰＥＧを結合したポリペプチドと比較しても、より透明で均一なヒドロゲルを形成することも、本明細書の実施例から明らかである。
また、本発明に係る糖鎖−ポリペプチド複合体は、生理的条件下（中性域）において均一で透明なヒドロゲルを形成し、抗原性も少ないため、動物の生体に用いるヒドロゲルとして好適である。
より具体的には、本発明に係る糖鎖−ポリペプチド複合体を含むヒドロゲルは、中性ｐＨにおいて、高濃度の血漿を含む条件下においても、透明で均一なゲル状態を維持する特徴を有していることから、例えば、止血剤として利用価値が高い。
さらに、本発明に係る糖鎖−ポリペプチド複合体を含むヒドロゲルは、中性ｐＨにおいて、酸性タンパク質、塩基性タンパク質のいずれを含んだ場合においても、高い徐放性を有していることから、様々な物質についての徐放担体として利用価値が高い。
図１は、（ＲＡＤＡ）４およびＣ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４について、様々なｐＨにおけるスチール球載荷試験の結果を示す写真である。 図２は、（ＲＡＤＡ）４およびＣ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４について、様々な濃度の血漿を含む場合のスチール球載荷試験の結果を示す写真である。 図３は、（ＲＡＤＡ）４およびＣ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４について、酸性タンパク質を内包した場合の徐放効果の測定結果を示すグラフである。 図４は、（ＲＡＤＡ）４およびＣ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４について、塩基性タンパク質を内包した場合の徐放効果の測定結果を示すグラフである。 図５は、（ＲＡＤＡ）４について、ｐＨ２またはｐＨ７の場合の円偏光二色性（ＣＤ）測定結果を示すグラフである。 図６は、Ｃ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４について、ｐＨ２またはｐＨ７の場合の円偏光二色性（ＣＤ）測定結果を示すグラフである。 図７は、（ＲＡＤＡ）４およびＣ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４について、ｐＨ７における動粘度測定の結果を示すグラフである。
本発明に係る糖鎖−ポリペプチド複合体は、生物由来であってもよく、化学合成によって製造されたものでもよいが、安全性や品質の安定性、糖鎖の均一性の面から、化学合成によって製造されたものであることが好ましい。
本発明に係る糖鎖−ポリペプチド複合体は、例えば、水溶液中において、ペプチド分子間の静電的相互作用、水素結合、および、疎水性相互作用などの相互作用を介して自己集合しうる。本明細書において、糖鎖−ポリペプチド複合体が水溶液中で「自己集合する」とは、水溶液中においてポリペプチド同士が、何らかの相互作用（例えば、静電的相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用等）を介して、自発的に集合することを意味し、限定的な意味で解釈されてはならない。
本発明に係る糖鎖−ポリペプチド複合体は、水溶液中において自己集合し、βシート構造を形成しうる。さらに、そのβシート構造が何重にも重なることにより、ヒドロゲルを形成し得る。水溶液中において糖鎖−ポリペプチド複合体がβシート構造を形成していることの確認方法は特に限定されないが、例えば、糖鎖−ポリペプチド複合体を含む水溶液の円偏光二色性（ＣＤ）を測定することにより、確認することができる。一般的に、βシート構造を有する分子の特徴として、１９７ｎｍ付近の波長に正の吸収がみられ、２１６ｎｍ付近の波長に負の吸収がみられることから、円偏光二色性の測定により、これらの波長付近のピークを確認することによって、βシート構造の形成を確認することができる。
本発明に係る糖鎖−ポリペプチド複合体は、極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基が交互に配置されたアミノ酸配列を含むことにより、水溶液中においてβシート構造を形成した際に、βシート構造の一方の面には極性アミノ酸残基のみが配置され得、他方の面に非極性アミノ酸残基のみが配置されうる。したがって、かかるβシート構造は、疎水面（非極性アミノ酸残基のみが配置された面）を隠すように集合して二層構造を形成しうる。そして、分子の自己集合が進むにつれてこのβシートの層構造が伸長してゆき、三次元の立体構造（例えば、ヒドロゲル）を形成しうる。本明細書において、このような性質を有するポリペプチドをＳＡＰ（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ）と記載することがある。
本発明において、「ｐＨが中性付近」であるとは、ｐＨが７．０付近であることを意味し、より具体的にはｐＨが５．０〜９．０の範囲、好ましくは、ｐＨが６．０〜８．０の範囲内であることを意味する。
本発明の一実施形態においては、糖鎖−ポリペプチド複合体が、ｐＨが中性付近の水溶液中において自己集合してβシート構造を含むヒドロゲルを形成しうるものであることを特徴とするが、当該特徴を有している限り、ｐＨが中性付近以外の水溶液中においても自己集合してβシート構造を含むヒドロゲルを形成しうるものを除外するものではない。
本発明に係る糖鎖−ポリペプチド複合体は、極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基が交互に配置されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むが、当該アミノ酸配列の長さは限定されず、好ましくは８〜３４個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であってよく、より好ましくは１２〜２５個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であってよく、さらに好ましくは１６〜２１個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であってよい。
本発明に係る糖鎖−ポリペプチド複合体は、極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基が交互に配置されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むが、本発明において、「アミノ酸」とは、その最も広い意味で用いられ、タンパク質構成アミノ酸のみならずアミノ酸変異体および誘導体といったようなタンパク質非構成アミノ酸を含む。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本発明におけるアミノ酸として、例えば、タンパク質構成Ｌ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸；アミノ酸変異体および誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β−アラニン、オルニチンなどのタンパク質非構成アミノ酸；およびアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられることを理解するであろう。タンパク質非構成アミノ酸の例として、α−メチルアミノ酸（α−メチルアラニンなど）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジンおよびα−メチル−ヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）および側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられる。本発明の好ましい態様において、本発明において用いられるアミノ酸は、タンパク質構成アミノ酸であってよい。
本発明において、極性アミノ酸残基は、側鎖が極性を有しうるアミノ酸残基であれば特に限定されないが、例えば、酸性アミノ酸残基と塩基性アミノ酸残基が含まれる。本明細書において、酸性アミノ酸残基は、例えば、アスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ）残基、および、グルタミン酸（Ｇｌｕ：Ｅ）などを含み、塩基性アミノ酸とは、例えば、アルギニン（Ａｒｇ：Ｒ）、リジン（Ｌｙｓ：Ｋ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ：Ｈ）などを含む。
なお、本明細書中において、例えば「アスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ）」などの表記は、アスパラギン酸の略号として、三文字表記で「Ａｓｐ」、一文字表記で「Ｄ」を用いることがあることを意味する。
また、本明細書において、中性アミノ酸残基のうち、水酸基、酸アミド基、チオール基等を含むアミノ酸残基は、極性を有するものとして、極性アミノ酸残基に含まれるものとする。例えば、本明細書において、チロシン（Ｔｙｒ：Ｙ）、セリン（Ｓｅｒ：Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ：Ｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ：Ｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ：Ｑ）、システイン（Ｃｙｓ：Ｃ）は極性アミノ酸残基に含まれる。
本明細書において、非極性アミノ酸残基は、側鎖が極性を有しないアミノ酸であれば特に限定されないが、例えば、アラニン（Ａｌａ：Ａ）、バリン（Ｖａｌ：Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ：Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ：Ｉ）、メチオニン（Ｍｅｔ：Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ：Ｆ）、トリプトファン（Ｔｒｐ：Ｗ）、グリシン（Ｇｌｙ：Ｇ）、プロリン（Ｐｒｏ：Ｐ）などを含む。
本発明に係る糖鎖−ポリペプチド複合体において、「極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基が交互に配置されたアミノ酸配列」は、好ましくは、当該アミノ酸配列は「ＲＡＤＡ」の繰り返し配列（繰り返しが２〜８回、好ましくは繰り返しが３〜６回）、または、「ＲＡＴＡＲＡＥＡ」の繰り返し配列（繰り返しが１〜４回、好ましくは繰り返しが２〜３回）であってよく、より好ましくは、当該アミノ酸配列は、ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ（配列番号１）、ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ（配列番号２）、および、ＲＡＴＡＲＡＥＡＲＡＴＡＲＡＥＡ（配列番号３）からなる群から選択されるアミノ酸配列であってよい。
本発明において、「糖鎖」とは、単位糖（単糖および／またはその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される単糖類および多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸並びにそれらの複合体および誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。糖鎖は直鎖型であっても分岐鎖型であってもよい。
また、本発明において、「糖鎖」には糖鎖の誘導体も含まれ、糖鎖の誘導体としては、例えば、糖鎖を構成する糖が、カルボキシ基を有する糖（例えば、Ｃ−１位が酸化されてカルボン酸となったアルドン酸（例えば、Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルコン酸）、末端のＣ原子がカルボン酸となったウロン酸（Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルクロン酸））、アミノ基またはアミノ基の誘導体を有する糖（例えば、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミンなど）、アミノ基およびカルボキシ基を両方とも有する糖（例えば、Ｎ−グリコイルノイラミン酸、Ｎ−アセチルムラミン酸など）、デオキシ化された糖（例えば、２−デオキシ−Ｄ−リボース）、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などである糖鎖が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明に係る糖鎖−ポリペプチド複合体において、ポリペプチドに結合される糖鎖は特に限定されないが、生体適合性の観点から、生体内で複合糖質（糖ペプチド（または糖タンパク質）、プロテオグリカン、糖脂質等）として存在する糖鎖であることが好ましい。かかる糖鎖としては、生体内で糖ペプチド（または糖タンパク質）としてペプチド（またはタンパク質）に結合している糖鎖であるＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖等が挙げられる。
本発明に係る糖鎖−ポリペプチド複合体において、ポリペプチドに結合される糖鎖は、例えば、ジシアロ（Ｄｉｓｉａｌｏ）糖鎖、アシアロ（Ａｓｉａｌｏ）糖鎖、ジグルクナック（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）糖鎖、ジマンノース（ＤｉＭａｎ）糖鎖、グルクナック（ＧｌｃＮＡｃ）糖鎖、マルトトリオース（Ｍａｌｔｏｔｒｉｏｓｅ）糖鎖、マルトース（Ｍａｌｔｏｓｅ）糖鎖、マルトテトラオース（Ｍａｌｔｏｔｅｔｒａｏｓｅ）糖鎖、マルトヘプタオース（Ｍａｌｔｏｈｅｐｔａｏｓｅ）糖鎖、β−シクロデキストリン（β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）糖鎖、γ−シクロデキストリン（γ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）糖鎖を用いることができる。
より具体的には、本発明に用いられる糖鎖は、以下の式（１）で示すジシアロ糖鎖であってよく、以下の式（２）で示すアシアロ糖鎖であってよく、以下の式（３）で示すジグルクナック糖鎖であってよく、以下の式（４）で示すジマンノース糖鎖であってよく、以下の式（５）で示すグルクナック糖鎖であってよく、以下の式（６）で示すマルトトリオース糖鎖であってよく、以下の式（７）で示すマルトース糖鎖であってよく、以下の式（８）で示すマルトテトラオース糖鎖であってよく、以下の式（９）で示すマルトヘプタオース糖鎖であってよく、以下の式（１０）で示すβ−シクロデキストリン糖鎖であってよく、以下の式（１０−２）で示すγ−シクロデキストリン糖鎖であってよい。

式（１）ジシアロ糖鎖

式（２）アシアロ糖鎖

式（３）ジグルクナック糖鎖

式（４）ジマンノース糖鎖

式（５）グルクナック糖鎖

式（６）マルトトリオース糖鎖

式（７）マルトース糖鎖

式（８）マルトテトラオース糖鎖

式（９）マルトヘプタオース糖鎖

式（１０）β−シクロデキストリン糖鎖

式（１０−２）γ−シクロデキストリン糖鎖
本発明において、上記のジシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖、ジマンノース糖鎖、またはマルトヘプタオース糖鎖の非還元末端から１または複数の糖を失った糖鎖も用いることができる。
本発明において、糖鎖が結合されるアミノ酸残基は特に限定されないが、例えば糖鎖をシステイン（Ｃｙｓ：Ｃ）またはアスパラギン（Ａｓｎ：Ｎ）に結合させることができ、好ましくはシステイン（Ｃｙｓ：Ｃ）に結合させることができる。
本発明において、アミノ酸に糖鎖を結合させる方法は特に限定されず、例えば、アミノ酸残基に糖鎖を直接結合してもよく、アミノ酸残基にリンカーを介して糖鎖を結合させてもよい。
また、本発明において、糖鎖が結合したアミノ酸残基は、「極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基が交互に配置されたアミノ酸配列」に対して直接結合していてもよく、例えば、リンカーを介して結合していてもよい。
このようなリンカーとしては、例えば、アミノ酸とペプチド結合できるように、両末端にアミノ基およびカルボキシ基を有するアルキル鎖やＰＥＧ鎖等を挙げることができる。このようなリンカーとしては、例えば、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−（式中、ｎは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは１〜１５の整数を示す。）や−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−（式中、ｍは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは１〜７の整数を示す。）等を挙げることができる。より具体的には、−ＮＨ−（ＣＨ２）１１−ＣＯ−（Ｃ１２ｌｉｎｋｅｒ）や−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−（ＰＥＧｌｉｎｋｅｒ）等を挙げることができる。
本発明の糖鎖−ポリペプチド複合体は、当業者に公知のポリペプチド合成方法に、糖鎖付加工程を組み込むことで製造することができる。糖鎖付加に際しては、トランスグルタミナーゼに代表される、酵素を利用する方法も用いることができるが、この場合、付加する糖鎖が大量に必要になる、最終工程後の精製が煩雑になる、糖鎖の付加位置および付加可能な糖鎖が制限される、等の問題があるため、アッセイ用等の少量の合成には用いることが可能でも、大規模な製造には実用的な方法とは言えないことがある。
本発明の糖鎖−ポリペプチド複合体の簡便な製造方法の具体例として、以下、糖鎖が結合したＡｓｎ（糖鎖付加Ａｓｎ）を使用し、固相合成、液相合成等の公知のペプチド合成方法を適用することにより糖鎖−ポリペプチド複合体を製造する方法（Ａ法）、および、任意のアミノ酸残基をＣｙｓとしたポリペプチドを公知のペプチド合成方法に従って製造し、その後、Ｃｙｓに化学合成により糖鎖を付加し、糖鎖−ポリペプチド複合体を製造する方法（Ｂ法）を例示する。これらの製造方法を参考に、当業者であれば様々な方法で糖鎖−ポリペプチド複合体を製造することが可能である。
また、これらのＡ法およびＢ法は、２つ以上を組み合わせて行うことも可能である。アッセイなどに用いる少量の合成であれば、さらに、上記の方法に、転移酵素による糖鎖伸長反応を組み合わせることも可能である。なお、Ａ法は、国際公開第２００４／００５３３０号パンフレット（ＵＳ２００５２２２３８２（Ａ１））に、Ｂ法は、国際公開第２００５／０１００５３号パンフレット（ＵＳ２００７０６０５４３（Ａ１））に、それぞれ記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。また、Ａ法およびＢ法において用いられる糖鎖構造が均一な糖鎖の製造に関しては、国際公開第０３／００８４３１号パンフレット（ＵＳ２００４１８１０５４（Ａ１））、国際公開第２００４／０５８９８４号パンフレット（ＵＳ２００６２２８７８４（Ａ１））、国際公開第２００４／０５８８２４号パンフレット（ＵＳ２００６００９４２１（Ａ１））、国際公開第２００４／０７００４６号パンフレット（ＵＳ２００６２０５０３９（Ａ１））、国際公開第２００７／０１１０５５号パンフレット等に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。
糖鎖−ポリペプチド複合体を製造する方法（Ａ法）
糖鎖−ポリペプチド複合体は、例えば、以下に概略を示すように、糖鎖が結合したＡｓｎを用いた固相合成によって製造することができる。
（１）脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシ基を樹脂（レジン）へ結合させる。この場合、アミノ酸のアミノ基窒素を脂溶性保護基で保護しているので、アミノ酸同士の自己縮合は防止され、レジンとアミノ酸とが反応して結合が起こる。
（２）得られた反応物の脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる。
（３）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシ基とを、アミド化反応させる。
（４）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる。
（５）上記（３）および（４）の工程を１回以上繰り返すことにより、任意の数の任意のアミノ酸が連結した、末端にレジンを結合し、他端に遊離アミノ基を有するペプチドが得られる。
（６）上記（５）で合成したペプチドの遊離アミノ基をアセチル基で保護する場合、無水酢酸、酢酸等を用いてアセチル化することも好ましい。
（７）最後に、酸でレジンを切断することにより、所望のアミノ酸配列を有するペプチドを得ることができる。
ここで、（１）において、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖付加Ａｓｎを用い、当該アスパラギン部分のカルボキシ基とレジンの水酸基とを反応させれば、Ｃ末端に糖鎖付加Ａｓｎを有するペプチドを得ることができる。
また、（２）の後、または、（３）と（４）を１回以上の任意の回数繰り返した後、（３）において、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖付加Ａｓｎを用いれば、ポリペプチドの任意の箇所に糖鎖を結合させることができる。
このように、（１）および（３）のいずれかの工程で、２回以上、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖付加Ａｓｎを用いることで、ポリペプチドの任意の２ヶ所以上に糖鎖を結合させることができる。
糖鎖付加Ａｓｎを結合させた後、脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、その直後に工程（７）を行えば、Ｎ末端に糖鎖付加Ａｓｎを有するポリペプチドを得ることができる。
Ｃ末端をアミド基として供給する樹脂（レジン）としては、通常、固相合成で使用する樹脂（レジン）であればよく、例えば、アミノ基で官能化されたＲｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ−レジン（メルク社製）、Ｒｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）や、ＮＨ−ＳＡＬ−レジン（渡辺化学社製）を用いることが好ましい。また、アミノ基で官能化されたＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ−レジン（メルク社製）等にＦｍｏｃ−ＮＨ−ＳＡＬ−レジン−リンカー（渡辺化学社製）等を結合させてもよい。このレジンとペプチドを酸で切断することにより、ペプチドのＣ末端アミノ酸をアミド化することができる。
また、Ｃ末端をカルボン酸にする場合の樹脂（レジン）としては、例えば、塩素で官能化された２−クロロトリチルクロリド樹脂（メルク社製）や、アミノ基で官能化されたＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）、水酸基を有するＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＴアルコール樹脂（メルク社製）、Ｗａｎｇレジン（メルク社製）、ＨＭＰＡ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）等を用いることができる。また、Ａｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジンとアミノ酸との間にリンカーを存在させてもよく、このようなリンカーとして、例えば、４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸（ＨＭＰＡ）、４−(４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ) −ブチル酢酸（ＨＭＰＢ）等を挙げることができる。Ｃ末端のアミノ酸が樹脂にあらかじめ結合したＨ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｉｔｙｌ ＮｏｖａＰＥＧ樹脂（メルク社製）等も用いることができる。
樹脂と脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸との結合は、例えば、水酸基を有する樹脂や塩素で官能化された樹脂を使用するには、アミノ酸のカルボキシ基を樹脂へエステル結合させる。また、アミノ基で官能化された樹脂を使用する場合には、アミノ酸のカルボキシ基を樹脂にアミド結合により結合させる。
なお、２−クロロトリチルクロリド樹脂は、固相合成においてペプチド鎖を伸長する際、末端にあるＣｙｓのラセミ化を防止することができる点において、好ましい。
糖鎖−ポリペプチド複合体を製造する方法−２（Ａ法）
糖鎖−ポリペプチド複合体は、例えば、以下に概略を示すように、糖鎖が結合したＡｓｎを用いた液相合成によって製造することができる。
（１）脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシ基をアミノ基が遊離でカルボキシ基が保護またはアミド化されたアミノ酸へ結合させる。
（２）得られた反応物の脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる。
（３）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシ基とを、溶液中でアミド化反応させる。この場合、Ｎ末端側のアミノ酸のアミノ基窒素を脂溶性保護基で保護しており、Ｃ末端側のカルボキシ基は保護またはアミド化されているので、アミノ酸同士の自己縮合は防止され、遊離のアミノ基とカルボキシ基とが反応して結合が起こる。
（４）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる。
（５）上記（３）および（４）の工程を１回以上繰り返すことにより、任意の数の任意のアミノ酸が連結した、Ｃ末端のカルボキシ基が保護またはアミド化され、Ｎ末端に遊離アミノ基を有するペプチドが得られる。
（６）上記（５）で合成したペプチドの遊離アミノ基をアセチル基で保護する場合、無水酢酸、酢酸等を用いてアセチル化することも好ましい。
（７）最後に、酸で側鎖の脂溶性保護基を切断することにより、所望のアミノ酸配列を有するペプチドを得ることができる。
糖鎖−ポリペプチド複合体を製造する方法−３（Ａ法）
糖鎖−ポリペプチド複合体は、例えば、以下に概略を示すように、糖鎖が結合したＡｓｎを用いたフラグメント合成法によって製造することができる。
（１）上記の糖鎖−ポリペプチド複合体を製造する方法（Ａ法）の（１）−（６）によって、アセチル基または脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたポリペプチドまたは糖鎖−ポリペプチド複合体を樹脂上に合成する。
（２）側鎖保護基が脱保護されない条件で、レジンからポリペプチドまたは糖鎖−ポリペプチド複合体を切断し、Ｃ末端に遊離のカルボキシを有し、Ｎ末端がアセチル基または脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたポリペプチドまたは糖鎖−ポリペプチド複合体を得る。
（３）得られたアセチル基または脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたポリペプチドまたは糖鎖−ポリペプチド複合体を、固相合成法または液相合成法により、樹脂またはポリペプチドと連結させる。
（４）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる。
（５）上記（３）および（４）の工程を１回以上繰り返すことにより、任意の数の任意のアミノ酸が連結したペプチドが得られる。
（６）最後に、酸でレジンを切断することにより、所望のアミノ酸配列を有するペプチドを得ることができる。
脂溶性保護基としては、例えば９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基等の、カーボネート系またはアミド系の保護基等を挙げることができる。アミノ酸に脂溶性保護基を導入するには、例えばＦｍｏｃ基を導入する場合には９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミジルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて反応を行うことにより導入できる。反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１〜５時間程度行うのが良い。
脂溶性保護基で保護したアミノ酸としては、市販のものも使用することができる。例えば、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＡＩａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨを挙げることができる。
また、脂溶性保護基で保護したアミノ酸であって、側鎖に保護基を導入したものとして、例えば、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを挙げることができる。
また、糖鎖−ポリペプチド結合体のアミノ酸配列中に、リンカーを付加させたい場合には、固相合成の過程において、上記の脂溶性保護基で保護したアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基で保護したリンカーを使用することで、好ましい位置に、リンカーを挿入することができる。
２−クロロトリチルクロリド樹脂を用いる場合、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、トリエチルアミン、ピリジン、２，４，６−コリジン等の塩基を用いることでエステル化を行うことができる。また、水酸基を有する樹脂を用いる場合、エステル化触媒として、例えば１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）等の公知の脱水縮合剤を用いることができる。アミノ酸と脱水縮合剤との使用割合は、前者１等量に対して、後者が、通常１〜１０等量、好ましくは２〜５等量である。
エステル化反応は、例えば、固相カラムにレジンを入れ、このレジンを溶剤で洗浄し、その後アミノ酸の溶液を加えることにより行うのが好ましい。洗浄用溶剤としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２−プロパノール、ジクロロメタン等を挙げることができる。アミノ酸を溶解する溶媒としては、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＤＭＦ、ジクロロメタン等を挙げることができる。エステル化反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１０分〜３０時間程度、好ましくは１５分〜２４時間程度行うのが良い。
この時固相上の未反応の基を、無水酢酸等を用いてアセチル化してキャッピングすることも好ましい。
脂溶性保護基の脱離は、例えば塩基で処理することにより行うことができる。塩基としては、例えばピペリジン、モルホリン等を挙げることができる。その際、溶媒の存在下で行うのが好ましい。溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール等を挙げることができる。
遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシ基とのアミド化反応は、活性化剤および溶媒の存在下行うのが好ましい。
活性化剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＷＳＣ／ＨＣｌ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ジエチルシアノホスホネート（ＤＥＰＣ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウム（ＤＩＰＣＩ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、ヒドロキシフタルイミド（ＨＯＰｈｔ）、ペンタフルオロフェノール（Ｐｆｐ−ＯＨ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−５−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム ３−オキシド ヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスホネート（ＨＡＴＵ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロジ−４−オキサ−１，２，３−ベンゾトリアジン（Ｄｈｂｔ）、４−(４,６−ジメトキシ−１,３,５−トリアジン−２−イル)−４−メチルモルフォリニウム クロライド ｎ−ハイドレート（ＤＭＴ−ＭＭ）等を挙げることができる。
活性化剤の使用量は、脂溶性の保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸に対して、１〜２０当量、好ましくは１〜１０当量、さらに好ましくは、１〜５当量とするのが好ましい。
溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ジクロロメタン等を挙げることができる。反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１０分〜３０時間程度、好ましくは１５分〜２４時間程度行うのが良い。脂溶性保護基の脱離は、上記と同様に行うことができる。
アミノ基で官能化されたＲｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ−レジン（メルク社製）、Ｒｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）、ＮＨ−ＳＡＬ−レジン（渡辺化学社製）や、ＮＨ−ＳＡＬ−レジン−リンカーが結合したＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ−レジン（メルク社製）等にＣ末端のアミノ酸を導入する場合、上記のアミド化反応を用いて導入することができる。
樹脂（レジン）からペプチド鎖を切断するには酸で処理するのが好ましい。酸としては、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、弗化水素（ＨＦ）等を挙げることができる。
このようにして、所望の位置に糖鎖付加Ａｓｎを有する糖鎖−ポリペプチド複合体を得ることができる。
なお、本発明の一実施態様において、固相合成に用いる糖鎖付加Ａｓｎにおける糖鎖上の非還元末端にシアル酸を含む場合には、酸処理によりシアル酸が切断されるのを防ぐために、当該シアル酸のカルボキシ基を、保護基により保護していることが好ましい。保護基としては、例えば、ベンジル基、アリル基、ジフェニルメチル基、フェナシル基等を挙げることができる。保護基の導入および保護基の脱離の方法は、公知の方法により行うことができる。
糖鎖−ポリペプチド複合体を製造する方法（Ｂ法）
糖鎖−ポリペプチド複合体は、まずポリペプチドを合成し、後で合成したポリペプチドへ糖鎖を付加する方法によっても製造することができる。具体的には、糖鎖を付加したい位置にＣｙｓを含むポリペプチドを、固相合成法、液相合成法、細胞により合成する方法、天然に存在するものを分離抽出する方法等により製造する。ポリペプチドを固相合成法または液相合成法により合成する場合、アミノ酸は一残基ずつ連結させても良く、ポリペプチドを連結させてもよい。ここで、ジスルフィド結合を形成する予定の位置にあるＣｙｓ等、糖鎖を付加しないＣｙｓに対しては、例えばアセトアミドメチル（Ａｃｍ）基で保護しておく。また、糖鎖を付加せず、かつ、ジスルフィド結合の形成にも使用しないＣｙｓを糖鎖−ポリペプチド複合体に導入する場合には、糖鎖付加工程およびジスルフィド結合形成工程の間、Ｃｙｓを保護基により保護しておき、その後脱保護するようにしてＣｙｓを導入することができる。このような保護基としては、例えば、ｔｅｒｔ−ブチル（ｔＢｕ）や４−メトキシベンジルを挙げることができる。
また、１つのポリペプチド中のＣｙｓに、異なる糖鎖を付加する場合には、最初に糖鎖を導入するＣｙｓを無保護とし、次に異なる糖鎖を導入するＣｙｓを、ＳｔＢｕ等により保護しておくことで、異なる糖鎖を導入することができる。具体的には、固相合成等によりポリペプチドを合成する際、第一の糖鎖を導入したいＣｙｓを無保護とし、かつ、第二の糖鎖を導入したいＣｙｓをＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ等を用いて、保護基を有するＣｙｓとする。その後、ＳｔＢｕ等の保護基を保持したまま、無保護のＣｙｓへ糖鎖を導入する。次に、ＳｔＢｕ基等を脱保護することで、無保護となったＣｙｓへ異なる糖鎖を導入することができる。なお、第一の糖鎖を導入したいＣｙｓおよび第二の糖鎖を導入したいＣｙｓは、１つ又は複数個とすることができる。
なお、ＳｔＢｕ基の脱保護は、トリス(２-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、トリブチルホスフィン等の還元剤を用いて反応させることにより脱保護することができる。上記反応は、通常０〜８０℃、好ましくは、５〜６０℃、更に好ましくは１０〜３５℃で行うのが良い。反応時間は、好ましくは、通常３０分〜５時間程度である。反応終了後は、適宜、公知の方法（例えば、高速液体カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））で精製するのが良い。
異なる糖鎖を導入する際には、Ｃｙｓの脱保護工程における還元条件やＨＰＬＣ等の精製工程における酸性条件に対して、より安定な糖鎖から導入することが好ましい。特に、シアル酸含有糖鎖を導入する際には、シアル酸を有さない糖鎖又はシアル酸残基数が少ない糖鎖から、先に導入することが好ましい。
また、糖鎖−ポリペプチド複合体のアミノ酸配列中に、リンカーを付加させたい場合には、例えば固相合成の過程において、脂溶性保護基で保護したアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基で保護したリンカーを使用することで、合成したポリペプチドの好ましい位置に、リンカーを挿入することができる。
次に、ハロアセチル化糖鎖誘導体を上記で得た無保護のＣｙｓを含むペプチドと反応させることにより、糖鎖を無保護のＣｙｓのチオール基と反応させ、ペプチドに結合させる。上記反応は、リン酸緩衝液、トリス‐塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液、またはこれらの混合溶液中において、通常０〜８０℃、好ましくは、１０〜６０℃、更に好ましくは１５〜３５℃で行うのが良い。反応時間は、通常１０分〜２４時間、好ましくは、通常３０分〜５時間程度である。反応終了後は、適宜、公知の方法（例えば、ＨＰＬＣ）で精製するのが良い。
ハロアセチル化糖鎖誘導体は、例えば、アスパラギン結合型糖鎖の１位の炭素に結合している水酸基を、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−（ＣＯ）−ＣＨ２Ｘ（Ｘはハロゲン原子、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０〜４の整数を示す。）で置換した化合物である。
具体的には、ハロアセチル化複合型糖鎖誘導体とＣｙｓ含有ポリペプチドとをリン酸緩衝液中、室温で反応させる。反応終了後、ＨＰＬＣで精製することにより糖鎖が結合したＣｙｓを有する糖鎖−ポリペプチド複合体を得ることができる。
また、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、アセトニトリルといった有機溶媒と、上記の緩衝液との混合溶液中で反応を行うこともできる。このとき、有機溶媒の比率は、０〜９９％（ｖ／ｖ）の範囲で、上記緩衝液に添加することができる。緩衝液への溶解性が低い無保護のＣｙｓを含むペプチドは、このような有機溶媒を添加することにより反応溶液への溶解性を向上させることができ、好ましい。
または、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、アセトニトリルといった有機溶媒や、それらの混合溶液中で反応を行うこともできる。その際、塩基の存在下で行うのが好ましい。塩基としては、例えばＤＩＰＥＡ、トリエチルアミン、ピリジン、２，４，６−コリジン等を挙げることができる。また、グアニジン塩酸塩や尿素を緩衝溶液に加えた混合溶液中においても反応を行うことができる。なお、グアニジン塩酸塩や尿素は、最終濃度が１Ｍ〜８Ｍとなるように上記緩衝液に加えることができる。グアニジン塩酸塩や尿素の添加によっても、緩衝液への溶解性の低いペプチドの溶解性を向上させることができ、好ましい。
さらに、無保護のＣｙｓを含むポリペプチドが、ジスルフィド結合を介した２量体を形成することを防止するために、トリス(２-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）やジチオトレイトール（ＤＴＴ）を緩衝液に添加して反応させることもできる。ＴＣＥＰやＤＴＴは、最終濃度が１０μＭ〜１０ｍＭとなるように緩衝液に加えることができる。
また、糖鎖を目的のＣｙｓへ結合させた後、Ａｃｍ等で保護されたＣｙｓの保護基を脱保護する。保護基がＡｃｍ基である場合は、水、メタノール、酢酸、またはこれらの混合溶液中において、ヨウ素、酢酸水銀（ＩＩ）、硝酸銀（Ｉ）、または、酢酸銀（Ｉ）等を用いて反応させることにより脱保護することができる。
上記反応は、通常０〜８０℃、好ましくは、５〜６０℃、更に好ましくは１０〜３５℃で行うのが良い。反応時間は、好ましくは、通常５分〜２４時間程度である。反応終了後は、ＤＴＴや塩酸等により処理した後、適宜、公知の方法（例えば、ＨＰＬＣ）で精製するのが良い。
このようにして、所望の位置に糖鎖が結合したＣｙｓを有する糖鎖−ポリペプチド複合体を得ることができる。また、このように精製された糖鎖−ポリペプチド複合体は、後述するように、脱保護されたＣｙｓ同士でのジスルフィド結合を形成させることができる。
また、ジシアロ糖鎖やモノシアロ糖鎖等のシアル酸含有糖鎖をペプチド配列中に複数本有する糖鎖−ポリペプチド複合体を製造する際には、導入する糖鎖上のシアル酸のカルボキシ基が、ベンジル（Ｂｎ）基、アリル基、ジフェニルメチル基、フェナシル基等により保護されたシアル酸含有糖鎖を用いることができる。
シアル酸のカルボキシ基が保護された糖鎖を導入した際には、後述する糖鎖−ポリペプチド複合体におけるジスルフィド結合の形成工程の後、シアル酸保護基の脱保護の工程をすることができる。
このように、シアル酸のカルボキシ基をベンジル基等で保護することにより、製造工程におけるＨＰＬＣ等による分離・精製工程が容易となる。また、シアル酸のカルボキシ基の保護は、酸に不安定なシアル酸の脱離を防ぐことも可能である。
糖鎖上のシアル酸のカルボキシ基の保護反応は、当業者に周知の方法により行うことができる。また、ジスルフィド結合を形成させた糖鎖−ポリペプチド複合体において、シアル酸のカルボキシ基の保護基は、塩基性条件下で加水分解することによって脱保護できる。上記反応は、通常０〜５０℃、好ましくは、０〜４０℃、更に好ましくは０〜３０℃で行うのが良い。反応時間は、好ましくは、通常５分〜５時間程度である。反応終了後は、リン酸や酢酸などの弱酸によって中和した後、適宜、公知の方法（例えば、ＨＰＬＣ）で精製するのが良い。
また、上記Ａ法およびＢ法により作製された糖鎖−ポリペプチド複合体は、空気および／または酸素、ヨウ素、ＤＭＳＯ、酸化および還元されたグルタチオンの混合物、フェリシアン酸カリウム、エルマン試薬（５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸））、トリフルオロ酢酸タリウム（III）、ならびに、アルキルトリクロロシランスルホキシドなどを用いた当業者に周知の方法で、Ｃｙｓ同士のジスルフィド結合を形成することができる。
なお、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ間でのジスルフィド結合を形成させる際に、ジスルフィド結合することが望ましくない糖鎖−ポリペプチド複合体中のＣｙｓに対しては、保護基により保護しておく。このような保護基としては、Ａｃｍ、ｔＢｕ、４−メトキシベンジル、４−メチルベンジル等、酸化条件で安定な保護基を用いることができる。
また、Ｂ法において、ジスルフィド結合の形成は、糖鎖の導入の前に行うことも可能である。ただし、ジスルフィド結合させたいＣｙｓに保護基が導入されている場合には、脱保護の工程がジスルフィド結合形成の工程よりも先となる。
また、Ｂ法においてハロアセチル化複合型糖鎖誘導体と反応させるアミノ酸は、チオール基を含有するアミノ酸であれば特に限定されず、例えば、Ｄ体のシステイン（Ｄ−Ｃｙｓ）、ホモシステイン、ノルシステイン、ペニシラミンなどもＣｙｓと同様に用いることが可能である。
本発明に係る糖鎖−ポリペプチド複合体に結合する糖鎖の種類は特に限定されないが、糖鎖−ポリペプチド複合体に結合している糖鎖に存在する糖残基の数の合計が５以上であることが好ましい。例えば、５糖以上の糖鎖を１本以上付加してもよく、５糖以下の糖鎖を複数本付加することにより、１つの糖鎖−ポリペプチド複合体に付加された糖鎖に存在する糖残基の数が５以上になるようにしてもよい。糖鎖を複数本付加する場合には、１つのペプチドに結合される糖鎖の種類は同一であってもよく、異なる種類の糖鎖を組み合わせて結合してもよいが、同一であることが好ましい。
例えば、糖鎖−ポリペプチド複合体に結合している糖鎖に存在する糖残基の数の合計が５の場合、２つの糖残基を有するマルトース糖鎖と、３つの糖残基を有するマルトトリオース糖鎖がそれぞれ１本ずつ結合していてもよい。また、糖鎖−ポリペプチド複合体に結合している糖鎖に存在する糖残基の数の合計が６の場合、マルトース糖鎖が３本結合されていてもよく、マルトトリオース糖鎖が２本結合されていてもよい。また、糖鎖−ポリペプチド複合体に結合している糖鎖に存在する糖残基の数の合計が７の場合、マルトース糖鎖が２本およびマルトトリオース糖鎖が１本結合していてもよく、７つの糖残基を有するジグルクナック糖鎖が１本結合していてもよい。同様に、糖鎖−ポリペプチド複合体に結合している糖鎖に存在する糖残基の数の合計が８以上の場合においても、様々な組み合わせの糖鎖が結合していてもよい。
本発明に係る糖鎖−ポリペプチド複合体に結合する糖鎖の数は、糖鎖−ポリペプチド複合体が、ｐＨが中性付近の水溶液中において自己集合することにより、βシート構造を形成しうるという特徴を失わない限り限定されない。例えば、１、２、３、４、５、または、６本であってよく、好ましくは、１、２、または、３本であってよい。
本発明に係る糖鎖−ポリペプチド複合体において、糖鎖が結合するアミノ酸残基の位置は、糖鎖−ポリペプチド複合体が、ｐＨが中性付近の水溶液中において自己集合することにより、βシート構造を形成しうるという特徴を失わない限り限定されない。例えば、糖鎖が結合するアミノ酸残基の位置はポリペプチドのＮ末端側および／またはＣ末端側であってよく、Ｎ末端側およびＣ末端側以外の位置であってもよい。
好ましくは、ポリペプチドのＮ末端に位置するアミノ酸残基から数えて、ｘ番目までの全てのアミノ酸、および、Ｃ末端に位置するアミノ酸残基から数えて、ｙ番目までの全てのアミノ酸（ここで、ｘおよびｙは整数であり、ｘ≧０であり、ｙ≧０であり、ｘ＋ｙは、ポリペプチドに結合している糖鎖の数の合計である）に糖鎖が結合していてもよい。
より具体的には、ポリペプチドに結合している糖鎖の数が１本の場合には、当該１本の糖鎖は、前記ポリペプチドのＮ末端に位置するアミノ酸残基、または、Ｃ末端に位置するアミノ酸残基と結合してもよい。
また、ポリペプチドに結合している糖鎖の数が２本の場合には、当該２本の糖鎖は、次の（１）〜（３）からなる群から選択されるアミノ酸残基と結合していてもよい。
（１）ポリペプチドのＮ末端に位置するアミノ酸残基から数えて１番目および２番目のアミノ酸残基
（２）ポリペプチドのＣ末端に位置するアミノ酸残基から数えて１番目および２番目のアミノ酸残基
（３）ポリペプチドのＮ末端に位置するアミノ酸残基、および、前記ポリペプチドのＣ末端に位置するアミノ酸残基
また、ポリペプチドに結合している糖鎖の数が３本の場合には、当該３本の糖鎖は、次の（１）〜（４）からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸残基と結合していてもよい。
（１）ポリペプチドのＮ末端に位置するアミノ酸残基から数えて１番目、２番目、および、３番目のアミノ酸残基
（２）ポリペプチドのＣ末端に位置するアミノ酸残基から数えて１番目、２番目、および、３番目のアミノ酸残基
（３）ポリペプチドのＮ末端に位置するアミノ酸残基から数えて１番目および２番目のアミノ酸残基、ならびに、ポリペプチドのＣ末端に位置するアミノ酸残基
（４）ポリペプチドのＮ末端に位置するアミノ酸残基、ならびに、ポリペプチドのＣ末端から数えて１番目および２番目に位置するアミノ酸残基
本発明に係る糖鎖−ポリペプチド複合体に付加される糖鎖は、分岐を有していることが好ましい。ここで、本発明において、ポリペプチドに結合された糖鎖が「分岐を有する糖鎖」であるとは、例えば、ジシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖のように、１つの糖鎖の中で分岐を有している場合に限定されず、例えば、１つのポリペプチドに複数本の直鎖状の糖鎖が付加されることにより、ペプチド全体として糖鎖が分岐を有している状態にある場合も含まれる。例えば、１つのペプチドにマルトース糖鎖やマルトトリオース糖鎖等の直鎖状の糖鎖が２本以上結合している場合も、本発明において「分岐を有する糖鎖」に含まれることとする。
本発明において、ヒドロゲルとは、分散媒が実質的に水であるゲルを意味する。本発明に係るペプチドを水に分散させると、ヒドロゲルを形成するが、ペプチドと水との混合割合は特に限定されず、ヒドロゲルの用途に応じて当業者が適宜混合割合を調節することができる。例えば、本発明の一実施形態に係る、Ｃ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４を用いてヒドロゲルを製造する場合、ペプチド濃度が０．５重量％以上である場合には広範なｐＨでヒドロゲルを形成するが、ペプチド濃度が約０．２５％重量％である場合には、中性ｐＨではヒドロゲルを形成し、酸性ｐＨではヒドロゲルを形成しないことがある。このように、本発明に係るペプチドから製造されたヒドロゲルは、ペプチド濃度が低濃度である場合、ｐＨによってヒドロゲル形成をコントロールすることができる。このような性質を利用して、例えば、ヒドロゲルの使用後にｐＨを変化させることにより、ゲルからゾルに変化させ、速やかに廃棄または排泄させることができる。
本発明において、ヒドロゲルの強度や性質についての評価方法は特に限定されないが、例えば、スチール球載荷試験や動粘液度測定によって評価することができる。スチール球載荷試験では、例えば、ダーラム管内で形成させたヒドロゲルの表面に所定の重量のスチール球を載荷し、スチール球がヒドロゲルの表面に留まるか、沈むかを観察することによって、ヒドロゲルの強度を評価することができる。また、スチール球載荷試験では、ヒドロゲル中の透明度や、不溶物・沈殿の有無を目視で確認することができる。ヒドロゲルの動粘液度測定では、対象となるヒドロゲルについて、検流計を用いて動粘度を測定することにより、時間の経過にともなうヒドロゲルの強度の変化を測定することができる。
なお、本実施例においてヒドロゲルを評価する場合には、ヒドロゲルを形成させる操作の一つとして、激しい撹拌操作を含んでいる。このような激しい撹拌操作を行うことにより、均一性の高いゲルを形成させることができ、より信頼性の高い評価を行うことができる。
本発明に係るヒドロゲルは様々な用途に用いることができるが、例えば、本発明に係るヒドロゲルは生体に対して安全性が高いことから、医薬用途（止血基材、血管塞栓材等の手術補助剤、医薬品等の徐放担体、外科手術や再生医療等における創傷被覆材、粘膜隆起材、歯槽骨再建材、角膜再生材などの組織再建材、組織培養実験等における三次元培養基材）や化粧品用途（スキンケア用品、ヘアケア用品等）に用いることができる。特に好ましくは、止血基材、徐放担体、または、培養基材として用いることができる。
本発明において、止血基材とは、生体からの出血を止めるために用いられる基材を広く意味する。本発明に係る止血基材は、本発明に係る糖鎖−ポリペプチド複合体と水のみを含むものに限定されず、その他の様々な成分を含んでいてもよい。例えば、消毒・殺菌成分を有する薬剤を含むことにより、傷口からの出血を止めるだけでなく、同時に傷口の殺菌・消毒も行うことができる。
本発明において、徐放担体とは、内包した物質や薬剤が徐々に放出される性質を有する担体を広く意味する。本発明に係る徐放担体に内包する物質は特に限定されず、様々な物質や薬剤を内包することができる。また、本発明に係る徐放担体に内包する物質や薬剤は１種類に限定されず、２種類以上の物質や薬剤を同時に内包することができる。
本発明において、培養基材とは、細胞や組織の培養の際に用いられる基材を広く意味する。例えば、細胞培養用のディッシュを本発明に係る培養基材でコートし、細胞を培養することによって、細胞の接着性・成長性を向上させることができる。また、例えば、本発明に係る培養基材に細胞や組織を内包させて培養することにより、細胞や組織の効率的な３次元培養を行うことができる。
本発明において、粘膜隆起材とは、内視鏡手術による胃癌や食道癌等の粘膜切除手術や粘膜下層剥離手術において、病変部位の粘膜隆起を形成する膜下注入材を広く意味する。例えば、内視鏡などで病変部位を切除する際、病変部位の下部に本発明に係る組織隆起材を注入し切除部位を隆起さることにより、病変部位の切除を容易に行うことができる。
本発明において、血管塞栓材とは、動脈塞栓術において、塞栓物として用いるための血管内塞栓促進用補綴材を広く意味する。肝臓がんや子宮筋腫などにおける動脈塞栓術において、本発明に係る血管塞栓材を病変部の上流にある動脈内に注入すると、血液と接触することによってヒドロゲルが形成される。これにより腫瘍への栄養の供給路である動脈を塞ぎ、腫瘍を死滅されることができる。
本発明において、組織再建材とは、再生医療において、生体内で組織を再建する際に足場となる材料を広く意味する。例えば、骨の再生において、本発明に係る組織再建材を注入すると、骨形成を行う細胞の足場となることができ、骨の再生を促進することを行うことができる。
なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられる場合があるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、しかしながら、本発明はいろいろな形態により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
本明細書において、例えば、Ｄｉｓｉａｌｏ−ＢｒＡｃと示した場合には、ブロモアセチル化されたジシアロ糖鎖を示す。また、例えば、Ｃ（Ｄｉｓｉａｌｏ）−（ＲＡＤＡ）４と示した場合には、ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡのアミノ酸配列を有するポリペプチドのＮ末端に、ジシアロ糖鎖が結合したシステイン残基が結合していることを示す。
（合成例１）Ｍａｌｔｏｈｅｐｔａｏｓｅ−ＢｒＡｃの合成
（合成例１−１） アミノ化
下記式（１１）であらわされる化合物１（商品名：マルトヘプタオース、東京化成社製）（５３．２ｍｇ、４６．１μｍｏｌ）を水（５ｍＬ）に溶解した。炭酸水素ナトリウム（３．６ｇ）を溶液に加え、３７℃に昇温後１９時間撹拌した。水を加えた後、減圧条件下で濃縮を数回行った。再度水に溶解させ凍結乾燥し、下記式（１２）であらわされる化合物２を含む凍結乾燥品を得た。

式（１１）

式（１２）
（合成例１−２） ブロモアセチル化
合成例１−１で得られた化合物２と炭酸ナトリウム（８３．０ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ、化合物２に対し２０等量）を水に溶解し０℃に冷却した。ジクロロメタンに溶解したブロモアセチルブロミド（４０．０μＬ、０．４６ｍｍｏｌ、化合物２に対し１０等量）
をゆっくり滴下し、２時間撹拌した。ジクロロメタン及び水を用いて分相し、水槽に臭化水素酸を加えた。減圧条件下、水を一部濃縮した。
反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：水 Ｂ：アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９９．５：０．５→９０：１０ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１３）で表わされるＭａｌｔｏｈｅｐｔａｏｓｅ−ＢｒＡｃ（２６．７ｍｇ、２０．９μｍｏｌ、収率４６％）を得た。

式（１３）
（合成例２）Ｍａｌｔｏｓｅ−ＢｒＡｃの合成
化合物１のかわりに、下記式（１４）であらわされる化合物３（商品名：マルトース、東京化成社製）（２００ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）を用いた以外は合成例１と同様の手法で合成を行い、下記式（１５）であらわされるＭａｌｔｏｓｅ−ＢｒＡｃ（１７９．１ｍｇ、収率６７％）を得た。

式（１４）

式（１５）
（合成例３）Ｍａｌｔｏｔｒｉｏｓｅ−ＢｒＡｃの合成
化合物１のかわりに、下記式（１６）であらわされる化合物４（商品名：マルトトリオース、東京化成社製）（１００ｍｇ、１９８．６μｍｏｌ）を用いた以外は合成例１と同様の手法で合成を行い、下記式（１７）であらわされるＭａｌｔｏｔｒｉｏｓｅ−ＢｒＡｃ（５８．２ｍｇ、収率４７％）を得た。

式（１６）

式（１７）
（合成例４）Ｍａｌｔｏｔｅｔｒａｏｓｅ−ＢｒＡｃの合成
化合物１のかわりに、下記式（１８）であらわされる化合物５（商品名：マルトテトラオース、東京化成社製）（２００ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を用いた以外は合成例１と同様の手法で合成を行い、下記式（１９）であらわされるＭａｌｔｏｔｅｔｒａｏｓｅ−ＢｒＡｃ（１３３．１ｍｇ、収率５１％）を得た。

式（１８）

式（１９）
（合成例５）β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ−ＢｒＡｃの合成
化合物１のかわりに、下記式（２０）であらわされる化合物６（商品名：３Ａ−アミノ−３Ａ−デオキシ−(２ＡＳ，３ＡＳ) −β−シクロデキストリン水和物、東京化成社製）（１０１．５ｍｇ、８９．５μｍｏｌ）を用いた以外は合成例１−２と同様の手法で合成を行い、下記式（２１）であらわされるβ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ−ＢｒＡｃ（３１．２ｍｇ、収率２８％）を得た。

式（２０）

式（２１）
（合成例６）γ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ−ＢｒＡｃの合成
化合物１のかわりに、下記式（２２）であらわされる化合物７（商品名：３Ａ−アミノ−３Ａ−デオキシ−(２ＡＳ，３ＡＳ) −γ−シクロデキストリン水和物、東京化成社製）（１００．０ｍｇ、７７．１μｍｏｌ）を用いた以外は合成例１−２と同様の手法で合成を行い、下記式（２３）であらわされるγ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ−ＢｒＡｃ（４１．１ｍｇ、収率３８％）を得た。

式（２２）

式（２３）
（合成例７）Ｄｉｓｉａｌｏ−ＢｒＡｃの合成
ＷＯ２００５／０１００５３に記載の方法と同様の手法で合成を行い、下記式（２５）であらわされるＤｉｓｉａｌｏ−ＢｒＡｃを得た。

式（２５）
（合成例８）Ａｓｉａｌｏ−ＢｒＡｃの合成
ＷＯ２００５／０１００５３に記載の方法と同様の手法で合成を行い、下記式（２７）であらわされるＡｓｉａｌｏ−ＢｒＡｃを得た。

式（２７）
（合成例９）ＤｉＧｌｃＮＡｃ−ＢｒＡｃの合成
ＷＯ２００５／０１００５３に記載の方法と同様の手法で合成を行い、下記式（２９）であらわされるＤｉＧｌｃＮＡｃ−ＢｒＡｃを得た。

式（２９）
（合成例１０）ＤｉＭａｎ−ＢｒＡｃの合成
ＷＯ２００５／０１００５３に記載の方法と同様の手法で合成を行い、下記式（３１）であらわされるＤｉＭａｎ−ＢｒＡｃを得た。

式（３１）
（合成例１１）ＧｌｃＮＡｃ−ＢｒＡｃの合成
ＷＯ２００５／０１００５３に記載の方法と同様の手法で合成を行い、下記式（３３）であらわされるＧｌｃＮＡｃ−ＢｒＡｃを得た。

式（３３）
（合成例１２）ＤｉＢｎ−Ｄｉｓｉａｌｏ−ＢｒＡｃの合成
Ｄｉｓｉａｌｏ−ＢｒＡｃ（２８．９ｍｇ、１２．３μｍｏｌ）にＤＭＦ（０．５８ｍＬ）、臭化リチウム（２１．５ｍｇ、２４８μｍｏｌ）、臭化ベンジル（１４．６μＬ、１２２μｍｏｌ）を順次加え、３０℃で２０時間反応させた。臭化ベンジル（１４．６μＬ、１２２μｍｏｌ）をさらに添加して２０時間反応させた。反応液にトルエン（３０ｍＬ）を加え、遠心分離（１０，０００×ｇ、１０分間）の後、沈殿物を水（１００μＬ）に溶解してＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ‐１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：８．０ｍＬ／分、展開溶媒 水：アセトニトリル＝９５：５→７０：３０ ２０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（３５）で表されるＤｉＢｎ−Ｄｉｓｉａｌｏ−ＢｒＡｃ（７．６ｍｇ、収率２４％）を得た。

式（３５）
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１００Ｈ１５２ＢｒＮ７Ｏ６２：［Ｍ＋Ｎａ］＋ ２５４４．８、found ２５４４．４。
（合成例１３）Ｃ（Ｄｉｓｉａｌｏ）−（ＲＡＤＡ）４の合成
（合成例１３−１）Ａｃ−Ｃ（ＲＡＤＡ）４−ＮＨ ２ の合成
固相合成用カラムにＲｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＰＥＧＡ樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（１２４．５ｍｇ、４００μｍｏｌ）と１−ビスジメチルアミノメチレン−５−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム ３−オキシドヘキサフルオロホスフェイト（ＨＣＴＵ）（１５７．２ｍｇ、３８０μｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１０４．５μＬ、６００μｍｏｌ）のＤＭＦ（２．５ｍＬ）溶液を加え、１５分間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて保護された下記式（３６）で表わされる、樹脂に結合した状態にあるポリペプチド（配列番号４）を合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。

式（３６）
Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、無水酢酸及びピリジンを加え１時間振盪した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、４時間室温で振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドの一部をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ‐１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエント Ａ：Ｂ＝８８：１２→７８：２２％ １１分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（３７）で表わされるポリペプチド（配列番号５）（３２．７ｍｇ）を得た。

式（３７）
（合成例１３−２）チオールの糖鎖修飾反応
合成例１３−１に記載の方法で得られたポリペプチド（配列番号５）（２０．５ｍｇ、１１．２μｍｏｌ）と、合成例７で合成したＤｉｓｉａｌｏ−ＢｒＡｃ（６６．０ｍｇ、２８．０μｍｏｌ、ペプチド１に対して２．５等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３、３．７ｍＬ）に溶解し、室温で４時間反応させた。
反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（３８）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号６）（２３．８ｍｇ、５．８３μｍｏｌ、収率５２％）を得た。

式（３８）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１２１Ｈ２０３Ｎ３５Ｏ６２Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ ２０４０．５、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １３６０．７、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ １０２０．７、ｆｏｕｎｄ ２０４０．４、１３６０．６、１０２０．７。
（合成例１４）Ｃ（Ａｓｉａｌｏ）−（ＲＡＤＡ）４の合成
合成例１３−１で合成したポリペプチド（配列番号５）（２２．７ｍｇ、１２．５μｍｏｌ）と、合成例８で合成したＡｓｉａｌｏ−ＢｒＡｃ（５５．０ｍｇ、３１．２μｍｏｌ、ペプチド１に対して２．５等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３、４．７ｍＬ）に溶解し、室温で３時間反応させた。
反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５ １８分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（３９）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号７）（２０．５ｍｇ、５．８６μｍｏｌ、収率４７％）を得た。

式（３９）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１３３Ｈ２２３Ｎ３５Ｏ７２Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １７４９．２、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １１６６．５、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ８７５．１、ｆｏｕｎｄ １７４９．３、１１６６．２、８７４．９。
（合成例１５）Ｃ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４の合成
合成例１３−１で合成したポリペプチド（配列番号５）（２５．３ｍｇ、１３．９μｍｏｌ）と、合成例９で合成したＤｉＧｌｃＮＡｃ−ＢｒＡｃ（３０．０ｍｇ、２０．９μｍｏｌ、ペプチド１に対して１．５等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３、４．７ｍＬ）に溶解し、室温で３時間反応させた。
反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝８８：１２→８１：１９ １０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（４０）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号８）（２３．９ｍｇ、７．５３μｍｏｌ、収率５４％）を得た。

式（４０）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１２１Ｈ２０３Ｎ３５Ｏ６２Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １５８７．１、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １０５８．４、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ７９４．０、ｆｏｕｎｄ １５８６．７、１０５８．１、７９３．８。
（合成例１６）Ｃ（ＤｉＭａｎ）−（ＲＡＤＡ）４の合成
合成例１３−１で合成したポリペプチド（配列番号５）（１５．２ｍｇ、８．３７μｍｏｌ）と、合成例１０で合成したＤｉＭａｎ−ＢｒＡｃ（２１．５ｍｇ、２０．９μｍｏｌ、ペプチド１に対して２．５等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、３．１ｍＬ）に溶解し、室温で２時間反応させた。
反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（４１）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号９）（１６．９ｍｇ、６．１１μｍｏｌ、収率７３％）を得た。

式（４１）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１２１Ｈ２０３Ｎ３５Ｏ６２Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １３８３．９、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ９２２．９、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ６２９．５、ｆｏｕｎｄ １３８３．６、９２２．７、６９２．３。
（合成例１７）Ｃ（ＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４の合成
合成例１３−１で合成したポリペプチド（配列番号５）（１４．９ｍｇ、８．２１μｍｏｌ）と、合成例１１で合成したＧｌｃＮＡｃ−ＢｒＡｃ（５．６ｍｇ、１６．４μｍｏｌ、ペプチド１に対して２．０等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３、３．１ｍＬ）に溶解し、室温で２時間反応させた。
反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９５：５→５：９５ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（４２）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号１０）（１５．４ｍｇ、７．４２μｍｏｌ、収率９０％）を得た。

式（４２）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ７９Ｈ１３４Ｎ３２Ｏ３２Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １０３９．１、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ６９３．１、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ５２０．０、ｆｏｕｎｄ １０３９．０、６９２．６、５２０．０。
（合成例１８）Ｃ（Ｍａｌｔｏｈｅｐｔａｏｓｅ）−（ＲＡＤＡ）４の合成
合成例１３−１で合成したポリペプチド（配列番号５）（９．３ｍｇ、５．１２μｍｏｌ）と合成例１で合成したＭａｌｔｏｈｅｐｔａｏｓｅ−ＢｒＡｃ（９．８ｍｇ、７．６８μｍｏｌ、ペプチド１に対して１．５等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３、３．１ｍＬ）に溶解し、室温で４時間反応させた。
反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝８８：１２→７２：２８ １６分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（４３）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号１１）（５．１ｍｇ、１．７０μｍｏｌ、収率３３％）を得た。

式（４３）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１１３Ｈ１９１Ｎ３１Ｏ６２Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １５０５．０、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １００３．７、ｆｏｕｎｄ １５０４．６、１００３．４。
（合成例１９）Ｃ（β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）−（ＲＡＤＡ）４の合成
合成例１３−１で合成したポリペプチド（配列番号５）（１７．７ｍｇ、９．７５μｍｏｌ）と、合成例５で合成したβ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ−ＢｒＡｃ（３６．７ｍｇ、２９．２μｍｏｌ、ペプチド１に対して３．０等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３、３．３ｍＬ）に溶解し、室温で２４時間反応させた。
反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝８８：１２→７２：２８ １６分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（４４）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号１２）（６．８ｍｇ、２．２７μｍｏｌ、収率２３％）を得た。

式（４４）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１１３Ｈ１８９Ｎ３１Ｏ６１Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １４９６．０、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ９９７．７、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ７４８．５、ｆｏｕｎｄ １４９５．６、９９７．７、７４８．３。
（合成例２０）Ｃ（γ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）−（ＲＡＤＡ）４の合成
合成例１３−１で合成したポリペプチド（配列番号５）（１６．０ｍｇ、８．８１μｍｏｌ）と、合成例６で合成したγ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ−ＢｒＡｃ（３６．７ｍｇ、２５．９μｍｏｌ、ペプチド１に対して３．０等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３、３．０ｍＬ）に溶解し、室温で５時間反応させた。
反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→５：９５ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（４５）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号１３）（６．０ｍｇ、１．９０μｍｏｌ、収率２２％）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１１９Ｈ１９９Ｎ３１Ｏ６６Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １５７７．１、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １０５１．７、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ７８９．０、ｆｏｕｎｄ １５７６．７、１０５１．４、７８８．８。
（合成例２１）Ｃ（Ｄｉｓｉａｌｏ）−（ＲＡＤＡ）５の合成
（合成例２１−１）Ａｃ−Ｃ（ＲＡＤＡ）５―ＮＨ ２ の合成
固相合成用カラムにＲｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＰＥＧＡ樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（１２４．５ｍｇ、４００μｍｏｌ）とＨＣＴＵ（１５７．２ｍｇ、３８０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．５μＬ、６００μｍｏｌ）のＤＭＦ（２．５ｍＬ）溶液を加え、１５分間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて保護された下記式（４６）で表わされる、樹脂に結合した状態にあるポリペプチド（配列番号１４）を合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。

式（４６）
Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、無水酢酸及びピリジンを加え１時間振盪した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、４時間室温で振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドの一部をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ‐１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエント Ａ：Ｂ＝８８：１２→７８：２２％ １１分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（４７）で表わされる化合物ポリペプチド（配列番号１５）（３２．７ｍｇ）を得た。

式（４７）
（合成例２１−２）チオールの糖鎖修飾反応
合成例２１−１で合成されたポリペプチド（配列番号１５）（１３．９ｍｇ、６．２４μｍｏｌ）と、合成例７で合成されたＤｉｓｉａｌｏ−ＢｒＡｃ（３６．５ｍｇ、１５．６μｍｏｌ、ペプチド１に対して２．５等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３、２．１ｍＬ）に溶解し、室温で３時間反応させた。
反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（４８）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号１６）（７．８ｍｇ、１．７４μｍｏｌ、収率２８％）を得た。

式（４８）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１７１Ｈ２８４Ｎ４４Ｏ９４Ｓ：［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １４９８．５、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ １１２４．１、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ８９９．５ ｆｏｕｎｄ １４９８．６、１１２３．９、８９９．４。
（合成例２２）Ｃ（Ａｓｉａｌｏ）−（ＲＡＤＡ）５の合成
合成例２１−１で合成されたポリペプチド（配列番号１５）（１８．８ｍｇ、８．４３μｍｏｌ）と、合成例８で合成されたＡｓｉａｌｏ−ＢｒＡｃ（４４．５ｍｇ、２５．３μｍｏｌ、ペプチド１に対して３．０等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、２．８ｍＬ）に溶解し、室温で２時間反応させた。
反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（４９）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号１７）（１６．０ｍｇ、４．０９μｍｏｌ、収率４９％）を得た。

式（４９）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１４９Ｈ２５０Ｎ４２Ｏ７８Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １９５５．９、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １３０４．３、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ９７８．５ ｆｏｕｎｄ １９５５．８、１３０４．２、９７８．２。
（合成例２３）Ｃ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）５の合成
合成例２１−１で合成されたポリペプチド（配列番号１５）（１９．４ｍｇ、８．７０μｍｏｌ）と、合成例９で合成されたＤｉＧｌｃＮＡｃ−ＢｒＡｃ（２０．０ｍｇ、２１．７μｍｏｌ、ペプチド１に対して２．５等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、３．１ｍＬ）に溶解し、室温で２時間反応させた。
反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９５：５→６０：４０ ２０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（５０）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号１８）（１６．８ｍｇ、４．６９μｍｏｌ、収率５４％）を得た。

式（５０）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１４９Ｈ２５０Ｎ４２Ｏ７８Ｓ：［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １１９６．２、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ８９７．４、 ｆｏｕｎｄ １１９５．９、８９７．２。
（合成例２４）Ｃ（ＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）５の合成
合成例２１−１で合成されたポリペプチド（配列番号１５）（１８．８ｍｇ、８．４３μｍｏｌ）と、合成例１１で合成されたＧｌｃＮＡｃ−ＢｒＡｃ（８．７ｍｇ、２５．３μｍｏｌ、ペプチド１に対して３．０等量）を７Ｍグアニジン、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、４．２ｍＬ）に溶解し、室温で１時間反応させた。
反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９５：５→５：９５ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（５１）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号１９）（１４．９ｍｇ、５．９９μｍｏｌ、収率７１％）を得た。

式（５１）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ９５Ｈ１６１Ｎ３９Ｏ３８Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １２４５．８、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ８３０．９、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ６２３．４ ｆｏｕｎｄ １２４５．１、８３０．８、６２３．３。
（合成例２５）Ｃ（ＤｉＢｎ−Ｄｉｓｉａｌｏ）−（ＲＡＤＡ）５の合成
合成例２１−１で合成したポリペプチド（配列番号１５）（２０．７ｍｇ、９．２９μｍｏｌ）と、合成例１２で合成したＤｉＢｎ−Ｄｉｓｉａｌｏ−ＢｒＡｃ（５８．６ｍｇ、２３．２μｍｏｌ、ペプチド１に対して２．５等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３、３．２ｍＬ）に溶解し、室温で１時間反応させた。
反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝８５：１５→７３：２７ １７分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（５２）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号２０）（７．５ｍｇ、１．６１μｍｏｌ、収率１７％）を得た。

式（５２）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１８５Ｈ２９６Ｎ４４Ｏ９４Ｓ：［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １５５８．６、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ １１６９．２、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ９３５．５ ｆｏｕｎｄ １５５８．４、１１６９．０、９２５．６。
（合成例２６）Ｃ（ＰＥＧ２０００）−（ＲＡＤＡ）５の合成
合成例２１−１で合成したポリペプチド（配列番号１５）（１５．９ｍｇ、７．１３μｍｏｌ）と、下記式（５３）で表わされる化合物（マレイミド化されたＰＥＧ、商品名：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（商標） ＭＥ−０２０ＭＡ、平均分子量２３３３、日油株式会社製）（２４．９ｍｇ、１０．７μｍｏｌ、ペプチド１に対して１．５等量）を８Ｍグアニジンを含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３、２．４ｍＬ）に溶解し、室温で１時間反応させた。

式（５３）
反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７５：２５→４０：６０ １２分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（５４）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号２１）（１０．９ｍｇ、２．３９μｍｏｌ、収率３４％）を得た。

式（５４）
（合成例２７）Ｃ（Ａｓｉａｌｏ）−（ＲＡＴＡＲＡＥＡ）２の合成
（合成例２７−１）Ａｃ−Ｃ−（ＲＡＴＡＲＡＥＡ）２−ＮＨ ２ の合成
固相合成用カラムにＲｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＰＥＧＡ樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（１２４．５ｍｇ、４００μｍｏｌ）とＨＣＴＵ（１５７．２ｍｇ、３８０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．５μＬ、６００μｍｏｌ）のＤＭＦ（２．５ｍＬ）溶液を加え、１５分間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて保護された下記式（５５）で表わされる、樹脂に結合した状態にあるポリペプチド（配列番号２２）を合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。

式（５５）
Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、無水酢酸及びピリジンを加え１時間振盪した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、４時間室温で振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドの一部をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ‐１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエント Ａ：Ｂ＝８８：１２→７８：２２％ １１分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（５６）で表わされるポリペプチド（配列番号２３）（３２．７ｍｇ）を得た。

式（５６）
（合成例２７−２）チオールの糖鎖修飾反応
合成例２７−１で合成したポリペプチド（配列番号２３）（７．３ｍｇ、４．０２μｍｏｌ）と、合成例８で合成したＡｓｉａｌｏ−ＢｒＡｃ（１７．７ｍｇ、１６．５μｍｏｌ、ペプチド１に対して１．５等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３、１．３ｍＬ）に溶解し、室温で３時間反応させた。
反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９５：５→２９：７１ １１分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（５７）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号２４）（４．６ｍｇ、１．３２μｍｏｌ、収率３３％）を得た。

式（５７）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１２３Ｈ２１１Ｎ３５Ｏ６０Ｓ：［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １１６６．５、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ８７５．１ ｆｏｕｎｄ １１６６．２、８７５．１。
（合成例２８）Ｃ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＴＡＲＡＥＡ）２の合成
合成例２７−１で合成したポリペプチド（配列番号２３）（２０．０ｍｇ、１１．０μｍｏｌ）と、合成例７で合成したＤｉｓｉａｌｏ−ＢｒＡｃ（２３．７ｍｇ、１６．５μｍｏｌ、ペプチド１に対して１．５等量）をＤＭＳＯ（０．９ｍＬ）に溶解した。溶液にＤＩＰＥＡ（５．８μＬ）を加え室温で１５分間反応させた。
反応溶液に蒸留水（４．０ｍＬ）加え、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→２９：７１ １１分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（５８）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号２５）（２３．９ｍｇ、７．５３μｍｏｌ、収率６８％）を得た。

式（５８）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１２３Ｈ２１１Ｎ３５Ｏ６０Ｓ：［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １０５８．４、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ７９４．０ ｆｏｕｎｄ １０５７．８、７９３．９。
（合成例２９）ＲＡＣ（Ａｓｉａｌｏ）−Ａ−（ＲＡＤＡ）３の合成
（合成例２９−１）Ａｃ−ＲＡＣＡ−（ＲＡＤＡ）３−ＮＨ ２ の合成
固相合成用カラムにＲｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＰＥＧＡ樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（１２４．５ｍｇ、４００μｍｏｌ）とＨＣＴＵ（１５７．２ｍｇ、３８０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．５μＬ、６００μｍｏｌ）のＤＭＦ（２．５ｍＬ）溶液を加え、１５分間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて保護された下記式（５９）で表わされる、樹脂に結合した状態にあるポリペプチド（配列番号２６）を合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。

式（５９）
Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、無水酢酸及びピリジンを加え１時間振盪した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、４時間室温で振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドの一部をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ‐１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエント Ａ：Ｂ＝８８：１２→７８：２２％ １１分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（６０）で表わされるポリペプチド（配列番号２７）（３２．７ｍｇ）を得た。

式（６０）
（合成例２９−２）チオールの糖鎖修飾反応
合成例２９−１で合成したポリペプチド（配列番号２７）（１４．１ｍｇ、８．２９μｍｏｌ）と合成例８で合成したＡｓｉａｌｏ−ＢｒＡｃ（３６．０ｍｇ、２０．７μｍｏｌ、ペプチド１に対して２．５等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３、２．６ｍＬ）に溶解し、室温で１時間反応させた。
反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９５：５→２９：７１ １１分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（６１）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号２８）（１３．４ｍｇ、３．９６μｍｏｌ、収率４８％）を得た。

式（６１）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１２９Ｈ２１８Ｎ３４Ｏ６９Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １６９１．７、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １１２８．１ ｆｏｕｎｄ １６９１．８、１１２８．２。
（合成例３０）ＲＡＣ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−Ａ−（ＲＡＤＡ）３の合成
合成例２９−１で合成したポリペプチド（配列番号２７）（１０．１ｍｇ、５．９４μｍｏｌ）と、合成例７で合成したＤｉｓｉａｌｏ−ＢｒＡｃ（２１．３ｍｇ、１４．８μｍｏｌ、ペプチド１に対して２．５等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３、２．０ｍＬ）に溶解し、室温で４時間反応させた。
反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（６２）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号２９）（１１．９ｍｇ、３．８９μｍｏｌ、収率６６％）を得た。

式（６２）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１１７Ｈ１９８Ｎ３４Ｏ５９Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １５２９．５、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １０２０．０、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ７６５．３ ｆｏｕｎｄ １５２９．２、１０１９．８、７６５．１。
（合成例３１）ＲＣ（Ａｓｉａｌｏ）−ＤＡ−（ＲＡＤＡ）３の合成
（合成例３１−１）Ａｃ−ＲＣＤＡ−（ＲＡＤＡ）３―ＮＨ ２ の合成
固相合成用カラムにＲｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＰＥＧＡ樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（１２４．５ｍｇ、４００μｍｏｌ）とＨＣＴＵ（１５７．２ｍｇ、３８０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．５μＬ、６００μｍｏｌ）のＤＭＦ（２．５ｍＬ）溶液を加え、１５分間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて保護された下記式（６３）で表わされる、樹脂に結合した状態にあるポリペプチド（配列番号３０）を合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。

式（６３）
Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、無水酢酸及びピリジンを加え１時間振盪した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、４時間室温で振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドの一部をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ‐１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエント Ａ：Ｂ＝８８：１２→７８：２２％ １１分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（６４）で表わされるポリペプチド（配列番号３１）（３２．７ｍｇ）を得た。

式（６４）
（合成例３１−２）チオールの糖鎖修飾反応
合成例３１−１で合成したポリペプチド（配列番号３１）（１４．８ｍｇ、８．４８μｍｏｌ）と、合成例８で合成したＡｓｉａｌｏ−ＢｒＡｃ（３７．４ｍｇ、２１．２μｍｏｌ、ペプチド１に対して２．５等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３、２．８ｍＬ）に溶解し、室温で２時間反応させた。
反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９５：５→２９：７１ １１分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（６５）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号３２）（２１．７ｍｇ、６．３４μｍｏｌ、収率７５％）を得た。

式（６５）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１３０Ｈ２１８Ｎ３４Ｏ７１Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １７１３．７、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １１４２．８、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ８５７．３ ｆｏｕｎｄ １７１３．７、１１４２．５、８５７．１。
（合成例３２）ＲＣ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−ＤＡ−（ＲＡＤＡ）３の合成
合成例３１−１で合成したポリペプチド（配列番号３１）（１１．０ｍｇ、６．３０μｍｏｌ）と、合成例９で合成したＤｉＧｌｃＮＡｃ−ＢｒＡｃ（２２．６ｍｇ、１５．７μｍｏｌ、ペプチド１に対して２．５等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３、２．１ｍＬ）に溶解し、室温で３時間反応させた。
反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（６６）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号３３）（１９．０ｍｇ、６．１２μｍｏｌ、収率９７％）を得た。

式（６６）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１１８Ｈ１９８Ｎ３４Ｏ６１Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １５５１．６、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １０３４．７、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ７７６．３ ｆｏｕｎｄ １５５１．２、１０３４．５、７７６．１。
（合成例３３）Ｃ（Ａｓｉａｌｏ）−ＡＤＡ−（ＲＡＤＡ）３の合成
（合成例３３−１）Ａｃ−ＣＡＤＡ−（ＲＡＤＡ）３―ＮＨ ２ の合成
固相合成用カラムにＲｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＰＥＧＡ樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（１２４．５ｍｇ、４００μｍｏｌ）とＨＣＴＵ（１５７．２ｍｇ、３８０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．５μＬ、６００μｍｏｌ）のＤＭＦ（２．５ｍＬ）溶液を加え、１５分間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて保護された下記式（６７）で表わされる、樹脂に結合した状態にあるポリペプチド（配列番号３４）を合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。

式（６７）
Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、無水酢酸及びピリジンを加え１時間振盪した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、４時間室温で振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドの一部をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ‐１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエント Ａ：Ｂ＝８８：１２→７８：２２％ １１分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（６８）で表わされるポリペプチド（配列番号３５）（３２．７ｍｇ）を得た。

式（６８）
（合成例３３−２）チオールの糖鎖修飾反応
合成例３３−１で合成したポリペプチド（配列番号３５）（１３．０ｍｇ、７．８３μｍｏｌ）と、合成例８で合成したＡｓｉａｌｏ−ＢｒＡｃ（３４．５ｍｇ、１９．６μｍｏｌ、ペプチド１に対して２．５等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３、２．６ｍＬ）に溶解し、室温で２時間反応させた。
反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９５：５→２９：７１ １１分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（６９）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号３６）（１５．２ｍｇ、４．５５μｍｏｌ、収率５８％）を得た。

式（６９）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１２７Ｈ２１１Ｎ３１Ｏ７１Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １６７１．１、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １１１４．４、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ８３６．１ ｆｏｕｎｄ １６７１．２、１１１４．１、８３５．８。
（合成例３４）Ｃ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−ＡＤＡ−（ＲＡＤＡ）３の合成
合成例３３−１で合成したポリペプチド（９．９ｍｇ、５．９６μｍｏｌ）と、合成例９で合成したＤｉＧｌｃＮＡｃ−ＢｒＡｃ（２１．４ｍｇ、１５．７μｍｏｌ、ペプチド１に対して２．５等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３、２．１ｍＬ）に溶解し、室温で４時間反応させた。
反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（７０）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号３７）（１０．９ｍｇ、３．６１μｍｏｌ、収率６１％）を得た。

式（７０）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１１５Ｈ１９１Ｎ３１Ｏ６１Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １５０９．０、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １００６．３、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ７５５．０ ｆｏｕｎｄ １５０８．７、１００６．１、７５４．９。
（合成例３５）２Ｃ（Ｍａｌｔｏｓｅ）−（ＲＡＤＡ）４の合成
（合成例３５−１）Ａｃ−２Ｃ−（ＲＡＤＡ）４−ＮＨ ２ の合成
固相合成用カラムにＲｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＰＥＧＡ樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（１２４．５ｍｇ、４００μｍｏｌ）とＨＣＴＵ（１５７．２ｍｇ、３８０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．５μＬ、６００μｍｏｌ）のＤＭＦ（２．５ｍＬ）溶液を加え、１５分間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて保護された下記式（７１）で表わされる、樹脂に結合した状態にあるポリペプチド（配列番号３８）を合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。

式（７１）
Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、無水酢酸及びピリジンを加え１時間振盪した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、４時間室温で振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドの一部をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ‐１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５％ １１分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（７２）で表わされるポリペプチド（配列番号３９）を得た。

式（７２）
（３５−２）チオールの糖鎖修飾反応
合成例３５−１で合成されたポリペプチド（配列番号３９）（９．８ｍｇ、５．１１μｍｏｌ）と、合成例２で合成されたＭａｌｔｏｓｅ−ＢｒＡｃ（１１．８ｍｇ、５４．６μｍｏｌ、ペプチド１に対して５．０等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３、１．７ｍＬ）に溶解し、室温で１．５時間反応させた。
反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（７３）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号４０）（９．２ｍｇ、３．４３μｍｏｌ、収率６７％）を得た。

式（７３）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１００Ｈ１６９Ｎ３３Ｏ４９Ｓ２：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １３４１．９、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ８９４．９、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ６７１．４ ｆｏｕｎｄ １３４１．６、８９４．７、６７１．３。
（合成例３６）２Ｃ（Ｍａｌｔｏｔｒｉｏｓｅ）−（ＲＡＤＡ）４の合成
合成例３５−１で合成したポリペプチド（配列番号３９）（１７．５ｍｇ、９．１２μｍｏｌ）と、合成例３で合成したＭａｌｔｏｔｒｉｏｓｅ−ＢｒＡｃ（３４．１ｍｇ、５４．６μｍｏｌ、ペプチド１に対して６．０等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３、３．１ｍＬ）に溶解し、室温で１．５時間反応させた。
反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（７４）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号４１）（１９．６ｍｇ、３．６１μｍｏｌ、収率７２％）を得た。

式（７４）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１１２Ｈ１８９Ｎ３３Ｏ５９Ｓ２：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １５０４．０、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １００３．０、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ７５２．５ ｆｏｕｎｄ １５０３．７、１００２．７、７５２．３。
（合成例３７）２Ｃ（Ｍａｌｔｏｔｅｔｒａｏｓｅ）−（ＲＡＤＡ）４の合成
合成例３５−１で合成したポリペプチド（配列番号３９）（９．８ｍｇ、５．１１μｍｏｌ）と、合成例４で合成したＭａｌｔｏｔｅｔｒａｏｓｅ−ＢｒＡｃ（２０．１ｍｇ、２５．５μｍｏｌ、ペプチド１に対して５．０等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３、１．７ｍＬ）に溶解し、室温で２時間反応させた。
反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（７５）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号４２）（１０．６ｍｇ、３．１８μｍｏｌ、収率６２％）を得た。

式（７５）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１２４Ｈ２０９Ｎ３３Ｏ６９Ｓ２：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １６６６．２、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １１１１．１、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ８３３．６ ｆｏｕｎｄ １６６６．２、１１１０．８、８３３．３。
（合成例３８）３Ｃ（Ｍａｌｔｏｓｅ）−（ＲＡＤＡ）４の合成
（合成例３８−１）Ａｃ−３Ｃ−（ＲＡＤＡ）４―ＮＨ ２ の合成
固相合成用カラムにＲｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＰＥＧＡ樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（１２４．５ｍｇ、４００μｍｏｌ）とＨＣＴＵ（１５７．２ｍｇ、３８０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．５μＬ、６００μｍｏｌ）のＤＭＦ（２．５ｍＬ）溶液を加え、１５分間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて保護された下記式（７６）で表わされる、樹脂に結合した状態にあるポリペプチド（配列番号４３）を合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。

式（７６）
Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、無水酢酸及びピリジンを加え１時間振盪した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、４時間室温で振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドの一部をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ‐１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５％ １１分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（７７）で表わされるポリペプチド（配列番号４４）を得た。

式（７７）
（合成例３８−２）チオールの糖鎖修飾反応
合成例３８−１で合成されたポリペプチド（配列番号４４）（１５．０ｍｇ、７．４２μｍｏｌ）と、合成例２で合成したＭａｌｔｏｓｅ−ＢｒＡｃ（２０．６ｍｇ、４４．６μｍｏｌ、ペプチド１に対して６．０等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３、２．４ｍＬ）に溶解し、室温で３時間反応させた。
反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（７８）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号４５）（１６．１ｍｇ、５．０９μｍｏｌ、収率６９％）を得た。

式（７８）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１１７Ｈ１９７Ｎ３５Ｏ６１Ｓ３：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １５８４．１、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １０５６．４、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ７９２．６ ｆｏｕｎｄ １５８３．７、１０５６．１、７９２．４。
（合成例３９）（ＲＡＤＡ）２−Ｃ（Ｍａｌｔｏｓｅ）−（ＡＲＡＤ）２の合成
（合成例３９−１）Ａｃ−（ＲＡＤＡ）２−Ｃ−（ＡＲＡＤ）２−ＮＨ ２ の合成
固相合成用カラムにＲｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＰＥＧＡ樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（１６４．６ｍｇ、４００μｍｏｌ）とＨＣＴＵ（１５７．２ｍｇ、３８０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．５μＬ、６００μｍｏｌ）のＤＭＦ（２．５ｍＬ）溶液を加え、１５分間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて保護された下記式（７９）で表わされる、樹脂に結合した状態にあるポリペプチド（配列番号４６）を合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。

式（７９）
Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、無水酢酸及びピリジンを加え１時間振盪した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、４時間室温で振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドの一部をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ‐１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５％ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（８０）で表わされるポリペプチド（配列番号４７）を得た。

式（８０）
（合成例３９−２）チオールの糖鎖修飾反応
合成例３９−１で合成したポリペプチド（配列番号４７）（１５．４ｍｇ、８．４８μｍｏｌ）と、合成例２で合成したＭａｌｔｏｓｅ−ＢｒＡｃ（９．８ｍｇ、２１．２μｍｏｌ、ペプチド１に対して２．５等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３、２．９ｍＬ）に溶解し、室温で３時間反応させた。
反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（８１）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号４８）（１７．８ｍｇ、８．１０μｍｏｌ、収率９６％）を得た。

式（８１）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８３Ｈ１４１Ｎ３１Ｏ３７Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １０９９．６、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ７３３．４、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ５５０．３ ｆｏｕｎｄ １０９９．５、７３３．０、５５０．２。
（合成例４０）（ＲＡＤＡ）２−Ｃ（Ｍａｌｔｏｔｒｉｏｓｅ）−（ＡＲＡＤ）２の合成
合成例３９−１で合成したポリペプチド（配列番号４７）（１４．８ｍｇ、８．１５μｍｏｌ）と、合成例３で合成したＭａｌｔｏｔｒｉｏｓｅ−ＢｒＡｃ（１２．７ｍｇ、２０．３μｍｏｌ、ペプチド１に対して２．５等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３、２．８ｍＬ）に溶解し、室温で３時間反応させた。
反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（８２）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号４９）（１３．８ｍｇ、５．８５μｍｏｌ、収率７２％）を得た。

式（８２）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８９Ｈ１５１Ｎ３１Ｏ４２Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １１８０．２、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ７８７．１、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ５９０．６ ｆｏｕｎｄ １１８０．５、７８７．０、５９０．８。
（合成例４１）（ＲＡＤＡ）２−Ｃ（Ｍａｌｔｏｔｅｔｒａｏｓｅ）−（ＡＲＡＤ）２の合成
合成例３９−１で合成したポリペプチド（配列番号４７）（１４．０ｍｇ、７．７１μｍｏｌ）と、合成例４で合成したＭａｌｔｏｔｅｔｒａｏｓｅ−ＢｒＡｃ（１５．２ｍｇ、２０．３μｍｏｌ、ペプチド１に対して２．５等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３、２．６ｍＬ）に溶解し、室温で２．５時間反応させた。
反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（８３）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号５０）（１４．９ｍｇ、５．９１μｍｏｌ、収率７７％）を得た。

式（８３）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ９５Ｈ１６１Ｎ３１Ｏ４７Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １２６１．８、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ８４１．５、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ６３１．４ ｆｏｕｎｄ １２６１．６、８４１．４、６３１．３。
（合成例４２）Ｃ（Ｍａｌｔｏｓｅ）−（ＲＡＤＡ）４−Ｃ（Ｍａｌｔｏｓｅ）の合成
（合成例４２−１）Ａｃ−Ｃ−（ＲＡＤＡ）４−Ｃ−ＮＨ ２ の合成
固相合成用カラムにＲｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＰＥＧＡ樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（１２４．５ｍｇ、４００μｍｏｌ）とＨＣＴＵ（１５７．２ｍｇ、３８０μｍｏｌ）と２，４，６−トリメチルピリジン（７９．３μＬ、６００μｍｏｌ）のＤＭＦ（２．５ｍＬ）溶液を加え、１時間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて保護された下記式（８４）で表わされる、樹脂に結合した状態にあるポリペプチド（配列番号５１）を合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。

式（８４）
Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、無水酢酸及びピリジンを加え１時間振盪した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、４時間室温で振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドの一部をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ‐１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５％ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（８５）で表わされるポリペプチド（配列番号５２）を得た。

式（８５）
（合成例４２−２）チオールの糖鎖修飾反応
合成例４２−１で合成したポリペプチド（配列番号５２）（１４．７ｍｇ、７．６６μｍｏｌ）と、合成例２で合成したＭａｌｔｏｓｅ−ＢｒＡｃ（１７．７ｍｇ、３８．３μｍｏｌ、ペプチド１に対して５等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む塩酸塩、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３、２．６ｍＬ）に溶解し、室温で２時間反応させた。
反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（８６）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号５３）（６．５ｍｇ、２．４２μｍｏｌ、収率３２％）を得た。

式（８６）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１００Ｈ１６９Ｎ３３Ｏ４９Ｓ２：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １３４１．９、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ８９４．９、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ６７１．４、ｆｏｕｎｄ １３４１．５、８９４．７、６７１．３。
（合成例４３）Ｃ（Ｍａｌｔｏｔｒｉｓｅ）−（ＲＡＤＡ）４−Ｃ（Ｍａｌｔｏｔｒｉｓｅ）の合成
合成例４２−１で合成したポリペプチド（配列番号５２）（１３．９ｍｇ、７．２４μｍｏｌ）と、合成例３で合成したＭａｌｔｏｔｒｉｏｓｅ−ＢｒＡｃ（２２．６ｍｇ、３６．２μｍｏｌ、ペプチド１に対して５等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む塩酸塩、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３、２．５ｍＬ）に溶解し、室温で２時間反応させた。
反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（８７）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号５４）（９．６ｍｇ、３．１９μｍｏｌ、収率４４％）を得た。

式（８７）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１１２Ｈ１８９Ｎ３３Ｏ５９Ｓ２：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １５０４．１、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １００３．０、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ７５２．５、ｆｏｕｎｄ １５０３．８、１００２．８、７５２．４。
（合成例４４）Ａｃ−（ＲＡＤＡ）４−Ｃ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）の合成
（合成例４４−１）Ａｃ−（ＲＡＤＡ）４−Ｃ−ＮＨ ２ の合成
固相合成用カラムにＲｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＰＥＧＡ樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（１２４．５ｍｇ、４００μｍｏｌ）とＨＣＴＵ（１５７．２ｍｇ、３８０μｍｏｌ）と２，４，６−トリメチルピリジン（７９．３μＬ、６００μｍｏｌ）のＤＭＦ（２．５ｍＬ）溶液を加え、１時間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて保護された下記式（８８）で表わされる、樹脂に結合した状態にあるポリペプチド（配列番号５５）を合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。

式（８８）
Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、無水酢酸及びピリジンを加え１時間振盪した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、４時間室温で振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドの一部をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ‐１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５％ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（８９）で表わされるポリペプチド（配列番号５６）を得た。

式（８９）
（合成例４４−２）チオールの糖鎖修飾反応
合成例４４−１で合成したポリペプチド（配列番号５６）（１５．１ｍｇ、８．３１μｍｏｌ）と、合成例９で合成したＤｉＧｌｃＮＡｃ−ＢｒＡｃ（２９．８ｍｇ、２０．８μｍｏｌ、ペプチド１に対して２．５等量）を３３μＭのＴＣＥＰおよび８Ｍグアニジン塩酸塩を含む、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３、２．８ｍＬ）に溶解し、室温で３時間反応させた。
反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（９０）で表わされる糖鎖−ポリペプチド複合体（配列番号５７）（１５．８ｍｇ、５．０１μｍｏｌ、収率６０％）を得た。

式（９０）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１２１Ｈ２０３Ｎ３５Ｏ６２Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １５８７．１、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １０５８．４、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ７９４．０ ｆｏｕｎｄ １５８６．７、１０５８．１、７９３．８。
（合成例４５） Ａｃ−Ｎ（Ａｓｉａｌｏ）（ＲＡＤＡ）４の合成
（合成例４５−１） Ｆｍｏｃ−（ＲＡＤＡ）４―Ｒｅｓｉｎの合成
固相合成用カラムにＲｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＰＥＧＡ樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（１２４．５ｍｇ、４００μｍｏｌ）とＨＣＴＵ（１５７．２ｍｇ、３８０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．５μＬ、６００μｍｏｌ）のＤＭＦ（２．５ｍＬ）溶液を加え、１５分間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて保護された下記式（９１）で表わされる、樹脂に結合した状態にあるポリペプチド（配列番号５８）を合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。

式（９１）
（合成例４５−２） 樹脂上での糖鎖縮合反応
合成例４５−１で合成した樹脂に結合した状態にあるポリペプチド（１０μｍｏｌ）のＦｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、下記式（９２）で表わされるＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ａｓｉａｌｏ）−ＯＨ（２９．８ｍｇ、１５μｍｏｌ）、ＤＭＦ−ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、４３３μＬ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボラート（ＴＢＴＵ）（６．４ｍｇ、３０μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（５．２μＬ、３０μｍｏｌ）を順次加え、終夜振盪した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、酢酸（２．８６μＬ、５０μｍｏｌ）と１−ヒドロキシベンゾトリアオール（ＨＯＢｔ）（６．８ｍｇ、５０μｍｏｌ）とＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（７．３μＬ、５０μｍｏｌ）のＤＭＦ（５００μＬ）溶液を加え１時間振盪した。

式（９２）
ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン（＝９５：２．５：２．５）を加え、４時間室温で振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドの一部をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ‐１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５％ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（９３）で表わされる糖鎖―ポリペプチド複合体（配列番号５９）（５．５ｍｇ）を得た。

式（９３）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１３２Ｈ２２１Ｎ３５Ｏ７２：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １７２６．２、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １１５１．１、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ８６３．６、ｆｏｕｎｄ １７２６．０、１１５０．８、８６３．４。
合成例４６ Ａｃ−Ｎ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）（ＲＡＤＡ）４の合成
合成例４５−１で合成した樹脂に結合した状態にあるポリペプチド（３２．１μｍｏｌ）のＦｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、下記式（９４）で表わされるＦｍｏｃ−Ａｓｎ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨ（７９．５ｍｇ、１５μｍｏｌ）、ＤＭＳＯ−ＤＭＦ（１／１、ｖ／ｖ、２．５ｍＬ）、ＴＢＴＵ（２０．６ｍｇ、９６．３μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１７．２μＬ、９６．３μｍｏｌ）を順次加え、２時間振盪した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、酢酸（９．２μＬ、１６０．５μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（２１．６ｍｇ、１６０．５μｍｏｌ）とＤＩＣ（２５．１μＬ、１６０．５μｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液を加え１時間振盪した。

式（９４）
ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン（＝９５：２．５：２．５）を加え、４時間室温で振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドの一部をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ‐１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５％ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（９５）で表わされる糖鎖―ポリペプチド複合体（配列番号６０）（３１．２ｍｇ）を得た。

式（９５）
ＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１２０Ｈ２０１Ｎ３５Ｏ６２：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １５６４．１、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １０４３．０、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ７８２．５、ｆｏｕｎｄ １５６３．７、１０４３．８、７８２．３。
（実施例１） スチール球載荷試験によるヒドロゲル特性の評価−１
１０ｍｇの糖鎖−ポリペプチド複合体、または、１０ｍｇの対照となるポリペプチドを５００μＬの超純水に溶解し、２重量％のポリペプチド溶液を調製した。この溶液と各種緩衝液を同量ずつダーラム管（６＊３０ｍｍ、マルエム）内に添加し、ボルテックスにより激しく攪拌することで、ペプチド濃度が１重量％のヒドロゲルを作製した。このとき、緩衝液として、クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ２．０及び３．５）、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、リン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１．５）を用いた。ダーラム管内のヒドロゲルの表面を水平にし、２０分間室温条件下で静置後、スチール球（直径１．５６ｍｍ、重さ１６ｍｇ、舟辺精工）をヒドロゲル上に載荷した。１０分後、スチール球の位置を目視により観察した。
ダーラム管内のスチール球の位置は３段階で評価し、スチール球がヒドロゲル表面付近に留まった状態を○、載荷後に沈降し内部で留まった状態を△、またダーラム管の下部まで沈降した状態を×とした。また、ヒドロゲルが均一ではなく白濁や不溶物（沈殿物）が観察された場合に※を付記した。スチール球が表面付近に留まり（○）、白濁や不溶物が見られない（※がない）ヒドロゲルは、透明性があり、かつ均一なゲルと考えられた。得られた写真を図１に、また評価結果を表１に示す。
なお、表１において、「糖残基数」とは、糖鎖−ポリペプチド複合体に結合している糖鎖に存在する糖残基の数の合計を示す。また、表に示した化合物の番号は、説明のために便宜的に付したものであり、製造例の番号とは一致しない。
図１および表１に示すように、Ｃ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４は全てのｐＨ領域（ｐＨ２．０〜ｐＨ１１．５）で透明で均一なヒドロゲル形成し、スチール球をヒドロゲル表面付近に保持した。一方、（ＲＡＤＡ）４はｐＨ２．０においては透明で均一なヒドロゲルを形成し、スチール球をヒドロゲル表面付近に保持したものの、ｐＨ３．５以上では白濁を伴った不均一なヒドロゲルを形成し、スチール球はヒドロゲルの内部まで侵入、もしくはダーラム管の底に沈降した。
以上より、Ｃ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４は中性ｐＨにおいて、ヒドロゲルの強度を維持したまま、透明で均一なヒドロゲルを形成できることがわかった。
（実施例２）スチール球載荷試験によるヒドロゲル特性の評価−２
実施例１と同様の方法を用いて、Ｃ（Ｄｉｓｉａｌｏ）−（ＲＡＤＡ）４、Ｃ（Ａｓｉａｌｏ）−（ＲＡＤＡ）４、Ｃ（Ｄｉｓｉａｌｏ）−（ＲＡＤＡ）５、Ｃ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）５、および（ＲＡＤＡ）４を用いたスチール球載荷試験を実施した。得られた評価結果を表２に示す。
表２に示すように、（ＲＡＤＡ）４の末端に比較的大きな糖鎖を修飾したものは、ヒドロゲルの強度を維持したまま、中性ｐＨにおいて透明で均一なヒドロゲルを形成した。これは水溶性が高く、嵩高い糖鎖をポリペプチドに修飾することで、ペプチド鎖間の過度な会合の抑制、または会合体の水溶性の改善、もしくはその両方が働いた結果であると考えられる。
以上より、（ＲＡＤＡ）４または（ＲＡＤＡ）５に種々の糖鎖を修飾した糖鎖−ポリペプチド複合体においても、ヒドロゲルの強度を維持したまま、中性ｐＨにおいて透明で均一なヒドロゲルを形成できることが分かった。
（実施例３）スチール球載荷試験によるヒドロゲル特性の評価−３
実施例１の方法と同様に、１重量％、０．５重量％及び０．２５重量％のヒドロゲル濃度でＣ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４のスチール球載荷試験を実施した。得られた評価結果を表３に示す。
表３に示すとおり、Ｃ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４は、ｐＨ７．４において、低濃度域でも均一なヒドロゲルを形成した。また、Ｃ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４はヒドロゲル濃度を０．２５重量％に下げた場合、ｐＨ７．４のみ均一なヒドロゲルを形成した。このことから、Ｃ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４は、ヒドロゲル濃度が低濃度である場合、ｐＨによってヒドロゲル形成をコントロールできることがわかった。
すなわち、本発明の糖鎖−ポリペプチド複合体は、ｐＨが中性の水溶液において、ヒドロゲル濃度が低い場合においても、ヒドロゲルの強度を維持したまま、透明で均一なヒドロゲルを形成することができることがわかった。さらに、本発明の糖鎖−ポリペプチド複合体は、ヒドロゲル濃度が低濃度である場合、ｐＨによってヒドロゲル形成をコントロールできることがわかった。
（実施例４）スチール球載荷試験によるヒドロゲル特性の評価−４
ヒドロゲルの濃度を０．５重量％で実施したこと以外は実施例１と同様の方法で、Ｃ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４、２Ｃ（Ｍａｌｔｏｓｅ）−（ＲＡＤＡ）４、２Ｃ（Ｍａｌｔｏｔｒｉｏｓｅ）−（ＲＡＤＡ）４、Ｃ（Ｍａｌｔｏｓｅ）−（ＲＡＤＡ）４−Ｃ（Ｍａｌｔｏｓｅ）、Ｃ（Ｍａｌｔｏｔｒｉｏｓｅ）−（ＲＡＤＡ）４−Ｃ（Ｍａｌｔｏｔｒｉｓｅ）、３Ｃ（Ｍａｌｔｏｓｅ）−（ＲＡＤＡ）４、（ＲＡＤＡ）４−Ｃ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）、Ｃ（Ｍａｌｔｏｈｅｐｔａｏｓｅ）−（ＲＡＤＡ）４、（ＲＡＴＡＲＡＥＡ）２、Ｃ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＴＡＲＡＥＡ）２を用いたスチール球載荷試験を実施した。得られた評価結果を表４に示す。
表４に示すとおり、糖鎖−ポリペプチド複合体に結合している糖鎖に存在する糖残基の合計が５以上であるＮｏ．２、９、１１、１２、１３、および、１７では、ｐＨ３．５およびｐＨ７．４において透明で均一なヒドロゲルを形成した。また、表には記載していないが、（ＲＡＤＡ）４のＮ末端にＣ（ＤｉＢｎ−Ｄｉｓｉａｌｏ）（糖残基数１１）を結合した糖鎖−ポリペプチド複合体も、ｐＨ７．４において透明で均一なヒドロゲルを形成した。一方、糖鎖−ポリペプチド複合体に結合している糖鎖に存在する糖残基の合計が４以下であるＮｏ．８および、Ｎｏ．１０では、ｐＨ７．４においてヒドロゲルを形成しなかった。すなわち、水溶液中で自己集合する性質を有するポリペプチドに、糖残基の合計が５以上の糖鎖を結合させた場合、当該糖鎖−ポリペプチド複合体は中性域において高い水溶性を示すようになり、透明で均一なヒドロゲルを形成することが明らかとなった。
また、糖鎖−ポリペプチド複合体に結合している糖鎖は、単独で分岐を有している糖鎖（例えばＮｏ．２およびＮｏ．１３のジグルクナック糖鎖、表２で示したジシアロ糖鎖およびアシアロ糖鎖）だけでなく、直鎖状の糖鎖（例えば、マルトース糖鎖およびマルトトリオース糖鎖）であっても、Ｎｏ．９、Ｎｏ．１１、Ｎｏ．１２のように、１つのポリペプチドに２本以上結合することにより、糖鎖−ポリペプチド複合体全体として、糖鎖が分岐を有している状態であれば、ｐＨ３．５およびｐＨ７．４において、透明で均一なヒドロゲルを形成することが明らかになった。
また、ポリペプチドの水溶性を向上させるために、ポリペプチドにＰＥＧを結合させる手法が知られているが、（ＲＡＤＡ）４および（ＲＡＤＡ）５にＰＥＧ２０００を結合した場合（Ｎｏ．１４、および、Ｎｏ．１５）においては、ｐＨ３．５およびｐＨ７．４における不溶物は観察されなかったが、均一なヒドロゲルを形成しなかった。すなわち、本発明の糖鎖−ポリペプチド複合体は、ＰＥＧ−ポリペプチド複合体と比較しても、より高い水溶性を示し、より透明で均一なヒドロゲルを形成することが明らかとなった。
また、Ｎｏ．１１では糖鎖がポリペプチドのＮ末端部分およびＣ末端部分に結合しており、Ｎｏ．１３では糖鎖がポリペプチドのＣ末端部分に糖鎖が結合しているが、いずれもｐＨ３．５およびｐＨ７．４において高い水溶性を示し、透明で均一なヒドロゲルを形成した。すなわち、本発明の糖鎖−ポリペプチド複合体において、糖鎖の結合部位はポリペプチドのＮ末端部分だけでなく、Ｃ末端部分でもよく、両末端部分でもよいことが明らかとなった。
さらに、（ＲＡＤＡ）４や（ＲＡＤＡ）５と同様に、ヒドロゲルを形成するポリペプチドとして、（ＲＡＴＡＲＡＥＡ）２が知られている。（ＲＡＴＡＲＡＥＡ）２に糖鎖を結合させた場合に、ゲル形成能が向上するか否かについて、スチール球載荷試験で評価した。表４に示すとおり、糖鎖の結合がない（ＲＡＴＡＲＡＥＡ）２であるＮｏ．１６は、ｐＨが３．５および７．４において不均一で白濁したヒドロゲルを形成し、スチール球はダーラム管の底に沈降した。一方、（ＲＡＴＡＲＡＥＡ）２のＮ末端部分にＣ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）を結合した糖鎖−ポリペプチド複合体であるＮｏ．１７は、ｐＨ３．５およびｐＨ７．４において透明で均一なゲルを形成した。また、表には示していないが、（ＲＡＴＡＲＡＥＡ）２のＮ末端にＣ（Ａｓｉａｌｏ）を結合させた糖鎖−ポリペプチド複合体も同様に、ｐＨ７．４において透明で均一なヒドロゲルを形成した。すなわち、（ＲＡＴＡＲＡＥＡ）２を含むポリペプチドに糖鎖を結合させると、より高い水溶性を示し、より透明で均一なヒドロゲルを形成することが明らかとなった。
以上の結果より、（ＲＡＤＡ）４に限らず、様々な配列のポリペプチドに対しても、糖鎖を結合させることにより、中性域を含む広範囲なｐＨにおいて透明で均一なゲルを形成する糖鎖−ポリペプチド複合体を製造できることが示された。
（実施例５）スチール球載荷試験によるヒドロゲル特性の評価−５
実施例１と同様の方法を用いて、Ｎ(Ａｓｉａｌｏ)−(ＲＡＤＡ)４、Ｎ(ＤｉＧｌｃＮＡｃ)−(ＲＡＤＡ)４及びＣ(ＤｉＧｌｃＮＡｃ)−(ＲＡＤＡ)４を用いたスチール球載荷試験を実施した。得られた評価結果を表５に示す。

表５に示す通り、アスパラギン結合型糖鎖−ポリペプチド複合体であるＮｏ．１８、１９もシステイン結合型糖鎖−ポリペプチド複合体であるＮｏ２と同様にｐＨ３．５及びｐＨ７．４において透明で均一なヒドロゲルを形成した。すなわち、糖鎖が結合されるアミノ酸がシステイン以外であっても、本発明の糖鎖−ポリペプチド複合体は透明で均一なヒドロゲルを形成することが明らかになった。
（実施例６）止血基材としての利用法検討
本発明の糖鎖−ポリペプチド複合体を含むヒドロゲルが、止血材として利用できるか否かを検証するため、ラット血漿を用いた評価試験を行った。
実施例１と同様の方法で、ポリペプチド水溶液を調製した。７週齢のＣｒｌｊ：ＷＩラットからヘパリンナトリウム注（味の素）を用いて血液を採取し、遠心処理後の上清から血漿を得た。ポリペプチド水溶液、血漿、および、ＰＢＳをダーラム管に加え、血漿濃度が５−５０％で、ポリペプチド濃度が０．５重量％となるようにヒドロゲルを調製した。その後、２０分間室温条件下で静置後、実施例１の方法と同様にスチール球載荷試験を実施した。２０分間静置後のヒドロゲルの写真を図２に、評価結果を表６に示す。
図２および表６に示したように、Ｃ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４を含むポリペプチド溶液は、血漿濃度に関わらず、均一なヒドロゲルを形成した。さらに驚くべきことには、Ｃ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４は、血漿濃度が５０％という非常に高濃度の状態においても、均一なヒドロゲルを形成した。一方、（ＲＡＤＡ）４を含むポリペプチド溶液は、全ての血漿濃度においてポリペプチド溶液が白濁し、不溶物が観察された。また、各ヒドロゲルのｐＨを確認したところ、全てｐＨ６−８の間であった。すなわち、本発明の糖鎖−ポリペプチド複合体は、中性ｐＨにおいて均一なヒドロゲルを形成するだけでなく、高濃度の血漿存在下においても、不溶物を生じにくく、透明なヒドロゲルを形成することが明らかになった。
以上の結果から、本発明の糖鎖−ポリペプチド複合体は、止血用医薬組成物として、非常に高い利用価値を有することが示された。
（実施例７）酸性タンパク質の徐放能の検討
本発明の糖鎖−ポリペプチド複合体を含むヒドロゲルが、中性ｐＨにおいて徐放担体としての利用できるか否かについて検討するため、試験を行った。
緩衝液としてリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。また、ヒドロゲルに内包する酸性タンパク質として、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８で蛍光標識されたＢｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）（Ａ１３１００、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。
緩衝液塩濃度が０．１５Ｍで、ＢＳＡ濃度が５μＭ、またポリペプチド濃度が０．２５−１重量％となるようにチューブに加え、ボルテックスにより混和した。混合物をマルチウェルインサートシステム（３５１１３０、ＢＤ）に５０μＬずつ添加し、３７度インキュベーター（細胞培養用ＣＯ２インキュベーター、ＭＣＯ−１８ＡＩＣ、ＳＡＮＹＯ）中で遮光下、一晩静置しＢＳＡ内包ヒドロゲルを調製した。３７度インキュベーター中で、ヒドロゲルと同じ緩衝液を２２５μＬずつ加えた９６ｗｅｌｌ平底プレート（３５３９２８、ＢＤ）にインサートシステムを浸し、プレートシェイカー（ＭＩＣＲＯ ＰＬＡＴＥ ＭＩＸＥＲ ＮＳ−Ｐ、アズワン、回転数：１／５目盛）を用いてプレートを振動させることで試験開始とした（０時間）。その後、経時的に平底プレート側に漏れ出してきた蛍光量を蛍光プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ３、モレキュラーデバイス）を用いて測定した。同一の蛍光標識ＢＳＡを用いて検量線を作成し、漏出した蛍光色素の量からタンパク質の濃度を算出した。（ＲＡＤＡ）４を含むヒドロゲル、および、Ｃ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４を含むヒドロゲルを用いた結果を図３に示す。対照としては、緩衝液にＢＳＡを添加しただけの溶液（Ｗ／Ｏ ＳＡＰ）を用いた。図３中、Ｙ軸は平底プレート中のＢＳＡ濃度を示し、Ｘ軸は試験開始からの時間を示す。
図３に示したとおり、（ＲＡＤＡ）４を含むヒドロゲルに内包されたＢＳＡは、試験開始後短時間のうちに大部分が漏出した。また、その漏出速度は、ポリペプチドが０．５重量％以下では、ポリペプチドを含まない溶液の場合と同等の漏出速度であり、徐放能を有していないことが示された。一方、Ｃ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４を含むヒドロゲルは、０．２５重量％という低濃度においても、ポリペプチドを含まない溶液の場合と比較してＢＳＡの漏出速度が緩やかであり、徐放能を有していた。
すなわち、本発明の糖鎖−ポリペプチド複合体は、中性ｐＨにおいて、酸性タンパク質を内包、保持し、徐放効果を有することが明らかとなった。
（実施例８）塩基性タンパク質の徐放能の検討
内包するタンパク質として塩基性タンパク質であるＬｙｓｏｚｙｍｅを用いた以外は、実施例７に記載の方法と同様に、徐放性試験を行った。Ｌｙｓｏｚｙｍｅは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａ１０２３５、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８で標識して使用した。結果を図４に示す。
図４に示したとおり、（ＲＡＤＡ）４を含むヒドロゲルに内包されたＬｙｓｏｚｙｍｅは、試験開始後１時間以内に大部分が漏出した。また、その漏出速度は、ポリペプチドを含まない溶液の場合とほぼ同等の漏出速度であり、徐放能を有していないことが示された。一方、Ｃ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４を含むヒドロゲルは、０．２５重量％という低濃度においても、ポリペプチドを含まない溶液の場合と比較してＬｙｓｏｚｙｍｅの漏出速度が緩やかであり、徐放能を有していた。
すなわち、本発明の糖鎖−ポリペプチド複合体は、中性ｐＨにおいて、塩基性タンパク質を内包、保持し、徐放効果を有することが明らかとなった。
（実施例９）円偏光二色性（ＣＤ）測定および解析
本発明の糖鎖−ポリペプチド複合体がβシート構造を形成することの確認として、ＣＤ測定を行った。一般的に、ある物質がβシート構造を有する場合に観察される波長の特徴は、１９７ｎｍ付近の正の吸収と２１６ｎｍ付近の負の吸収である。そのため、本発明についてもこれらの波長の大きさに注目し、ｐＨがβシート構造に与える影響を調べた。
本発明の一実施形態であるＣ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４、または、対照として（ＲＡＤＡ）４を超純水で溶解した。これらのポリペプチド水溶液へ、それぞれ１−１０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を添加することでｐＨを調整し、ｐＨ２またはｐＨ７の１００ｍＭポリペプチド水溶液を作成した。この水溶液を光路長０．１ｃｍの石英セルに移した。そして、ＣＤスペクトルを、スペクトル旋光計（Ｊ−８０５、Ｊａｓｃｏ）を用いて、波長１８５−２６０ｎｍで、楕円形性（ミリ度）を測定した。平均残基楕円型性（Ｍｅａｎ ｒｅｓｉｄｕｅ ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｔｙ）θは以下の式を用いて算出した。
［θ］＝（θｏｂｓ／１０・ｌ・ｃ）／ｒ
ここでθｏｂｓはミリ度で測定した楕円形性、ｌはセル長さ（ｃｍ）、ｃは濃度（Ｍ）、そしてｒはアミノ酸の残基数を表す。
（ＲＡＤＡ）４についての結果のグラフを図５に示し、Ｃ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４についての結果のグラフを図６に示す。
図５および図６に示すように、ｐＨ２では（ＲＡＤＡ）４およびＣ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４ともに大きなモル楕円率を示した。一方、ｐＨ７においてはＣ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４は大きなモル楕円率を示すものの、（ＲＡＤＡ）４のモル楕円率は著しく低下していた。すなわち、（ＲＡＤＡ）４は中性ｐＨにおいてβシート構造をほとんど形成しなかったのに対し、Ｃ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４は中性ｐＨにおいてもβシート構造を形成することが明らかとなった。
上記の結果は、Ｃ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４は糖鎖の存在によって、ポリペプチド同士の過度な会合が抑制され、βシートを維持していたのに対し、（ＲＡＤＡ）４は中性ｐＨでは会合が過度に促進したためにβシートが減少したのではないかと考えられる。このことは、（ＲＡＤＡ）４がスチール球載荷試験において、中性ｐＨで白濁・沈殿を起こし、均一で強固なヒドロゲルを形成できなくなった現象（例えば、図１）と一致している。
以上の結果から、本発明の糖鎖−ポリペプチド複合体は、中性ｐＨにおいてβシート構造を形成することが確かめられた。
（実施例１０）動粘度測定及び解析
スチール球載荷試験で確認したヒドロゲルの強度に加えて、時間の経過におけるヒドロゲル強度の変化やヒドロゲルの安定性を観察するため、動粘度測定を行った。
動粘度測定には、０．３ｍｍのギャップ高を有する直径２５ｍｍのステンレス鋼平行プレートを備えた検流計（ＭＣＲ３０２、アントンパール）を用いた。本発明の一実施形態であるＣ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４、または、対照として（ＲＡＤＡ）４を超純水に溶解した。これらのポリペプチド水溶液へ、ｐＨ調整のために５ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を添加することで、ｐＨ７の０．５重量％のヒドロゲルを調製した。そして、これらのヒドロゲルを、２５度に設定した検流計にすみやかに移し、時間経過に従って位相角（ｔａｎδ）をモニタリングした。（周波数＝１Ｈｚ、歪み＝１０％）
この測定結果を図７に示す。
図７に示すとおり、Ｃ（ＤｉＧｌｃＮＡｃ）−（ＲＡＤＡ）４を含むヒドロゲルの位相角は、測定開始から速やかに減少していることから、強固なヒドロゲルが形成されていることが示された。一方、（ＲＡＤＡ）４を含むヒドロゲルは位相角が大きく、壊れやすいヒドロゲルを形成している、あるいは不均一に一部分だけ強固なヒドロゲルを形成していることが示された。
このことは、（ＲＡＤＡ）４がスチール球載荷試験において、中性ｐＨで白濁・沈殿を起こし、均一で強固なヒドロゲルを形成できなくなった現象（例えば、図１）と一致している。
以上の結果から、本発明の糖鎖−ポリペプチド複合体は、中性ｐＨにおいて強固なヒドロゲルを形成することが確かめられた。

Claims (12)

  1. 糖鎖−ポリペプチド複合体であって、
    前記ポリペプチドが、極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基が交互に配置された、８〜３４個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
    前記ポリペプチドに１〜３本の糖鎖が結合しており、
    前記ポリペプチドのＮ末端に位置するアミノ酸残基から数えて、ｘ番目までの全てのアミノ酸、および、Ｃ末端に位置するアミノ酸残基から数えて、ｙ番目までの全てのアミノ酸（ここで、ｘおよびｙは整数であり、ｘ≧０であり、ｙ≧０であり、ｘ＋ｙは、ポリペプチドに結合している糖鎖の数の合計である）に糖鎖が結合しており、
    前記ポリペプチドにおいて、前記糖鎖が結合しているアミノ酸残基は、システイン残基またはアスパラギン残基であり、
    前記ポリペプチドに結合している１〜３本の糖鎖に存在する糖残基の数の合計が５以上であり、
    前記「極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基が交互に配置された、８〜３４個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列」における各非極性アミノ酸残基が、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、プロリン残基、および、グリシン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
    前記「極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基が交互に配置された、８〜３４個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列」における各極性アミノ酸残基が、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、アルギニン残基、および、トレオニン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基である、
    糖鎖−ポリペプチド複合体。
  2. 請求項１に記載の糖鎖−ポリペプチド複合体であって、
    前記糖鎖−ポリペプチド複合体が、ｐＨが５．０〜９．０の水溶液中において自己集合することにより、βシート構造を含むヒドロゲルを形成しうるものであることを特徴とする、
    糖鎖−ポリペプチド複合体。
  3. 請求項１に記載の糖鎖−ポリペプチド複合体であって、
    前記アミノ酸配列が、「ＲＡＤＡ」の繰り返し配列、または、「ＲＡＴＡＲＡＥＡ」の繰り返し配列であることを特徴とする、
    糖鎖−ポリペプチド複合体。
  4. 請求項３に記載の糖鎖−ポリペプチド複合体であって、
    前記アミノ酸配列が、ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ（配列番号１）、ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ（配列番号２）、および、ＲＡＴＡＲＡＥＡＲＡＴＡＲＡＥＡ（配列番号３）からなる群から選択されるアミノ酸配列であることを特徴とする、
    糖鎖−ポリペプチド複合体。
  5. 請求項１に記載の糖鎖−ポリペプチド複合体であって、
    前記ポリペプチドに結合している糖鎖の数が１本の場合には、当該１本の糖鎖は、前記ポリペプチドのＮ末端に位置するアミノ酸残基、または、Ｃ末端に位置するアミノ酸残基と結合しており、
    前記ポリペプチドに結合している糖鎖の数が２本の場合には、当該２本の糖鎖は、次の（１）〜（３）からなる群から選択されるアミノ酸残基と結合しており、
    （１）前記ポリペプチドのＮ末端に位置するアミノ酸残基から数えて１番目および２番目のアミノ酸残基
    （２）前記ポリペプチドのＣ末端に位置するアミノ酸残基から数えて１番目および２番目のアミノ酸残基
    （３）前記ポリペプチドのＮ末端に位置するアミノ酸残基、および、前記ポリペプチドのＣ末端に位置するアミノ酸残基
    前記ポリペプチドに結合している糖鎖の数が３本の場合には、当該３本の糖鎖は、次の（１）〜（４）からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸残基と結合していることを特徴とする、
    糖鎖−ポリペプチド複合体。
    （１）前記ポリペプチドのＮ末端に位置するアミノ酸残基から数えて１番目、２番目、および、３番目のアミノ酸残基
    （２）前記ポリペプチドのＣ末端に位置するアミノ酸残基から数えて１番目、２番目、および、３番目のアミノ酸残基
    （３）前記ポリペプチドのＮ末端に位置するアミノ酸残基から数えて１番目および２番目のアミノ酸残基、ならびに、前記ポリペプチドのＣ末端に位置するアミノ酸残基
    （４）前記ポリペプチドのＮ末端に位置するアミノ酸残基、ならびに、前記ポリペプチドのＣ末端から数えて１番目および２番目に位置するアミノ酸残基
  6. 請求項１に記載の糖鎖−ポリペプチド複合体であって、
    前記糖鎖が、分岐を有する糖鎖であることを特徴とする、
    糖鎖−ポリペプチド複合体。
  7. 請求項１に記載の糖鎖−ポリペプチド複合体であって、
    前記糖鎖が、ジシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖、ジマンノース糖鎖、グルクナック糖鎖、マルトトリオース糖鎖、マルトース糖鎖、マルトテトラオース糖鎖、マルトヘプタオース糖鎖、β−シクロデキストリン、および、γ−シクロデキストリンからなる群から選択される糖鎖であることを特徴とする、
    糖鎖−ポリペプチド複合体。
  8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の糖鎖−ポリペプチド複合体を含む、
    ヒドロゲル形成用組成物。
  9. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の糖鎖−ポリペプチド複合体を含む組成物であって、
    前記組成物が、ヒドロゲルの状態にあることを特徴とする、
    組成物。
  10. 請求項８または９に記載の組成物を含む、
    止血用医薬組成物。
  11. 請求項８または９に記載の組成物を含む、
    徐放担体用組成物。
  12. 請求項８または９に記載の組成物を含む、
    培養基材用組成物。
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