TW201533061A - 糖鏈-多肽複合物 - Google Patents

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Abstract

本發明之課題係提供可在廣域pH形成透明均質之水凝膠的糖鏈-多肽複合物。 本發明所提供之糖鏈-多肽複合物，係糖鏈-多肽複合物，其特徵係前述多肽係由極性胺基酸殘基及非極性胺基酸殘基交互排列，包含8至34個胺基酸殘基所成胺基酸序列之多肽，且前述多肽鍵結1個或多個糖鏈。

Description

糖鏈-多肽複合物
本發明係關於在多肽鍵結糖鏈之糖鏈-多肽複合物。
水凝膠及纖維蛋白膠等生物凝膠，目前係利用在三維培養等研究用基材、手術中/手術後之止血劑及創傷癒合敷片等外科用基材，藥物傳送系統(DDS)等之中。
然而，此等之大多數係使用生物由來的材料，因此在使用時，存在受病毒等微生物之感染、致免疫性、疾病傳遞等風險。舉例如，纖維蛋白膠在手術時係作為止血劑利用而有高價值，然而其原料來自於人類血液，因此在使用於實際之手術時，常發生患者受纖維蛋白膠中所混入之肝炎病毒所感染的事件，成為大的社會問題。同時，生物由來之生物凝膠，亦存在未必可以品質均質之凝膠供應的問題。
相對於生物由來之生物凝膠，已知以化學合成所製造之生物凝膠，無感染之風險，且可供應品質均質之凝膠(專利文獻1)。然而，目前為止已知之生物凝膠，卻在凝膠形成時，有緩衝液之交換及取代、多種藥劑混合 等步驟之必要，因此在操作上亦複雜。同時，亦有由於因pH範圍而成為難溶性，而有限定所併用的藥劑及溶劑，限定適用之部位(患部)、及使用時注射筒及注射管受阻塞等之問題。而且，特別因為接近於生物體之pH，在中性領域為難溶性(亦即，不透明)，因此在如手術區等必須辨視性時，使用上會有困難。
[先前技術文獻]
專利文獻
[專利文獻1]美國專利第5670483號
本發明之課題，係提供在廣域pH可形成透明均質之水凝膠的糖鏈-多肽複合物。
本發明人等，為解決前述問題經過刻意研究之結果，意外地，發現以含胺基酸序列係極性胺基酸殘基與非極性胺基酸殘基交互排列的多肽，與糖鏈鍵結所製造之糖鏈-多肽複合物，在廣域之pH，特別在中性範圍顯示高水溶性，因而可形成透明均質之水凝膠，而完成本發明。
亦即，本發明所提供之糖鏈-多肽複合物，係糖鏈-多肽複合物，其特徵為前述多肽係含有以極性胺基酸殘基與非極性胺基酸殘基交互排列，包含8至34個胺基酸殘基之胺基酸序列的多肽，且前述多肽係鍵結1個或多個 糖鏈。
同時，本發明之一實施形態中，前述糖鏈-多肽複合物，在pH為中性附近的水溶液中可藉由自行集合，形成含β-褶板結構之水凝膠。
而且，本發明之一實施形態中，前述各極性胺基酸殘基，係選自：天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、精胺酸殘基、離胺酸殘基、組胺酸殘基、酪胺酸殘基、絲胺酸殘基、蘇胺酸殘基、天冬醯胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、及半胱胺酸殘基所成群組的胺基酸殘基。
並且，本發明之一實施形態中，前述各非極性胺基酸殘基，係選自：丙胺酸殘基、纈胺酸殘基、白胺酸殘基、異白胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、苯丙胺酸殘基、色胺酸殘基、脯胺酸殘基、及甘胺酸殘基所成群組的胺基酸殘基。
同時，本發明之一實施形態中，前述各極性胺基酸殘基，係選自：天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、精胺酸殘基、及蘇胺酸殘基所成群組的胺基酸殘基；前述各非極性胺基酸殘基，係丙胺酸殘基。
而且，本發明之一實施形態中，前述胺基酸序列，為「RADA」之重複序列、或「RATARAEA」之重複序列。
並且，本發明之一實施形態中，前述胺基酸序列，係選自：RADARADARADARADA(序列編號1)、RADARADARADARADARADA(序列編號2)、及 RATARAEARATARAEA(序列編號3)所成群組的胺基酸序列。
同時，本發明之一實施形態中，鍵結在前述多肽之1個或多個糖鏈中所存在的糖殘基數合計為5以上。
而且，本發明之一實施形態中，鍵結在前述多肽之糖鏈數，為1、2、或3股。
並且，本發明之一實施形態中其特徵係，從位在前述多肽N末端之胺基酸殘基計算，至第x個的所有胺基酸、及從位在C末端之胺基酸殘基計算，至第y個的所有胺基酸(其中，x及y為整數，x≧0、y≧0，且x+y，係鍵結在多肽的糖鏈數之合計)係鍵結糖鏈。
同時，本發明之一實施形態中，鍵結在前述多肽的糖鏈數，為1、2、或3股；在鍵結在前述多肽的糖鏈數為1股時，該1股糖鏈，係鍵結在位在前述多肽N末端之胺基酸殘基、或位在C末端之胺基酸殘基上；在鍵結在前述多肽的糖鏈數為2股時，該2股糖鏈，係鍵結在選自以下(1)至(3)所成群組的胺基酸殘基上；
(1)從位在前述多肽N末端之胺基酸殘基計算，為第1及第2個之胺基酸殘基
(2)從位在前述多肽C末端之胺基酸殘基計算，為第1及第2個之胺基酸殘基
(3)位在前述多肽N末端之胺基酸殘基、及位在前述多肽C末端之胺基酸殘基
在鍵結在前述多肽的糖鏈數為3股時，該3股糖鏈， 係鍵結在任一選自以下(1)至(4)所成群組的胺基酸殘基。
(1)從位在前述多肽N末端之胺基酸殘基計算，為第1、第2及第3個之胺基酸殘基
(2)從位在前述多肽C末端之胺基酸殘基計算，為第1、第2及第3個之胺基酸殘基
(3)從位在前述多肽N末端之胺基酸殘基計算，為第1及第2個之胺基酸殘基、以及位在前述多肽C末端之胺基酸殘基
(4)位在前述多肽N末端之胺基酸殘基、及從位在前述多肽C末端計算，為第1及第2個之胺基酸殘基
而且，本發明之一實施形態中，前述糖鏈，為具支鏈之糖鏈。
並且，本發明之一實施形態中，前述糖鏈，為選自：二唾液酸糖鏈、無唾液酸糖鏈、二-N-乙醯葡萄糖胺糖鏈、二甘露糖糖鏈、N-乙醯葡萄糖胺糖鏈、麥芽三糖糖鏈、麥芽糖糖鏈、麥芽四糖糖鏈、麥芽七糖糖鏈、β-環糊精、及γ-環糊精的糖鏈。
同時，本發明之一實施形態中，其係水凝膠形成用組成物，其中係含本發明之糖鏈-多肽複合物。而且，該水凝膠形成用組成物，可為止血用醫藥組成物、亦可為緩釋載體用醫藥組成物、亦可為培養基材用組成物。
而且，本發明之一實施形態中，係含本發明之糖鏈-多肽複合物的組成物，且前述組成物，為水凝膠之 狀態。並且，該類組成物，可為止血用醫藥組成物、亦可為緩釋載體用醫藥組成物、亦可為培養基材用組成物。
將以上所述的本發明之一或複數特徵所任意組合的發明，本業業者應可理解，應包含在本發明之範圍中。
本發明之糖鏈-多肽複合物，在包含中性範圍之廣域pH範圍中亦具有高水溶性，而可形成均一透明之水凝膠，因此不受併用之藥劑及溶劑所限定，可作為各種用途使用。同時，亦可在廣域之pH範圍中使用，因此適用部位(患部)不受限定。
同時，本發明之糖鏈-多肽複合物，在包含中性範圍之廣域pH亦具有高水溶性，而可形成均一透明之水凝膠，因此在中性pH亦可以溶膠(sol)狀態及凝膠(gel)狀態可逆存在。亦即，糖鏈-多肽複合物，在暫時形成凝膠狀態後，即使經由機械性攪拌形成溶膠狀態，亦可再形成凝膠狀態。因此，可以凝膠狀態(亦即，為Ready-to-Use之狀態)流通，而無如其他胜肽性凝膠，在適於凝膠化之pH(例如，酸性pH)下形成凝膠後，須再進行緩衝液交換(或置換)等使pH為中性之煩雜操作。亦即，本發明之糖鏈-多肽複合物，與其他胜肽性凝膠比較，操作性非常優異。而且，本發明之糖鏈-多肽複合物，可使用之pH範圍廣，因此使用時不易發生阻塞注射筒及注射管等問題。
此外，本發明之糖鏈-多肽複合物，係由動物 生物體內存在的糖鏈所修飾，因此與未受任何修飾的胜肽比較，可減低其抗原性。同時，本發明之糖鏈-多肽複合物，亦幾乎不會產生經聚乙二醇(PEG)等修飾之化合物所見到的毒性之危險性。因此，本發明之糖鏈-多肽複合物，在使用在生物體時為高安全性。
同時，由本案說明書之實施例亦可知，本發明之糖鏈-多肽複合物，與鍵結PEG之多肽比較，可形成更透明均一的水凝膠。
而且，本發明之糖鏈-多肽複合物，在生理條件下(中性範圍)亦可形成均一透明之水凝膠，抗原性亦低，因此適於作為動物生物體中使用之水凝膠。
更具體言之，含本發明糖鏈-多肽複合物之水凝膠，亦具有在中性pH，即使在含高濃度血漿的條件下，亦可維持透明均一的凝膠狀態之特徵，因此在利用在如止血劑方面有高的價值。
而且，含本發明糖鏈-多肽複合物之水凝膠，在中性pH，即使在含任何酸性蛋白質、鹼性蛋白質之情形下，亦具有高緩釋性，因此在各種物質之緩釋載體方面有高的利用價值。
第1圖所示，係(RADA)4及C(DiGlcNAc)-(RADA)4，在各種pH的鋼球載重試驗結果之圖像。
第2圖所示，係(RADA)4及C(DiGlcNAc)-(RADA)4， 在含各種濃度血漿之情形下的鋼球載重試驗結果之圖像。
第3圖所示，係(RADA)4及C(DiGlcNAc)-(RADA)4，在內包酸性蛋白質的情形下測定緩釋效果結果之曲線圖。
第4圖所示，係(RADA)4及C(DiGlcNAc)-(RADA)4，在內包鹼性蛋白質的情形下測定緩釋效果結果之曲線圖。
第5圖所示，係(RADA)4，在pH2及pH7之情形下測定圓偏光二色性(CD)結果之曲線圖。
第6圖所示，係C(DiGlcNAc)-(RADA)4，在pH2及pH7之情形下測定圓偏光二色性(CD)結果之曲線圖。
第7圖所示，係(RADA)4及C(DiGlcNAc)-(RADA)4，在pH7下測定動黏度結果之曲線圖。
(發明之實施形態)
本發明之糖鏈-多肽複合物，可由生物而來，亦可以化學合成而製造，惟由安全性及品質之安定性、糖鏈之均一性方面而言，以化學合成製造較佳。
本發明之糖鏈-多肽複合物，例如在水溶液中，可藉由胜肽分子間之靜電相互作用、氫鍵鍵結、及疏水性相互作用等相互作用而自行集合。本說明書中，糖鏈-多肽複合物在水溶液中所謂「自行集合」，係指在水溶液中多肽之間，藉由任何相互之作用(例如：靜電相互作用、氫鍵鍵結、凡德瓦爾力、疏水性相互作用等)，自發地集合之意，但非限定性解釋之意義。
本發明之糖鏈-多肽複合物，在水溶液中可自 行集合，而形成β-褶板結構。之後，再以該β-褶板結構數層重疊，即可形成水凝膠。確定水溶液中之糖鏈-多肽複合物形成β-褶板結構的方法並無特別之限定，可藉由測定如含糖鏈-多肽複合物水溶液之圓偏光二色性(CD)，予以確定。一般言之，具有β-褶板結構的分子之特徵，係在197nm附近之波長可見到正吸收，在216nm附近之波長可見到負吸收，藉由測定圓偏光二色性，確定此等波長附近之波峰，即可確定係形成β-褶板結構。
本發明之糖鏈-多肽複合物，由於含極性胺基酸殘基與非極性胺基酸殘基交互排列之胺基酸序列，在水溶液中形成β-褶板結構時，可在β-褶板結構一面僅排列極性胺基酸殘基，在另一面僅排列非極性胺基酸殘基。因此，可使該β-褶板結構，形成隱藏疏水面(僅排列非極性胺基酸殘基之面)而集合成二層結構。同時，再進而使分子自行集合而延伸該β-褶板結構，即可形成三維之立體結構(如水凝膠)。在本說明書中，具有此種性質之多肽係以SAP(Self-Assembling Peptide)表示。
本發明中，所謂「pH為中性附近」，意指pH在7.0附近，更具體言之以pH 5.0至9.0之範圍為佳，pH在6.0至8.0之範圍內更佳。
同時，本發明之一實施形態中，糖鏈-多肽複合物之特徵係在pH中性附近之水溶液中可自行集合形成含β-褶板結構的水凝膠，因此只要具有該特徵，並不排除在pH中性附近以外之水溶液中可自行集合形成含β- 褶板結構的水凝膠。
本發明之糖鏈-多肽複合物，係包含含極性胺基酸殘基與非極性胺基酸殘基交互排列之胺基酸序列的多肽，惟該胺基酸序列的長度並無限定，而以含8至34個胺基酸殘基之胺基酸序列為佳，含12至25個胺基酸殘基之胺基酸序列更佳，含16至21個胺基酸殘基之胺基酸序列又更佳。
本發明之糖鏈-多肽複合物，係包含含極性胺基酸殘基與非極性胺基酸殘基交互排列之胺基酸序列的多肽，本發明中，所謂「胺基酸」，係使用其最廣之意義，不只為構成蛋白質之胺基酸，亦包含胺基酸變異體及衍生物之類非構成蛋白質之胺基酸。本業業者，由考慮其廣義定義，可理解本發明中之胺基酸，可為如：構成蛋白質之L-胺基酸；D-胺基酸；胺基酸變異體及衍生物等經過化學修飾之胺基酸；原白胺酸、β-丙胺酸、鳥胺酸等非構成蛋白質之胺基酸；及具有本業業界一般已知之蛋白質特徵而以化學合成的化合物等。非構成蛋白質胺基酸之例，可舉如：α-甲基胺基酸(α-甲基丙胺酸等)、D-胺基酸、類組胺酸胺基酸(2-胺基-組胺酸、β-羥基-組胺酸、高組胺酸、α-氟化甲基-組胺酸及α-甲基-組胺酸等)、側鏈上含額外亞甲基的胺基酸(「高」胺基酸)及胺基酸側鏈中之羧酸官能基為磺酸基所取代之胺基酸(半胱胺酸等)。本發明之較佳態樣中，本發明中所使用之胺基酸，以蛋白質構成之胺基酸較佳。
本發明中，極性胺基酸殘基，只要為側鏈含極性之胺基酸殘基者即可並無特別之限定，可包含如：酸性胺基酸殘基及鹼性胺基酸殘基。本說明書中，酸性胺基酸殘基，可例舉如：天冬胺酸(Asp：D)殘基、及麩胺酸(Glu：E)等；鹼性胺基酸，可例舉如：精胺酸(Arg：R)、離胺酸(Lys：K)、組胺酸(His：H)等。
再者，本說明書中，如「天冬胺酸(Asp：D)」等之表示，係天冬胺酸之簡寫，即使用三字表示時為「Asp」、以一字表示時為「D」。
此外，本說明書中，中性胺基酸殘基中，含羥基、酸醯胺基、硫醇基等之胺基酸殘基，係具有極性者，因此亦包含於極性胺基酸殘基中。舉例如，本說明書中，酪胺酸(Tyr：Y)、絲胺酸(Ser：S)、蘇胺酸(Thr：T)、天冬醯胺酸(Asn：N)、麩醯胺酸(Gln：Q)、半胱胺酸(Cys：C)係包含於極性胺基酸殘基中。
本說明書中，非極性胺基酸殘基，只要側鏈為不具極性之胺基酸即可並無特別之限定，可包含如：丙胺酸(Ala：A)、纈胺酸(Val：V)、白胺酸(Leu：L)、異白胺酸(Ile：I)、甲硫胺酸(Met：M)、苯丙胺酸(Phe：F)、色胺酸(Trp：W)、甘胺酸(Gly：G)、脯胺酸(Pro：P)等。
本發明之糖鏈-多肽複合物中，「極性胺基酸殘基與非極性胺基酸殘基交互排列之胺基酸序列」，係以該胺基酸序列為「RADA」之重複序列(重複2至8次為佳， 重複3至6次更佳)、或「RATARAEA」之重複序列(重複1至4次為佳，重複2至3次更佳)為佳，該胺基酸序列，為選自：RADARADARADARADA(序列編號1)、RADARADARADARADARADA(序列編號2)、及RATARAEARATARAEA(序列編號3)所成群組的胺基酸序列更佳。
本發明中，所謂「糖鏈」，意指連接1個以上單元糖(單糖及/或其衍生物)的化合物。連接2個以上單元糖之情形時，各單元糖之間，可以糖苷鍵經去水縮合而鍵結。該類糖鏈，可例舉如：生物體中所含之單糖類及多糖類(葡萄糖、半乳糖、甘露醣、海藻醣、木醣、N-乙醯葡萄糖胺、N-乙醯半乳糖胺、唾液酸以及此等之複合物及衍生物)，及其他由經分解之多糖、醣蛋白、蛋白多醣、醣胺聚醣、醣脂等複合生物體分子所分解或衍生之糖鏈等範圍廣泛之物，但並不限定於此。糖鏈可為直鏈型亦可為支鏈型。
同時，本發明中，「糖鏈」中亦包含糖鏈之衍生物，糖鏈之衍生物，可例舉如：其構成糖鏈之糖，為含羧基之糖(例如：C-1位受氧化形成羧酸之醛醣酸(aldonic acid)(例如：D-葡萄糖受氧化之D-葡萄糖酸)、末端之C原子形成羧酸之醣醛酸(uronic acid)(D-葡萄糖受氧化之D-葡萄糖醛酸))、含胺基或胺基的衍生物之糖(例如：D-葡萄糖胺、D-半乳醣胺等)、含胺基及羧基兩者之糖(例如：N-寡聚醣神經胺醣酸(N-glycoylneuraminic acid)、N-乙醯 胞壁酸等)、去氧化之糖(例如：2-去氧-D-核醣)、含硫酸基之硫酸化糖、含磷酸基之磷酸化糖等糖鏈但並不限定於此。
本發明之糖鏈-多肽複合物中，鍵結於多肽之糖鏈並無特別之限定，而由對生物體的適性之觀點而言，以生物體內為複合醣(compound sugar)(醣肽(或醣蛋白)、蛋白多醣、醣脂等)存在之糖鏈較佳。該類糖鏈，可例舉如生物體內鍵結在胜肽(或蛋白質)上的N-鍵結型糖鏈、O-鍵結型糖鏈等糖鏈之醣肽(或醣蛋白)。
本發明之糖鏈-多肽複合物中，鍵結在前述多肽的糖鏈，可使用如：二唾液酸(Disialo)糖鏈、無唾液酸(Asialo)糖鏈、二-N-乙醯葡萄糖胺(DiGlcNAc)糖鏈、二甘露醣(DiMan)糖鏈、N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)糖鏈、麥芽三糖(Maltotriose)糖鏈、麥芽糖(Maltose)糖鏈、麥芽四糖(Maltotetraose)糖鏈、麥芽七糖(Maltohetaose)糖鏈、β-環糊精(β-cyclodextrin)糖鏈、γ-環糊精(γ-cyclodextrin)糖鏈。
更具體言之，本發明中所使用之糖鏈，可為：如下式(1)所示之二唾液酸糖鏈、如下式(2)所示之無唾液酸糖鏈、如下式(3)所示之二-N-乙醯葡萄糖胺糖鏈、如下式(4)所示之二甘露醣糖鏈、如下式(5)所示之N-乙醯葡萄糖胺糖鏈、如下式(6)所示之麥芽三糖糖鏈、如下式(7)所示之麥芽糖糖鏈、如下式(8)所示之麥芽四糖糖鏈、如下式(9)所示之麥芽七糖糖鏈、如下式(10) 所示之β-環糊精糖鏈、如下式(10-2)所示之γ-環糊精糖鏈。
式(5)N-乙醯葡萄糖胺糖鏈
本發明中，亦可使用自上述二唾液酸糖鏈、無唾液酸糖鏈、二-N-乙醯葡萄糖胺糖鏈、二甘露醣糖鏈、或麥芽七糖糖鏈之非還原端去除1個或多個糖之糖鏈。
本發明中，糖鏈所鍵結之胺基酸殘基並無特別之限定，如糖鏈可鍵結在半胱胺酸(Cys：C)或天冬醯胺酸(Asn：N)上，鍵結在半胱胺酸(Cys：C)上更佳。
本發明中，使糖鏈鍵結在胺基酸上之方法並 無特別之限定，例如胺基酸殘基可直接鍵結糖鏈，亦可為胺基酸殘基介由連接基團鍵結糖鏈。
同時，本發明中，糖鏈所鍵結之胺基酸殘基，可對「極性胺基酸殘基與非極性胺基酸殘基交互排列之胺基酸序列」直接鍵結，如介由連接基團鍵結。
此類連接基團，係可例舉如可使胺基酸與胜肽鍵結，兩末端含胺基及羧基之烷鏈及PEG鏈等。此類連接基團，可舉如：-NH-(CH2)n-CO-(式中，n為整數，只要不妨礙目的的連接基團之機能即可並無特別之限定，以1至15之整數較佳。)及-NH-(CH2CH2O)m-CH2CH2-CO-(式中，m為整數，只要不妨礙目的連接基團之機能即可並無特別之限定，以1至7之整數較佳。)等。更具體地可舉如：-NH-(CH2)11-CO-(C12-linker)及-NH-(CH2CH2O)3-CH2CH2-CO-(PEG-linker)等。
本發明之糖鏈-多肽複合物，可以本業業者一般已知之多肽合成方法，再加入糖鏈附加步驟製造。在附加糖鏈時，可以利用，以轉麩醯胺基酶為代表之酵素的方法，但該情形時，會有附加之糖鏈必須大量，使最終步驟後之精製煩雜，糖鏈附加之位置及可附加之糖鏈亦受限定等問題，因此雖可使用在分析用途等少量之合成中，但大規模製造上並非實用性的方法。
以下所例舉，係本發明糖鏈-多肽複合物的簡便製造方法之具體例，係使用鍵結糖鏈之Asn(糖鏈附加Asn)，再適當使用固相合成、液相合成等一般已知的胜肽 合成方法之製造糖鏈-多肽複合物的方法(A法)；及依照一般已知之胜肽合成方法製造任意胺基酸殘基之Cys多肽，之後，再經由化學合成在Cys上附加糖鏈，以製造糖鏈-多肽複合物之方法(B法)。以此類製造方法為參考，本業業者即可以各種方法製造糖鏈-多肽複合物。
再者，此類A法及B法，亦可以2種以上組合進行。分析等少量使用者之合成，可在上述方法，再組合轉移酶的糖鏈延伸反應。再者，A法，在專利國際公開第2004/005330號簡報(US 2005222382(A1))中，B法，在專利國際公開第2005/010053號簡報(US 2007060543(A1))中，亦各曾記載，其中所揭示者亦全部併在本說明中作為參考。此外，關於製造在A法及B法中所使用的糖鏈構造為均一之糖鏈，亦曾記載在專利國際公開第03/008431號簡報(US 2004181054(A1))、專利國際公開第2004/058984號簡報(US 2006228784(A1))、專利國際公開第2004/058824號簡報(US 2006009421(A1))、專利國際公開第2004/070046號簡報(US 2006205039(A1))、專利國際公開第2007/011055號簡報等之中，其中所揭示者亦全部併在本說明中作為參考。
糖鏈-多肽複合物之製造方法(A法)
糖鏈-多肽複合物，可如，以下概略所示，使用鍵結糖鏈之Asn經由固相合成製造。
(1)先以胺基氮受脂溶性保護基保護之胺基酸的羧基 鍵結在樹脂(resin)。在該情形下，由於胺基酸的胺基氮受脂溶性保護基所保護，因此可防止胺基酸之間自行縮合，樹脂係與胺基酸反應而鍵結。
(2)之後再使所得反應物的脂溶性保護基脫離而形成游離胺基。
(3)該游離胺基，再與胺基氮受脂溶性保護基所保護之任意胺基酸的羧基，進行醯胺化反應。
(4)之後使上述脂溶性保護基脫離而形成游離胺基。
(5)經由1次以上重複上述(3)及(4)之步驟，即可使任意數目之任意胺基酸鍵結，獲得末端鍵結樹脂，另端上含游離胺基之胜肽。
(6)在上述(5)中所合成之胜肽的游離胺基受乙醯基所保護時，使用乙酸酐、乙酸等乙醯化亦佳。
(7)最後，再以酸切斷樹脂，即可得到具有期望之胺基酸序列的胜肽。
其中，在(1)中，使用胺基氮受脂溶性保護基所保護之糖鏈附加Asn，替代胺基氮受脂溶性保護基所保護之胺基酸，胺基氮使該天冬醯胺酸部分之羧基與樹脂的羥基反應，即可獲得C末端含糖鏈附加Asn的胜肽。
同時，在(2)之後，或以1次以上之任意次數重複(3)及(4)之後，在(3)中，使用胺基氮受脂溶性保護基所保護之糖鏈附加Asn，替代胺基氮受脂溶性保護基所保護之胺基酸，胺基氮即可在多肽之任意位置鍵結糖鏈。
如此操作，在任何(1)及(3)之步驟中，2次以上，使用胺基氮受脂溶性保護基所保護之糖鏈附加Asn，替代胺基氮受脂溶性保護基所保護之胺基酸，胺基氮即可在多肽之任意2處以上鍵結糖鏈。
在鍵結糖鏈附加Asn之後，再使脂溶性保護基脫離而形成游離胺基，之後隨即進行步驟(7)，即可得到N末端含糖鏈附加Asn的多肽。
提供之C末端為醯胺基的樹脂，一般，只要為可在固相合成中使用之樹脂即可，以使用如：以胺基官能化之Rink-Amide-Resin(Merck公司製造)、Rink-Amide-PEGA Resin(Merck公司製造)、及NH-SAL-Resin(渡邊化學公司製造)為佳。此外，亦可在以胺基官能化之Amino-PEGA-Resin(Merck公司製造)等上再鍵結Fmoc-NH-SAL-Resin-Linker(渡邊化學公司製造)等。之後再以酸切斷該類樹脂與胜肽，即可使胜肽C末端之胺基酸醯胺化。
此外，C末端為羧酸之樹脂(resin)，以使用如：以氯官能化之2-氯三苯甲基氯樹脂(Merck公司製造)、以胺基官能化之Amino-PEGA Resin(Merck公司製造)、含羥基之NovaSyn TGT醇樹脂(Merck公司製造)、Wang Resin(Merck公司製造)、及HMPA-PEGA Resin(Merck公司製造)等。同時，在Amino-PEGA Resin與胺基酸之間存在連接基團時亦可，該連接基團，可舉如：乙酸4-羥基甲基苯氧酯(HMPA)、丁酸4-(4-羥基甲基-3-甲氧基苯氧 酯(HMPB)等。亦可使用C末端之胺基酸預先與樹脂鍵結之H-Cys-(Trt)-Trityl Nova PEG樹脂(Merck公司製造)等。
樹脂與胺基氮受脂溶性保護基所保護之胺基酸之鍵結，可使用如含羥基的樹脂及以氯官能化之樹脂，使胺基酸的羧基以酯鍵鍵結在樹脂。同時，亦可使用以胺基官能化之樹脂，使胺基酸的羧基以醯胺鍵結鍵結在樹脂。
而且，2-氯三苯甲基氯樹脂，亦具有在固相合成中胜肽鏈延伸時，可防止末端Cys消旋化之特點，因此較佳。
糖鏈-多肽複合物之製造方法-2(A法)
糖鏈-多肽複合物，可如以下概略所示，使用鍵結糖鏈之Asn經由液相合成製造。
(1)先使胺基氮受脂溶性保護基保護之胺基酸的羧基與胺基游離而羧基受保護或醯胺化之胺基酸鍵結。
(2)之後再使所得反應物的脂溶性保護基脫離而形成游離胺基。
(3)該游離胺基，再與胺基氮受脂溶性保護基所保護之任意胺基酸的羧基，在溶液中進行醯胺化反應。該情形時，N末端側胺基酸之胺基氮係受脂溶性保護基所保護，C末端側之羧基受保護或醯胺化，因此可防止胺基酸之間自行縮合，游離胺基係與羧基反應而鍵結。
(4)之後再使上述脂溶性保護基脫離而形成游離胺基。
(5)經由1次以上重複上述(3)及(4)之步驟，即可使任意數目之任意胺基酸鍵結，獲得C末端之羧基受保護或醯胺化、N末端含游離胺基之胜肽。
(6)在上述(5)中所合成之胜肽的游離胺基受乙醯基保護時，使用乙酸酐、乙酸等乙醯化亦佳。
(7)最後，再以酸切斷側鏈之脂溶性保護基，即可得到具有期望之胺基酸序列的胜肽。
糖鏈-多肽複合物之製造方法-3(A法)
糖鏈-多肽複合物，可如以下概略所示，以鍵結糖鏈之Asn經由片段合成法製造。
(1)先以製造上述糖鏈-多肽複合物的方法(A法)之(1)至(6)，在樹脂上合成胺基氮受乙醯基或脂溶性保護基保護之多肽或糖鏈-多肽複合物。
(2)之後再於側鏈保護基未經脫保護之條件下，自樹脂切斷多肽或糖鏈-多肽複合物，即可獲得C末端含游離羧基、N末端胺基氮受乙醯基或脂溶性保護基保護的多肽或糖鏈-多肽複合物。
(3)所得之胺基氮受乙醯基或脂溶性保護基保護的多肽或糖鏈-多肽複合物，再經由固相合成法或液相合成法，與樹脂或多肽鍵結。
(4)之後再使上述脂溶性保護基脫離而形成游離胺基。
(5)經由1次以上重複上述(3)及(4)之步驟，即 可使任意數目之任意胺基酸鍵結而得到胜肽。
(6)最後，再以酸切斷樹脂，即可得到具有期望之胺基酸序列的胜肽。
脂溶性保護基，可例舉如：9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、第三丁氧基羰基(Boc)、苯甲基、烯丙基、烯丙氧基羰基、乙醯基等，羧酸酯系或醯胺系之保護基等。在胺基酸上導入脂溶性保護基時，例如在導入Fmoc基時可加入9-芴基甲基-N-琥珀醯亞胺基碳酸酯與碳酸氫鈉進行反應而導入。該反應可在0至50℃，並最好在室溫，進行反應約1至5小時左右。
受脂溶性保護基保護之胺基酸，亦可使用已商品化之商品。其例可舉如：Fmoc-Ser-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys-OH、Fmoc-Arg-OH、Fmoc-His-OH、Fmoc-Asp-OH、Fmoc-Glu-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Cys-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Pro-OH。
受脂溶性保護基保護之胺基酸，在側鏈導入保護基者，可舉如：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Cys(StBu)-OH、Fmoc-Cys(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、 Fmoc-Tyr(tBu)-OH。
此外，欲在糖鏈-多肽鍵結物之胺基酸序列中，附加連接基團時，在固相合成之過程中，替代上述受脂溶性保護基所保護之胺基酸，經由使用受脂溶性保護基保護之連接基團，即可於較佳之位置，嵌入連接基團。
在使用2-氯三苯甲基氯樹脂之情形時，可使用：二異丙基乙胺(DIPEA)、三乙胺、吡啶、2,4,6-三甲吡啶等鹼進行酯化。在使用含羥基之樹脂時，酯化之催化劑，可使用：1-三甲苯基磺醯基-3-硝基-1,2,4-三唑(MSNT)、二環己基碳二亞胺(DCC)、二異丙基碳二亞胺(DIC)等一般已知之去水縮合劑。胺基酸與去水縮合劑之使用比例，相對於前者1當量，後者，一般為1至10當量，以2至5當量為佳。
酯化反應，以如將樹脂置入固相之管柱中，再以溶劑洗淨該樹脂，之後加入胺基酸之溶液進行操作為佳。洗淨用溶劑，可舉如：二甲基甲醯胺(DMF)、2-丙醇、二氯甲烷等。溶解胺基酸之溶劑，可舉如：二甲基亞碸(DMSO)、DMF、二氯甲烷等。酯化反應以0至50℃為佳，室溫更佳，並以進行約10分鐘至30小時左右為佳，15分鐘至24小時左右更佳。
此時固相上未反應之基，以使用乙酸酐等乙醯化而封端(capping)較佳。
脂溶性保護基之脫離，例如以鹼處理進行。該鹼，可舉如：哌啶、嗎福林等。當中，以在溶劑存在下 進行較佳。其溶劑，可舉如：DMSO、DMF、甲醇等。
游離胺基與胺基氮受脂溶性保護基所保護的任意胺基酸之羧基的醯胺化反應，以在活化劑及溶劑存在下進行為佳。
活化劑之例，可舉如：二環己基碳二亞胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺．鹽酸鹽(WSC/HCl)、疊氮磷酸二苯酯(DPPA)、羰基二咪唑(CDI)、氰基膦酸二乙酯(DEPC)、苯并三唑-1-基氧-三吡咯啶鏻(DIPCI)、苯并三唑-1-基氧-三吡唑啶鏻六氟磷酸鹽(PyBOP)、1-羥基苯并三唑(HOBt)、羥基琥珀醯亞胺(HOSu)、二甲基胺基吡啶(DMAP)、1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)、羥基苯二甲醯亞胺(HOPht)、五氟酚(Pfp-OH)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)、1-〔雙(二甲基胺基)亞甲基〕-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸鹽(HCTU)、O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HATU)、O-苯并三唑-1-基-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TBTU)、3,4-二氫-3-羥基-4-氧雜-1,2,3-苯并三(Dhbt)、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三-2-基)-4-甲基嗎福啉鎓氯化物n水合物(DMT-MM)等。
活化劑之使用量，相對於胺基氮受脂溶性保護基所保護之任意胺基酸，以1至20當量為佳，1至10當量更佳，1至5當量又更佳。
溶劑之例，可舉如：DMSO、DMF、二氯甲烷 等。反應以在0至50℃，最好在室溫進行約10分至30小時左右為佳，15分至24小時左右更佳，脂溶性保護基之脫離，可如上述同樣進行。
在胺基官能化之Rink-Amide-Resin(Merck公司製造)、Rink-Amino-PEGA Resin(Merck公司製造)、NH-SAL-Resin(渡邊化學公司製造)、及NH-SAL-Resin-Linker所鍵結之Amino-PEGA-Resin(Merck公司製造)等於C末端導入胺基酸時，可以上述之醯胺化反應進行導入。
由樹脂(resin)切斷胜肽鏈時以使用酸處理為佳。該酸之例，可舉如：三氟乙酸(TFA)、氟化氫(HF)等。
如此操作，即可得到在期望之位置含糖鏈附加Asn的糖鏈-多肽複合物。
同時，在本發明之一實施樣態中，在固相合成所使用之糖鏈附加Asn中在糖鏈之非還原末端含唾液酸時，為防止酸處理使唾液酸切斷，以該唾液酸之羧基經保護基保護為佳。該保護基之例，可舉如：苯甲基、烯丙基、二苯基甲基、苯甲醯甲基等。保護基之導入及保護基之脫離方法，可以一般已知之方法進行。
糖鏈-多肽複合物之製造方法(B法)
糖鏈-多肽複合物，可以先行合成多肽，之後再將合成之多肽附加在糖鏈的方法製造。具體言之，即對欲附加糖 鏈之位置含Cys的多肽，先以固相合成法、液相合成法、以細胞合成之方法、由天然存在之物中分離萃取之方法等製造。在多肽係以固相合成法或液相合成法合成之情形時，胺基酸可各以一殘基鍵結，亦可鍵結在多肽。其中，在預定形成雙硫鍵的位置之Cys等，對未附加糖鏈之Cys，係預先以如乙醯胺甲基(Acm)予以保護。同時，在未附加糖鏈、且不使用在形成雙硫鍵的Cys導入糖鏈-多肽複合物中時，係在糖鏈附加步驟及形成雙硫鍵步驟之間，預先以保護基保護Cys，之後再藉由脫保護即可導入Cys。此類保護基，可例舉如：第三丁基(tBu)及4-甲氧基苯甲基。
此外，在1多肽中，係在Cys附加不同糖鏈時，可於最初時使導入糖鏈之Cys未受保護，其次將導入不同糖鏈之Cys，預先藉由StBu等保護，即可導入不同之糖鏈。具體言之，即在以固相合成等合成多肽時，先使欲導入第一糖鏈之Cys不受保護，且以Fmoc-Cys(StBu)-OH等使欲導入第二糖鏈之Cys等，形成含保護基之Cys。然後，再於維持StBu等保護基之下，在未受保護之Cys上導入糖鏈。其次，將StBu基等進行脫保護，即可在未受保護之Cys上導入不同之糖鏈。再者，欲導入第一糖鏈之Cys及欲導入第二糖鏈之Cys，可為1個亦可為多個。
此外，StBu基之脫保護，可以使用：三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、二硫蘇醣醇(DTT)、三丁基膦等還原劑進行反應而脫保護。上述反應，一般以在0至80℃進行為佳，5至60℃更佳，10至35℃又更佳。反應時 間，一般以30分至5小時左右為佳。反應終了後，以再經由適當、一般已知之方法(如高速液相管柱層析(HPLC))精製為佳。
在導入不同的糖鏈時，以導入對CyS之脫保護步驟中的還原條件及HPLC等之精製步驟中的酸性條件，更為安定之糖鏈較佳。特別，在導入含唾液酸之糖鏈時，以由未含唾液酸之糖鏈或唾液酸殘基數少的糖鏈，先行導入較佳。
同時，在於糖鏈-多肽複合物之胺基酸序列中，附加連接基團時，可如在固相合成之過程中，替代以脂溶性保護基保護之胺基酸，而使用以脂溶性保護基保護之連接基團，即可在所合成之多肽所期望之位置，嵌入連接基團。
其次，再使鹵素乙醯化糖鏈衍生物與在上述中所得之含無保護Cys的胜肽反應，使糖鏈與無保護Cys之硫醇基反應，而鍵結於胜肽上。上述反應，可在磷酸緩衝液、Tris-鹽酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、或此等之混合溶液中，一般在0至80℃進行反應，在10至60℃更佳，在15至35℃又更佳。反應時間，一般以10分至24小時為佳，一般30分至5小時左右更佳。在反應終了後，亦可再以適當、一般已知之方法(如HPLC)精製。
鹵素乙醯化糖鏈衍生物，可舉如天冬醯胺酸鍵結型糖鏈之1位碳鍵結的羥基，以-NH-(CH2)a-(CO)-CH2X(X為鹵素原子，a為整數，只要不妨礙目的的連接基團 之機能即可並無特別之限定，而表示0至4之整數。)取代之化合物。
具體言之，係以鹵素乙醯化複合型糖鏈衍生物與含Cys多肽在磷酸緩衝液中，於室溫反應。反應終了後，再經由HPLC精製即可獲得含糖鏈鍵結Cys之糖鏈-多肽複合物。
再者，亦可在DMSO、DMF、甲醇、乙腈之有機溶劑、與上述緩衝液之混合溶液中進行反應。此時，可以有機溶劑之比例，為0至99%(v/v)之範圍，添加至上述緩衝液中。含對緩衝液溶解性低的無保護Cys之胜肽，可藉由添加此類有機溶劑而提高對反應溶液之溶解性，因此更佳。
此外，亦可在DMSO、DMF、甲醇、乙腈之有機溶劑、及此等之混合溶液中進行反應。當中，以在鹼存在下進行較佳。鹼之例，可舉如：DIPEA、三乙胺、吡啶、2,4,6-三甲吡啶等。同時，亦可在緩衝溶液中再加入胍鹽酸鹽、尿素之混合溶液中進行反應。其中，胍鹽酸鹽及尿素，可以最終濃度1M至8M加入上述緩衝溶液中。添加胍鹽酸鹽、尿素，對緩衝液溶解性低的胜肽可提高其溶解性，因此更佳。
此外，含無保護Cys之多肽，為了防止介由雙硫鍵而形成2聚體，亦可在緩衝液中添加三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、二硫蘇醣醇(DTT)之後反應。TCEP及DTT，可以最終濃度10μM至10mM加入緩衝溶液中。
之後，在糖鏈鍵結在目的之Cys之後，再以Acm等使受保護之Cys的保護基脫保護。在保護基為Acm基時，可在水、甲醇、乙酸、或此等混合溶液中，使用碘、乙酸汞(Ⅱ)、硝酸銀(I)、或乙酸銀(I)等反應而脫保護。
上述反應，一般以在0至80℃進行為佳，在5至60℃更佳，在10至35℃又更佳。反應時間，一般以5分至24小時左右為佳。在反應終了後，在以DTT及鹽酸等處理之後，亦可再以適當、一般已知之方法(如HPLC)精製。
如此操作，即可得到在期望的位置含鍵結糖鏈之Cys的糖鏈-多肽複合物。同時，此類精製之糖鏈-多肽複合物，亦可再如後述，使脫保護之Cys之間形成雙硫鍵。
再者，在製造胜肽序列中含複數股之含有二唾液酸糖鏈及單唾液酸糖鏈等含唾液酸糖鏈的糖鏈-多肽複合物時，亦可使用所導入的糖鏈上之唾液酸的羧基，受苯甲基(Bn)、烯丙基、二苯基甲基、苯甲醯甲基等保護之含唾液酸糖鏈。
在導入唾液酸的羧基受保護之糖鏈時，亦可在後述之糖鏈-多肽複合物中雙硫鍵的形成步驟之後，再進行唾液酸保護基之脫保護步驟。
如此操作，藉由以苯甲基等保護唾液酸之羧基，使製造步驟中經由HPLC等之分離/精製步驟容易。同 時，保護唾液酸之羧基，亦可防止對酸不安定之唾液酸脫離。
糖鏈上唾液酸羧基之保護反應，可以本業業者熟習之方法進行。同時，形成雙硫鍵之糖鏈-多肽複合物中，唾液酸羧基的保護基，可以在鹼性條件下進行水解脫保護。上述反應，一般以在0至50℃進行為佳，在0至40℃更佳，在0至30℃又更佳。反應時間，一般以5分至5小時左右為佳。在反應終了後，在以磷酸、乙酸等弱酸中和之後，亦可再以適當、一般已知之方法(如HPLC)精製。
此外，以上述A法及B法製作之糖鏈-多肽複合物，可以：空氣及/或氧、碘、DMSO、氧化或還原之麩胱甘肽之混合物、鐵氰酸鉀、艾耳門藥劑(5,5’-二硫二(2-硝基苯甲酸))、三氟乙酸鉈(Ⅲ)、以及烷基三氯矽烷亞碸等本業業者習知之方法，形成Cys之間的雙硫鍵。
再者，在形成Cys-Cys間之雙硫鍵時，對糖鏈-多肽複合物中雙硫鍵為非所欲的Cys，可預先以保護基保護。此類保護基之例，可使用如：Acm、tBu、4-甲氧基苯甲基、4-甲基苯甲基等，在氧化條件下安定之保護基。
而且，B法中，形成雙硫鍵，亦可在導入糖鏈之前進行。但是，在欲形成雙硫鍵之Cys上導入保護基時，脫保護步驟須在形成雙硫鍵步驟之前進行。
此外，B法中與鹵素乙醯化複合型糖鏈衍生物反應之胺基酸，只要為含硫醇基之胺基酸即可並無特別之限定，例如D-構形體之半胱胺酸(D-Cys)、高半胱胺酸、原半胱 胺酸、青黴胺等可與Cys同樣使用。
本發明之糖鏈-多肽複合物中鍵結之糖鏈種類並無特別之限定，而以糖鏈-多肽複合物中鍵結之糖鏈所存在的糖殘基數合計為5以上較佳。舉例如，藉由1股以上5糖以上之糖鏈附加、多股5糖以下之糖鏈附加，即可使存在於1個糖鏈-多肽複合物中附加糖鏈之糖殘基數為5以上。在以多股糖鏈附加時，鍵結在1胜肽上的糖鏈之種類可相同，亦可以不同種類之糖鏈組合鍵結，而以相同者較佳。
舉例如，在存在於糖鏈-多肽複合物中之鍵結糖鏈的糖殘基數合計為5時，可以含2個糖殘基之麥芽糖糖鏈、含3個糖殘基之麥芽三糖糖鏈各1股鍵結。同時，在存在於糖鏈-多肽複合物中之鍵結糖鏈的糖殘基數合計為6時，可以3股麥芽糖糖鏈鍵結，亦可以2股麥芽三糖糖鏈鍵結。此外，在存在於糖鏈-多肽複合物中之鍵結糖鏈的糖殘基數合計為7時，可以2股麥芽糖糖鏈及1股麥芽三糖糖鏈鍵結，亦可以1股含7個糖殘基之二-N-乙醯葡萄糖胺糖鏈鍵結。同樣地，在存在於糖鏈-多肽複合物中之鍵結糖鏈的糖殘基數合計為8以上時，可以各種組合之糖鏈鍵結。
鍵結在本發明糖鏈-多肽複合物的糖鏈數，只要糖鏈-多肽複合物，不致失去可在pH中性附近之水溶液中自行集合，而形成β-褶板結構之特徵即可並無特別之限定。舉例如，以1、2、3、4、5、或6股為佳，1、2、 或3股更佳。
本發明之糖鏈-多肽複合物中，糖鏈所鍵結之胺基酸殘基的位置，只要不致失去糖鏈-多肽複合物，可在pH中性附近之水溶液中自行集合，而形成β-褶板結構之特徵即可並無特別之限定。舉例如，糖鏈鍵結之胺基酸殘基的位置以在多肽之N末端側及/或C末端側為佳，在N末端側及C末端側以外的位置亦可。
最好，在從位在多肽N末端之胺基酸殘基計算，至第x個的全部之胺基酸、及從位在C末端之胺基酸殘基計算，至第y個的全部之胺基酸(其中，x及y為整數，而x≧0、y≧0，且x+y，係鍵結在多肽之糖鏈數之合計)均鍵結糖鏈。
更具體言之，在多肽鍵結之糖鏈數為1股時，該1股之糖鏈，可鍵結在位在前述多肽N末端之胺基酸殘基、或位在前述多肽C末端之胺基酸殘基。
同時，在多肽鍵結之糖鏈數為2股時，該2股之糖鏈，可鍵結在選自以下之(1)至(3)所成群組之胺基酸殘基。
(1)從位在多肽N末端的胺基酸殘基計算之第1個及第2個的胺基酸殘基
(2)從位在多肽C末端的胺基酸殘基計算之第1個及第2個的胺基酸殘基
(3)位在多肽N末端的胺基酸殘基、及位在多肽C末端的胺基酸殘基
而且，在多肽鍵結之糖鏈數為3股時，該3股之糖鏈，可與選自以下(1)至(4)所成群組的任意胺基酸殘基鍵結。
(1)從位在多肽N末端的胺基酸殘基計算，第1個、第2個及第3個胺基酸殘基
(2)從位在多肽C末端的胺基酸殘基計算，第1個、第2個及第3個胺基酸殘基
(3)從位在多肽N末端的胺基酸殘基計算，第1個及第2個胺基酸殘基、及位在多肽C末端的胺基酸殘基
(4)位在多肽N末端的胺基酸殘基、及從位在多肽C末端計算，第1個及第2個胺基酸殘基
本發明之糖鏈-多肽複合物上所附加之糖鏈，以含支鏈較佳。其中，本發明中，多肽鍵結之糖鏈為所謂「含支鏈之糖鏈」時，只要為如二唾液酸糖鏈、無唾液酸糖鏈、二-N-乙醯葡萄糖胺糖鏈，在其1個糖鏈中含支鏈者即可並無特別之限定，舉例如，包含在1個多肽中附加多股直鏈糖鏈，而以胜肽全體而言為含支鏈糖鏈之狀態的情形。例如，在1個胜肽中鍵結2股以上的麥芽糖糖鏈及麥芽三糖糖鏈等直鏈糖鏈時，亦包含在本發明之「含支鏈之糖鏈」中。
本發明中，所謂水凝膠，意指基本上分散介質為水。只要本發明之胜肽可分散在水中，形成水凝膠，胜肽與水之混合比例並無特別之限定，本業業者亦可視水凝膠之用途適當調節混合之比例。舉例如，本發明之一實 施形態中，在以C(DiGlcNAc)-(RADA)4製造水凝膠時，胜肽濃度為0.5重量%以上時可在廣域pH形成水凝膠，而在胜肽濃度為約0.25重量%時，可在中性pH形成水凝膠，但在酸性pH並不形成水凝膠。因此，以本發明之胜肽製造之水凝膠，在胜肽濃度為低濃度時，可以pH控制水凝膠之形成。利用此種性質，可如，在使用水凝膠後藉由變化pH，使凝膠變化為溶膠，即可快速拋棄或排除。
本發明中，對水凝膠之強度及性質的評量方法並無特別之限定，可以如鋼球載重試驗及動黏度測定評量。鋼球載重試驗，可如，在竇漢氏管(Durham tube)內形成之水凝膠的表面負載固定重量之鋼球，以觀察鋼球於水凝膠的表面停留、下沉，評量水凝膠的強度。同時，在鋼球載重試驗中，亦可同時目視確定水凝膠之透明度、及有無不溶物/沉澱。水凝膠的動黏度測定，係對對象之水凝膠，以檢流計測定動黏度，即可測定隨時間經過之水凝膠強度變化。
再者，本實施例中評量水凝膠時，形成水凝膠之操作之一，亦包含激烈攪拌之操作。進行此類激烈攪拌之操作，可形成高均一性之凝膠，因此可使進行之評量信賴性更高。
本發明之水凝膠可用於各種用途中，例如，本發明之水凝膠對生物體之安全性高，因此可用於醫藥用途(止血基材、血管栓塞材料等之手術補助劑、醫藥品等之緩釋載體、外科手術及再生醫療等之中之創傷包覆材 料、黏膜隆起材料、齒槽骨重建材料、角膜再生材料等組織重建材料，組織培養實驗等之中之三維培養基材)及化妝品用途(護膚用品、護髮用品等)上。特別，以使用為止血基材、緩釋載體、或培養基材更佳。
本發明中，所謂止血基材，廣泛指生物體出血之止血所使用的基材。本發明之止血基材，並不限定僅包含本發明之糖鏈-多肽複合物與水，亦可再含其他之各種成分。例如，再含包含消毒/殺菌成分之藥劑時，不只對傷口出血之止血，亦同時可進行傷口之殺菌/消毒。
本發明中，所謂緩釋載體，廣泛指具有緩緩釋放內包物質及藥劑之性質的載體。本發明之緩釋載體中內包的物質並無特別之限定，可內包各種物質及藥劑。同時，本發明緩釋載體中內包之物質及藥劑並不限定為1種，亦可同時內包2種以上的物質及藥劑。
本發明中，所謂培養基材，廣泛指細胞及組織之培養上所使用的基材。舉例如，將本發明之培養基材塗佈於細胞培養用的培養皿，再培養細胞，即可提高細胞之黏接性/成長性。同時，如在本發明之培養基材中將細胞及組織內包並進行培養，亦可對細胞及組織有效率地進行三維培養。
本發明中，所謂黏膜隆起材料，廣泛指在以內視鏡手術之胃癌及食道癌等黏膜的切除手術及黏膜下層剝離手術中，在病變部位形成黏膜隆起之膜下注入材料。例如，在以內視鏡等切除病變部位時，在病變部位之下部 注入本發明之組織隆起材料使切除部位隆起時，可容易地進行病變部位之切除。
本發明中，所謂血管栓塞材料，廣泛指動脈栓塞術中，作為栓塞物使用之血管內栓塞促進用修復材料。在肝癌及子宮肌瘤等之動脈栓塞術中，以本發明之血管栓塞材料由病變部位上游之動脈內注射，在與血液接觸時可形成水凝膠。藉此可阻塞腫瘤營養供給路徑之動脈，即可使腫瘤死滅。
本發明中，所謂組織重建材料，廣泛指再生醫療中，在生物體內重建組織時形成支架之材料。例如，在骨質之再生中，注入本發明之組織重建材料，可形成細胞支架進行骨質之形成，即可促進骨質之再生。
再者，本說明書中所使用之用語，係用以說明特定之實施形態，並無限定發明之含意。
此外，本說明書中所使用之「包含」的用語，除文意上明顯須不同地理解之情形外，係在所述事項(構成材料、步驟、要點、數字等)所存在之含意，但並未排除存在以外之其他事項(構成材料、步驟、要點、數字等)。
只要無不同之定義，在此所使用的全部之用語(包含技術用語及科學用語。)，係具有與本發明所屬技術之本業業者所廣泛理解者為相同之含意。其中所使用之用語，除非明顯表示為不同之定義，可以具有整合本說明書及相關技術範圍中之含意的含意解釋，而不可以理想化、或過度形式性之含意解釋。
第一的、第二的等用語係在表現各種要素之情形時使用，但應理解此等要素並不受該類用語所限定。此類用語只為使一種要素與其他之要素區別，例如將第一要素記載為第二要素，同樣地，將第二要素記載為第一要素，在不脫離本發明之範圍下亦為可能。
以下，再以實施例更具體說明本發明，然而，本發明可以各種形態具體化，因此並不限定以其中記載之實施例解釋。
本說明書中，如表示為二唾液酸-BrAc時，即表示為溴乙醯化之二唾液酸糖鏈。在如表示為C(二唾液酸)-(RADA)4時，即表示在含RADARADARADARADA胺基酸序列的多肽之N末端，鍵結二唾液酸鍵結之半胱胺酸殘基。
實施例
(合成例1)麥芽七糖-BrAc之合成
(合成例1-1)胺化
先將下述式(11)所示之化合物1(商品名：麥芽七糖，東京化成公司製造)(53.2mg，46.1μmol)溶於水(5mL)。再將碳酸氫鈉(3.6g)加入溶液中，在昇溫至37℃之後攪拌19小時。然後加入水，並在減壓條件下進行濃縮數次。之後再次溶於水中並冷凍乾燥，即可獲得含如下述式(12)所示之化合物2的冷凍乾燥品。
(合成例1-2)溴乙醯化
先將合成例1-1中所得之化合物2及碳酸鈉(83.0mg，0.92mmol，相對於化合物2為20當量)溶於水中並冷卻至0℃。之後緩緩滴入溶於二氯甲烷之溴乙醯溴(40.0μL， 0.46mmol，相對於化合物2為10當量)，並攪拌2小時。再以二氯甲烷及水並使其分液，並於水層中加入氫溴酸。之後於減壓條件下，濃縮部分之水。
該反應溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：水，B：乙腈，梯度A：B=99.5：0.5→90：10，15分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(13)所示之麥芽七糖-BrAc(26.7mg，20.9μmol，產率46%)。
(合成例2)麥芽糖-BrAc之合成
除改用下述式(14)所示之化合物3(商品名：麥芽糖，東京化成公司製造)(200mg，0.58mmol)取代化合物1以外，以合成例1相同之操作方法進行合成，即可獲得如下述式(15)所示之麥芽糖-BrAc(179.1mg，產率67%)。
(合成例3)麥芽三糖-BrAc之合成
除改用下述式(16)所示之化合物4(商品名：麥芽三糖，東京化成公司製造)(100mg，198.6μmol)取代化合物1以外，以合成例1相同之操作方法進行合成，即可獲得如下述式(17)所示之麥芽三糖-BrAc(58.2mg，產率47%)。
(合成例4)麥芽四糖-BrAc之合成
除改用下述式(18)所示之化合物5(商品名：麥芽四糖，東京化成公司製造)(200mg，0.2mmol)取代化合物1以外，以合成例1相同之操作方法進行合成，即可獲得如下述式(19)所示之麥芽四糖-BrAc(133.1mg，產率51%)。
(合成例5)β-環糊精-BrAc之合成
除改用下述式(20)所示之化合物6(商品名：3A-胺基-3A-去氧-(2AS,3AS)-β-環糊精水合物，東京化成公司製造)(101.5mg，89.5μmol)取代化合物1以外，以合成例1-2相同之操作方法進行合成，即可獲得如下述式(21)所示之β-環糊精-BrAc(31.2mg，產率28%)。
(合成例6)γ-環糊精-BrAc之合成
除改用下述式(22)所示之化合物7(商品名：3A-胺基-3A-去氧-(2AS,3AS)-γ-環糊精水合物，東京化成公司製造)(100.0mg，77.1μmol)取代化合物1以外，以合成例1-2相同之操作方法進行合成，即可獲得如下述式(23)所示之γ-環糊精-BrAc(41.1mg，產率38%)。
(合成例7)二唾液酸-BrAc之合成
係以WO2005/010053中記載的方法相同之操作方法進行合成，即可獲得如下述式(25)所示之二唾液酸-BrAc。
(合成例8)無唾液酸-BrAc之合成
係以WO2005/010053中記載的方法相同之操作方法進行合成，即可獲得如下述式(27)所示之無唾液酸-BrAc。
(合成例9)DiGlcNAc-BrAc之合成
係以WO2005/010053中記載的方法相同之操作方法進行合成，即可獲得如下述式(29)所示之DiGlcNAc-BrAc。
(合成例10)DiMan-BrAc之合成
係以WO2005/010053中記載的方法相同之操作方法進行合成，即可獲得如下述式(31)所示之DiMan-BrAc。
(合成例11)GlcNAc-BrAc之合成
係以WO2005/010053中記載的方法相同之操作方法進行合成，即可獲得如下述式(33)所示之GlcNAc-BrAc。
(合成例12)DiBn-二唾液酸-BrAc之合成
先在二唾液酸-BrAc(28.9mg，12.3μmol)中依序加入DMF(0.58mL)、溴化鋰(21.5mg，248μmol)、溴甲苯(14.6μL，122μmol)，之後於30℃反應20小時。在再次添加溴甲苯(14.6μL，122μmol)之後再反應20小時。之後於該反應溶液中加入甲苯(30mL)，經由離心分離(10,000×g，10分)之後，再以水(100μL)溶解沉澱物並以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：8.0mL/分，沖提溶劑水：乙腈=95：5→70：30，20分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(35)所示之DiBn-二唾液酸-BrAc(7.6mg，產率24%)。
MALDI-MS：(m/z)計算值C100H152BrN7O62：〔M+Na〕+ 2544.8，實測值2544.4。
(合成例13)C(二唾液酸)-(RADA)4之合成
(合成例13-1)Ac-C(RADA)4-NH2之合成
先於固相合成用管柱中填充Rink amide PEGA樹脂(100μmol)，以DMF及二氯甲烷清洗後，再加入Fmoc-Ala-OH(124.5mg，400μmol)、1-雙二甲基胺基亞甲基-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸鹽(HCTU)(157.2mg，380μmol)及二異丙基乙胺(DIPEA)(104.5μL，600μmol)DMF(2.5mL)溶液，並振盪15分。在以二氯甲烷及DMF清洗後，其Fmoc保護基，再於DMF中經20%之哌啶處理去除。以DMF清洗後，再使用Prelude(商標)胜肽合成機，藉由Fmoc法以胜肽固相合成法合成受保護之下述式(36)所示，為鍵結在樹脂狀態之多肽(序列編號4)。縮合反應，係使用縮合劑HCTU並 於DMF中進行。
Fmoc保護基，係於DMF中經20%之哌啶處理去除。以DMF及二氯甲烷清洗之後，再加入乙酸酐及吡啶並振盪1小時。在以DMF及二氯甲烷清洗之後，加入三氟乙酸(TFA)：水：三異丙基矽烷：乙烷二硫醇(=90：2.5：5：2.5)，並於室溫振盪4小時。之後過濾去除樹脂，再於濾液中加入冷卻之二乙基醚，即可得到粗胜肽沉澱。該粗胜肽之部分再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=88：12→78：22%，11分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(37)所示之多肽(序列編號5)(32.7mg)。
Ac-Cys-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-NH2式(37)
(合成例13-2)硫醇之糖鏈修飾反應
先將以合成例13-1中記載之方法所得之多肽(序列編號5)(20.5mg，11.2μmol)、合成例7中合成之二唾液酸-BrAc(66.0mg，28.0μmol，相對於胜肽1為2.5當量)溶 於含33μM之TCEP及8M胍鹽酸鹽的0.2M磷酸緩衝液(pH7.3，3.7mL)中，並於室溫反應4小時。
該反應溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25，15分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(38)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號6)(23.8mg，5.83μmol，產率52%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C121H203N35O62S：〔M+2H〕2+ 2040.5,〔M+3H〕3+ 1360.7,〔M+4H〕4+ 1020.7，實測值2040.4,1360.6,1020.7。
(合成例14)C(無唾液酸)-(RADA)4之合成
先將合成例13-1中所合成之多肽(序列編號5)(22.7mg，12.5μmol)、合成例8中合成之無唾液酸-BrAc(55.0mg，31.2μmol，相對於胜肽1為2.5當量)溶於含33μM之TCEP及8M胍鹽酸鹽之0.2M磷酸緩衝液(pH7.3，4.7mL)中，並於室溫反應3小時。
該反應溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25，18分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(39)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號7)(20.5mg，5.86μmol，產率47%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C133H223N35O72S：〔M+2H〕2+ 1749.2,〔M+3H〕3+ 1166.5,〔M+4H〕4+ 875.1，實測值1749.3,1166.2,874.9。
(合成例15)C(DiGlcNAc)-(RADA)4之合成
先將合成例13-1中合成之多肽(序列編號5)(25.3mg，13.9μmol)、合成例9中合成之DiGlcNAc-BrAc(30.0mg，20.9μmol，相對於胜肽1為1.5當量)溶於含33μM之TCEP及8M胍鹽酸鹽之0.2M磷酸緩衝液(pH7.3，4.7mL)中，並於室溫反應3小時。
該反應溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=88：12→81：19，10分直線濃 度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(40)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號8)(23.9mg，7.53μmol，產率54%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C121H203N35O62S：〔M+2H〕2+ 1587.1,〔M+3H〕3+ 1058.4,〔M+4H〕4+ 794.0，實測值1586.7,1058.1,793.8。
(合成例16)C(DiMan)-(RADA)4之合成
先將合成例13-1中合成之多肽(序列編號5)(15.2mg，8.37μmol)、合成例10中合成之DiMan-BrAc(21.5mg，20.9μmol，相對於胜肽1為2.5當量)溶於含33μM之TCEP及8M胍鹽酸鹽之0.2M磷酸緩衝液(pH7.2，3.1mL)中，並於室溫反應2小時。
該反應溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25，15分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(41)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號9)(16.9mg，6.11μmol，產率73%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C121H203N35O62S：〔M+2H〕2+ 1383.9,〔M+3H〕3+ 922.9,〔M+4H〕4+ 629.5，實測值1383.6,922.7,692.3。
(合成例17)C(GlcNAc)-(RADA)4之合成
先將合成例13-1中合成之多肽(序列編號5)(14.9mg，8.21μmol)、合成例11中合成之GlcNAc-BrAc(5.6mg，16.4μmol，相對於胜肽1為2.0當量)溶於含33μM之TCEP及8M胍鹽酸鹽之0.2M磷酸緩衝液(pH7.3，3.1mL)中，並於室溫反應2小時。
該反應溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=95：5→5：95，15分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(42)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號10)(15.4mg，7.42μmol，產率90%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C79H134N32O32S：〔M+2H〕2+ 1039.1,〔M+3H〕3+ 693.1,〔M+4H〕4+ 520.0，實測值1039.0,692.6,520.0。
(合成例18)C(麥芽七糖)-(RADA)4之合成
先將合成例13-1中合成之多肽(序列編號5)(9.3mg，5.12μmol)、合成例1中合成之麥芽七糖-BrAc(9.8mg，7.68μmol，相對於胜肽1為1.5當量)溶於含33μM之TCEP及8M胍鹽酸鹽之0.2M磷酸緩衝液(pH7.3，3.1mL)中，並於室溫反應4小時。
該反應溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=88：12→72：28，16分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(43)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號11)(5.1mg，1.70μmol，產率33%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C113H191N31O62S：〔M+2H〕2+ 1505.0,〔M+3H〕3+ 1003.7，實測值1504.6,1003.4。
(合成例19)C(β-環糊精)-(RADA)4之合成
先將合成例13-1中合成之多肽(序列編號5)(17.7mg，9.75μmol)、合成例5中合成之β-環糊精-BrAc(36.7mg，29.2μmol，相對於胜肽1為3.0當量)溶於含33μM之TCEP及8M胍鹽酸鹽之0.2M磷酸緩衝液(pH7.3，3.3mL)中，並於室溫反應24小時。
該反應溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=88：12→72：28，16分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(44)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號12)(6.8mg，2.27μmol，產率23%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C113H189N31O61S：〔M+2H〕2+ 1496.0,〔M+3H〕3+ 997.7,〔M+4H〕4+ 748.5，實測值1495.6,997.7,748.3。
(合成例20)C(γ-環糊精)-(RADA)4之合成
先將合成例13-1中合成之多肽(序列編號5)(16.0mg，8.81μmol)、合成例6中合成之γ-環糊精-BrAc(36.7mg，25.9μmol，相對於胜肽1為3.0當量)溶於含33μM之TCEP及8M胍鹽酸鹽之0.2M磷酸緩衝液(pH7.3，3.0mL)中，並於室溫反應5小時。
該反應溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→5：95，15分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(45)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號13)(6.0mg，1.90μmol，產率22%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C119H199N31O66S：〔M+2H〕2+ 1577.1,〔M+3H〕3+ 1051.7,〔M+4H〕4+ 789.0，實測值1576.7,1051.4,788.8。
(合成例21)C(二唾液酸)-(RADA)5之合成
(合成例21-1)Ac-C(RADA)5-NH2之合成
先於固相合成用管柱中填充Rink amide PEGA樹脂(100μmol)，以DMF及二氯甲烷清洗後，再加入 Fmoc-Ala-OH(124.5mg，400μmol)、HCTU(157.2mg，380μmol)及DIPEA(104.5μL，600μmol)之DMF(2.5mL)溶液，並振盪15分。在以二氯甲烷及DMF清洗後，其Fmoc保護基，再於DMF中經20%之哌啶處理去除。以DMF清洗後，再使用Prelude(商標)胜肽合成機，藉由Fmoc法以胜肽固相合成法合成受保護之下述式(46)所示，為鍵結在樹脂狀態之多肽(序列編號14)。縮合反應，係使用縮合劑HCTU並於DMF中進行。
Fmoc保護基，係於DMF中經20%之哌啶處理去除。以DMF及二氯甲烷清洗之後，再加入乙酸酐及吡啶並振盪1小時。在以DMF及二氯甲烷清洗之後，加入TFA：水：三異丙基矽烷：乙烷二硫醇(=90：2.5：5：2.5)，並於室溫振盪4小時。之後過濾去除樹脂，再於濾液中加入冷卻之二乙基醚，即可得到粗胜肽沉澱。該粗胜肽之部分再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=88：12→78：22%，11分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(47)所示之化合物多肽(序列編號15)(32.7mg)。
Ac-Cys-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-NH2式(47)
(合成例21-2)硫醇之糖鏈修飾反應
先將合成例21-1中合成之多肽(序列編號15)(13.9mg，6.24μmol)、合成例7中合成之二唾液酸-BrAc(36.5mg，15.6μmol，相對於胜肽1為2.5當量)溶於含33μM之TCEP及8M胍鹽酸鹽之0.2M磷酸緩衝液(pH7.3，2.1mL)中，並於室溫反應3小時。
該反應溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25，15分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(48)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號16)(7.8mg，1.74μmol，產率28%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C171H284N44O94S：〔M+3H〕3+ 1498.5,〔M+4H〕4+ 1124.1,〔M+5H〕5+ 899.5，實測值1498.6,1123.9,899.4。
(合成例22)C(無唾液酸)-(RADA)5之合成
先將合成例21-1中合成之多肽(序列編號15)(18.8mg，8.43μmol)、合成例8中合成之無唾液酸-BrAc(44.5mg，25.3μmol，相對於胜肽1為3.0當量)溶於含33μM之TCEP及8M胍鹽酸鹽之0.2M磷酸緩衝液(pH7.2，2.8mL)中，並於室溫反應2小時。
該反應溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25，15分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(49)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號17)(16.0mg，4.09μmol，產率49%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C149H250N42O78S：〔M+2H〕2+ 1955.9,〔M+3H〕3+ 1304.3,〔M+4H〕4+ 978.5，實測值1955.8,1304.2,978.2。
(合成例23)C(DiGlcNAc)-(RADA)5之合成
先將合成例21-1中合成之多肽(序列編號15)(19.4mg，8.70μmol)、合成例9中合成之DiGlcNAc-BrAc(20.0mg，21.7μmol，相對於胜肽1為2.5當量)溶於含 33μM之TCEP及8M胍鹽酸鹽之0.2M磷酸緩衝液(pH7.2，3.1mL)中，並於室溫反應2小時。
該反應溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=95：5→60：40，20分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(50)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號18)(16.8mg，4.69μmol，產率54%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C149H250N42O78S：〔M+3H〕3+ 1196.2,〔M+4H〕4+ 897.4，實測值1195.9,897.2。
(合成例24)C(GlcNAc)-(RADA)5之合成
先將合成例21-1中合成之多肽(序列編號15)(18.8mg，8.43μmol)、合成例11中合成之GlcNAc-BrAc(8.7mg，25.3μmol，相對於胜肽1為3.0當量)溶於含7M胍鹽酸鹽之0.2M磷酸緩衝液(pH7.2，4.2mL)中，並於室溫反應1小時。
該反應溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速： 7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=95：5→5：95，15分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(51)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號19)(14.9mg，5.99μmol，產率71%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C95H161N39O28S：〔M+2H〕2+ 1245.8,〔M+3H〕3+ 830.9,〔M+4H〕4+ 623.4，實測值1245.1,830.8,623.3。
(合成例25)C(DiBn-二唾液酸)-(RADA)5之合成
先將合成例21-1中合成之多肽(序列編號15)(20.7mg，9.29μmol)、合成例12中合成之DiBn-二唾液酸-BrAc(58.6mg，23.2μmol，相對於胜肽1為2.5當量)溶於含33μM之TCEP及8M胍鹽酸鹽之0.2M磷酸緩衝液(pH7.3，3.2mL)中，並於室溫反應1小時。
該反應溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=85：15→73：27，17分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(52)所示之糖鏈- 多肽複合物(序列編號20)(7.5mg，1.61μmol，產率17%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C185H296N44O94S：〔M+3H〕3+ 1558.6,〔M+4H〕4+ 1169.2,〔M+5H〕5+ 935.5，實測值1558.4,1169.0,925.6。
(合成例26)C(PEG2000)-(RADA)5之合成
先將合成例21-1中合成之多肽(序列編號15)(15.9mg，7.13μmol)、下述式(53)所示之化合物(馬來醯亞胺化PEG，商品名：SUNBRIGHT(商標)ME-020MA，平均分子量2333，日油公司製造)(24.9mg，10.7μmol，相對於胜肽1為1.5當量)溶於含8M胍之0.2M磷酸緩衝液(pH7.3，2.4mL)中，並於室溫反應1小時。
該反應溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速： 7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=75：25→40：60，12分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(54)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號21)(10.9mg，2.39μmol，產率34%)。
(合成例27)C(無唾液酸)-(RATARAEA)2之合成
(合成例27-1)Ac-C-(RATARAEA)2-NH2之合成
先於固相合成用管柱中填充Rink amide PEGA樹脂(100μmol)，以DMF及二氯甲烷清洗後，再加入Fmoc-Ala-OH(124.5mg，400μmol)、HCTU(157.2mg，380μmol)及DIPEA(104.5μL，600μmol)之DMF(2.5mL)溶液，並振盪15分。在以二氯甲烷及DMF清洗後，其Fmoc保護基，再於DMF中經20%之哌啶處理去除。以DMF清洗後，再使用Prelude(商標)胜肽合成機，以Fmoc法之胜肽固相合成法合成受保護之下述式(55)所示，為鍵結在樹脂狀態之多肽(序列編號22)。縮合反應，係使用縮合劑HCTU並於DMF中進行。
Fmoc保護基，係於DMF中經20%之哌啶處理去除。以DMF及二氯甲烷清洗之後，再加入乙酸酐及吡啶並振盪1小時。在以DMF及二氯甲烷清洗之後，加入TFA：水：三異丙基矽烷：乙烷二硫醇(=90：2.5：5：2.5)，並於室溫振盪4小時。之後過濾去除樹脂，再於濾液中加入冷卻之二乙基醚，即可得到粗胜肽沉澱。該粗胜肽之部分再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=88：12→78：22%，11分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(56)所示之多肽(序列編號23)(32.7mg)。
Ac-Cys-Arg-Ala-Thr-Ala-Arg-Ala-Glu-Ala-Arg-Ala-Thr-Ala-Arg-Ala-Glu-Ala-NH2式(56)
(合成例27-2)硫醇之糖鏈修飾反應
先將合成例27-1中合成之多肽(序列編號23)(7.3mg，4.02μmol)、合成例8中合成之無唾液酸-BrAc(17.7mg，16.5μmol，相對於胜肽1為1.5當量)溶於含33μM之TCEP及8M胍鹽酸鹽之0.2M磷酸緩衝液(pH7.3，1.3mL)中，並於室溫反應3小時。
該反應溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10% 水/90%乙腈，梯度A：B=95：5→29：71，11分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(57)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號24)(4.6mg，1.32μmol，產率33%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C123H211N35O60S：〔M+3H〕3+ 1166.5,〔M+4H〕4+ 875.1，實測值1166.2,875.1。
(合成例28)C(DiGlcNAc)-(RATARAEA)2之合成
先將合成例27-1中合成之多肽(序列編號23)(20.0mg，11.0μmol)、合成例7中合成之二唾液酸-BrAc(23.7mg，16.5μmol，相對於胜肽1為1.5當量)溶於DMSO(0.9mL)中。之後於溶液中加入DIPEA(5.8μL)並於室溫反應15分。
之後於該反應溶液中加入蒸餾水(4.0mL)，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→29：71，11分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(58)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號25)(23.9mg，7.53μmol，產率68%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C123H211N35O60S：〔M+3H〕3+ 1058.4,〔M+4H〕4+ 794.0，實測值1057.8,793.9。
(合成例29)RAC(無唾液酸)-A-(RADA)3之合成
(合成例29-1)Ac-RACA-(RADA)3-NH2之合成
先於固相合成用管柱中填充Rink amide PEGA樹脂(100μmol)，以DMF及二氯甲烷清洗後，再加入Fmoc-Ala-OH(124.5mg，400μmol)、HCTU(157.2mg，380μmol)及DIPEA(104.5μL，600μmol)之DMF(2.5mL)溶液，並振盪15分。在以二氯甲烷及DMF清洗後，其Fmoc保護基，再於DMF中經20%之哌啶處理去除。以DMF清洗後，再使用Prelude(商標)胜肽合成機，藉由Fmoc法以胜肽固相合成法合成受保護之下述式(59)所示，為鍵結在樹脂狀態之多肽(序列編號26)。縮合反應，係使用縮合劑HCTU並於DMF中進行。
Fmoc保護基，係於DMF中經20%之哌啶處 理去除。以DMF及二氯甲烷清洗之後，再加入乙酸酐及吡啶並振盪1小時。在以DMF及二氯甲烷清洗之後，加入TFA：水：三異丙基矽烷：乙烷二硫醇(=90：2.5：5：2.5)，並於室溫振盪4小時。之後過濾去除樹脂，再於濾液中加入冷卻之二乙基醚，即可得到粗胜肽沉澱。該粗胜肽之部分再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=88：12→78：22%，11分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(60)所示之多肽(序列編號27)(32.7mg)。
Ac-Arg-Ala-Cys-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-NH2式(60)
(合成例29-2)硫醇之糖鏈修飾反應
先將合成例29-1中合成之多肽(序列編號27)(14.1mg，8.29μmol)及合成例8中合成之無唾液酸-BrAc(36.0mg，20.7μmol，相對於胜肽1為2.5當量)溶於含33μM之TCEP及8M胍鹽酸鹽之0.2M磷酸緩衝液(pH7.3，2.6mL)中，並於室溫反應1小時。
該反應溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=95：5→29：71，11分直線濃度 梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(61)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號28)(13.4mg，3.96μmol，產率48%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C129H218N34O69S：〔M+2H〕2+ 1691.7,〔M+3H〕3+ 1128.1，實測值1691.8,1128.2。
(合成例30)RAC(DiGlcNAc)-A-(RADA)3之合成
先將合成例29-1中合成之多肽(序列編號27)(10.1mg，5.94μmol)、合成例7中合成之二唾液酸-BrAc(21.3mg，14.8μmol，相對於胜肽1為2.5當量)溶於含33μM之TCEP及8M胍鹽酸鹽之0.2M磷酸緩衝液(pH7.3，2.0mL)中，並於室溫反應4小時。
該反應溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25，15分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(62)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號29)(11.9mg，3.89μmol，產率66%)。
式(62)
ESI-MS：(m/z)計算值C117H198N34O59S：〔M+2H〕2+ 1529.5,〔M+3H〕3+ 1020.0,〔M+4H〕4+ 765.3，實測值1529.2,1019.8,765.1。
(合成例31)RC(無唾液酸)-DA-(RADA)3之合成
(合成例31-1)Ac-RCDA-(RADA)3-NH2之合成
先於固相合成用管柱中填充Rink amide PEGA樹脂(100μmol)，以DMF及二氯甲烷清洗後，再加入Fmoc-Ala-OH(124.5mg，400μmol)、HCTU(157.2mg，380μmol)及DIPEA(104.5μL，600μmol)之DMF(2.5mL)溶液，並振盪15分。在以二氯甲烷及DMF清洗後，其Fmoc保護基，再於DMF中經20%之哌啶處理去除。以DMF清洗後，再使用Prelude(商標)胜肽合成機，藉由Fmoc法以胜肽固相合成法合成受保護之下述式(63)所示，為鍵結在樹脂狀態之多肽(序列編號30)。縮合反應，係使用縮合劑HCTU並於DMF中進行。
Fmoc保護基，係於DMF中經20%之哌啶處理去除。以DMF及二氯甲烷清洗之後，再加入乙酸酐及吡 啶並振盪1小時。在以DMF及二氯甲烷清洗之後，加入TFA：水：三異丙基矽烷：乙烷二硫醇(=90：2.5：5：2.5)，並於室溫振盪4小時。之後過濾去除樹脂，再於濾液中加入冷卻之二乙基醚，即可得到粗胜肽沉澱。該粗胜肽之部分再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=88：12→78：22%，11分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(64)所示之多肽(序列編號31)(32.7mg)。
Ac-Arg-Cys-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-NH2式(64)
(合成例31-2)硫醇之糖鏈修飾反應
先將合成例31-1中合成之多肽(序列編號31)(14.8mg，8.48μmol)、合成例8中合成之無唾液酸-BrAc(37.4mg，21.2μmol，相對於胜肽1為2.5當量)溶於含33μM之TCEP及8M胍鹽酸鹽之0.2M磷酸緩衝液(pH7.3，2.8mL)中，並於室溫反應2小時。
該反應溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=95：5→29：71，11分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(65)所示之糖鏈- 多肽複合物(序列編號32)(21.7mg，6.34μmol，產率75%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C130H218N34O71S：〔M+2H〕2+ 1713.7,〔M+3H〕3+ 1142.8,〔M+4H〕4+ 857.3，實測值1713.7,1142.5,857.1。
(合成例32)RC(DiGlcNAc)-DA-(RADA)3之合成
先將合成例31-1中合成之多肽(序列編號31)(11.0mg，6.30μmol)、及合成例9中合成之DiGlcNAc-BrAc(22.6mg，15.7μmol，相對於胜肽1為2.5當量)溶於含33μM之TCEP及8M胍鹽酸鹽之0.2M磷酸緩衝液(pH7.3，2.1mL)中，並於室溫反應3小時。
該反應溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25，15分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(66)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號33)(19.0mg，6.12μmol，產率97%)。
式(66)
ESI-MS：(m/z)計算值C118H198N34O61S：〔M+2H〕2+ 1551.6,〔M+3H〕3+ 1034.7,〔M+4H〕4+ 776.3，實測值1551.2,1034.5,776.1。
(合成例33)C(無唾液酸)-ADA-(RADA)3之合成
(合成例33-1)Ac-CADA-(RADA)3-NH2之合成
先於固相合成用管柱中填充Rink amide PEGA樹脂(100μmol)，以DMF及二氯甲烷清洗後，再加入Fmoc-Ala-OH(124.5mg，400μmol)、HCTU(157.2mg，380μmol)及DIPEA(104.5μL，600μmol)之DMF(2.5mL)溶液，並振盪15分。在以二氯甲烷及DMF清洗後，其Fmoc保護基，再於DMF中經20%之哌啶處理去除。以DMF清洗後，再使用Prelude(商標)胜肽合成機，藉由Fmoc法以胜肽固相合成法合成受保護之下述式(67)所示，為鍵結在樹脂狀態之多肽(序列編號34)。縮合反應，係使用縮合劑HCTU並於DMF中進行。
Fmoc保護基，係於DMF中經20%之哌啶處理去除。以DMF及二氯甲烷清洗之後，再加入乙酸酐及吡 啶並振盪1小時。在以DMF及二氯甲烷清洗之後，加入TFA：水：三異丙基矽烷：乙烷二硫醇(=90：2.5：5：2.5)，並於室溫振盪4小時。之後過濾去除樹脂，再於濾液中加入冷卻之二乙基醚，即可得到粗胜肽沉澱。該粗胜肽之部分再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=88：12→78：22%，11分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(68)所示之多肽(序列編號35)(32.7mg)。
Ac-Cys-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-NH2式(68)
(合成例33-2)硫醇之糖鏈修飾反應
先將合成例33-1中合成之多肽(序列編號35)(13.0mg，7.83μmol)、及合成例8中合成之無唾液酸-BrAc(34.5mg，19.6μmol，相對於胜肽1為2.5當量)溶於含33μM之TCEP及8M胍鹽酸鹽之0.2M磷酸緩衝液(pH7.3，2.6mL)中，並於室溫反應2小時。
該反應溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=95：5→29：71，11分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(69)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號36)(15.2mg，4.55μmol，產率58%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C127H211N31O71S：〔M+2H〕2+ 1671.1,〔M+3H〕3+ 1114.4,〔M+4H〕4+ 836.1，實測值1671.2,1114.1,835.8。
(合成例34)C(DiGlcNAc)-ADA-(RADA)3之合成
先將合成例33-1中合成之多肽(9.9mg，5.96μmol)、及合成例9中合成之DiGlcNAc-BrAc(21.4mg，15.7μmol，相對於胜肽1為2.5當量)溶於含33μM之TCEP及8M胍鹽酸鹽之0.2M磷酸緩衝液(pH7.3，2.1mL)中，並於室溫反應4小時。
該反應溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25，15分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(70)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號37)(10.9mg，3.61μmol，產率61%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C115H191N31O61S：〔M+2H〕2+ 1509.0,〔M+3H〕3+ 1006.3,〔M+4H〕4+ 755.0，實測值1508.7,1006.1,754.9。
(合成例35)2C(麥芽糖)-(RADA)4之合成
(合成例35-1)Ac-2C-(RADA)4-NH2之合成
先於固相合成用管柱中填充Rink amide PEGA樹脂(100μmol)，以DMF及二氯甲烷清洗後，再加入Fmoc-Ala-OH(124.5mg，400μmol)、HCTU(157.2mg，380μmol)及DIPEA(104.5μL，600μmol)之DMF(2.5mL)溶液，並振盪15分。在以二氯甲烷及DMF清洗後，其Fmoc保護基，再於DMF中經20%之哌啶處理去除。以DMF清洗後，再使用Prelude(商標)胜肽合成機，藉由Fmoc法以胜肽固相合成法合成受保護之下述式(71)所示，為鍵結在樹脂狀態之多肽(序列編號38)。縮合反應，係使用縮合劑HCTU並於DMF中進行。
Fmoc保護基，係於DMF中經20%之哌啶處理去除。以DMF及二氯甲烷清洗之後，再加入乙酸酐及吡啶並振盪1小時。在以DMF及二氯甲烷清洗之後，加入 TFA：水：三異丙基矽烷：乙烷二硫醇(=90：2.5：5：2.5)，並於室溫振盪4小時。之後過濾去除樹脂，再於濾液中加入冷卻之二乙基醚，即可得到粗胜肽沉澱。該粗胜肽之部分再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25%，11分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(72)所示之多肽(序列編號39)。
Ac-Cys-Cys-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-NH2式(72)
(合成例35-2)硫醇之糖鏈修飾反應
先將合成例35-1中合成之多肽(序列編號39)(9.8mg，5.11μmol)、及合成例2中合成之麥芽糖-BrAc(11.8mg，54.6μmol，相對於胜肽1為5.0當量)溶於含33μM之TCEP及8M胍鹽酸鹽之0.2M磷酸緩衝液(pH7.3，1.7mL)中，並於室溫反應1.5小時。
該反應溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25，15分直線濃度梯度溶出〕梯度A：B=95：5→29：71，11分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(73)所示之糖鏈- 多肽複合物(序列編號40)(9.2mg，3.43μmol，產率67%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C100H169N33O49S2：〔M+2H〕2+ 1341.9,〔M+3H〕3+ 894.9,〔M+4H〕4+ 671.4，實測值1341.6,894.7,671.3。
(合成例36)2C(麥芽三糖)-(RADA)4之合成
先將合成例35-1中合成之多肽(序列編號39)(17.5mg，9.12μmol)、及合成例3中合成之麥芽三糖-BrAc(34.1mg，54.6μmol，相對於胜肽1為6.0當量)溶於含33μM之TCEP及8M胍鹽酸鹽之0.2M磷酸緩衝液(pH7.3，3.1mL)中，並於室溫反應1.5小時。
該反應溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25，15分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(74)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號41)(19.6mg，3.61μmol，產率72%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C112H189N33O59S2：〔M+2H〕2+ 1504.0,〔M+3H〕3+ 1003.0,〔M+4H〕4+ 752.5，實測值1503.7,1002.7,752.3。
(合成例37)2C(麥芽四糖)-(RADA)4之合成
先將合成例35-1中合成之多肽(序列編號39)(9.8mg，5.11μmol)、合成例4中合成之麥芽四糖-BrAc(20.1mg，25.5μmol，相對於胜肽1為5.0當量)溶於含33μM之TCEP及8M胍鹽酸鹽之0.2M磷酸緩衝液(pH7.3，1.7mL)中，並於室溫反應2小時。
該反應溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25，15分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(75)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號42)(10.6mg，3.18μmol，產率62%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C124H209N33O69S2：〔M+2H〕2+ 1666.2,〔M+3H〕3+ 1111.1,〔M+4H〕4+ 833.6，實測值1666.2,1110.8,833.3。
(合成例38)3C(麥芽糖)-(RADA)4之合成
(合成例38-1)Ac-3C-(RADA)4-NH2之合成
先於固相合成用管柱中填充Rink amide PEGA樹脂(100μmol)，以DMF及二氯甲烷清洗後，再加入Fmoc-Ala-OH(124.5mg，400μmol)、HCTU(157.2mg，380μmol)及DIPEA(104.5μL，600μmol)之DMF(2.5mL)溶液，並振盪15分。在以二氯甲烷及DMF清洗後，其Fmoc保護基，再於DMF中經20%之哌啶處理去除。以DMF清洗後，再使用Prelude(商標)胜肽合成機，藉由Fmoc法以胜肽固相合成法合成受保護之下述式(76)所示，為鍵結在樹脂狀態之多肽(序列編號43)。縮合反應，係使用縮合劑HCTU並於DMF中進行。
式(76)
Fmoc保護基，係於DMF中經20%之哌啶處理去除。以DMF及二氯甲烷清洗之後，再加入乙酸酐及吡啶並振盪1小時。在以DMF及二氯甲烷清洗之後，加入TFA：水：三異丙基矽烷：乙烷二硫醇(=90：2.5：5：2.5)，並於室溫振盪4小時。之後過濾去除樹脂，再於濾液中加入冷卻之二乙基醚，即可得到粗胜肽沉澱。該粗胜肽之部分再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25%，11分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(77)所示之多肽(序列編號44)。
Ac-Cys-Cys-Cys-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-NH2式(77)
(合成例38-2)硫醇之糖鏈修飾反應
先將合成例38-1中合成之多肽(序列編號44)(15.0mg，7.42μmol)、及合成例2中合成之麥芽糖-BrAc(20.6mg，44.6μmol，相對於胜肽1為6.0當量)溶於含33μM之TCEP及8M胍鹽酸鹽之0.2M磷酸緩衝液(pH7.3，2.4mL)中，並於室溫反應3小時。
該反應溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速： 7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25，15分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(78)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號45)(16.1mg，5.09μmol，產率69%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C117H197N35O61S3：〔M+2H〕2+ 1584.1,〔M+3H〕3+ 1056.4,〔M+4H〕4+ 792.6，實測值1583.7,1056.1,792.4。
(合成例39)(RADA)2-C(麥芽糖)-(ARDA)2之合成
(合成例39-1)Ac-(RADA)2-C-(ARDA)2-NH2之合成
先於固相合成用管柱中填充Rink amide PEGA樹脂(100μmol)，以DMF及二氯甲烷清洗後，再加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH(164.6mg，400μmol)、HCTU(157.2mg，380μmol)及DIPEA(104.5μL，600μmol)之DMF(2.5mL)溶液，並振盪15分。在以二氯甲烷及DMF清洗後，其Fmoc保護基，再於DMF中經20%之哌啶處理去除。以DMF清洗後，再使用Prelude(商標)胜肽合成機，藉由Fmoc法以胜肽固相合成法合成受保護之下述式(79)所示，為鍵結在樹脂狀態之多肽(序列編號46)。縮合反應，係使用 縮合劑HCTU並於DMF中進行。
Fmoc保護基，係於DMF中經20%之哌啶處理去除。以DMF及二氯甲烷清洗之後，再加入乙酸酐及吡啶並振盪1小時。在以DMF及二氯甲烷清洗之後，加入TFA：水：三異丙基矽烷：乙烷二硫醇(=90：2.5：5：2.5)，並於室溫振盪4小時。之後過濾去除樹脂，再於濾液中加入冷卻之二乙基醚，即可得到粗胜肽沉澱。該粗胜肽之部分再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25%，15分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(80)所示之多肽(序列編號47)。
Ac-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Cys-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-NH2式(80)
(合成例39-2)硫醇之糖鏈修飾反應
先將合成例39-1中合成之多肽(序列編號47)(15.4mg，8.48μmol)、及合成例2中合成之麥芽糖-BrAc(9.8mg，21.2μmol，相對於胜肽1為2.5當量)溶於含33μM之TCEP及8M胍鹽酸鹽之0.2M磷酸緩衝液(pH7.3， 2.9mL)中，並於室溫反應3小時。
該反應溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25，15分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(81)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號48)(17.8mg，8.10μmol，產率96%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C83H141N31O37S：〔M+2H〕2+ 1099.6,〔M+3H〕3+ 733.4,〔M+4H〕4+ 550.3，實測值1099.5,733.0,550.2。
(合成例40)(RADA)2-C(麥芽三糖)-(ARAD)2之合成
先將合成例39-1中合成之多肽(序列編號47)(14.8mg，8.15μmol)、及合成例3中合成之麥芽三糖-BrAc(12.7mg，20.3μmol，相對於胜肽1為2.5當量)溶於含33μM之TCEP及8M胍鹽酸鹽之0.2M磷酸緩衝液(pH7.3，2.8mL)中，並於室溫反應3小時。
該反應溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速： 7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25，15分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(82)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號49)(13.8mg，5.85μmol，產率72%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C89H151N31O42S：〔M+2H〕2+ 1180.2,〔M+3H〕3+ 787.1,〔M+4H〕4+ 590.6，實測值1180.5,787.0,590.8。
(合成例41)(RADA)2-C(麥芽四糖)-(ARAD)2之合成
先將合成例39-1中合成之多肽(序列編號47)(14.0mg，7.71μmol)、合成例4中合成之麥芽四糖-BrAc(15.2mg，20.3μmol，相對於胜肽1為2.5當量)溶於含33μM之TCEP及8M胍鹽酸鹽之0.2M磷酸緩衝液(pH7.3，2.6mL)中，並於室溫反應2.5小時。
該反應溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25，15分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(83)所示之糖鏈- 多肽複合物(序列編號50)(14.9mg，5.91μmol，產率77%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C95H161N31O47S：〔M+2H〕2+ 1261.8,〔M+3H〕3+ 841.5,〔M+4H〕4+ 631.4，實測值1261.6,841.4,631.3。
(合成例42)C(麥芽糖)-(RADA)4-C(麥芽糖)之合成
(合成例42-1)Ac-C-(RADA)4-C-NH2之合成
先於固相合成用管柱中填充Rink amide PEGA樹脂(100μmol)，以DMF及二氯甲烷清洗後，再加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(124.5mg，400μmol)、HCTU(157.2mg，380μmol)及2,4,6-三甲基吡啶(79.3μL，600μmol)之DMF(2.5mL)溶液，並振盪1小時。在以二氯甲烷及DMF清洗後，其Fmoc保護基，再於DMF中經20%之哌啶處理去除。以DMF清洗後，再使用Prelude(商標)胜肽合成機，藉由Fmoc法以胜肽固相合成法合成受保護之下述式(84)所示，為鍵結在樹脂狀態之多肽(序列編號51)。縮合反應，係使用縮合劑HCTU並於DMF中進行。
式(84)
Fmoc保護基，係於DMF中經20%之哌啶處理去除。以DMF及二氯甲烷清洗之後，再加入乙酸酐及吡啶並振盪1小時。在以DMF及二氯甲烷清洗之後，加入TFA：水：三異丙基矽烷：乙烷二硫醇(=90：2.5：5：2.5)，並於室溫振盪4小時。之後過濾去除樹脂，再於濾液中加入冷卻之二乙基醚，即可得到粗胜肽沉澱。該粗胜肽之部分再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25%，15分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(85)所示之多肽(序列編號52)。
Ac-Cys-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Cys-NH2式(85)
(合成例42-2)硫醇之糖鏈修飾反應
先將以合成例42-1中合成之多肽(序列編號52)(14.7mg，7.66μmol)、及合成例2中合成之麥芽糖-BrAc(17.7mg，38.3μmol，相對於胜肽1為5當量)溶於含33μM之TCEP及含8M胍鹽酸鹽之鹽酸鹽的0.2M磷酸緩衝液(pH7.3，2.6mL)中，並於室溫反應2小時。
該反應溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速： 7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25，15分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(86)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號53)(6.5mg，2.42μmol，產率32%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C100H169N33O49S2：〔M+2H〕2+ 1341.9,〔M+3H〕3+ 894.9,〔M+4H〕4+ 671.4，實測值1341.5,894.7,671.3。
(合成例43)C(麥芽三糖)-(RADA)4-C(麥芽三糖)之合成
先將合成例42-1中合成之多肽(序列編號52)(13.9mg，7.24μmol)、及合成例3中合成之麥芽三糖-BrAc(22.6mg，36.2μmol，相對於胜肽1為5當量)溶於含33μM之TCEP及含8M胍鹽酸鹽之鹽酸鹽的0.2M磷酸緩衝液(pH7.3，2.5mL)中，並於室溫反應2小時。
該反應溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25，15分直線濃 度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(87)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號54)(9.6mg，3.19μmol，產率44%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C112H189N33O59S2：〔M+2H〕2+ 1504.1,〔M+3H〕3+ 1003.0,〔M+4H〕4+ 752.5，實測值1503.8,1002.8,752.4。
(合成例44)Ac-(RADA)4-C(DiGlcNAc)之合成
(合成例44-1)Ac-(RADA)4-C-NH2之合成
先於固相合成用管柱中填充Rink amide PEGA樹脂(100μmol)，以DMF及二氯甲烷清洗後，再加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(124.5mg，400μmol)、HCTU(157.2mg，380μmol)及2,4,6-三甲基吡啶(79.3μL，600μmol)之DMF(2.5mL)溶液，並振盪1小時。在以二氯甲烷及DMF清洗後，其Fmoc保護基，再於DMF中經20%之哌啶處理去除。以DMF清洗後，再使用Prelude(商標)胜肽合成機，藉由Fmoc法以胜肽固相合成法合成受保護之下述式(88)所示，為鍵結在樹脂狀態之多肽(序列編號55)。縮合反應，係使用縮合劑HCTU並於DMF中進行。
Fmoc保護基，係於DMF中經20%之哌啶處理去除。以DMF及二氯甲烷清洗之後，再加入乙酸酐及吡啶並振盪1小時。在以DMF及二氯甲烷清洗之後，加入TFA：水：三異丙基矽烷：乙烷二硫醇(=90：2.5：5：2.5)，並於室溫振盪4小時。之後過濾去除樹脂，再於濾液中加入冷卻之二乙基醚，即可得到粗胜肽沉澱。該粗胜肽之部分再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25%，15分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(89)所示之多肽(序列編號56)。
Ac-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Cys-NH2式(89)
(合成例44-2)硫醇之糖鏈修飾反應
先將合成例44-1中合成之多肽(序列編號56)(15.1mg，8.31μmol)、及合成例9中合成之DiGlcNAc-BrAc(29.8mg，20.8μmol，相對於胜肽1為2.5當量)溶於含33μM之TCEP及8M胍鹽酸鹽之0.2M磷酸緩衝液(pH7.3，2.8mL)中，並於室溫反應3小時。
該反應溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25，15分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(90)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號57)(15.8mg，5.01μmol，產率60%)。
ESI-MS：(m/z)計算值C121H203N35O62S：〔M+2H〕2+ 1587.1,〔M+3H〕3+ 1058.4,〔M+4H〕4+ 794.0，實測值1586.7,1058.1,793.8。
(合成例45)Ac-N(無唾液酸)-(RADA)4之合成
(合成例45-1)Fmoc-(RADA)4-Resin之合成
先於固相合成用管柱中填充Rink amide PEGA樹脂(100μmol)，以DMF及二氯甲烷清洗後，再加入Fmoc-Ala-OH(124.5mg，400μmol)、HCTU(157.2mg，380μmol)及DIPEA(104.5μL，600μmol)之DMF(2.5mL)溶液，並振盪15分。在以二氯甲烷及DMF清洗後，其Fmoc保護基，再於DMF中經20%之哌啶處理去除。以DMF清洗後，再使用Prelude(商標)胜肽合成機，藉由Fmoc法 以胜肽固相合成法合成受保護之下述式(91)所示，為鍵結在樹脂狀態之多肽(序列編號58)。縮合反應，係使用縮合劑HCTU並於DMF中進行。
(合成例45-2)樹脂上之糖鏈縮合反應
將合成例45-1中所合成為鍵結在樹脂狀態的多肽(10μmol)之Fmoc保護基，於DMF中以20%之哌啶處理去除。在以DMF及二氯甲烷清洗之後，再依序加入下述式(92)所示之Fmoc-Asn(無唾液酸)-OH(29.8mg，15μmol)、DMF-DMSO(1/1，v/v，433μL)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TBTU)(6.4mg，30μmol)、及DIPEA(5.2μL，30μmol)，並振盪一夜。在以DMF及二氯甲烷清洗之後，其Fmoc保護基，再於DMF中經20%之哌啶處理去除。以DMF及二氯甲烷清洗後，再加入乙酸(2.86μL，50μmol)、1-羥基苯并三唑(HOBt)(6.8mg，50μmol)、及N,N′-二異丙基碳二亞胺(DIC)(7.3μL，50μmol)之DMF(500μL)溶液，並振盪1小時。
在以DMF及二氯甲烷清洗之後，加入TFA：水：三異丙基矽烷(=95：2.5：2.5)，並於室溫振盪4小時。之後過濾去除樹脂，再於濾液中加入冷卻之二乙基醚，即可得到粗胜肽沉澱。該粗胜肽之部分再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25%，15分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(93)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號59)(5.5mg)。
ESI-MS：(m/z)計算值C132H221N35O72：〔M+2H〕2+ 1726.2,〔M+3H〕3+ 1151.1,〔M+4H〕4+ 863.6，實測值1726.0,1150.8,863.4。
(合成例46)Ac-N(DiGlcNAc)(RADA)4之合成
將合成例45-1中所合成為鍵結在樹脂狀態的多肽(32.1μmol)之Fmoc保護基，於DMF中以20%之哌啶處理去除。在以DMF及二氯甲烷清洗之後，再依序加入下述式(94)所示之Fmoc-Asn(DiGlcNAc)-OH(79.5mg，15μmol)、DMSO-DMF(1/1，v/v，2.5mL)、TBTU(20.6mg，96.3μmol)、及DIPEA(17.2μL，96.3μmol)，並振盪2小時。在以DMF及二氯甲烷清洗之後，其Fmoc保護基，再於DMF中經20%之哌啶處理去除。以DMF及二氯甲烷清洗後，再加入乙酸(9.2μL，160.5μmol)、HOBt(21.6mg，160.5μmol)及DIC(25.1μL，160.5μmol)之DMF(2mL)溶液並振盪1小時。
在以DMF及二氯甲烷清洗之後，加入TFA：水：三異丙基矽烷(=95：2.5：2.5)，並於室溫振盪4小時。 之後過濾去除樹脂，再於濾液中加入冷卻之二乙基醚，即可得到粗胜肽沉澱。該粗胜肽之部分再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，20×250mm；流速：7.0mL/分，沖提溶劑A：0.1%TFA水，B：0.09%TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25%，15分直線濃度梯度溶出〕精製，即可獲得如下述式(95)所示之糖鏈-多肽複合物(序列編號60)(31.2mg)。
ESI-MS：(m/z)計算值C120H201N35O62：〔M+2H〕2+ 1564.1,〔M+3H〕3+ 1043.0,〔M+4H〕4+ 782.5，實測值1563.7,1043.8,782.3。
(實施例1)以鋼球載重試驗評量水凝膠特性-1
係以10mg之糖鏈-多肽複合物、或對照之10mg多肽溶於500μL之超純水中，調配成2重量%之多肽溶液。再將該溶液及同量之各種緩衝液添加於竇漢氏管(6×30mm，Maruemu公司製造)內，以渦流攪拌機(Vortex)激烈攪拌，製作成胜肽濃度1重量%之水凝膠。其中，緩衝液方面，係使用檸檬酸-磷酸緩衝液(pH2.0及3.5)、磷酸緩衝液(pH7.4)、磷酸-氫氧化鈉緩衝液(pH11.5)。之後以竇 漢氏管內水凝膠之表面為水平，於室溫條件下靜置20分之後，再以鋼球(直徑1.56mm，重量16mg，舟邊精工公司製造)負載於水凝膠上。經過10分之後，以目視觀察鋼球之位置。
之後對竇漢氏管內鋼球之位置以3等級評量，以鋼球停留在水凝膠表面附近之狀態為○，負載後沉降停留在內部之狀態為△，而沉降至竇漢氏管下方之狀態為×。同時，在水凝膠不均一而可觀察到混濁及不溶物(沉澱物)之情形以※附註。鋼球停留在表面附近(○)、未見混濁及不溶物(無※)之水凝膠，應該為具有透明性、且均一之凝膠。所得之圖像如第1圖，評量結果如表1所示。
同時，表1中，所謂「糖殘基數」，表示鍵結於糖鏈-多肽複合物所存在之糖鏈的糖殘基數之合計。此外，表中所示化合物之編號，係為便於說明而附記者，未必與製造例之編號一致。
如第1圖及表1所示，C(DiGlcNAc)-(RADA)4在全pH範圍(pH2.0至pH11.5)均可形成透明均一之水凝 膠，且可保持鋼球在水凝膠表面附近。另一方面，(RADA)4在pH2.0可形成透明均一之水凝膠，且亦可保持鋼球在水凝膠表面附近，但在pH3.5以上時則伴隨混濁形成不均一之水凝膠，同時鋼球亦前進至水凝膠內部，或沉降至竇漢氏管之底部。
由以上可知，C(DiGlcNAc)-(RADA)4在中性之pH，可在維持水凝膠強度之下，形成透明均一之水凝膠。
(實施例2)以鋼球載重試驗評量水凝膠特性-2
以如實施例1相同之方法，使用C(二唾液酸)-(RADA)4、C(無唾液酸)-(RADA)4C(二唾液酸)-(RADA)5、C(DiGlcNAc)-(RADA)5、及(RADA)4實施鋼球載重試驗。所得之評量結果如表2所示。
如表2所示，在(RADA)4末端經較大糖鏈修飾者，可在維持水凝膠強度之下，在中性之pH形成透明均一之水凝膠。推想此係以水溶性高，而體積大之糖鏈修飾多肽，因此抑制胜肽鏈間過度集合，同時亦改善集合體之水溶性，或者因兩方所作用之結果。
由以上可知，即使(RADA)4或(RADA)5經各種糖鏈所修飾之糖鏈-多肽複合物，亦可在維持水凝膠強度之下，在中性pH形成透明均一之水凝膠。
(實施例3)以鋼球載重試驗評量水凝膠特性-3
以如實施例1相同之方法，以1重量%、0.5重量%及0.25重量%之水凝膠濃度實施C(DiGlcNAc)-(RADA)4之鋼球載重試驗。其所得之評量結果如表3所示。
如表3所示，C(DiGlcNAc)-(RADA)4，在pH7.4，即使在低濃度範圍亦可形成均一之水凝膠。同時，C(DiGlcNAc)-(RADA)4在水凝膠濃度降至0.25重量%時， 只在pH7.4形成均一之水凝膠。因此可知，C(DiGlcNAc)-(RADA)4，在水凝膠濃度為低濃度之情形時，可藉由pH控制水凝膠形成。
亦即，本發明之糖鏈-多肽複合物，在pH中性之水溶液中，即使在水凝膠濃度低之情形，亦可在維持水凝膠強度之下，形成透明均一之水凝膠。同時可知，本發明之糖鏈-多肽複合物，在水凝膠濃度為低濃度之情形，亦可藉由pH控制水凝膠形成。
(實施例4)以鋼球載重試驗評量水凝膠特性-4
除水凝膠改為濃度0.5重量%實施以外，以如實施例1相同之方法，使用C(DiGlcNAc)-(RADA)4、2C(麥芽糖)-(RADA)4、2C(麥芽三糖)-(RADA)4、C(麥芽糖)-(RADA)4-C(麥芽糖)、C(麥芽三糖)-(RADA)4-C(麥芽三糖)、3C(麥芽糖)-(RADA)4、(RADA)4-C((DiGlcNAc)、C(麥芽七糖)-(RADA)4、(RATARAEA)2、C(DiGlcNAc)-(RATARAEA)2實施鋼球載重試驗。所得之評量結果如表4所示。
如表4所示，糖鏈-多肽複合物鍵結之糖鏈中所存在之糖殘基合計為5以上之No.2、9、11、12、13、及 17，在pH3.5及pH7.4可形成透明均一之水凝膠。同時，在表中雖未記載，在(RADA)4之N末端鍵結C(DiBn-二唾液酸)(糖殘基數為11)之糖鏈-多肽複合物，在pH7.4亦可形成透明均一之水凝膠。另一方面，在糖鏈-多肽複合物鍵結之糖鏈中所存在之糖殘基合計為4以下之No.8及No.10，在pH7.4並不形成水凝膠。亦即可知，具有在水溶液中自行集合之性質的多肽，在鍵結糖殘基合計為5以上之糖鏈時，可使該糖鏈-多肽複合物在中性範圍下表現高水溶性，而形成透明均一之水凝膠。
同時亦可知，在糖鏈-多肽複合物中鍵結之糖鏈，不只在含單獨分支的糖鏈(如No.2及No.13的二-N-乙醯葡萄糖胺糖鏈、表2所示之二唾液酸糖鏈及無唾液酸糖鏈)，即使在直鏈之糖鏈(如麥芽糖糖鏈及麥芽三糖糖鏈)，如No.9、No.11、No.12，由於1個多肽鍵結2股以上，使糖鏈-多肽複合物在整體上，為糖鏈具有分支之狀態，則在pH3.5及pH7.4，亦可形成透明均一之水凝膠。
為提高多肽之水溶性，已知可以在多肽鍵結PEG的方法操作，在(RADA)4及(RADA)5鍵結PEG2000之情形(No.14、及No.15)，雖然在pH3.5及pH7.4並未觀察到不溶物，但並不形成均一之水凝膠。亦即可知，本發明之糖鏈-多肽複合物，與PEG-多肽複合物比較，顯示更高之水溶性，可形成更透明均一之水凝膠。
同時，在No.11中糖鏈係鍵結在多肽之N末端部分及C末端部分，在No.13中糖鏈係鍵結在多肽之C 末端部分，但在pH3.5及pH7.4均顯示高水溶性，而可形成透明均一之水凝膠。亦即可知，本發明之糖鏈-多肽複合物中，糖鏈之鍵結部位不只可在多肽之N末端部分，亦可在C末端部分、或兩末端部分。
同時，與(RADA)4及(RADA)5相同，已知(RATARAEA)2亦為可形成水凝膠之多肽。因此再對(RATARAEA)2與糖鏈鍵結之情況，是否可提高凝膠之形成能力，以鋼球載重試驗加以評量。如表4所示，其(RATARAEA)2中未鍵結糖鏈之No.16，在pH3.5及pH7.4可形成不均一而混濁之水凝膠，鋼球亦沉降至竇漢氏管底部。另一方面，在(RATARAEA)2之N末端部分鍵結C(DiGlcNAc)之糖鏈-多肽複合物的No.17，在pH3.5及pH7.4可形成透明均一之水凝膠。同時，在表中雖未記載，在(RATARAEA)2之N末端部分鍵結C(無唾液酸)之糖鏈-多肽複合物亦同樣，在pH7.4可形成透明均一之水凝膠。亦即可知，在含(RATARAEA)2之多肽鍵結糖鏈時，可顯示更高之水溶性，且可形成更透明均一之水凝膠。
以上之結果顯示，不限於(RADA)4，即使對各種序列之多肽，在鍵結糖鏈時，在包含中性範圍的廣域pH均可形成透明均一之凝膠而可製造糖鏈-多肽複合物。
(實施例5)以鋼球載重試驗評量水凝膠特性-5
以如實施例1相同之方法，使用N(無唾液酸)-(RADA)4、N(DiGlcNAc)-(RADA)4及 C(DiGlcNAc)-(RADA)4實施鋼球載重試驗。所得之評量結果如表5所示。
如表5所示，天冬醯胺酸鍵結型糖鏈-多肽複合物之No.18、19亦與半胱胺酸鍵結型糖鏈-多肽複合物之No.2相同，在pH3.5及pH7.4均可形成透明均一之水凝膠。亦即可知，即使鍵結糖鏈之胺基酸為半胱胺酸之外，本發明之糖鏈-多肽複合物亦可形成透明均一之水凝膠。
(實施例6)作為止血基材之利用法的檢討
為檢討含本發明糖鏈-多肽複合物之水凝膠，是否可利用為止血材料，再以大鼠血漿進行評量試驗。
先以如實施例1相同之方法，調製多肽水溶液。再由7週大之Crlj：W1大鼠以肝素鈉注射筒(味之素公司製造)採取血液，再自離心處理後之上清液得到血漿。之後將多肽水溶液、血漿、及PBS加入竇漢氏管中，調配成血漿濃度5至50%、多肽濃度0.5重量%之水凝膠。之後，再於室 溫條件下靜置20分後，以如實施例1之方法同樣實施鋼球載重試驗。靜置20分後水凝膠之圖像如第2圖所示，評量結果如表6所示。
如第2圖及表6所示，含C(DiGlcNAc)-(RADA)4之多肽溶液，不拘血漿之濃度，均可形成均一之水凝膠。而且更為意外，C(DiGlcNAc)-(RADA)4，即使在血漿濃度50%之非常高濃度的狀態下，亦可形成均一之水凝膠。另一方面，含(RADA)4之多肽溶液，在全部之血漿濃度中，多肽溶液均為混濁，並可觀察到不溶物。同時，確定各水凝膠之pH，全部在pH6至8之間。亦即可知，本發明之糖鏈-多肽複合物，不只可在中性pH形成均一之水凝膠，即使在高濃度之血漿存在下，亦不易產生不溶物，而形成透明之水凝膠。
由以上之結果，顯示本發明之糖鏈-多肽複合物，作為止血用醫藥組成物，具有非常高之利用價值。
(實施例7)酸性蛋白質緩釋能力之檢討
為檢討含本發明糖鏈-多肽複合物之水凝膠，在中性pH是否可利用為緩釋載體，接著再進行試驗。
緩衝液係使用磷酸緩衝液(pH7.4)。同時，水凝膠中內包之酸性蛋白質，係使用經由Alexa Fluor(註冊商標)488螢光標識之Bovine Serum Albumin(BSA)(A13100，Life Technologies公司製造)。
再以緩衝液鹽濃度為0.15M、BSA濃度為5μM、或多肽濃度為0.25至1重量%之方式加入試管中，並以渦流攪拌機混合。該混合物再各以50μL添加於多孔培養池系統(Multiwell Insert System)(351130，BD)中，之後於37℃培養箱(細胞培養用CO2培養箱，MCO-18AIC，SANYO公司製造)中，在遮光下靜置一晚調製成BSA內包水凝膠。在37℃培養箱中，將培養池系統浸入各加入225μL與水凝膠相同緩衝液之96 well平底盤(353928，BD)中，之後以微盤振盪機(MICRO PLATE MIXER NS-P，AS ONE公司製造，旋轉數：1/5單位)振盪微盤開始試驗(0小時)。之後，經時以螢光微盤分析儀(SpectraMax M3，Molecular Devices公司製造)測定由平底盤側漏出之螢光量。之後以同一螢光標識BSA製作檢量曲線，由漏出螢光色素的量計算蛋白質之濃度。使用含(RADA)4之水凝膠、及C(DiGlcNAc)-(RADA)4之水凝膠的結果如第3圖所示。作為對照，使用緩衝液中僅添加BSA之溶液(W/O SAP)。第3圖中，Y軸表示平底盤中BSA之濃度，X軸表示自試驗 開始之時間。
如第3圖所示，內包在含(RADA)4之水凝膠中的BSA，在試驗開始後短時間內大部分即漏出。同時，漏出速度，在多肽為0.5重量%以下時，係與未含多肽溶液時之漏出速度相等，顯示不具有緩釋能力。另一方面，含C(DiGlcNAc)-(RADA)4之水凝膠，即使在0.25重量%之低濃度，與未含多肽之溶液相較，BSA之漏出速度緩慢，係具有緩釋能力。
亦即可知，本發明之糖鏈-多肽複合物，在中性pH中，具有內包、保持、緩釋酸性蛋白質之效果。
(實施例8)鹼性蛋白質緩釋能力之檢討
對內包之蛋白質除使用鹼性蛋白質Lysozyme以外，以如實施例7中記載之方法同樣，進行緩釋性試驗。Lysozyme，係使用Alexa Fluor(註冊商標)488 Protein Labeling Kit(A10235，Invitrogen公司製造)標識Alexa Fluor(註冊商標)488後使用。其結果如第4圖所示。
如第4圖所示，內包在含(RADA)4之水凝膠中的Lysozyme，在試驗開始後1小時以內即大部分漏出。而且，其漏出之速度，與不含多肽溶液時之漏出速度約為同等，顯示不具有緩釋能力。另一方面，含C(DiGlcNAc)-(RADA)4之水凝膠，即使在0.25重量%之低濃度中，與未含多肽之溶液的情形比較，Lysozyme之漏出速度緩慢，因此具有緩釋能力。
亦即可知，本發明之糖鏈-多肽複合物，在中性pH中，具有內包、保持、緩釋鹼性蛋白質之效果。
(實施例9)圓偏光二色性(CD)之測定及解析
為確定本發明之糖鏈-多肽複合物可形成β-褶板結構，再進行CD測定。一般言之，在物質具有β-褶板結構時觀察其波長，具有在197nm附近之正吸收及在216nm附近之負吸收的特徵。因此，本發明中即注意此等波長之大小，試驗pH對β-褶板結構之影響。
將本發明之一實施形態中的C(DiGlcNAc)-(RADA)4、或作為對照之(RADA)4均溶於超純水中。再對此類多肽之水溶液，各添加1至10mM之氫氧化鈉水溶液調整pH，製作成pH2或pH7之100mM多肽水溶液。之後將該水溶液移至光徑長度0.1cm之透明石英槽中。之後，對其CD光譜，以光譜旋光計(J-805，Jasco公司製造)，在波長185至260nm，測定楕圓形性(毫度(milli-degree))。平均殘基楕圓率(mean residue ellipticity)θ係以下式計算。
〔θ〕=(θ obs/10．l．c)/r
當中θ obs係以毫度測定之楕圓形性，l為石英槽長度(cm)，c為濃度(M)，而r表示胺基酸之殘基數。
(RADA)4結果之曲線圖如第5圖所示，C(DiGlcNAc)-(RADA)4結果之曲線圖如第6圖所示。
如第5圖及第6圖所示，在pH2顯示(RADA)4 及C(DiGlcNAc)-(RADA)4之莫耳楕圓率大。另一方面，在pH7顯示C(DiGlcNAc)-(RADA)4之莫耳楕圓率大，但(RADA)4為顯著低莫耳楕圓率。亦即，相對於(RADA)4在中性pH幾乎不形成β-褶板結構，C(DiGlcNAc)-(RADA)4即使在中性pH亦明顯形成β-褶板結構。
由上述之結果，推想應該係由於相對於C(DiGlcNAc)-(RADA)4存在著糖鏈，抑制多肽之間過度集合，而可維持β-褶板結構，(RADA)4在中性pH會促進過度集合而減少β-褶板所致。此結果，與(RADA)4在鋼球載重試驗中，在中性pH會發生混濁/沉澱，無法形成均一強靭之水凝膠的現象(如第1圖)亦為一致。
由以上之結果可確定，本發明之糖鏈-多肽複合物，在中性pH可形成β-褶板結構。
(實施例10)動黏度之測定及解析
為在鋼球載重試驗中所確定之水凝膠的強度之外，再觀察隨時間經過之水凝膠強度之變化及水凝膠之安定性，而進行動黏度之測定。
動黏度之測定中，係使用具有0.3mm高度差之直徑25mm不銹鋼平行板之檢流計(MCR302，Anton-Parr公司製造)。再以本發明之一實施形態中之C(DiGlcNAc)-(RADA)4、或作為對照之(RADA)4溶於超純水中。之後為調整此類多肽水溶液之pH，再添加5mM之氫氧化鈉水溶液，配成pH7之0.5重量%水凝膠。之後，將 此等水凝膠，快速移至設定為25度之檢流計，並偵測隨時間經過之相位角(tan δ)。(頻率數=1Hz，斜度=10%)
測定之結果如第7圖所示，如第7圖所示，含C(DiGlcNAc)-(RADA)4水凝膠之相位角，由測定開始即快速減少，顯示形成強靭之水凝膠。另一方面，含(RADA)4的水凝膠之相位角大，顯示係形成易崩壞之水凝膠，或不均一而只有部分強靭之水凝膠。
此結果，與(RADA)4在鋼球載重試驗中，在中性pH會發生混濁/沉澱，無法形成均一強靭之水凝膠的現象(如第1圖)亦為一致。
由以上之結果可確定，本發明之糖鏈-多肽複合物，在中性pH可形成強靭之水凝膠。
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<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<400> 2
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<400> 3
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
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<221> 結合
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<221> 結合
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<221> 結合
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<221> 結合
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<221> 結合
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<221> 結合
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<221> 結合
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<221> 結合
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
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<220>
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
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<220>
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<400> 8
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
<223> 附加DiMan糖鏈
<220>
<221> 醯胺化
<222> (17)..(17)
<400> 9
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
<223> 附加GlcNAc糖鏈
<220>
<221> 醯胺化
<222> (17)..(17)
<400> 10
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> 醯胺化
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
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<220>
<221> CARBOHYD
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<220>
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
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<220>
<221> CARBOHYD
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<223> 附加γ-環糊精糖鏈
<220>
<221> 醯胺化
<222> (17)..(17)
<400> 13
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<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
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<220>
<221> 結合
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<220>
<221> 結合
<222> (2)..(2)
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<220>
<221> 結合
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<220>
<221> 結合
<222> (6)..(6)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (8)..(8)
<223> OtBu
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<221> 結合
<222> (10)..(10)
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<220>
<221> 結合
<222> (12)..(12)
<223> OtBu
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<221> 結合
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<220>
<221> 結合
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<223> OtBu
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<220>
<221> 結合
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<220>
<221> 結合
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<212> PRT
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<220>
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<220>
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<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
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<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
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<220>
<221> CARBOHYD
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<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
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<220>
<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> 醯胺化
<222> (21)..(21)
<400> 18
<210> 19
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
<223> 附加GlcNAc糖鏈
<220>
<221> 醯胺化
<222> (21)..(21)
<400> 19
<210> 20
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
<223> 附加DiBn-二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 醯胺化
<222> (21)..(21)
<400> 20
<210> 21
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> 附加PEG2000
<220>
<221> 醯胺化
<222> (21)..(21)
<400> 21
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> Fmoc
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> Trt
<220>
<221> 結合
<222> (2)..(2)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (4)..(4)
<223> tBu
<220>
<221> 結合
<222> (6)..(6)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (8)..(8)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (10)..(10)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (12)..(12)
<223> tBu
<220>
<221> 結合
<222> (14)..(14)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (16)..(16)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
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<223> 樹脂
<400> 22
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> 醯胺化
<222> (17)..(17)
<400> 23
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
<223> 附加無唾液酸糖鏈
<220>
<221> 醯胺化
<222> (17)..(17)
<400> 24
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
<223> 附加DiGlcNAc糖鏈
<220>
<221> 醯胺化
<222> (17)..(17)
<400> 25
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> Fmoc
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (3)..(3)
<223> Trt
<220>
<221> 結合
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<223> Pbf
<220>
<221> 結合
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<223> OtBu
<220>
<221> 結合
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<223> Pbf
<220>
<221> 結合
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<220>
<221> 結合
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<223> Pbf
<220>
<221> 結合
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<223> OtBu
<220>
<221> 結合
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<223> 樹脂
<400> 26
<210> 27
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
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<220>
<221> 醯胺化
<222> (16)..(16)
<400> 27
<210> 28
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (3)..(3)
<223> 附加無唾液酸糖鏈
<220>
<221> 醯胺化
<222> (16)..(16)
<400> 28
<210> 29
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (3)..(3)
<223> 附加DiGlcNAc糖鏈
<220>
<221> 醯胺化
<222> (16)..(16)
<400> 29
<210> 30
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> Fmoc
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (2)..(2)
<223> Trt
<220>
<221> 結合
<222> (3)..(3)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (5)..(5)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (7)..(7)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (9)..(9)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (11)..(11)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (13)..(13)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (15)..(15)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (16)..(16)
<223> 樹脂
<400> 30
<210> 31
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> 醯胺化
<222> (16)..(16)
<400> 31
<210> 32
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (2)..(2)
<223> 附加無唾液酸糖鏈
<220>
<221> 醯胺化
<222> (16)..(16)
<400> 32
<210> 33
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (2)..(2)
<223> 附加DiGlcNAc糖鏈
<220>
(221> 醯胺化
<222> (16)..(16)
<400> 33
<210> 34
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> Fmoc
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> Trt
<220>
<221> 結合
<222> (3)..(3)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (5)..(5)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (7)..(7)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (9)..(9)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (11)..(11)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (13)..(13)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (15)..(15)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (16)..(16)
<223> 樹脂
<400> 34
<210> 35
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> 醯胺化
<222> (16)..(16)
<400> 35
<210> 36
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
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<221> CARBOHYD
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<220>
<221> 醯胺化
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<400> 36
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
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<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
<223> 附加DiGlcNAc糖鏈
<220>
<221> 醯胺化
<222> (16)..(16)
<400> 37
<210> 38
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> Fmoc
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> Trt
<220>
<221> 結合
<222> (2)..(2)
<223> Trt
<220>
<221> 結合
<222> (3)..(3)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (5)..(5)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (7)..(7)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (9)..(9)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (11)..(11)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (13)..(13)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (15)..(15)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (17)..(17)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (18)..(18)
<223> 樹脂
<400> 38
<210> 39
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> 醯胺化
<222> (18)..(18)
<400> 39
<210> 40
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
<223> 附加麥芽糖糖鏈
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (2)..(2)
<223> 附加麥芽糖糖鏈
<220>
<221> 醯胺化
<222> (18)..(18)
<400> 40
<210> 41
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
<223> 附加麥芽三糖糖鏈
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (2)..(2)
<223> 附加麥芽三糖糖鏈
<220>
<221> 醯胺化
<222> (18)..(18)
<400> 41
<210> 42
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
<223> 附加麥芽四糖糖鏈
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (2)..(2)
<223> 附加麥芽四糖糖鏈
<220>
<221> 醯胺化
<222> (18)..(18)
<400> 42
<210> 43
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> Fmoc
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> Trt
<220>
<221> 結合
<222> (2)..(2)
<223> Trt
<220>
<221> 結合
<222> (3)..(3)
<223> Trt
<220>
<221> 結合
<222> (4)..(4)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (6)..(6)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (8)..(8)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (10)..(10)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (12)..(12)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (14)..(14)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (16)..(16)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (18)..(18)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (19)..(19)
<223> 樹脂
<400> 43
<210> 44
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> 醯胺化
<222> (19)..(19)
<400> 44
<210> 45
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
<223> 附加麥芽糖糖鏈
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (2)..(2)
<223> 附加麥芽糖糖鏈
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (3)..(3)
<223> 附加麥芽糖糖鏈
<220>
<221> 醯胺化
<222> (19)..(19)
<400> 45
<210> 46
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> Fmoc
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (3)..(3)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (5)..(5)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (7)..(7)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (9)..(9)
<223> Trt
<220>
<221> 結合
<222> (11)..(11)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (13)..(13)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (15)..(15)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (17)..(17)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (17)..(17)
<223> 樹脂
<400> 46
<210> 47
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> 醯胺化
<222> (17)..(17)
<400> 47
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (9)..(9)
<223> 附加麥芽糖糖鏈
<220>
<221> 醯胺化
<222> (17)..(17)
<400> 48
<210> 49
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (9)..(9)
<223> 附加麥芽三糖糖鏈
<220>
<221> 醯胺化
<222> (17)..(17)
<400> 49
<210> 50
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (9)..(9)
<223> 附加麥芽四糖糖鏈
<220>
<221> 醯胺化
<222> (17)..(17)
<400> 50
<210> 51
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> Fmoc
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> Trt
<220>
<221> 結合
<222> (2)..(2)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (4)..(4)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (6)..(6)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (8)..(8)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (10)..(10)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (12)..(12)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (14)..(14)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (16)..(16)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (18)..(18)
<223> Trt
<220>
<221> 結合
<222> (18)..(18)
<223> 樹脂
<400> 51
<210> 52
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> 醯胺化
<222> (18)..(18)
<400> 52
<210> 53
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
<223> 附加麥芽糖糖鏈
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (18)..(18)
<223> 附加麥芽糖糖鏈
<220>
<221> 醯胺化
<222> (18)..(18)
<400> 53
<210> 54
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
<223> 附加麥芽三糖糖鏈
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (18)..(18)
<223> 附加麥芽三糖糖鏈
<220>
<221> 醯胺化
<222> (18)..(18)
<400> 54
<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> Fmoc
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (3)..(3)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (5)..(5)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (7)..(7)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (9)..(9)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (11)..(11)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (13)..(13)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (15)..(15)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (17)..(17)
<223> Trt
<220>
<221> 結合
<222> (17)..(17)
<223> 樹脂
<400> 55
<210> 56
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> 醯胺化
<222> (17)..(17)
<400> 56
<210> 57
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (17)..(17)
<223> 附加DiGlcNAc糖鏈
<220>
<221> 醯胺化
<222> (17)..(17)
<400> 57
<210> 58
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> Fmoc
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (3)..(3)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (5)..(5)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (7)..(7)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (9)..(9)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (11)..(11)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (13)..(13)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (15)..(15)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (16)..(16)
<223> 樹脂
<400> 58
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
<223> 附加無唾液酸糖鏈
<220>
<221> 醯胺化
<222> (17)..(17)
<400> 59
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 乙醯化
<222> (1)..(1)
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
<223> 附加DiGlcNAc糖鏈
<220>
<221> 醯胺化
<222> (17)..(17)
<400> 60
本案所有圖式皆為結果數據，故本案無指定代表圖。

Claims (18)

  1. 一種糖鏈-多肽複合物，其特徵為：前述多肽係以極性胺基酸殘基與非極性胺基酸殘基交互排列，包含8至34個胺基酸殘基所成之胺基酸序列的多肽，且前述多肽鍵結1個或多個糖鏈。
  2. 如申請專利範圍第1項中記載之糖鏈-多肽複合物，其中，前述糖鏈-多肽複合物，在pH為中性附近之水溶液中可藉由自行集合，形成含β-褶板結構之水凝膠。
  3. 如申請專利範圍第1項中記載之糖鏈-多肽複合物，其中，前述各極性胺基酸殘基，係選自：天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、精胺酸殘基、離胺酸殘基、組胺酸殘基、酪胺酸殘基、絲胺酸殘基、蘇胺酸殘基、天冬醯胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、及半胱胺酸殘基所成群組的胺基酸殘基。
  4. 如申請專利範圍第1或3項中記載之糖鏈-多肽複合物，其中，前述各非極性胺基酸殘基，係選自：丙胺酸殘基、纈胺酸殘基、白胺酸殘基、異白胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、苯丙胺酸殘基、色胺酸殘基、脯胺酸殘基、及甘胺酸殘基所成群組的胺基酸殘基。
  5. 如申請專利範圍第4項中記載之糖鏈-多肽複合物，其中，前述各極性胺基酸殘基，係選自：天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、精胺酸殘基、及蘇胺酸殘基所成群組的胺基酸殘基；前述各非極性胺基酸殘基，係丙胺酸殘基。
  6. 如申請專利範圍第1項中記載之糖鏈-多肽複合物，其中，前述胺基酸序列，為「RADA」之重複序列、或「RATARAEA」之重複序列。
  7. 如申請專利範圍第6項中記載之糖鏈-多肽複合物，其中，前述胺基酸序列，係選自：RADARADARADARADA(序列編號1)、RADARADARADARADARADA(序列編號2)、及RATARAEARATARAEA(序列編號3)所成群組的胺基酸序列。
  8. 如申請專利範圍第1項中記載之糖鏈-多肽複合物，其中，鍵結在前述多肽之1個或多個糖鏈中存在之糖殘基數合計為5以上。
  9. 如申請專利範圍第8項中記載之糖鏈-多肽複合物，其中，鍵結在前述多肽之糖鏈數，為1、2、或3股。
  10. 如申請專利範圍第8項中記載之糖鏈-多肽複合物，其中，從位在前述多肽N末端之胺基酸殘基計算，至第x個的所有胺基酸、及從位在C末端之胺基酸殘基計算，至第y個的所有胺基酸(其中，x及y為整數，x≧0、y≧0，且x+y，係鍵結在多肽的糖鏈數之合計)係鍵結糖鏈。
  11. 如申請專利範圍第10項中記載之糖鏈-多肽複合物，其中，鍵結在前述多肽的糖鏈數，為1、2、或3股；鍵結在前述多肽的糖鏈數為1股時，該1股糖鏈，係鍵結在位於前述多肽N末端之胺基酸殘基、或位於C末端之胺基酸殘基； 鍵結在前述多肽的糖鏈數為2股時，該2股糖鏈，係鍵結在選自以下(1)至(3)所成群組的胺基酸殘基；(1)從位在前述多肽N末端之胺基酸殘基計算，為第1及第2個之胺基酸殘基(2)從位在前述多肽C末端之胺基酸殘基計算，為第1及第2個之胺基酸殘基(3)位在前述多肽N末端之胺基酸殘基、及位在前述多肽C末端之胺基酸殘基鍵結在前述多肽的糖鏈數為3股時，該3股糖鏈，係鍵結在任一選自以下(1)至(4)所成群組的胺基酸殘基；(1)從位在前述多肽N末端之胺基酸殘基計算，為第1、第2及第3個之胺基酸殘基(2)從位在前述多肽C末端之胺基酸殘基計算，為第1、第2及第3個之胺基酸殘基(3)從位在前述多肽N末端之胺基酸殘基計算，為第1及第2個之胺基酸殘基、以及位在前述多肽C末端之胺基酸殘基(4)位在前述多肽N末端之胺基酸殘基、及從位在前述多肽C末端計算，為第1及第2個之胺基酸殘基。
  12. 如申請專利範圍第1項中記載之糖鏈-多肽複合物，其中前述糖鏈，為含支鏈之糖鏈。
  13. 如申請專利範圍第8項中記載之糖鏈-多肽複合物，其中前述糖鏈，為選自二唾液酸糖鏈、無唾液酸糖鏈、二-N-乙醯葡萄糖胺糖鏈、二甘露醣糖鏈、N-乙醯葡萄糖胺糖鏈、麥芽三糖糖鏈、麥芽糖糖鏈、麥芽四糖糖鏈、麥芽七糖糖鏈、β-環糊精、及γ-環糊精所成群組的糖鏈。
  14. 一種水凝膠形成用組成物，其係含申請專利範圍第1至13之任一項中記載之糖鏈-多肽複合物。
  15. 一種組成物，其係含申請專利範圍第1至13之任一項中記載之糖鏈-多肽複合物之組成物，其特徵為前述組成物為水凝膠之狀態。
  16. 一種止血用醫藥組成物，其係含申請專利範圍第14或15項中記載之組成物。
  17. 一種緩釋載體用組成物，其係含申請專利範圍第14或15項中記載之組成物。
  18. 一種培養基材用組成物，其係含申請專利範圍第14或15項中記載之組成物。
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