KR20160002835A - 당쇄-폴리펩티드 복합체 - Google Patents

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KR20160002835A
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Abstract

[과제] 본 발명은 광범위한 pH에서 투명하고 균질한 하이드로겔을 형성할 수 있는 당쇄-폴리펩티드 복합체를 제공하는 것을 과제로 하였다.
[해결수단] 본 발명은 당쇄-폴리펩티드 복합체이고, 상기 폴리펩티드가, 극성 아미노산 잔기와 비극성 아미노산 잔기가 교대로 배치된, 8 내지 34개의 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이며, 상기 폴리펩티드에 1 또는 복수의 당쇄가 결합하고 있는 것을 특징으로 하는, 당쇄-폴리펩티드 복합체를 제공한다.

Description

당쇄-폴리펩티드 복합체{(SUGAR CHAIN)-POLYPEPTIDE COMPLEX}
본 발명은 당쇄가 폴리펩티드에 결합한 당쇄-폴리펩티드 복합체에 관한 것이다.
하이드로겔 또는 피브린 글루(fibrin glue) 등의 바이오겔은, 3차원 배양 등의 연구용 기재, 수술중/수술후의 지혈제나 상처치유 시트 등의 외과용 기재, 약물전달 시스템(DDS) 등에 이용되고 있다.
그러나, 이들의 대부분은 생물 유래 재료를 이용한 것이기 때문에, 사용시에 바이러스 등의 미생물의 감염, 면역원성, 질환의 전파 등의 위험이 존재한다. 예를 들어, 피브린 글루는 수술시의 지혈제로서 이용가치가 높지만, 원료가 인간 혈액 유래이기 때문에, 실제로 수술시에 사용한 경우에, 환자가 피프린 글루에 혼입되어 있는 간염 바이러스에 감염하는 사고가 많이 발생하고, 큰 사회문제가 되고 있다. 또한, 생물 유래의 바이오겔은 반드시 균질한 품질의 겔을 공급할 수 없는 문제점도 존재한다.
생물 유래의 바이오겔에 비해, 화학합성에 의해 제조된 바이오겔은 감염의 위험이 없고, 균질한 품질의 겔을 제공할 수 있는 것으로 알려져 있다 (특허문헌 1). 그러나 지금까지 알려진 바이오겔은, 겔을 형성시키는 경우에 버퍼 교환이나 치환, 다제(multiple agent) 혼합 등의 절차가 필요하며, 조작이 복잡하다. 또한, pH 영역에 따라서는 난용해성이 되기 때문에 병용하는 시약이나 용매가 한정될 뿐만 아니라, 적용가능한 부위(환부)가 제한되거나, 사용시에 주사기나 튜브가 막혀버리는 등의 문제가 있다. 또한, 특히 생체의 pH에 가까운 중성영역에서 난용해성 (즉, 투명하지 않음)이며, 예를 들어 수술분야 등의 시인성(visibility)을 필요로 하는 상황에서 사용하는 것이 곤란하다.
특허문헌 1: 미국특허 제5670483호
본 발명은 광범위한 pH에서 투명하고 균질한 하이드로겔을 형성할 수 있는 당쇄-폴리펩티드 복합체를 제공하는 것을 과제로 하였다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의연구를 수행한 결과, 극성 아미노산 잔기와 비극성 아미노산 잔기가 교대로 배치된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 당쇄를 결합시킴으로써 제조된 당쇄-폴리펩티드 복합체가 놀랍게도 광범위한 pH영역, 특히 중성영역에서 높은 수용성을 나타내고, 투명하고 균질한 하이드로겔을 형성한다는 것을 밝혀내고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 당쇄-폴리펩티드 복합체이며, 상기 폴리펩티드가 극성 아미노산 잔기와 비극성 아미노산 잔기가 교대로 배치된, 8 내지 34개의 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이며, 상기 폴리펩티드에 1 또는 복수의 당쇄가 결합하고 있는 것을 특징으로 하는, 당쇄-폴리펩티드 복합체를 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시형태에서는 상기 당쇄-폴리펩티드 복합체가, pH가 중성부근의 수용액 중에서 자기집합함으로써 β시트 구조를 포함하는 하이드로겔을 형성할 수 있는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 실시형태에서는 상기 각 극성 아미노산 잔기가, 아스파라긴산 잔기, 글루탐산 잔기, 아르기닌 잔기, 리신 잔기, 히스티딘 잔기, 티로신 잔기, 세린 잔기, 트레오닌 잔기, 아스파라긴 잔기, 글루타민 잔기, 및 시스테인 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 실시형태에서는 상기 각 비극성 아미노산 잔기가, 알라닌 잔기, 발린 잔기, 류신 잔기, 이소류신 잔기, 메티오닌 잔기, 페닐알라닌 잔기, 트립토판 잔기, 프롤린 잔기, 및 글리신 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 실시형태에서는, 상기 각 극성 아미노산 잔기가, 아스파라긴산 잔기, 글루탐산 잔기, 아르기닌 잔기, 및 트레오닌 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기이며, 상기 각 비극성 아미노산이 알라닌 잔기인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 실시형태에서는 상기 아미노산 서열이, "RADA"의 반복서열, 또는 "RATARAEA"의 반복서열인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 실시형태에서는, 상기 아미노산 서열이, RADARADARADARADA(서열번호 1), RADARADARADARADARADA(서열번호 2), 및 RATARAEARATARAEA(서열번호 3)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 실시형태에서는, 상기 폴리펩티드에 결합하고 있는 1 또는 복수의 당쇄에 존재하는 당잔기 수의 합계가 5 이상인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 실시형태에서는, 상기 폴리펩티드에 결합하고 있는 당쇄의 수가 1, 2, 또는 3개인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 실시형태에서는, 상기 폴리펩티드의 N 말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 계산하여 x 번째까지의 모든 아미노산, 및 C 말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 계산하여 y 번째까지의 모든 아미노산 (여기서, x 및 y는 정수이고,
Figure pct00001
이고,
Figure pct00002
이고, x + y는 폴리펩티드에 결합하고 있는 당쇄의 수의 합계임)에 당쇄가 결합하고 있는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 실시형태에서는, 상기 폴리펩티드에 결합하고 있는 당쇄의 수가 1, 2, 또는 3개이며, 상기 폴리펩티드에 결합하고 있는 당쇄의 수가 1개의 경우에는, 상기 1개의 당쇄는 상기 폴리펩티드의 N 말단에 위치하는 아미노산 잔기, 또는 C 말단에 위치하는 아미노산 잔기와 결합하고 있으며,
상기 폴리펩티드에 결합하고 있는 당쇄의 수가 2개의 경우에는, 상기 2개의 당쇄는 다음의 (1) 내지 (3)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기와 결합하고 있으며,
(1) 상기 폴리펩티드의 N 말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 계산하여 1 번째 및 2번째의 아미노산 잔기
(2) 상기 폴리펩티드의 C 말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 계산하여 1 번째 및 2번째의 아미노산 잔기
(3) 상기 폴리펩티드의 N 말단에 위치하는 아미노산 잔기, 및 상기 폴리펩티드의 C 말단에 위치하는 아미노산 잔기,
상기 폴리펩티드에 결합하고 있는 당쇄의 수가 3개의 경우에는, 상기 3개의 당쇄는 다음의 (1) 내지 (4)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 잔기와 결합하고 있는 것을 특징으로 한다.
(1) 상기 폴리펩티드의 N 말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 계산하여 1번째, 2번째, 및 3번째의 아미노산 잔기
(2) 상기 폴리펩티드의 C 말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 계산하여 1 번째, 2번째, 및 3번째의 아미노산 잔기
(3) 상기 폴리펩티드의 N 말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 계산하여 1 번째 및 2번째의 아미노산 잔기, 및 상기 폴리펩티드의 C 말단에 위치하는 아미노산 잔기
(4) 상기 폴리펩티드의 N 말단에 위치하는 아미노산 잔기, 및 상기 폴리펩티드의 C 말단으로부터 계산하여 1번째 및 2번째에 위치하는 아미노산 잔기.
또한, 본 발명의 일 실시형태에서는, 상기 당쇄가 분지(branch)를 갖는 당쇄인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 실시형태에서는, 상기 당쇄가 디시알로 당쇄, 아시알로 당쇄, 디GlcNAc(diGlcNAc) 당쇄, 디만노오스 당쇄, GlcNAc 당쇄, 말토트리오스 당쇄, 말토오스 당쇄, 말토테트라오스 당쇄, 말토헵타오스 당쇄, β-사이클로덱스트린, 및 γ-사이클로덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 당쇄인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 실시형태에서는, 본 발명의 당쇄-폴리펩티드 복합체를 포함하는, 하이드로겔 형성용 조성물인 것을 특징으로 한다. 또한, 이와 같은 하이드로겔 형성용 조성물은, 지혈용 의약조성물일 수 있고, 서방 담체용 조성물일 수 있고, 배양 기재용 조성물일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시형태에서는, 본 발명의 당쇄-폴리펩티드 복합체를 포함하는 조성물이고, 상기 조성물이 하이드로겔의 상태에 있는 것을 특징으로 한다. 또한, 이와 같은 조성물은 지혈용 의약조성물일 수 있고, 서방 담체용 조성물일 수 있고, 배양 기재용 조성물일 수 있다.
이상에서 설명한 본 발명의 하나 또는 복수의 특징을 임의로 조합시킨 발명도 본 발명의 범위에 포함된다는 것을 당업자라면 이해할 것이다.
본 발명에 따른 당쇄-폴리펩티드 복합체는, 중성영역을 포함하는 광범위한 pH 영역에서 높은 수용성을 가지고, 균일하고 투명한 하이드로겔을 형성하기 때문에, 병용하는 시약이나 용매의 제한을 받기 어렵고, 다양한 용도로 이용될 수 있다. 또한, 광범위한 pH 영역에서 이용될 수 있기 때문에, 적용부위(환부)가 제한되기 어렵다.
또한, 본 발명에 따른 당쇄-폴리펩티드 복합체는, 중성영역을 포함하는 광범위한 pH 영역에서 높은 수용성을 가지고, 균일하고 투명한 하이드로겔을 형성하기 때문에, 중성 pH에서 졸 상태와 겔 상태가 가역적으로 존재할 수 있다. 즉, 당쇄-폴리펩티드 복합체는, 일단 겔 상태를 형성한 후에, 기계적 교반에 의해 졸 상태가 되어도 다시 겔 상태가 될 수 있다. 따라서, 겔 상태(즉, Ready-to-Use 상태)에서 유통시킬 수 있으며, 그 외의 펩티드성의 겔과 같이, 겔화에 적합한 pH(예를 들어, 산성 pH)에서 겔을 형성시킨 후에, 중성 pH를 달성하기 위한 버퍼 교환(또는 치환)을 수행하는 등, 복잡한 조작을 필요로 하지 않는다. 즉, 본 발명에 따른 당쇄-폴리펩티드 복합체는, 그 외의 펩티드성의 겔과 비교하여, 작업성이 상당히 우수하다. 또한, 본 발명에 따른 당쇄-폴리펩티드 복합체는, 사용가능한 pH 범위가 넓기 때문에 사용시에 주사기나 튜브가 막혀버리는 등의 문제가 발생하기 어렵다.
또한, 본 발명에 따른 당쇄-폴리펩티드 복합체는, 동물의 생체 내에 존재하는 당쇄에 의해 수식되기 때문에 전혀 수식되어 있지 않은 펩티드와 비교하여, 항원성이 저감되어 있다. 또한, 본 발명에 따른 당쇄-폴리펩티드 복합체는, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등에 의해 수식된 화합물에서 볼 수 있는 바와 같은 독성이 발생할 위험성도 거의 없다. 따라서, 본 발명에 따른 당쇄-폴리펩티드 복합체는 생체에 사용시 안전성이 높다.
또한, 본 발명에 따른 당쇄-폴리펩티드 복합체는, PEG를 결합한 폴리펩티드와 비교하여도 더욱 투명하고 균일한 하이드로겔을 형성하는 것도 본 명세서의 실시예로부터 분명하다.
또한, 본 발명에 따른 당쇄-폴리펩티드 복합체는, 생리적 조건하(중성영역)에서 균일하고 투명한 하이드로겔을 형성하고, 항원성도 적기 때문에, 동물의 생체에 사용하는 하이드로겔로서 적합하다.
보다 구체적으로는, 본 발명에 따른 당쇄-폴리펩티드 복합체를 포함하는 하이드로겔은, 중성 pH에서 고농도의 혈장을 포함하는 조건하에서도 투명하고 균일한 겔 상태를 유지하는 특징을 갖고 있기 때문에, 예를 들어, 지혈제로서 이용가치가 높다.
또한, 본 발명에 따른 당쇄-폴리펩티드 복합체를 포함하는 하이드로겔은, 중성 pH에서 산성 단백질, 염기성 단백질 중 어느 하나를 포함하는 경우에도 높은 서방성을 가지고 있기 때문에, 다양한 물질에 대한 서방 담체로서 이용가치가 높다.
[도 1] 도 1은 (RADA) 4 및 C(디GlcNAc)-(RADA) 4에 대하여, 다양한 pH에서의 강구 부하 시험(steel ball loading test)의 결과를 나타내는 사진이다.
[도 2] 도 2는 (RADA) 4 및 C(디GlcNAc)-(RADA) 4에 대하여, 다양한 농도의 혈장을 포함하는 경우의 강구 부하 시험의 결과를 나타내는 사진이다.
[도 3] 도 3은 (RADA) 4 및 C(디GlcNAc)-(RADA) 4에 대하여, 산성 단백질을 내포한 경우의 서방효과의 측정결과를 나타내는 그래프이다.
[도 4] 도 4는 (RADA) 4 및 C(디GlcNAc)-(RADA) 4에 대하여, 염기성 단백질을 내포한 경우의 서방효과의 측정결과를 나타내는 그래프이다.
[도 5] 도 5는 (RADA) 4에 대하여, pH 2 또는 pH 7의 경우의 원편광 이색성 (CD; circular dichroism) 측정결과를 나타내는 그래프이다.
[도 6] 도 6은 C(디GlcNAc)-(RADA) 4에 대하여, pH 2 또는 pH 7의 경우의 원편광 이색성(CD) 측정결과를 나타내는 그래프이다.
[도 7] 도 7은 (RADA) 4 및 C(디GlcNAc)-(RADA) 4에 대하여, pH 7에서의 동적 점도(kinetic viscosity) 측정의 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명에 따른 당쇄-폴리펩티드 복합체는, 생물 유래일 수 있고, 화학합성에 의해 제조된 것일 수도 있으나, 안전성이나 품질의 안정성, 당쇄의 균일성의 면에서 화학합성에 의해 제조된 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 당쇄-폴리펩티드 복합체는, 예를 들어, 수용액 중에서 펩티드 분자간의 정전기적 상호작용, 수소결합, 및 소수성 상호작용 등의 상호작용을 통해 자기집합할 수 있다. 본 명세서에서, 당쇄-폴리펩티드 복합체가 수용액 중에서 "자기 집합한다"라는 것은, 수용액 중에서 폴리펩티드끼리 어떤 상호작용 (예를 들어, 정전기적 상호작용, 수소결합, 반데르발스 힘, 소수성 상호작용 등)을 통해 자발적으로 집합하는 것을 의미하고, 한정적인 의미로 해석되어서는 안된다.
본 발명에 따른 당쇄-폴리펩티드 복합체는, 수용액 중에서 자기집합하고, β 시트구조를 형성할 수 있다. 또한, 그의 β시트 구조가 겹겹이 적층됨으로써 하이드로겔을 형성할 수 있다. 수용액 중에서 당쇄-폴리펩티드 복합체가 β시트 구조를 형성하고 있는 것의 확인 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 당쇄-폴리펩티드 복합체를 포함하는 수용액의 원편광 이색성(CD)을 측정함으로써 확인할 수 있다. 일반적으로, β시트 구조를 갖는 분자의 특징으로서, 197nm 부근의 파장에 정의 흡수가 보이고, 216nm 부근의 파장에 부의 흡수가 보여지기 때문에 원편광 이색성의 측정에 의해 이들 파장 부근의 피크를 확인함으로써 β시트 구조의 형성을 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 당쇄-폴리펩티드 복합체는, 극성 아미노산 잔기와 비극성 아미노산 잔기가 교대로 배치된 아미노산 서열을 포함함으로써, 수용액 중에서 β시트 구조를 형성할 때에, β시트 구조의 한쪽 면에는 극성 아미노산 잔기만 배치될 수 있고, 다른 쪽의 면에 비극성 아미노산 잔기만이 배치될 수 있다. 따라서, 이러한 β시트 구조는, 소수성 면(비극성 아미노산 잔기만이 배치된 면)을 숨기도록 집합하여 2층 구조를 형성할 수 있다. 또한, 분자의 자기집합이 진행됨에 따라, 이 β시트의 층구조가 신장하여, 삼차원의 입체구조(예를 들어, 하이드로겔)를 형성할 수 있다. 본 명세서에서, 이와 같은 성질을 갖는 폴리펩티드를 SAP(Self-Assembling Peptide)라고 기재할 수 있다.
본 발명에서, "pH가 중성 부근"이라는 것은 pH가 7.0 부근임을 의미하고, 보다 구체적으로는 pH가 5.0 내지 9.0의 범위, 바람직하게는 pH가 6.0 내지 8.0의 범위 내인 것을 의미한다.
본 발명의 일 실시형태에서는, 당쇄-폴리펩티드 복합체가, pH가 중성 부근의 수용액 중에서 자기집합하여 β시트구조를 포함하는 하이드로겔을 형성할 수 있다는 것을 특징으로 하나, 상기 특징을 가지고 있는 한, pH가 중성부근 이외의 수용액 중에서도 자기집합하여 β시트 구조를 포함하는 하이드로겔을 형성할 수 있는 것을 제외하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 당쇄-폴리펩티드 복합체는, 극성 아미노산 잔기와 비극성 아미노산 잔기가 교대로 배치된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하나, 상기 아미노산 서열의 길이는 한정되지 않고, 바람직하게는 8 내지 34개의 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열일 수 있고, 보다 바람직하게는 12 내지 25개의 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열일 수 있고, 더욱 바람직하게는 16 내지 21개의 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열일 수 있다.
본 발명에 따른 당쇄-폴리펩티드 복합체는, 극성 아미노산 잔기와 비극성 아미노산 잔기가 교대로 배치된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하나, 본 발명에서, "아미노산"이라는 것은 그의 가장 넓은 의미로 사용되며, 단백질 구성 아미노산 뿐만 아니라 아미노산 변이체 및 유도체와 같은 단백질 비구성 아미노산을 포함한다. 당업자라면, 이러한 넓은 정의를 고려하여 본 발명에서의 아미노산으로서, 예를 들어 단백질 구성 L-아미노산; D-아미노산; 아미노산 변이체 및 유도체 등의 화학적으로 수식된 아미노산; 노르로이신(norleucine), β-알라닌, 오르니틴 등의 단백질 비구성 아미노산; 및 아미노산의 특징인 당업계에 공지된 특성을 갖는 화학적으로 합성된 화합물 등을 들 수 있다는 것을 이해할 것이다. 단백질 비구성 아미노산의 예로서, α-메틸아미노산(α-메틸 알라닌 등), D-아미노산, 히스티딘 유사 아미노산(2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘 및 α-메틸-히스티딘 등), 측쇄에 여분의 메틸렌을 갖는 아미노산 ( "호모" 아미노산) 및 측쇄 중의 카르복실산 관능기 아미노산이 설폰산기로 치환된 아미노산(시스테인산 등)을 들 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 아미노산은 단백질 구성 아미노산일 수 있다.
본 발명에서, 극성 아미노산 잔기는 측쇄가 극성을 가질 수 있는 아미노산 잔기이면 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 산성 아미노산 잔기와 염기성 아미노산 잔기가 포함된다. 본 명세서에서, 산성 아미노산 잔기는, 예를 들어 아스파라긴산(Asp : D) 잔기, 및 글루탐산(Glu : E) 등을 포함하며, 염기성 아미노산은 예를 들어, 아르기닌(Arg : R), 리신(Lys : K), 히스티딘(His : H) 등을 포함한다.
또한, 본 명세서 중에서, 예를 들어 "아스파라긴산(Asp: D)" 등의 표기는, 아스파라긴산의 약자로, 세 문자 표기로 "Asp", 한 문자 표기로 "D"를 사용하는 것을 의미한다.
또한, 본 명세서에서, 중성 아미노산 잔기 중, 수산기, 산 아미드기, 티올기 등을 포함하는 아미노산 잔기는 극성을 가지는 것으로서, 극성 아미노산 잔기에 포함되는 것으로 한다. 예를 들어, 본 명세서에서 티로신(Tyr: Y), 세린(Ser: S), 트레오닌(Thr: T), 아스파라긴(Asn: N), 글루타민(Gln: Q), 시스테인(Cys: C)은 극성 아미노산 잔기에 포함된다.
본 명세서에서, 비극성 아미노산 잔기는, 측쇄가 극성을 갖지 않는 아미노산이면 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어 알라닌(Ala: A), 발린(Val: V), 류신(Leu : L), 이소류신(Ile: I), 메티오닌(Met: M), 페닐알라닌(Phe: F), 트립토판(Trp : W), 글리신(Gly: G), 프롤린(Pro: P) 등을 포함한다.
본 발명에 따른 당쇄-폴리펩티드 복합체에서, "극성 아미노산 잔기와 비극성 아미노산 잔기가 교대로 배치된 아미노산 서열"은, 바람직하게는 상기 아미노산 서열은 "RADA"의 반복서열(반복이 2 내지 8회, 바람직하게는 반복이 3 내지 6회), 또는 "RATARAEA"의 반복서열(반복이 1 내지 4 회, 바람직하게는 반복이 2 내지 3회)일 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 아미노산 서열은 RADARADARADARADA(서열번호 1), RADARADARADARADARADA(서열번호 2), 및 RATARAEARATARAEA(서열번호 3)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열일 수 있다.
본 발명에서 "당쇄"라는 것은, 단위 당(단당 및/또는 그의 유도체)가 하나 이상 연결되어 형성된 화합물을 말한다. 단위 당이 2개 이상 연결되는 경우, 각각의 단위 당끼리의 사이는 글리코시드 결합에 의한 탈수 축합에 의해 결합한다. 이와 같은 당쇄로서는, 예를 들어 생체 중에 함유되는 단당류 및 다당류(글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 푸코오스, 크실로오스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 시알산 및 이들의 복합체 및 유도체) 이외에, 분해된 다당, 당단백질, 프로테오글리칸, 글리코사민글리칸, 당지질 등의 복합 생체 분자로부터 분해 또는 유도된 당쇄 등 광범위한 것을 열거할 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 당쇄는 직쇄형일수도, 분지쇄형일 수도 있다.
또한, 본 발명에서, "당쇄"에는 당쇄의 유도체도 포함되며, 당쇄의 유도체로서는, 예를 들어 당쇄를 구성하는 당이 카르복실기를 갖는 당(예를 들어, C-1 위치가 산화되어 카르복실산으로 된 알돈산(aldonic acid)(예를 들어, D-글루코오스가 산화된 D-글루콘산), 말단의 C 원자가 카르복실산으로 된 우론산(uronic acid)(D-글루코오스가 산화된 D-글루쿠론산)), 아미노기 또는 아미노기의 유도체를 갖는 당 (예를 들어, D-글루코사민, D-갈락토사민 등), 아미노기 및 카르복실기를 둘 다 가진 당(예를 들어, N-글리코일뉴라민산(N-glycoylneuraminic acid), N-아세틸무람산(N-acetylmuramic acid) 등), 데옥시화된 당(예를 들어, 2-데옥시-D-리보오스), 황산기를 포함하는 황산화 당, 인산기를 포함하는 인산화 당 등인 당쇄을 들 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 당쇄-폴리펩티드 복합체에서, 폴리펩티드에 결합되는 당쇄는 특별히 한정되지 않지만, 생체적합성의 관점에서 생체 내에 복합당질(당 펩티드 (또는 당 단백질), 프로테오글리칸, 당지질 등)로서 존재하는 당쇄인 것이 바람직하다. 이러한 당쇄로서는, 생체 내에서 당 펩티드(또는 당 단백질)로서 펩티드(또는 단백질)에 결합하고 있는 당쇄인 N-결합형 당쇄, O-결합형 당쇄 등을 들 수 있다.
본 발명에 따른 당쇄-폴리 펩티드 복합체에서, 폴리펩티드에 결합되는 당쇄는, 예를 들어, 디시알로(Disialo) 당쇄, 아시알로(Asialo) 당쇄, 디GlcNAc (DiGlcNAc) 당쇄, 디만노오스(DiMan) 당쇄, GlcNAc 당쇄, 말토트리오스 (Maltotriose) 당쇄, 말토오스(Maltose) 당쇄, 말토테트라오스(Maltotetraose) 당쇄, 말토헵타오스(Maltoheptaose) 당쇄, β-사이클로덱스트린(β-cyclodextrin) 당쇄, γ-사이클로덱스트린(γ-cyclodextrin) 당쇄를 사용할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명에 사용되는 당쇄는 하기 화학식 (1)로 나타내는 디시알로 당쇄일 수 있고, 하기 화학식 (2)로 나타내는 아시알로 당쇄일 수 있고, 하기 화학식 (3)으로 나타내는 디GlcNAc 당쇄일 수 있고, 하기 화학식 (4)로 나타내는 디만노오스 당쇄일 수 있고, 하기 화학식 (5)로 나타내는 GlcNAc 당쇄일 수 있고, 하기 화학식 (6)으로 나타내는 말토트리오스 당쇄일 수 있고, 하기 화학식 (7)로 나타내는 말토오스 당쇄일 수 있고, 하기 화학식 (8)로 나타내는 말토테트라오스 당쇄일 수 있고, 하기 화학식 (9)로 나타내는 말토헵타오스 당쇄일 수 있고, 하기 화학식 (10)으로 나타내는 β-사이클로덱스트린 당쇄일 수 있고, 하기 화학식 (10-2)로 나타내는 γ-사이클로덱스트린 당쇄일 수 있다.
[화학식 1]
Figure pct00003
식(1) 디시알로 당쇄
[화학식 2]
Figure pct00004
식(2) 아시알로 당쇄
[화학식 3]
Figure pct00005
식(3) 디GlcNAc 당쇄
[화학식 4]
Figure pct00006
식(4) 디만노오스 당쇄
[화학식 5]
Figure pct00007
식 (5) GlcNAc 당쇄
[화학식 6]
Figure pct00008
식(6) 말토트리오스 당쇄
[화학식 7]
Figure pct00009
식(7) 말토오스 당쇄
[화학식 8]
Figure pct00010
식(8) 말토테트라오스 당쇄
[화학식 9]
Figure pct00011
식(9) 말토헵타오스 당쇄
[화학식 10]
Figure pct00012
식(10) β-사이클로덱스트린 당쇄
[화학식 11]
Figure pct00013
식(10-2) γ-사이클로덱스트린 당쇄
본 발명에서, 상기 디시알로 당쇄, 아시알로 당쇄, 디GlcNAc 당쇄, 디만노오스 당쇄, 또는 말토헵타오스 당쇄의 비환원 말단으로부터 1 또는 복수의 당을 상실한 당쇄도 사용할 수 있다.
본 발명에서, 당쇄가 결합되는 아미노산 잔기는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 당쇄를 시스테인(Cys: C) 또는 아스파라긴(Asn: N)에 결합시킬 수 있으며, 바람직하게는 시스테인(Cys: C)에 결합시킬 수 있다.
본 발명에서, 아미노산에 당쇄를 결합시키는 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 아미노산 잔기에 당쇄를 직접 결합할 수도 있고, 아미노산 잔기에 링커를 통해 당쇄를 결합시킬 수도 있다.
또한, 본 발명에서 당쇄가 결합된 아미노산 잔기는, "극성 아미노산 잔기와 비극성 아미노산 잔기가 교대로 배치된 아미노산 서열"에 대해 직접 결합하고 있을 수도 있고, 예를 들어, 링커를 통해 결합하고 있을 수도 있다.
이와 같은 링커로서는, 예를 들어, 아미노산과 펩타이드 결합할 수 있도록 양 말단에 아미노기 및 카르복실기를 갖는 알킬쇄 또는 PEG쇄 등을 들 수 있다. 이와 같은 링커로서는, 예를 들어, -NH-(CH2)n-CO-(식 중, n은 정수이고, 목적으로 하는 링커 기능을 저해하지 않는 한 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 1 내지 15의 정수를 나타낸다) 또는 -NH-(CH2CH2O)m-CH2CH2-CO-(식 중, m은 정수이고, 목적으로하는 링커 기능을 저해하지 않는 한 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 1 내지 7의 정수를 나타낸다.) 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, -NH-(CH2)11-CO-(C12 링커) 또는 -NH-(CH2CH2O)3-CH2CH2-CO-(PEG 링커) 등을 들 수 있다.
본 발명의 당쇄-폴리펩티드 복합체는, 당업자에게 공지된 폴리펩티드 합성 방법으로 당쇄 부가 공정을 조합하여 제조할 수 있다. 당쇄 부가에서는, 트랜스 글루타미나제로 대표되는 효소를 이용하는 방법도 사용할 수 있으나, 이 경우, 부가하는 당쇄가 대량으로 필요하게 되고, 최종 공정 후의 정제가 복잡하게 되고, 당쇄의 부가 위치 및 부가가능한 당쇄가 제한되는 등의 문제가 있기 때문에, 분석용 등의 소량의 합성에는 사용하는 것이 가능하더라도 대규모 제조에는 실용적인 방법이라고 할 수 없다.
본 발명의 당쇄-폴리펩티드 복합체의 간단한 제조방법의 구체적인 예로서, 이하, 당쇄가 결합한 Asn(당쇄 부가 Asn)를 사용하고, 고상 합성, 액상 합성 등의 공지의 펩티드 합성방법을 적용함으로써 당쇄-폴리펩티드 복합체를 제조하는 방법(A 법), 및 임의의 아미노산 잔기를 Cys로 한 폴리펩티드를 공지의 펩티드 합성방법에 따라 제조하고, 그 후, Cys에 화학합성에 의해 당쇄를 부가하고, 당쇄-폴리펩티드 복합체를 제조하는 방법(B 법)을 예시한다. 이들 제조방법을 참고로, 당업자라면 다양한 방법으로 당쇄-폴리 펩티드 복합체를 제조하는 것이 가능하다.
또한, 이들 A 법 및 B 법은, 2개 이상을 조합시켜 수행하는 것도 가능하다. 분석 등에 사용되는 소량의 합성이면, 추가로 상기의 방법에, 전이효소에 의한 당쇄 신장반응을 조합시키는 것도 가능하다. 또한, A 법은 국제공개 제2004/005330호 팜플렛 (US2005/222382 (A1))에, B 법은 국제공개 제2005/010053호 팜플렛 (US2007/060543 (A1))에, 각각 기재되어 있으며, 그의 개시는 전체로서 본 명세서에 참조로 포함된다. 또한, A 법 및 B 법에서 사용되는 당쇄 구조가 균일한 당쇄의 제조에 관해서는, 국제공개 제03/008431호 팜플렛 (US2004/181054 (A1)), 국제공개 제 2004/058984호 팜플렛 (US2006/228784 (A1)), 국제공개 제2004/058824호 팜플렛 (US2006/009421 (A1)), 국제공개 제2004/070046호 팜플렛 (US2006/205039 (A1)), 국제공개 제2007/011055호 팜플렛 등에 기재되어 있으며, 그의 개시는 전체로서 본 명세서에 참조로 포함된다.
당쇄 -폴리펩티드 복합체를 제조 하는 방법 ( A 법 )
당쇄-폴리펩티드 복합체는, 예를 들어, 이하에 개략적으로 나타내는 바와 같이, 당쇄가 결합한 Asn를 이용한 고상 합성에 의해 제조할 수 있다.
(1) 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 아미노산의 카르복실기를 수지 (레진)에 결합시킨다. 이 경우, 아미노산의 아미노기 질소를 지용성 보호기로 보호하고 있으므로, 아미노산끼리의 자기 축합은 방지되고, 레진과 아미노산이 반응하여 결합이 일어난다.
(2) 얻어진 반응물의 지용성 보호기를 탈리하여 유리 아미노기를 형성시킨다.
(3) 이 유리 아미노기와, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 임의의 아미노산의 카르복실기를 아미드화 반응시킨다.
(4) 상기 지용성 보호기를 탈리하여 유리 아미노기를 형성시킨다.
(5) 상기 (3) 및 (4)의 공정을 1회 이상 반복함으로써, 임의의 수의 임의의 아미노산이 연결된, 말단에 레진을 결합하고 다른 말단에 유리 아미노기를 갖는 펩티드를 얻을 수 있다.
(6) 상기 (5)에서 합성한 펩티드의 유리 아미노기를 아세틸기로 보호하는 경우, 무수 아세트산, 아세트산 등을 이용하여 아세틸화하는 것도 바람직하다.
(7) 마지막으로, 산으로 레진을 절단함으로써 원하는 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 얻을 수 있다.
여기에서, (1)에서, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 아미노산 대신에, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 당쇄 부가 Asn을 사용하여, 해당 아스파라긴 부분의 카르복실기와 레진의 수산기를 반응시키면 C 말단에 당쇄 부가 Asn을 갖는 펩티드를 얻을 수 있다.
또한, (2)의 후, 또는 (3)과 (4)를 1회 이상의 임의의 횟수를 반복한 후, (3)에서, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 아미노산 대신에, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 당쇄 부가 Asn을 사용하면, 폴리펩티드의 임의의 위치에 당쇄를 결합시킬 수 있다.
이와 같이, (1) 및 (3) 중 어느 하나의 공정에서, 2회 이상 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 아미노산 대신에, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 당쇄 부가 Asn을 이용함으로써, 폴리펩티드의 임의의 2개 위치 이상에 당쇄를 결합시킬 수 있다.
당쇄 부가 Asn을 결합시킨 후, 지용성 보호기를 탈리하여 유리 아미노기를 형성시키고, 그 직후에 공정 (7)을 수행하면, N 말단에 당쇄 부가 Asn을 갖는 폴리펩티드를 얻을 수 있다.
C 말단을 아미드기로서 공급하는 수지(레진)으로서는, 통상적으로 고상 합성에 사용하는 수지(레진)일 수 있고, 예를 들어, 아미노기로 관능화된 Rink-아미드- 레진(머크사 제), Rink-아미드-PEGA 레진(머크사 제)나, NH-SAL-레진(와타나베카가쿠사 제)을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 아미노기로 관능화된 아미노-PEGA- 레진(머크사 제) 등에 Fmoc-NH-SAL-레진-링커(와타나베카가쿠사 제) 등을 결합시킬 수 있다. 이 레진과 펩티드를 산으로 절단함으로써 펩티드의 C 말단 아미노산을 아미드화 할 수 있다.
또한, C 말단을 카르복실산으로 하는 경우의 수지(레진)으로서는, 예를 들어, 염소로 관능화된 2-클로로트리틸 클로라이드 수지(머크사 제)나, 아미노기로 관능화 된 아미노-PEGA 레진(머크사 제), 수산기를 갖는 NovaSyn TGT 알콜 수지 (머크사 제), Wang 레진(머크사 제), HMPA-PEGA 레진(머크사 제) 등을 사용할 수 있다. 또한, 아미노-PEGA 레진과 아미노산 사이에 링커를 존재시킬 수도 있고, 이와 같은 링커로서 예를 들어, 4-히드록시메틸페녹시아세트산(HMPA), 4-(4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시)- 부틸아세트산(HMPB) 등을 들 수 있다. C 말단의 아미노산이 수지에 미리 결합된 H-Cys(Trt)-트리틸 NovaPEG 수지(머크사 제) 등도 사용할 수 있다.
수지와 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 아미노산과의 결합은, 예를 들면, 수산기를 갖는 수지나 염소로 관능화된 수지를 사용하는데는, 아미노산의 카르복실기를 수지에 에스테르 결합시킨다. 또한, 아미노기로 관능화된 수지를 사용하는 경우에는 아미노산의 카르복실기를 수지에 아미드 결합으로 결합시킨다.
또한, 2-클로로트리틸 클로라이드 수지는, 고상 합성에서 펩티드쇄를 신장 할 때, 말단에 있는 Cys의 라세미화를 방지할 수 있는 점에서 바람직하다.
당쇄 - 폴리펩티드 복합체를 제조하는 방법-2 (A 법)
당쇄-폴리펩티드 복합체는, 예를 들어 이하에 개략적으로 나타내는 바와 같이, 당쇄가 결합한 Asn을 이용한 액상합성에 의해 제조할 수 있다.
(1) 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 아미노산의 카르복실기를 아미노기가 유리하여 카르복실기가 보호 또는 아미드화된 아미노산에 결합시킨다.
(2) 얻어진 반응물의 지용성 보호기를 탈리하여 유리 아미노기를 형성시킨다.
(3) 이 유리 아미노기와, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 임의의 아미노산의 카르복실기를 용액 중에서 아미드화 반응시킨다. 이 경우, N 말단측의 아미노산의 아미노기 질소를 지용성 보호기로 보호하고 있으며, C 말단측의 카르복실기는 보호 또는 아미드화되어 있기 때문에, 아미노산끼리의 자기축합은 방지되고, 유리의 아미노기와 카르복실기가 반응하여 결합이 일어난다.
(4) 상기 지용성 보호기를 탈리하여 유리 아미노기를 형성시킨다.
(5) 상기 (3) 및 (4)의 공정을 1회 이상 반복함으로써, 임의의 수의 임의의 아미노산이 결합된, C 말단의 카르복실기가 보호 또는 아미드화되어, N 말단에 유리 아미노기를 갖는 펩티드를 얻을 수 있다.
(6) 상기 (5)에서 합성한 펩티드의 유리 아미노기를 아세틸기로 보호하는 경우, 무수 아세트산, 아세트산 등을 이용하여 아세틸화하는 것도 바람직하다.
(7) 마지막으로, 산으로 측쇄의 지용성 보호기를 절단함으로써, 원하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 얻을 수 있다.
당쇄 - 폴리펩티드 복합체를 제조 하는 방법 -3 ( A 법 )
당쇄-폴리펩티드 복합체는, 예를 들어, 이하에 개략적으로 나타내는 바와 같이, 당쇄가 결합한 Asn를 이용한 프래그먼트 합성법(fragment synthesis)에 의해 제조할 수 있다.
(1) 상기의 당쇄-폴리펩티드 복합체를 제조하는 방법 (A 법)의 (1) 내지 (6)에 의해, 아세틸기 또는 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 폴리펩티드 또는 당쇄-폴리펩티드 복합체를 수지상에 합성한다.
(2) 측쇄 보호기가 탈보호되지 않는 조건에서, 레진으로부터 폴리펩티드 또는 당쇄-폴리펩티드 복합체를 절단하고, C 말단에 유리 카르복실을 가지며, N 말단이 아세틸기 또는 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 폴리펩티드 또는 당쇄-폴리펩티드 복합체를 얻는다.
(3) 얻어진 아세틸기 또는 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 폴리펩티드 또는 당쇄 - 폴리펩티드 복합체를, 고상 합성법 또는 액상 합성법에 의해 수지 또는 폴리펩티드와 연결시킨다.
(4) 상기 지용성 보호기를 탈리하여 유리 아미노기를 형성시킨다.
(5) 상기 (3) 및 (4)의 공정을 1회 이상 반복함으로써, 임의의 수의 임의의 아미노산이 연결된 펩티드를 얻을 수 있다.
(6) 마지막으로, 산으로 수지를 절단함으로써, 원하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 얻을 수 있다.
지용성 보호기로서는, 예를 들어 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)기, t- 부틸옥시카르보닐(Boc)기, 벤질기, 알릴기, 알릴옥시카르보닐기, 아세틸기 등의 카보네이트계 또는 아미드계의 보호기 등을 들 수 있다. 아미노산에 지용성 보호기를 도입하는데는, 예를 들면 Fmoc기를 도입하는 경우에는 9-플루오레닐메틸-N-숙신이미딜 카보네이트와 탄산수소 나트륨을 첨가하여 반응을 수행함으로써 도입할 수 있다. 반응은 0 내지 50℃, 바람직하게는 실온에서, 약 1 내지 5 시간 정도 수행할 수 있다.
지용성 보호기로 보호된 아미노산으로서는, 시판 중의 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, Fmoc-Ser-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Tyr-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys-OH, Fmoc-Arg-OH, Fmoc-His-OH, Fmoc-Asp-OH, Fmoc-Glu-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Thr-OH, Fmoc-Cys-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Pro-OH를 들 수 있다.
또한, 지용성 보호기로 보호된 아미노산이며, 측쇄에 보호기를 도입한 것으로서, 예를 들어, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Cys(StBu)-OH, Fmoc-Cys(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH를 들 수 있다.
또한, 당쇄-폴리펩티드 결합체의 아미노산 서열 중에는, 링커를 부가시키고 싶은 경우에는 고상 합성의 과정에서 상기 지용성 보호기로 보호한 아미노산 대신에, 지용성 보호기로 보호한 링커를 사용하여 바람직한 위치에 링커를 삽입할 수 있다.
2-클로로트리틸클로라이드 수지를 사용하는 경우, 디이소프로필에틸아민 (DIPEA), 트리에틸아민, 피리딘, 2,4,6-콜리딘 등의 염기를 사용하여 에스테르화를 수행할 수 있다. 또한 수산기를 갖는 수지를 사용하는 경우, 에스테르화 촉매로서, 예를 들면, 1-메시틸렌설포닐-3-니트로-1,2,4-트리아졸(MSNT), 디시클로헥실카르보디이미드(DCC), 및 디이소프로필카르보디이미드(DIC) 등의 공지된 탈수축합제를 사용할 수 있다. 아미노산과 탈수축합제와의 사용 비율은, 전자 1 당량에 대해 후자가 통상 1 내지 10 당량, 바람직하게는 2 내지 5 당량이다.
에스테르화 반응은, 예를 들어, 고상 컬럼에 레진을 넣고, 이 레진을 용제로 세정한 후, 아미노산 용액을 첨가하여 수행하는 것이 바람직하다. 세정용 용제로서는, 예컨대 디메틸포름아미드(DMF), 2-프로판올, 디클로로메탄 등을 들 수 있다. 아미노산을 용해하는 용매로서는, 예를 들어 디메틸설폭사이드(DMSO), DMF, 디클로로메탄 등을 들 수 있다. 에스테르화 반응은 0 내지 50℃, 바람직하게는 실온에서, 약 10분 내지 30시간 정도, 바람직하게는 15분 내지 24시간 정도 수행할 수 있다.
이때 고체상 위의 미반응의 기를, 무수 아세트산 등을 이용하여 아세틸화하여 캡핑(capping)하는 것도 바람직하다.
지용성 보호기의 탈리는, 예를 들면 염기로 처리함으로써 수행할 수 있다. 염기로서는, 예를 들어 피페리딘, 모르폴린 등을 들 수 있다. 이때, 용매의 존재하에서 수행하는 것이 바람직하다. 용매로서는, 예를 들어 DMSO, DMF, 메탄올 등을 들 수 있다.
유리 아미노기와, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 임의의 아미노산의 카르복실기의 아미드화 반응은, 활성화제 및 용매의 존재하에 수행하는 것이 바람직하다.
활성화제로서는, 예를 들면, 디사이클로헥실 카르보디이미드 (DCC), 1-에틸-3- (3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드·염산염 (WSC/HCl), 디페닐포스포릴아지드 (DPPA), 카르보닐디이미다졸(CDI), 디에틸시아노포스포네이트(DEPC), 벤조트리아 졸-1-일옥시-트리스피롤리디노포스포늄(DIPCI), 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스피 롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBOP), 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt), 히드록시숙신이미드(HOSu), 디메틸아미노피리딘(DMAP), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 (HOAt), 히드록시프탈이미드(HOPht), 펜타플루오로페놀(Pfp-OH), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU), 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-5-클로로-1H-벤조트리아졸리움 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트(HCTU), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스포네이트(HATU), O-벤조트리아졸-1-일-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TBTU), 3,4-디히드로-3-히드로디-4-옥사-1,2,3-벤조트리아진(Dhbt), 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모폴리늄 클로라이드 n- 히드레이트 (DMT-MM) 등을 들 수 있다.
활성화제의 사용량은, 지용성의 보호기로 아미노기 질소가 보호된 임의의 아미노산에 대하여 1 내지 20 당량, 바람직하게는 1 내지 10 당량, 더욱 바람직하게는 1 내지 5 당량으로 하는 것이 바람직하다.
용매로서는, 예를 들어 DMSO, DMF, 디클로로메탄 등을 들 수 있다. 반응은 0 내지 50 ℃, 바람직하게는 실온에서, 약 10분 내지 30시간 정도, 바람직하게는 15 분 내지 24시간 정도 수행할 수 있다. 지용성 보호기의 탈리는 상기와 동일하게 수행할 수 있다.
아미노기로 관능화된 Rink-Amide-레진(머크사 제), Rink-Amide-PEGA 레진 (머크사 제), NH-SAL-레진(와타나베카가쿠사 제)이나, NH-SAL-레진-링커가 결합한 Amino-PEGA-레진(머크사 제) 등에 C 말단의 아미노산을 도입하는 경우, 상기 아미드화 반응을 사용하여 도입할 수 있다.
수지(레진)로부터 펩티드쇄를 절단하는데는 산으로 처리하는 것이 바람직하다. 산으로서는, 예를 들면 트리플루오로 아세트산(TFA), 불화수소(HF) 등을 들 수 있다.
이와 같이 하여, 원하는 위치에 당쇄 부가 Asn을 갖는 당쇄-폴리펩티드 복합체를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시양태에서, 고상 합성에 사용하는 당쇄 부가 Asn에서의 당쇄상의 비환원 말단에 시알산을 포함하는 경우에는, 산 처리에 의해 시알 산이 절단되는 것을 방지하기 위해, 상기 시알산의 카르복실기를 보호기로 보호하는 것이 바람직하다. 보호기로서는, 예를 들면, 벤질기, 알릴기, 디페닐메틸기, 펜아실기 등을 들 수 있다. 보호기의 도입 및 보호기의 탈리 방법은 공지의 방법으로 수행할 수 있다.
당쇄 -폴리펩티드 복합체를 제조 하는 방법 ( B 법 )
당쇄-폴리펩티드 복합체는, 먼저 폴리펩티드를 합성하고, 이후에 합성한 폴리펩티드에 당쇄를 부가하는 방법에 의해서도 제조할 수 있다. 구체적으로는, 당쇄를 부가하고 싶은 위치에 Cys을 포함하는 폴리펩티드를, 고상 합성법, 액상 합성법, 세포에 의해 합성하는 방법, 천연에 존재하는 것을 분리 추출하는 방법 등으로 제조한다. 폴리펩티드를 고상 합성법 또는 액상 합성법으로 합성하는 경우, 아미노산은 하나의 잔기씩 연결시킬 수도 있고, 폴리펩티드를 연결시킬 수도 있다. 여기에서, 디설파이드 결합을 형성할 예정의 위치에 있는 Cys 등, 당쇄를 부가하지 않은 Cys에 대해서는 예를 들어 아세트아미드메틸(Acm)기로 보호해 둔다. 또한, 당쇄를 부가하지 않고, 디설파이드 결합의 형성에도 사용하지 않은 Cys를 당쇄-폴리펩티드 복합체에 도입하는 경우에는, 당쇄 부가 공정 및 디설파이드 결합 형성 공정 사이에, Cys를 보호기로 보호하여 두고, 그 후 탈보호하도록 하여 Cys을 도입할 수 있다. 이와 같은 보호기로서는, 예를 들어, tert-부틸(tBu)이나 4-메톡시벤질을 들 수 있다.
또한, 1개의 폴리펩티드 중의 Cys에, 상이한 당쇄를 부가하는 경우에는, 최초에 당쇄를 도입하는 Cys를 비보호로 하고, 다음에 상이한 당쇄를 도입하는 Cys를, StBu 등으로 보호하여 둠으로써 상이한 당쇄를 도입할 수 있다. 구체적으로는, 고상 합성 등에 의해 폴리펩티드를 합성하는 경우, 첫번째 당쇄를 도입하고 싶은 Cys를 비보호로 하고, 또한 두번째 당쇄를 도입하고 싶은 Cys를 Fmoc-Cys(StBu)-OH 등을 사용하여, 보호기를 갖는 Cys로 한다. 그 후, StBu 등의 보호기를 유지하면서 비보호된 Cys에 당쇄를 도입한다. 다음에, StBu 기 등을 탈보호하여 비보호된 Cys에 상이한 당쇄를 도입할 수 있다. 또한, 첫번째 당쇄를 도입하고 싶은 Cys 및 두 번째 당쇄를 도입하고 싶은 Cys는 하나 또는 복수개로 할 수 있다.
또한, StBu기의 탈보호는, 트리스(2-카르복실에틸)포스핀 염산염 (TCEP), 디티 오트레이톨(DTT), 트리부틸포스핀 등의 환원제를 사용하여 반응시킴으로써 탈보호 할 수 있다. 상기 반응은, 통상 0 내지 80℃, 바람직하게는 5 내지 60℃, 더욱 바람직하게는 10 내지 35℃에서 수행할 수 있다. 반응시간은, 바람직하게는 통상 30 분 내지 5 시간 정도이다. 반응 종료 후 적절히 공지의 방법 (예를 들면, 고속 액체 칼럼크로마토그래피 (HPLC))로 정제할 수 있다.
상이한 당쇄를 도입하는 경우에는, Cys의 탈보호 공정에서의 환원조건이나 HPLC 등의 정제 공정에서의 산성 조건에 대하여, 보다 안정한 당쇄로부터 도입하는 것이 바람직하다. 특히 시알산 함유 당쇄를 도입하는 경우에는, 시알산을 갖지 않는 당쇄 또는 시알산 잔기수가 적은 당쇄부터 먼저 도입하는 것이 바람직하다.
또한, 당쇄-폴리펩티드 복합체의 아미노산 서열 중에, 링커를 부가시키고 싶은 경우에는, 예를 들어 고상 합성 과정에서 지용성 보호기로 보호한 아미노산 대신에, 지용성 보호기로 보호한 링커를 사용하여, 합성한 폴리펩티드의 바람직한 위치에 링커를 삽입할 수 있다.
다음에, 할로아세틸화 당쇄 유도체를 상기에서 얻은 비보호된 Cys을 포함하는 펩티드와 반응시킴으로써 당쇄를 비보호된 Cys의 티올기와 반응시켜, 펩티드에 결합시킨다. 상기 반응은, 인산 완충액, 트리스-염산 완충액, 구연산 완충액, 또는 이들의 혼합 용액 중에서, 통상 0 내지 80℃, 바람직하게는 10 내지 60℃, 더욱 바람직하게는 15 내지 35℃에서 수행할 수 있다. 반응시간은 통상 10분 내지 24시간, 바람직하게는 통상 30분 내지 5시간 정도이다. 반응 종료 후, 적절히 공지의 방법(예를 들면, HPLC)으로 정제할 수 있다.
할로아세틸화 당쇄 유도체는, 예를 들어, 아스파라긴 결합형 당쇄의 1번 위치의 탄소에 결합하고 있는 수산기를, -NH-(CH2)a-(CO)-CH2X (X는 할로겐 원자, a는 정수이고, 목적으로 하는 링커 기능을 저해하지 않는 한 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 0 내지 4의 정수를 나타낸다)로 치환한 화합물이다.
구체적으로는, 할로아세틸화 복합형 당쇄 유도체와 Cys 함유 폴리펩티드를 인산 완충액 중, 실온에서 반응시킨다. 반응 종료 후, HPLC로 정제함으로써 당쇄가 결합된 Cys를 갖는 당쇄-폴리펩티드 복합체를 얻을 수 있다.
또한, DMSO, DMF, 메탄올, 아세토니트릴 등의 유기용매와 상기 완충액과의 혼합 용액 중에서 반응을 수행할 수도 있다. 이때 유기 용매의 비율은, 0 내지 99% (v/v)의 범위로 상기 완충액에 첨가할 수 있다. 완충액에의 용해성이 낮은 비보호된 Cys를 포함하는 펩티드는, 이와 같은 유기용매를 첨가함으로써 반응용액에의 용해성를 향상시킬 수 있어 바람직하다.
또는, DMSO, DMF, 메탄올, 아세토니트릴 등의 유기용매나, 그의 혼합용액 중에서 반응을 수행할 수도 있다. 그 경우, 염기의 존재하에서 수행하는 것이 바람직하다. 염기로서는, 예를 들어 DIPEA, 트리에틸아민, 피리딘, 2,4,6-콜리딘 등을 들 수 있다. 또한, 구아니딘 염산염이나 요소를 완충용액에 첨가한 혼합용액 중에서도 반응을 수행할 수 있다. 또한, 구아니딘 염산염이나 요소는 최종 농도가 1 M 내지 8 M이 되도록 상기 완충액에 첨가할 수 있다. 구아니딘 염산염이나 요소의 첨가에 의해서도, 완충액에의 용해성이 낮은 펩티드의 용해도를 향상시킬 수 있어 바람직하다.
또한, 비보호된 Cys를 포함하는 폴리펩티드가, 디설파이드 결합을 통한 2량체를 형성하는 것을 방지하기 위해, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 염산염 (TCEP) 또는 디티오트레이톨(DTT)을 완충액에 첨가하여 반응시킬 수도 있다. TCEP 또는 DTT는, 최종 농도가 10 μM 내지 10 mM이 되도록 완충액에 첨가할 수 있다.
또한, 당쇄를 목적의 Cys에 결합시킨 후, Acm 등으로 보호된 Cys의 보호기를 탈보호한다. 보호기가 Acm기인 경우에는, 물, 메탄올, 아세트산 또는 이들의 혼합 용액중에서 요소, 아세트산 수은(II), 질산은(I), 또는 아세트산 은(I) 등을 사용하여 반응시킴으로써 탈보호할 수 있다.
상기 반응은, 통상 0 내지 80℃, 바람직하게는 5 내지 60℃, 더욱 바람직하게는 10 내지 35℃에서 수행할 수 있다. 반응 시간은, 바람직하게는 통상 5분 내지 24시간 정도이다. 반응 종료 후에는, DTT나 염산 등으로 처리한 후, 적절히 공지의 방법(예를 들어, HPLC)으로 정제할 수 있다.
이렇게 하여, 원하는 위치에 당쇄가 결합된 Cys을 갖는 당쇄-폴리 펩티드 복합체를 얻을 수 있다. 또한, 이와 같이 정제된 당쇄-폴리 펩티드 복합체는, 후술하는 바와 같이, 탈보호된 Cys끼리의 디설파이드 결합을 형성시킬 수 있다.
또한, 디시알로 당쇄 또는 모노시알로 당쇄 등의 시알산 함유 당쇄를 펩티드 서열 중에 복수개 갖는 당쇄-폴리펩티드 복합체를 제조하는 경우에는, 도입하는 당쇄상의 시알산의 카르복실기가, 벤질(Bn)기, 알릴기, 디페닐메틸기, 펜아실기 등으로 보호된 시알산 함유 당쇄를 사용할 수 있다.
시알산의 카르복실기가 보호된 당쇄를 도입한 경우에는, 후술하는 당쇄-폴리 펩티드 복합체에서의 디설파이드 결합의 형성 공정 후, 시알산 보호기의 탈보호의 공정을 수행할 수 있다.
이와 같이, 시알산의 카르복실기를 벤질기 등으로 보호함으로써 제조공정에서의 HPLC 등에 의한 분리·정제 공정이 용이하게 된다. 또한, 시알산의 카르복실기의 보호는 산에 불안정한 시알산의 탈리를 방지할 수도 있다.
당쇄 상의 시알산의 카르복실기의 보호반응은, 당업자에게 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 또한, 디설파이드 결합을 형성시킨 당쇄-폴리펩티드 복합체에서, 시알산의 카르복실기의 보호기는, 염기성 조건하에서 가수분해함으로써 탈보호 할 수 있다. 상기 반응은, 통상 0 내지 50℃, 바람직하게는 0 내지 40℃, 더욱 바람직하게는 0 내지 30℃에서 수행할 수 있다. 반응시간은 바람직하게는 통상 5분 내지 5시간 정도이다. 반응 종료 후, 인산 또는 아세트산 등의 약산으로 중화한 후, 적절히 공지의 방법(예를 들어, HPLC)으로 정제할 수 있다.
또한, 상기 A 법 및 B 법에 의해 제조된 당쇄-폴리펩티드 복합체는, 공기 및/또는 산소, 요소, DMSO, 산화 및 환원된 글루타티온의 혼합물, 페리시안산 칼륨, 엘만 시약(Ellman's reagent)(5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)), 트리플루오로 아세트산 탈륨(III) 및 알킬트리클로로 실란설폭사이드 등을 사용하여 당업자에게 잘 알려진 방법으로 Cys끼리의 디설파이드 결합을 형성할 수 있다.
또한, Cys-Cys 간의 디설파이드 결합을 형성시키는 경우에, 디설파이드 결합하는 것이 바람직하지 않은 당쇄-폴리펩티드 복합체 중의 Cys에 대해서는, 보호기로 보호하여 둔다. 이와 같은 보호기로서는, Acm, tBu, 4-메톡시벤질, 4-메틸벤질 등, 산화조건에서 안정한 보호기를 사용할 수 있다.
또한, B 법에서 디설파이드 결합의 형성은 당쇄의 도입 전에 수행할 수 있다. 그러나 디설파이드 결합시키고 싶은 Cys에 보호기가 도입되어 있는 경우에는 탈보호의 공정이 디설파이드 결합 형성의 공정보다 먼저이다.
또한, B 법에서 할로아세틸화 복합형 당쇄 유도체와 반응시키는 아미노산은, 티올기를 함유하는 아미노산이면 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, D체의 시스테인(D-Cys), 호모시스테인, 노르시스테인, 페니실아민 등도 Cys와 동일하게 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 당쇄-폴리펩티드 복합체에 결합하는 당쇄의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 당쇄-폴리펩티드 복합체에 결합하고 있는 당쇄에 존재하는 당잔기의 수의 합계가 5 이상인 것이 바람직하다. 예를 들어, 5당 이상의 당쇄를 1개 이상 부가할 수도 있고, 5당 이하의 당쇄를 복수개 부가함으로써, 하나의 당쇄-폴리 펩티드 복합체에 부가된 당쇄에 존재하는 당잔기의 수가 5 이상이 되도록 할 수도 있다. 당쇄를 복수개 부가하는 경우에는, 하나의 펩티드에 결합되는 당쇄의 종류는 동일할 수도 있고, 상이한 종류의 당쇄를 조합시켜 결합할 수도 있으나, 동일한 것이 바람직하다.
예를 들어, 당쇄-폴리펩티드 복합체에 결합하고 있는 당쇄에 존재하는 당잔기의 수의 합계가 5인 경우, 2개의 당잔기를 갖는 말토오스 당쇄와, 3개의 당 잔기를 갖는 말토트리오스 당쇄가 각각 1개씩 결합하고 있을 수도 있다. 또한, 당쇄-폴리 펩티드 복합체에 결합하고 있는 당쇄에 존재하는 당잔기의 수의 합계가 6인 경우, 말토오스 당쇄가 3개 결합되어 있을 수도 있고, 말토트리오스 당쇄가 2개 결합되어 있을 수도 있다. 또한, 당쇄-폴리펩티드 복합체에 결합하고 있는 당쇄에 존재하는 당잔기의 수의 합계가 7인 경우, 말토오스 당쇄가 2개 및 말토트리오스 당쇄가 1개 결합하고 수 있어도 좋다. 7개의 당 잔기를 갖는 디GlcNAc 당쇄가 1개 결합하고 있을 수도 있다. 마찬가지로, 당쇄-폴리펩티드 복합체에 결합하고 있는 당쇄에 존재하는 당잔기의 수의 합계가 8 이상인 경우에서도 다양한 조합의 당쇄가 결합하고 있을 수도 있다.
본 발명에 따른 당쇄-폴리펩티드 복합체에 결합하는 당쇄의 수는, 당쇄-폴리 펩티드 복합체가 pH가 중성 부근의 수용액 중에서 자기 집합함으로써 β-시트 구조를 형성할 수 있는 특징을 상실하지 않는 한 한정되지 않는다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개일 수 있고, 바람직하게는 1, 2, 또는 3개일 수 있다.
본 발명에 따른 당쇄-폴리펩티드 복합체에서, 당쇄가 결합하는 아미노산 잔기의 위치는, 당쇄-폴리펩티드 복합체가 pH가 중성 부근의 수용액 중에서 자기집합으로써 β-시트 구조를 형성하는 특징을 잃지 않는 한 한정되지 않는다. 예를 들어, 당쇄가 결합하는 아미노산 잔기의 위치는, 폴리펩티드의 N 말단측 및/또는 C 말단측일 수 있고, N 말단 및 C 말단 이외의 위치일 수도 있다.
바람직하게는, 폴리펩티드의 N 말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 계산하여, x 번째까지의 모든 아미노산, 및 C 말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 계산하여, y 번째까지의 모든 아미노산(여기에서, x 및 y는 정수이고,
Figure pct00014
이고
Figure pct00015
이고, x + y는 폴리펩티드에 결합하고 있는 당쇄의 수의 합계이다)에 당쇄가 결합되어 있을 수도 있다.
보다 구체적으로는, 폴리펩티드에 결합하고 있는 당쇄의 수가 1개인 경우에는, 상기 1개의 당쇄는 상기 폴리펩티드의 N 말단에 위치하는 아미노산 잔기 또는 C 말단에 위치하는 아미노산 잔기와 결합할 수 있다.
또한, 폴리펩티드에 결합하고 있는 당쇄의 수가 2개인 경우에는, 상기 2개의 당쇄는, 다음의 (1) 내지 (3)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기와 결합하고 있을 수도 있다.
(1) 폴리펩티드의 N 말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 계산하여 1번째 및 2번째의 아미노산 잔기
(2) 폴리펩티드의 C 말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 계산하여 1번째 및 2번째의 아미노산 잔기
(3) 폴리펩티드의 N 말단에 위치하는 아미노산 잔기, 및 상기 폴리펩티드의 C 말단에 위치하는 아미노산 잔기.
또한, 폴리펩티드에 결합하고 있는 당쇄의 수가 3개인 경우에는, 상기 3개의 당쇄는, 다음의 (1) 내지 (4)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 잔기와 결합하고 있을 수도 있다.
(1) 폴리펩티드의 N 말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 계산하여, 1번째, 2번째, 및 3번째의 아미노산 잔기
(2) 폴리펩티드의 C 말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 계산하여, 1번째, 2번째, 및 3번째의 아미노산 잔기
(3) 폴리펩티드의 N 말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 계산하여, 1번째 및 2번째 아미노산 잔기, 및 폴리펩티드의 C 말단에 위치하는 아미노산 잔기
(4) 폴리펩티드의 N 말단에 위치하는 아미노산 잔기, 및 폴리펩티드의 C 말단으로부터 계산하여, 1번째 및 2번째에 위치하는 아미노산 잔기.
본 발명에 따른 당쇄-폴리펩티드 복합체에 부가되는 당쇄는 분지(branch)를 가지고 있는 것이 바람직하다. 여기서, 본 발명에서, 폴리펩티드에 결합된 당쇄가 "분지를 갖는 당쇄"라는 것은, 예를 들어, 디시알로 당쇄, 아시알로 당쇄, 디GlcNAc 당쇄와 같이 하나의 당쇄 중에 분지를 가지고 있는 경우에 한정되지 않고, 예를 들어, 하나의 폴리펩티드에 복수개의 직쇄상의 당쇄가 부가됨으로써, 펩티드 전체로서 당쇄가 분지를 가지고 있는 상태에 있는 경우도 포함된다. 예를 들어, 하나의 펩타이드에 말토오스 당쇄나 말토트리오스 당쇄 등의 직쇄상의 당쇄가 2개 이상 결합하고 있는 경우에도, 본 발명에서 "분지를 갖는 당쇄"에 포함되는 것으로 한다.
본 발명에서 하이드로겔은, 분산매가 실질적으로 물인 겔을 의미한다. 본 발명에 따른 펩티드를 물에 분산시키면 하이드로겔을 형성하나, 펩티드와 물의 혼합 비율은 특별히 한정되지 않고, 하이드로겔의 용도에 따라 당업자가 적절히 혼합비율을 조절할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 실시형태에 따른, C(디GlcNAc)-(RADA) 4를 사용하여 하이드로겔을 제조하는 경우, 펩티드 농도가 0.5 중량% 이상인 경우에는 광범위한 pH에서 하이드로겔을 형성하나, 펩티드 농도가 약 0.25 중량%인 경우에는 중성 pH에서는 하이드로겔을 형성하고 산성 pH에서는 하이드로겔을 형성하지 않을 수 있다. 이와 같이, 본 발명에 따른 펩티드로부터 제조된 하이드로겔은, 펩티드 농도가 저농도인 경우, pH에 의해 하이드로겔 형성을 제어할 수 있다. 이러한 성질을 이용하여, 예를 들어, 하이드로겔의 사용 후에 pH를 변화시킴으로써 겔에서 졸로 변화시켜 신속하게 폐기 또는 배설시킬 수 있다.
본 발명에서, 하이드로겔의 강도 또는 성질에 대한 평가 방법은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 강구 부하 시험(steel ball loading test) 또는 동적 점액도 측정(kinetic viscosity measurement)에 의해 평가할 수 있다. 강구 부하 시험에서는, 예를 들어, 더람관(Durham's tube) 내에서 형성시킨 하이드로겔의 표면에 소정의 중량의 강구(steel ball)를 로딩하고 강구가 하이드로겔의 표면에 머무르는지 가라앉는지를 관찰함으로써 하이드로겔의 강도를 평가할 수 있다. 또한, 강구 부하 시험에서는, 하이드로겔 중의 투명도 또는 불용물·침전의 유무를 육안으로 확인할 수 있다. 하이드로겔의 동적 점액도 측정에서는, 대상으로 하는 하이드로겔에 대하여 검류계를 사용하여 동적 점도를 측정함으로써, 시간 경과에 따른 하이드로겔의 강도 변화를 측정할 수 있다.
또한, 본 실시예에서 하이드로겔을 평가하는 경우에는, 하이드로겔을 형성시키는 작업의 하나로서 격렬한 교반작업을 포함한다. 이러한 격렬한 교반작업을 수행함으로써 균일성이 높은 겔을 형성시킬 수 있으며, 더욱 신뢰성이 높은 평가를 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 하이드로겔은, 다양한 용도로 사용할 수 있으나, 예를 들면, 본 발명에 따른 하이드로겔은 생체에 대해 안정성이 높기 때문에, 의약 용도(지혈 기재, 혈관 색전재 등의 수술 보조제, 의약품 등의 서방 담체, 외과수술이나 재생 의료 등에서의 상처 피복재, 점막융기재, 치조골 재건재, 각막 재생재 등의 조직재건재, 조직배양 실험 등에서의 3차원 배양기재) 또는 화장품 용도(스킨 케어 용품, 헤어 케어 용품 등)에 이용할 수 있다. 특히 바람직하게는, 지혈기재, 서방담체 또는 배양기재로서 사용할 수 있다.
본 발명에서, 지혈기재라는 것은, 생체로부터의 출혈을 멈추게 하기 위해 사용되는 기재를 넓게 의미한다. 본 발명에 따른 지혈 기재는, 본 발명에 따른 당쇄-폴리펩티드 복합체와 물만을 포함한 것으로 한정되지 않고, 그 외의 다양한 성분을 포함하고 있을 수도 있다. 예를 들어, 소독·살균 성분을 가진 약제를 포함함으로써, 상처로부터의 출혈을 멈추게 할 뿐만 아니라 동시에 상처의 살균·소독도 수행할 수 있다.
본 발명에서, 서방 담체라는 것은, 내포한 물질이나 약제가 서서히 방출되는 성질을 갖는 담체를 넓게 의미한다. 본 발명에 따른 서방 담체에 내포하는 물질은 특별히 한정되지 않고 다양한 물질이나 약제를 내포할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 서방 담체에 내포하는 물질이나 약제는 1 종류로 한정되지 않고, 2 종류 이상의 물질이나 약제를 동시에 내포할 수 있다.
본 발명에서, 배양기재라는 것은, 세포 또는 조직의 배양시에 사용되는 기재를 넓게 의미한다. 예를 들어, 세포 배양용 접시를 본 발명에 따른 배양기재로 코팅하고, 세포를 배양함으로써 세포의 접착성·성장성을 향상시킬 수 있다. 또한, 예를 들어, 본 발명에 따른 배양기재에 세포나 조직을 내포시켜 배양함으로써, 세포나 조직의 효율적인 3차원 배양을 수행할 수 있다.
본 발명에서, 점막 융기재라는 것은, 내시경 수술에 의한 위암이나 식도암 등의 점막 절제 수술이나 점막하층 박리수술에서 병변부위의 점막 융기를 형성하는 막하 주입재를 넓게 의미한다. 예를 들어, 내시경 등으로 병변 부위를 절제하는 경우, 병변 부위의 하부에 본 발명에 따른 조직 융기재를 주입하고 절제부위를 융기시킴으로써, 병변 부위의 절제를 용이하게 수행할 수 있다.
본 발명에서, 혈관 색전재라는 것은, 동맥 색전술에서 색전물질로 사용하기 위한 혈관내 색전 촉진용 보철재를 넓게 의미한다. 간장암이나 자궁 근종 등에서의 동맥 색전술에서, 본 발명에 따른 혈관 색전재를 병변부의 상류에 있는 동맥내에 주입하면, 혈액과 접촉하여 하이드로겔이 형성된다. 이로 인해, 종양으로의 영양의 공급로인 동맥을 막고 종양을 사멸시킬 수 있다.
본 발명에서 조직 재건재라는 것은, 재생 의료에서, 생체 내에서 조직을 재건하는 경우에 발판이 되는 재료를 넓게 의미한다. 예를 들어, 뼈의 재생에 있어서, 본 발명에 따른 조직 재건재를 주입하면, 뼈 형성을 수행하는 세포의 발판이 될 수 있으며, 뼈의 재생을 촉진하는 것을 수행할 수 있다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어는, 특정의 실시형태를 설명하기 위해 사용되는 것이며, 발명을 한정하려는 의도는 아니다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 "포함하는"이란 용어는, 문맥상 분명히 다른 이해를 하여야 하는 경우를 제외하고, 기술된 사항(부재, 단계, 요소, 숫자 등)이 존재하는 것을 의도하는 것이며, 그 이외의 사항(부재, 단계, 요소, 숫자 등)이 존재하는 것을 배제하지 않는다.
다른 정의가 없는 한, 여기에 사용되는 모든 용어 (기술용어 및 과학 용어를 포함함)은 본 발명이 속하는 기술의 당업자에 의해 널리 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 여기에 사용되는 용어는, 다른 정의가 명시되어 있지 않는 한, 본 명세서 및 관련 기술분야에서의 의미에 부합하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 이상화되거나 또는 과도하게 형식적인 의미에서 해석되어야 하는 것은 아니다.
첫번째, 두번째 등의 용어가 다양한 요소를 표현하기 위해 사용되는 경우가 있으나, 이들 요소는 그 용어에 의해 한정되어서는 안된다 것은 이해될 것이다. 이들 용어는, 하나의 요소를 다른 요소와 구별하기 위해서만 사용되는 것이며, 예를 들어, 첫 번째 요소를 두 번째 요소라고 기술하고, 마찬가지로, 두 번째 요소는 첫 번째 요소로 기술하는 것은, 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 가능하다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하나, 그러나, 본 발명은 여러 가지 형태로 구현화할 수 있으며, 여기에 기재되는 실시예로 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서에서, 예를 들어 디시알로-BrAc이라고 나타낸 경우에는, 브로모아세틸화된 디시알로 당쇄를 나타낸다. 또한, 예를 들어, C(디시알로)-(RADA) 4로 나타낸 경우에는, RADARADARADARADA의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 N 말단에 디시알로 당쇄가 결합된 시스테인 잔기가 결합하고 있는 것을 나타내다.
실시예
(합성예 1) 말토헵타오스-BrAc의 합성
( 합성예 1-1) 아미노화
하기 식(11)로 표시되는 화합물 1 (상품명: 말토헵타오스, 도쿄카세이사 제) (53.2 mg, 46.1 μmol)을 물(5 mL)에 용해시켰다. 탄산수소나트륨(3.6 g)을 용액에 첨가하고, 37℃로 승온한 후 19시간 동안 교반하였다. 물을 첨가한 후, 감압 조건하에서 농축을 수회 수행하였다. 다시 물에 용해시켜 동결 건조하고, 하기 식(12)로 표시되는 화합물 2를 포함하는 동결 건조품을 얻었다.
[화학식 12]
Figure pct00016
식 (11)
[화학식 13]
Figure pct00017
식 (12)
( 합성예 1-2) 브로모아세틸화
합성예 1-1에서 수득한 화합물 2와 탄산나트륨(83.0 mg, 0.92 mmol, 화합물 2에 대해 20 당량)을 물에 용해하고 0℃로 냉각시켰다. 디클로로메탄에 용해된 브로모아세틸 브로마이드(40.0 μL, 0.46 mmol, 화합물 2에 대해 10 당량)을 서서히 적가하고 2시간 동안 교반하였다. 디클로로메탄 및 물을 사용하여 상분리하고, 수조에 브롬화수소산을 첨가하였다. 감압 조건하에서 물을 일부 농축하였다.
반응 용액을, HPLC [컬럼 : SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속 : 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 물, B : 아세토니트릴, 구배(gradient) A : B = 99.5 : 0.5 → 90:10, 15분, 직선농도 구배용출]을 이용하여 정제하고, 하기 식 (13)으로 표시되는 말토헵타오스-BrAc(26.7 mg, 20.9 μmol, 수율 46%)를 얻었다.
[화학식 14]
Figure pct00018
식 (13)
(합성예 2) 말토오스-BrAc의 합성
화합물 1의 대신에, 하기 식 (14)로 표시되는 화합물 3(상품명: 말토오스, 도쿄카세이사 제)(200 mg, 0.58 mmol)을 사용한 것 이외에는, 합성예 1과 동일한 방법으로 합성을 수행하여, 하기 식 (15)로 표현되는 말토오스-BrAc(179.1 mg, 수율 67%)을 얻었다.
[화학식 15]
Figure pct00019
식 (14)
[화학식 16]
Figure pct00020
식 (15)
( 합성예 3 ) 말토트리오스 - BrAc 의 합성
화합물 1의 대신에, 하기 식 (16)으로 표시되는 화합물 4(상품명: 말토트리오스, 도쿄카세이사 제)(100 mg, 198.6 μmol)을 사용한 것 이외에는 합성예 1과 동일한 방법으로 합성을 수행하여, 하기 식 (17)로 표시되는 말토트리오스-BrAc(58.2 mg, 수율 47%)를 얻었다.
[화학식 17]
Figure pct00021
식 (16)
[화학식 18]
Figure pct00022
식 (17)
( 합성예 4 ) 말토테트라오스 - BrAc 의 합성
화합물 1의 대신에, 하기 식 (18)로 표시되는 화합물 5(상품명: 말토테트라오스, 도쿄카세이사 제)(200 mg, 0.2 mmol)을 사용한 것 이외에는 합성예 1과 동일한 방법으로 합성을 수행하여, 하기 식 (19)로 표시되는 말토테트라오스-BrAc(133.1 mg, 수율 51%)를 얻었다.
[화학식 19]
Figure pct00023
식 (18)
[화학식 20]
Figure pct00024
식 (19)
( 합성예 5 ) β- 사이클로덱스트린 - BrAc 의 합성
화합물 1의 대신에, 하기 식 (20)으로 표시되는 화합물 6(상품명: 3A-아미노 -3A-데옥시-(2AS, 3AS)-β-사이클로덱스트린 수화물, 도쿄카세이사 제)(101.5 mg, 89.5 μmol)을 사용한 것 이외에는 합성예 1-2과 동일한 방법으로 합성을 수행하여, 하기 식 (21)로 표시되는 β-사이클로덱스트린-BrAc (31.2 mg, 수율 28%)를 얻었다.
[화학식 21]
Figure pct00025
식 (20)
[화학식 22]
Figure pct00026
식 (21)
( 합성예 6 ) γ- 사이클로덱스트린 - BrAc 의 합성
화합물 1의 대신에, 하기 식 (22)로 표시되는 화합물 7(상품명: 3A-아미노 -3A-데옥시-(2AS, 3AS)-γ-사이클로덱스트린 수화물, 도쿄카세이사 제)(100.0 mg, 77.1 μmol)을 사용한 것 이외에는 합성예 1-2과 동일한 방법으로 합성을 수행하여, 하기 식 (23)으로 표시되는 γ-사이클로덱스트린-BrAc(41.1 mg, 수율 38%)를 얻었다.
[화학식 23]
Figure pct00027
식 (22)
[화학식 24]
Figure pct00028
식 (23)
( 합성예 7 ) 디시알로 -BrAc 의 합성
WO2005/010053호에 기재된 방법과 동일한 방법으로 합성을 수행하여, 하기 식 (25)로 표시되는 디시알로-BrAc를 얻었다.
[화학식 25]
Figure pct00029
식 (25)
( 합성예 8 ) 아시알로 - BrAc 의 합성
WO2005/010053에 기재된 방법과 동일한 방법으로 합성을 수행하여, 하기 식 (27)로 표시되는 아시알로-BrAc를 얻었다.
[화학식 26]
Figure pct00030
식 (27)
( 합성예 9 ) 디GlcNAc - BrAc 의 합성
WO2005/010053에 기재된 방법과 동일한 방법으로 합성을 수행하여, 하기 식(29)로 표시되는 디GlcNAc-BrAc를 얻었다.
[화학식 27]
Figure pct00031
식 (29)
( 합성예 10 ) 디 Man ( DiMan ) - BrAc 의 합성
WO2005/010053에 기재된 방법과 동일한 방법으로 합성을 수행하여, 하기 식 (31)로 표시되는 디Man(DiMan)-BrAc를 얻었다.
[화학식 28]
Figure pct00032
식 (31)
( 합성예 11 ) GlcNAc - BrAc 의 합성
WO2005/010053에 기재된 방법과 동일한 방법으로 합성을 수행하여, 하기 식 (33)으로 표시되는 GlcNAc-BrAc를 얻었다.
[화학식 29]
Figure pct00033
식 (33)
(합성예 12) DiBn-디시알로-BrAc의 합성
디시알로-BrAc(28.9 mg, 12.3 μmol)에 DMF(0.58 mL), 브롬화 리튬 (21.5 mg, 248 μmol), 브롬화벤질(14.6 μL, 122 μmol)을 순차적으로 첨가하고, 30℃에서 20시간 반응시켰다. 브롬화벤질(14.6 μL, 122 μmol)을 추가로 첨가하여 20시간 동안 반응시켰다. 반응액에 톨루엔(30 mL)을 첨가하고 원심분리(10,000 x g, 10분간)한 후, 침전물을 물(100 μL)에 용해하여 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 8.0 mL/분, 전개 용매 물 : 아세토니트릴 = 95 : 5 → 70 : 30, 20분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (35)로 표시되는 DiBn-디시알로-BrAc (7.6 mg, 수율 24%)를 얻었다.
[화학식 30]
Figure pct00034
식 (35)
MALDI-MS : (m/z) calcd for C100H152BrN7O62: [M+Na]+ 2544.8, found: 2544.4.
( 합성예 13 ) C( 디시알로 ) -( RADA ) 4 의 합성
( 합성 예 13-1 ) Ac - C ( RADA ) 4 -NH 2 의 합성
고상 합성용 컬럼에 Rink amide PEGA 수지(100 μmol)를 넣고, DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, Fmoc-Ala-OH(124.5 mg, 400 μmol)과 1-비스디메틸아미노 메틸렌-5-클로로-1H-벤조트리아졸륨 3-옥사이드헥사플루오로포스페이트 (HCTU) (157.2 mg, 380 μmol)와 디이소프로필에틸아민(DIPEA)(104.5 μL, 600 μmol)의 DMF(2.5 mL) 용액을 첨가하고 15분간 진탕하였다. 디클로로메탄 및 DMF로 세정한 후, Fmoc 보호기를, DMF중의 20% 피페리딘으로 처리하여 제거하였다. DMF로 세척한 후 Prelude(상표) 펩티드 합성기를 이용하여 Fmoc 법에 의한 펩티드 고상 합성법으로 보호된 하기 식(36)으로 표시되는 수지에 결합된 상태에 있는 폴리펩티드 (서열번호 4)를 합성하였다. 축합 반응은 축합제로서 HCTU을 사용하여 DMF 중에서 수행하였다.
[화학식 31]
Figure pct00035
식 (36)
Fmoc 보호기를 DMF 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, 무수 아세트산 및 피리딘을 첨가하여 1시간 진탕하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세정한 후, 트리플루오로 아세트산(TFA): 물: 트리이소 프로필실란: 에탄디티올(= 90 : 2.5 : 5 : 2.5)을 첨가하고 4시간 동안 실온에서 진탕하였다. 수지를 여과하여 제거하고 여액에 냉각한 디에틸에테르를 첨가하고 조 펩타이드(crude peptide)를 침전으로 얻었다. 조 펩티드의 일부를 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속 : 7.0 L/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 88 : 12 → 78 : 22%, 11분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하여, 하기 식 (37)로 표시되는 폴리펩티드(서열번호 5) (32.7 mg)를 얻었다.
[화학식 32]
Figure pct00036
식 (37)
( 합성예 13-2) 티올의 당쇄 수식 반응
합성예 13-1에 기재된 방법으로 얻어진 폴리펩티드(서열번호 5)(20.5 mg, 11.2 μmol)과, 합성예 7에서 합성한 디시알로-BrAc(66.0 mg, 28.0 μmol, 펩티드 1에 대해 2.5 당량)을 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는 0.2 M 인산 완충액(pH 7.3, 3.7 mL)에 용해하여 실온에서 4시간 반응시켰다.
반응용액을, HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A: 0.1% TFA 물, B: 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 90 : 10 → 75 : 25, 15분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (38)로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체(서열번호 6)( 23.8 mg, 5.83 μmol, 수율 52%)를 얻었다.
[화학식 33]
Figure pct00037
식 (38)
ESI-MS: (m/z) calcd for C121H203N35O62S: [M+2H]2+ 2040.5, [M+3H]3+ 1360.7, [M+4H]4+ 1020.7, found: 2040.4, 1360.6, 1020.7.
( 합성예 14 ) C( 아시알로 ) -( RADA ) 4 의 합성
합성예 13-1에서 합성한 폴리펩티드(서열번호 5)(22.7 mg, 12.5 μmol)와, 합성예 8에서 합성한 아시알로-BrAc(55.0 mg, 31.2 μmol, 펩티드 1에 대해 2.5 당량)을 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.3, 4.7 mL)에 용해시키고 실온에서 3시간 동안 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A: 0.1% TFA 물, B: 0.09 % TFA/100% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 90 : 10 → 75 : 25, 18분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 식 (39)로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체(서열번호 7)(20.5 mg, 5.86 μmol, 수율 47%)를 얻었다.
[화학식 34]
Figure pct00038
식 (39)
ESI-MS: (m/z) calcd for C133H223N35O72S: [M+2H]2+ 1749.2, [M+3H]3+ 1166.5, [M+4H]4+ 875.1, found: 1749.3, 1166.2, 874.9.
( 합성예 15) C( 디GlcNAc )-( RADA ) 4의 합성
합성예 13-1에서 합성한 폴리펩티드(서열번호 5)(25.3 mg, 13.9 μmol)과, 합성예 9에서 합성한 디GlcNAc-BrAc(30.0 mg, 20.9 μmol, 펩타드 1에 대해 1.5 당량)을 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.3, 4.7 mL)에 용해시키고, 실온에서 3 시간 동안 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A: 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 88 : 12 → 81 : 19, 10분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 식 (40)으로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체(서열번호 8)( 23.9 mg, 7.53 μmol, 수율 54%)를 얻었다.
[화학식 35]
Figure pct00039
식 (40)
ESI-MS: (m/z) calcd for C121H203N35O62S: [M+2H]2+ 1587.1, [M+3H]3+ 1058.4, [M+4H]4+ 794.0, found: 1586.7, 1058.1, 793.8.
( 합성예 16 ) C( 디 Man ) -( RADA ) 4 의 합성
합성예 13-1에서 합성한 폴리펩타드(서열번호 5) (15.2 mg, 8.37 μmol)와, 합성예 10에서 합성한 디Man-BrAc(21.5 mg, 20.9 μmol, 펩티드 1에 대go 2.5 당량)을 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는 0.2 M 인산 완충액 (pH 7. 2, 3.1 mL)에 용해시키고, 실온에서 2시간 동안 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5μm), φ 20 x 250mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물 B: 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 90 : 10 → 75 : 25, 15분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 식 (41)로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체(서열번호 9)(16.9 mg, 6.11 μmol, 수율 73%)를 얻었다.
[화학식 36]
Figure pct00040
식 (41)
ESI-MS: (m/z) calcd for C121H203N35O62S: [M+2H]2+ 1383.9, [M+3H]3+ 922.9, [M+4H]4+ 629.5, found: 1383.6, 922.7, 692.3.
( 합성예 17 ) C( GlcNAc ) -( RADA ) 4 의 합성
합성예 13-1에서 합성한 폴리펩티드(서열번호 5) (14.9 mg, 8.21 μmol)와, 합성예 11에서 합성한 GlcNAc-BrAc(5.6 mg, 16.4 μmol, 펩티드 1에 대해 2.0 당량)을 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.3, 3.1 mL)에 용해시키고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [칼럼 : SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5μm), φ 20 x 250 mm, 유속 : 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물 B : 0.09 % TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 95 : 5 → 5 : 95, 15분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 식 (42)로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체(서열번호 10)( 15.4 mg, 7.42 μmol, 수율 90%)를 얻었다.
[화학식 37]
Figure pct00041
식 (42)
ESI-MS: (m/z) calcd for C79H134N32O32S: [M+2H]2+ 1039.1, [M+3H]3+ 693.1, [M+4H]4+ 520.0, found: 1039.0, 692.6, 520.0.
( 합성예 18 ) C( 말토헵타오스 ) -( RADA ) 4 의 합성
합성예 13-1에서 합성한 폴리펩티드 (서열번호 5) (9.3 mg, 5.12 μmol)와 합성예 1에서 합성한 말토헵타오스-BrAc (9.8 mg, 7.68 μmol, 펩티드 1에 대해 1.5 당량)을 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.3, 3.1 mL)에 용해시키고 실온에서 4시간 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물 B: 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 88 : 12 → 72 : 28, 16분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 식 (43)으로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체(서열번호 11)(5.1 mg, 1.70 μmol, 수율 33%)를 얻었다.
[화학식 38]
Figure pct00042
식 (43)
ESI-MS: (m/z) calcd for C113H191N31O62S: [M+2H]2+ 1505.0, [M+3H]3+ 1003.7, found: 1504.6, 1003.4.
( 합성예 19 ) C(β- 사이클로덱스트린 ) -( RADA ) 4 의 합성
합성예 13-1에서 합성한 폴리펩티드(서열번호 5)(17.7 mg, 9.75 μmol)와, 합성예 5에서 합성한 β-사이클로덱스트린-BrAc(36.7 mg, 29.2 μmol, 펩티드 1에 대해 3.0 당량)을 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.3, 3.3 mL)에 용해시키고, 실온에서 24시간 동안 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A: 0.1% TFA 물 B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 88 : 12 → 72 : 28, 16분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (44)로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체 (서열번호 12)( 6.8 mg, 2.27 μmol, 수율 23%)를 얻었다.
[화학식 39]
Figure pct00043
식 (44)
ESI-MS: (m/z) calcd for C113H189N31O61S: [M+2H]2+ 1496.0, [M+3H]3+ 997.7, [M+4H]4+ 748.5, found: 1495.6, 997.7, 748.3.
( 합성예 20 ) C(γ- 사이클로덱스트린 ) -( RADA ) 4 의 합성
합성예 13-1에서 합성한 폴리펩티드(서열번호 5)(16.0 mg, 8.81 μmol)와, 합성예 6에서 합성한 γ-사이클로덱스트린-BrAc(36.7 mg, 25.9 μmol, 펩티드 1에 대해 3.0 당량)을 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는 0.2 M 인산 완충액(pH 7.3, 3.0 mL)에 용해시키고 실온에서 5시간 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물 B: 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 90 : 10 → 5 : 95, 15분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (45)로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체(서열번호 13)( 6.0 mg, 1.90 μmol, 수율 22%)를 얻었다.
[화학식 40]
Figure pct00044
ESI-MS: (m/z) calcd for C119H199N31O66S: [M+2H]2+ 1577.1, [M+3H]3+ 1051.7, [M+4H]4+ 789.0, found: 1576.7, 1051.4, 788.8.
( 합성예 21) C( 디시알로 )-( RADA ) 5의 합성
( 합성예 21-1) Ac-C( RADA ) 5-NH 2 의 합성
고상 합성용 컬럼에 Rink amide PEGA 수지(100 μmol)를 넣고, DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, Fmoc-Ala-OH(124.5 mg, 400 μmol)와 HCTU(157.2 mg, 380 μmol)와 DIPEA(104.5 μL, 600 μmol)의 DMF (2.5 mL) 용액을 첨가하고 15분간 진탕하였다. 디클로로메탄 및 DMF로 세척한 후, Fmoc 보호기를 DMF 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 제거하였다. DMF로 세척한 후 Prelude(상표) 펩티드 합성기를 이용하여, Fmoc 법에 의한 펩티드 고상 합성법으로 보호된 하기 식 (46)으로 표시되는 수지에 결합한 상태의 폴리펩티드(서열번호 14)를 합성하였다. 축합반응은 축합제로 HCTU를 사용하여 DMF 중에서 수행하였다.
[화학식 41]
Figure pct00045
식 (46)
Fmoc 보호기를 DMF 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, 무수 아세트산 및 피리딘을 첨가하여 1시간 진탕하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, TFA : 물 : 트리이소프로필실란 : 에탄디티올 (= 90 : 2.5 : 5 : 2.5)을 첨가하고, 4시간 동안 실온에서 진탕하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 여액에 냉각한 디에틸에테르를 첨가하고, 조 펩티드를 침전으로 얻었다. 조 펩티드의 일부를 HPLC [칼럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 88 : 12 → 78 : 22%, 11분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (47)로 표시되는 화합물 폴리펩티드 (서열번호 15) (32.7 mg)를 얻었다.
[화학식 42]
Figure pct00046
식 (47)
( 합성예 21-2) 티올의 당쇄 수식 반응
합성예 21-1에서 합성된 폴리펩티드(서열번호 15)(13.9 mg, 6.24 μmol)와, 합성예 7에서 합성된 디시알로-BrAc (36.5 mg, 15.6 μmol, 펩티드 1에 대해 2.5 당량)을 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.3, 2.1 mL)에 용해시키고 실온에서 3시간 동안 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [컬럼 : SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B: 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 90 : 10 → 75 : 25, 15분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (48)로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체(서열번호 16) (7.8 mg, 1.74 μmol, 수율 28%)를 얻었다.
[화학식 43]
Figure pct00047
식 (48)
ESI-MS: (m/z) calcd for C171H284N44O94S: [M+3H]3+ 1498.5, [M+4H]4+ 1124.1, [M+5H]5+ 899.5, found: 1498.6, 1123.9, 899.4.
( 합성예 22) C( 아시알로 )-( RADA ) 5의 합성
합성예 21-1에서 합성된 폴리펩티드(서열번호 15) (18.8 mg, 8.43 μmol)와, 합성예 8에서 합성된 아시알로-BrAc(44.5 mg, 25.3 μmol, 펩티드 1에 대해 3.0 당량)을 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.2, 2.8 mL)에 용해시키고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 90 : 10 → 75 : 25, 15분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (49)로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체 (서열번호 17) (16.0 mg, 4.09 μmol, 수율 49%)를 얻었다.
[화학식 44]
Figure pct00048
식 (49)
ESI-MS: (m/z) calcd for C149H250N42O78S: [M+2H]2+ 1955.9, [M+3H]3+ 1304.3, [M+4H]4+ 978.5, found: 1955.8, 1304.2, 978.2.
( 합성예 23) C( 디GlcNAc )-( RADA ) 5의 합성
합성예 21-1에서 합성된 폴리펩티드(서열번호 15)(19.4 mg, 8.70 μmol)와, 합성예 9에서 합성된 디GlcNAc-BrAc(20.0 mg, 21.7 μmol, 펩티드 1에 대해 2.5 당량)을 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는, 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.2, 3.1 mL)에 용해시키고, 실온에서 2시간 동안 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [컬럼 : SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA, 물 B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 95 : 5 → 60 : 40, 20분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (50)으로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체 (서열번호 18)(16.8 mg, 4.69 μmol, 수율 54%)를 얻었다.
[화학식 45]
Figure pct00049
식 (50)
ESI-MS: (m/z) calcd for C149H250N42O78S: [M+3H]3+ 1196.2, [M+4H]4+ 897.4, found: 1195.9, 897.2.
( 합성예 24) C( GlcNAc )-( RADA ) 5의 합성
합성예 21-1에서 합성된 폴리펩티드 (서열번호 15) (18.8 mg, 8.43 μmol)와, 합성예 11에서 합성된 GlcNAc-BrAc(8.7 mg, 25.3 μmol, 펩티드 1에 대해 3.0 당량)을 7 M 구아니딘, 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.2, 4.2 mL)에 용해시키고, 실온에서 1시간 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 95 : 5 → 5 : 95, 15분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (51)으로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체 (서열번호 19) (14.9 mg, 5.99 μmol, 수율 71%)를 얻었다.
[화학식 46]
Figure pct00050
식 (51)
ESI-MS: (m/z) calcd for C95H161N39O38S: [M+2H]2+ 1245.8, [M+3H]3+ 830.9, [M+4H]4+ 623.4, found: 1245.1, 830.8, 623.3.
( 합성예 25) C( DiBn - 디시알로 ) - ( RADA ) 5의 합성
합성예 21-1에서 합성한 폴리펩티드(서열번호 15)(20.7 mg, 9.29 μmol)와, 합성예 12에서 합성한 DiBn-디시알로-BrAc(58.6 mg, 23.2 μmol, 펩티드 1에 대해 2.5 당량)을 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.3, 3.2 mL)에 용해시키고, 실온에서 1 시간 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 85 : 15 → 73 : 27, 17분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (52)로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체 (서열번호 20) (7.5 mg, 1.61 μmol, 수율 17%)를 얻었다.
[화학식 47]
Figure pct00051
식 (52)
ESI-MS: (m/z) calcd for C185H296N44O94S: [M+3H]3+ 1558.6, [M+4H]4+ 1169.2, [M+5H]5+ 935.5, found: 1558.4, 1169.0, 925.6.
( 합성예 26 ) C( PEG2000 ) -( RADA ) 5의 합성
합성예 21-1에서 합성한 폴리펩티드(서열번호 15)(15.9 mg, 7.13 μmol)와, 하기 식(53)으로 표시되는 화합물(말레이미드화된 PEG, 상품명: SUNBRIGHT (상표) ME-020MA, 평균분자량 2333, 니치유(日油) 주식회사 제) (24.9 mg, 10.7 μmol, 펩티드 1에 대해 1.5 당량)를 8 M 구아니딘을 포함하는 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.3, 2.4 mL)에 용해시키고, 실온에서 1시간 반응시켰다.
[화학식 48]
Figure pct00052
식 (53)
반응용액을 HPLC [칼럼 : SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 75 : 25 → 40 : 60, 12분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (54)로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체 (서열번호 21) (10.9 mg, 2.39 μmol, 수율 34%)를 얻었다.
[화학식 49]
Figure pct00053
식 (54)
(합성예 27) C (아시알로)-(RATARAEA) 2의 합성
(합성예 27-1) Ac-C- (RATARAEA) 2-NH 2 의 합성
고상 합성용 컬럼에 Rink amide PEGA 수지 (100 μmol)를 넣고, DMF 및 디클로로 메탄으로 세척한 후, Fmoc-Ala-OH(124.5 mg, 400 μmol)와 HCTU(157.2 mg, 380 μmol)와 DIPEA(104.5 μL, 600 μmol)의 DMF(2.5 mL) 용액을 첨가하고 15분간 진탕하였다. 디클로로메탄 및 DMF로 세척한 후, Fmoc 보호기를 DMF 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 제거하였다. DMF로 세척한 후, Prelude(상표) 펩티드 합성기를 이용하여, Fmoc 법에 의한 펩티드 고상 합성법으로 보호된 하기 식(55)으로 표시되는 수지에 결합한 상태에 있는 폴리펩티드(서열번호 22)를 합성하였다. 축합반응은 축합제로서 HCTU을 사용하여 DMF 중에서 수행하였다.
[화학식 50]
Figure pct00054
식 (55)
Fmoc 보호기를, DMF 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, 무수 아세트산 및 피리딘을 첨가하여 1시간 진탕하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, TFA : 물 : 트리이소프로필실란 : 에탄디티올 (= 90 : 2.5 : 5 : 2.5)을 첨가하고 4시간 동안 실온에서 진탕하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 여액에 냉각한 디에틸에테르를 첨가하고, 조펩티드를 침전으로 얻었다. 조 펩티드의 일부를 HPLC [컬럼 : SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속 : 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 88 : 12 → 78 : 22%,, 11분, 직선농도 구배 용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식(56)으로 표시되는 폴리펩티드(서열번호 23)(32 .7 mg)를 얻었다.
[화학식 51]
Figure pct00055
식 (56)
( 합성예 27-2) 티올의 당쇄 수식 반응
합성예 27-1에서 합성한 폴리펩티드(서열번호 23)(7.3 mg, 4.02 μmol)와, 합성예 8에서 합성한 아시알로-BrAc(17.7 mg, 16.5 μmol, 펩티드 1에 대해 1.5 당량)을 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.3, 1.3 mL)에 용해시키고, 실온에서 3시간 동안 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속 : 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 95 : 5 → 29 : 71, 11분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식(57)으로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체 (서열번호 24) (4.6 mg, 1.32 μmol, 수율 33%)를 얻었다.
[화학식 52]
Figure pct00056
식 (57)
ESI-MS: (m/z) calcd for C123H211N35O60S: [M+3H]3+ 1166.5, [M+4H]4+ 875.1, found: 1166.2, 875.1.
( 합성예 28) C( 디GlcNAc )-( RATARAEA ) 2의 합성
합성예 27-1에서 합성한 폴리펩티드(서열번호 23)(20.0 mg, 11.0 μmol)와, 합성예 7에서 합성한 디시알로-BrAc(23.7 mg, 16.5 μmol, 펩티드 1에 대해 1.5 당량)을 DMSO(0.9 mL)에 용해시켰다. 용액에 DIPEA(5.8 μL)를 첨가하고, 실온에서 15분간 반응시켰다.
반응용액에 증류수(4.0 mL)를 첨가하고, HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 90 : 10 → 29 : 71, 11분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (58)으로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체(서열번호 25)(23.9 mg, 7.53 μmol, 수율 68%)를 얻었다.
[화학식 53]
Figure pct00057
식 (58)
ESI-MS: (m/z) calcd for C123H211N35O60S: [M+3H]3+ 1058.4, [M+4H]4+ 794.0, found: 1057.8, 793.9.
( 합성예 29) RAC ( 아시알로 )-A-( RADA ) 3의 합성
(합성예 29-1) Ac-RACA-(RADA) 3-NH 2 의 합성
고상 합성용 컬럼에 Rink amide PEGA 수지(100 μmol)를 넣고, DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, Fmoc-Ala-OH(124.5 mg, 400 μmol)와 HCTU(157.2 mg, 380 μmol)와 DIPEA(104.5 μL, 600 μmol)의 DMF(2.5 mL) 용액을 첨가하고, 15분간 진탕하였다. 디클로로메탄 및 DMF로 세척한 후, Fmoc 보호기를 DMF 중의 20% 피페리 딘으로 처리하여 제거하였다. DMF로 세척한 후 Prelude(상표) 펩티드 합성기를 이용하여, Fmoc 법에 의한 펩티드 고상 합성법으로 보호된 하기 식 (59)으로 표시되는 수지에 결합한 상태의 폴리펩티드(서열번호 26)를 합성하였다. 축합반응은 축합제로서 HCTU을 사용하여 DMF 중에서 수행하였다.
[화학식 54]
Figure pct00058
식 (59)
Fmoc 보호기를, DMF 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, 무수 아세트산 및 피리딘을 첨가하여 1시간 진탕하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, TFA : 물 : 트리이소프로필실란 : 에탄디티올 (= 90 : 2.5 : 5 : 2.5)을 첨가하고, 4시간 동안 실온에서 진탕하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 여액에 냉각한 디에틸에테르를 첨가하고, 조 펩티드를 침전으로 얻었다. 조 펩티드의 일부를 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 88 : 12 → 78 : 22%, 11분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (60)으로 표시되는 폴리펩티드(서열번호 27)(32 .7 mg)를 얻었다.
[화학식 55]
Figure pct00059
식 (60)
( 합성예 29-2) 티올의 당쇄 수식 반응
합성예 29-1에서 합성한 폴리펩티드(서열번호 27)(14.1 mg, 8.29 μmol)와 합성예 8에서 합성한 아시알로-BrAc(36.0 mg, 20.7 μmol, 펩티드 1에 대해 2.5 당량)을 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.3, 2.6 mL)에 용해시키고, 실온에서 1시간 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 95 : 5 → 29 : 71, 11분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (61)으로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체(서열번호 28) (13 .4 mg, 3.96 μmol, 수율 48%)를 얻었다.
[화학식 56]
Figure pct00060
식 (61)
ESI-MS: (m/z) calcd for C129H218N34O69S: [M+2H]2+ 1691.7, [M+3H]3+ 1128.1, found: 1691.8, 1128.2.
( 합성예 30) RAC ( DiGlcNAc )-A-( RADA ) 3의 합성
합성예 29-1에서 합성한 폴리펩티드(서열번호 27)(10.1 mg, 5.94 μmol)와, 합성예 7에서 합성한 디시알로-BrAc(21.3 mg, 14.8 μmol, 펩티드 1에 대해 2.5 당량)을 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.3, 2.0 mL)에 용해시키고, 실온에서 4시간 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B: 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 90 : 10 → 75 : 25, 15분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (62)로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체(서열번호 29) (11 .9 mg, 3.89 μmol, 수율 66%)를 얻었다.
[화학식 57]
Figure pct00061
식 (62)
ESI-MS: (m/z) calcd for C117H198N34O59S: [M+2H]2+ 1529.5, [M+3H]3+ 1020.0, [M+4H]4+ 765.3, found: 1529.2, 1019.8, 765.1.
( 합성예 31) RC ( 아시알로 )-DA-( RADA ) 3의 합성
(합성예 31-1) Ac-RCDA-(RADA) 3-NH 2 의 합성
고상 합성용 컬럼에 Rink amide PEGA 수지(100 μmol)를 넣고, DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, Fmoc-Ala-OH(124.5 mg, 400 μmol)와 HCTU(157.2 mg, 380 μmol)와 DIPEA(104.5 μL, 600 μmol)의 DMF(2.5 mL) 용액을 첨가하고, 15분간 진탕하였다. 디클로로메탄 및 DMF로 세척한 후, Fmoc 보호기를 DMF 중의 20% 피페리 딘으로 처리하여 제거하였다. DMF로 세척한 후, Prelude(상표) 펩티드 합성기를 이용하여, Fmoc법에 의한 펩티드 고상 합성법으로 보호된 하기 식 (63)으로 표시되는 수지에 결합된 상태의 폴리펩티드(서열번호 30)를 합성하였다. 축합반응은 축합제로서 HCTU을 사용하여 DMF 중에서 수행하였다.
[화학식 58]
Figure pct00062
식 (63)
Fmoc 보호기를, DMF 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, 무수 아세트산 및 피리딘을 첨가하고 1시간 진탕하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, TFA : 물 : 트리이소프로필실란 : 에탄디티올(= 90 : 2.5 : 5 : 2.5)을 첨가하고, 4시간 동안 실온에서 진탕하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 여액에 냉각한 디에틸에테르를 첨가하고, 조펩티드를 침전으로 얻었다. 조펩티드의 일부를 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A: 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 88 : 12 → 78 : 22%, 11분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (64)로 표시되는 폴리펩티드(서열번호 31)(32 .7 mg)를 얻었다.
[화학식 59]
Figure pct00063
식 (64)
( 합성예 31-2) 티올의 당쇄 수식 반응
합성예 31-1에서 합성한 폴리펩티드(서열번호 31)(14.8 mg, 8.48 μmol)와, 합성예 8에서 합성한 아시알로-BrAc(37.4 mg, 21.2 μmol, 펩티드 1에 대해 2.5 당량)을 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.3, 2.8 mL)에 용해시키고, 실온에서 2시간 동안 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 95 : 5 → 29 : 71, 11분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (65)로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체(서열번호 32) (21.7 mg, 6.34 μmol, 수율 75%)를 얻었다.
[화학식 60]
Figure pct00064
식 (65)
ESI-MS: (m/z) calcd for C130H218N34O71S: [M+2H]2+ 1713.7, [M+3H]3+ 1142.8, [M+4H]4+ 857.3, found: 1713.7, 1142.5, 857.1.
( 합성예 32) RC ( 디GlcNAc )-DA-( RADA ) 3의 합성
합성예 31-1에서 합성한 폴리펩티드(서열번호 31)(11.0 mg, 6.30 μmol)와, 합성예 9에서 합성한 디GlcNAc-BrAc(22.6 mg, 15.7 μmol, 펩티드 1에 대해 2.5 당량)을 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는 0.2 M 인산 완충액(pH 7.3, 2.1 mL)에 용해시키고, 실온에서 3시간 동안 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 90 : 10 → 75 : 25, 15분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (66)으로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체(서열번호 33)(19 .0 mg, 6.12 μmol, 수율 97%)를 얻었다.
[화학식 61]
Figure pct00065
식 (66)
ESI-MS: (m/z) calcd for C118H198N34O61S: [M+2H]2+ 1551.6, [M+3H]3+ 1034.7, [M+4H]4+ 776.3, found: 1551.2, 1034.5, 776.1.
(합성예 33) C (아시알로)-ADA-(RADA) 3의 합성
( 합성예 33-1) Ac- CADA -( RADA ) 3-NH 2 의 합성
고상 합성용 컬럼에 Rink amide PEGA 수지(100 μmol)를 넣고, DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, Fmoc-Ala-OH(124.5 mg, 400 μmol)와 HCTU(157.2 mg, 380 μmol)와 DIPEA(104.5 μL, 600 μmol)의 DMF(2.5 mL) 용액을 첨가하고, 15분간 진탕하였다. 디클로로메탄 및 DMF로 세척한 후, Fmoc 보호기를 DMF 중의 20% 피페리 딘으로 처리하여 제거하였다. DMF로 세척한 후, Prelude(상표) 펩티드 합성기를 이용하여, Fmoc법에 의한 펩티드 고상 합성법으로 보호된 하기 식 (67)로 표시되는 수지에 결합된 상태의 폴리펩티드(서열번호 34)를 합성하였다. 축합반응은 축합제로서 HCTU을 사용하여 DMF 중에서 수행하였다.
[화학식 62]
Figure pct00066
식 (67)
Fmoc 보호기를, DMF 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, 무수 아세트산 및 피리딘을 첨가하고, 1시간 진탕하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, TFA : 물 : 트리이소프로필실란 : 에탄디티올(= 90 : 2.5 : 5 : 2.5)을 첨가하고, 4시간 동안 실온에서 진탕하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 여액에 냉각한 디에틸에테르를 첨가하고, 조 펩티드를 침전으로 얻었다. 조 펩티드의 일부를 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개용매 A : 0.1% TFA 물, B: 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 88 : 12 → 78 : 22%, 11분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (68)로 표시되는 폴리펩티드(서열번호 35)(32 .7 mg)를 얻었다.
[화학식 63]
Figure pct00067
식 (68)
( 합성예 33-2) 티올의 당쇄 수식 반응
합성예 33-1에서 합성한 폴리펩티드(서열번호 35)(13.0 mg, 7.83 μmol)와, 합성예 8에서 합성한 아시알로-BrAc(34.5 mg, 19.6 μmol, 펩티드 1에 대해 2.5 당량)을 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.3, 2.6 mL)에 용해시키고, 실온에서 2시간 동안 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 95 : 5 → 29 : 71, 11분, 직선농도 구배용출]을 이용하여 정제하고, 하기 식 (69)로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체(서열번호 36) (15 .2 mg, 4.55 μmol, 수율 58%)를 얻었다.
[화학식 64]
Figure pct00068
식 (69)
ESI-MS: (m/z) calcd for C127H211N31O71S: [M+2H]2+ 1671.1, [M+3H]3+ 1114.4, [M+4H]4+ 836.1, found: 1671.2, 1114.1, 835.8.
( 합성예 34) C( 디GlcNAc )-ADA-( RADA ) 3의 합성
합성예 33-1에서 합성된 폴리펩티드(9.9 mg, 5.96 μmol)와, 합성예 9에서 합성한 디GlcNAc-BrAc(21.4 mg, 15.7 μmol, 펩티드 1에 대해 2.5 당량)를 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.3, 2.1 mL)에 용해시키고, 실온에서 4시간 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 90 : 10 → 75 : 25, 15분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (70)으로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체(서열번호 37)(10.9 mg, 3.61 μmol, 수율 61%)를 얻었다.
[화학식 65]
Figure pct00069
식 (70)
ESI-MS: (m/z) calcd for C115H191N31O61S: [M+2H]2+ 1509.0, [M+3H]3+ 1006.3, [M+4H]4+ 755.0, found: 1508.7, 1006.1, 754.9.
( 합성예 35) 2C(말토오스)-( RADA ) 4의 합성
(합성예 35-1) Ac-2C-(RADA) 4-NH 2 의 합성
고상 합성용 컬럼에 Rink amide PEGA 수지(100 μmol)를 넣고, DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, Fmoc-Ala-OH(124.5 mg, 400 μmol)와 HCTU(157.2 mg, 380 μmol)와 DIPEA(104.5 μL, 600 μmol)의 DMF(2.5 mL) 용액을 첨가하고, 15분간 진탕하였다. 디클로로메탄 및 DMF로 세척한 후, Fmoc 보호기를 DMF 중의 20% 피페리 딘으로 처리하여 제거하였다. DMF로 세척한 후, Prelude(상표) 펩티드 합성기를 이용하여, Fmoc법에 의한 펩티드 고상 합성법으로 보호된 하기 식 (71)로 표시되는 수지에 결합된 상태의 폴리펩티드(서열번호 38)를 합성하였다. 축합반응은 축합제로서 HCTU를 사용하여 DMF 중에서 수행하였다.
[화학식 66]
Figure pct00070
식 (71)
Fmoc 보호기를, DMF 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, 무수 아세트산 및 피리딘을 첨가하고 1시간 진탕하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, TFA : 물 : 트리이소프로필실란 : 에탄디티올(= 90 : 2.5 : 5 : 2.5)을 첨가하고, 4시간 동안 실온에서 진탕하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 여액에 냉각한 디에틸에테르를 첨가하고, 조 펩티드를 침전으로 얻었다. 조펩티드의 일부를 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 90 : 10 → 75 : 25%, 11분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (72)으로 표시되는 폴리펩티드(서열번호 39)를 얻었다.
[화학식 67]
Figure pct00071
식 (72)
(35-2) 티올의 당쇄 수식 반응
합성예 35-1에서 합성된 폴리펩티드(서열번호 39)(9.8 mg, 5.11 μmol)와, 합성예 2에서 합성된 말토오스-BrAc(11.8 mg, 54.6 μmol, 펩티드 1에 대해 5.0 당량)을 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.3, 1.7 mL)에 용해시키고 실온에서 1.5시간 동안 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [컬럼 : SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B: 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 90 : 10 → 75 : 25, 15분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (73)으로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체(서열번호 40)(9 .2 mg, 3.43 μmol, 수율 67%)를 얻었다.
[화학식 68]
Figure pct00072
식 (73)
ESI-MS: (m/z) calcd for C100H169N33O49S2: [M+2H]2+ 1341.9, [M+3H]3+ 894.9, [M+4H]4+ 671.4, found: 1341.6, 894.7, 671.3.
( 합성예 36) 2C( 말토트리오스 )-( RADA ) 4의 합성
합성예 35-1에서 합성한 폴리펩티드(서열번호 39)(17.5 mg, 9.12 μmol)와, 합성예 3에서 합성한 말토트리오스-BrAc(34.1 mg, 54.6 μmol, 펩티드 1에 대해 6.0 당량)을 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.3, 3.1 mL)에 용해시키고, 실온에서 1.5시간 동안 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 90 : 10 → 75 : 25, 15분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (74)로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체(서열번호 41)(19 .6 mg, 3.61 μmol, 수율 72%)를 얻었다.
[화학식 69]
Figure pct00073
식 (74)
ESI-MS: (m/z) calcd for C112H189N33O59S2: [M+2H]2+ 1504.0, [M+3H]3+ 1003.0, [M+4H]4+ 752.5, found: 1503.7, 1002.7, 752.3.
( 합성예 37) 2C( 말토테트라오스 )-( RADA ) 4의 합성
합성예 35-1에서 합성한 폴리펩티드(서열번호 39)(9.8 mg, 5.11 μmol)와, 합성예 4에서 합성한 말토테트라오스-BrAc(20.1 mg, 25.5 μmol, 펩티드 1에 대해 5.0 당량)을 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.3, 1.7 mL)에 용해시키고, 실온에서 2시간 동안 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 90 : 10 → 75 : 25, 15분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (75)로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체(서열번호 42)(10 .6 mg, 3.18 μmol, 수율 62%)를 얻었다.
[화학식 70]
Figure pct00074
식 (75)
ESI-MS: (m/z) calcd for C124H209N33O69S2: [M+2H]2+ 1666.2, [M+3H]3+ 1111.1, [M+4H]4+ 833.6, found: 1666.2, 1110.8, 833.3.
(합성예 38) 3C (말토오스)-(RADA) 4의 합성
(합성예 38-1) Ac-3C-(RADA) 4-NH 2 의 합성
고상 합성용 컬럼에 Rink amide PEGA 수지(100 μmol)를 넣고, DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, Fmoc-Ala-OH(124.5 mg, 400 μmol)와 HCTU(157.2 mg, 380μmol)와 DIPEA(104.5 μL, 600 μmol)의 DMF(2.5 mL) 용액을 첨가하고, 15분간 진탕하였다. 디클로로메탄 및 DMF로 세척한 후, Fmoc 보호기를 DMF 중의 20% 피페리 딘으로 처리하여 제거하였다. DMF로 세척한 후, Prelude(상표) 펩티드 합성기를 이용하여 Fmoc법에 의한 펩티드 고상 합성법으로 보호된 하기 식 (76)으로 표시되는 수지에 결합된 상태의 폴리펩티드 (서열번호 43)를 합성하였다. 축합반응은 축합제로서 HCTU를 사용하여 DMF 중에서 수행하였다.
[화학식 71]
Figure pct00075
식 (76)
Fmoc 보호기를, DMF 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, 무수 아세트산 및 피리딘을 첨가하고, 1시간 진탕하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, TFA : 물 : 트리이소프로필실란 : 에탄디티올 (= 90 : 2.5 : 5 : 2.5)을 첨가하고, 4시간 동안 실온에서 진탕하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 여액에 냉각한 디에틸에테르를 첨가하고, 조 펩티드를 침전으로 얻었다. 조 펩티드의 일부를 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 90 : 10 → 75 : 25%, 11분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (77)로 표시되는 폴리펩티드(서열번호 44)를 얻었다.
[화학식 72]
Figure pct00076
식 (77)
( 합성예 38-2) 티올의 당쇄 수식 반응
합성예 38-1에서 합성된 폴리펩티이드(서열번호 44)(15.0 mg, 7.42 μmol)와, 합성예 2에서 합성한 말토오스-BrAc(20.6 mg, 44.6 μmol, 펩티드 1에 대해 6.0 당량)을 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.3, 2.4 mL)에 용해시키고, 실온에서 3시간 동안 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 90 : 10 → 75 : 25, 15분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (78)로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체(서열번호 45) (16.1 mg, 5.09 μmol, 수율 69%)를 얻었다.
[화학식 73]
Figure pct00077
식 (78)
ESI-MS: (m/z) calcd for C117H197N35O61S3: [M+2H]2+ 1584.1, [M+3H]3+ 1056.4, [M+4H]4+ 792.6, found: 1583.7, 1056.1, 792.4.
( 합성예 39) ( RADA )2-C(말토오스)-( ARAD ) 2의 합성
( 합성예 39-1) Ac-( RADA )2-C-( ARAD ) 2-NH 2 의 합성
고상 합성용 컬럼에 Rink amide PEGA 수지(100 μmol)를 넣고, DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, Fmoc-Asp(OtBu)-OH(164.6 mg, 400 μmol)와 HCTU (157.2 mg, 380 μmol)와 DIPEA(104.5 μL, 600 μmol)의 DMF(2.5 mL) 용액을 첨가하고, 15분간 진탕하였다. 디클로로메탄 및 DMF로 세척한 후, Fmoc 보호기를 DMF 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 제거하였다. DMF로 세척한 후, Prelude (상표) 펩티드 합성기를 이용하여, Fmoc법에 의한 펩타이드 고상 합성법으로 보호된 하기 식(79)로 표시되는 수지에 결합된 상태의 폴리펩티드(서열번호 46)를 합성하였다. 축합반응은 축합제로서 HCTU를 사용하여 DMF 중에서 수행하였다.
[화학식 74]
Figure pct00078
식 (79)
Fmoc 보호기를 DMF 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, 무수 아세트산 및 피리딘을 첨가하고 1시간 진탕하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, TFA : 물 : 트리이소프로필실란 : 에탄디티올 (= 90 : 2.5 : 5 : 2.5)을 첨가하고, 4시간 동안 실온에서 진탕하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 여액에 냉각한 디에틸에테르를 첨가하고, 조펩티드를 침전으로 얻었다. 조 펩티드의 일부를 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 90 : 10 → 75 : 25%, 15분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (80)으로 표시되는 폴리펩티드(서열번호 47)를 얻었다.
[화학식 75]
Figure pct00079
식 (80)
( 합성예 39-2) 티올의 당쇄 수식 반응
합성예 39-1에서 합성한 폴리펩티드(서열번호 47)(15.4 mg, 8.48 μmol)와, 합성예 2에서 합성한 말토오스-BrAc(9.8 mg, 21.2 μmol, 펩티드 1에 대해 2.5 당량)을 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.3, 2.9 mL)에 용해시키고, 실온에서 3시간 동안 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 90 : 10 → 75 : 25, 15 분, 직선 농도 구배 용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식(81)로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체(서열번호 48)(17 .8 mg, 8.10 μmol, 수율 96%)를 얻었다.
[화학식 76]
Figure pct00080
식 (81)
ESI-MS: (m/z) calcd for C83H141N31O37S: [M+2H]2+ 1099.6, [M+3H]3+ 733.4, [M+4H]4+ 550.3, found: 1099.5, 733.0, 550.2.
( 합성예 40) ( RADA )2-C( 말토트리오스 )-( ARAD ) 2의 합성
합성예 39-1에서 합성한 폴리펩티드(서열번호 47)(14.8 mg, 8.15 μmol)와, 합성예 3에서 합성한 말토트리오스-BrAc(12.7 mg, 20.3 μmol, 펩티드 1에 대해 2.5 당량)을 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.3, 2.8 mL)에 용해시키고, 실온에서 3시간 동안 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 90 : 10 → 75 : 25, 15분, 직선농도 구배용출]을 이용하여 정제하고, 하기 식 (82)로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체(서열번호 49)(13 .8 mg, 5.85 μmol, 수율 72%)를 얻었다.
[화학식 77]
Figure pct00081
식 (82)
ESI-MS: (m/z) calcd for C89H151N31O42S: [M+2H]2+ 1180.2, [M+3H]3+ 787.1, [M+4H]4+ 590.6, found: 1180.5, 787.0, 590.8.
( 합성예 41) ( RADA )2-C( 말토테트라오스 )-( ARAD ) 2의 합성
합성예 39-1에서 합성한 폴리펩티드(서열번호 47)(14.0 mg, 7.71 μmol)와, 합성예 4에서 합성한 말토테트라오스-BrAc(15.2 mg, 20.3 μmol, 펩티드 1에 대해 2.5 당량)을 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.3, 2.6 mL)에 용해시키고, 실온에서 2.5시간 동안 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 90 : 10 → 75 : 25, 15분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (83)으로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체(서열번호 50)(14 .9 mg, 5.91 μmol, 수율 77%)를 얻었다.
[화학식 78]
Figure pct00082
식 (83)
ESI-MS: (m/z) calcd for C95H161N31O47S: [M+2H]2+ 1261.8, [M+3H]3+ 841.5, [M+4H]4+ 631.4, found: 1261.6, 841.4, 631.3.
( 합성예 42) C(말토오스)-( RADA ) 4-C(말토오스)의 합성
(합성예 42-1) Ac-C-(RADA) 4-C-NH 2 의 합성
고상 합성용 컬럼에 Rink amide PEGA 수지(100 μmol)를 넣고, DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, Fmoc-Cys(Trt)-OH(124.5 mg, 400 μmol)와 HCTU(157.2 mg, 380 μmol)과 2,4,6-트리메틸피리딘(79.3 μL, 600 μmol)의 DMF(2.5 mL) 용액을 첨가하고 1시간 진탕하였다. 디클로로메탄 및 DMF로 세척한 후, Fmoc 보호기를 DMF 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 제거하였다. DMF로 세척한 후, Prelude(상표) 펩티드 합성기를 이용하여, Fmoc법에 의한 펩티드 고상 합성법으로 보호된 하기 식 (84)으로 표시되는 수지에 결합된 상태의 폴리펩티드(서열번호 51)를 합성하였다. 축합반응은 축합제로서 HCTU를 사용하여 DMF 중에서 수행하였다.
[화학식 79]
Figure pct00083
식 (84)
Fmoc 보호기를, DMF 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, 무수 아세트산 및 피리딘을 첨가하고, 1시간 진탕하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, TFA : 물 : 트리이소프로필실란 : 에탄디티올 (= 90 : 2.5 : 5 : 2.5)을 첨가하고, 4시간 동안 실온에서 진탕하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 여액에 냉각한 디에틸에테르를 첨가하고, 조 펩티드를 침전으로 얻었다. 조 펩티드의 일부를 HPLC [컬럼 : SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 90 : 10 → 75 : 25%, 15분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (85)로 표시되는 폴리펩티드(서열번호 52)를 얻었다.
[화학식 80]
Figure pct00084
식 (85)
( 합성예 42-2) 티올의 당쇄 수식 반응
합성예 42-1에서 합성한 폴리펩티드(서열번호 52)(14.7 mg, 7.66 μmol)와, 합성예 2에서 합성한 말토오스-BrAc(17.7 mg, 38.3 μmol, 펩티드 1에 대해 5 당량)을 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는 염산염, 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.3, 2.6 mL)에 용해시키고, 실온에서 2시간 동안 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 90 : 10 → 75 : 25, 15분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (86)으로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체(서열번호 53)(6.5 mg, 2.42 μmol, 수율 32%)를 얻었다.
[화학식 81]
Figure pct00085
식 (86)
ESI-MS: (m/z) calcd for C100H169N33O49S2: [M+2H]2+ 1341.9, [M+3H]3+ 894.9, [M+4H]4+ 671.4, found: 1341.5, 894.7, 671.3.
( 합성예 43) C( 말토트리오스 )-( RADA ) 4-C( 말토트리오스 )의 합성
합성예 42-1에서 합성한 폴리펩티드(서열번호 52)(13.9 mg, 7.24 μmol)와, 합성예 3에서 합성한 말토트리오스-BrAc(22.6 mg, 36.2 μmol, 펩티드 1에 대해 5 당량)을 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는 염산염, 0.2 M 인산 완충액(pH 7.3, 2.5 mL)에 용해시키고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 90 : 10 → 75 : 25, 15분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고 하기 식 (87)로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체(서열번호 54) (9.6 mg, 3.19 μmol, 수율 44%)를 얻었다.
[화학식 82]
Figure pct00086
식 (87)
ESI-MS: (m/z) calcd for C112H189N33O59S2: [M+2H]2+ 1504.1, [M+3H]3+ 1003.0, [M+4H]4+ 752.5, found: 1503.8, 1002.8, 752.4.
( 합성예 44) Ac-( RADA )4-C( 디GlcNAc )의 합성
( 합성예 44-1) Ac-( RADA )4-C-NH 2 의 합성
고상 합성용 컬럼에 Rink amide PEGA 수지(100 μmol)를 넣고, DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후 Fmoc-Cys(Trt)-OH(124.5 mg, 400 μmol)와 HCTU(157.2 mg, 380 μmol)과 2,4,6-트리메틸피리딘(79.3 μL, 600 μmol)의 DMF(2.5 mL) 용액을 첨가하고 1시간 진탕하였다. 디클로로메탄 및 DMF로 세정한 후, Fmoc 보호기를 DMF 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 제거하였다. DMF로 세척한 후 Prelude(상표) 펩타이드 합성기를 이용하여, Fmoc법에 의한 펩티드 고상 합성법으로 보호된 하기 식 (88)로 표시되는 수지에 결합된 상태의 폴리펩티드(서열번호 55)를 합성하였다. 축합반응은 축합제로서 HCTU를 사용하여 DMF 중에서 수행하였다.
[화학식 83]
Figure pct00087
식 (88)
Fmoc 보호기를 DMF 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, 무수 아세트산 및 피리딘을 첨가하고, 1시간 진탕하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, TFA : 물 : 트리이소프로필실란 : 에탄디티올 (= 90 : 2.5 : 5 : 2.5)을 첨가하고, 4시간 동안 실온에서 진탕하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 여액에 냉각한 디에틸에테르를 첨가하고, 조펩티드를 침전으로 얻었다. 조 펩티드의 일부를 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 90 : 10 → 75 : 25%, 15분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (89)로 표시되는 폴리펩티드(서열번호 56)를 얻었다.
[화학식 84]
Figure pct00088
식 (89)
( 합성예 44-2) 티올의 당쇄 수식 반응
합성예 44-1에서 합성한 폴리펩티드(서열번호 56)(15.1 mg, 8.31 μmol)와, 합성예 9에서 합성한 디GlcNAc(DiGlcNAc)-BrAc(29.8 mg, 20.8 μmol, 펩티드 1에 대해 2.5 당량)을 33 μM의 TCEP 및 8 M 구아니딘 염산염을 포함하는 0.2 M 인산 완충액(pH 7.3, 2.8 mL)에 용해시키고, 실온에서 3시간 동안 반응시켰다.
반응용액을 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 90 : 10 → 75 : 25, 15분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (90)으로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체(서열번호 57)(15.8 mg, 5.01 μmol, 수율 60%)를 얻었다.
[화학식 85]
Figure pct00089
식 (90)
ESI-MS: (m/z) calcd for C121H203N35O62S: [M+2H]2+ 1587.1, [M+3H]3+ 1058.4, [M+4H]4+ 794.0, found: 1586.7, 1058.1, 793.8.
( 합성예 45) Ac-N( 아시알로 )( RADA ) 4의 합성
( 합성예 45-1) Fmoc -( RADA ) 4-레진의 합성
고상 합성용 컬럼에 Rink amide PEGA 수지(100 μmol)를 넣고, DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, Fmoc-Ala-OH(124.5 mg, 400 μmol)과 HCTU(157.2 mg, 380 μmol)와 DIPEA(104.5 μL, 600 μmol)의 DMF(2.5 mL) 용액을 첨가하고, 15분간 진탕하였다. 디클로로메탄 및 DMF로 세척한 후, Fmoc 보호기를 DMF 중의 20% 피페리 딘으로 처리하여 제거하였다. DMF로 세척한 후, Prelude (상표) 펩티드 합성기를 이용하여, Fmoc법에 의한 펩티드 고상 합성법으로 보호된 하기 식 (91)로 표시되는 수지에 결합한 상태의 폴리펩티드(서열번호 58)를 합성하였다. 축합반응은 축합제로서 HCTU를 사용하여 DMF 중에서 수행하였다.
[화학식 86]
Figure pct00090
식 (91)
( 합성예 45-2 ) 수지상 에서 의 당쇄 축합반응
합성예 45-1에서 합성한 수지에 결합한 상태의 폴리펩티드(10 μmol)의 Fmoc 보호기를 DMF 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, 하기 식 (92)로 표시되는 Fmoc-Asn(아시알로)-OH(29.8 mg, 15 μmol), DMF-DMSO(1/1, v/v, 433 μL), O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸 우로늄 테트라플루오로보레이트(TBTU)(6.4 mg, 30 μmol), DIPEA(5.2 μL, 30 μmol)을 순차적으로 첨가하여 밤새도록 진탕하였다.
DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, Fmoc 보호기를, DMF 중의 20% 피페리 딘으로 처리하여 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, 아세트산(2.86 μL, 50 μmol)와 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)(6.8 mg, 50 μmol)과 N,N'-디이소 프로필카르보디이미드(DIC)(7.3 μL, 50 μmol)의 DMF(500 μL) 용액을 첨가하고, 1시간 진탕하였다.
[화학식 87]
Figure pct00091
식 (92)
DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, TFA : 물 : 트리이소프로필실란(= 95 : 2.5 : 2.5)을 첨가하고, 4시간 동안 실온에서 진탕하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 여액에 냉각한 디에틸에테르를 첨가하고, 조 펩티드를 침전으로 얻었다. 조 펩티드의 일부를 HPLC [컬럼 : SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속: 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 90 : 10 → 75 : 25%, 15분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고 하기 식 (93)으로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체(서열번호 59) (5.5 mg)를 얻었다.
[화학식 88]
Figure pct00092
식 (93)
ESI-MS: (m/z) calcd for C132H221N35O72: [M+2H]2+ 1726.2, [M+3H]3+ 1151.1, [M+4H]4+ 863.6, found: 1726.0, 1150.8, 863.4.
합성예 46 Ac-N( 디GlcNAc )( RADA ) 4의 합성
합성예 45-1에서 합성한 수지에 결합한 상태의 폴리펩티드(32.1 μmol)의 Fmoc 보호기를 DMF 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 제거하였다. DMF 및 디클로로 메탄으로 세척한 후 하기 식 (94)로 표시되는 Fmoc-Asn(디GlcNAc)-OH(79.5 mg, 15μmol), DMSO-DMF(1/1, v/v, 2.5 mL), TBTU(20.6 mg, 96.3 μmol), DIPEA(17.2 μL, 96.3 μmol)를 순차적으로 첨가하고, 2시간 동안 진탕하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, Fmoc 보호기를 DMF 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, 아세트산(9.2 μL, 160.5 μmol)과 HOBt (21.6 mg, 160.5 μmol)와 DIC(25.1 μL, 160.5 μmol)의 DMF(2 mL)용액을 첨가하고 1 시간 동안 진탕하였다.
[화학식 89]
Figure pct00093
식 (94)
DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후, TFA : 물 : 트리이소프로필실란(= 95 : 2.5 : 2.5)을 첨가하고, 4시간 동안 실온에서 진탕하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 여액에 냉각한 디에틸에테르를 첨가하고, 조펩티드를 침전으로 얻었다. 조펩티드의 일부를 HPLC [컬럼: SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm, 유속 : 7.0 mL/분, 전개 용매 A : 0.1% TFA 물, B : 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A : B = 90 : 10 → 75 : 25%, 15분, 직선농도 구배용출]을 사용하여 정제하고, 하기 식 (95)로 표시되는 당쇄-폴리펩티드 복합체(서열번호 60) (31.2 mg)를 얻었다.
[화학식 90]
Figure pct00094
식 (95)
ESI-MS: (m/z) calcd for C120H201N35O62: [M+2H]2+ 1564.1, [M+3H]3+ 1043.0, [M+4H]4+ 782.5, found: 1563.7, 1043.8, 782.3.
(실시예 1) 강구 부하 시험(steel ball loading test)에 의한 하이드로겔 특성의 평가-1
10 mg의 당쇄-폴리펩티드 복합체 또는 10 mg의 대조군 폴리펩티드를 500 μL의 초순수에 용해시키고, 2 중량%의 폴리펩티드 용액을 제조하였다. 이 용액과 각종 완충액을 동량씩 더람관(Durham's tube)(6*30 mm, 마루에무사 제)에 첨가하고, 볼텍스(vortex)로 격렬하게 교반하여 펩티드 농도가 1 중량%의 하이드로겔을 제조하였다. 이 때, 완충액으로서 구연산-인산 완충액(pH 2.0 및 3.5), 인산 완충액(pH 7.4), 인산-수산화 나트륨 완충액(pH 11.5)을 이용하였다. 더람관 내의 하이드로겔의 표면을 수평으로 하고, 20분간 실온 조건하에서 정치한 후, 강구(steel ball)(직경 1.56 mm, 무게 16 mg, 후나베세이코사 제)을 하이드로겔 상에 부하하였다. 10분 후, 강구의 위치를 육안으로 관찰하였다.
더람관 내의 강구의 위치는 3단계로 평가하고, 강구가 하이드로겔 표면 부근에 머무른 상태를 ○, 부하 후에 침강하고 내부에 머무른 상태를 △, 또한 더람관의 하부까지 침강한 상태를 X로 하였다. 또한, 하이드로겔이 균일하지 않고 백탁이나 불용물(침전물)이 관찰된 경우에 ※를 부기하였다. 강구가 표면 부근에 머무르고(○), 백탁이나 불용물이 보이지 않는(※이 없는) 하이드로겔은, 투명성이 있으며 균일한 겔로 여겨졌다. 얻어진 사진을 도 1에, 또한 평가 결과를 표 1에 나타낸다.
또한, 표 1에서, "당잔기 수"라는 것은, 당쇄-폴리펩티드 복합체에 결합하고 있는 당쇄에 존재하는 당잔기의 수의 합계를 나타낸다. 또한, 표에 나타낸 화합물의 번호는 설명을 위해 편의적으로 붙인 것이며, 제조예의 번호와 일치하지 않는다.
No.
 화합물명
 당잔기수
 pH
2.0 3.5 7.4 11.5
1 (RADA)4 - ○ △※ X※ X※
2 C(디GlcNAc)-(RADA)4 7 ○ ○ ○ ○
도 1 및 표 1에 나타낸 바와 같이, C(디GlcNAc)-(RADA) 4는 모든 pH 영역 (pH 2.0 내지 pH 11.5)에서 투명하고 균일한 하이드로겔을 형성하고, 강구를 하이드로겔 표면 부근에 유지하였다. 한편, (RADA) 4는 pH 2.0에서는 투명하고 균일한 하이드로겔을 형성하고, 강구를 하이드로겔 표면 부근에 유지하였으나, pH 3.5 이상에서는 백탁을 갖는 불규칙한 하이드로겔을 형성하고 강구는 하이드로겔의 내부까지 침입하거나 또는 더람관의 바닥으로 침강하였다.
이상으로부터, C(디GlcNAc)-(RADA) 4는 중성 pH에서 하이드로겔의 강도를 유지하면서 투명하고 균일한 하이드로겔을 형성할 수 있음을 확인하였다.
(실시예 2) 강구 부하 시험(steel ball loading test)에 의한 하이드로겔 특성의 평가-2
실시예 1과 동일한 방법을 이용하여, C(디시알로)-(RADA) 4, C(아시알로)-(RADA) 4, C(디시알로)-(RADA) 5, C(디GlcNAc)-(RADA) 5 및 (RADA) 4를 이용하여 강구 부하 시험을 실시하였다. 얻어진 평가 결과를 표 2에 나타낸다.
번호 화합물명 당잔기수 pH
3.5 7.4
1 (RADA)4 - △※ X※
2 C(디GlcNAc)-(RADA)4 7 ○ ○
3 C(디시알로)-(RADA)4 11 ○ ○
4 C(아시알로)-(RADA)4 9 ○ ○
5 C(디시알로)-(RADA)5 11 ○ ○
6 C(아시알로)-(RADA)5 9 ○ ○
7 C(디GlcNAc)-(RADA)5 7 ○ ○
표 2에 나타낸 바와 같이, (RADA) 4의 말단에 비교적 큰 당쇄를 수식한 것은, 하이드로겔의 강도를 유지하면서 중성 pH에서 투명하고 균일한 하이드로겔을 형성하였다. 이것은 수용성이 높고 부피가 큰 당쇄를 폴리펩티드에 수식함으로써 펩티드쇄 사이의 과도한 회합(assembly)의 억제, 또는 회합체의 수용성의 개선, 또는 둘 모두가 작용한 결과로 여겨진다.
이상으로부터, (RADA) 4 또는 (RADA) 5에 다양한 당쇄를 수식한 당쇄-폴리펩티드 복합체에서도, 하이드로겔의 강도를 유지하면서 중성 pH에서 투명하고 균일한 하이드로겔을 형성할 수 있음을 확인하였다.
(실시예 3) 강구 부하 시험(steel ball loading test)에 의한 하이드로겔 특성의 평가-3
실시예 1의 방법과 동일하게, 1 중량%, 0.5 중량% 및 0.25 중량%의 하이드로겔 농도에서 C(디GlcNAc)-(RADA) 4의 강구 부하 시험을 실시하였다. 얻어진 평가결과를 표 3에 나타낸다.
번호
 화합물명
 당잔기수
 하이드로겔 농도
 pH
3.5 7.4

2
C(디GlcNAc)-(RADA)4
7
 1 중량% ○ ○
0.5 중량% ○ ○
0.25 중량% X ○
표 3에 나타낸 바와 같이, C(디GlcNAc)-(RADA) 4는 pH 7.4에서 저농도 영역에서도 균일한 하이드로겔을 형성하였다. 또한, C(디GlcNAc)-(RADA) 4는 하이드로겔 농도를 0.25 중량%로 낮춘 경우, pH 7.4만 균일한 하이드로겔을 형성하였다. 이로부터, C(디GlcNAc)-(RADA) 4는 하이드로겔 농도가 저농도인 경우, pH에 의해 하이드로겔 형성을 조절할 수 있음을 확인하였다.
즉, 본 발명의 당쇄-폴리펩티드 복합체는, pH가 중성인 수용액에서 하이드로 겔 농도가 낮은 경우에서도 하이드로겔의 강도를 유지하면서 투명하고 균일한 하이드로겔을 형성할 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명의 당쇄-폴리펩티드 복합체는, 하이드로겔 농도가 저농도인 경우, pH에 의해 하이드로겔 형성을 조절할 수 있음을 확인하였다.
(실시예 4) 강구 부하 시험(steel ball loading test)에 의한 하이드로겔 특성의 평가-4
하이드로 겔의 농도를 0.5 중량%에서 실시한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로, C(디GlcNAc)-(RADA) 4, 2C(말토오스)-(RADA) 4, 2C(말토트리오스)-(RADA) 4, C(말토오스)-(RADA)4-C(말토오스), C(말토트리오스)-(RADA)4-C(말토트리오스), 3C(말토오스)-(RADA) 4, (RADA)4-C(디GlcNAc), C(말토헵타오스)-(RADA) 4, (RATARAEA) 2, C(디GlcNAc)-(RATARAEA) 2를 이용한 강구 부하 시험을 실시하였다. 얻어진 평가 결과를 표 4에 나타낸다.
No.
 화합물명
 당잔기수
 pH
3.5 7.4
1 (RADA)4 - X※ X※
2 C(디GlcNAc)-(RADA)4 7 ○ ○
8 2C(말토오스)-(RADA)4 4 ○※ X※
9 2C(말토트리오스)-(RADA)4 6 ○ ○
10 C(말토오스)-(RADA)4-C(말토오스) 4 ○※ X※
11 C(말토트리오스) -(RADA)4-C(말토트리오스) 6 ○ ○
12 3C(말토오스)-(RADA)4 6 ○ ○
13 (RADA)4-C(디GlcNAc) 7 ○ ○
14 C(PEG2000)-(RADA)4 - X X
15 C(PEG2000)-(RADA)5 - X X
16 (RATARAEA)2 - X※ X※
17 C(디GlcNAc)-(RATARAEA)2 7 ○ ○
표 4에 나타낸 바와 같이, 당쇄-폴리펩티드 복합체에 결합하고 있는 당쇄에 존재하는 당잔기의 합계가 5이상인 No. 2, 9, 11, 12, 13, 및 17에서는, pH 3.5 및 pH 7.4에서 투명하고 균일한 하이드로겔을 형성하였다. 또한, 표에는 기재되어 있지 않으나, (RADA) 4의 N 말단에 C(DiBn-디시알로)(당잔기수 11)를 결합한 당쇄-폴리펩티드 복합체도 pH 7.4에서 투명하고 균일한 하이드로겔을 형성하였다. 한편, 당쇄-폴리펩티드 복합체에 결합하고 있는 당쇄에 존재하는 당잔기의 합계가 4 이하인 No. 8 및 No. 10에서는, pH 7.4에서 하이드로겔을 형성하지 않았다. 즉, 수용액 중에서 자기집합하는 성질을 갖는 폴리펩티드에 당잔기의 합계가 5 이상의 당쇄를 결합시킨 경우, 해당 당쇄-폴리펩티드 복합체는 중성영역에서 높은 수용성을 나타내게 되고, 투명하고 균일한 하이드로겔을 형성하는 것으로 밝혀졌다.
또한, 당쇄-폴리펩티드 복합체에 결합하고 있는 당쇄는, 단독으로 분지를 가지고 있는 당쇄(예를 들어, No.2 및 No.13의 디GlcNAc 당쇄, 표 2에 나타낸 디시알로 당쇄 및 아시알로 당쇄) 뿐만 아니라 직쇄상의 당쇄(예를 들어, 말토오스 당쇄 및 말토트리오스 당쇄)도, No.9, No.11, No.12와 같이, 하나의 폴리펩티드에 2개 이상 결합함으로써, 당쇄-폴리펩티드 복합체 전체로서 당쇄가 분지를 가지고 있는 상태라면 pH 3.5 및 pH 7.4에서 투명하고 균일한 하이드로겔을 형성한다는 것이 밝혀졌다.
또한, 폴리펩티드의 수용성을 향상시키기 위해 폴리펩티드에 PEG를 결합시키는 방법이 알려져 있으나, (RADA) 4 및 (RADA) 5에 PEG2000을 결합한 경우(No.14, 및 No.15)에서는, pH 3.5 및 pH 7.4에서의 불용물은 관찰되지 않았으나, 균일한 하이드로겔을 형성하지 않았다. 즉, 본 발명의 당쇄-폴리펩티드 복합체는 PEG-폴리펩티드 복합체와 비교하여도, 보다 높은 수용성을 나타내고, 보다 투명하고 균일한 하이드로겔을 형성하는 것으로 밝혀졌다.
또한, No.11에서는 당쇄가 폴리펩티드의 N 말단 부분 및 C 말단 부분에 결합하고 있고, No.13에서는 당쇄가 폴리펩티드의 C 말단 부분에 당쇄가 결합하고 있으나, 모두 pH 3.5 및 pH 7.4에서 높은 수용성을 나타내고, 투명하고 균일한 하이드로겔을 형성하였다. 즉, 본 발명의 당쇄-폴리펩티드 복합체에서 당쇄의 결합부위는 폴리펩티드의 N 말단 부분뿐만 아니라 C 말단 부분일 수도 있고, 양 말단 부분일 수도 있는 것으로 밝혀졌다.
또한, (RADA) 4 또는 (RADA) 5와 동일하게, 하이드로겔을 형성하는 폴리펩티드로서, (RATARAEA) 2가 알려져 있다. (RATARAEA) 2에 당쇄를 결합시킨 경우에, 겔 형성능이 향상하는지 여부에 대하여, 강구 부하 시험으로 평가하였다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 당쇄의 결합이 없는 (RATARAEA) 2인 No.16은, pH가 3.5 및 7.4에서 불균일하고 백탁한 하이드로겔을 형성하고, 강구는 더람관의 바닥으로 침강하였다. 한편, (RATARAEA) 2의 N 말단 부분에 C(디GlcNAc)를 결합한 당쇄-폴리펩티드 복합체인 No.17은, pH 3.5 및 pH 7.4에서 투명하고 균일한 겔을 형성하였다. 또한, 표에는 나타나 있지 않지만, (RATARAEA) 2의 N 말단에 C(아시알로)를 결합시킨 당쇄-폴리펩티드 복합체도 동일하게, pH 7.4에서 투명하고 균일한 하이드로겔을 형성하였다. 즉, (RATARAEA) 2를 포함하는 폴리펩티드에 당쇄를 결합시키면, 보다 높은 수용성을 나타내고, 더욱 투명하고 균일한 하이드로겔을 형성하는 것이 밝혀졌다.
이상의 결과로부터, (RADA) 4뿐만 아니라 다양한 배열의 폴리펩티드에 대해서도 당쇄를 결합시킴으로써 중성영역을 포함하는 광범위한 pH에서 투명하고 균일 한 겔을 형성하는 당쇄 - 폴리펩티드 복합체를 제조할 수 있는 것으로 나타났다.
(실시예 5) 강구 부하 시험(steel ball loading test)에 의한 하이드로겔 특성의 평가-5
실시예 1과 동일한 방법을 이용하여 N(아시알로)-(RADA) 4, N(디GlcNAc)- (RADA) 4 및 C(디GlcNAc)-(RADA) 4를 이용한 강구 부하 시험을 실시하였다. 얻어진 평가 결과를 표 5에 나타낸다.
No.
 화합물명
 당잔기수
 pH
3.5 7.4
2 C(디GlcNAc)-(RADA)4 7 ○ ○
18 N(아시알로)-(RADA)4 9 ○ ○
19 N(디GlcNAc)-(RADA)4 7 ○ ○
표 5에 나타낸 바와 같이, 아스파라긴 결합형 당쇄-폴리펩티드 복합체인 No. 18, 19도 시스테인 결합형 당쇄-폴리펩티드 복합체인 No. 2와 마찬가지로 pH 3.5 및 pH 7.4에서 투명하고 균일한 하이드로겔을 형성하였다. 즉, 당쇄가 결합된 아미노산이 시스테인 이외여도 본 발명의 당쇄-폴리펩티드 복합체는 투명하고 균일한 하이드로겔을 형성하는 것이 밝혀졌다.
(실시예 6) 지혈 기재로서의 이용법 검토
본 발명의 당쇄-폴리펩티드 복합체를 포함하는 하이드로겔이, 지혈재로서 이용가능한지 여부를 확인하기 위해 렛트 혈장을 이용한 평가 시험을 수행하였다.
실시예 1과 동일한 방법으로 폴리펩티드 수용액을 제조하였다. 7주령의 Crlj : WI 렛트에서 헤파린 나트륨 주입(아지노모토)을 사용하여 혈액을 채취하고, 원심처리 후의 상청으로부터 혈장을 얻었다. 폴리펩티드 수용액, 혈장, 및 PBS를 더람관에 첨가하고, 혈장농도가 5 내지 50%이고, 폴리펩티드 농도가 0.5 중량%가 되도록 하이드로겔을 제조하였다. 그 후, 20분간 실온 조건하에서 정치한 후, 실시예 1의 방법과 동일하게 강구 부하 시험을 실시하였다. 20분간 정치한 후의 하이드로겔의 사진을 도 2에, 평가결과를 표 6에 나타낸다.
No.
 화합물명
 혈장농도 비고
50% 25% 10% 5%
1 (RADA)4 △※ △※ X※ X※ 모든 농도에서 침전물을 확인
50%에서는침전상에서 구(ball)를 유지
2 C(디GlcNAc)-(RADA)4 ○ ○ ○ ○
도 2 및 표 6에 나타낸 바와 같이, C (디GlcNAc)-(RADA) 4를 포함하는 폴리 펩티드 용액은, 혈장농도에 관계없이 균일한 하이드로겔을 형성하였다. 더욱 놀라운 것은, C(디GlcNAc)-(RADA) 4는, 혈장농도가 50%라고 하는 상당히 고농도의 상태에서도 균일한 하이드로겔을 형성하였다. 한편, (RADA) 4를 포함하는 폴리펩티드 용액은, 모든 혈장 농도에서 폴리펩티드 용액이 백탁하고 불용물이 관찰되었다. 또한, 각 하이드로겔의 pH를 검토한 결과, 모두 pH 6-8 사이이었다. 즉, 본 발명의 당쇄-폴리 펩티드 복합체는, 중성 pH에서 균일한 하이드로겔을 형성할 뿐만 아니라 고농도의 혈장 존재하에 있어서도 불용물을 생성하기 어렵고 투명한 하이드로겔을 형성하는 것이 밝혀졌다.
이상의 결과로부터, 본 발명의 당쇄-폴리펩티드 복합체는 지혈용 약학조성물로서 상당히 높은 이용가치를 갖는 것으로 나타났다.
(실시예 7) 산성 단백질의 서방능의 검토
본 발명의 당쇄-폴리펩티드 복합체를 포함하는 하이드로겔이 중성 pH에서 서방 담체로서 이용가능한지 여부에 대해 검토하기 위해 시험을 수행하였다.
완충액으로서 인산 완충액 (pH 7.4)을 사용하였다. 또한, 하이드로겔에 내포하는 산성 단백질로서, Alexa Fluor(등록 상표) 488로 형광 표지된 Bovine Serum Albumin(BSA)(A13100, Life Technologies)을 사용하였다.
완충액 염농도가 0.15 M이고, BSA 농도가 5 μM, 또한, 폴리펩티드 농도가 0.25-1 중량%가 되도록 튜브에 첨가하고, 볼텍스로 혼화하였다. 혼합물을 멀티 웰 인서트 시스템(351130, BD)에 50 μL씩 첨가하고 37도 인큐베이터(세포배양용 CO2 인큐베이터, MCO-18AIC, SANYO) 중에서 차광하에 밤새도록 정치하여 BSA 내포 하이드로겔을 제조하였다. 37도 인큐베이터 중에서, 하이드로겔과 동일한 완충액을 225 μL씩 첨가한 96 well 평면 바닥 플레이트(353928, BD)에 인서트 시스템을 담그고, 플레이트 진탕기(MICRO PLATE MIXER NS-P, 애즈원 사, 회전수 : 1/5 눈금)를 이용하여 플레이트를 진동시킴으로써 시험을 개시하였다(0 시간). 그 후, 경시적으로 평면 바닥 플레이트 측에 누출된 형광량을 형광 플레이트 리더(SpectraMax M3, 모레큘러 디바이스)를 이용하여 측정하였다. 동일한 형광표지 BSA를 이용하여 검량선을 작성하고, 유출된 형광색소의 양으로부터 단백질의 농도를 산출하였다. (RADA) 4를 포함하는 하이드로겔, 및 C(디GlcNAc)-(RADA) 4를 포함하는 하이드로겔을 이용한 결과를 도 3에 나타낸다. 대조군으로는 완충액에 BSA만을 첨가한 용액(W/O SAP)을 사용하였다. 도 3 중, Y축은 평면 바닥 플레이트중의 BSA 농도를 나타내고, X축은 시험개시로부터의 시간을 나타낸다.
도 3에 나타낸 바와 같이, (RADA) 4를 포함하는 하이드로겔에 내포된 BSA는 시험 개시 후 단시간 내에 대부분이 누출하였다. 또한, 그 누출속도는 폴리펩티드가 0.5 중량% 이하에서는 폴리펩티드를 포함하지 않는 용액의 경우와 동등한 누출속도이며, 서방능을 가지고 있지 않는 것으로 나타났다. 한편, C(디GlcNAc)-(RADA) 4를 포함하는 하이드로겔은, 0.25 중량%의 낮은 농도에서도 폴리펩티드를 포함하지 않는 용액의 경우와 비교하여 BSA의 누출속도가 완만하고, 서방능을 가지고 있었다.
즉, 본 발명의 당쇄-폴리펩티드 복합체는, 중성 pH에서 산성 단백질을 내포, 보유하고 서방 효과를 갖는 것이 밝혀졌다.
(실시예 8) 염기성 단백질의 서방능의 검토
내포하는 단백질로서 염기성 단백질인 Lysozyme을 이용한 것 이외에는, 실시 예 7에 기재된 방법과 동일하게, 서방성 시험을 실시하였다. Lysozyme은, Alexa Fluor(등록상표) 488 단백질 라벨링 키트(A10235, 인비트로겐)를 사용하여 Alexa Fluor (등록상표) 488로 표지하여 사용하였다. 결과를 그림 4에 나타낸다.
도 4에 나타낸 바와 같이, (RADA) 4를 포함하는 하이드로겔에 내포된 Lysozyme은, 시험 개시 후 1시간 이내에 대부분이 누출하였다. 또한, 그의 누출 속도는 폴리펩티드를 포함하지 않는 용액의 경우와 거의 동등한 누출속도이며, 서방능을 가지고 있지 않는 것으로 나타났다. 한편, C(디GlcNAc)-(RADA) 4를 포함하는 하이드로겔은, 0.25 중량%의 낮은 농도에서도 폴리펩티드를 포함하지 않는 용액의 경우와 비교하여 Lysozyme의 누출속도가 완만하고, 서방능을 가지고 있었다.
즉, 본 발명의 당쇄-폴리펩티드 복합체는, 중성 pH에서 염기성 단백질을 내포, 보유하고 서방 효과를 갖는 것이 밝혀졌다.
(실시예 9) 원편광 이색성(CD) 측정 및 분석
본 발명의 당쇄-폴리펩티드 복합체가 β시트 구조를 형성한다는 것을 확인하기 위해 CD 측정을 수행하였다. 일반적으로, 물질이 β시트 구조를 갖는 경우에 관찰되는 파장의 특징은 197nm 부근의 정(positive)의 흡수와 216nm 부근의 부(negative)의 흡수이다. 그 때문에, 본 발명에 대해서도 이러한 파장의 크기에 주목하고 pH가 β시트 구조에 미치는 영향을 조사하였다.
본 발명의 일 실시형태인 C(디GlcNAc)-(RADA) 4 또는 대조군으로 (RADA) 4를 초순수에 용해시켰다. 이들 폴리펩티드 수용액에 각각 1-10 mM의 수산화 나트륨 수용액을 첨가하여 pH를 조정하고, pH 2 또는 pH 7의 100 mM 폴리펩티드 수용액을 제조하였다. 이 수용액을 광로 길이 0.1 cm의 석영 셀에 옮겼다. 또한, CD 스펙트럼을, 스펙트럼 선광계(J-805, Jasco)를 이용하여 파장 185-260 nm에서 타원형성(밀리도; millidegree)을 측정하였다. 평균 잔기 타원형성(Mean residue ellipticity) θ는 하기의 식을 이용하여 산출하였다.
Figure pct00095
여기에서, θ obs는 밀리도로 측정한 타원형성, l은 셀 길이(cm), c는 농도 (M), 및 r은 아미노산의 잔기 수를 나타낸다.
(RADA) 4에 대한 결과의 그래프를 도 5에 나타내고, C(디GlcNAc)-(RADA) 4에 대한 결과의 그래프를 도 6에 나타낸다.
도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, pH 2에서는 (RADA) 4 및 C (디GlcNAc)-(RADA) 4 모두 높은 몰 타원율을 나타내었다. 한편, pH 7에서는 C(디GlcNAc)-(RADA) 4는 높은 몰 타원율을 나타내나, (RADA) 4의 몰 타원율은 현저하게 감소하였다. 즉, (RADA) 4는 중성 pH에서 β시트 구조를 거의 형성하지 않은 반면, C(디GlcNAc)-(RADA) 4는 중성 pH에서도 β시트 구조를 형성하는 것이 밝혀졌다.
상기 결과는, C(디GlcNAc)-(RADA)4는 당쇄의 존재에 의해 폴리펩티드끼리의 과한 회합이 억제되고, β시트를 유지하고 있는 반면, (RADA) 4는, 중성 pH에서는 회합이 과도하게 촉진되어 β시트가 감소한 것일 수도 있다고 여겨진다. 이것은, (RADA) 4가 강구 부하 시험에서, 중성 pH에서 백탁, 침전을 일으키고, 균일하고 강하고 단단한 하이드로겔을 형성할 수 없게 된 현상(예를 들어, 도 1)과 일치한다.
이상의 결과로부터, 본 발명의 당쇄-폴리펩티드 복합체는 중성 pH에서 β시트 구조를 형성하는 것으로 확인되었다.
(실시예 10) 동적 점도(kinetic viscosity) 측정 및 분석
강구 부하 시험에서 확인된 하이드로겔의 강도에 추가하여, 시간의 경과에 따른 하이드로겔 강도의 변화 또는 하이드로겔의 안정성을 관찰하기 위해, 동적 점도 측정을 수행하였다.
동적 점도 측정에는, 0.3 mm의 간격 높이를 갖는 직경 25 mm의 스테인레스 강철 평행 플레이트를 구비한 검류계(MCR302, 안톤파르 게엠베하)를 사용하였다. 본 발명의 일 실시형태인 C(디GlcNAc)-(RADA) 4 또는 대조군으로서 (RADA) 4를 초순수에 용해시켰다. 이들 폴리펩티드 수용액에, pH 조정을 위해 5 mM의 수산화 나트륨 수용액을 첨가하여 pH 7의 0.5 중량%의 하이드로겔을 제조하였다. 그리고 이들 하이드로겔을, 25도로 설정한 검류계에 신속하게 옮기고, 시간 경과에 따라 위상각(tanδ)을 모니터링하였다. (주파수 = 1Hz, 왜곡 = 10%)
이 측정 결과를 도 7에 나타낸다.
도 7에 나타낸 바와 같이, C(디GlcNAc)-(RADA) 4를 포함하는 하이드로겔의 위상각은, 측정 개시로부터 신속하게 감소하는 것으로부터, 강하고 단단한 하이드로겔이 형성되어 있는 것으로 나타났다. 한편, (RADA) 4를 포함하는 하이드로겔은 위상각이 크고, 깨지기 쉬운 하이드로겔을 형성하고 있거나 또는 불균일하게 일부만 강하고 단단한 하이드로겔을 형성하고 있는 것으로 나타났다.
이것은, (RADA) 4가 강구 부하 시험에서, 중성 pH에서 백탁, 침전을 일으키고, 균일하고 강하고 단단한 하이드로겔을 형성할 수 없게 된 현상(예를 들어, 도 1)과 일치한다.
이상의 결과로부터, 본 발명의 당쇄-폴리펩티드 복합체는, 중성 pH에서 강하고 단단한 하이드로겔을 형성하는 것으로 확인되었다.
SEQUENCE LISTING <110> GLYTECH, INC. <120> SUGAR CHAIN - POLYPEPTIDE COMPLEX <130> IPA150978-JP <150> JP2013-075493 <151> 2013.03.30 <160> 57 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 1 Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala 1 5 10 15 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 2 Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala 1 5 10 15 Arg Ala Asp Ala 20 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 3 Arg Ala Thr Ala Arg Ala Glu Ala Arg Ala Thr Ala Arg Ala Glu Ala 1 5 10 15 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Fmoc <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (2)..(2) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (4)..(4) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> 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<223> chemically synthesized <220> <221> ACETYLATION <222> (1)..(1) <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Asialo sugar chain added <220> <221> AMIDATION <222> (16)..(16) <400> 36 Cys Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala 1 5 10 15 <210> 37 <211> 16 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> ACETYLATION <222> (1)..(1) <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> DiGlcNAc sugar chain added <220> <221> AMIDATION <222> (16)..(16) <400> 37 Cys Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala 1 5 10 15 <210> 38 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Fmoc <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (2)..(2) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (3)..(3) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (5)..(5) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (7)..(7) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (9)..(9) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (11)..(11) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (13)..(13) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (15)..(15) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (17)..(17) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (18)..(18) <223> Resin <400> 38 Cys Cys Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala 1 5 10 15 Asp Ala <210> 39 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> ACETYLATION <222> (1)..(1) <220> <221> AMIDATION <222> (18)..(18) <400> 39 Cys Cys Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala 1 5 10 15 Asp Ala <210> 40 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> ACETYLATION <222> (1)..(1) <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Maltose sugar chain added <220> <221> CARBOHYD <222> (2)..(2) <223> Maltose sugar chain added <220> <221> AMIDATION <222> (18)..(18) <400> 40 Cys Cys Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala 1 5 10 15 Asp Ala <210> 41 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> ACETYLATION <222> (1)..(1) <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Maltotriose sugar chain added <220> <221> CARBOHYD <222> (2)..(2) <223> Maltotriose sugar chain added <220> <221> AMIDATION <222> (18)..(18) <400> 41 Cys Cys Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala 1 5 10 15 Asp Ala <210> 42 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> ACETYLATION <222> (1)..(1) <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Maltotetraose sugar chain added <220> <221> CARBOHYD <222> (2)..(2) <223> Maltotetraose sugar chain added <220> <221> AMIDATION <222> (18)..(18) <400> 42 Cys Cys Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala 1 5 10 15 Asp Ala <210> 43 <211> 19 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Fmoc <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (2)..(2) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (3)..(3) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (4)..(4) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (6)..(6) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (8)..(8) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (10)..(10) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (12)..(12) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (14)..(14) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (16)..(16) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (18)..(18) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (19)..(19) <223> Resin <400> 43 Cys Cys Cys Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg 1 5 10 15 Ala Asp Ala <210> 44 <211> 19 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> ACETYLATION <222> (1)..(1) <220> <221> AMIDATION <222> (19)..(19) <400> 44 Cys Cys Cys Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg 1 5 10 15 Ala Asp Ala <210> 45 <211> 19 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> ACETYLATION <222> (1)..(1) <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Maltose sugar chain added <220> <221> CARBOHYD <222> (2)..(2) <223> Maltose sugar chain added <220> <221> CARBOHYD <222> (3)..(3) <223> Maltose sugar chain added <220> <221> AMIDATION <222> (19)..(19) <400> 45 Cys Cys Cys Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg 1 5 10 15 Ala Asp Ala <210> 46 <211> 17 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Fmoc <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (3)..(3) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (5)..(5) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (7)..(7) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (9)..(9) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (11)..(11) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (13)..(13) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (15)..(15) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (17)..(17) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (17)..(17) <223> Resin <400> 46 Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Cys Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala 1 5 10 15 Asp <210> 47 <211> 17 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> ACETYLATION <222> (1)..(1) <220> <221> AMIDATION <222> (17)..(17) <400> 47 Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Cys Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala 1 5 10 15 Asp <210> 48 <211> 17 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> ACETYLATION <222> (1)..(1) <220> <221> CARBOHYD <222> (9)..(9) <223> Maltose sugar chain added <220> <221> AMIDATION <222> (17)..(17) <400> 48 Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Cys Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala 1 5 10 15 Asp <210> 49 <211> 17 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> ACETYLATION <222> (1)..(1) <220> <221> CARBOHYD <222> (9)..(9) <223> Maltotriose sugar chain added <220> <221> AMIDATION <222> (17)..(17) <400> 49 Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Cys Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala 1 5 10 15 Asp <210> 50 <211> 17 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> ACETYLATION <222> (1)..(1) <220> <221> CARBOHYD <222> (9)..(9) <223> Maltotetraose sugar chain added <220> <221> AMIDATION <222> (17)..(17) <400> 50 Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Cys Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala 1 5 10 15 Asp <210> 51 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Fmoc <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (2)..(2) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (4)..(4) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (6)..(6) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (8)..(8) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (10)..(10) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (12)..(12) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (14)..(14) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (16)..(16) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (18)..(18) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (18)..(18) <223> Resin <400> 51 Cys Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp 1 5 10 15 Ala Cys <210> 52 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> ACETYLATION <222> (1)..(1) <220> <221> AMIDATION <222> (18)..(18) <400> 52 Cys Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp 1 5 10 15 Ala Cys <210> 53 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> ACETYLATION <222> (1)..(1) <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Maltose sugar chain added <220> <221> CARBOHYD <222> (18)..(18) <223> Maltose sugar chain added <220> <221> AMIDATION <222> (18)..(18) <400> 53 Cys Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp 1 5 10 15 Ala Cys <210> 54 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> ACETYLATION <222> (1)..(1) <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Maltotriose sugar chain added <220> <221> CARBOHYD <222> (18)..(18) <223> Maltotriose sugar chain added <220> <221> AMIDATION <222> (18)..(18) <400> 54 Cys Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp 1 5 10 15 Ala Cys <210> 55 <211> 17 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Fmoc <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (3)..(3) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (5)..(5) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (7)..(7) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (9)..(9) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (11)..(11) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (13)..(13) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (15)..(15) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (17)..(17) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (17)..(17) <223> Resin <400> 55 Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala 1 5 10 15 Cys <210> 56 <211> 17 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> ACETYLATION <222> (1)..(1) <220> <221> AMIDATION <222> (17)..(17) <400> 56 Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala 1 5 10 15 Cys <210> 57 <211> 17 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> ACETYLATION <222> (1)..(1) <220> <221> CARBOHYD <222> (17)..(17) <223> DiGlcNAc sugar chain added <220> <221> AMIDATION <222> (17)..(17) <400> 57 Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala 1 5 10 15 Cys <210> 58 <211> 16 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Fmoc <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (3)..(3) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (5)..(5) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (7)..(7) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (9)..(9) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (11)..(11) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (13)..(13) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (15)..(15) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (16)..(16) <223> Resin <400> 58 Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala 1 5 10 15 <210> 59 <211> 17 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> ACETYLATION <222> (1)..(1) <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Asialo sugar chain added <220> <221> AMIDATION <222> (17)..(17) <400> 59 Asn Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp 1 5 10 15 Ala <210> 60 <211> 17 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> ACETYLATION <222> (1)..(1) <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> DiGlcNAc sugar chain added <220> <221> AMIDATION <222> (17)..(17) <400> 60 Asn Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp 1 5 10 15 Ala

Claims (18)

  1. 당쇄-폴리펩티드 복합체에 있어서,
    상기 폴리펩티드가, 극성 아미노산 잔기와 비극성 아미노산 잔기가 교대로 배치된, 8 내지 34개의 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이며,
    상기 폴리펩티드에 1 또는 복수의 당쇄가 결합하고 있는 것을 특징으로 하는,
    당쇄-폴리펩티드 복합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 당쇄-폴리펩티드 복합체에 있어서, 상기 당쇄-폴리펩티드 복합체가, pH가 중성부근의 수용액 중에서 자기집합함으로써 β시트 구조를 포함하는 하이드로겔을 형성하는 것을 특징으로 하는,
    당쇄-폴리펩티드 복합체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 당쇄-폴리펩티드 복합체에 있어서, 상기 각 극성 아미노산 잔기가, 아스파라긴산 잔기, 글루탐산 잔기, 아르기닌 잔기, 리신 잔기, 히스티딘 잔기, 티로신 잔기, 세린 잔기, 트레오닌 잔기, 아스파라긴 잔기, 글루타민 잔기, 및 시스테인 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것을 특징으로 하는,
    당쇄-폴리펩티드 복합체.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서,
    상기 당쇄-폴리펩티드 복합체에 있어서, 상기 각 비극성 아미노산 잔기가, 알라닌 잔기, 발린 잔기, 류신 잔기, 이소류신 잔기, 메티오닌 잔기, 페닐알라닌 잔기, 트립토판 잔기, 프롤린 잔기, 및 글리신 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것을 특징으로 하는,
    당쇄-폴리펩티드 복합체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 당쇄-폴리펩티드 복합체에 있어서, 상기 각 극성 아미노산 잔기가 아스파라긴산 잔기, 글루탐산 잔기, 아르기닌 잔기, 및 트레오닌 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기이며,
    상기 각 비극성 아미노산이 알라닌 잔기인 것을 특징으로 하는,
    당쇄-폴리펩티드 복합체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 당쇄-폴리펩티드 복합체에 있어서, 상기 아미노산 서열이, "RADA"의 반복서열, 또는 "RATARAEA"의 반복서열인 것을 특징으로 하는,
    당쇄-폴리펩티드 복합체.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 당쇄-폴리펩티드 복합체에 있어서, 상기 아미노산 서열이 RADARADARADARADA (서열번호 1), RADARADARADARADARADA (서열번호 2), 및 RATARAEARATARAEA (서열번호 3)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는,
    당쇄-폴리펩티드 복합체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 당쇄-폴리펩티드 복합체에 있어서, 상기 폴리펩티드에 결합하고 있는 1 또는 복수의 당쇄에 존재하는 당잔기 수의 합계가 5 이상인 것을 특징으로 하는,
    당쇄-폴리펩티드 복합체.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 당쇄-폴리펩티드 복합체에 있어서, 상기 폴리펩티드에 결합하고 있는 당쇄의 수가 1, 2, 또는 3개인 것을 특징으로 하는,
    당쇄-폴리펩티드 복합체.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 당쇄-폴리펩티드 복합체에 있어서, 상기 폴리펩티드의 N 말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 계산하여, x 번째까지의 모든 아미노산, 및 C 말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 계산하여, y 번째까지의 모든 아미노산 (여기서, x 및 y는 정수이고,
    Figure pct00096
    이고,
    Figure pct00097
    이고, x + y는 폴리펩티드에 결합하고 있는 당쇄의 수의 합계이다)에 당쇄가 결합하고 있는 것을 특징으로 하는,
    당쇄-폴리펩티드 복합체.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 당쇄-폴리펩티드 복합체에 있어서,
    상기 폴리펩티드에 결합하고 있는 당쇄의 수가 1, 2, 또는 3개이며,
    상기 폴리펩티드에 결합하고 있는 당쇄의 수가 1개의 경우에는, 상기 1개의 당쇄는, 상기 폴리펩티드의 N 말단에 위치하는 아미노산 잔기, 또는 C 말단에 위치하는 아미노산 잔기와 결합하고 있으며,
    상기 폴리펩티드에 결합하고 있는 당쇄의 수가 2개의 경우에는, 상기 2개의 당쇄는, 다음의 (1) 내지 (3)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기와 결합하고 있으며,
    (1) 상기 폴리펩티드의 N 말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 계산하여 1 번째 및 2 번째의 아미노산 잔기
    (2) 상기 폴리펩티드의 C 말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 계산하여 1 번째 및 2 번째의 아미노산 잔기
    (3) 상기 폴리펩티드의 N 말단에 위치하는 아미노산 잔기, 및 상기 폴리펩티드의 C 말단에 위치하는 아미노산 잔기,
    상기 폴리펩티드에 결합하고 있는 당쇄의 수가 3개의 경우에는, 상기 3개의 당쇄는, 다음의 (1) 내지 (4)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 잔기와 결합하고 있는 것을 특징으로 하는,
    당쇄-폴리펩티드 복합체.
    (1) 상기 폴리펩티드의 N 말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 계산하여 1번째, 2번째, 및 3번째의 아미노산 잔기
    (2) 상기 폴리펩티드의 C 말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 계산하여 1 번째, 2번째, 및 3번째의 아미노산 잔기
    (3) 상기 폴리펩티드의 N 말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 계산하여 1 번째 및 2 번째의 아미노산 잔기, 및 상기 폴리펩티드의 C 말단에 위치하는 아미노산 잔기
    (4) 상기 폴리펩티드의 N 말단에 위치하는 아미노산 잔기, 및 상기 폴리펩티드의 C 말단으로부터 계산하여 1번째 및 2번째에 위치하는 아미노산 잔기.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 당쇄-폴리펩티드 복합체에 있어서, 상기 당쇄가 분지(branch)를 갖는 당쇄인 것을 특징으로 하는,
    당쇄-폴리펩티드 복합체.
  13. 제8항에 있어서,
    상기 당쇄-폴리펩티드 복합체에 있어서, 상기 당쇄가 디시알로 당쇄, 아시알로 당쇄, 디GlcNAc 당쇄, 디만노오스 당쇄, GlcNAc 당쇄, 말토트리오스 당쇄, 말토오스 당쇄, 말토테트라오스 당쇄, 말토헵타오스 당쇄, β-사이클로덱스트린, 및 γ-사이클로덱스트린로 이루어진 군으로부터 선택되는 당쇄인 것을 특징으로 하는,
    당쇄-폴리펩티드 복합체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 당쇄-폴리펩티드 복합체를 포함하는,
    하이드로겔 형성용 조성물.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 당쇄-폴리펩티드 복합체를 포함하는 조성물이며,
    상기 조성물이 하이드로겔의 상태에 있는 것을 특징으로 하는,
    조성물.
  16. 제14항 또는 제15항에 기재된 조성물을 포함하는,
    지혈용 의약조성물.
  17. 제14항 또는 제15항에 기재된 조성물을 포함하는,
    서방 담체용 조성물.
  18. 제14항 또는 제15항에 기재된 조성물을 포함하는,
    배양 기재용 조성물.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102248381B1 (ko) 2020-11-26 2021-05-06 박시형 벨 테스터기

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9879097B2 (en) 2013-04-19 2018-01-30 Glytech, Inc. Method for producing activated sugar chain derivative and activated sugar chain derivative produced therefrom
EP3124058A4 (en) * 2014-03-28 2017-11-29 Otsuka Chemical Co., Ltd. Hemostatic pharmaceutical composition
KR20180132093A (ko) 2016-03-30 2018-12-11 컨바텍 테크놀러지스 인크 개조된 상처 드레싱
CN107529533B (zh) * 2017-09-07 2020-10-30 中国药科大学 一类可自组装成水凝胶的pH敏感多肽及其作为装载药物材料的应用
CN108553683B (zh) * 2018-05-21 2021-06-01 中国石油大学(华东) 基于天然多糖/短肽的复合纳米止血材料及其制备方法
JP7142286B2 (ja) * 2018-07-13 2022-09-27 慶應義塾 セレン含有アミノ酸を含む糖鎖－ポリペプチド複合体、および、その医薬用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5670483A (en) 1992-12-28 1997-09-23 Massachusetts Insititute Of Technology Stable macroscopic membranes formed by self-assembly of amphiphilic peptides and uses therefor
WO2008113030A2 (en) * 2007-03-14 2008-09-18 Arch Therapeutics, Inc Treatment of leaky or damaged tight junctions and enhancing extracellular matrix

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2481746A1 (en) 2001-06-19 2012-08-01 Otsuka Chemical Co., Ltd. Process for producing sugar chain asparagine derivative
US7943763B2 (en) 2002-07-05 2011-05-17 Otsuka Chemical Holdings Co., Ltd. Process for preparing glycopeptides having asparagine-linked oligosaccharides, and the glycopeptides
TWI335920B (en) 2002-12-24 2011-01-11 Yasuhiro Kajihara Sugar chain asparagine derivatives, sugar chain asparagine and sugar chain and manufacture thereof
TWI247749B (en) 2002-12-26 2006-01-21 Yasuhiro Kajihara 3 branch type saccharide chain asparagine derivative, saccharide chain asparagine there of, saccharide chain there of, and method for producing same
PT1591532T (pt) 2003-02-04 2019-01-11 Glytech Inc Processo para produção de um derivado de asparagina de cadeia de açúcar
WO2005010053A1 (ja) 2003-07-28 2005-02-03 Otsuka Chemical Co., Ltd. アミノ化複合型糖鎖誘導体及びその製造方法
US8299032B2 (en) * 2005-06-27 2012-10-30 Menicon Co., Ltd. Self-assembling peptide and gel produced from the same
TWI342880B (en) 2005-07-19 2011-06-01 Otsuka Chemical Co Ltd Method for producing sugar chain derivatives, and sugar chain derivatives
JP2007217376A (ja) * 2006-02-17 2007-08-30 Nagoya Institute Of Technology 自己組織化ペプチド組成物
BRPI0920030B1 (pt) * 2008-10-06 2019-03-26 3-D Matrix, Ltd. Agente de oclusão do tecido, agentes hemostáticos, preventivos e de oclusão ou escleroterapia relacionados, e infusão do tecido mucosal
JP2012082180A (ja) * 2010-10-14 2012-04-26 Nagoya Univ 骨再生用自己組織化ペプチドハイドロゲル
WO2012147497A1 (ja) * 2011-04-27 2012-11-01 株式会社メニコン 人工硝子体材料

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5670483A (en) 1992-12-28 1997-09-23 Massachusetts Insititute Of Technology Stable macroscopic membranes formed by self-assembly of amphiphilic peptides and uses therefor
WO2008113030A2 (en) * 2007-03-14 2008-09-18 Arch Therapeutics, Inc Treatment of leaky or damaged tight junctions and enhancing extracellular matrix
JP2010521495A (ja) * 2007-03-14 2010-06-24 アーチ セラピューティクス， インコーポレイテッド 漏出性または損傷を受けたタイトジャンクションの処置および細胞外マトリクスの増強

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. AM. CHEM. SOC., Vol. 126, pp. 8421-8425(2004.) *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102248381B1 (ko) 2020-11-26 2021-05-06 박시형 벨 테스터기

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