CN105408346B - 糖链-多肽复合物 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供可在宽的pH范围形成透明均质的水凝胶的糖链‑多肽复合物。本发明提供糖链‑多肽复合物，所述糖链‑多肽复合物的特征在于，所述多肽包含极性氨基酸残基及非极性氨基酸残基交互排列的、由8至34个氨基酸残基所构成的氨基酸序列，且所述多肽结合1个或多个糖链。

Description

糖链-多肽复合物
技术领域
本发明是关于多肽结合糖链的糖链-多肽复合物。
背景技术
水凝胶及纤维蛋白胶等生物凝胶，目前被利用为三维培养等研究用基质、手术中/手术后的止血剂及创伤愈合敷片等外科用基质、药物传送系统(DDS)等。
然而，这些的大多数使用生物来源的材料，因此在使用时，存在受病毒等微生物的感染、免疫原性、疾病传播等风险。例如，尽管纤维蛋白胶在手术时作为止血剂利用而有高价值，然而其原料来自于人类血液，因此在使用于实际的手术时，常发生患者受纤维蛋白胶中所混入的肝炎病毒所感染的事件，因此造成重大的社会问题。同时，生物来源的生物凝胶，亦存在未必可以以品质均一的凝胶供应的问题。
相对于生物来源的生物凝胶，已知以化学合成所制造的生物凝胶，无感染的风险，且可供应品质均一的凝胶(专利文献1)。然而，目前为止已知的生物凝胶，却在凝胶形成时，有缓冲液的交换或置换、多种药剂混合等步骤的必要，因此在操作上亦复杂。同时，亦有由于因pH范围而成为难溶性，而有限定所并用的试剂或溶剂，而且还有限定适用的部位(患部)、及使用时注射筒或注射管受阻塞等问题。而且，由于难溶性、特别是在接近于生物体的pH的中性范围内的难溶性(亦即，不透明)，因此在如手术区等需要辨视性时，使用上会有困难。
[先前技术文献]
专利文献
[专利文献1]美国专利第5670483号
发明内容
(发明要解决的问题)
本发明的目的是提供在宽的pH范围内可形成透明均质的水凝胶的糖链-多肽复合物。
(解决问题的手段)
本发明的发明人等，为解决所述问题经过广泛研究的结果，意外地，发现通过使含极性氨基酸残基与非极性氨基酸残基交互排列的氨基酸序列的多肽，与糖链结合所制造的糖链-多肽复合物，在宽的pH范围内，特别是在中性范围显示高水溶性，因而可形成透明且均质的水凝胶，从而完成本发明。
亦即，本发明提供糖链-多肽复合物，其特征为所述多肽是含有极性氨基酸残基与非极性氨基酸残基交互排列的、由8至34个氨基酸残基组成的氨基酸序列的多肽，且所述多肽结合1个或多个糖链。
同时，本发明的一实施方案中，其特征是，所述糖链-多肽复合物，在pH为中性附近的水溶液中可通过自组装，形成含β-折叠结构的水凝胶。
而且，本发明的一实施方案中，其特征是，所述各极性氨基酸残基，是选自下述所组成的组的氨基酸残基：天冬氨酸残基、谷氨酸残基、精氨酸残基、赖氨酸残基、组氨酸残基、酪氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、及半胱氨酸残基。
并且，本发明的一实施方案中，其特征是，所述各非极性氨基酸残基，是选自：丙氨酸残基、缬氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、甲硫氨酸残基、苯丙氨酸残基、色氨酸残基、脯氨酸残基、及甘氨酸残基所组成的组的氨基酸残基。
同时，本发明的一实施方案中，其特征是，所述各极性氨基酸残基，是选自：天冬氨酸残基、谷氨酸残基、精氨酸残基、及苏氨酸残基所组成的组的氨基酸残基；且所述各非极性氨基酸残基是丙氨酸残基。
而且，本发明的一实施方案中，其特征是，所述氨基酸序列，为「RADA」重复序列、或「RATARAEA」重复序列。
并且，本发明的一实施方案中，其特征是，所述氨基酸序列，是选自：RADARADARADARADA(序列编号1)、RADARADARADARADARADA(序列编号2)、及RATARAEARATARAEA(序列编号3)所组成的组的氨基酸序列。
同时，本发明的一实施方案中，其特征是，结合在所述多肽的1个或多个糖链中所存在的糖残基数合计为5以上。
而且，本发明的一实施方案中，其特征是，结合在所述多肽的糖链数，为1、2、或3股。
并且，本发明的一实施方案中，其特征是，从位于所述多肽N末端的氨基酸残基计算，至第x个的所有氨基酸、及从位于C末端的氨基酸残基计算，至第y个的所有氨基酸(其中，x及y为整数，x≥0、y≥0，且x+y，是结合在多肽的糖链的总数)结合糖链。
同时，本发明的一实施方案中，其特征是，结合在所述多肽的糖链数，为1、2、或3股；在结合在所述多肽的糖链数为1股时，该1股糖链，结合在位于所述多肽N末端的氨基酸残基、或位于C末端的氨基酸残基上；
在结合在所述多肽的糖链数为2股时，该2股糖链，结合在选自以下(1)至(3)所组成的组的氨基酸残基上：
(1)从位于所述多肽N末端的氨基酸残基计算，为第1及第2个的氨基酸残基，
(2)从位于所述多肽C末端的氨基酸残基计算，为第1及第2个的氨基酸残基，
(3)位于所述多肽N末端的氨基酸残基、及位于所述多肽C末端的氨基酸残基，
在结合在所述多肽的糖链数为3股时，该3股糖链，结合在任一选自以下(1)至(4)所组成的组的氨基酸残基：
(1)从位于所述多肽N末端的氨基酸残基计算，为第1、第2及第3个的氨基酸残基，
(2)从位于所述多肽C末端的氨基酸残基计算，为第1、第2及第3个的氨基酸残基，
(3)从位于所述多肽N末端的氨基酸残基计算，为第1及第2个的氨基酸残基、以及位于所述多肽C末端的氨基酸残基，
(4)位于所述多肽N末端的氨基酸残基、及从位于所述多肽C末端计算，为第1及第2个的氨基酸残基。
而且，本发明的一实施方案中，其特征是，所述糖链，为具有支链的糖链。
并且，本发明的一实施方案中，其特征是，所述糖链，为选自：二唾液酸糖链、无唾液酸糖链、二-N-乙酰葡萄糖胺糖链、二甘露糖糖链、N-乙酰葡萄糖胺糖链、麦芽三糖糖链、麦芽糖糖链、麦芽四糖糖链、麦芽七糖糖链、β-环糊精、及γ-环糊精的糖链。
同时，本发明的一实施方案中，其特征是，其是水凝胶形成用组合物，该组合物包含本发明的糖链-多肽复合物。而且，该水凝胶形成用组合物，可为止血用医药组合物、亦可为缓释载体用医药组合物、亦可为培养基质用组合物。
而且，本发明的一实施方案中，其特征是，其是含本发明的糖链-多肽复合物的组合物，且所述组合物，为水凝胶的状态。并且，该类组合物，可为止血用医药组合物、亦可为缓释载体用医药组合物、亦可为培养基质用组合物。
将以上所述的本发明的一个或多个特征所任意组合的发明，本领域技术人员应可理解，应包含在本发明的范围中。
(发明的效果)
本发明的糖链-多肽复合物，在包含中性范围的宽的pH范围中亦具有高水溶性，而可形成均一透明的水凝胶，因此不受并用的药剂或溶剂所限定，可作为各种用途使用。同时，由于亦可在宽的pH范围中使用，因此适用部位(患部)不受限定。
同时，本发明的糖链-多肽复合物，在包含中性范围的宽的pH亦具有高水溶性，而可形成均一透明的水凝胶，因此在中性pH亦可以溶胶(sol)状态及凝胶(gel)状态可逆存在。亦即，糖链-多肽复合物，一旦形成凝胶状态后，即使经由机械性搅拌形成溶胶状态，亦可再形成凝胶状态。因此，可以以凝胶状态(亦即，为随时可用的状态)流通(distributed)，而不像其它肽性凝胶，在适于凝胶化的pH(例如，酸性pH)下形成凝胶后，须再进行缓冲液交换(或置换)等使pH为中性的繁杂操作。亦即，本发明的糖链-多肽复合物，与其他肽性凝胶比较，操作性非常优异。而且，本发明的糖链-多肽复合物，可使用的pH范围广，因此使用时不易发生阻塞注射筒及注射管等问题。
此外，本发明的糖链-多肽复合物，是由动物生物体内存在的糖链所修饰，因此与未受任何修饰的肽比较，其抗原性降低。同时，本发明的糖链-多肽复合物，亦几乎不会产生如在经聚乙二醇(PEG)等修饰的化合物中所见到的毒性的危险性。因此，本发明的糖链-多肽复合物，在使用于生物体时具有高安全性。
同时，由本案说明书的实施例亦可知，本发明的糖链-多肽复合物，与结合PEG的多肽比较，可形成更透明均一的水凝胶。
而且，本发明的糖链-多肽复合物，在生理条件下(中性范围)亦可形成均一透明的水凝胶，且具有低抗原性，因此适于作为动物活体中使用的水凝胶。
更具体言之，含本发明糖链-多肽复合物的水凝胶，在中性pH，即使在含高浓度血浆的条件下，亦具有可维持透明均一的凝胶状态的特征，因此在利用在如止血剂方面有高的价值。
而且，含本发明糖链-多肽复合物的水凝胶，在中性pH，即使在含任何酸性蛋白质、碱性蛋白质的情形下，亦具有高缓释性，因此在用于各种物质的缓释载体方面有高的利用价值。
附图说明
图1所示的是，(RADA)4及C(DiGlcNAc)-(RADA)4在各种pH的钢球载重试验结果的图像。
图2所示的是，(RADA)4及C(DiGlcNAc)-(RADA)4，在含各种浓度血浆的情形下的钢球载重试验结果的图像。
图3所示的是，(RADA)4及C(DiGlcNAc)-(RADA)4，在内包酸性蛋白质的情形下测定缓释效果结果的曲线图。
图4所示的是，(RADA)4及C(DiGlcNAc)-(RADA)4，在内包碱性蛋白质的情形下测定缓释效果结果的曲线图。
图5所示的是，(RADA)4，在pH2或pH7的情形下测定圆偏光二色性(CD)结果的曲线图。
图6所示的是，C(DiGlcNAc)-(RADA)4，在pH2或pH7的情形下测定圆偏光二色性(CD)结果的曲线图。
图7所示的是，(RADA)4及C(DiGlcNAc)-(RADA)4，在pH7下测定动力黏度结果的曲线图。
具体实施方式
本发明的糖链-多肽复合物，可以是生物来源的，亦可以通过化学合成而制造，但就安全性或品质的稳定性、糖链的均一性方面而言，优选以化学合成制造。
本发明的糖链-多肽复合物，例如在水溶液中，可通过肽分子间的静电相互作用、氢键结合、及疏水性相互作用等相互作用而自组装。本说明书中，糖链-多肽复合物在水溶液中所谓「自组装」，是指在水溶液中多肽之间，通过某种相互作用(例如：静电相互作用、氢键结合、范德华力、疏水性相互作用等)，自发地集合之意，但不应当被解释为具有限制意义。
本发明的糖链-多肽复合物，在水溶液中可自组装，而形成β-折叠结构。之后，再以该β-折叠结构进行数层重叠，即可形成水凝胶。确定水溶液中的糖链-多肽复合物形成β-折叠结构的方法并无特别的限定，可通过测定如含糖链-多肽复合物水溶液的圆偏光二色性(CD)，予以确定。一般而言，作为具有β-折叠结构的分子的特征，在197nm附近的波长可见到正吸收，在216nm附近的波长可见到负吸收，通过测定圆偏光二色性，确定这些波长附近的波峰，即可确定系形成β-折叠结构。
本发明的糖链-多肽复合物，由于含极性氨基酸残基与非极性氨基酸残基交互排列的氨基酸序列，在水溶液中形成β-折叠结构时，可在β-折叠结构一面仅排列极性氨基酸残基，在另一面仅排列非极性氨基酸残基。因此，可使该β-折叠结构，以形成隐藏疏水面(仅排列非极性氨基酸残基的面)的方式而组装成二层结构。随后，再进而使分子自组装而延伸该β-折叠分层结构，即可形成三维的立体结构(如水凝胶)。在本说明书中，具有此种性质的多肽以SAP(自组装肽)表示。
本发明中，所谓「pH为中性附近」，意指pH在7.0附近，更具体而言是指pH 5.0至9.0的范围，优选pH在6.0至8.0的范围内。
同时，本发明的一实施方案中，糖链-多肽复合物的特征是，在pH中性附近的水溶液中可自组装形成含β-折叠结构的水凝胶。因此只要具有该特征，并不排除在pH中性附近以外的水溶液中可自组装形成含β-折叠结构的水凝胶的那些。
本发明的糖链-多肽复合物，包含含极性氨基酸残基与非极性氨基酸残基交互排列的氨基酸序列的多肽。该氨基酸序列的长度并无限定，但优选是由8至34个氨基酸残基组成的氨基酸序列，更优选是由12至25个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且进一步优选是由16至21个氨基酸残基组成的氨基酸序列。
本发明的糖链-多肽复合物，包含含极性氨基酸残基与非极性氨基酸残基交互排列的氨基酸序列的多肽。本发明中，所谓「氨基酸」，是以其最广的意义使用，不只为构成蛋白质的氨基酸，亦包含氨基酸变异体及衍生物等非构成蛋白质的氨基酸。本领域技术人员，根据其广义定义，可理解本发明中的氨基酸，可为如：构成蛋白质的L-氨基酸；D-氨基酸；氨基酸变异体及衍生物等经过化学修饰的氨基酸；正亮氨酸、β-丙氨酸、鸟氨酸等非构成蛋白质的氨基酸；及具有本领域已知的为氨基酸特征的特性的化学合成的化合物等。非构成蛋白质氨基酸的例子，可包括：α-甲基氨基酸(α-甲基丙氨酸等)、D-氨基酸、类组氨酸氨基酸(2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸(homohistidine)、α-氟化甲基-组氨酸及α-甲基-组氨酸等)、侧链上含额外亚甲基的氨基酸(「高」氨基酸)及氨基酸侧链中的羧酸官能团为磺酸基所取代的氨基酸(磺基丙氨酸等)。本发明的优选方面中，本发明中所使用的氨基酸，可以是蛋白质构成的氨基酸。
本发明中，极性氨基酸残基，只要为侧链具有极性的氨基酸残基即可并无特别的限定，可包含如：酸性氨基酸残基及碱性氨基酸残基。本说明书中，酸性氨基酸残基，可例举如：天冬氨酸(Asp：D)残基、及谷氨酸(Glu：E)等；碱性氨基酸，可例举如：精氨酸(Arg：R)、赖氨酸(Lys：K)、组氨酸(His：H)等。
此外，本说明书中，如「天冬氨酸(Asp：D)」等的表示，是天冬氨酸的简写，即使用三字母表示时为「Asp」、以一字母表示时为「D」。
此外，本说明书中，中性氨基酸残基中，含羟基、酸酰胺基、硫醇基等的氨基酸残基，是具有极性的，因此亦包含于极性氨基酸残基中。举例如，本说明书中，酪氨酸(Tyr：Y)、丝氨酸(Ser：S)、苏氨酸(Thr：T)、天冬酰胺(Asn：N)、谷氨酰胺(Gln：Q)、半胱氨酸(Cys：C)包含于极性氨基酸残基中。
本说明书中，非极性氨基酸残基，只要侧链为不具极性的氨基酸即可并无特别的限定，可包含如：丙氨酸(Ala：A)、缬氨酸(Val：V)、亮氨酸(Leu：L)、异亮氨酸(Ile：I)、甲硫氨酸(Met：M)、苯丙氨酸(Phe：F)、色氨酸(Trp：W)、甘氨酸(Gly：G)、脯氨酸(Pro：P)等。
本发明的糖链-多肽复合物中，「极性氨基酸残基与非极性氨基酸残基交互排列的氨基酸序列」，优选为该氨基酸序列为「RADA」的重复序列(重复2至8次，优选重复3至6次)、或「RATARAEA」的重复序列(优选重复1至4次，更有选重复2至3次)的那些氨基酸序列，更优选为该氨基酸序列，为选自：RADARADARADARADA(序列编号1)、RADARADARADARADARADA(序列编号2)、及RATARAEARATARAEA(序列编号3)所组成的组的氨基酸序列。
本发明中，所谓「糖链」，意指由1个以上单元糖(单糖及/或其衍生物)连接而成的化合物。在由2个以上单元糖连接而成的情形时，各单元糖之间，经脱水缩合而以糖苷键结合。该类糖链，可例举如：生物体中所含的单糖类及多糖类(葡萄糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖、木糖、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸以及这些的复合物及衍生物)，及其他由经分解的多糖、糖蛋白、蛋白多糖、糖胺聚糖、糖脂等复合生物体分子所分解或衍生的糖链等范围广泛之物，但并不限定于此。糖链可为直链型亦可为支链型。
同时，本发明中，「糖链」中亦包含糖链的衍生物，糖链的衍生物，可例举如：构成糖链的糖，为含羧基的糖(例如：C-1位受氧化形成羧酸的醛糖酸(aldonic acid)(例如：D-葡萄糖受氧化的D-葡萄糖酸)、末端的C原子形成羧酸的糖醛酸(uronic acid)(D-葡萄糖受氧化的D-葡萄糖醛酸))、含氨基或氨基的衍生物的糖(例如：D-葡萄糖胺、D-半乳糖胺等)、含氨基及羧基两者的糖(例如：N-羟乙酰神经氨酸(N-glycoylneuraminic acid)、N-乙酰胞壁酸等)、去氧化的糖(例如：2-脱氧-D-核糖)、含硫酸基的硫酸化糖、含磷酸基的磷酸化糖等糖链但并不限定于此。
本发明的糖链-多肽复合物中，结合于多肽的糖链并无特别的限定，但就生物相容性的观点而言，优选为在生物体内作为复合糖(糖肽(或糖蛋白)、蛋白多糖、糖脂等)存在的糖链。该类糖链，可例举如生物体内结合在肽(或蛋白质)上的N-结合型糖链、O-结合型糖链等糖链的糖肽(或糖蛋白)。
本发明的糖链-多肽复合物中，结合在所述多肽的糖链，可使用如：二唾液酸(Disialo)糖链、无唾液酸(Asialo)糖链、二-N-乙酰葡萄糖胺(DiGlcNAc)糖链、二甘露糖(DiMan)糖链、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)糖链、麦芽三糖(Maltotriose)糖链、麦芽糖(Maltose)糖链、麦芽四糖(Maltotetraose)糖链、麦芽七糖(Maltohetaose)糖链、β-环糊精(β-cyclodextrin)糖链、γ-环糊精(γ-cyclodextrin)糖链。
更具体言的，本发明中所使用的糖链，可为：如下式(1)所示的二唾液酸糖链、如下式(2)所示的无唾液酸糖链、如下式(3)所示的二-N-乙酰葡萄糖胺糖链、如下式(4)所示的二甘露糖糖链、如下式(5)所示的N-乙酰葡萄糖胺糖链、如下式(6)所示的麦芽三糖糖链、如下式(7)所示的麦芽糖糖链、如下式(8)所示的麦芽四糖糖链、如下式(9)所示的麦芽七糖糖链、如下式(10)所示的β-环糊精糖链、如下式(10-2)所示的γ-环糊精糖链。
式(1)二唾液酸糖链
式(2)无唾液酸糖链
式(3)二-N-乙酰葡萄糖胺糖链
式(4)二甘露糖糖链
式(5)N-乙酰葡萄糖胺糖链
式(6)麦芽三糖糖链
式(7)麦芽糖糖链
式(8)麦芽四糖糖链
式(9)麦芽七糖糖链
式(10)β-环糊精糖链
式(10-2)γ-环糊精糖链
本发明中，亦可使用自上述二唾液酸糖链、无唾液酸糖链、二-N-乙酰葡萄糖胺糖链、二甘露糖糖链、或麦芽七糖糖链的非还原末端去除1个或多个糖的糖链。
本发明中，糖链所结合的氨基酸残基并无特别的限定，如糖链可结合在半胱氨酸(Cys：C)或天冬酰胺(Asn：N)上，优选结合在半胱氨酸(Cys：C)上。
本发明中，使糖链结合在氨基酸上的方法并无特别的限定，例如氨基酸残基可直接结合糖链，亦可为氨基酸残基经由连接基团而结合糖链。
同时，本发明中，糖链所结合的氨基酸残基，可与「极性氨基酸残基与非极性氨基酸残基交互排列的氨基酸序列」直接结合，或可以如经由连接基团结合。
此类连接基团，可例举如两末端含氨基及羧基的烷链及PEG链等，以使其可与氨基酸结合而形成肽键。此类连接基团，可举如：-NH-(CH2)n-CO-(式中，n为整数，只要不妨碍目的的连接基团的功能即可并无特别的限定，优选为1至15的整数。)或-NH-(CH2CH2O)m-CH2CH2-CO-(式中，m为整数，只要不妨碍目的连接基团的功能即可并无特别的限定，优选为1至7的整数。)等。更具体地可举如：-NH-(CH2)11-CO-(C12-连接基团)及-NH-(CH2CH2O)3-CH2CH2-CO-(PEG-连接基团)等。
本发明的糖链-多肽复合物，可以以本领域技术人员一般已知的多肽合成方法，再加入糖链附加步骤制造。在附加糖链时，尽管可以利用，以转谷氨酰胺酶为代表的酶的方法，但该情形时，会有附加的糖链必须是大量的、使最终步骤后的纯化烦杂、糖链附加的位置及可附加的糖链亦受限定等问题。因此该方法虽可使用于分析用途等少量的合成中，但在大规模制造上其并非是实用性的方法。
以下所例举的是本发明糖链-多肽复合物的简便制造方法的具体例：通过使用结合糖链的Asn(糖链附加Asn)，再适当使用固相合成、液相合成等公知的肽合成方法而制造糖链-多肽复合物的方法(A法)；及通过依照公知的肽合成方法制造任意氨基酸残基是Cys的多肽，之后，再经由化学合成在Cys上附加糖链，以制造糖链-多肽复合物的方法(B法)。以此类制造方法为参考，本领域技术人员即可以各种方法制造糖链-多肽复合物。
再者，此类A法及B法，亦可以2种以上组合进行。在用于分析等少量的合成时，上述方法可进一步与转移酶的糖链延伸反应组合使用。而且，A法，在专利国际公开第2004/005330号简报(US 2005222382(A1))中，B法，在国际公开第2005/010053号简报(US2007060543(A1))中，亦各有记载，其所公开内容亦全部并在本说明中作为参考。此外，关于制造在A法及B法中所使用的糖链构造为均一的糖链，亦曾记载在国际公开第03/008431号简报(US 2004181054(A1))、国际公开第2004/058984号简报(US 2006228784(A1))、国际公开第2004/058824号简报(US 2006009421(A1))、国际公开第2004/070046号简报(US2006205039(A1))、国际公开第2007/011055号简报等之中，其所公开内容亦全部并在本说明中作为参考。
糖链-多肽复合物的制造方法(A法)
糖链-多肽复合物，可如，以下概略所示，使用结合糖链的Asn经由固相合成制造。
(1)先使氨基氮受脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基结合于树脂(resin)。在该情形下，由于氨基酸的氨基氮受脂溶性保护基所保护，因此可防止氨基酸之间自缩合，而使树脂与氨基酸反应而结合。
(2)之后再使所得反应物的脂溶性保护基脱离而形成游离氨基。
(3)该游离氨基，再与氨基氮受脂溶性保护基所保护的任意氨基酸的羧基，进行酰胺化反应。
(4)之后使上述脂溶性保护基脱离而形成游离氨基。
(5)重复上述(3)及(4)的步骤1次以上，即可使任意数目的任意氨基酸结合而获得一末端结合树脂，另一末端上含游离氨基的肽。
(6)在上述(5)中所合成的肽的游离氨基将要受乙酰基所保护时，优选使用乙酸酐、乙酸等进行乙酰化。
(7)最后，再以酸切断树脂，即可得到具有期望的氨基酸序列的肽。
其中，在(1)中，通过使用氨基氮受脂溶性保护基所保护的糖链附加Asn，替代氨基氮受脂溶性保护基所保护的氨基酸，并使该天冬酰胺部分的羧基与树脂的羟基反应，即可获得C末端含糖链附加Asn的肽。
同时，在(2)之后，或以1次以上的任意次数重复(3)及(4)之后，在(3)中，使用氨基氮受脂溶性保护基所保护的糖链附加Asn，替代氨基氮受脂溶性保护基所保护的氨基酸，即可在多肽的任意位置结合糖链。
如此操作，在任何(1)及(3)的步骤中，2次以上，使用氨基氮受脂溶性保护基所保护的糖链附加Asn，替代氨基氮受脂溶性保护基所保护的氨基酸，即可在多肽的任意2处以上结合糖链。
在结合糖链附加Asn之后，再使脂溶性保护基脱离而形成游离氨基，之后随即进行步骤(7)，即可得到N末端含糖链附加Asn的多肽。
提供的C末端为酰氨基的树脂，一般只要为可在固相合成中使用的树脂即可，优选使用如：以氨基官能化的Rink-Amide-Resin(Merck公司制造)、Rink-Amide-PEGA Resin(Merck公司制造)、或NH-SAL-Resin(渡边化学公司制造)。此外，亦可在以氨基官能化的Amino-PEGA-Resin(Merck公司制造)等上再结合Fmoc-NH-SAL-Resin-Linker(渡边化学公司制造)等。之后再以酸切断该类树脂与肽，即可使肽C末端的氨基酸酰胺化。
此外，使C末端为羧酸的树脂(resin)，优选使用如：以氯官能化的2-氯三苯甲基氯树脂(Merck公司制造)、以氨基官能化的Amino-PEGA Resin(Merck公司制造)、含羟基的NovaSyn TGT醇树脂(Merck公司制造)、Wang Resin(Merck公司制造)、及HMPA-PEGA Resin(Merck公司制造)等。同时，在Amino-PEGA Resin与氨基酸之间可以存在连接基团，该连接基团，可列举如：4-羟基甲基苯氧基乙酸(HMPA)、4-(4-羟基甲基-3-甲氧基苯氧基)-丁基乙酸(HMPB)等。亦可使用C末端的氨基酸预先与树脂结合的H-Cys-(Trt)-Trityl Nova PEG树脂(Merck公司制造)等。
对于树脂与氨基氮受脂溶性保护基所保护的氨基酸的结合，可使用如含羟基的树脂或以氯官能化的树脂，使氨基酸的羧基以酯键结合在树脂。同时，亦可使用以氨基官能化的树脂，使氨基酸的羧基以酰胺键结合在树脂。
而且，2-氯三苯甲基氯树脂是优选的，因为在固相合成中肽链延伸时，其具有可防止末端Cys消旋化的特点。
糖链-多肽复合物的制造方法-2(A法)
糖链-多肽复合物，可如以下概略所示，使用结合糖链的Asn经由液相合成制造。
(1)先使氨基氮受脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基，与氨基游离而羧基受保护或酰胺化的氨基酸结合。
(2)之后再使所得反应物的脂溶性保护基脱离而形成游离氨基。
(3)该游离氨基，再与氨基氮受脂溶性保护基所保护的任意氨基酸的羧基，在溶液中进行酰胺化反应。该情形时，N末端侧氨基酸的氨基氮受脂溶性保护基所保护，C末端侧的羧基受保护或酰胺化，因此可防止氨基酸之间自缩合，游离氨基与羧基反应而结合。
(4)之后再使上述脂溶性保护基脱离而形成游离氨基。
(5)重复上述(3)及(4)的步骤1次以上，即可使任意数目的任意氨基酸结合，而获得C末端的羧基受保护或酰胺化、N末端含游离氨基的肽。
(6)在上述(5)中所合成的肽的游离氨基将要受乙酰基保护时，优选使用乙酸酐、乙酸等进行乙酰化。
(7)最后，再以酸切断侧链的脂溶性保护基，即可得到具有期望的氨基酸序列的肽。
糖链-多肽复合物的制造方法-3(A法)
糖链-多肽复合物，可如以下概略所示，以结合糖链的Asn经由片段合成法制造。
(1)先以制造上述糖链-多肽复合物的方法(A法)的(1)至(6)，在树脂上合成氨基氮受乙酰基或脂溶性保护基保护的多肽或糖链-多肽复合物。
(2)之后再于侧链保护基未经脱保护的条件下，自树脂切断多肽或糖链-多肽复合物，即可获得C末端含游离羧基、N末端氨基氮受乙酰基或脂溶性保护基保护的多肽或糖链-多肽复合物。
(3)所得的氨基氮受乙酰基或脂溶性保护基保护的多肽或糖链-多肽复合物，再经由固相合成法或液相合成法，与树脂或多肽结合。
(4)之后再使上述脂溶性保护基脱离而形成游离氨基。
(5)重复上述(3)及(4)的步骤1次以上，即可使任意数目的任意氨基酸结合而得到肽。
(6)最后，再以酸切断树脂，即可得到具有期望的氨基酸序列的肽。
脂溶性保护基，可例举如：9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)、苯甲基、烯丙基、烯丙氧基羰基、乙酰基等，羧酸酯系或酰胺系的保护基等。在氨基酸上导入脂溶性保护基时，例如在导入Fmoc基时，可加入9-芴基甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯与碳酸氢钠进行反应而导入。该反应可在0至50℃、并优选在室温，进行反应约1至5小时。
受脂溶性保护基保护的氨基酸，亦可使用已商品化的商品。其例可列举如：Fmoc-Ser-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys-OH、Fmoc-Arg-OH、Fmoc-His-OH、Fmoc-Asp-OH、Fmoc-Glu-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Cys-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Pro-OH。
此外，受脂溶性保护基保护的、在侧链导入保护基的氨基酸，可列举如：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Cys(StBu)-OH、Fmoc-Cys(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH。
此外，想要在糖链-多肽结合物的氨基酸序列中，附加连接基团时，在固相合成的过程中，通过替代上述受脂溶性保护基所保护的氨基酸，而使用受脂溶性保护基保护的连接基团，即可于优选的位置，嵌入连接基团。
在使用2-氯三苯甲基氯树脂的情形时，可使用：二异丙基乙胺(DIPEA)、三乙胺、吡啶、2,4,6-三甲吡啶等碱进行酯化。在使用含羟基的树脂时，作为酯化的催化剂，可使用：1-均三甲苯基磺酰基-3-硝基-1,2,4-三唑(MSNT)、二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)等一般已知的脱水缩合剂。氨基酸与脱水缩合剂的使用比例是，相对于前者1当量，后者，一般为1至10当量、优选2至5当量。
酯化反应，优选通过例如将树脂置入固相的管柱中，再以溶剂洗净该树脂，之后加入氨基酸的溶液进行操作。洗净用溶剂，可列举如：二甲基甲酰胺(DMF)、2-丙醇、二氯甲烷等。溶解氨基酸的溶剂，可列举如：二甲基亚砜(DMSO)、DMF、二氯甲烷等。酯化反应可以在0至50℃、优选室温进行约10分钟至30小时左右、优选15分钟至24小时左右。
此时固相上未反应的基团，优选使用乙酸酐等进行乙酰化而封端(capping)。
脂溶性保护基的脱离，例如以碱处理进行。该碱，可列举如：哌啶、吗啉等。其中，优选在溶剂存在下进行该操作。其溶剂，可列举如：DMSO、DMF、甲醇等。
游离氨基与氨基氮受脂溶性保护基所保护的任意氨基酸的羧基的酰胺化反应，优选在活化剂及溶剂存在下进行。
活化剂的例子，可列举如：二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺·盐酸盐(WSC/HCl)、叠氮基磷酸二苯酯(DPPA)、羰基二咪唑(CDI)、氰基膦酸二乙酯(DEPC)、苯并三唑-1-基氧-三吡咯烷基鏻(DIPCI)、苯并三唑-1-基氧-三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、羟基琥珀酰亚胺(HOSu)、二甲基氨基吡啶(DMAP)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)、羟基邻苯二甲酰亚胺(HOPht)、五氟苯酚(Pfp-OH)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、1-〔双(二甲基氨基)亚甲基〕-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HCTU)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)、O-苯并三唑-1-基-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)、3,4-二氢-3-羟基-4-氧杂-1,2,3-苯并三嗪(Dhbt)(3,4-dihydro-3-hydrodi-4-oxa-1,2,3-benzotriazine(Dhbt))、氯化4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉n水合物(DMT-MM)等。
活化剂的使用量，相对于氨基氮受脂溶性保护基所保护的任意氨基酸，为1至20当量、优选1至10当量、更优选1至5当量。
溶剂的例子，可列举如：DMSO、DMF、二氯甲烷等。反应可以在0至50℃、优选在室温，进行约10分钟至30小时左右、优选15分至24小时左右。脂溶性保护基的脱离，可如上述同样进行。
在导入C末端氨基酸至氨基官能化的Rink-Amide-Resin(Merck公司制造)、Rink-Amino-PEGA Resin(Merck公司制造)、NH-SAL-Resin(渡边化学公司制造)、及NH-SAL-Resin-Linker所结合的Amino-PEGA-Resin(Merck公司制造)等时，可用上述的酰胺化反应进行导入。
自树脂(resin)切断肽链时，优选使用酸处理。该酸的例子，可列举如：三氟乙酸(TFA)、氟化氢(HF)等。
如此操作，即可得到在期望的位置含糖链附加Asn的糖链-多肽复合物。
同时，在本发明的一实施方案中，在固相合成所使用的糖链附加Asn中的糖链的非还原末端含唾液酸时，为防止酸处理使唾液酸切断，优选该唾液酸的羧基经保护基保护。该保护基的实例，可列举如：苯甲基、烯丙基、二苯基甲基、苯甲酰甲基等。保护基的导入及保护基的脱离方法，可以以公知的方法进行。
糖链-多肽复合物的制造方法(B法)
糖链-多肽复合物，可以通过先行合成多肽，之后再将合成的多肽附加在糖链的方法制造。具体而言，即对在将要附加糖链的位置含Cys的多肽，用固相合成法、液相合成法、以细胞合成的方法、由天然存在之物中分离萃取的方法等制造。在多肽以固相合成法或液相合成法合成的情形时，氨基酸可各以一残基结合，亦可结合在多肽。其中，在预定形成双硫键的位置的Cys等将不附加糖链的Cys，预先以如乙酰胺甲基(Acm)予以保护。同时，在糖链-多肽复合物中导入将不附加糖链、且也不用于形成双硫键的Cys时，可以在糖链附加步骤及形成双硫键步骤的过程中，预先以保护基保护Cys，之后再通过脱保护即可导入Cys。此类保护基，可例举如：叔丁基(tBu)或4-甲氧基苯甲基等。
此外，在1多肽中，在Cys附加不同糖链时，可通过首先使用于导入糖链的Cys未受保护，其次将用于导入不同糖链的Cys，预先通过StBu等保护，即可导入不同的糖链。具体而言，即在以固相合成等合成多肽时，先使要导入第一糖链的Cys不受保护，且以Fmoc-Cys(StBu)-OH等使要导入第二糖链的Cys等，形成含保护基的Cys。然后，再于维持StBu等保护基的同时，在未受保护的Cys上导入糖链。其次，将StBu基团等进行脱保护，即可在未受保护的Cys上导入不同的糖链。而且，将要导入第一糖链的Cys及将要导入第二糖链的Cys，可为1个亦可为多个。
此外，StBu基团的脱保护，可以使用：三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、三丁基膦等还原剂进行反应而脱保护。上述反应，一般在0至80℃进行，优选在5至60℃进行，更优选在10至35℃进行。反应时间，一般优选为30分钟至5小时左右。反应完成后，优选再经由适当、公知的方法(如高效液相柱色谱(HPLC))纯化。
在导入不同的糖链时，优选导入对CyS的脱保护步骤中的还原条件及HPLC等的纯化步骤中的酸性条件，更为稳定的糖链。特别是，在导入含唾液酸的糖链时，优选先导入不含唾液酸的糖链或唾液酸残基数少的糖链。
同时，在想要于糖链-多肽复合物的氨基酸序列中，附加连接基团时，可通过例如在固相合成的过程中，替代以脂溶性保护基保护的氨基酸，而使用以脂溶性保护基保护的连接基团，即可在所合成的多肽的所期望的位置，嵌入连接基团。
接着，再通过使卤代乙酰化糖链衍生物与在上述中所得的含无保护Cys的肽反应，而使糖链与无保护Cys的硫醇基反应，而结合于肽上。上述反应，可在磷酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、或它们的混合溶液中，一般在0至80℃进行反应，优选在10至60℃进行反应，更优选在15至35℃进行反应。反应时间，通常为10分钟至24小时，一般优选为30分钟至5小时左右。在反应完成后，亦可再以适当、公知的方法(如HPLC)纯化。
卤代乙酰化糖链衍生物，可列举如天冬酰胺结合型糖链的1位碳结合的羟基，以-NH-(CH2)a-(CO)-CH2X(X为卤素原子，a为整数，只要不妨碍目的的连接基团的功能即可并无特别的限定，而表示0至4的整数)取代的化合物。
具体而言，卤代乙酰化复合型糖链衍生物与含Cys多肽在磷酸缓冲液中，于室温反应。反应完成后，再经由HPLC纯化即可获得含糖链结合Cys的糖链-多肽复合物。
此外，亦可在DMSO、DMF、甲醇、乙腈等有机溶剂、与上述缓冲液的混合溶液中进行反应。此时，可以有机溶剂的比例，为0至99％(v/v)的范围，添加至上述缓冲液中。这对于含对缓冲液溶解性低的无保护Cys的肽是优选的，因为可通过添加此类有机溶剂而提高对反应溶液的溶解性。
此外，亦可在DMSO、DMF、甲醇、乙腈等机溶剂、及它们的混合溶液中进行反应。优选在碱存在下进行该反应。碱的例子，可列举如：DIPEA、三乙胺、吡啶、2,4,6-三甲吡啶等。同时，亦可在缓冲溶液中再加入胍盐酸盐或尿素的混合溶液中进行反应。其中，胍盐酸盐或尿素，可以最终浓度1M至8M加入上述缓冲溶液中。添加胍盐酸盐或尿素，可提高对缓冲液溶解性低的肽的溶解性，因此是优选的。
此外，含无保护Cys的多肽，为了防止经由双硫键而形成2聚体，亦可在缓冲液中添加三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)或二硫苏糖醇(DTT)之后反应。TCEP或DTT，可以最终浓度10μM至10mM加入缓冲溶液中。
之后，在糖链结合在目的的Cys之后，再以Acm等使受保护的Cys的保护基脱保护。在保护基为Acm基时，可在水、甲醇、乙酸、或它们的混合溶液中，使用碘、乙酸汞(Ⅱ)、硝酸银(I)、或乙酸银(I)等反应而脱保护。
上述反应，一般在0至80℃进行，优选在5至60℃、更优选在10至35℃进行。反应时间，一般优选为5分钟至24小时左右。在反应完成后，在以DTT及盐酸等处理之后，亦可再以适当、公知的方法(如HPLC)纯化。
如此操作，即可得到在期望的位置含结合糖链的Cys的糖链-多肽复合物。同时，此类纯化的糖链-多肽复合物，亦可再如下文所述，使脱保护的Cys之间形成双硫键。
此外，在制造肽序列中含多股的含唾液酸糖链(诸如二唾液酸糖链及单唾液酸糖链等)的糖链-多肽复合物时，亦可使用所要导入的糖链上的唾液酸的羧基，受苯甲基(Bn)、烯丙基、二苯基甲基、苯甲酰甲基等保护的含唾液酸糖链。
在导入唾液酸的羧基受保护的糖链时，亦可在后述的糖链-多肽复合物中双硫键的形成步骤之后，再进行唾液酸保护基的脱保护步骤。
如此操作，通过以苯甲基等保护唾液酸的羧基，使制造步骤中经由HPLC等的分离/纯化步骤容易。同时，保护唾液酸的羧基，亦可防止对酸不稳定的唾液酸脱离。
糖链上唾液酸羧基的保护反应，可以本领域技术人员熟习的方法进行。同时，形成双硫键的糖链-多肽复合物中，唾液酸羧基的保护基，可以在碱性条件下进行水解脱保护。上述反应，一般在0至50℃进行，优选在0至40℃进行，更优选在0至30℃进行。反应时间，一般优选为5分钟至5小时左右。在反应完成后，在以磷酸或乙酸等弱酸中和之后，亦可再以适当、公知的方法(如HPLC)纯化。
此外，通过上述A法及B法制作的糖链-多肽复合物，可以利用：空气及/或氧、碘、DMSO、氧化和还原的谷胱甘肽的混合物、铁氰酸钾、埃尔曼试剂(5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸))、三氟乙酸铊(Ⅲ)、以及烷基三氯硅烷亚砜等通过本领域技术人员公知的方法，形成Cys之间的双硫键。
此外，在形成Cys-Cys间的双硫键时，对糖链-多肽复合物中的不希望形成双硫键的Cys，可预先以保护基保护。此类保护基的例子，可使用如：Acm、tBu、4-甲氧基苯甲基、4-甲基苯甲基等在氧化条件下稳定的保护基。
而且，B法中，形成双硫键，亦可在导入糖链之前进行。但是，在要形成双硫键的Cys上导入保护基时，脱保护步骤须在形成双硫键步骤之前进行。
此外，B法中与卤代乙酰化复合型糖链衍生物反应的氨基酸，只要为含硫醇基的氨基酸即可并无特别的限定，例如D-型的半胱氨酸(D-Cys)、高半胱氨酸、原半胱氨酸(norcysteine)、青霉胺等可与Cys同样使用。
本发明的糖链-多肽复合物中结合的糖链种类并无特别的限定，但优选糖链-多肽复合物中结合的糖链所存在的糖残基数合计为5以上。例如，通过1股以上的5糖以上的糖链附加、多股5糖以下的糖链附加，即可使存在于1个糖链-多肽复合物中附加糖链的糖残基数为5以上。在以多股糖链附加时，结合在1个肽上的糖链的种类可相同，亦可以以不同种类的糖链组合结合，但优选以相同种类的糖链结合。
例如，在存在于糖链-多肽复合物中的结合糖链的糖残基数合计为5时，可以用含2个糖残基的麦芽糖糖链、含3个糖残基的麦芽三糖糖链各1股进行结合。同时，在存在于糖链-多肽复合物中的结合糖链的糖残基数合计为6时，可以3股麦芽糖糖链进行结合，亦可以2股麦芽三糖糖链进行结合。此外，在存在于糖链-多肽复合物中的结合糖链的糖残基数合计为7时，可以2股麦芽糖糖链及1股麦芽三糖糖链进行结合，亦可以以1股含7个糖残基的二-N-乙酰葡萄糖胺糖链进行结合。同样地，在存在于糖链-多肽复合物中的结合糖链的糖残基数合计为8以上时，可以各种组合的糖链进行结合。
结合在本发明糖链-多肽复合物的糖链数，只要糖链-多肽复合物，不致失去可在pH中性附近的水溶液中自组装，而形成β-折叠结构的特征即可并无特别的限定。例如，可以是1、2、3、4、5、或6股，优选是1、2、或3股。
本发明的糖链-多肽复合物中，糖链所结合的氨基酸残基的位置，只要不致失去糖链-多肽复合物，可在pH中性附近的水溶液中自组装，而形成β-折叠结构的特征即可并无特别的限定。例如，糖链结合的氨基酸残基的位置可以在多肽的N末端侧及/或C末端侧，在N末端侧及C末端侧以外的位置亦可。
优选地，可以在从位于多肽N末端的氨基酸残基计算，至第x个的全部的氨基酸、及从位于C末端的氨基酸残基计算，至第y个的全部的氨基酸(其中，x及y为整数，而x 0、y 0，且x+y，系结合在多肽的糖链数的合计)上均结合糖链。
更具体而言，在多肽结合的糖链数为1股时，该1股的糖链，可结合在位于所述多肽N末端的氨基酸残基、或位于所述多肽C末端的氨基酸残基。
同时，在多肽结合的糖链数为2股时，该2股的糖链，可结合在选自以下的(1)至(3)所组成的组的氨基酸残基：
(1)从位于多肽N末端的氨基酸残基计算的第1个及第2个氨基酸残基
(2)从位于多肽C末端的氨基酸残基计算的第1个及第2个氨基酸残基
(3)位于多肽N末端的氨基酸残基、及位于多肽C末端的氨基酸残基
而且，在多肽结合的糖链数为3股时，该3股的糖链，可与选自以下(1)至(4)所组成的组的任意氨基酸残基结合：
(1)从位于多肽N末端的氨基酸残基计算，第1个、第2个及第3个氨基酸残基
(2)从位于多肽C末端的氨基酸残基计算，第1个、第2个及第3个氨基酸残基
(3)从位于多肽N末端的氨基酸残基计算，第1个及第2个氨基酸残基、及位于多肽C末端的氨基酸残基
(4)位于多肽N末端的氨基酸残基、及从位于多肽C末端计算，第1个及第2个氨基酸残基
本发明的糖链-多肽复合物上所附加的糖链，优选含支链。其中，本发明中，多肽结合的糖链为所谓「含支链的糖链」时，并不限于例如，在诸如二唾液酸糖链、无唾液酸糖链、二-N-乙酰葡萄糖胺糖链等1个糖链中含支链的情形，而且还涵盖例如，在1个多肽中附加多股直链糖链，而以肽整体而言为含支链糖链的状态的情形。例如，在1个肽中结合2股以上的麦芽糖糖链或麦芽三糖糖链等直链糖链时，亦包含在本发明的「含支链的糖链」中。
本发明中，所谓水凝胶，意指基本上分散介质为水的凝胶。只要本发明的肽可分散在水中，形成水凝胶，肽与水的混合比例并无特别的限定，本领域技术人员亦可视水凝胶的用途适当调节混合的比例。例如，本发明的一实施方案中，在以C(DiGlcNAc)-(RADA)4制造水凝胶时，肽浓度为0.5重量％以上时可在宽的pH形成水凝胶，而在肽浓度为约0.25重量％时，可在中性pH形成水凝胶，但在酸性pH并不形成水凝胶。因此，以本发明的肽制造的水凝胶，在肽浓度为低浓度时，可以通过pH控制水凝胶的形成。利用此种性质，可以例如，在使用水凝胶后通过改变pH，使凝胶变化为溶胶，即可快速抛弃或排出。
本发明中，对水凝胶的强度及性质的评量方法并无特别的限定，可以通过例如钢球载重试验及动力黏度测定评量。钢球载重试验，可例如，通过在杜汉氏管(Durham tube)内形成的水凝胶的表面负载给定重量的钢球，以观察钢球于水凝胶的表面停留、或下沉，来评量水凝胶的强度。同时，在钢球载重试验中，亦可同时目视确定水凝胶的透明度、及有无不溶物或沉淀。在水凝胶的动力黏度测定时，通过以流变仪测定对象的水凝胶动力黏度，即可测定随时间经过的水凝胶强度变化。
此外，本实施例中评量水凝胶时，作为形成水凝胶的操作之一，亦包含剧烈搅拌的操作。进行此类剧烈搅拌的操作，可形成高均一性的凝胶，因此可使进行的评量更可靠。
本发明的水凝胶可用于各种用途中，例如，本发明的水凝胶对生物体的安全性高，因此可用于医药用途(止血基质、血管栓塞材料等的手术辅助剂、医药品等的缓释载体、外科手术或再生医疗等之中的创伤包覆材料、黏膜隆起材料、齿槽骨重建材料、角膜再生材料等组织重建材料，组织培养实验等之中的三维培养基质)或化妆品用途(护肤用品、护发用品等)上。特别优选地，它可以用作止血基质、缓释载体、或培养基质更佳。
本发明中，所谓止血基质，广泛指生物体出血的止血所使用的基质。本发明的止血基质，并不限定仅包含本发明的糖链-多肽复合物与水，亦可再含其他的各种成分。例如，再含具有消毒/杀菌成分的药剂时，不只对伤口出血进行止血，亦同时可进行伤口的杀菌/消毒。
本发明中，所谓缓释载体，广泛指具有缓缓释放内包物质或药剂的性质的载体。本发明的缓释载体中内包的物质并无特别的限定，可内包各种物质或药剂。同时，本发明缓释载体中内包的物质或药剂并不限定为1种，亦可同时内包2种以上的物质或药剂。
本发明中，所谓培养基质，广泛指细胞及组织的培养所使用的基质。例如，将本发明的培养基质涂布于细胞培养用的培养皿，再培养细胞，即可提高细胞的粘附性/成长性。同时，例如在本发明的培养基质中将细胞及组织内包并进行培养，亦可对细胞及组织有效率地进行三维培养。
本发明中，所谓黏膜隆起材料，广泛指在通过内窥镜手术的胃癌及食道癌等黏膜的切除手术或黏膜下层剥离手术中，用于在病变部位形成黏膜隆起的膜下注入材料。例如，在以内窥镜等切除病变部位时，在病变部位的下部注入本发明的组织隆起材料使切除部位隆起时，可容易地进行病变部位的切除。
本发明中，所谓血管栓塞材料，广泛指动脉栓塞术中，作为栓塞物使用的血管内栓塞促进用修复材料。在肝癌或子宫肌瘤等的动脉栓塞术中，以本发明的血管栓塞材料自病变部位上游的动脉内注射，在与血液接触时可形成水凝胶。由此可阻塞肿瘤营养供给路径的动脉，即可杀死肿瘤。
本发明中，所谓组织重建材料，广泛指再生医疗中，在生物体内重建组织时形成支架的材料。例如，在骨的再生中，注入本发明的组织重建材料，可形成细胞支架进行骨形成，即可促进骨的再生。
此外，本说明书中所使用的用语，用以说明特定的实施方案，并无限定发明的含意。
此外，本说明书中所使用的「包含」的用语，除文意上明显须不同地理解的情形外，是所述事项(组件、步骤、要素、数字等)所存在的含意，但并未排除存在以外的其他事项(组件、步骤、要素、数字等)。
只要无不同的定义，在此所使用的全部的用语(包含技术用语及科学用语)，具有与本发明所属技术领域的技术人员所广泛理解的相同的含意。其中所使用的用语，除非明显表示为不同的定义，否则应被解释成与本说明书及关连技术领域中的含义一致的含义，而不应被解释成理想化、或过度形式化的含义。
第一的、第二等用语在表达各种要素的情形时使用，但应理解这些要素并不受该类用语所限定。此类用语只为使一种要素与其他的要素区别，例如将第一要素记载为第二要素，同样地，将第二要素记载为第一要素，均不会脱离本发明的范围。
以下，再以实施例更具体说明本发明，然而，本发明可以各种实施方案具体化，因此不可被解释成受限于本文所记载的实施例。
本说明书中，如表示为二唾液酸-BrAc时，即表示为溴乙酰化的二唾液酸糖链。此外，在如表示为C(二唾液酸)-(RADA)4时，即表示在含RADARADARADARADA氨基酸序列的多肽的N末端，结合二唾液酸结合的半胱氨酸残基。
实施例
(合成例1)麦芽七糖-BrAc的合成
(合成例1-1)胺化
先将下述式(11)所示的化合物1(商品名：麦芽七糖，东京化成公司制造)(53.2mg，46.1μmol)溶于水(5mL)。再将碳酸氢钠(3.6g)加入溶液中，在升温至37℃之后搅拌19小时。然后加入水，并在减压条件下进行浓缩数次。之后再次溶于水中并冷冻干燥，即可获得含如下述式(12)所示的化合物2的冷冻干燥品。
式(11)
式(12)
(合成例1-2)溴乙酰化
先将合成例1-1中所得的化合物2及碳酸钠(83.0mg，0.92mmol，相对于化合物2为20当量)溶于水中并冷却至0℃。之后缓缓滴入溶于二氯甲烷的溴乙酰溴(40.0μL，0.46mmol，相对于化合物2为10当量)，并搅拌2小时。再以二氯甲烷及水并使其分液，并于水层中加入氢溴酸。之后于减压条件下，浓缩部分的水。
该反应溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：水，B：乙腈，梯度A：B＝99.5：0.5→90：10，15分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(13)所示的麦芽七糖-BrAc(26.7mg，20.9μmol，产率46％)。
式(13)
(合成例2)麦芽糖-BrAc的合成
除改用下述式(14)所示的化合物3(商品名：麦芽糖，东京化成公司制造)(200mg，0.58mmol)取代化合物1以外，以合成例1相同的操作方法进行合成，即可获得如下述式(15)所示的麦芽糖-BrAc(179.1mg，产率67％)。
式(14)
式(15)
(合成例3)麦芽三糖-BrAc的合成
除改用下述式(16)所示的化合物4(商品名：麦芽三糖，东京化成公司制造)(100mg，198.6μmol)取代化合物1以外，以合成例1相同的操作方法进行合成，即可获得如下述式(17)所示的麦芽三糖-BrAc(58.2mg，产率47％)。
式(16)
式(17)
(合成例4)麦芽四糖-BrAc的合成
除改用下述式(18)所示的化合物5(商品名：麦芽四糖，东京化成公司制造)(200mg，0.2mmol)取代化合物1以外，以合成例1相同的操作方法进行合成，即可获得如下述式(19)所示的麦芽四糖-BrAc(133.1mg，产率51％)。
式(18)
式(19)
(合成例5)β-环糊精-BrAc的合成
除改用下述式(20)所示的化合物6(商品名：3A-氨基-3A-脱氧-(2AS,3AS)-β-环糊精水合物，东京化成公司制造)(101.5mg，89.5μmol)取代化合物1以外，以合成例1-2相同的操作方法进行合成，即可获得如下述式(21)所示的β-环糊精-BrAc(31.2mg，产率28％)。
式(20)
式(21)
(合成例6)γ-环糊精-BrAc的合成
除改用下述式(22)所示的化合物7(商品名：3A-氨基-3A-脱氧-(2AS,3AS)-γ-环糊精水合物，东京化成公司制造)(100.0mg，77.1μmol)取代化合物1以外，以合成例1-2相同的操作方法进行合成，即可获得如下述式(23)所示的γ-环糊精-BrAc(41.1mg，产率38％)。
式(22)
式(23)
(合成例7)二唾液酸-BrAc的合成
以与WO2005/010053中记载的方法的相同的操作方法进行合成，即可获得如下述式(25)所示的二唾液酸-BrAc。
式(25)
(合成例8)无唾液酸-BrAc的合成
以与WO2005/010053中记载的方法相同的操作方法进行合成，即可获得如下述式(27)所示的无唾液酸-BrAc。
式(27)
(合成例9)DiGlcNAc-BrAc的合成
以与WO2005/010053中记载的方法相同的操作方法进行合成，即可获得如下述式(29)所示的DiGlcNAc-BrAc。
式(29)
(合成例10)DiMan-BrAc的合成
以与WO2005/010053中记载的方法相同的操作方法进行合成，即可获得如下述式(31)所示的DiMan-BrAc。
式(31)
(合成例11)GlcNAc-BrAc的合成
以与WO2005/010053中记载的方法相同的操作方法进行合成，即可获得如下述式(33)所示的GlcNAc-BrAc。
式(33)
(合成例12)DiBn-二唾液酸-BrAc的合成
先在二唾液酸-BrAc(28.9mg，12.3μmol)中依序加入DMF(0.58mL)、溴化锂(21.5mg，248μmol)、苄基溴(14.6μL，122μmol)，之后于30℃反应20小时。在再次添加苄基溴(14.6μL，122μmol)之后再反应20小时。之后于该反应溶液中加入甲苯(30mL)，经由离心分离(10,000×g，10分钟)之后，再以水(100μL)溶解沉淀物并以HPLC〔管柱：SHISEIDOCAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：8.0mL/分钟，展开剂水：乙腈＝95：5→70：30，20分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(35)所示的DiBn-二唾液酸-BrAc(7.6mg，产率24％)。
式(35)
MALDI-MS：(m/z)计算值C100H152BrN7O62:〔M+Na〕+2544.8,实测值2544.4。
(合成例13)C(二唾液酸)-(RADA)4的合成
(合成例13-1)Ac-C(RADA)4-NH2的合成
先于固相合成用管柱中填充Rink amide PEGA树脂(100μmol)，以DMF及二氯甲烷清洗后，再加入Fmoc-Ala-OH(124.5mg，400μmol)、1-双二甲基氨基亚甲基-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HCTU)(157.2mg，380μmol)及二异丙基乙胺(DIPEA)(104.5μL，600μmol)DMF(2.5mL)溶液，并振荡15分种。在以二氯甲烷及DMF清洗后，其Fmoc保护基，再经20％的哌啶的DMF溶液处理去除。以DMF清洗后，再使用Prelude(商标)肽合成机，通过Fmoc法以肽固相合成法合成受保护的下述式(36)所示，为结合在树脂状态的多肽(序列编号4)。缩合反应，使用缩合剂HCTU并于DMF中进行。
式(36)(Resin:树脂，下同)
Fmoc保护基，经20％的哌啶的DMF溶液处理去除。以DMF及二氯甲烷清洗之后，再加入乙酸酐及吡啶并振荡1小时。在以DMF及二氯甲烷清洗之后，加入三氟乙酸(TFA)：水：三异丙基硅烷：乙二硫醇(＝90：2.5：5：2.5)，并于室温振荡4小时。之后过滤去除树脂，再于滤液中加入冷却的二乙基醚，即可得到粗肽沉淀。该粗肽的部分再以HPLC〔管柱：SHISEIDOCAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝88：12→78：22％，11分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(37)所示的多肽(序列编号5)(32.7mg)。
Ac-Cys-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-NH2
式(37)
(合成例13-2)硫醇的糖链修饰反应
先将以合成例13-1中记载的方法所得的多肽(序列编号5)(20.5mg，11.2μmol)、合成例7中合成的二唾液酸-BrAc(66.0mg，28.0μmol，相对于肽1为2.5当量)溶于含33μM的TCEP及8M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3，3.7mL)中，并于室温反应4小时。
该反应溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝90：10→75：25，15分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(38)所示的糖链-多肽复合物(序列编号6)(23.8mg，5.83μmol，产率52％)。
式(38)(Disialo:二唾液酸，下同)
ESI-MS：(m/z)计算值C121H203N35O62S:〔M+2H〕2+2040.5,〔M+3H〕3+1360.7,〔M+4H〕4+1020.7,实测值2040.4,1360.6,1020.7。
(合成例14)C(无唾液酸)-(RADA)4的合成
先将合成例13-1中所合成的多肽(序列编号5)(22.7mg，12.5μmol)、合成例8中合成的无唾液酸-BrAc(55.0mg，31.2μmol，相对于肽1为2.5当量)溶于含33μM的TCEP及8M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3，4.7mL)中，并于室温反应3小时。
该反应溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝90：10→75：25，18分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(39)所示的糖链-多肽复合物(序列编号7)(20.5mg，5.86μmol，产率47％)。
式(39)(Asialo:无唾液酸，下同)
ESI-MS：(m/z)计算值C133H223N35O72S:〔M+2H〕2+1749.2,〔M+3H〕3+1166.5,〔M+4H〕4+875.1,实测值1749.3,1166.2,874.9。
(合成例15)C(DiGlcNAc)-(RADA)4的合成
先将合成例13-1中合成的多肽(序列编号5)(25.3mg，13.9μmol)、合成例9中合成的DiGlcNAc-BrAc(30.0mg，20.9μmol，相对于肽1为1.5当量)溶于含33μM的TCEP及8M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3，4.7mL)中，并于室温反应3小时。
该反应溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝88：12→81：19，10分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(40)所示的糖链-多肽复合物(序列编号8)(23.9mg，7.53μmol，产率54％)。
式(40)
ESI-MS：(m/z)计算值C121H203N35O62S:〔M+2H〕2+1587.1,〔M+3H〕3+1058.4,〔M+4H〕4+794.0,实测值1586.7,1058.1,793.8。
(合成例16)C(DiMan)-(RADA)4的合成
先将合成例13-1中合成的多肽(序列编号5)(15.2mg，8.37μmol)、合成例10中合成的DiMan-BrAc(21.5mg，20.9μmol，相对于肽1为2.5当量)溶于含33μM的TCEP及8M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.2，3.1mL)中，并于室温反应2小时。
该反应溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝90：10→75：25，15分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(41)所示的糖链-多肽复合物(序列编号9)(16.9mg，6.11μmol，产率73％)。
式(41)
ESI-MS：(m/z)计算值C121H203N35O62S:〔M+2H〕2+1383.9,〔M+3H〕3+922.9,〔M+4H〕4+629.5,实测值1383.6,922.7,692.3。
(合成例17)C(GlcNAc)-(RADA)4的合成
先将合成例13-1中合成的多肽(序列编号5)(14.9mg，8.21μmol)、合成例11中合成的GlcNAc-BrAc(5.6mg，16.4μmol，相对于肽1为2.0当量)溶于含33μM的TCEP及8M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3，3.1mL)中，并于室温反应2小时。
该反应溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝95：5→5：95，15分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(42)所示的糖链-多肽复合物(序列编号10)(15.4mg，7.42μmol，产率90％)。
式(42)
ESI-MS：(m/z)计算值C79H134N32O32S:〔M+2H〕2+1039.1,〔M+3H〕3+693.1,〔M+4H〕4+520.0,实测值1039.0,692.6,520.0。
(合成例18)C(麦芽七糖)-(RADA)4的合成
先将合成例13-1中合成的多肽(序列编号5)(9.3mg，5.12μmol)、合成例1中合成的麦芽七糖-BrAc(9.8mg，7.68μmol，相对于肽1为1.5当量)溶于含33μM的TCEP及8M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3，3.1mL)中，并于室温反应4小时。
该反应溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝88：12→72：28，16分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(43)所示的糖链-多肽复合物(序列编号11)(5.1mg，1.70μmol，产率33％)。
式(43)(Maltoheptaose:麦芽七糖，下同)
ESI-MS：(m/z)计算值C113H191N31O62S:〔M+2H〕2+1505.0,〔M+3H〕3+1003.7,实测值1504.6,1003.4。
(合成例19)C(β-环糊精)-(RADA)4的合成
先将合成例13-1中合成的多肽(序列编号5)(17.7mg，9.75μmol)、合成例5中合成的β-环糊精-BrAc(36.7mg，29.2μmol，相对于肽1为3.0当量)溶于含33μM的TCEP及8M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3，3.3mL)中，并于室温反应24小时。
该反应溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝88：12→72：28，16分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(44)所示的糖链-多肽复合物(序列编号12)(6.8mg，2.27μmol，产率23％)。
式(44)(β-cyclodextrin:β-环糊精，下同)
ESI-MS：(m/z)计算值C113H189N31O61S:〔M+2H〕2+1496.0,〔M+3H〕3+997.7,〔M+4H〕4+748.5,实测值1495.6,997.7,748.3。
(合成例20)C(γ-环糊精)-(RADA)4的合成
先将合成例13-1中合成的多肽(序列编号5)(16.0mg，8.81μmol)、合成例6中合成的γ-环糊精-BrAc(36.7mg，25.9μmol，相对于肽1为3.0当量)溶于含33μM的TCEP及8M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3，3.0mL)中，并于室温反应5小时。
该反应溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝90：10→5：95，15分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(45)所示的糖链-多肽复合物(序列编号13)(6.0mg，1.90μmol，产率22％)。
式(45)(γ-cyclodextrin:γ-环糊精，下同)
ESI-MS：(m/z)计算值C119H199N31O66S:〔M+2H〕2+1577.1,〔M+3H〕3+1051.7,〔M+4H〕4+789.0,实测值1576.7,1051.4,788.8。
(合成例21)C(二唾液酸)-(RADA)5的合成
(合成例21-1)Ac-C(RADA)5-NH2的合成
先于固相合成用管柱中填充Rink amide PEGA树脂(100μmol)，以DMF及二氯甲烷清洗后，再加入Fmoc-Ala-OH(124.5mg，400μmol)、HCTU(157.2mg，380μmol)及DIPEA(104.5μL，600μmol)的DMF(2.5mL)溶液，并振荡15分钟。在以二氯甲烷及DMF清洗后，其Fmoc保护基，再经20％的哌啶的DMF溶液处理去除。以DMF清洗后，再使用Prelude(商标)肽合成机，通过Fmoc法以肽固相合成法合成受保护的下述式(46)所示，为结合在树脂状态的多肽(序列编号14)。缩合反应，使用缩合剂HCTU并于DMF中进行。
式(46)
Fmoc保护基，经20％的哌啶的DMF溶液处理去除。以DMF及二氯甲烷清洗的后，再加入乙酸酐及吡啶并振荡1小时。在以DMF及二氯甲烷清洗之后，加入TFA：水：三异丙基硅烷：乙二硫醇(＝90：2.5：5：2.5)，并于室温振荡4小时。之后过滤去除树脂，再于滤液中加入冷却的二乙基醚，即可得到粗肽沉淀。该粗肽的部分再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAKC18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝88：12→78：22％，11分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(47)所示的化合物多肽(序列编号15)(32.7mg)。
Ac-Cys-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-NH2
式(47)
(合成例21-2)硫醇的糖链修饰反应
先将合成例21-1中合成的多肽(序列编号15)(13.9mg，6.24μmol)、合成例7中合成的二唾液酸-BrAc(36.5mg，15.6μmol，相对于肽1为2.5当量)溶于含33μM的TCEP及8M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3，2.1mL)中，并于室温反应3小时。
该反应溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝90：10→75：25，15分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(48)所示的糖链-多肽复合物(序列编号16)(7.8mg，1.74μmol，产率28％)。
式(48)
ESI-MS：(m/z)计算值C171H284N44O94S:〔M+3H〕3+1498.5,〔M+4H〕4+1124.1,〔M+5H〕5+899.5,实测值1498.6,1123.9,899.4。
(合成例22)C(无唾液酸)-(RADA)5的合成
先将合成例21-1中合成的多肽(序列编号15)(18.8mg，8.43μmol)、合成例8中合成的无唾液酸-BrAc(44.5mg，25.3μmol，相对于肽1为3.0当量)溶于含33μM的TCEP及8M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.2，2.8mL)中，并于室温反应2小时。
该反应溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝90：10→75：25，15分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(49)所示的糖链-多肽复合物(序列编号17)(16.0mg，4.09μmol，产率49％)。
式(49)(Asialo:无唾液酸，下同)
ESI-MS：(m/z)计算值C149H250N42O78S:〔M+2H〕2+1955.9,〔M+3H〕3+1304.3,〔M+4H〕4+978.5,实测值1955.8,1304.2,978.2。
(合成例23)C(DiGlcNAc)-(RADA)5的合成
先将合成例21-1中合成的多肽(序列编号15)(19.4mg，8.70μmol)、合成例9中合成的DiGlcNAc-BrAc(20.0mg，21.7μmol，相对于肽1为2.5当量)溶于含33μM的TCEP及8M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.2，3.1mL)中，并于室温反应2小时。
该反应溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝95：5→60：40，20分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(50)所示的糖链-多肽复合物(序列编号18)(16.8mg，4.69μmol，产率54％)。
式(50)
ESI-MS：(m/z)计算值C149H250N42O78S:〔M+3H〕3+1196.2,〔M+4H〕4+897.4,实测值1195.9,897.2。
(合成例24)C(GlcNAc)-(RADA)5的合成
先将合成例21-1中合成的多肽(序列编号15)(18.8mg，8.43μmol)、合成例11中合成的GlcNAc-BrAc(8.7mg，25.3μmol，相对于肽1为3.0当量)溶于含7M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.2，4.2mL)中，并于室温反应1小时。
该反应溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝95：5→5：95，15分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(51)所示的糖链-多肽复合物(序列编号19)(14.9mg，5.99μmol，产率71％)。
式(51)
ESI-MS：(m/z)计算值C95H161N39O28S:〔M+2H〕2+1245.8,〔M+3H〕3+830.9,〔M+4H〕4+623.4,实测值1245.1,830.8,623.3。
(合成例25)C(DiBn-二唾液酸)-(RADA)5的合成
先将合成例21-1中合成的多肽(序列编号15)(20.7mg，9.29μmol)、合成例12中合成的DiBn-二唾液酸-BrAc(58.6mg，23.2μmol，相对于肽1为2.5当量)溶于含33μM的TCEP及8M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3，3.2mL)中，并于室温反应1小时。
该反应溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝85：15→73：27，17分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(52)所示的糖链-多肽复合物(序列编号20)(7.5mg，1.61μmol，产率17％)。
式(52)
ESI-MS：(m/z)计算值C185H296N44O94S:〔M+3H〕3+1558.6,〔M+4H〕4+1169.2,〔M+5H〕5+935.5,实测值1558.4,1169.0,925.6。
(合成例26)C(PEG2000)-(RADA)5的合成
先将合成例21-1中合成的多肽(序列编号15)(15.9mg，7.13μmol)、下述式(53)所示的化合物(马来酰亚胺化PEG，商品名：SUNBRIGHT(商标)ME-020MA，平均分子量2333，日油公司制造)(24.9mg，10.7μmol，相对于肽1为1.5当量)溶于含8M胍的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3，2.4mL)中，并于室温反应1小时。
式(53)
该反应溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝75：25→40：60，12分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(54)所示的糖链-多肽复合物(序列编号21)(10.9mg，2.39μmol，产率34％)。
式(54)
(合成例27)C(无唾液酸)-(RATARAEA)2的合成
(合成例27-1)Ac-C-(RATARAEA)2-NH2的合成
先于固相合成用管柱中填充Rink amide PEGA树脂(100μmol)，以DMF及二氯甲烷清洗后，再加入Fmoc-Ala-OH(124.5mg，400μmol)、HCTU(157.2mg，380μmol)及DIPEA(104.5μL，600μmol)的DMF(2.5mL)溶液，并振荡15分钟。在以二氯甲烷及DMF清洗后，其Fmoc保护基，再经20％的哌啶的DMF溶液处理去除。以DMF清洗后，再使用Prelude(商标)肽合成机，以Fmoc法的肽固相合成法合成受保护的下述式(55)所示，为结合在树脂状态的多肽(序列编号22)。缩合反应，使用缩合剂HCTU并于DMF中进行。
式(55)
Fmoc保护基，经20％的哌啶的DMF溶液处理去除。以DMF及二氯甲烷清洗之后，再加入乙酸酐及吡啶并振荡1小时。在以DMF及二氯甲烷清洗之后，加入TFA：水：三异丙基硅烷：乙二硫醇(＝90：2.5：5：2.5)，并于室温振荡4小时。之后过滤去除树脂，再于滤液中加入冷却的二乙基醚，即可得到粗肽沉淀。该粗肽的部分再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAKC18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝88：12→78：22％，11分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(56)所示的多肽(序列编号23)(32.7mg)。
Ac-Cys-Arg-Ala-Thr-Ala-Arg-Ala-Glu-Ala-Arg-Ala-Thr-Ala-Arg-Ala-Glu-Ala-NH2
式(56)
(合成例27-2)硫醇的糖链修饰反应
先将合成例27-1中合成的多肽(序列编号23)(7.3mg，4.02μmol)、合成例8中合成的无唾液酸-BrAc(17.7mg，16.5μmol，相对于肽1为1.5当量)溶于含33μM的TCEP及8M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3，1.3mL)中，并于室温反应3小时。
该反应溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝95：5→29：71，11分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(57)所示的糖链-多肽复合物(序列编号24)(4.6mg，1.32μmol，产率33％)。
式(57)
ESI-MS：(m/z)计算值C123H211N35O60S:〔M+3H〕3+1166.5,〔M+4H〕4+875.1,实测值1166.2,875.1。
(合成例28)C(DiGlcNAc)-(RATARAEA)2的合成
先将合成例27-1中合成的多肽(序列编号23)(20.0mg，11.0μmol)、合成例7中合成的二唾液酸-BrAc(23.7mg，16.5μmol，相对于肽1为1.5当量)溶于DMSO(0.9mL)中。之后于溶液中加入DIPEA(5.8μL)并于室温反应15分钟。
之后于该反应溶液中加入蒸馏水(4.0mL)，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELLPAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝90：10→29：71，11分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(58)所示的糖链-多肽复合物(序列编号25)(23.9mg，7.53μmol，产率68％)。
式(58)
ESI-MS：(m/z)计算值C123H211N35O60S:〔M+3H〕3+1058.4,〔M+4H〕4+794.0,实测值1057.8,793.9。
(合成例29)RAC(无唾液酸)-A-(RADA)3的合成
(合成例29-1)Ac-RACA-(RADA)3-NH2的合成
先于固相合成用管柱中填充Rink amide PEGA树脂(100μmol)，以DMF及二氯甲烷清洗后，再加入Fmoc-Ala-OH(124.5mg，400μmol)、HCTU(157.2mg，380μmol)及DIPEA(104.5μL，600μmol)的DMF(2.5mL)溶液，并振荡15分。在以二氯甲烷及DMF清洗后，其Fmoc保护基，再经20％的哌啶的DMF溶液处理去除。以DMF清洗后，再使用Prelude(商标)肽合成机，通过Fmoc法以肽固相合成法合成受保护的下述式(59)所示，为结合在树脂状态的多肽(序列编号26)。缩合反应，使用缩合剂HCTU并于DMF中进行。
式(59)
Fmoc保护基，经20％的哌啶的DMF溶液处理去除。以DMF及二氯甲烷清洗之后，再加入乙酸酐及吡啶并振荡1小时。在以DMF及二氯甲烷清洗之后，加入TFA：水：三异丙基硅烷：乙二硫醇(＝90：2.5：5：2.5)，并于室温振荡4小时。之后过滤去除树脂，再于滤液中加入冷却的二乙基醚，即可得到粗肽沉淀。该粗肽的部分再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAKC18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝88：12→78：22％，11分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(60)所示的多肽(序列编号27)(32.7mg)。
Ac-Arg-Ala-Cys-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-NH2
式(60)
(合成例29-2)硫醇的糖链修饰反应
先将合成例29-1中合成的多肽(序列编号27)(14.1mg，8.29μmol)及合成例8中合成的无唾液酸-BrAc(36.0mg，20.7μmol，相对于肽1为2.5当量)溶于含33μM的TCEP及8M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3，2.6mL)中，并于室温反应1小时。
该反应溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝95：5→29：71，11分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(61)所示的糖链-多肽复合物(序列编号28)(13.4mg，3.96μmol，产率48％)。
式(61)
ESI-MS：(m/z)计算值C129H218N34O69S:〔M+2H〕2+1691.7,〔M+3H〕3+1128.1,实测值1691.8,1128.2。
(合成例30)RAC(DiGlcNAc)-A-(RADA)3的合成
先将合成例29-1中合成的多肽(序列编号27)(10.1mg，5.94μmol)、合成例7中合成的二唾液酸-BrAc(21.3mg，14.8μmol，相对于肽1为2.5当量)溶于含33μM的TCEP及8M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3，2.0mL)中，并于室温反应4小时。
该反应溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝90：10→75：25，15分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(62)所示的糖链-多肽复合物(序列编号29)(11.9mg，3.89μmol，产率66％)。
式(62)
ESI-MS：(m/z)计算值C117H198N34O59S:〔M+2H〕2+1529.5,〔M+3H〕3+1020.0,〔M+4H〕4+765.3,实测值1529.2,1019.8,765.1。
(合成例31)RC(无唾液酸)-DA-(RADA)3的合成
(合成例31-1)Ac-RCDA-(RADA)3-NH2的合成
先于固相合成用管柱中填充Rink amide PEGA树脂(100μmol)，以DMF及二氯甲烷清洗后，再加入Fmoc-Ala-OH(124.5mg，400μmol)、HCTU(157.2mg，380μmol)及DIPEA(104.5μL，600μmol)的DMF(2.5mL)溶液，并振荡15分钟。在以二氯甲烷及DMF清洗后，其Fmoc保护基，再经20％的哌啶的DMF溶液处理去除。以DMF清洗后，再使用Prelude(商标)肽合成机，通过Fmoc法以肽固相合成法合成受保护的下述式(63)所示，为结合在树脂状态的多肽(序列编号30)。缩合反应，使用缩合剂HCTU并于DMF中进行。
式(63)
Fmoc保护基，经20％的哌啶的DMF溶液处理去除。以DMF及二氯甲烷清洗之后，再加入乙酸酐及吡啶并振荡1小时。在以DMF及二氯甲烷清洗之后，加入TFA：水：三异丙基硅烷：乙二硫醇(＝90：2.5：5：2.5)，并于室温振荡4小时。之后过滤去除树脂，再于滤液中加入冷却的二乙基醚，即可得到粗肽沉淀。该粗肽的部分再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAKC18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝88：12→78：22％，11分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(64)所示的多肽(序列编号31)(32.7mg)。
Ac-Arg-Cys-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-NH2
式(64)
(合成例31-2)硫醇的糖链修饰反应
先将合成例31-1中合成的多肽(序列编号31)(14.8mg，8.48μmol)、合成例8中合成的无唾液酸-BrAc(37.4mg，21.2μmol，相对于肽1为2.5当量)溶于含33μM的TCEP及8M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3，2.8mL)中，并于室温反应2小时。
该反应溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝95：5→29：71，11分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(65)所示的糖链-多肽复合物(序列编号32)(21.7mg，6.34μmol，产率75％)。
式(65)
ESI-MS：(m/z)计算值C130H218N34O71S:〔M+2H〕2+1713.7,〔M+3H〕3+1142.8,〔M+4H〕4+857.3,实测值1713.7,1142.5,857.1。
(合成例32)RC(DiGlcNAc)-DA-(RADA)3的合成
先将合成例31-1中合成的多肽(序列编号31)(11.0mg，6.30μmol)、及合成例9中合成的DiGlcNAc-BrAc(22.6mg，15.7μmol，相对于肽1为2.5当量)溶于含33μM的TCEP及8M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3，2.1mL)中，并于室温反应3小时。
该反应溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝90：10→75：25，15分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(66)所示的糖链-多肽复合物(序列编号33)(19.0mg，6.12μmol，产率97％)。
式(66)
ESI-MS：(m/z)计算值C118H198N34O61S:〔M+2H〕2+1551.6,〔M+3H〕3+1034.7,〔M+4H〕4+776.3,实测值1551.2,1034.5,776.1。
(合成例33)C(无唾液酸)-ADA-(RADA)3的合成
(合成例33-1)Ac-CADA-(RADA)3-NH2的合成
先于固相合成用管柱中填充Rink amide PEGA树脂(100μmol)，以DMF及二氯甲烷清洗后，再加入Fmoc-Ala-OH(124.5mg，400μmol)、HCTU(157.2mg，380μmol)及DIPEA(104.5μL，600μmol)的DMF(2.5mL)溶液，并振荡15分钟。在以二氯甲烷及DMF清洗后，其Fmoc保护基，再经20％的哌啶的DMF溶液处理去除。以DMF清洗后，再使用Prelude(商标)肽合成机，通过Fmoc法以肽固相合成法合成受保护的下述式(67)所示，为结合在树脂状态的多肽(序列编号34)。缩合反应，使用缩合剂HCTU并于DMF中进行。
式(67)
Fmoc保护基，经20％的哌啶的DMF溶液处理去除。以DMF及二氯甲烷清洗之后，再加入乙酸酐及吡啶并振荡1小时。在以DMF及二氯甲烷清洗之后，加入TFA：水：三异丙基硅烷：乙二硫醇(＝90：2.5：5：2.5)，并于室温振荡4小时。之后过滤去除树脂，再于滤液中加入冷却的二乙基醚，即可得到粗肽沉淀。该粗肽的部分再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAKC18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝88：12→78：22％，11分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(68)所示的多肽(序列编号35)(32.7mg)。
Ac-Cys-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-NH2
式(68)
(合成例33-2)硫醇的糖链修饰反应
先将合成例33-1中合成的多肽(序列编号35)(13.0mg，7.83μmol)、及合成例8中合成的无唾液酸-BrAc(34.5mg，19.6μmol，相对于肽1为2.5当量)溶于含33μM的TCEP及8M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3，2.6mL)中，并于室温反应2小时。
该反应溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝95：5→29：71，11分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(69)所示的糖链-多肽复合物(序列编号36)(15.2mg，4.55μmol，产率58％)。
式(69)
ESI-MS：(m/z)计算值C127H211N31O71S:〔M+2H〕2+1671.1,〔M+3H〕3+1114.4,〔M+4H〕4+836.1,实测值1671.2,1114.1,835.8。
(合成例34)C(DiGlcNAc)-ADA-(RADA)3的合成
先将合成例33-1中合成的多肽(9.9mg，5.96μmol)、及合成例9中合成的DiGlcNAc-BrAc(21.4mg，15.7μmol，相对于肽1为2.5当量)溶于含33μM的TCEP及8M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3，2.1mL)中，并于室温反应4小时。
该反应溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝90：10→75：25，15分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(70)所示的糖链-多肽复合物(序列编号37)(10.9mg，3.61μmol，产率61％)。
式(70)
ESI-MS：(m/z)计算值C115H191N31O61S:〔M+2H〕2+1509.0,〔M+3H〕3+1006.3,〔M+4H〕4+755.0,实测值1508.7,1006.1,754.9。
(合成例35)2C(麦芽糖)-(RADA)4的合成
(合成例35-1)Ac-2C-(RADA)4-NH2的合成
先于固相合成用管柱中填充Rink amide PEGA树脂(100μmol)，以DMF及二氯甲烷清洗后，再加入Fmoc-Ala-OH(124.5mg，400μmol)、HCTU(157.2mg，380μmol)及DIPEA(104.5μL，600μmol)的DMF(2.5mL)溶液，并振荡15分钟。在以二氯甲烷及DMF清洗后，其Fmoc保护基，再经20％的哌啶的DMF溶液处理去除。以DMF清洗后，再使用Prelude(商标)肽合成机，通过Fmoc法以肽固相合成法合成受保护的下述式(71)所示，为结合在树脂状态的多肽(序列编号38)。缩合反应，使用缩合剂HCTU并于DMF中进行。
式(71)
Fmoc保护基，经20％的哌啶的DMF溶液处理去除。以DMF及二氯甲烷清洗之后，再加入乙酸酐及吡啶并振荡1小时。在以DMF及二氯甲烷清洗之后，加入TFA：水：三异丙基硅烷：乙二硫醇(＝90：2.5：5：2.5)，并于室温振荡4小时。之后过滤去除树脂，再于滤液中加入冷却的二乙基醚，即可得到粗肽沉淀。该粗肽的部分再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAKC18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝90：10→75：25％，11分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(72)所示的多肽(序列编号39)。
Ac-Cys-Cys-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-NH2
式(72)
(合成例35-2)硫醇的糖链修饰反应
先将合成例35-1中合成的多肽(序列编号39)(9.8mg，5.11μmol)、及合成例2中合成的麦芽糖-BrAc(11.8mg，54.6μmol，相对于肽1为5.0当量)溶于含33μM的TCEP及8M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3，1.7mL)中，并于室温反应1.5小时。
该反应溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝90：10→75：25，15分钟线性浓度梯度洗脱〕梯度A：B＝90：10→75：25，15分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(73)所示的糖链-多肽复合物(序列编号40)(9.2mg，3.43μmol，产率67％)。
式(73)(Maltose：麦芽糖，下同)
ESI-MS：(m/z)计算值C100H169N33O49S2:〔M+2H〕2+1341.9,〔M+3H〕3+894.9,〔M+4H〕4+671.4,实测值1341.6,894.7,671.3。
(合成例36)2C(麦芽三糖)-(RADA)4的合成
先将合成例35-1中合成的多肽(序列编号39)(17.5mg，9.12μmol)、及合成例3中合成的麦芽三糖-BrAc(34.1mg，54.6μmol，相对于肽1为6.0当量)溶于含33μM的TCEP及8M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3，3.1mL)中，并于室温反应1.5小时。
该反应溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝90：10→75：25，15分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(74)所示的糖链-多肽复合物(序列编号41)(19.6mg，3.61μmol，产率72％)。
式(74)(Maltotriose：麦芽三糖，下同)
ESI-MS：(m/z)计算值C112H189N33O59S2:〔M+2H〕2+1504.0,〔M+3H〕3+1003.0,〔M+4H〕4+752.5,实测值1503.7,1002.7,752.3。
(合成例37)2C(麦芽四糖)-(RADA)4的合成
先将合成例35-1中合成的多肽(序列编号39)(9.8mg，5.11μmol)、合成例4中合成的麦芽四糖-BrAc(20.1mg，25.5μmol，相对于肽1为5.0当量)溶于含33μM的TCEP及8M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3，1.7mL)中，并于室温反应2小时。
该反应溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝90：10→75：25，15分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(75)所示的糖链-多肽复合物(序列编号42)(10.6mg，3.18μmol，产率62％)。
式(75)(Maltotetraose：麦芽四糖，下同)
ESI-MS：(m/z)计算值C124H209N33O69S2:〔M+2H〕2+1666.2,〔M+3H〕3+1111.1,〔M+4H〕4+833.6,实测值1666.2,1110.8,833.3。
(合成例38)3C(麦芽糖)-(RADA)4的合成
(合成例38-1)Ac-3C-(RADA)4-NH2的合成
先于固相合成用管柱中填充Rink amide PEGA树脂(100μmol)，以DMF及二氯甲烷清洗后，再加入Fmoc-Ala-OH(124.5mg，400μmol)、HCTU(157.2mg，380μmol)及DIPEA(104.5μL，600μmol)的DMF(2.5mL)溶液，并振荡15分钟。在以二氯甲烷及DMF清洗后，其Fmoc保护基，再经20％的哌啶的DMF溶液处理去除。以DMF清洗后，再使用Prelude(商标)肽合成机，通过Fmoc法以肽固相合成法合成受保护的下述式(76)所示，为结合在树脂状态的多肽(序列编号43)。缩合反应，使用缩合剂HCTU并于DMF中进行。
式(76)
Fmoc保护基，经20％的哌啶的DMF溶液处理去除。以DMF及二氯甲烷清洗之后，再加入乙酸酐及吡啶并振荡1小时。在以DMF及二氯甲烷清洗之后，加入TFA：水：三异丙基硅烷：乙二硫醇(＝90：2.5：5：2.5)，并于室温振荡4小时。之后过滤去除树脂，再于滤液中加入冷却的二乙基醚，即可得到粗肽沉淀。该粗肽的部分再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAKC18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝90：10→75：25％，11分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(77)所示的多肽(序列编号44)。
Ac-Cys-Cys-Cys-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-NH2
式(77)
(合成例38-2)硫醇的糖链修饰反应
先将合成例38-1中合成的多肽(序列编号44)(15.0mg，7.42μmol)、及合成例2中合成的麦芽糖-BrAc(20.6mg，44.6μmol，相对于肽1为6.0当量)溶于含33μM的TCEP及8M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3，2.4mL)中，并于室温反应3小时。
该反应溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝90：10→75：25，15分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(78)所示的糖链-多肽复合物(序列编号45)(16.1mg，5.09μmol，产率69％)。
式(78)
ESI-MS：(m/z)计算值C117H197N35O61S3:〔M+2H〕2+1584.1,〔M+3H〕3+1056.4,〔M+4H〕4+792.6,实测值1583.7,1056.1,792.4。
(合成例39)(RADA)2-C(麦芽糖)-(ARDA)2的合成
(合成例39-1)Ac-(RADA)2-C-(ARDA)2-NH2的合成
先于固相合成用管柱中填充Rink amide PEGA树脂(100μmol)，以DMF及二氯甲烷清洗后，再加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH(164.6mg，400μmol)、HCTU(157.2mg，380μmol)及DIPEA(104.5μL，600μmol)的DMF(2.5mL)溶液，并振荡15分钟。在以二氯甲烷及DMF清洗后，其Fmoc保护基，再经20％的哌啶的DMF溶液处理去除。以DMF清洗后，再使用Prelude(商标)肽合成机，通过Fmoc法以肽固相合成法合成受保护的下述式(79)所示，为结合在树脂状态的多肽(序列编号46)。缩合反应，使用缩合剂HCTU并于DMF中进行。
式(79)
Fmoc保护基，经20％的哌啶的DMF溶液处理去除。以DMF及二氯甲烷清洗之后，再加入乙酸酐及吡啶并振荡1小时。在以DMF及二氯甲烷清洗之后，加入TFA：水：三异丙基硅烷：乙二硫醇(＝90：2.5：5：2.5)，并于室温振荡4小时。之后过滤去除树脂，再于滤液中加入冷却的二乙基醚，即可得到粗肽沉淀。该粗肽的部分再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAKC18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝90：10→75：25％，15分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(80)所示的多肽(序列编号47)。
Ac-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Cys-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-NH2
式(80)
(合成例39-2)硫醇的糖链修饰反应
先将合成例39-1中合成的多肽(序列编号47)(15.4mg，8.48μmol)、及合成例2中合成的麦芽糖-BrAc(9.8mg，21.2μmol，相对于肽1为2.5当量)溶于含33μM的TCEP及8M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3，2.9mL)中，并于室温反应3小时。
该反应溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝90：10→75：25，15分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(81)所示的糖链-多肽复合物(序列编号48)(17.8mg，8.10μmol，产率96％)。
式(81)
ESI-MS：(m/z)计算值C83H141N31O37S:〔M+2H〕2+1099.6,〔M+3H〕3+733.4,〔M+4H〕4+550.3,实测值1099.5,733.0,550.2。
(合成例40)(RADA)2-C(麦芽三糖)-(ARAD)2的合成
先将合成例39-1中合成的多肽(序列编号47)(14.8mg，8.15μmol)、及合成例3中合成的麦芽三糖-BrAc(12.7mg，20.3μmol，相对于肽1为2.5当量)溶于含33μM的TCEP及8M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3，2.8mL)中，并于室温反应3小时。
该反应溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝90：10→75：25，15分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(82)所示的糖链-多肽复合物(序列编号49)(13.8mg，5.85μmol，产率72％)。
式(82)
ESI-MS：(m/z)计算值C89H151N31O42S:〔M+2H〕2+1180.2,〔M+3H〕3+787.1,〔M+4H〕4+590.6,实测值1180.5,787.0,590.8。
(合成例41)(RADA)2-C(麦芽四糖)-(ARAD)2的合成
先将合成例39-1中合成的多肽(序列编号47)(14.0mg，7.71μmol)、合成例4中合成的麦芽四糖-BrAc(15.2mg，20.3μmol，相对于肽1为2.5当量)溶于含33μM的TCEP及8M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3，2.6mL)中，并于室温反应2.5小时。
该反应溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝90：10→75：25，15分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(83)所示的糖链-多肽复合物(序列编号50)(14.9mg，5.91μmol，产率77％)。
式(83)
ESI-MS：(m/z)计算值C95H161N31O47S:〔M+2H〕2+1261.8,〔M+3H〕3+841.5,〔M+4H〕4+631.4,实测值1261.6,841.4,631.3。
(合成例42)C(麦芽糖)-(RADA)4-C(麦芽糖)的合成
(合成例42-1)Ac-C-(RADA)4-C-NH2的合成
先于固相合成用管柱中填充Rink amide PEGA树脂(100μmol)，以DMF及二氯甲烷清洗后，再加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(124.5mg，400μmol)、HCTU(157.2mg，380μmol)及2,4,6-三甲基吡啶(79.3μL，600μmol)的DMF(2.5mL)溶液，并振荡1小时。在以二氯甲烷及DMF清洗后，其Fmoc保护基，再经20％的哌啶的DMF溶液处理去除。以DMF清洗后，再使用Prelude(商标)肽合成机，通过Fmoc法以肽固相合成法合成受保护的下述式(84)所示，为结合在树脂状态的多肽(序列编号51)。缩合反应，使用缩合剂HCTU并于DMF中进行。
式(84)
Fmoc保护基，经20％的哌啶的DMF溶液处理去除。以DMF及二氯甲烷清洗之后，再加入乙酸酐及吡啶并振荡1小时。在以DMF及二氯甲烷清洗之后，加入TFA：水：三异丙基硅烷：乙二硫醇(＝90：2.5：5：2.5)，并于室温振荡4小时。之后过滤去除树脂，再于滤液中加入冷却的二乙基醚，即可得到粗肽沉淀。该粗肽的部分再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAKC18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝90：10→75：25％，15分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(85)所示的多肽(序列编号52)。
Ac-Cys-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Cys-NH2
式(85)
(合成例42-2)硫醇的糖链修饰反应
先将以合成例42-1中合成的多肽(序列编号52)(14.7mg，7.66μmol)、及合成例2中合成的麦芽糖-BrAc(17.7mg，38.3μmol，相对于肽1为5当量)溶于含33μM的TCEP及含8M胍盐酸盐的盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3，2.6mL)中，并于室温反应2小时。
该反应溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝90：10→75：25，15分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(86)所示的糖链-多肽复合物(序列编号53)(6.5mg，2.42μmol，产率32％)。
式(86)
ESI-MS：(m/z)计算值C100H169N33O49S2:〔M+2H〕2+1341.9,〔M+3H〕3+894.9,〔M+4H〕4+671.4,实测值1341.5,894.7,671.3。
(合成例43)C(麦芽三糖)-(RADA)4-C(麦芽三糖)的合成
先将合成例42-1中合成的多肽(序列编号52)(13.9mg，7.24μmol)、及合成例3中合成的麦芽三糖-BrAc(22.6mg，36.2μmol，相对于肽1为5当量)溶于含33μM的TCEP及含8M胍盐酸盐的盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3，2.5mL)中，并于室温反应2小时。
该反应溶液，再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝90：10→75：25，15分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(87)所示的糖链-多肽复合物(序列编号54)(9.6mg，3.19μmol，产率44％)。
式(87)
ESI-MS：(m/z)计算值C112H189N33O59S2:〔M+2H〕2+1504.1,〔M+3H〕3+1003.0,〔M+4H〕4+752.5,实测值1503.8,1002.8,752.4。
(合成例44)Ac-(RADA)4-C(DiGlcNAc)的合成
(合成例44-1)Ac-(RADA)4-C-NH2的合成
先于固相合成用管柱中填充Rink amide PEGA树脂(100μmol)，以DMF及二氯甲烷清洗后，再加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(124.5mg，400μmol)、HCTU(157.2mg，380μmol)及2,4,6-三甲基吡啶(79.3μL，600μmol)的DMF(2.5mL)溶液，并振荡1小时。在以二氯甲烷及DMF清洗后，其Fmoc保护基，再经20％的哌啶的DMF溶液处理去除。以DMF清洗后，再使用Prelude(商标)肽合成机，通过Fmoc法以肽固相合成法合成受保护的下述式(88)所示，为结合在树脂状态的多肽(序列编号55)。缩合反应，使用缩合剂HCTU并于DMF中进行。
式(88)
Fmoc保护基，经20％的哌啶的DMF溶液处理去除。以DMF及二氯甲烷清洗之后，再加入乙酸酐及吡啶并振荡1小时。在以DMF及二氯甲烷清洗之后，加入TFA：水：三异丙基硅烷：乙二硫醇(＝90：2.5：5：2.5)，并于室温振荡4小时。之后过滤去除树脂，再于滤液中加入冷却的二乙基醚，即可得到粗肽沉淀。该粗肽的部分再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAKC18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝90：10→75：25％，15分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(89)所示的多肽(序列编号56)。
Ac-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Cys-NH2
式(89)
(合成例44-2)硫醇的糖链修饰反应
先将合成例44-1中合成的多肽(序列编号56)(15.1mg，8.31μmol)、及合成例9中合成的DiGlcNAc-BrAc(29.8mg，20.8μmol，相对于肽1为2.5当量)溶于含33μM的TCEP及8M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3，2.8mL)中，并于室温反应3小时。
该反应溶液再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝90：10→75：25，15分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(90)所示的糖链-多肽复合物(序列编号57)(15.8mg，5.01μmol，产率60％)。
式(90)
ESI-MS：(m/z)计算值C121H203N35O62S:〔M+2H〕2+1587.1,〔M+3H〕3+1058.4,〔M+4H〕4+794.0,实测值1586.7,1058.1,793.8。
(合成例45)Ac-N(无唾液酸)-(RADA)4的合成
(合成例45-1)Fmoc-(RADA)4-树脂的合成
先于固相合成用管柱中填充Rink amide PEGA树脂(100μmol)，以DMF及二氯甲烷清洗后，再加入Fmoc-Ala-OH(124.5mg，400μmol)、HCTU(157.2mg，380μmol)及DIPEA(104.5μL，600μmol)的DMF(2.5mL)溶液，并振荡15分钟。在以二氯甲烷及DMF清洗后，其Fmoc保护基，再经20％的哌啶的DMF溶液处理去除。以DMF清洗后，再使用Prelude(商标)肽合成机，通过Fmoc法以肽固相合成法合成受保护的下述式(91)所示，为结合在树脂状态的多肽(序列编号58)。缩合反应，使用缩合剂HCTU并于DMF中进行。
式(91)
(合成例45-2)树脂上的糖链缩合反应
将合成例45-1中所合成的为结合在树脂状态的多肽(10μmol)的Fmoc保护基，以20％的哌啶的DMF溶液处理去除。在以DMF及二氯甲烷清洗之后，再依序加入下述式(92)所示的Fmoc-Asn(无唾液酸)-OH(29.8mg，15μmol)、DMF-DMSO(1/1，v/v，433μL)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)(6.4mg，30μmol)、及DIPEA(5.2μL，30μmol)，并振荡一夜。在以DMF及二氯甲烷清洗之后，其Fmoc保护基，再经20％的哌啶的DMF溶液处理去除。以DMF及二氯甲烷清洗后，再加入乙酸(2.86μL，50μmol)、1-羟基苯并三唑(HOBt)(6.8mg，50μmol)、及N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)(7.3μL，50μmol)的DMF(500μL)溶液，并振荡1小时。
式(92)
在以DMF及二氯甲烷清洗之后，加入TFA：水：三异丙基硅烷(＝95：2.5：2.5)，并于室温振荡4小时。之后过滤去除树脂，再于滤液中加入冷却的二乙基醚，即可得到粗肽沉淀。该粗肽的部分再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝90：10→75：25％，15分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(93)所示的糖链-多肽复合物(序列编号59)(5.5mg)。
式(93)
ESI-MS：(m/z)计算值C132H221N35O72:〔M+2H〕2+1726.2,〔M+3H〕3+1151.1,〔M+4H〕4+863.6,实测值1726.0,1150.8,863.4。
(合成例46)Ac-N(DiGlcNAc)(RADA)4的合成
将合成例45-1中所合成的为结合在树脂状态的多肽(32.1μmol)的Fmoc保护基，以20％的哌啶的DMF溶液处理去除。在以DMF及二氯甲烷清洗之后，再依序加入下述式(94)所示的Fmoc-Asn(DiGlcNAc)-OH(79.5mg，15μmol)、DMSO-DMF(1/1，v/v，2.5mL)、TBTU(20.6mg，96.3μmol)、及DIPEA(17.2μL，96.3μmol)，并振荡2小时。在以DMF及二氯甲烷清洗之后，其Fmoc保护基，再经20％的哌啶的DMF溶液处理去除。以DMF及二氯甲烷清洗后，再加入乙酸(9.2μL，160.5μmol)、HOBt(21.6mg，160.5μmol)及DIC(25.1μL，160.5μmol)的DMF(2mL)溶液并振荡1小时。
式(94)
在以DMF及二氯甲烷清洗之后，加入TFA：水：三异丙基硅烷(＝95：2.5：2.5)，并于室温振荡4小时。之后过滤去除树脂，再于滤液中加入冷却的二乙基醚，即可得到粗肽沉淀。该粗肽的部分再以HPLC〔管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，流速：7.0mL/分钟，展开剂A：0.1％TFA水，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝90：10→75：25％，15分钟线性浓度梯度洗脱〕纯化，即可获得如下述式(95)所示的糖链-多肽复合物(序列编号60)(31.2mg)。
式(95)
ESI-MS：(m/z)计算值C120H201N35O62:〔M+2H〕2+1564.1,〔M+3H〕3+1043.0,〔M+4H〕4+782.5,实测值1563.7,1043.8,782.3。
(实施例1)以钢球载重试验评量水凝胶特性-1
以10mg的糖链-多肽复合物、或对照的10mg多肽溶于500μL的超纯水中，调配成2重量％的多肽溶液。再将等量的该溶液及各种缓冲液各自添加于杜汉氏管(6×30mm，Maruemu公司制造)内，通过涡旋(vortexing)剧烈搅拌，制作成肽浓度为1重量％的水凝胶。其中，缓冲液方面，使用柠檬酸-磷酸缓冲液(pH2.0及3.5)、磷酸缓冲液(pH7.4)、磷酸-氢氧化钠缓冲液(pH11.5)。之后将杜汉氏管内水凝胶的表面设置为水平，于室温条件下静置20分钟之后，再以钢球(直径1.56mm，重量16mg，舟边精工公司制造)负载于水凝胶上。经过10分之后，以目视观察钢球的位置。
之后对杜汉氏管内钢球的位置以3等级评量，将钢球停留在水凝胶表面附近的状态设定为○，将负载后沉降停留在内部的状态设定为△，而将沉降至杜汉氏管下方的状态设定为╳。同时，在水凝胶不均一而可观察到混浊及不溶物(沉淀物)的情形以※附注。钢球停留在表面附近(○)、未见混浊及不溶物(无※)的水凝胶，应该为具有透明性、且均一的凝胶。所得的图像如图1，评量结果如表1所示。
同时，表1中，所谓「糖残基数」，表示结合于糖链-多肽复合物的糖链中所存在的糖残基数的合计。此外，表中所示化合物的编号，是为便于说明而分配的，而并与制造例的编号一致。
[表1]
表1
如图1及表1所示，C(DiGlcNAc)-(RADA)4在所有的pH范围(pH2.0至pH11.5)均可形成透明均一的水凝胶，且可保持钢球在水凝胶表面附近。另一方面，(RADA)4在pH2.0可形成透明均一的水凝胶，且亦可保持钢球在水凝胶表面附近，但在pH3.5以上时则伴随混浊形成不均一的水凝胶，同时钢球亦前进至水凝胶内部，或沉降至杜汉氏管的底部。
由以上可知，C(DiGlcNAc)-(RADA)4在中性的pH，可在维持水凝胶强度之下，形成透明均一的水凝胶。
(实施例2)以钢球载重试验评量水凝胶特性-2
以与实施例1相同的方法，使用C(二唾液酸)-(RADA)4、C(无唾液酸)-(RADA)4、C(二唾液酸)-(RADA)5、C(DiGlcNAc)-(RADA)5、及(RADA)4实施钢球载重试验。所得的评量结果如表2所示。
[表2]
表2
如表2所示，在(RADA)4末端经较大糖链修饰的那些，可在维持水凝胶强度之下，在中性的pH形成透明均一的水凝胶。推想这是以水溶性高，而体积大的糖链修饰多肽，因此抑制肽链间过度集合，同时亦改善组装体的水溶性，或者因两方所作用的结果。
由以上可知，即使(RADA)4或(RADA)5经各种糖链所修饰的糖链-多肽复合物，亦可在维持水凝胶强度之下，在中性pH形成透明均一的水凝胶。
(实施例3)以钢球载重试验评量水凝胶特性-3
以与实施例1相同的方法，以1重量％、0.5重量％及0.25重量％的水凝胶浓度实施C(DiGlcNAc)-(RADA)4的钢球载重试验。其所得的评量结果如表3所示。
[表3]
表3
如表3所示，C(DiGlcNAc)-(RADA)4，在pH7.4，即使在低浓度范围亦可形成均一的水凝胶。同时，C(DiGlcNAc)-(RADA)4在水凝胶浓度降至0.25重量％时，只在pH7.4形成均一的水凝胶。因此可知，C(DiGlcNAc)-(RADA)4，在水凝胶浓度为低浓度的情形时，可通过pH控制水凝胶形成。
亦即，本发明的糖链-多肽复合物，在pH中性的水溶液中，即使在水凝胶浓度低的情形，亦可在维持水凝胶强度之下，形成透明均一的水凝胶。同时可知，本发明的糖链-多肽复合物，在水凝胶浓度为低浓度的情形，亦可通过pH控制水凝胶形成。
(实施例4)以钢球载重试验评量水凝胶特性-4
除水凝胶改为浓度0.5重量％实施以外，以与实施例1相同的方法，使用C(DiGlcNAc)-(RADA)4、2C(麦芽糖)-(RADA)4、2C(麦芽三糖)-(RADA)4、C(麦芽糖)-(RADA)4-C(麦芽糖)、C(麦芽三糖)-(RADA)4-C(麦芽三糖)、3C(麦芽糖)-(RADA)4、(RADA)4-C((DiGlcNAc)、C(麦芽七糖)-(RADA)4、(RATARAEA)2、C(DiGlcNAc)-(RATARAEA)2实施钢球载重试验。所得的评量结果如表4所示。
[表4]
表4
如表4所示，糖链-多肽复合物结合的糖链中所存在的糖残基合计为5以上的编号2、9、11、12、13、及17，在pH3.5及pH7.4可形成透明均一的水凝胶。同时，在表中虽未记载，在(RADA)4的N末端结合C(DiBn-二唾液酸)(糖残基数为11)的糖链-多肽复合物，在pH7.4亦可形成透明均一的水凝胶。另一方面，在糖链-多肽复合物结合的糖链中所存在的糖残基合计为4以下的编号8及编号10，在pH7.4并不形成水凝胶。亦即可知，具有在水溶液中自组装的性质的多肽，在结合糖残基合计为5以上的糖链时，可使该糖链-多肽复合物在中性范围下表现高水溶性，而形成透明均一的水凝胶。
同时亦可知，在糖链-多肽复合物中结合的糖链，不只在为单独含分支的糖链(如编号2及编号13的二-N-乙酰葡萄糖胺糖链、以及表2所示的二唾液酸糖链及无唾液酸糖链)时，即使为在直链的糖链(如麦芽糖糖链或麦芽三糖糖链)时，如编号9、编号11、编号12，由于1个多肽结合2股以上，使糖链-多肽复合物在整体上，为糖链具有分支的状态，则在pH3.5及pH7.4，亦可形成透明均一的水凝胶。
为提高多肽的水溶性，已知可以通过在多肽结合PEG的方法操作，在(RADA)4及(RADA)5结合PEG2000的情形(编号14、及编号15)，虽然在pH3.5及pH7.4并未观察到不溶物，但并不形成均一的水凝胶。亦即可知，本发明的糖链-多肽复合物，与PEG-多肽复合物比较，显示更高的水溶性，并可形成更透明均一的水凝胶。
同时，在编号11中糖链结合在多肽的N末端部分及C末端部分，在编号13中糖链结合在多肽的C末端部分，但在pH3.5及pH7.4均显示高水溶性，而可形成透明均一的水凝胶。亦即可知，本发明的糖链-多肽复合物中，糖链的结合部位不只可在多肽的N末端部分，亦可在C末端部分、或两末端部分。
同时，与(RADA)4及(RADA)5相同，已知(RATARAEA)2亦为可形成水凝胶的多肽。因此再对(RATARAEA)2与糖链结合时，是否可提高凝胶的形成能力，以钢球载重试验加以评量。如表4所示，(RATARAEA)2未结合糖链的编号16，在pH3.5及pH7.4形成不均一而混浊的水凝胶，且钢球亦沉降至杜汉氏管底部。另一方面，在(RATARAEA)2的N末端部分结合C(DiGlcNAc)的糖链-多肽复合物的编号17，在pH3.5及pH7.4可形成透明均一的水凝胶。同时，在表中虽未记载，在(RATARAEA)2的N末端部分结合C(无唾液酸)的糖链-多肽复合物亦同样，在pH7.4可形成透明均一的水凝胶。亦即可知，在含(RATARAEA)2的多肽结合糖链时，可显示更高的水溶性，且可形成更透明均一的水凝胶。
以上的结果显示，不限于(RADA)4，即使对各种序列的多肽，在结合糖链时，在包含中性范围的宽的pH均可形成透明均一的凝胶而可制造糖链-多肽复合物。
(实施例5)以钢球载重试验评量水凝胶特性-5
以与实施例1相同的方法，使用N(无唾液酸)-(RADA)4、N(DiGlcNAc)-(RADA)4及C(DiGlcNAc)-(RADA)4实施钢球载重试验。所得的评量结果如表5所示。
[表5]
表5
如表5所示，为天冬酰胺结合型糖链-多肽复合物的编号18、19亦与为半胱氨酸结合型糖链-多肽复合物的编号2相同，在pH3.5及pH7.4均可形成透明均一的水凝胶。亦即可知，即使结合糖链的氨基酸不是半胱氨酸，本发明的糖链-多肽复合物亦可形成透明均一的水凝胶。
(实施例6)作为止血基质的利用法的研究
为研究含本发明糖链-多肽复合物的水凝胶，是否可利用为止血材料，又以大鼠血浆进行评量试验。
先以与实施例1相同的方法，制备多肽水溶液。再自7周大的Crlj:W1大鼠以肝素钠注射液(味之素公司制造)采取血液，再自离心处理后的上清液得到血浆。之后将多肽水溶液、血浆、及PBS加入杜汉氏管中，调配成血浆浓度5至50％、多肽浓度0.5重量％的水凝胶。之后，再于室温条件下静置20分钟后，以与实施例1的方法同样实施钢球载重试验。静置20分后水凝胶的图像如图2所示，评量结果如表6所示。
[表6]
表6
如图2及表6所示，含C(DiGlcNAc)-(RADA)4的多肽溶液，不拘于血浆的浓度，均可形成均一的水凝胶。而且更为意外的是，C(DiGlcNAc)-(RADA)4，即使在血浆浓度为50％的非常高浓度的状态下，亦可形成均一的水凝胶。另一方面，含(RADA)4的多肽溶液，在全部的血浆浓度中，多肽溶液均为混浊，并可观察到不溶物。同时，确定各水凝胶的pH，全部在pH6至8之间。亦即可知，本发明的糖链-多肽复合物，不只可在中性pH形成均一的水凝胶，即使在高浓度的血浆存在下，亦不易产生不溶物，而形成透明的水凝胶。
由以上的结果，显示本发明的糖链-多肽复合物，作为止血用医药组合物，具有非常高的利用价值。
(实施例7)酸性蛋白质缓释能力的研究
为研究含本发明糖链-多肽复合物的水凝胶，在中性pH是否可利用为缓释载体，接着又进行了试验。
缓冲液使用磷酸缓冲液(pH7.4)。同时，水凝胶中内包的酸性蛋白质，使用经由Alexa Fluor(注册商标)488萤光标识的Bovine Serum Albumin(BSA)(A13100，LifeTechnologies公司制造)。
再以缓冲液盐浓度为0.15M、BSA浓度为5μΜ、和多肽浓度为0.25至1重量％的方式将组分加入试管中，并以涡流搅拌机混合。该混合物再各以50μL添加于多孔培养池系统(Multiwell Insert System)(351130，BD)中，之后于37℃培养箱(细胞培养用CO2培养箱，MCO-18AIC，SANYO公司制造)中，在遮光下静置过夜，调制成BSA内包水凝胶。在37℃培养箱中，将培养池系统浸入各加入225μL与水凝胶相同缓冲液的96孔平底板(353928，BD)中，之后以板振荡机(MICRO PLATE MIXER NS-P，AS ONE公司制造，旋转数：1/5量程)振荡微盘开始试验(0小时)。之后，随着时间的变化以荧光板分析仪(SpectraMax M3，MolecularDevices公司制造)测定由平底板侧漏出的荧光量。之后以同一荧光标识BSA制作标准曲线，由漏出荧光色素的量计算蛋白质的浓度。含(RADA)4的水凝胶、及含C(DiGlcNAc)-(RADA)4的水凝胶的结果如图3所示。作为对照，使用缓冲液中仅添加BSA的溶液(W/O SAP)。图3中，Y轴表示平底板中BSA的浓度，X轴表示自试验开始的时间。
如图3所示，内包在含(RADA)4的水凝胶中的BSA，在试验开始后短时间内大部分即漏出。同时，漏出速度，在多肽为0.5重量％以下时，与未含多肽溶液时的漏出速度相等，显示不具有缓释能力。另一方面，含C(DiGlcNAc)-(RADA)4的水凝胶，即使在0.25重量％的低浓度，与未含多肽的溶液相较，BSA的漏出速度缓慢，具有缓释能力。
亦即可知，本发明的糖链-多肽复合物，在中性pH中，具有内包、保持、缓释酸性蛋白质的效果。
(实施例8)碱性蛋白质缓释能力的研究
对内包的蛋白质除使用碱性蛋白质Lysozyme以外，以与实施例7中记载的方法同样，进行缓释性试验。Lysozyme，使用Alexa Fluor(注册商标)488Protein Labeling Kit(A10235，Invitrogen公司制造)标识Alexa Fluor(注册商标)488后使用。其结果如图4所示。
如图4所示，内包在含(RADA)4的水凝胶中的Lysozyme，在试验开始后1小时以内即大部分漏出。而且，其漏出的速度，与不含多肽溶液时的漏出速度约相等，显示不具有缓释能力。另一方面，含C(DiGlcNAc)-(RADA)4的水凝胶，即使在0.25重量％的低浓度中，与未含多肽的溶液的情形比较，Lysozyme的漏出速度缓慢，因此具有缓释能力。
亦即可知，本发明的糖链-多肽复合物，在中性pH中，具有内包、保持、缓释碱性蛋白质的效果。
(实施例9)圆偏光二色性(CD)的测定及解析
为确定本发明的糖链-多肽复合物可形成β-折叠结构，又进行了CD测定。一般而言，在物质具有β-折叠结构时观察其波长，具有在197nm附近的正吸收及在216nm附近的负吸收的特征。因此，本发明中即关注这些波长的大小，研究pH对β-折叠结构的影响。
将本发明的一实施方案中的C(DiGlcNAc)-(RADA)4、或作为对照的(RADA)4均溶于超纯水中。再对此类多肽的水溶液，各添加1至10mM的氢氧化钠水溶液调整pH，制作成pH2或pH7的100mM多肽水溶液。之后将该水溶液移至光径长度0.1cm的透明石英皿中。之后，对其CD光谱，以光谱旋光计(J-805，Jasco公司制造)，在波长185至260nm，测定椭圆率(毫度(millidegree))。平均残基椭圆率(mean residue ellipticity)θ以下式计算。
〔θ〕＝(θobs/10·l·c)/r
当中θobs表示以毫度测定的椭圆率，l为石英皿长度(cm)，c为浓度(M)，而r表示氨基酸的残基数。
(RADA)4的结果的曲线图如图5所示，C(DiGlcNAc)-(RADA)4的结果的曲线图如图6所示。
如图5及图6所示，在pH2显示(RADA)4及C(DiGlcNAc)-(RADA)4的高摩尔椭圆率。另一方面，在pH7显示C(DiGlcNAc)-(RADA)4的摩尔椭圆率高，但(RADA)4为显著低摩尔椭圆率。亦即，(RADA)4在中性pH几乎不形成β-折叠结构，而C(DiGlcNAc)-(RADA)4即使在中性pH亦明显形成β-折叠结构。
由上述的结果，推想应该是由于C(DiGlcNAc)-(RADA)4存在着糖链，抑制多肽之间过度集合，而可维持β-折叠结构，而(RADA)4在中性pH会促进过度集合而减少β-折叠所致。此结果，与(RADA)4在钢球载重试验中，在中性pH会发生混浊/沉淀，无法形成均一强韧的水凝胶的现象(如图1)亦是一致的。
由以上的结果可确定，本发明的糖链-多肽复合物，在中性pH可形成β-折叠结构。
(实施例10)动力黏度的测定及解析
除了在钢球载重试验中所确定的水凝胶的强度之外，再观察随时间经过的水凝胶强度的变化及水凝胶的稳定性，而进行动力黏度的测定。
动力黏度的测定中，使用具有0.3mm间隙高度的直径25mm不锈钢平行板的流变仪(MCR302，Anton-Parr公司制造)。再以本发明的一实施方案中的C(DiGlcNAc)-(RADA)4、或作为对照的(RADA)4溶于超纯水中。之后为调整此类多肽水溶液的pH，再添加5mM的氢氧化钠水溶液，配成pH7的0.5重量％水凝胶。之后，将这些水凝胶，快速移至设定为25度的流变仪，并监测随时间经过的相位角(tanδ)。(频率数＝1Hz，变形(distortion)＝10％)
测定的结果如图7所示，
如图7所示，含C(DiGlcNAc)-(RADA)4的水凝胶的相位角，自测定开始即快速减少，显示形成强韧的水凝胶。另一方面，含(RADA)4的水凝胶的相位角大，显示形成易碎的水凝胶，或不均一而只有部分强韧的水凝胶。
此结果，与(RADA)4在钢球载重试验中，在中性pH会发生混浊/沉淀，无法形成均一强韧的水凝胶的现象(如图1)亦是一致的。
由以上的结果可确定，本发明的糖链-多肽复合物，在中性pH可形成强韧的水凝胶。

Claims (17)

1.糖链-多肽复合物，其特征为：所述多肽是包含极性氨基酸残基与非极性氨基酸残基交互排列的、由8至34个氨基酸残基所构成的氨基酸序列的多肽，且所述多肽结合1个或多个糖链，
结合至所述多肽的1个或多个糖链中存在的糖残基数合计为5以上。
2.如权利要求1所述的糖链-多肽复合物，其中，所述糖链-多肽复合物，在pH为中性附近的水溶液中可通过自组装而形成含β-折叠结构的水凝胶。
3.如权利要求1所述的糖链-多肽复合物，其中，所述各极性氨基酸残基，是选自：天冬氨酸残基、谷氨酸残基、精氨酸残基、赖氨酸残基、组氨酸残基、酪氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、及半胱氨酸残基所组成的组的氨基酸残基。
4.如权利要求1或3所述的糖链-多肽复合物，其中，所述各非极性氨基酸残基，是选自：丙氨酸残基、缬氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、甲硫氨酸残基、苯丙氨酸残基、色氨酸残基、脯氨酸残基、及甘氨酸残基所组成的组的氨基酸残基。
5.如权利要求4所述的糖链-多肽复合物，其中，所述各极性氨基酸残基，是选自：天冬氨酸残基、谷氨酸残基、精氨酸残基、及苏氨酸残基所组成的组的氨基酸残基；且所述各非极性氨基酸是丙氨酸残基。
6.如权利要求1所述的糖链-多肽复合物，其中，所述氨基酸序列，为“RADA”的重复序列、或“RATARAEA”的重复序列。
7.如权利要求6所述的糖链-多肽复合物，其中，所述氨基酸序列，是选自：RADARADARADARADA(序列编号1)、RADARADARADARADARADA(序列编号2)、及RATARAEARATARAEA(序列编号3)所组成的组的氨基酸序列。
8.如权利要求1所述的糖链-多肽复合物，其中，结合至所述多肽的糖链数为1、2、或3股。
9.如权利要求1所述的糖链-多肽复合物，其中，从位于所述多肽N末端的氨基酸残基计算，至第x个的所有氨基酸、及从位于C末端的氨基酸残基计算，至第y个的所有氨基酸(其中，x及y为整数，x≥0、y≥0，且x+y是结合至多肽的糖链的总数)结合糖链。
10.如权利要求9所述的糖链-多肽复合物，其中，结合至所述多肽的糖链数，为1、2、或3股；
结合至所述多肽的糖链数为1股时，该1股糖链，结合在位于所述多肽N末端的氨基酸残基、或位于C末端的氨基酸残基；
结合至所述多肽的糖链数为2股时，该2股糖链，结合在选自以下(1)至(3)所组成的组的氨基酸残基：
(1)从位于所述多肽N末端的氨基酸残基计算，为第1及第2个的氨基酸残基，
(2)从位于所述多肽C末端的氨基酸残基计算，为第1及第2个的氨基酸残基，
(3)位于所述多肽N末端的氨基酸残基、及位于所述多肽C末端的氨基酸残基；以及
结合至所述多肽的糖链数为3股时，该3股糖链，结合在任一选自以下(1)至(4)所组成的组的氨基酸残基：
(1)从位于所述多肽N末端的氨基酸残基计算，为第1、第2及第3个的氨基酸残基，
(2)从位于所述多肽C末端的氨基酸残基计算，为第1、第2及第3个的氨基酸残基，
(3)从位于所述多肽N末端的氨基酸残基计算，为第1及第2个的氨基酸残基、以及位于所述多肽C末端的氨基酸残基，和
(4)位于所述多肽N末端的氨基酸残基、及从位于所述多肽C末端计算，为第1及第2个的氨基酸残基。
11.如权利要求1所述的糖链-多肽复合物，其中所述糖链，为含支链的糖链。
12.如权利要求1所述的糖链-多肽复合物，其中所述糖链，为选自二唾液酸糖链、无唾液酸糖链、二-N-乙酰葡萄糖胺糖链、二甘露糖糖链、N-乙酰葡萄糖胺糖链、麦芽三糖糖链、麦芽糖糖链、麦芽四糖糖链、麦芽七糖糖链、β-环糊精、及γ-环糊精所组成的组的糖链。
13.水凝胶形成用组合物，所述组合物含权利要求1至12中任一项所述的糖链-多肽复合物。
14.组合物，所述组合物含权利要求1至12中任一项所述的糖链-多肽复合物，其特征为所述组合物为水凝胶的状态。
15.止血用医药组合物，其含权利要求13或14所述的组合物。
16.缓释载体用组合物，所述组合物含权利要求13或14所述的组合物。
17.培养基质用组合物，所述组合物含权利要求13或14所述的组合物。
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