KR20050095609A - 당사슬 아스파라긴 유도체의 제조방법 - Google Patents

당사슬 아스파라긴 유도체의 제조방법 Download PDF

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오츠카 가가쿠 가부시키가이샤
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Abstract

탈지난황으로부터 당사슬 아스파라긴 유도체를 제조하는 방법으로서, (a) 탈지난황을 단백질 분해효소에 의해 당사슬 펩티드 혼합물을 제조하는 공정, (b) 당사슬 펩티드 혼합물을 펩티드 분해효소에 의해 당사슬 아스파라긴 혼합물을 제조하는 공정, (c) 당사슬 아스파라긴 혼합물 중의 당사슬 아스파라긴에 지용성 보호기를 도입하여 당사슬 아스파라긴 유도체 혼합물을 제조하는 공정, (d) 당사슬 아스파라긴 유도체 혼합물을 크로마토그래피에 제공하여 각 당사슬 아스파라긴 유도체를 분리하는 공정을 포함하는 당사슬 아스파라긴 유도체의 제조방법.

Description

당사슬 아스파라긴 유도체의 제조방법{Process for producing sugar chain asparagine derivative}
본 발명은 당사슬 아스파라긴 유도체의 제조방법에 관한 것이다.
최근, 핵산(DNA), 단백질에 이은 제3의 사슬형상 생명분자로서, 당사슬분자가 주목되어 오고 있다. 인간의 몸은 약 60조개의 세포로 되어 있는 하나의 대세포사회(huge cell society)로, 모든 세포 표면은 당사슬분자에 의해 덮혀 있다. 예를 들면, ABO식 혈액형은 세포 표면의 당사슬의 차이에 의해 결정되고 있다.
당사슬은 세포간의 인식이나 상호작용에 관련된 작용을 가져, 세포사회를 성립시키는 중요한 본질로 되어 있다. 세포사회의 교란은 암, 만성질환, 감염증, 노화 등으로 이어진다.
예를 들면, 세포가 암화(癌化)되면 당사슬의 구조변화가 일어나는 것이 알려져 있다. 또한, 콜레라균이나 인플루엔자 바이러스 등은 어느 특정한 당사슬을 인식하여 결합함으로써, 세포에 침입하여 감염되는 것이 알려져 있다.
당사슬은 단당(simple sugar)의 배열, 결합양식·부위, 사슬의 길이·분지양식, 전체의 고차구조 등의 다양성으로부터, 핵산이나 단백질의 구조와 비교하면 매우 복잡한 구조이다. 따라서, 그 구조에 유래하는 생물학적인 정보는 핵산이나 단백질에 비해 다종다양하다. 당사슬은 연구의 중요성을 인식하고 있으면서도, 그 구조의 복잡함이나 다양성에 의해 핵산이나 단백질에 비해 연구의 추진이 뒤져 있는 상황에 있다.
한편, 탈지난황(delipidated egg yolk)으로부터 당사슬 아스파라긴이 얻어지는 것은 알려져 있다(예를 들면 특허문헌 1 참조). 특허문헌 1에 의하면, 탈지난황에 아몬드 또는 살구종자를 첨가함으로써 종래 보다도 대량으로 당사슬 아스파라긴을 얻고 있다. 그러나, 이 방법으로 얻어지는 당사슬 아스파라긴은 순도가 95%나 92%로, 순수한 당사슬 아스파라긴을 단리(isolation)하고 있다고는 할 수 없다. 또한, 수량도 탈지난황 100 ㎏으로부터 디시알릴올리고당(disialyloligosaccharide)(11당 디시알릴올리고당)을 29.5 g 또는 27.2 g으로 얻고 있다.
또한, 계란의 가용 분획(soluble fraction)으로부터 추출되는 당펩티드(SGP:시알릴글리코펩티드)로부터 당사슬 아스파라긴이 얻어지는 것도 알려져 있다. 이 SGP는, 11개의 당잔기로 되는 복합형 당사슬의 환원말단에, 아미노산 6잔기로 되는 펩티드 사슬의 아스파라긴 잔기가 결합된 화합물이다. 그러나, SGP는, 예를 들면 세코 등[비오케미카 비오피지카 악타(Biochem. Biophys. Acta) 제1335권, 제23페이지(1997)]의 방법에 따르면, 계란황(chicken egg yolk) 1개로부터 약 8 ㎎ 밖에 얻어지지 않는 것이 나타내어져 있다.
[특허문헌 1] 국제공개 WO96/02255호 공보(청구항 8 및 청구항 10)
본 발명의 목적은, 의약품 개발 등의 분야에 있어서 유용한 각종 단리된 당사슬 아스파라긴 유도체를 종래에 비해 매우 용이하고 또한 대량으로 얻을 수 있는, 당사슬 아스파라긴 유도체의 제조방법을 제공하는 것에 있다.
발명의 개시
본 발명은 이하의 발명에 관한 것이다.
1. 탈지난황으로부터 당사슬 아스파라긴 유도체를 제조하는 방법으로서, (a) 탈지난황을 단백질 분해효소에 의해 당사슬 펩티드 혼합물을 제조하는 공정, (b) 당사슬 펩티드 혼합물을 펩티드 분해효소에 의해 당사슬 아스파라긴 혼합물을 제조하는 공정, (c) 당사슬 아스파라긴 혼합물 중의 당사슬 아스파라긴에 지용성 보호기를 도입하여 당사슬 아스파라긴 유도체 혼합물을 제조하는 공정, (d) 당사슬 아스파라긴 유도체 혼합물을 크로마토그래피에 제공하여 각 당사슬 아스파라긴 유도체를 분리하는 공정을 포함하는 당사슬 아스파라긴 유도체의 제조방법.
2. 탈지난황이 조류 알의 난황을 유기 용매로 탈지처리함으로써 얻어진 것인 상기 당사슬 아스파라긴 유도체의 제조방법.
3. 당사슬 아스파라긴 유도체가 11~5 당사슬 아스파라긴 유도체인 상기 당사슬 아스파라긴 유도체의 제조방법.
4. 지용성 보호기가 카보네이트기 함유, 아실기, 알릴기, Fmoc기 또는 Boc기인 상기 당사슬 아스파라긴 유도체의 제조방법.
5. (b)에서 얻어지는 당사슬 아스파라긴 혼합물에 포함되는 당사슬 아스파라긴을 미리 가수분해하여 일부 당잔기를 절단해 두는 상기 당사슬 아스파라긴 유도체의 제조방법.
6. (c)에서 얻어지는 당사슬 아스파라긴 유도체 혼합물에 포함되는 당사슬 아스파라긴 유도체를 미리 가수분해하여 일부 당잔기를 절단해 두는 상기 당사슬 아스파라긴 유도체의 제조방법.
본 발명의 당사슬 아스파라긴 유도체의 제조방법은, 난황, 예를 들면, 조류 난황으로부터 얻어지는 탈지난황을 단백질 분해효소에 의해 당사슬 펩티드 혼합물을 얻고, 이어서 펩티드 분해효소에 의해 당사슬 아스파라긴의 혼합물을 얻고, 이어서 이 혼합물에 포함되는 해당 당사슬 아스파라긴에 지용성 보호기를 도입(결합)하여 당사슬 아스파라긴 유도체의 혼합물을 얻은 후에 해당 혼합물을 각 당사슬 아스파라긴 유도체로 분리하는 것을 커다란 특징으로 한다. 또한, 본 명세서에 있어서 「당사슬 아스파라긴」이란 아스파라긴이 결합된 상태의 당사슬을 말한다. 또한, 「아스파라긴 결합형 당사슬」이란 단백질의 폴리펩티드 중의 아스파라긴(Asn)의 산아미노기에, 환원말단에 존재하는 N-아세틸글루코사민이 N-글리코시드 결합된 당사슬군으로서, Man(β1-4)GlcNac(β1-4)GlcNac를 모핵으로 하는 당사슬군을 말한다. 「당사슬 아스파라긴 유도체」란 아스파라긴 잔기에 지용성 보호기가 결합된 상태의 당사슬 아스파라긴을 말한다. 또한, 화합물의 구조식 중, 「AcHN」은 아세트아미도기를 나타낸다.
본 발명의 당사슬 아스파라긴 유도체의 제조방법은, 구체적으로는
(a) 탈지난황을 단백질 분해효소에 의해 당사슬 펩티드 혼합물을 제조하는 공정, 및
(b) 당사슬 펩티드 혼합물을 펩티드 분해효소에 의해 당사슬 아스파라긴 혼합물을 제조하는 공정, 및
(c) 당사슬 아스파라긴 혼합물 중의 당사슬 아스파라긴에 지용성 보호기를 도입하여 당사슬 아스파라긴 유도체 혼합물을 제조하는 공정, 및
(d) 당사슬 아스파라긴 유도체 혼합물을 크로마토그래피에 제공하여 각 당사슬 아스파라긴 유도체를 분리하는 공정,
을 포함하는 것이다.
이하, 본 발명의 탈지난황으로부터 당사슬 아스파라긴 유도체를 얻는 제조방법을 구체적으로 설명한다.
본 발명에 사용되는 탈지난황이란 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 조류 알의 난황(닭, 메추라기, 집오리, 청둥오리, 비둘기 등의 난황이 바람직하다. 특히 난황 내에 포함되는 인간형(human-type) 당사슬 아스파라긴, 특히 인간형 2분지 당사슬 아스파라긴의 양으로부터 닭이 좋다.)을 유기 용매로 탈지처리한 것이 좋다. 이 때, 유기 용매로서는, 메탄올, 에탄올, 디에틸에테르 등이 바람직하다.
(a)공정으로서는, 상기 탈지난황을 단백질 분해효소에 의해 단백질을 절단하여, 탈지난황에 포함되는 당사슬 펩티드(당사슬 아스파라긴 펩티드)의 혼합물을 얻는다. 이 때, 사용하는 단백질 분해효소로서는, 예를 들면, 프로나아제(Pronase)(와코쥰야쿠사제), 오리엔타아제(Orientase)(HBI사제) 등, 일반의 것을 사용할 수 있다.
또한, 당사슬 펩티드의 혼합물로부터 당사슬 펩티드 이외의 성분을 공지의 방법, 예를 들면, 겔여과 칼럼(gel permeation column), 이온교환 칼럼(ion exchange column) 등을 사용한 각종 크로마토그래피나, 고속액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용한 정제법에 따라 제거하는 것이 바람직하다.
(b)공정으로서는, (a)공정에서 얻어진 당사슬 펩티드의 혼합물을 펩티드 분해효소에 의해 펩티드를 분해하고, 당사슬 펩티드에 포함되는 당사슬 아스파라긴의 혼합물을 얻는다. 이 때, 사용하는 펩티드 분해효소로서는, 예를 들면, 액티나아제(actinase) 등, 일반의 것을 사용할 수 있다.
또한, 당사슬 아스파라긴의 혼합물로부터 당사슬 아스파라긴 이외의 성분을 공지의 방법, 예를 들면, 겔여과 칼럼, 이온교환 칼럼 등을 사용한 각종 크로마토그래피나, 고속액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용한 정제법에 따라 제거하는 것이 바람직하다.
또한, 목적으로 하는 당사슬구조를 갖는 당사슬 아스파라긴 유도체를 효율적으로 얻는다고 하는 관점에서, 추가로 해당 혼합물에 포함되는 당사슬 아스파라긴을 가수분해하여 일부 당잔기를 미리 절단해 두는 것이 바람직하다. 가수분해하는 방법으로서는 산을 사용하는 방법 또는 효소를 사용하는 방법 등이 있다.
상기 산으로서는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 염산, 황산, 질산, 트리플루오로초산 등의 무기산 및 유기산, 양이온교환 수지, 불용성 고체시약(실리카겔 등) 등을 사용할 수 있다. 또한, 효소로서는, 당가수분해효소가 적합하고, 엔도형(endo-type), 엑소형(exo-type) 중 어느 반응양식의 효소도 사용할 수 있다. 이러한 효소로서는 특별히 한정되지 않고, 해당 활성을 갖는 것이라면, 시판의 효소, 새롭게 단리된 효소, 유전자공학적으로 창제(創製)된 효소여도 된다.
효소반응은 공지의 조건에 따르면 되고, 그 때, 반응의 진행을 박층 크로마토그래피로 추적하여, 화합물이 가장 많이 얻어지는 지점에서 반응을 적절히 정지시키면 된다.
(c)공정으로서는, (b)공정에서 얻어진 당사슬 아스파라긴을 포함하는 혼합물을 사용하여, 그것에 포함되는 당사슬 아스파라긴에 지용성 보호기의 도입을 행한다. 해당 보호기로서는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)기나, t-부틸옥시카르보닐(Boc)기, 알릴옥시카보네이트(Alloc)기 등의 카보네이트 함유기, 아세틸(Ac)기 등의 아실기, 알릴기, 벤질기 등의 보호기를 사용할 수 있다. 합성의 효율 및 다음 공정의 분리정제의 효율을 고려하면, 바람직하게는, 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)기나, t-부틸옥시카르보닐(Boc)기, 알릴옥시카보네이트기 등의 카보네이트 함유기, 아세틸기 등의 아실기가 좋다. 또한, 얻어진 당사슬 아스파라긴 유도체를 바로 목적으로 하는 당펩티드의 합성에 사용할 수 있다는 관점에서, 해당 보호기로서는 펩티드 합성에 널리 사용되는 Fmoc기 또는 Boc기가 바람직하고, 그 중에서도 Fmoc기는 시알산 등 비교적 산성 조건에 불안정한 당이 당사슬에 존재하는 경우에 특히 유효하기 때문에 보다 바람직하다. 또한, 보호기의 도입은 공지의 방법(예를 들면, Protecting Groups in Organic Chemistry, John Wiley & Sons INC., New York 1991, ISBN 0-471-62301-6 을 참조)에 따라 행하면 된다.
예를 들면, Fmoc기를 사용하는 경우, 당사슬 아스파라긴을 포함하는 혼합물에 대해 아세톤 또는 DMF를 적량 가한 후, 추가로 9-플루오레닐메틸-N-숙신이미딜 카보네이트와 탄산수소나트륨을 가하여 용해하고, 25℃에서 아스파라긴 잔기로의 Fmoc기의 결합반응을 행함으로써, 해당 당사슬 아스파라긴의 아스파라긴 잔기에 Fmoc기를 도입할 수 있다.
이상의 조작에 의해, 지용성 보호기가 도입된 당사슬 아스파라긴 유도체의 혼합물이 얻어진다.
(d)공정으로서는, (c)공정에서 얻어진 당사슬 아스파라긴 유도체 혼합물을 공지의 크로마토그래피, 특히 분취형 크로마토그래피(fractionating chromatography)에 제공하여 각 당사슬 아스파라긴 유도체로 분리한다. 또한, 이러한 공정에 있어서는, 얻어진 당사슬 아스파라긴 유도체 혼합물을 직접 사용할 수 있지만, 목적으로 하는 당사슬구조를 갖는 당사슬 아스파라긴 유도체를 효율적으로 얻는다는 관점에서, 추가로 해당 혼합물에 포함되는 당사슬 아스파라긴 유도체를 가수분해에 제공하고, 일부 당잔기를 미리 절단하여 얻어지는 당사슬 아스파라긴 유도체의 혼합물을 사용해도 된다. 또한, 당잔기의 절단 정도는 상기와 동일하다. 또한, 가수분해는 상기와 동일하게 하여 행할 수 있다.
각 당사슬 아스파라긴 유도체의 크로마토그래피에 의한 분리는, 적절히 공지의 크로마토그래피를 단독으로 또는 복수 조합하여 사용함으로써 행할 수 있다.
예를 들면, 얻어진 당사슬 아스파라긴 유도체 혼합물을 겔여과 칼럼크로마토그래피로 정제 후, HPLC를 사용하여 정제한다. HPLC에 있어서 사용할 수 있는 칼럼으로서는 역상계 칼럼(reverse phase column)이 적합하고, 예를 들면, ODS, Phenyl계, 니트릴계나, 음이온교환계의 칼럼, 구체적으로는, 예를 들면, 파마시아사제 모노 Q 칼럼(mono Q column manufactured by Pharmacia), 이아트론사제 이아트로비즈 칼럼(Iatro-beads column manufactured by Iatron) 등이 이용 가능하다. 분리조건 등은, 적절히 공지의 조건을 참조하여 조정하면 된다. 이상의 조작에 의해, 당사슬 아스파라긴 유도체 혼합물로부터 목적으로 하는 각 당사슬 아스파라긴 유도체를 얻을 수 있다.
상기에서 얻어지는 당사슬 아스파라긴 유도체로서는, 에를 들면 11~5 당사슬 아스파라긴 유도체, 바람직하게는 11~7 당사슬 아스파라긴 유도체, 더욱 바람직하게는 11~9 당사슬 아스파라긴 유도체, 특히 바람직하게는 하기 식으로 나타내어지는 11 당사슬 아스파라긴 유도체를 들 수 있다. 또한, 식 중의 Prot는 보호기를 나타낸다.
더욱이, 분리된 당사슬 아스파라긴 유도체를 가수분해함으로써, 목적으로 하는 당사슬 구조를 갖는 당사슬 아스파라긴 유도체를 효율적으로 얻을 수 있다. 예를 들면, 당사슬 아스파라긴 유도체를 분리하는 단계에 있어서는 혼합물에 포함되는 당사슬 아스파라긴 유도체의 종류를 제한하여 당사슬 아스파라긴 유도체를 대충 분리하고, 이어서 가수분해, 예를 들면, 당 가수분해효소를 사용하여 가수분해함으로써 목적으로 하는 당사슬 구조를 갖는 당사슬 아스파라긴 유도체를 효율적으로 얻을 수 있다. 또한, 가수분해는 상기와 동일하게 하여 행할 수 있다. 특히, 목적으로 하는 당사슬 구조를 갖는 당사슬 아스파라긴 유도체를 보다 효율적으로 얻는 관점으로부터, 당잔기의 절단양식이 명확한 당 가수분해효소를 사용하여 가수분해하는 것이 바람직하다.
이와 같이, 각 당사슬 아스파라긴 유도체를 얻은 후, 추가로 각종 당 가수분해효소 등을 사용하여 해당 유도체를 가수분해하고, 당사슬의 비환원말단의 당잔기를 제거함으로써, 예를 들면, 당사슬 말단의 분지구조가 불균일한 다양한 당사슬 아스파라긴 유도체를 각각 단일 화합물로서 얻을 수 있다. 또한, 여러가지 당 가수분해효소를 사용하여, 가수분해하는 순서나 그 종류를 변경함으로써, 보다 많은 종류의 당사슬 아스파라긴 유도체를 제조할 수 있다.
또한 본 발명은, 여러 가지의 단리된 당사슬 아스파라긴을 대량으로 얻을 수 있는 당사슬 아스파라긴의 제조방법을 제공한다. 해당 방법은, 상기 당사슬 아스파라긴 유도체의 제조방법에 따른 당사슬 아스파라긴 유도체의 제조공정에 이어, 추가로, 얻어진 당사슬 아스파라긴 유도체로부터 보호기를 제거하는 공정을 포함하는 것이다.
당사슬 아스파라긴 유도체로부터의 보호기의 제거는, 공지의 방법에 따라 행할 수 있다(예를 들면, Protecting Groups in Organic Chemistry, John Wiley & Sons INC., New York 1991, ISBN 0-471-62301-6을 참조). 예를 들면, 보호기가 Fmoc기인 경우, N,N-디메틸포름아미드(DMF) 중, 당사슬 아스파라긴 유도체에 모르폴린(morpholine)을 가하여 반응을 행함으로써 Fmoc기를 제거할 수 있다. 또한, Boc기는 약산을 반응시킴으로써 제거할 수 있다. 보호기 제거 후, 목적에 따라 적절히 공지의 방법, 예를 들면 겔여과 칼럼, 이온교환 칼럼 등을 사용하는 각종 크로마토그래피나, HPLC에 의한 분리라고 하는 방법에 의해 정제함으로써, 당사슬 아스파라긴을 얻어도 된다.
또한, 보호기가 벤질기인 경우, 벤질기의 제거는 공지의 방법에 따라 행할 수 있다(예를 들면, Protecting Groups in Organic Chemistry, John Wiley & Sons INC., New York 1991, ISBN 0-471-62301-6을 참조).
더욱이, 당사슬 아스파라긴으로부터의 아스파라긴 잔기의 제거는 공지의 방법에 따라 행할 수 있다. 예를 들면, 당사슬 아스파라긴을 무수 히드라진과 반응시킨 후, 아세틸화함으로써 아스파라긴 잔기를 제거하여 당사슬을 얻을 수 있다. 또한, 당사슬 아스파라긴을 염기성 수용액으로 가열 환류 후, 아세틸화함으로써도 아스파라긴 잔기를 제거하여 당사슬을 얻을 수 있다. 아스파라긴 잔기 제거 후, 목적에 따라 적절히 공지의 방법, 예를 들면 겔여과 칼럼, 이온교환 칼럼 등을 사용하는 각종 크로마토그래피나, HPLC에 의한 분리라고 하는 방법에 의해 정제해도 된다.
이와 같이 본 발명에 따르면, 목적으로 하는 당사슬 구조를 갖는 당사슬 아스파라긴 유도체, 당사슬 아스파라긴 및 당사슬(이하, 3개를 총괄하여 당사슬류라고 하는 경우가 있다)을 저렴하고 또한 효율적으로 대량으로 제조할 수 있다.
이러한 당사슬류는 의약품 개발 등의 분야에 있어서 매우 유용하다. 예를 들면, 의약품 개발에 있어서의 응용예로서는, 예를 들면 암의 백신 합성을 들 수 있다. 세포가 암화되면 체내에는 없었던 당사슬이 발현되는 것이 알려져 있다. 또한, 해당 당사슬을 화학적으로 합성하여 백신으로서 개체에 투여하면, 암의 증식이 억제되는 것도 알려져 있다. 따라서, 본 발명에 의해 목적으로 하는 당사슬을 제조할 수 있다면, 암 치료에 유효한 백신의 합성을 행하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명에 의해 얻어지는 당사슬류를, 추가로 화학적인 반응 및 당전이효소에 의한 반응 등을 조합시키고 새로운 당잔기를 결합시켜 유도체화하여, 신규한 백신의 합성을 행하는 것도 가능하다.
또한, 예를 들면, 당단백질인 에리스로포이에틴(erythropoietin;EPO)이, 그 적혈구 증식능에 의해 빈혈 치료약으로서 사용되고 있지만, 이 EPO는 당사슬이 결합되어 있지 않으면 활성이 나오지 않는 것이 판명되어 있다. 이와 같이, 단백질에는 당사슬의 결합에 의해 생리활성을 발현하는 것이 있기 때문에, 예를 들면, 당사슬을 결합시킬 수 없는 대장균 발현계에 의해 단백질만을 대량으로 조제하고, 이어서 목적으로 하는 당사슬구조를 갖는, 본 발명에 의해 제조한 당사슬을 도입함으로써 생리활성의 발현을 부여하거나, 또한, 임의의 단백질에 여러 가지 당사슬구조를 갖는, 본 발명에 의해 제조한 당사슬을 도입함으로써, 새로운 생리활성을 갖는 신규한 당단백질을 합성하는 것도 가능하다.
또한, 천연의 당단백질에 존재하는 당사슬을 본 발명에 의해 제조한 당사슬과 치환함으로써 새로운 생리활성을 부여하는 것도 가능하다. 당단백질이 갖는 당사슬을 본 발명에 의해 얻어진 당사슬과 치환하는 기술로서는, 예를 들면, P. Sears and C. H. Wong, Science, 2001, vol 291, p 2344~2350에 기재된 방법을 들 수 있다. 즉, 당단백질을 β-N-아세틸글루코사미니다아제(Endo-H)로 처리하여 단백질 표면의 아스파라긴 잔기에는 N-아세틸글루코사민 잔기가 1개만 결합된 상태로 한다. 이어서, 본 발명에 의해 얻어진 당사슬 아스파라긴 중의 목적으로 하는 당사슬을 β-N-아세틸글루코사미니다아제(Endo-M)를 사용해서, 상기 N-아세틸글루코사민 잔기에 결합시킨다고 하는 방법을 들 수 있다. 또한, tRNA에 N-아세틸글루코사민을 결합시켜 두고, 대장균 등의 발현계를 이용하여 N-아세틸글루코사민 잔기를 갖는 당단백질을 합성 후, 본 발명에 의해 얻어진 당사슬 아스파라긴 중의 목적으로 하는 당사슬을 Endo-M을 사용하여 도입하는 것도 가능하다.
또한, 현재, 당단백질을 치료약으로서 이용할 때의 문제로서, 투여된 당단백질의 대사속도가 빠른 것을 들 수 있다. 이것은, 당단백질의 당사슬 말단에 존재하는 시알산이 생체 내에서 제거되면 바로 해당 당단백질이 간장에 의해 대사되는 것에 따른 것이다. 그 때문에, 어느 정도 양의 당단백질을 투여할 필요가 있다. 따라서, 본 발명에 의해 당사슬의 말단에 제거되기 어려운 시알산을 새롭게 삽입한 당사슬을 제조하고, 대상 단백질에 해당 당사슬을 Endo-M을 이용하여 도입하면, 생체 내에서의 당단백질의 대사속도를 제어하는 것이 가능해져, 투여하는 당단백질의 양을 낮게 하는 것도 가능하다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하에 실시예를 들어 설명하지만, 본 발명은 조금도 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
에탄올(EtOH) 67 ㎖를 교반하고 있는 곳에, 난황 1개를 깨뜨려 넣었다. 약 5시간 교반한 후 여과를 행하고, 추가로 EtOH 30 ㎖로 세정을 행하였다. 얻어진 결정에, 다시 EtOH 83 ㎖를 가하여 하룻밤 교반을 행한 후 여과를 행하여 EtOH 30 ㎖로 세정 후, 결정을 건조시키자 탈지난황(Delipidated Egg Yolk)이 약 3 g 얻어졌다.
(a) 이것을 인산 완충액(pH=7.0, 30 ㎖)에 용해시킨 후, NaN3(10 ㎎)를 가하였다. 추가로, 오리엔타아제 ONS(HBI사제, 1.0 g)를 가하여 50℃에서 약 24시간 정치(靜置)시켰다. 반응의 종료를 TLC로 확인한 후, 반응액을 셀라이트로 여과하였다. 여액을 농축에 의해 감소시키고, 겔여과 칼럼크로마토그래피(Sephadex G-25, 2.5×100 ㎝, H2O)로 정제하였다. 목적으로 하는 당이 포함되는 분획을 모아 농축하고, 이어서 동결 건조를 행하였다.
(b) 얻어진 잔류물(약 430 ㎎)에, 트리스-염산·염화칼슘 완충용액(pH=7.5, 43 ㎖), NaN3(21 ㎎)를 가하여 용해시켰다. 이것에, 액티나아제 E(43 ㎎)를 가하여 12시간 간격으로 pH를 체크하면서 24시간 정치시켰다. 24시간 후, 반응액에 다시 액티나아제 E 21.5 ㎎을 가하고, 다시 pH를 체크하면서 약 48시간 반응시켰다. 반응의 종료를 TLC로 확인한 후, 셀라이트 여과를 행하여 여액을 농축으로 감소시키고, 겔여과 칼럼크로마토그래피(Sepadex G-25, 2.6×100 ㎝, H2O)로 정제하였다. 목적으로 하는 당이 포함되는 분획을 모아 농축하고, 이어서 동결 건조를 행하였다.
(c) 얻어진 잔류물(약 120 ㎎)을 물 1.5 ㎖에 용해하고, 중탄산나트륨 26 ㎎을 가하였다. 여기에, Fmoc-Osu[N-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl) oxysuccinimide] 68 ㎎을 용해한 디메틸포름아미드 2.5 ㎖를 가하고, 실온에서 2시간 반응시켰다. 원료 소실을 TLC(이소프로판올:1 M 초산암모늄 수용액=3:2)로 확인 후, 이베포레이터(evaporator)를 사용하여 농축하였다. 잔사에, 물 15 ㎖, 디에틸에테르 25 ㎖를 가하여 10분간 교반한 후, 분액조작을 행하였다. 추가로 수층을, 디에틸에테르 15 ㎖로 세정한 후, 농축하고, 동결 건조를 행하였다. 이것을, ODS 칼럼(와코겔(Wako-Gel) 100C18)을 사용하고, 기울기 용리(gradient elution)하여 정제하였다. 당사슬이 포함되어 있는 분획을 모아, 농축하고, 이어서 동결 건조를 행하였다.
(d) 이 잔류물을 HPLC 분취 칼럼으로 정제하였다(YMC-Pack R&D ODS, D-ODS-5-A, 20×250 mm, AN/25 mM AcONH4 buffer=20/80, 7.5 ㎖/min., wavelength; 274 nm). 약 15분 후에 나오는 메인 피크를 분취 후, 농축하고, 이어서 ODS 칼럼으로 탈염처리를 행하였다. 동결 건조하자, 목적으로 하는 디시알로 Fmoc 당사슬 유도체가, 약 13.3 ㎎ 얻어졌다.
얻어진 화합물의 1H-NMR 데이터는 이하와 같다.
실시예 2 [디시알로 당사슬-Boc 유도체(11 당)
(b)까지는 실시예 1과 동일하게 행하였다.
(c) 얻어진 잔류물(약 120 ㎎)을 0.1 N NaOHaq. 1 ㎖에 용해시켰다. 여기에, (Boc)2O(4 ㎖, 도쿄 가세이사제)를 가하고, 실온에서 2시간 반응시켰다. 원료 소실을 TLC(이소프로판올: 1 M 초산암모늄 수용액=3:2)로 확인 후, 디클로로메탄 2.5 ㎖를 가하여 분액을 행하였다. 수층을 추가로 디클로로메탄 2.5 ㎖로 세정한 후, 40 mM HCl로 pH=7.0으로 조정한다. 수층을 농축 후, ODS 칼럼으로 정제를 행한다(gradient H2O 100% → H2O/AN=99/1 → H2O/AN=95/5 → H2O/AN=90/10). 목적의 디시알로 당사슬 Boc 유도체가 포함되어 있는 분획(HPLC로 확인)을 모아, 농축하고, 이어서 동결 건조를 행하였다.
(d) 이 잔류물을 HPLC로 단리·정제를 행하였다(YMC-Pack ODS-AM, SH-343-5AM, 20×250 mm, AN/25 mM AcONH4 buffer=5/95, 7.0 ㎖/min., wavelength; 215 nm). 약 11분 후에 나오는 메인 피크를 분취 후, 농축하고, 이어서 겔 칼럼크로마토그래피(Sephadex G-25, H2O)로 탈염처리를 행하였다. 동결 건조하자, 목적으로 하는 디시알로 당사슬 Boc 유도체가, 약 10.0 ㎎ 얻어졌다.
실시예 3 [디시알로-당사슬 Ac 유도체(11 당)]
(b)까지는 실시예 1과 동일하게 행하였다.
(c) 얻어진 잔류물(약 120 ㎎)을, 정제수 1 ㎖에 용해시켰다. 이것에 K2CO3(72 ㎎)를 가하고, 추가로 무수 초산(99 ㎖)을 가하여 약 2시간 교반하였다. 실온에서 2시간 반응시킨 후, 원료 소실을 TLC(이소프로판올: 1 M 초산암모늄 수용액=3:2)로 확인 후, 디클로로메탄 2.5 ㎖를 가하여 분액을 행하였다. 수층을 추가로 디클로로메탄 2.5 ㎖로 세정한 후, sat. NaHCO3aq.로 pH=7.0으로 조정하였다. 수층을 농축 후, ODS 칼럼으로 정제를 행하였다(gradient H2O 100% → H2O/AN=99/1 → H2O/AN=95/5). 목적의 디시알로 당사슬 Ac 유도체가 포함되어 있는 분획(HPLC로 확인)을 모아, 농축하고, 이어서 동결 건조를 행하였다.
(d) 이 잔류물을 HPLC로 단리·정제를 행하였다(YMC-Pack ODS-AM, SH-343-5AM, 20×250 mm, AN/25 mM AcONH4 buffer=1/99, 7.0 ㎖/min., wavelength; 215 nm). 약 11분 후에 나오는 메인 피크를 분취 후, 농축하고, 이어서 겔 칼럼크로마토그래피(Sephadex G-25, H2O)로 탈염처리를 행하였다. 동결 건조하자, 목적으로 하는 디시알로 당사슬 Ac 유도체가, 약 8.5 ㎎ 얻어졌다.
실시예 4 [디시알로 당사슬-Alloc 유도체(11 당)]
(b)까지는 실시예 1과 동일하게 행하였다.
(c) 얻어진 잔류물(약 120 ㎎)을, 0.1 N NaOHaq. 6 ㎖에 용해시켰다. 여기에, (AllylOCO)2O(573 ㎖, 도쿄 가세이사제)를 가하고, 실온에서 12시간 반응시켰다. 원료 소실을 TLC(이소프로판올: 1 M 초산암모늄 수용액=3:2)로 확인 후, 디클로로메탄 12 ㎖를 가하여 분액을 행하였다. 수층을 추가로 디클로로메탄 12 ㎖로 세정한 후, 40 mM HCl로 pH=7.0으로 조정하였다. 수층을 농축 후, ODS 칼럼으로 정제를 행하였다(gradient H2O 100% → H2O/AN=99/1 → H2O/AN=95/5). 목적의 디시알로 당사슬 Alloc 유도체가 포함되어 있는 분획(HPLC로 확인)을 모아, 농축하고, 이어서 동결 건조를 행하였다.
(d) 이 잔류물을 HPLC로 단리·정제를 행하였다(YMC-Pack ODS-AM, SH-343-5AM, 20×250 mm, AN/25 mM AcONH4 buffer=2/98, 7.5 ㎖/min., wavelength; 215 nm). 약 18분 후에 나오는 메인 피크를 분취 후, 농축하고, 이어서 겔 칼럼크로마토그래피(Sephadex G-25, H2O)로 탈염처리를 행하였다. 동결 건조하자, 목적으로 하는 디시알로 당사슬 Alloc 유도체가, 약 8.7 ㎎ 얻어졌다.
본 발명에 따르면, 의약품 개발 등의 분야에 있어서 유용한 각종 단리된 당사슬 아스파라긴 유도체를 종래에 비해 매우 용이하고 또한 대량으로 얻을 수 있다.

Claims (12)

  1. 탈지난황으로부터 당사슬 아스파라긴 유도체를 제조하는 방법으로서, (a) 탈지난황을 단백질 분해효소에 의해 당사슬 펩티드 혼합물을 제조하는 공정, (b) 당사슬 펩티드 혼합물을 펩티드 분해효소에 의해 당사슬 아스파라긴 혼합물을 제조하는 공정, (c) 당사슬 아스파라긴 혼합물 중의 당사슬 아스파라긴에 지용성 보호기를 도입하여 당사슬 아스파라긴 유도체 혼합물을 제조하는 공정, (d) 당사슬 아스파라긴 유도체 혼합물을 크로마토그래피에 제공하여 각 당사슬 아스파라긴 유도체를 분리하는 공정을 포함하는 당사슬 아스파라긴 유도체의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 탈지난황이 조류 알의 난황을 유기 용매로 탈지처리함으로써 얻어진 것인 당사슬 아스파라긴 유도체의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 당사슬 아스파라긴 유도체가 11~5 당사슬 아스파라긴 유도체인 당사슬 아스파라긴 유도체의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서, 당사슬 아스파라긴 유도체가 11~7 당사슬 아스파라긴 유도체인 당사슬 아스파라긴 유도체의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 당사슬 아스파라긴 유도체가 11~9 당사슬 아스파라긴 유도체인 당사슬 아스파라긴 유도체의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 당사슬 아스파라긴 유도체가 11 당사슬 아스파라긴 유도체인 당사슬 아스파라긴 유도체의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 지용성 보호기가 카보네이트 함유기 또는 아실기인 당사슬 스파라긴 유도체의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 지용성 보호기가 카보네이트 함유기인 당사슬 스파라긴 유도체의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 지용성 보호기가 Fmoc기 또는 Boc기인 당사슬 스파라긴 유도체의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 지용성 보호기가 Fmoc기인 당사슬 스파라긴 유도체의 제조방법.
  11. 제1항에 있어서, (b)에서 얻어지는 당사슬 아스파라긴 혼합물에 포함되는 당사슬 아스파라긴을 미리 가수분해하여 일부 당잔기를 절단해 두는 당사슬 스파라긴 유도체의 제조방법.
  12. 제1항에 있어서, (c)에서 얻어지는 당사슬 아스파라긴 유도체 혼합물에 포함되는 당사슬 아스파라긴 유도체를 미리 가수분해하여 일부 당잔기를 절단해 두는 당사슬 스파라긴 유도체의 제조방법.
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