JPH0899988A - シアル酸類含有オリゴ糖の製造法 - Google Patents
シアル酸類含有オリゴ糖の製造法Info
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- JPH0899988A JPH0899988A JP6274184A JP27418494A JPH0899988A JP H0899988 A JPH0899988 A JP H0899988A JP 6274184 A JP6274184 A JP 6274184A JP 27418494 A JP27418494 A JP 27418494A JP H0899988 A JPH0899988 A JP H0899988A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 糖鎖生物学の進歩に伴い今後需要が高まるも
のと考えられるシアル酸含有オリゴ糖を鳥類卵脱脂卵黄
より工業的規模で製造する方法を提供することを目的と
する。 【構成】 シアル酸含有オリゴ糖を鳥類卵脱脂卵黄から
水もしくは塩溶液で抽出することにより製造する方法。
のと考えられるシアル酸含有オリゴ糖を鳥類卵脱脂卵黄
より工業的規模で製造する方法を提供することを目的と
する。 【構成】 シアル酸含有オリゴ糖を鳥類卵脱脂卵黄から
水もしくは塩溶液で抽出することにより製造する方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は鳥類卵脱脂卵黄からシア
ル酸類を含有するオリゴ糖を製造する方法に関するもの
である。
ル酸類を含有するオリゴ糖を製造する方法に関するもの
である。
【０００２】
【従来の技術】シアル酸類含有オリゴ糖には、糖タンパ
ク質分子中に存在するオリゴ糖鎖、ガングリオシドに存
在するオリゴ糖鎖、及び糖タンパク質もしくはガングリ
オシドより遊離して存在するオリゴ糖ペプチドもしくは
オリゴ糖鎖などが天然に存在している。近年数多くの研
究により、シアル酸類含有オリゴ糖の生物学的意義が明
らかになりつつある。シアル酸類含有オリゴ糖は糖タン
パク質上に存在してその三次構造の規定、プロテアーゼ
に対する抵抗性の増大、血中半減期の規定、分子間相互
作用、溶解度の増大などに関与し、ガングリオシドでは
細胞間認識、細胞分化などに影響を与える構成要素とな
っている。特に、炎症反応の初期過程においてシアリル
ルイス−Ｘ抗原が重要な役割を果たすという知見、及び
シアル酸類含有オリゴ糖が様々な病原性ウイルスや毒素
のレセプターとなり得るという事実より、抗炎症作用、
抗ウイルス感染作用などを目指した医薬品及び機能性食
品への本化合物の需要が今後高まるものと考えられ、そ
の工業的規模での生産技術の確立が望まれている。鳥類
卵卵黄中に存在するシアル酸類含有オリゴ糖としては、
例えばホスビチン分子に結合したものが従来より知られ
ている［Ｓｈａｉｎｋｉｎ，Ｒ．，ａｎｄＰｅｒｌｍａ
ｎｎ，Ｇ．Ｅ．（１９７１）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１４５，６９３−７００］。しか
しながら従来法ではシアル酸含有オリゴ糖ペプチドの調
製にゲル濾過及び陰イオン交換クロマトグラフィーとい
った高価で複雑な手段を必要とし、本化合物の工業的規
模での調製は困難であった。また、鶏卵脱脂卵黄の水溶
性画分をヒドラジン分解−再アセチル化してシアル酸類
含有オリゴ糖を調製する方法についての報告［Ｋｏｋｅ
ｔｓｕ，Ｍ．，ｅｔａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｆｏｏｄ
Ｓｃｉ．５８，７４３−７４７；Ｋｏｋｅｔｓｕ，
Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）食品化工技術１３，２
０９，−２１４；Ｋｏｋｅｔｓｕ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．
（１９９３）ジャパンフードサイエンス３２，２１−２
７］及び鶏卵脱脂卵黄を直接プロテアーゼ消化すること
により水溶化させシアル酸類含有オリゴ糖を調製する方
法についての報告［Ｋｏｋｅｔｓｕ，Ｍ．，ｅｔ ａ
ｌ．（１９９３）糖質シンポジウム講演要旨集１５ｔ
ｈ，８９−９０；特願平０５−５４９６６］がなされて
いるが、前者については高価で危険な試薬を使用するた
め大量調製には不向きであり、後者については脱脂卵黄
すべてを水溶化させるため多量のプロテアーゼを必要と
し、また、シアル酸類含有オリゴ糖を持たない不溶性の
タンパク質を非特異的に加水分解し水溶化してしまうた
めそれら不溶性タンパク質を栄養剤や調味料、飼料、機
能性ペプチドの調製などへ応用することを不可能にして
いた。
ク質分子中に存在するオリゴ糖鎖、ガングリオシドに存
在するオリゴ糖鎖、及び糖タンパク質もしくはガングリ
オシドより遊離して存在するオリゴ糖ペプチドもしくは
オリゴ糖鎖などが天然に存在している。近年数多くの研
究により、シアル酸類含有オリゴ糖の生物学的意義が明
らかになりつつある。シアル酸類含有オリゴ糖は糖タン
パク質上に存在してその三次構造の規定、プロテアーゼ
に対する抵抗性の増大、血中半減期の規定、分子間相互
作用、溶解度の増大などに関与し、ガングリオシドでは
細胞間認識、細胞分化などに影響を与える構成要素とな
っている。特に、炎症反応の初期過程においてシアリル
ルイス−Ｘ抗原が重要な役割を果たすという知見、及び
シアル酸類含有オリゴ糖が様々な病原性ウイルスや毒素
のレセプターとなり得るという事実より、抗炎症作用、
抗ウイルス感染作用などを目指した医薬品及び機能性食
品への本化合物の需要が今後高まるものと考えられ、そ
の工業的規模での生産技術の確立が望まれている。鳥類
卵卵黄中に存在するシアル酸類含有オリゴ糖としては、
例えばホスビチン分子に結合したものが従来より知られ
ている［Ｓｈａｉｎｋｉｎ，Ｒ．，ａｎｄＰｅｒｌｍａ
ｎｎ，Ｇ．Ｅ．（１９７１）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１４５，６９３−７００］。しか
しながら従来法ではシアル酸含有オリゴ糖ペプチドの調
製にゲル濾過及び陰イオン交換クロマトグラフィーとい
った高価で複雑な手段を必要とし、本化合物の工業的規
模での調製は困難であった。また、鶏卵脱脂卵黄の水溶
性画分をヒドラジン分解−再アセチル化してシアル酸類
含有オリゴ糖を調製する方法についての報告［Ｋｏｋｅ
ｔｓｕ，Ｍ．，ｅｔａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｆｏｏｄ
Ｓｃｉ．５８，７４３−７４７；Ｋｏｋｅｔｓｕ，
Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）食品化工技術１３，２
０９，−２１４；Ｋｏｋｅｔｓｕ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．
（１９９３）ジャパンフードサイエンス３２，２１−２
７］及び鶏卵脱脂卵黄を直接プロテアーゼ消化すること
により水溶化させシアル酸類含有オリゴ糖を調製する方
法についての報告［Ｋｏｋｅｔｓｕ，Ｍ．，ｅｔ ａ
ｌ．（１９９３）糖質シンポジウム講演要旨集１５ｔ
ｈ，８９−９０；特願平０５−５４９６６］がなされて
いるが、前者については高価で危険な試薬を使用するた
め大量調製には不向きであり、後者については脱脂卵黄
すべてを水溶化させるため多量のプロテアーゼを必要と
し、また、シアル酸類含有オリゴ糖を持たない不溶性の
タンパク質を非特異的に加水分解し水溶化してしまうた
めそれら不溶性タンパク質を栄養剤や調味料、飼料、機
能性ペプチドの調製などへ応用することを不可能にして
いた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、糖鎖生物学
の進歩に伴い今後需要が高まるものと考えられるシアル
酸類含有オリゴ糖を鳥類卵脱脂卵黄より工業的規模で製
造する方法を提供するものである。また本発明により脱
脂卵黄の大部分を占める（重量比８０％以上）不溶性タ
ンパク質の回収が可能となる。
の進歩に伴い今後需要が高まるものと考えられるシアル
酸類含有オリゴ糖を鳥類卵脱脂卵黄より工業的規模で製
造する方法を提供するものである。また本発明により脱
脂卵黄の大部分を占める（重量比８０％以上）不溶性タ
ンパク質の回収が可能となる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明はシアル酸類含有
オリゴ糖を、鳥類卵脱脂卵黄から水もしくは塩溶液で抽
出し限外ろ過処理を行うか、もしくはさらにこのろ過液
をプロテアーゼ消化、ペプチド−Ｎ−グリカナーゼ消
化、もしくはエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダ
ーゼ消化することにより製造する方法である。そして本
発明はさらに水溶性の高いシアル酸類含有オリゴ糖画分
を水もしくは塩溶液で抽出することにより、脱脂卵黄の
主要構成成分である不溶性タンパク質を分解することな
く回収することが可能となる方法を提供するものであ
る。本発明におけるシアル酸類とは、ノイラミン酸（５
−ａｍｉｎｏ−３，５−ｄｉｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｙｃ
ｅｒｏ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏ−２−ｎｏｎｕｌｏｓｏｎ
ｉｃ ａｃｉｄ）のアシル誘導体の総称であるシアル酸
及びデアミノノイラミン酸であるＫＤＮ（２−ｋｅｔｏ
−３−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｙｃｅｒｏ−Ｄ−ｇａｌａ
ｃｔｏ−ｎｏｎｏｎｉｃ ａｃｉｄ）誘導体を指す。本
発明におけるシアル酸類含有オリゴ糖とは、シアル酸類
が１残基以上オリゴ糖鎖分子に共有結合し、かつアミノ
酸を含まない低分子性の遊離糖鎖、もしくはシアル酸類
が１残基以上オリゴ糖ペプチド分子に共有結合している
低分子性化合物である。ここで言う糖ペプチドとは、オ
リゴ糖鎖にアミノ酸が１残基以上結合した化合物を指
す。
オリゴ糖を、鳥類卵脱脂卵黄から水もしくは塩溶液で抽
出し限外ろ過処理を行うか、もしくはさらにこのろ過液
をプロテアーゼ消化、ペプチド−Ｎ−グリカナーゼ消
化、もしくはエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダ
ーゼ消化することにより製造する方法である。そして本
発明はさらに水溶性の高いシアル酸類含有オリゴ糖画分
を水もしくは塩溶液で抽出することにより、脱脂卵黄の
主要構成成分である不溶性タンパク質を分解することな
く回収することが可能となる方法を提供するものであ
る。本発明におけるシアル酸類とは、ノイラミン酸（５
−ａｍｉｎｏ−３，５−ｄｉｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｙｃ
ｅｒｏ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏ−２−ｎｏｎｕｌｏｓｏｎ
ｉｃ ａｃｉｄ）のアシル誘導体の総称であるシアル酸
及びデアミノノイラミン酸であるＫＤＮ（２−ｋｅｔｏ
−３−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｙｃｅｒｏ−Ｄ−ｇａｌａ
ｃｔｏ−ｎｏｎｏｎｉｃ ａｃｉｄ）誘導体を指す。本
発明におけるシアル酸類含有オリゴ糖とは、シアル酸類
が１残基以上オリゴ糖鎖分子に共有結合し、かつアミノ
酸を含まない低分子性の遊離糖鎖、もしくはシアル酸類
が１残基以上オリゴ糖ペプチド分子に共有結合している
低分子性化合物である。ここで言う糖ペプチドとは、オ
リゴ糖鎖にアミノ酸が１残基以上結合した化合物を指
す。
【０００５】本発明における鳥類卵卵黄とは、ニワト
リ、ウズラ、アヒル、カモなどの鳥類の卵の生卵黄、も
しくはその加工品である液状卵黄、卵黄粉末を指し、脱
脂卵黄とは鳥類卵卵黄を有機溶媒抽出（メタノール、エ
タノール、ジエチルエーテル等）することにより脱脂し
た後の残渣を指す。脱脂率については特に限定されるも
のではないが、好ましくは全固形分当たりの残存脂質量
が２０％以下であれば良い。本発明における塩溶液とは
シアロ糖タンパク質を効率良く抽出するために必要なイ
オン強度を得るためのものであり、塩としては特に限定
されるものではないが水に対して溶解度の大きいカリウ
ム塩及びナトリウム塩であれば良く、ＮａＣｌ、ＫＣｌ
が好ましい。また、ｐＨ５−９の領域内に緩衝能を持つ
塩であればいずれでも良く、特に限定されるものではな
いがＴｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＡｃＯＨ、ＡｃＯＨ
−ＡｃＯＮａなどの緩衝液が好ましい。また、塩濃度は
塩が溶け得る量であれば特に限定されるものではない
が、抽出効率の点から０．５Ｍまでの濃度が好ましい。
本発明におけるプロテアーゼとは至適ｐＨを７−８に有
するエンド型プロテアーゼであれば良く、例えばＡｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属などの産生す
るプロテアーゼ等が考えられる。具体的にはオリエンタ
ーゼＯＮＳ、９０Ｎ（阪急バイオ社製）、プロテアーゼ
Ｎ（天野製薬社製）、ＡＯプロテアーゼ（盛進製薬社
製）などの食品添加物用プロテアーゼ製剤などがあり、
また他の起源であるところのアクチナーゼＥ、キモトリ
プシン、トリプシンなどの酵素製剤なども用いることが
できる。酵素反応は卵黄抽出液を各プロテアーゼの至適
ｐＨ・温度・イオン強度に合わせて行うことで進行し特
に限定されるものではないが、好ましくはｐＨ７〜８、
３０〜５０℃、イオン強度０．１〜０．５が良い。ま
た、酵素量は酵素の種類などによって特に限定されるも
のではないが好ましくは脱脂卵黄に対し０．０３〜０．
１％（ｗ／ｗ）加えることにより効率良く製造できる。
リ、ウズラ、アヒル、カモなどの鳥類の卵の生卵黄、も
しくはその加工品である液状卵黄、卵黄粉末を指し、脱
脂卵黄とは鳥類卵卵黄を有機溶媒抽出（メタノール、エ
タノール、ジエチルエーテル等）することにより脱脂し
た後の残渣を指す。脱脂率については特に限定されるも
のではないが、好ましくは全固形分当たりの残存脂質量
が２０％以下であれば良い。本発明における塩溶液とは
シアロ糖タンパク質を効率良く抽出するために必要なイ
オン強度を得るためのものであり、塩としては特に限定
されるものではないが水に対して溶解度の大きいカリウ
ム塩及びナトリウム塩であれば良く、ＮａＣｌ、ＫＣｌ
が好ましい。また、ｐＨ５−９の領域内に緩衝能を持つ
塩であればいずれでも良く、特に限定されるものではな
いがＴｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＡｃＯＨ、ＡｃＯＨ
−ＡｃＯＮａなどの緩衝液が好ましい。また、塩濃度は
塩が溶け得る量であれば特に限定されるものではない
が、抽出効率の点から０．５Ｍまでの濃度が好ましい。
本発明におけるプロテアーゼとは至適ｐＨを７−８に有
するエンド型プロテアーゼであれば良く、例えばＡｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属などの産生す
るプロテアーゼ等が考えられる。具体的にはオリエンタ
ーゼＯＮＳ、９０Ｎ（阪急バイオ社製）、プロテアーゼ
Ｎ（天野製薬社製）、ＡＯプロテアーゼ（盛進製薬社
製）などの食品添加物用プロテアーゼ製剤などがあり、
また他の起源であるところのアクチナーゼＥ、キモトリ
プシン、トリプシンなどの酵素製剤なども用いることが
できる。酵素反応は卵黄抽出液を各プロテアーゼの至適
ｐＨ・温度・イオン強度に合わせて行うことで進行し特
に限定されるものではないが、好ましくはｐＨ７〜８、
３０〜５０℃、イオン強度０．１〜０．５が良い。ま
た、酵素量は酵素の種類などによって特に限定されるも
のではないが好ましくは脱脂卵黄に対し０．０３〜０．
１％（ｗ／ｗ）加えることにより効率良く製造できる。
【０００６】本発明におけるペプチド−Ｎ−グリカナー
ゼ（グリコペプチダーゼ及びペプチド−Ｎ−グリコシダ
ーゼと同義、以下ＰＮＧａｓｅと略す）とは図１のよう
にＮ−グリコシド型糖鎖を糖タンパク質もしくは糖ペプ
チドから遊離させる酵素であり、例としてＦｌａｖｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ由
来のＰＮＧａｓｅ Ｆ ［Ｐｌｕｍｍｅｒ，Ｔ．Ｈ．，
Ｊｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２５９，１０７００−１０７０４；Ｔａｒｅｎｔ
ｉｎｏ，Ａ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４，４６６５−４６７１］、アー
モンドエムルシン由来のＰＮＧａｓｅＡ［Ｔａｋａｈａ
ｓｈｉ，Ｎ．（１９７７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７６，１１９４−１２０
１；Ｔａｇａ，Ｅ．Ｍ．，ｅｔａｌ．（１９８４）Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３，８１５−８２２］などが
挙げられ、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダー
ゼ（以下ｅｎｄｏと略す）とは図２のようにＮ−グリコ
シド型糖鎖のジ−Ｎ−アセチルキトビオース構造を加水
分解する酵素であり、例としてＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ由来のｅｎｄｏ
Ｆ［Ｐｌｕｍｍｅｒ，Ｔ．Ｈ．，Ｊｒ．，ａｎｄ Ｔ
ａｒｅｎｔｉｎｏ，Ａ．Ｌ．（１９９１）Ｇｌｙｃｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ １，２５７−２６３］、ヒト唾液由来の
ｅｎｄｏ ＨＳ［Ｉｔｏ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（１９９
３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１６０７４−１
６０８１］などが挙げられ、特に限定されるものではな
いが、好ましくはＰＮＧａｓｅ Ｆを使用し、ｐＨ８〜
９、３０〜５０℃、１時間〜２日間の反応条件で行なう
のが好ましい。本発明における限外ろ過とは、限外ろ過
膜によって溶液中の高分子画分を除去る方法である。こ
こで使用される限外ろ過膜の分画分子量は、特に限定さ
れるものではないが、好ましくは５，０００−１００，
０００、より好ましくは５，０００−２０，０００であ
る。
ゼ（グリコペプチダーゼ及びペプチド−Ｎ−グリコシダ
ーゼと同義、以下ＰＮＧａｓｅと略す）とは図１のよう
にＮ−グリコシド型糖鎖を糖タンパク質もしくは糖ペプ
チドから遊離させる酵素であり、例としてＦｌａｖｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ由
来のＰＮＧａｓｅ Ｆ ［Ｐｌｕｍｍｅｒ，Ｔ．Ｈ．，
Ｊｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２５９，１０７００−１０７０４；Ｔａｒｅｎｔ
ｉｎｏ，Ａ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４，４６６５−４６７１］、アー
モンドエムルシン由来のＰＮＧａｓｅＡ［Ｔａｋａｈａ
ｓｈｉ，Ｎ．（１９７７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７６，１１９４−１２０
１；Ｔａｇａ，Ｅ．Ｍ．，ｅｔａｌ．（１９８４）Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３，８１５−８２２］などが
挙げられ、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダー
ゼ（以下ｅｎｄｏと略す）とは図２のようにＮ−グリコ
シド型糖鎖のジ−Ｎ−アセチルキトビオース構造を加水
分解する酵素であり、例としてＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ由来のｅｎｄｏ
Ｆ［Ｐｌｕｍｍｅｒ，Ｔ．Ｈ．，Ｊｒ．，ａｎｄ Ｔ
ａｒｅｎｔｉｎｏ，Ａ．Ｌ．（１９９１）Ｇｌｙｃｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ １，２５７−２６３］、ヒト唾液由来の
ｅｎｄｏ ＨＳ［Ｉｔｏ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（１９９
３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１６０７４−１
６０８１］などが挙げられ、特に限定されるものではな
いが、好ましくはＰＮＧａｓｅ Ｆを使用し、ｐＨ８〜
９、３０〜５０℃、１時間〜２日間の反応条件で行なう
のが好ましい。本発明における限外ろ過とは、限外ろ過
膜によって溶液中の高分子画分を除去る方法である。こ
こで使用される限外ろ過膜の分画分子量は、特に限定さ
れるものではないが、好ましくは５，０００−１００，
０００、より好ましくは５，０００−２０，０００であ
る。
【０００７】本発明のシアル酸類含有オリゴ糖は例えば
次のように製造することができる。鳥類卵脱脂卵黄に水
もしくは塩溶液を加え、４〜８０℃、好ましくは４〜４
０℃で１０分〜３日間攪拌した後濾過を行い不溶性タン
パク質と分別し、得られた抽出濾液を脱塩・濃縮し、さ
らに乾燥することによりシアル酸類含有オリゴ糖を得
る。また、上記抽出ろ液をプロテアーゼ消化することに
より高分子性糖タンパク質からシアル酸類含有オリゴ糖
を遊離させ、限外濾過により未消化の高分子性物質、酵
素分子及び低分子性のペプチド・アミノ酸・塩を除去し
て製造することもできる。さらに、上記抽出ろ液にペプ
チド−Ｎ−グリカナーゼもしくはエンド−β−Ｎ−アセ
チルグルコサミニダーゼを加え、ｐＨ５〜９、２０〜６
０℃で１時間〜３日間反応を行い、限外濾過によりシア
ル酸類含有オリゴ糖を高分子性タンパク質成分と瀘別
し、脱塩して製造することもできる。そのうえ、上記抽
出ろ液を限外ろ過処理してろ液を集め、脱塩、濃縮し、
乾燥することによりシアル酸類含有オリゴ糖を製造する
こともできる。以下実施例により本発明をさらに詳細に
説明するがこれにより限定されるもではない。
次のように製造することができる。鳥類卵脱脂卵黄に水
もしくは塩溶液を加え、４〜８０℃、好ましくは４〜４
０℃で１０分〜３日間攪拌した後濾過を行い不溶性タン
パク質と分別し、得られた抽出濾液を脱塩・濃縮し、さ
らに乾燥することによりシアル酸類含有オリゴ糖を得
る。また、上記抽出ろ液をプロテアーゼ消化することに
より高分子性糖タンパク質からシアル酸類含有オリゴ糖
を遊離させ、限外濾過により未消化の高分子性物質、酵
素分子及び低分子性のペプチド・アミノ酸・塩を除去し
て製造することもできる。さらに、上記抽出ろ液にペプ
チド−Ｎ−グリカナーゼもしくはエンド−β−Ｎ−アセ
チルグルコサミニダーゼを加え、ｐＨ５〜９、２０〜６
０℃で１時間〜３日間反応を行い、限外濾過によりシア
ル酸類含有オリゴ糖を高分子性タンパク質成分と瀘別
し、脱塩して製造することもできる。そのうえ、上記抽
出ろ液を限外ろ過処理してろ液を集め、脱塩、濃縮し、
乾燥することによりシアル酸類含有オリゴ糖を製造する
こともできる。以下実施例により本発明をさらに詳細に
説明するがこれにより限定されるもではない。
【０００８】
実施例１ 鶏卵由来脱脂卵黄１０ｇに５０ｍｌの０−１ Ｍ Ｎａ
Ｃｌを加え室温で３時間攪拌し、濾紙（Ｎｏ．２；ＡＤ
ＶＡＮＴＥＣ社製）によりろ過し、脱塩後凍結乾燥しシ
アル酸類含有オリゴ糖を得た（収量は表１参照）。生成
物中にシアル酸類含有オリゴ糖が含まれていることの確
認は、本標品をＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０及びＳｅｐｈ
ａｄｅｘＧ−２５ゲルろ過カラムにかけた後１Ｈ−ＮＭ
Ｒ測定をすることにより行った（Ｖｌｉｅｇｅｎｔｈａ
ｒｔ，Ｊ．Ｆ．Ｇ．ｅｔａｌ（１９８３）Ａｄｖ．Ｃａ
ｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１，２
０９を参照）。また、ゲルろ過カラムの結果よりシアル
酸残基はすべてシアル酸類含有オリゴ糖として存在して
いることが判明し、以後シアル酸量を定量することによ
りシアル酸類含有オリゴ糖の量を評価した。得られた生
成物の全シアル酸量をレゾルシノール法［Ｓｖｅｎｎｅ
ｒｈｏｌｍ，Ｌ．，（１９５７）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ２４，６０４−６１１］により
定量したところ表１のような結果が得られた。
Ｃｌを加え室温で３時間攪拌し、濾紙（Ｎｏ．２；ＡＤ
ＶＡＮＴＥＣ社製）によりろ過し、脱塩後凍結乾燥しシ
アル酸類含有オリゴ糖を得た（収量は表１参照）。生成
物中にシアル酸類含有オリゴ糖が含まれていることの確
認は、本標品をＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０及びＳｅｐｈ
ａｄｅｘＧ−２５ゲルろ過カラムにかけた後１Ｈ−ＮＭ
Ｒ測定をすることにより行った（Ｖｌｉｅｇｅｎｔｈａ
ｒｔ，Ｊ．Ｆ．Ｇ．ｅｔａｌ（１９８３）Ａｄｖ．Ｃａ
ｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１，２
０９を参照）。また、ゲルろ過カラムの結果よりシアル
酸残基はすべてシアル酸類含有オリゴ糖として存在して
いることが判明し、以後シアル酸量を定量することによ
りシアル酸類含有オリゴ糖の量を評価した。得られた生
成物の全シアル酸量をレゾルシノール法［Ｓｖｅｎｎｅ
ｒｈｏｌｍ，Ｌ．，（１９５７）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ２４，６０４−６１１］により
定量したところ表１のような結果が得られた。
【０００９】
【表１】
【００１０】実施例２ 鶏卵由来脱脂卵黄１００ｋｇを５００Ｌの０．２ Ｍ
ＮａＣｌに懸濁し、室温で３時間攪拌した。濾過した後
４℃で２日間静置して微量の不溶物を落とし、得られた
上清を分画分子量２万以下の膜を用い限外濾過した。濾
過液をさらに逆浸透膜（ＲＯ膜）により脱塩し、スプレ
ードライにより乾燥したところ９．５ｋｇのシアル酸類
含有オリゴ糖を得た。シアル酸含量はレゾルシノール法
により１５％（ｗ／ｗ）と算出された。また、０．２
Ｍ ＮａＣｌ抽出で生じた残渣を水で洗浄後凍結乾燥し
たところ８３ｋｇの不溶性タンパク質標品を回収でき
た。 実施例３ 実施例２で得られる４℃、２日間静置後の上清（脱脂卵
黄１００ｋｇ由来）を分画分子量５，０００以下の膜を
用い限外ろ過した。ろ過液を脱塩、乾燥させたところ
３．９ｋｇのシアル酸類含有オリゴ糖を得た。シアル酸
含量はレゾルシノール法により１９％（ｗ／ｗ）と算出
された。 実施例４ 実施例２で得られる４℃、２日間静置後の上清（脱脂卵
黄１００ｋｇ由来）に０．１ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩
衝液を加えｐＨを７．５に合わせ、３０ｇのオリエンタ
ーゼＯＮＳ（阪急バイオ）を加え５０℃、１６時間消化
を行った。酵素消化液を実施例１と同様に限外濾過・脱
塩し乾燥したところ１５．０ｋｇのシアル酸類含有オリ
ゴ糖を得た。シアル酸含量はレゾルシノール法により１
１％（ｗ／ｗ）と算出された。
ＮａＣｌに懸濁し、室温で３時間攪拌した。濾過した後
４℃で２日間静置して微量の不溶物を落とし、得られた
上清を分画分子量２万以下の膜を用い限外濾過した。濾
過液をさらに逆浸透膜（ＲＯ膜）により脱塩し、スプレ
ードライにより乾燥したところ９．５ｋｇのシアル酸類
含有オリゴ糖を得た。シアル酸含量はレゾルシノール法
により１５％（ｗ／ｗ）と算出された。また、０．２
Ｍ ＮａＣｌ抽出で生じた残渣を水で洗浄後凍結乾燥し
たところ８３ｋｇの不溶性タンパク質標品を回収でき
た。 実施例３ 実施例２で得られる４℃、２日間静置後の上清（脱脂卵
黄１００ｋｇ由来）を分画分子量５，０００以下の膜を
用い限外ろ過した。ろ過液を脱塩、乾燥させたところ
３．９ｋｇのシアル酸類含有オリゴ糖を得た。シアル酸
含量はレゾルシノール法により１９％（ｗ／ｗ）と算出
された。 実施例４ 実施例２で得られる４℃、２日間静置後の上清（脱脂卵
黄１００ｋｇ由来）に０．１ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩
衝液を加えｐＨを７．５に合わせ、３０ｇのオリエンタ
ーゼＯＮＳ（阪急バイオ）を加え５０℃、１６時間消化
を行った。酵素消化液を実施例１と同様に限外濾過・脱
塩し乾燥したところ１５．０ｋｇのシアル酸類含有オリ
ゴ糖を得た。シアル酸含量はレゾルシノール法により１
１％（ｗ／ｗ）と算出された。
【００１１】実施例５ 実施例２で得られる４℃、２日間静置後の上清（脱脂卵
黄１ｋｇ由来）に５Ｌの０．２５ Ｍ リン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ８．５）及びＰＮＧａｓｅ Ｆ５０ Ｕ
を加え３７℃で２４ｈインキュベートした後分画分子量
１万以下の膜を用いて限外濾過した。濾過液を逆浸透膜
により脱塩し、凍結乾燥したところ５０ｇのシアル酸類
含有オリゴ糖を得た。シアル酸含量はレゾルシノール法
により１９％（ｗ／ｗ）と算出された。
黄１ｋｇ由来）に５Ｌの０．２５ Ｍ リン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ８．５）及びＰＮＧａｓｅ Ｆ５０ Ｕ
を加え３７℃で２４ｈインキュベートした後分画分子量
１万以下の膜を用いて限外濾過した。濾過液を逆浸透膜
により脱塩し、凍結乾燥したところ５０ｇのシアル酸類
含有オリゴ糖を得た。シアル酸含量はレゾルシノール法
により１９％（ｗ／ｗ）と算出された。
【００１２】比較例 上記実施例２−５における、使用した鶏卵脱脂卵黄量
（ｋｇ）、使用したプロテアーゼ量（ｋｇ）、１ｋｇシ
アル酸類含有オリゴ糖を得るのに必要なプロテアーゼ量
（ｋｇ）、シアル酸類含有オリゴ糖収量（ｋｇ）、生成
物のシアル酸含量（％）を特願平０５−５４９６６にお
ける数値と比較したところ、表２のようになった。
（ｋｇ）、使用したプロテアーゼ量（ｋｇ）、１ｋｇシ
アル酸類含有オリゴ糖を得るのに必要なプロテアーゼ量
（ｋｇ）、シアル酸類含有オリゴ糖収量（ｋｇ）、生成
物のシアル酸含量（％）を特願平０５−５４９６６にお
ける数値と比較したところ、表２のようになった。
【００１３】
【表２】
【００１４】特願平０５−５４９６６では脱脂卵黄をそ
のままプロテアーゼ消化するため多量の酵素を必要とす
るが、本発明の方法により、生成物のシアル酸含量は高
くなり（すなわちシアル酸類含有オリゴ糖含量は高くな
り）、プロテアーゼの使用量を約１／９に減らすことが
できた。これらの効果は、本発明の根幹である、シアル
酸含有オリゴ糖の供給源として脱脂卵黄の水溶性画分の
みに着目しているという点に依存するものである。ま
た、本発明においては実施例２におけるように脱脂卵黄
の主要成分である不溶性タンパク質を上記の点により分
解することなしに高収率で回収することができた。本発
明の実施態様ならびに目的生成物を挙げれば以下のとお
りである。 １ シアル酸類含有オリゴ糖を、鳥類卵脱脂卵黄から塩
溶液で抽出することにより製造する方法。 ２ シアル酸類含有オリゴ糖を、鳥類卵脱脂卵黄から塩
溶液で抽出して得られる溶液を、限外ろ過することによ
り製造する方法。 ３ シアル酸類含有オリゴ糖を、鳥類卵脱脂卵黄から塩
溶液で脱脂して得られる溶液を酵素消化し、さらに限外
ろ過することにより製造する方法。 ４ シアル酸類含有オリゴ糖を、鳥類卵脱脂卵黄から塩
溶液で抽出して得られる溶液をプロテアーゼ消化し、さ
らに限外ろ過することにより製造する方法。 ５ シアル酸類含有オリゴ糖を、鳥類卵脱脂卵黄もしく
は鳥類卵脱脂卵黄から塩溶液で抽出して得られる溶液
を、ペプチド−Ｎ−グリカナーゼもしくはエンド−β−
Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化し、さらに限外ろ
過することにより製造する方法。 ６ 鳥類卵脱脂卵黄からシアル酸類含有オリゴ糖を塩溶
液で抽出した際生じる残渣（不溶性タンパク質）を回収
する方法。
のままプロテアーゼ消化するため多量の酵素を必要とす
るが、本発明の方法により、生成物のシアル酸含量は高
くなり（すなわちシアル酸類含有オリゴ糖含量は高くな
り）、プロテアーゼの使用量を約１／９に減らすことが
できた。これらの効果は、本発明の根幹である、シアル
酸含有オリゴ糖の供給源として脱脂卵黄の水溶性画分の
みに着目しているという点に依存するものである。ま
た、本発明においては実施例２におけるように脱脂卵黄
の主要成分である不溶性タンパク質を上記の点により分
解することなしに高収率で回収することができた。本発
明の実施態様ならびに目的生成物を挙げれば以下のとお
りである。 １ シアル酸類含有オリゴ糖を、鳥類卵脱脂卵黄から塩
溶液で抽出することにより製造する方法。 ２ シアル酸類含有オリゴ糖を、鳥類卵脱脂卵黄から塩
溶液で抽出して得られる溶液を、限外ろ過することによ
り製造する方法。 ３ シアル酸類含有オリゴ糖を、鳥類卵脱脂卵黄から塩
溶液で脱脂して得られる溶液を酵素消化し、さらに限外
ろ過することにより製造する方法。 ４ シアル酸類含有オリゴ糖を、鳥類卵脱脂卵黄から塩
溶液で抽出して得られる溶液をプロテアーゼ消化し、さ
らに限外ろ過することにより製造する方法。 ５ シアル酸類含有オリゴ糖を、鳥類卵脱脂卵黄もしく
は鳥類卵脱脂卵黄から塩溶液で抽出して得られる溶液
を、ペプチド−Ｎ−グリカナーゼもしくはエンド−β−
Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化し、さらに限外ろ
過することにより製造する方法。 ６ 鳥類卵脱脂卵黄からシアル酸類含有オリゴ糖を塩溶
液で抽出した際生じる残渣（不溶性タンパク質）を回収
する方法。
【００１５】
【発明の効果】以上のように本発明により、鳥類卵脱脂
卵黄からシアル酸類含有オリゴ糖を工業的規模で安価・
簡便に製造することができる。本標品は医薬品素材、機
能性食品素材、及び学術研究用試薬として需要が高まり
つつあり、産業界にとって極めて有益である。また、脱
脂卵黄の大部分を占める成分である不溶性タンパク質を
未修飾の状態で回収することができ、不溶性タンパク質
標品を栄養剤、調味料、飼料、機能性ペプチドなどの分
野へ応用することが可能となった。すなわち本発明は脱
脂卵黄を多角的に利用する方法の一つとして位置付けら
れ得るものである。
卵黄からシアル酸類含有オリゴ糖を工業的規模で安価・
簡便に製造することができる。本標品は医薬品素材、機
能性食品素材、及び学術研究用試薬として需要が高まり
つつあり、産業界にとって極めて有益である。また、脱
脂卵黄の大部分を占める成分である不溶性タンパク質を
未修飾の状態で回収することができ、不溶性タンパク質
標品を栄養剤、調味料、飼料、機能性ペプチドなどの分
野へ応用することが可能となった。すなわち本発明は脱
脂卵黄を多角的に利用する方法の一つとして位置付けら
れ得るものである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年１月３０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】追加
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ペプチド−Ｎ−グリカナーゼによるＮ−グリ
コシド型糖鎖の遊離の図である。
コシド型糖鎖の遊離の図である。
【図２】 エンド−β−Ｎ−アセチルグリコサミニダー
ゼによるＮ−グリコシド型糖鎖のジ−Ｎ−アセチルキト
ビオース構造の加水分解の図である。
ゼによるＮ−グリコシド型糖鎖のジ−Ｎ−アセチルキト
ビオース構造の加水分解の図である。
Claims (6)
- 【請求項１】 シアル酸類含有オリゴ糖を、鳥類卵脱脂
卵黄から水もしくは塩溶液で抽出することにより製造す
る方法。 - 【請求項２】 シアル酸類含有オリゴ糖を、鳥類卵脱脂
卵黄から水もしくは塩溶液で抽出して得られる溶液を、
限外ろ過することにより製造する方法。 - 【請求項３】 シアル酸類含有オリゴ糖を、鳥類卵脱脂
卵黄から水もしくは塩溶液で抽出して得られる溶液を酵
素消化することにより製造する方法。 - 【請求項４】 シアル酸類含有オリゴ糖を、鳥類卵脱脂
卵黄から水もしくは塩溶液で抽出して得られる溶液をプ
ロテアーゼ消化することにより製造する方法。 - 【請求項５】 プロテアーゼが、アクチナーゼＥ、キモ
トリプシン、トリプシン、サーモリシンなどのエンド型
プロテアーゼから選ばれる１種または２種以上である請
求項４記載の製造方法。 - 【請求項６】 シアル酸類含有オリゴ糖を、鳥類卵脱脂
卵黄もしくは鳥類卵脱脂卵黄から水もしくは塩溶液で抽
出して得られる溶液を、ペプチド−Ｎ−グリカナーゼも
しくはエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消
化することにより製造する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6274184A JPH0899988A (ja) | 1994-09-29 | 1994-09-29 | シアル酸類含有オリゴ糖の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6274184A JPH0899988A (ja) | 1994-09-29 | 1994-09-29 | シアル酸類含有オリゴ糖の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0899988A true JPH0899988A (ja) | 1996-04-16 |
Family
ID=17538214
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6274184A Pending JPH0899988A (ja) | 1994-09-29 | 1994-09-29 | シアル酸類含有オリゴ糖の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0899988A (ja) |
Cited By (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08266255A (ja) * | 1995-03-30 | 1996-10-15 | Taiyo Kagaku Co Ltd | 学習能力向上組成物 |
| WO1997035595A1 (en) * | 1996-03-26 | 1997-10-02 | Dcv Biologics L.P. | Egg anti-inflammatory composition, method of isolation and use |
| JPH10279595A (ja) * | 1997-04-02 | 1998-10-20 | Taiyo Kagaku Co Ltd | 卵黄低分子ペプチド |
| KR20020031266A (ko) * | 2000-10-23 | 2002-05-01 | 황재관 | 계란 알끈의 시알릴올리고당과 펩타이드 및 그 생산방법 |
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-
1994
- 1994-09-29 JP JP6274184A patent/JPH0899988A/ja active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
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| A521 | Written amendment |
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| A02 | Decision of refusal |
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