KR100353396B1 - 시알산이결합된폴리펩타이드혼합물 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 시알산 당단백질이 풍부한 생체물질로부터 특정 프로테아제들 또는 이들의 조합으로 시알산 당단백질을 가수분해하여 시알산 결합 폴리펩티드 혼합물을 제공하고자 하는 것이다. 또한 본 발명은, 상기와 같은 가수분해 단계 후 수용성 분획에 대하여 한외 여과(Ultra filtration)막을 사용하여 분자량 조절, 농축 및 탈염공정을 통하여 시알산 함량이 높은 시알산 결합 폴리펩티드 혼합물을 제공하고자 하는 것이다.

이러한 시알산 당단백질을 가수분해하는 효소로는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 호알칼리 엔도프로테아제(endo-protease), 아스퍼질러스 오리제(Asp, oryzae) 유래의 엑소프로테아제(exo-protease), 바실러스(Bacillus)계 균주 유래의 약알칼리 엔도프로테아제를 사용하였다.

결과적으로 본 발명에 의해 제조공정, 비용 및 가격측면에서 경제적으로 시알산을 공급할 수 있는 시알산 결합 폴리펩티드 혼합물을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 시알산 결합 폴리펩티드 혼합물은 생체내 흡수가 용이하고 부작용이 작은 것이므로, 시알산을 제공하는 기능성 식품 또는 의약품 소재를 준비하는데 사용될 수 있다.

Description

시알산이 결합된 폴리펩타이드 혼합물

본 발명은 시알산이 결합된 폴리펩타이드 혼합물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 시알산이 결합된 당단백질을 일정한 프로테아제로 가수분해하여 얻은, 식품 또는 의약품 소재로 적절한 시알산 결합 폴리펩타이드 혼합물에 관한 것이다.

세포막(cell membrane)은 비대칭적인 이중막으로서, 한쪽막은 세포질과 접하며, 다른 한쪽막은 세포 표면에 노출되어 있다. 특히, 세포막의 세포 표면은 세포의 성장과 분화를 위한 신호들이 전달되는 곳이고, 세포들간의 상호인식이 일어나는 곳이기 때문에, 암의 발생이나 전이에 매우 중요한 역할을 한다. 또한, 바이러스들의 침입에 의한 외부 항원을 인식하는 부분도 세포 표면에 있으며, 선택적인 약물 전달을 위한 열쇠도 세포 표면에 있다.

한편, 세포막은 당(sugar)을 함유하는 당지질(glycolipid) 및 당단백질(glycoprotein)을 포함하고 있다. 더욱이, 당 그룹들(sugar groups)은 주로 세포표면에 노출되어 있어서, 세포가 그 주위환경들과 상호작용하는데 참여하고 있다. 특히, 세포표면에 있는 당 그룹들은 음전하를 띠는 시알산 잔기로 끝나는 경우가 많다. 이러한 시알산 및 시알산 당단백질을 자세히 살펴보면, 다음과 같다.

시알산은 블릭스(Blix) 등에 의해 1936년 소의 하악선 뮤신(mucin)에서 처음으로 분리되었다. 이러한 시알산은 뉴라민산(Neuraminic acid)의 총칭으로 자연계에서는 약 30종 이상의 유도체가 존재한다고 알려져 있으며, 이 중 엔-아세틸뉴라민산(N-Acetylneuraminic acid: NANA 또는 Neu5Ac)이 대표적인 시알산이다. 시알산은 구탄당계의 산성당으로 일부의 대사과정을 제외하고는 자연계에서 유리상태로 존재하지 않으며, 동물의 장기, 조직, 혈액, 점액, 유즙 등의 올리고당, 다당, 당단백질, 당지질의 구성성분으로 널리 존재하며, 식물체에서는 발견되지 않았으나, 미생물계에서는 비교적 널리 분포되어 있다고 한다.

시알산은 세포막의 세포 표면에 있는 당단백질 또는 당지질의 구성성분으로 말단에 위치하므로서 다양한 생물학적인 기능을 발휘하는데, 최근의 활발한 연구로 인하여 여러 가지 생리적 기능이 해명되고 있다.

예를들면, 시알산은 포유동물의 생체내에서 프락토즈-6-포스페이트(Fructose-6-phosphate)로 부터 엔-아세틸만노즈아민(N-acetylamannoseamine)을 경유하여 합성된다. 이러한 시알산은 뇌의 강글리오사이드(ganglioside)나 당단백질의 구성성분으로, 뇌나 중추신경계에 특히 많이 함유되어 있으며 그 양이 유아기에 급격히 증가하기 때문에, 시알산은 이러한 조직의 기능발현이나 발달에 중요한 역할을 하는 것으로 생각되어진다[S. E. Carlson: Am. J. Clin. Neut.,41. 720-729(1985)]. 그러나, 신생아의 경우 엔-아세틸만노즈아민을 합성하는 UDP-N-아세틸클루코스아민-2'-에피머레이즈의 활성이 약하다는 것이 동물실험을 통해 밝혀졌다. 따라서, 외부로부터 공급되는 시알산은영아의 두뇌발달에 도움을 줄 수 있을 것이다.

또한, 바이러스나 세균 등의 감염은 점막 상피세포에 있는 당그룹에 바이러스나 세균이 결합함으로써 시작되는데, 병원성 대장균이나 콜레라균이 생산하는 독소는 소화관 상피세포에 시알산을 함유하는 당그룹에 결합하여 설사를 일으킨다. 그러나, 모유의 시알산함유성분은 유아의 구강, 식도, 소화관에 병원체(바이러스 세균, 세균독소)가 상피세포에 부착하는 것을 길항적으로 저해하여 감염이나 설사 등을 방지할 수 있다[S. Fukuta et al. : Infect. Immun.,56,1748-1753(1988)].

한편, 시알산 결합 올리고당은 락토바실러스(lactobacillus), 비피더스(bifidus)와 같은 유용한 장내 유산균의 생육인자의 하나로, 특히 신생아에 있어서 정장작용에 도움을 준다고 알려지고 있다. 또한 시알산은 임신중 태아와 모체사이의 거부반응을 방지하여 유산이나 사산을 예방할 수 있으며, 신경 세포막의 구성성분으로 신경전달시 조절작용을 한다. 또한, 점액단백질(mucoprotein)의 불가결한 성분으로 인플루엔자 바이러스(influenza virus)의 용혈작용을 저지하는 등 다양한 역할이 밝혀지고 있으며, 이 외에 항암제의 개발, 독소성분의 중화작용, 항염증작용 등의 기능이 보고되고 있다.

상기에서 언급한 바와 같이 시알산 및 시알산 당단백질은 생체내에서 중요한 역할을 하며 우수한 생리적 기능을 가지고 있으므로, 상기와 같은 기능을 하는 시알산 당단백질을 제공 및 제어하기 위해, 종래에는 생체물질로부터 특정한 시알산 당단백질 자체를 정제하거나, 특정한 시알산 당단백질의 유도체를 제조하는 방법에 관한 것이 주를 이루었다. 그러나, 상기 정제 및 제조방법은 복잡한 공정을 통한것으로 비용 및 시간이 많이 소비될 뿐만 아니라, 특정한 시알산 당단백질을 제공하는 것이므로, 단순히 시알산을 생체내 제공하는데는 비용 및 시간에 있어서 수지가 맞지 아니하며, 시알산 자체를 유기화학적으로 제조하는 것 또한 비용이 고가인 문제점이 있어 왔다.

따라서, 상기와 같은 문제점을 극복하고자 본 발명은, 시알산 당단백질이 풍부한 생체물질로부터 특정한 프로테아제로 시알산 당단백질을 가수분해하여 시알산 결합 폴리펩티드 혼합물을 제공하고자 하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 상기와 같은 가수분해 단계 후 수용성 분획에 대하여 한외 여과(Ultra filtration)막을 사용하여 분자량 조절, 농축 및 탈염공정을 통하여 시알산 함량이 높은 시알산 결합 폴리펩티드 혼합물을 제공하고자 하는 것이다.

상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 시알산 당단백질을 호알 칼리성 엔도프로테아제로 처리하여 단편화하는 제1 엔도 가수분해 단계; 상기 제 1 엔도 가수분해로 형성된 펩티드들을 약알칼리성 엔도프로테아제로 처리하는 제2 엔도 가수분해 단계; 상기 제2 엔도 가수분해로 형성된 펩티드들을 엑소프로테아제로 처리하는 엑소 가수분해 단계; 및 상기 엔도 및 엑소 가수분해를 거쳐 형성된 펩티드들을 2,000 내지 5,000달톤의 한외 여과막을 사용하여 여과하는 선별 단계를 포함하는 방법으로 제조된 것을 특징으로 한다.

이하에서는 시알산 결합 폴리펩티드를 제조할 수 있는 프로테아제 및 본 발명에 의한 시알산 결합 폴리펩티드 혼합물의 제조방법을 상세히 설명하고자 한다.

본 발명자는 실험을 통해 기존에 정제된 효소들 중 특정 프로테아제가 시알산 당단백질 가수분해 활성을 갖고 있다는 것을 발견하였다. 이러한 효소들로는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 호알칼리 엔도프로테아제(endo-protease), 아스퍼질러스 오리제(Asp, oryzae) 유래의 엑소프로테아제(exo-protease), 바실러스(Bacillus)계 균주 유래의 약알칼리 엔도프로테아제들이 있었다.

따라서, 본 발명자는 이러한 효소들로 시알산 당단백질을 가수분해하므로서, 시알산 당단백질의 N 말단쪽 단백질 부분을 제거하여, 천연의 시알산 당단백질에 비해서 시알산 함유 올리고당이 차지하는 비율이 상대적으로 큰 시알산 결합 폴리펩티드 혼합물을 제공하고자 한다. 이러한 시알산 결합 폴리펩티드는 생체내 적용에 유리하도록 수용성이 크며 알레르기(allergy)와 같은 부작용이 작다.

더욱 자세하게 살펴보면, 본 발명에서 사용된 시알산 당단백질을 가수분해하는 효소로는 다음과 같은 것이 있다.

바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 호알칼리 엔도프로테아제 (endo-protease)로는 프로레테(Proleather; Amano사), 오리엔타제(Orientase; Hankyu사), 사비나제(Sabinase; Novo사) 등을 사용하였다.

또한, 아스퍼질러스 오리제(Asp, oryzae) 유래의 엑소프로테아제(exo-protease)로는 프로테아제 A(Protease A; Amano사), 프로테아제 M (Protease M; Amano사), 플라보자임(Flavourzyme; Novo Nordisk 사) 등을 사용하였다.

또한, 바실러스(Bacillus)계 균주 유래의 약알칼리 엔도프로테아제로는 페스칼라제(Pescalase; gist-brocades사), 서모아제(Thermoase; Daiwa Kasei사), 프로테아제 N(Protease N; Amano사) 등을 사용하였다.

이러한 효소들이 시알산 당단백질을 가수분해하여, 시알산 당단백질로부터 일부 단백질부분을 제거하여 시알산의 함량이 높아지는 것을 보여주는 실험은 다음과 같다.

[실험 1]

60℃, pH 10.0에서 12시간동안, 지방성분을 제거한 탈지난황을 하기와 같은 바실러스 서브틸리스 유래의 호알칼리 엔도프로테아제로 가수분해한 후, 여과하여, 여과액에서의 시알산 함량을 페리오데이트-TBA(periodate-TBA; Warren 등 J. Biol. Chem., 1959,234, p1971)을 사용하여 측정하였다. 즉, 시알산을 정량하기 위해 우선 시료를 묽은 황산으로 가수분해하여 당과 결합되어 있는 시알산을 유리시켰다. 여기에 페리오데이트(periodate) 시약을 첨가하여 유리 시알산을 산화시키며, 이것에 다시 TBA시약을 첨가하여 발색단(chromophore)을 생성시킨 후 분광측정기(spectrophotometer)를 이용하여 발색된 시알산을 정량하였다. 기타의 분석은 공지의 방법으로 행하였다.

탈지난황은 약 0.2%(탈지난황의 건조중량 대비)의 시알산을 함유하고 있으며, 탈지난황을 하기와 같은 바실러스 서브틸리스 유래의 호알칼리 엔도프로테아제로 가수분해한 후 여과액의 시알산 함량(여과액의 건조중량 대비)을 표 1에 표시하였다.

이와 같이 바실러스 서브틸리스 유래의 호알칼리 엔도프로테아제로 탈지난황을 가수분해하면, 시알산의 함량이 0.2%에서 상기 표 1에 표시된 함량으로 정제됨을 알 수 있다.

[실험 2]

55℃, pH7.0에서 12시간동안 탈지난황을 아스퍼질러스 오리제(Asp. oryzae)유래의 엑소프로테아제로 가수분해한 후 여과하였다. 여과액에서의 시알산 함량을 periodate-TBA를 사용하여 측정하였다. 여과액 중 시알산 함량(여과액의 건조중량대비)은 표 2에 나타나 있다.

이와 같이 아스퍼질러스 오리제 유래의 엑소프로테아제로 탈지난황을 가수분해하면, 시알산의 함량이 0.2%에서 상기 표 2에 표시된 함량으로 정제됨을 알 수 있다.

[실험 3]

55℃, pH8.0에서 12시간동안 탈지난황을 하기와 같은 바실러스계 균주 유래의 약알칼리 엔도프로테아제로 가수분해한 후 여과하였다. 여과액에서의 시알산 함량을 periodate-TBA을 사용하여 측정하였다. 여과액 중 시알산 함량(여과액의 건조중량대비)은 표 3에 나타나 있다.

이와 같이 바실러스계 균주 유래의 약알칼리 엑소프로테아제로 난황을 가수분해하면, 시알산의 함량이 0.2%에서 상기 표 3에 표시된 함량으로 정제됨을 알 수 있다.

상기와 같은 실험결과에 의해 본 발명자는 바실러스 서브틸리스 유래의 호알칼리 엔도프로테아제, 아스퍼질러스 오리제(Asp. oryzae)유래의 엑소프로테아제, 또는 바실러스(Bacillus)계 균주 유래의 약알칼리 엔도프로테아제로 시알산 당단백질을 가수분해하여 시알산을 정제하고자 한다. 게다가, 상기 3종류의 효소들을 일정 순서로 적절히 조합하여, 시알산의 수율이 높으며 시알산을 식품 또는 의료용 소재로 적절하게 적용할 수 있는 시알산 결합 폴리펩티드 혼합물을 제공하고자 한다.

이에 대하여 자세히 살펴보면 다음과 같다.

난황(Egg Yolk)은 우수한 영양학적 발란스뿐만아니라 여러 가지 필수영양소를 가지고 있는 뛰어난 식품이다. 한편, 시알산은 생체내 미량 성분이지만, 난황은 인체내 모유를 제외한 단백질 원료중 가장 많은 양을 함유하고 있다. 따라서, 난황의 우수한 안전성, 영양성, 싼 가격 및 풍부한 공급량을 고려할 때, 난황으로부터 시알산이 결합된 폴리펩티드를 생산하는 것이 산업적으로 가장 유리할 것이므로, 본 발명자는 시알산 결합 폴리펩티드를 준비하고자 하는 생체물질로서 난황을 선택하였다.

한편, 난황중에는 약 30%정도의 지방질이 포함되어 있기 때문에 이를 제조에 바로 사용할 경우에는 제조공정 중 유화로 인한 여과, 분리 등에 큰 문제점이 될 수 있다. 따라서, 난황을 1차적으로 유기용매(에탄올, 핵산 등)를 이용하여 지방성분을 추출, 제거하여 이렇게 얻어진 탈지난황을 출발물질로 사용하였다. 탈지난황중에는 시알산이 약 0.2%(건조중량 대비)정도 함유되어 있다.

탈지난황에 물을 가하여 고형분 함량이 5∼20중량%, 바람직하게는 10∼15중량%의 현탄액을 만든 후, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘 등의 알칼리 용액을 사용하여 pH를 9∼11로 조정한 후, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 호알칼리 엔도프로테아제, 예를들면, 프로레테(Proleather), 오리엔타제(Orientase), 사비나제(Sabinase)등을 탈지 난황 중 조단백함량의 0.1%∼2.0% 첨가하여 30분∼24시간동안 1차 가수분해하였다.

상기 엔도프로테아제는 시알산 당단백질의 단백질부분을 무작위적인 크기로 분해하여 다양한 길이의 시알산 결합 폴리펩티드 혼합물을 만들어 낸다.

1차 가수분해가 종료된 후 염산 등을 이용하여 2차 사용효소의 최적 반응 pH를 중성 또는 산성으로 조절한 후 아스퍼질러스 오리제(Asp, oryzae) 유래의 엑소 프로테아제(exo-protease), 예를들면 프로테아제 A(Protease A), 프로테아제 M(Protease M), 플라보자임(Flavourzyme) 등을 이용하여 상기 1차 가수분해와 같이 2차로 가수분해를 실시하였다.

1차 가수분해시 단백질 분자 내부에 있었던 소수성아미노산이 가수분해물 말단에 노출되어 쓴맛을 나타낼 수 있다. 따라서, 2차로 엑소프로테아제를 사용하여 말단의 소수성 아미노산을 절단, 제거하면 쓴맛으로 인한 식품소재 적용성 저하를 방지할 수 있으며, 단백질 부분의 분자량을 감소시켜 인체내 외래 단백질에 의한 알레르기를 줄일 수 있다.

한편, pH 조절을 위해 과다한 염산 등의 투입으로 야기되는 염의 생성을 방지하기 위하여 상기 1차 가수분해 후 별도의 pH 조절없이 바실러스(Bacillus)계 균주 유래의 약알칼리 엔도프로테아제, 예를들면 페스칼라제(Pescalase), 서모아제(Thermoase), 프로테아제 N(Protease N) 등을 사용하여 상기 엑소프로테아제에 의한 2차 가수분해 전에 추가로 가수분해를 실시하면, 최종적으로 pH 조절없이 엑소프로테아제에 의한 가수분해를 실시할 수 있다.

가수분해시 pH 및 온도 등의 조건은 각 효소들의 최적조건에서 행하는 것이 바람직하다.

가수분해가 종료되면 열처리에 의한 효소 실활후 규조토 등의 여과보조제를 사용하여 불용성 고형분을 제거하여 수용성 가수분해액을 취하였다. 그리고나서, 평균 분자량 2,000∼5,000 Dalton의 한외 여과막을 사용하여 저분자분획(permeate)을 제거하고, 농축한 후 농축액(retentate)에 물을 가하여 탈염을 실시하였다.

난황으로부터 유래된 시알산 당단백질의 최소 분자량이 약 2,000 Dalton으로 알려져 있으며, 시알산 및 이를 포함한 올리고당의 분자량이 대략 2,000 Dalton이다. 따라서, 2,000 Dalton 이하의 여과막을 사용할 경우에는 여과시간이 길어져 작업효율 및 오염의 위험성이 있고, 5,000 Dalton이상의 여과막을 사용할 경우는 원하는 제품이 막을 통과하여 손실의 위험성이 크다.

탈염이 종료된 후 농축액은 분무건조 또는 동결건조하여 최종제품 분말을 얻었다.

이하에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하고자 한다.

[실시예 1]

건조 난황 분말 2톤에 에탄올 12톤을 가하여 교반한 후 Nutch filter를 이용하여 고형분 탈지 난황 800㎏을 얻었다. 탈지 난황 800㎏에 물 4톤을 가하고 교반하면서 60℃까지 승온시켰다. 수산화 나트륨을 사용하여 반응액의 pH를 10.5로 조절한 후 프로레테(Proleather) 10㎏을 첨가하고 8시간 반응시켰다. 1차 가수분해 후 염산을 이용하여 pH를 7.0으로 조절한 뒤 플라보자임(Flavourzyme) 5㎏을 첨가하고 20시간 동안 반응시켰다. 2차 가수분해후 반응액을 90℃까지 승온시킨 후 10분간 열처리하여 효소를 실활시켰다. 반응액은 규조토 120㎏을 사용하여 필터 프레스(filter press)로 불용성 고형분을 제거하고 약 3.2톤의 수용성 여과액을 얻었다. 여과액은 평균 분자량 5,000 Dalton의 한외 여과막(Millipore사)을 사용하여저분자물질을 제거하고 약 1톤의 농축액을 얻었다. 여기에 물을 가하여 탈염을 시작하고 전기전도도가 2,000 uS이하가 되면 가수를 중단했다. 이 액을 분무 건조하여 건조 감량 4.8%, 조단백 함량 65%, 시알산 함량 2.2%의 분말 42㎏을 얻었다.

[실시예 2]

실시예 1에서 얻은 탈지난황 800㎏에 물 4톤을 가하고 55℃로 승온한 후 pH를 9.5로 조절하였다. 1차 가수분해 효소로 오리엔타제(Orientase) 8㎏을 가한 후 10시간동안 반응시켰다. 2차가수분해를 위해 pH를 4.5로 조절한 후 프로테아제 M(Protease M) 8㎏을 첨가하고 16시간동안 반응시켰다. 효소실활 후 불용성 분획을 제거하고 2,000 Dalton의 한외 여과막(AMT사)을 사용하여 실시예 1과 같이, 농축, 탈염 후 동결 건조하여 건조 감량 2.3%, 조단백 함량 68%, 시알산 함량 2.5%의 분말 51㎏을 얻었다.

[실시예 3]

실시예 1과 같은 탈지난황 800㎏에 물 4톤을 가하고 55℃로 승온한 뒤 pH를 9.8로 조절하고 오리엔타제(Orientase)를 5㎏ 첨가한 후 4시간동안 반응시켰다. 1차 효소반응 후 별도의 pH 조절없이 프로테아제 N(Protease N)을 5㎏ 첨가하여 8시간 반응시켰다. 2차 효소반응후 최종적으로 pH조절없이 플라보자임(Flavourzyme) 10㎏을 첨가하여 18시간 동안 반응시켰다. 효소실활후 여과액은 실시예 2와 같이 2,000 Dalton 한외 여과막을 사용하여 농축, 탈염 후 분무 건조하여 건조감량 5.1%, 조단백 함량 72%, 시알산 함량 2.4%의 분말 48㎏을 얻었다.

본 발명은, 시알산 당단백질이 풍부한 생체물질로부터 특정 프로테아제를 또는 이들의 조합으로 시알산 당단백질을 가수분해하여 시알산 결합 폴리펩티드 혼합물을 제공하고자 하는 것이다. 또한 본 발명은, 상기와 같은 가수분해 단계 후 수용성 분획에 대하여 한외 여과(Ultra filtration)막을 사용하여 분자량 조절, 농축 및 탈염공정을 통하여 시알산 함량이 높은 시알산 결합 폴리펩티드 혼합물을 제공하고자 하는 것이다.

따라서, 본 발명에 의해 제조공정, 비용 및 가격면에서 경제적으로 시알산을 공급할 수 있는 시알산 결합 폴리펩티드 혼합물을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 시알산 결합 폴리펩티드 혼합물은 생체내 흡수가 용이하고 부작용이 작은 것이므로, 시알산을 제공하는 기능성 식품 또는 의약품 소재를 준비하는데 사용될 수 있다.

Claims (5)

1. 탈지 난황을 호알칼리성 엔도프로테아제로 처리하여 단편화하는 제1 엔도 가수분해 단계;

   상기 제 1 엔도 가수분해로 형성된 펩티드들을 약알칼리성 엔도프로테아제로 처리하는 제2 엔도 가수분해 단계;

   상기 제 2 엔도 가수분해로 형성된 펩티드들을 엑소프로테아제로 처리하는 엑소 가수분해 단계; 및

   상기 엔도 및 엑소 가수분해를 거쳐 형성된 펩티드들을 2,000 내지 5,000 달톤의 한외 여과막을 사용하여 여과하는 선별 단계를 포함하는 방법으로 제조된 것을 특징으로 하는 시알산 결합 폴리펩티드 혼합물.
2. 제1항에 있어서, 상기 제 1엔도 가수분해 단계의 엔도프로테아제는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 호알칼리 프로테아제인 것을 특징으로 하는 시알산 결합 폴리펩티드 혼합물.
3. 제1항에 있어서, 상기 엑소 가수분해 단계의 엑소프로테아제는 아스퍼질러스 오리제(Asp, oryzae) 유래의 엑소프로테아제인 것을 특징으로 하는 시알산 결합 폴리펩티드 혼합물.
4. 제1항에 있어서, 상기 제2 엔도 가수분해 단계의 엔도프로테아제는 바실러스 서브틸리스 유래의 약알칼리 프로테아제인 것을 특징으로 하는 시알산 결합 폴리펩티드 혼합물.
5. 제1항에 있어서, 상기 방법은,

   상기 선별 단계 이후에, 상기 펩티드들을 함유한 수용액을 농축 및 탈염하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시알산 결합 폴리펩티드 혼합물.