JPH08140693A - フェニルアラニン含量の少ないペプチド混合物の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 フェニルアラニン含量の少ない一定品質のペ
プチド混合物の製造法であって、１種若しくは２種以上
の蛋白質からなる原料蛋白質の水溶液又は予め軽度に加
水分解した原料蛋白質の水溶液に、１種又は２種以上の
蛋白分解酵素を添加し、原料蛋白質又は予め軽度に加水
分解した原料蛋白質の加水分解を開始し、加水分解によ
り分解液中に遊離したフェニルアラニンの量を経時的
に、かつ短時間で測定し、原料蛋白質又は予め軽度に加
水分解した原料蛋白質に含まれるフェニルアラニンの総
量に対する遊離したフェニルアラニンの量の割合を算出
し、その算出した値が予め設定された特定の範囲内に達
したときに直ちに加水分解を停止し、分解液中の遊離し
たフェニルアラニンを除去することを特徴とするフェニ
ルアラニン含量の少ないペプチド混合物の製造法。 【効果】 本発明の方法によりフェニルアラニン含有量
が低い値で一定し、高品質の製品を簡便に製造すること
が可能であり、該製品は、フェニルケトン尿症の乳幼
児、成人、及び妊産婦の食事における蛋白源として広く
利用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、フェニルアラニンの摂
取を制限する必要のあるアミノ酸代謝異常症、特にフェ
ニルケトン尿症患者が日常的に摂取することが可能であ
るフェニルアラニン含量の少ないペプチド混合物を、常
に安定した状態で、一定の品質で製造する方法に関す
る。本明細書において、百分率は、特に断りのない限り
重量による表示である。

【０００２】

【従来の技術】フェニルケトン尿症（以下ＰＫＵと記載
することがある）は、アミノ酸の一つであるフェニルア
ラニン（以下Ｐｈｅと記載することがある）をチロシン
に変換するフェニルアラニン水酸化酵素が先天的に欠如
しているため、Ｐｈｅが、血中に蓄積され、神経系の障
害、発育障害を惹起する先天性代謝異常症である。従っ
て、ＰＫＵ患者は、体内にＰｈｅが蓄積しないよう医師
の指導のもとに、Ｐｈｅの摂取量を厳密に制御しなけれ
ばならないのである。

【０００３】一方、Ｐｈｅは、蛋白質に通常３〜５％程
度含まれている普通のアミノ酸であるため、従来、ＰＫ
Ｕ患者は、食品若しくは乳児用調製乳の蛋白質成分の一
部又は全部を、Ｐｈｅを含まないアミノ酸混合物に置換
して摂取しなければならなかった。しかしながら、この
ようなアミノ酸混合物は、アミノ酸特有の不快な風味を
呈するとともに、腸管での浸透圧が高いために下痢を惹
起する等の欠点があった。そのため、風味が良く、かつ
食事療法に好適なＰＫＵ患者用蛋白質源が、患者、その
家族又は医師から待望されていた。

【０００４】その一つの方法として、ＰＫＵ患者用蛋白
質源としてκ−カゼイングリコマクロペプチド（以下Ｇ
ＭＰと記載することがある）を用いる方法が開示されて
いる（特開平４−１２６０５１号公報）。ＧＭＰは、そ
のアミノ酸配列中にＰｈｅを全く含まず、また分子量が
８，０００ダルトンと高く浸透圧上昇の問題もほとんど
ないためＰＫＵ患者用蛋白源として有効である。しかし
ながら、ＧＭＰを単離するための操作が極めて繁雑であ
り、工業的生産のためには不都合であった。しかも、最
近の栄養学的知見によれば、蛋白質よりもオリゴペプチ
ドの方が消化吸収に優れていることが明らかになってい
る。

【０００５】ＰＫＵ患者用蛋白質源にオリゴペプチドを
用いた他の例として、蛋白質を蛋白分解酵素で分解し、
Ｐｈｅ含量の少ない画分をゲル濾過により回収し、低フ
ェニルアラニンペプチド（以下ＬＰＰと記載することが
ある）を用いる方法がある［ジャーナル・オブ・フード
・サイエンス(Journal of Food Science)、第４１巻、
第１０２９〜１０３２ページ、１９７６年及び特開昭６
１−６８４２６号公報］。

【０００６】更に、蛋白質を水系下で、エキソペプチダ
ーゼで処理するか、又はエンドペプチダーゼで処理後エ
キソペプチダーゼで処理し、芳香族アミノ酸をほとんど
含まないポリペプチドと遊離芳香族アミノ酸又は芳香族
アミノ酸を末端に有する低分子ペプチドを活性炭を用い
て吸着し、逆浸透膜又はイオン交換性電気透析膜を用い
て低分子物質を分離し、ＬＰＰを製造する方法が開示さ
れている（特公平２−５４０７０号公報）。これらの方
法により、ＬＰＰを工業的に製造することが可能となっ
た。

【０００７】一方、蛋白分解酵素で原料の蛋白質を分解
してペプチドを製造する場合、いくつかの従来技術を例
示すれば次のとおりである。 １）蛋白質をエンド型蛋白分解酵素及びエキソ型蛋白分
解酵素共存の水系下で、０．５〜１０時間酵素分解し、
苦味の極めて少ない平均鎖長３〜１０のオリゴペプチド
を得ることを特徴とするオリゴペプチド混合物の製造法
が開示されている（特開昭６２−１４３６９７号公
報）。

【０００８】２）カゼイン溶液をカラムに充填した固定
化酵素で部分分解する方法において、カゼイン溶液の通
液速度を制御してカゼインの部分分解物を製造する方法
が開示されている（特公平３−３１４２１号公報）。

【０００９】３）原料蛋白質の抗原性を認めなくなるま
で、かつ、原料蛋白質に含まれる芳香族アミノ酸が、９
０％以上遊離アミノ酸になるまで分解し、ゲル濾過法に
よりペプチド部分を回収することことにより、抗原性を
呈さず、分子量１，０００ダルトン以下、遊離アミノ酸
含有量が２０％以下、芳香族アミノ酸含有量が全アミノ
酸の１．０％以下の低分子量ペプチドの製造法が開示さ
れている（特開平２−１３８９９１号公報）。

【００１０】４）獣乳κ−カゼイン由来のグリコポリペ
プチドの蛋白分解酵素加水分解物であって、フィッシャ
ー値が３０から６０の範囲であるペプチド混合物を製造
する方法において、分解率が５〜２５％となった時点で
加熱処理し、酵素を失活させる方法が開示されている
（特開平２−３００１３７号公報）。

【００１１】５）牛乳ホエー蛋白質を、生体内で生ずる
蛋白質消化をシミュレーションし得る蛋白質分解酵素と
接触させることにより、加水分解を、生成物中に残留蛋
白質がほとんど含有しなくなるまで、即ち、１２％トリ
クロル酢酸に沈殿しうる窒素を含有しなくなるまで、及
び少なくとも５０％のペプチドが２〜５のアミノ酸を含
有し、遊離アミノ酸の量が１５％以下であるペプチド混
合物を得るまで継続することを特徴とする牛乳ホエー蛋
白質からのペプチド混合物の製造法が開示されている
（特公昭６２−６１０３９号公報）。

【００１２】６）乳蛋白質の加水分解物が、分子量１，
０００以下であり、芳香族アミノ酸の９０％以上が遊離
アミノ酸であって、ヒト皮膚細胞に対して増殖賦活作用
を有し乳蛋白質の抗原性を有しないことを特徴とする化
粧料及び皮膚外用剤が開示されている（特開平４−２６
６０４号公報）。

【００１３】７）乳蛋白質を固定化蛋白分解酵素で分解
して蛋白分解物を製造する方法において、ペプチドセン
サーでペプチド濃度を測定する方法及びペプチドの平均
鎖長を測定する方法が開示されている（食品産業バイオ
リアクターシステム技術研究組合編、「実践バイオリア
クター」、第１６６〜１８４ページ、食品産業バイオリ
アクターシステム技術研究組合発行、１９９０年）。

【００１４】８）小麦グルテンを固定化蛋白分解酵素で
分解してグルテン分解物を製造する方法において、グル
テン分解物の疎水性を逆相クロマトグラフィーで経時的
に計測して泡末安定性に優れたグルテン分解物が製造で
きることが開示されている（食品産業バイオリアクター
システム技術研究組合編、「実践バイオリアクター」、
第１０６〜１２６ページ、食品産業バイオリアクターシ
ステム技術研究組合発行、１９９０年）。

【００１５】９）味噌、醤油等の発酵食品の製造、リジ
ン、グルタミン酸等のアミノ酸発酵における工程管理に
おいて、目的生産物である遊離アミノ酸量を測定するこ
とが知られている（食品工業、第３４巻、第１６号、第
１〜１１ページ、１９９１年）。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】前記従来技術に示され
るように、従来、蛋白質分解酵素で原料の蛋白質を分解
してペプチド混合物を製造する場合、分解反応の終点
を、反応時間、蛋白溶液の通液速度等を指標とするか、
又は分解物の分解率、疎水度等の測定により決定する
か、のいずれかであったが、これらの方法では、刻々変
化する分解物の理化学的性状、特に遊離のアミノ酸量を
正確に把握することが極めて困難であった。

【００１７】従って、従来のペプチド混合物の製造法に
おいては、製造バッチごとにペプチド混合物が含有する
遊離アミノ酸量及び組成が異なり、ペプチド混合物の品
質が一定しないという致命的な欠点があった。しかも、
酵素反応を再現性よく実施するためには、反応温度、ｐ
Ｈ、酵素力価、基質濃度等を厳密に制御しなければなら
ず、そのため工業的スケールでは作業性も劣り、一定の
アミノ酸遊離率を得ることは事実上困難であった。

【００１８】このことは、高品質のＬＰＰを製造する場
合においても次のような致命的な欠点を有することを意
味している。前記のとおり、蛋白質を蛋白分解酵素で分
解する工程を含むＬＰＰの製造法において、ペプチド混
合物のＰｈｅ含量を低下させるための方法は、蛋白分解
酵素により蛋白質を加水分解することにより蛋白質から
十分量のＰｈｅを遊離させ、遊離したＰｈｅをゲル濾
過、活性炭吸着等により除去するという原理に基づいて
おり、蛋白質の蛋白分解酵素による加水分解工程の制御
が高品質のＬＰＰを製造するための重要な技術となって
いる。

【００１９】即ち、Ｐｈｅの遊離が不十分であった場合
には、酵素分解反応に続くゲル濾過又は活性炭処理によ
り除去されるＰｈｅ量が少なくなるため、ペプチド混合
物のＰｈｅ含量が高くなり、これはＰＫＵ患者用として
不適当なものとなる。また、Ｐｈｅの遊離が過剰の場合
（換言すれば酵素分解反応が過度に進行した場合）、Ｐ
ｈｅ以外のアミノ酸遊離率も高くなるために風味が著し
く悪化し、浸透圧も高くなるため、不快な味、下痢症状
の発生等のため治療効果が極めて低下する不都合があ
り、その改善が強く要請されている状況にあった。即
ち、高品質のＬＰＰを製造するためには、蛋白質の蛋白
分解酵素による加水分解工程において得られるペプチド
混合物の遊離Ｐｈｅ量が、常に一定となることが極めて
重要な課題である。

【００２０】本発明者らは、常に一定の品質が得られる
ペプチド混合物の製造法を発明し、既に特許出願（出願
番号未着。以下先願と記載することがある）した。先願
の方法は、「一定品質のペプチド混合物の製造法であっ
て、１種若しくは２種以上の蛋白質からなる原料蛋白質
の水溶液又は予め軽度に加水分解した原料蛋白質の水溶
液に、１種若しくは２種以上の蛋白分解酵素を添加し、
原料蛋白質又は予め軽度に加水分解した原料蛋白質の加
水分解を開始し、加水分解により分解液中に遊離した特
定アミノ酸の量を経時的に、かつ短時間で測定し、原料
蛋白質又は予め軽度に加水分解した原料蛋白質に含まれ
る特定アミノ酸の総量に対する遊離した特定アミノ酸の
量の割合を算出し、その算出した値が予め設定された特
定の範囲内に達したとき直ちに加水分解を停止すること
を特徴とするペプチド混合物の製造法。」である。

【００２１】このような状況の中で、本発明者らは、前
記従来技術に鑑みて、常に安定した状態で、一定の品質
のフェニルアラニン含量の少ないペプチド混合物を得る
ために、鋭意研究を行なった結果、蛋白質の蛋白分解酵
素による加水分解工程において、分解液中に遊離したＰ
ｈｅの量を、経時的、かつ短時間で測定し、原料蛋白質
に含まれているＰｈｅの総量との割合を算出し、その値
が予め設定した特定の範囲内に達したときに直ちに分解
反応を停止し、遊離したＰｈｅを除去することにより、
簡便に、Ｐｈｅ含量が一定のフェニルアラニン含量の少
ないペプチド混合物が得られることを見い出し、本発明
を完成した。

【００２２】本発明の目的は、遊離Ｐｈｅの量が一定
し、特にＰＫＵ患者が日常的に摂取することが可能であ
る、品質が良好なフェニルアラニン含量の少ないペプチ
ド混合物を簡便に製造し得る新規な方法を提供すること
にある。

【００２３】

【課題を解決するための手段】前記課題を解決する本発
明は、フェニルアラニン含量の少ない一定品質のペプチ
ド混合物の製造法であって、１種若しくは２種以上の蛋
白質からなる原料蛋白質の水溶液又は予め軽度に加水分
解した原料蛋白質の水溶液に、１種又は２種以上の蛋白
分解酵素を添加し、原料蛋白質又は予め軽度に加水分解
した原料蛋白質の加水分解を開始し、加水分解により分
解液中に遊離したフェニルアラニンの量を経時的に、か
つ短時間で測定し、原料蛋白質又は予め軽度に加水分解
した原料蛋白質に含まれるフェニルアラニンの総量に対
する遊離したフェニルアラニンの量の割合を算出し、そ
の算出した値が予め設定された特定の範囲内に達したと
きに直ちに加水分解を停止し、分解液中の遊離したフェ
ニルアラニンを除去することを特徴とするフェニルアラ
ニン含量の少ないペプチド混合物の製造法であり、遊離
したフェニルアラニンの量の測定が、酵素膜センサーを
用いて行われることを望ましい態様としてもいる。

【００２４】次に本発明について詳述する。本発明の出
発原料として使用する原料蛋白質は、獣乳、卵、魚肉、
畜肉等に由来する動物性蛋白質、大豆、小麦等に由来す
る植物性蛋白質、又はこれらの任意の混合物であり、特
に限定されるものではない。また、蛋白質を予め軽度に
加水分解した分解物であって、更に蛋白分解酵素により
分解し得る大きい分子量のペプチド混合物を出発原料と
することもできる。

【００２５】原料蛋白質又は予め軽度に加水分解した原
料蛋白質を、蛋白質換算で１０％前後の濃度で水に溶解
し、殺菌及び蛋白質の酵素分解を効率よく行うため、６
５〜９０℃の温度範囲で５〜３０分間加熱処理してもよ
い。次いで溶液のｐＨをアルカリ又は酸溶液を用いて使
用する蛋白分解酵素の至適ｐＨ付近に調整し、原料水溶
液を調製する。

【００２６】次いで、前記原料水溶液に蛋白分解酵素を
添加するが、蛋白分解酵素の添加は一括添加、又は少量
に分割して添加する逐次添加であってもよい。使用する
蛋白分解酵素としては、動物由来（例えば、パンクレア
チン、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン等）、植
物由来（例えば、パパイン、ブロメライン等）、微生物
由来（例えば、酵母、カビ、細菌、放線菌、乳酸菌等）
のエンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼがあげら
れるが、エンドプロテアーゼとしては、Ｐｈｅ等の芳香
族アミノ酸に対して親和性のあるものが好ましく、例え
ば、ペプシン、キモトリプシン等が望ましい。エキソプ
ロテアーゼとしては、Ｐｈｅ等の芳香族アミノ酸を末端
に有するペプチドに対してペプチダーゼ活性を示すもの
が好ましく、黒麹菌、放線菌、酵母等に由来するエキソ
ペプチダーゼを好適な例として示すことができる。

【００２７】Ｐｈｅを十分に遊離させるためには、前記
のエンドプロテアーゼとエキソプロテアーゼとを組み合
わせて用いることが望ましく、原料蛋白質溶液に一括添
加により、又はエンドプロテアーゼを添加した後一定時
間経過後にエキソプロテアーゼを添加し、段階的に、分
解反応を実施することもできる。添加する酵素量は、例
えば、エンドペプチダーゼを原料蛋白質１ｇ当たり５０
００〜１００００ＰＵＮ単位、エキソペプチダーゼを原
料蛋白質１ｇ当たり１０〜５０活性単位の添加を、望ま
しい態様として例示することができる（ＰＵＮ単位及び
活性単位については後記する）。

【００２８】所定量の酵素を添加した原料水溶液を、通
常、酵素の至適温度に所定時間保持して蛋白質の酵素に
よる分解を開始するが、分解中に微生物の増殖が懸念さ
れる場合は、必要に応じて酵素の至適温度より高温域ま
たは低温域の温度に所定時間保持して蛋白質の酵素によ
る加水分解を行なうこともできる。しかしながら、酵素
の至適温度よりも極端に異なる温度範囲では、加水分解
反応の効率が低下するので、通常４０〜６０℃の温度範
囲が望ましい。

【００２９】加水分解の開始後、分解液中に遊離したＰ
ｈｅの量を経時的に、かつ短時間に測定するが、例え
ば、高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと記載
することがある）、酵素膜センサー［例えば、バイオテ
ックアナライザー（旭化成工業社製）］等を用いること
ができ、特に望ましい態様としてオンラインにより測定
する方法を例示することができる。これらにより、分解
液中に遊離したＰｈｅの量を経時的に、かつ短時間に測
定し、出発原料である蛋白質又は予め軽度に加水分解し
た蛋白質に含まれるＰｈｅの総量に対する遊離したＰｈ
ｅの量の割合が予め設定された特定の範囲に達したと
き、ただちに分解液中の酵素を失活又は除去し、加水分
解を停止する。該ペプチド混合物をＰＫＵ患者に供する
ことを考慮すると、原料蛋白質又は予め軽度に加水分解
した蛋白質に含まれるＰｈｅを高度に遊離して除去する
必要があるので、前記特定の範囲は、８５〜９５％を例
示することができ、望ましくは８８〜９２％である。

【００３０】分解液中の酵素の失活又は除去は、常法に
よる加熱処理、限外濾過膜等を用いる分解液からの酵素
の除去等により実施することができる。加熱処理の加熱
温度と保持時間は使用した酵素の熱安定性を考慮し、十
分に失活できる条件を適宜設定することができる。加熱
処理又は濾過処理による酵素の失活又は除去工程には、
相当の時間を要し、この間に分解が進行するおそれがあ
る場合には、所定の条件のもとに、分解の進行程度（Ｐ
ｈｅの遊離速度）を、試験により予め測定し、その結果
に基づいて加水分解を停止する前記特定の範囲を決定
し、設定するのが望ましい。

【００３１】分解液中の酵素の失活又は除去後、常法に
より分解液を冷却し、セライト濾過、精密濾過、限外濾
過、遠心分離等の方法により分解液から沈殿を除去す
る。得られた分解液からのＰｈｅ等の芳香族アミノ酸の
除去は、適宜の方法、例えば、ゲル濾過法、吸着樹脂
法、活性炭吸着法等を単独又は組合わせて実施すること
ができる。ゲル濾過剤としては、排除限界分子量１０，
０００ダルトン以下、望ましくは２，５００ダルトン以
下のものを使用し、芳香族アミノ酸に吸着性をもつ疎水
性側鎖、例えば、カルボキシル基、ブチル基、フェニル
基、疎水性部位をもつゲル担体を、特に好適な例として
示すことができる。このようなゲル濾過剤としては、セ
ファデックスＧ−１０（ファルマシア社製）、セルロフ
ァインＧＣＬ−２５（生化学工業社製）等、また、活性
炭としては、例えば、白鷺（武田薬品工業社製）等を例
示することができる。

【００３２】ゲル濾過剤又は活性炭をカラムに充填し、
このカラムに分解液を通液し、水又は芳香族アミノ酸の
吸着性を高めるため２〜１５％のエタノール水溶液を溶
出液として溶出することができる。芳香族アミノ酸の除
去操作は、分解液にゲル濾過剤又は活性炭を投入し、所
定時間静置し、芳香族アミノ酸を吸着させるバッチ法式
により実施することもできる。

【００３３】前記の方法によって得られたフェニルアラ
ニン含量の少ないペプチド混合物の溶液を、公知の方法
により濃縮して濃縮液とすることもでき、また、この濃
縮液を公知の方法により乾燥して粉末とすることもでき
る。得られたフェニルアラニン含量の少ないペプチド混
合物の溶液、その濃縮液又はその粉末は、通常の食品原
料と同様にＰＫＵ患者用の食品原料として使用し、各種
ＰＫＵ患者用の食品を製造することができる。

【００３４】前記ＰＵＮ単位及び活性単位は、次のとお
りである。エンドペプチダーゼのＰＵＮ単位は、カゼイ
ン［ハマーシュタイン(Hammerstein) 。メルク社製］に
エンドペプチダーゼを作用させ、３０℃で１分間に１μ
ｇのチロシンに相当するアリルアミノ酸のフォリン試薬
での呈色反応を示す酵素活性が１ＰＵＮ単位である。

【００３５】また、エキソペプチダーゼの活性単位は、
次の方法により測定した。エキソペプチダーゼを含有す
る粉末を０．２ｇ／１００ｍｌの割合で０．１モルのリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に分散又は溶解し酵素溶液と
する。一方、ロイシルパラニトロアニリド（国産化学社
製。以下Ｌｅｕ−ｐＮＡと記載する）を０．１モルのリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して２ｍＭの基質溶液
を調製する。酵素溶液１ｍｌに基質溶液１ｍｌを加え３
７℃で５分間反応させた後、３０％の酢酸溶液２ｍｌを
加えて反応を停止させる。反応液をメンブランフィルタ
ーで濾過し、波長４１０ｎｍで濾液の吸光度を測定す
る。エキソペプチダーゼの活性単位は、１分間に１μｍ
ｏｌのＬｅｕ−ｐＮＡを分解するのに必要な酵素量が１
活性単位であり、次式により算出した。 活性単位（粉末１ｇ当たり）＝２０×（Ａ／Ｂ） （ただし、前記の式において、Ａ及びＢは、それぞれ波
長４１０ｎｍにおける試料の吸光度及び０．２５ｍＭパ
ラニトロアニリンの吸光度である）

【００３６】次に試験例を示して本発明を詳述するが、
本発明においては、次の試験方法を採用した。 （１）アミノ酸組成の測定方法 トリプトファン、システイン及びメチオニン以外のアミ
ノ酸については、試料を６Ｎ塩酸で１１０℃、２４時間
加水分解し、トリプトファンについては、水酸化バリウ
ムで１１０℃、２２時間アルカリ分解し、システイン及
びメチオニンについては、過ぎ酸処理後、６Ｎ塩酸で１
１０℃、１８時間加水分解し、それぞれアミノ酸自動分
析機（日立製作所製。８３５型）により分析し、アミノ
酸の質量を測定した。

【００３７】（２）遊離アミノ酸組成の測定方法 スルホサリチル酸で試料を除蛋白し、アミノ酸自動分析
機（日立製作所製。８３５型）により分析し、遊離アミ
ノ酸の質量を策定した。そして前記アミノ酸組成の分析
で得られた各アミノ酸の質量に対する遊離アミノ酸質量
の百分率を算出した。

【００３８】（３）遊離Ｐｈｅ量の測定方法 遊離アミノ酸濃度測定用酵素膜センサー（旭化成工業社
製）を装着したバイオテックアナライザー（旭化成工業
社製）により遊離アミノ酸量を測定し、この値と予め予
備実験により（２）で求めた遊離Ｐｈｅ率との相関値か
ら分解液中の遊離Ｐｈｅ量を測定した。

【００３９】（４）ＨＰＬＣ Inertsil PREP-ODSカラム（ＧＬサイエンス社製。６．
５×２５０ｍｍ）をＨＰＬＣ（島津製作所製）に装着
し、分解液０．１ｍｌを供給し、溶離液（０．１％トリ
フルオロ酢酸溶液）に対する溶離Ｂ（０．１％トリフル
オロ酢酸溶液）の割合が１００分間で５０％となる濃度
勾配で１．５ｍｌ／分の流速で溶出を行った。

【００４０】（５）分解率 ケルダール法により試料の全窒素を、ホルモール滴定法
により試料のホルモール態窒素を、それぞれ測定し、こ
れらの値から次式により算出した。 分解率（％）＝（ホルモール態窒素）／（全窒素）×１
００

【００４１】試験例１ この試験は、従来から採用されているペプチド混合物の
製造方法、即ち、反応時間を指標にして酵素分解を停
止する方法、分解率を指標にして酵素分解を停止する
方法、及び本発明の方法［酵素膜センサー（バイオテ
ックアナライザー。旭化成工業社製）］とにより、ペプ
チド混合物を製造し、得られたペプチド混合物中の遊離
Ｐｈｅ、及びこのペプチド混合物から遊離Ｐｈｅを除去
して得られるＰｈｅ含量の少ないペプチド混合物のＰｈ
ｅ含量に及ぼす影響を比較検討した。

【００４２】１）試料の調製 前記の方法では、酵素分解反応を１５時間で停止した
こと、前記の方法では、酵素分解を分解率が３０％に
達したときに停止したこと、及び前記の本発明の方法
では、分解液中の遊離Ｐｈｅ濃度を経時的に、かつ短時
間で測定し、Ｐｈｅの遊離率が９０％に達した時点で酵
素分解を停止したことを除き、実施例１と同一の方法に
より牛乳乳清蛋白質溶液の加水分解をそれぞれ５回反復
して実施し、合計１５種類のペプチド混合物を調製し
た。更に、これらの３種類の方法により得られた分解液
から、それぞれ、実施例１と同一の方法により遊離Ｐｈ
ｅを除去し、試料を調製した。

【００４３】２）試験方法 各分解液の遊離Ｐｈｅ及び各試料中の全Ｐｈｅ量を、そ
れぞれ前記の方法により測定し、５回の結果の平均値と
標準偏差を算出した。

【００４４】３）試験結果 この試験結果は表１に示すとおりである。表１から明ら
かなように、各方法で得られた試料の遊離Ｐｈｅ量の標
準偏差は、の本発明の方法が最も小さく、５回反復し
て製造した場合でも品質が安定しており、次いでの方
法の変動が少なく、の方法は最も変動が大きく品質が
不安定であることが認められた。また、これらの３種類
の方法により製造した試料中の全Ｐｈｅの値及び標準偏
差も、の本発明の方法が最も低値を示し、品質が安定
していることが認められた。尚、酵素の種類、原料蛋白
質の種類を変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得ら
れた。

【００４５】

【表１】

【００４６】試験例２ この試験は、試験例１とは異なる原料蛋白質及び分解条
件で加水分解を行った場合の各方法を比較するために実
施した。 １）試料の調製 前記試験例１のの方法では、酵素分解反応を２０時間
で停止したこと、前記試験例１のの方法では、酵素分
解を分解率が３５％に達したときに停止したこと、前記
試験例１のの本発明の方法では、分解液中の遊離Ｐｈ
ｅ濃度を経時的に、かつ短時間で測定し、Ｐｈｅの遊離
率が９０％に達した時点で酵素分解を停止したこと、を
除き、実施例２と同一の方法により牛乳カゼインの加水
分解をそれぞれ５回反復して実施し、合計１５種類の分
解液を調製した。更に、これらの３種類の方法により得
られた分解液から、それぞれ、実施例２と同一の方法に
より遊離Ｐｈｅを除去して試料を調製した。

【００４７】２）試験方法 試験例１と同一の方法によった。

【００４８】３）試験結果 この試験結果は表２に示すとおりである。表２から明ら
かなように、各方法で製造した分解液の遊離Ｐｈｅ量の
標準偏差は、の本発明の方法が最も小さく、の本発
明の方法が最も小さく、５回反復して製造した場合でも
品質が安定しており、次いでの方法の変動が少なく、
の方法は最も変動が大きく品質が不安定であることが
認められた。また、これらの３種類の方法により製造し
た試料中の全Ｐｈｅの値及び標準偏差も、の本発明の
方法が最も低値を示し、品質が安定していることが認め
られた。尚、酵素の種類、原料蛋白質の種類を変更して
試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。

【００４９】

【表２】

【００５０】

【実施例】次に実施例を示して本発明を更に詳述する
が、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 実施例１ 市販の乳清蛋白質濃縮物（ラクプロダン８０。デンマー
クプロテイン社製。蛋白質含量７５％）１００ｇを１０
％の濃度で脱イオン水に溶解し、６５℃で３０分間加熱
殺菌し、４５℃に保持し、水酸化ナトリウムでｐＨを
８．５に調整し、パンクレアチンＦ（天野製薬社製）１
５万ＰＵＮ単位（乳清蛋白質１ｇ当たり２０００ＰＵＮ
単位）、プロテアーゼＮアマノ（天野製薬社製）１５万
ＰＵＮ単位（乳清蛋白質１ｇ当たり２０００ＰＵＮ単
位）、アクチナーゼＡＳ（科研ファルマ社製）単位（乳
清蛋白質１ｇ当たり５０００ＰＵＮ単位）、プロテアー
ゼＡアマノ（天野製薬社製）８００活性単位（乳清蛋白
質１ｇ当たり１０．７活性単位）を添加し、加水分解を
開始し、酵素膜センサー［バイオテックアナライザー
（旭化成工業社製）］を用いて経時的に、かつ短時間で
この分解液の遊離Ｐｈｅ量を測定し、遊離Ｐｈｅ率が９
０％に達した時点で８５℃、１０分間加熱して酵素を失
活させ、酵素分解を停止し、セライト濾過法により沈殿
物を除去し、常法により凍結乾燥し、ペプチド混合物約
７３ｇを得た。

【００５１】得られた凍結乾燥物５ｇを１０％の濃度で
水に溶解し、セファデックスＧ−１０（ファルマシア社
製）を充填した５ｃｍ×１５ｃｍカラムに通液し、脱イ
オン水を用いて溶出し、フェニルアラニン含量の少ない
ペプチド混合物を回収し、溶出液を凍結乾燥し、フェニ
ルアラニン含量の少ないペプチド混合物約２．２ｇを得
た。

【００５２】前記製造法を３回反復して得られたフェニ
ルアラニン含量の少ないペプチド混合物を前記試験方法
により試験した結果、Ｐｈｅ含有量は全アミノ酸当たり
０．２％であり、３回の製造におれるＰｈｅの量にはほ
とんど差異が認められなかった。

【００５３】実施例２ 市販牛乳カゼイン（ＡＬＡＣＩＤ。ニュージーランドデ
イリーボード製。蛋白質含量９０％）２００ｇを脱イオ
ン水に懸濁し、１０％水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に
調整して溶解し、脱イオン水で１２％の濃度に調整し、
９０℃で５分間加熱殺菌し、５０℃に保持し、パンクレ
アチンＦ（天野製薬社製）７２万ＰＵＮ単位（カゼイン
蛋白質１ｇ当たり４０００ＰＵＮ単位）を添加して加水
分解を開始し、開始５時間後にアクチナーゼＡＳ（科研
ファルマ社製）９０万単位（カゼイン蛋白質１ｇ当たり
５０００ＰＵＮ単位）を添加し、加水分解を継続し、Ｈ
ＰＬＣ（島津製作所製）を用いて、経時的に、かつ短時
間でこの分解液の遊離Ｐｈｅ量を測定し、遊離Ｐｈｅ率
が９０％に達した時点で、８５℃で１０分間加熱して酵
素を失活し、酵素分解を停止させ、分画分子量が３００
０ダルトンの限外濾過膜（旭化成工業社製）により沈殿
物を除去し、常法により凍結乾燥し、ペプチド混合物約
１６５ｇを得た。

【００５４】得られた凍結乾燥物１５０ｇを２０％の濃
度で水に溶解し、粉末活性炭［白鷺（武田薬品社製）］
３５ｇを投入し、４℃で１５時間静置し、のち濾過して
活性炭を除去し、吸着樹脂（ＫＳ−３５。北越炭素工業
社製）１９０ｍｌを充填したカラムに５ｍｌ／分の流速
で通液し、溶出液を凍結乾燥し、フェニルアラニン含量
の少ないペプチド混合物約１１２ｇを得た。

【００５５】前記製造法を３回反復して得られたフェニ
ルアラニン含量の少ないペプチド混合物を前記試験方法
により試験した結果、Ｐｈｅ含有量は全アミノ酸当たり
０．３％であり、３回の製造におれるＰｈｅの量にはほ
とんど差異が認められなかった。

【００５６】実施例３ 市販の乳清蛋白質濃縮物（ラクプロダン８０。デンマー
クプロテイン社製。蛋白質含量７５％）５００ｇ及び市
販の大豆蛋白粉末（ＳＵＰＲＯ。不二製油社製。蛋白質
含量９０％）５００ｇを脱イオン水に１０％の濃度で溶
解し、７０℃で５分間加熱殺菌し、５５℃に保持し、水
酸化カリウムでｐＨを９に調整し、パンクレアチンＦ
（天野製薬社製）１２３万７５００ＰＵＮ単位（蛋白質
１ｇ当たり１５００ＰＵＮ単位）、パパインＷ−４０
（天野製薬社製）１６５万ＰＵＮ単位（蛋白質１ｇ当た
り２０００ＰＵＮ単位）、アクチナーゼＡＳ（科研ファ
ルマ社製）３３０万ＰＵＮ単位（蛋白質１ｇ当たり４０
００ＰＵＮ単位）及びプロテアーゼＡアマノ（天野製薬
社製）１６５００活性単位（蛋白質１ｇ当たり２０活性
単位）を添加して加水分解を開始し、酵素膜センサー
（バイオテックアナライザー（旭化成工業社製））を用
いて経時的に、かつ短時間でこの分解液の遊離Ｐｈｅ量
を測定し、遊離Ｐｈｅ率が８８％に達した時点で、９０
℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、セライト濾過法
により沈殿物を除去し、常法により凍結乾燥し、ペプチ
ド混合物約７２０ｇを得た。

【００５７】得られた凍結乾燥物１００ｇを１０％の濃
度で水に溶解し、セルロファインＧＣＬ−２５（生化学
工業社製）を充填した３７ｃｍ×１５ｃｍカラムに通液
し、脱イオン水を用いて溶出し、フェニルアラニン含量
の少ないペプチド混合物を回収し、凍結乾燥し、フェニ
ルアラニン含量の少ないペプチド混合物約５２ｇを得
た。

【００５８】前記製造法を３回反復して得られたフェニ
ルアラニン含量の少ないペプチド混合物を前記試験方法
により試験した結果、Ｐｈｅ含有量は全アミノ酸当たり
０．４％であり、３回の製造におれるＰｈｅの量にはほ
とんど差異が認められなかった。

【００５９】

【発明の効果】以上詳記したとおり、本発明は、フェニ
ルケトン尿症患者の摂取に適当したフェニルアラニン含
量の少ないペプチド混合物の新規な製造法であり、本発
明の方法により、フェニルアラニン含有量が低い値で一
定し、高品質の製品を簡便に製造することが可能であ
り、本発明方法により製造されるフェニルアラニン含有
量の少ない一定品質のペプチド混合物は、従来製品にみ
られるような風味及び浸透圧上の欠点がなく、フェニル
ケトン尿症の乳幼児、成人、及び妊産婦の食事における
蛋白源として広く利用できる。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成７年１２月１３日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００４

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００４】その一つの方法として、ＰＫＵ患者用蛋白
質源としてκ−カゼイングリコマクロペプチド（以下Ｇ
ＭＰと記載することがある）を用いる方法が開示されて
いる（特開平４−１２６０５１号公報）。ＧＭＰは、そ
のアミノ酸配列中にＰｈｅを全く含まず、また分子量が
８，０００ダルトンと大きく浸透圧上昇の問題もほとん
どないためＰＫＵ患者用蛋白源として有効である。しか
しながら、ＧＭＰを単離するための操作が極めて繁雑で
あり、工業的生産のためには不都合であった。しかも、
最近の栄養学的知見によれば、蛋白質よりもオリゴペプ
チドの方が消化吸収に優れていることが明らかになって
いる。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２１】このような状況の中で、本発明者らは、前
記従来技術に鑑みて、常に安定した状態で、一定の品質
のＰｈｅ含量の少ないペプチド混合物を得るために、鋭
意研究を行なった結果、蛋白質の蛋白分解酵素による加
水分解工程において、分解液中に遊離したＰｈｅの量
を、経時的、かつ短時間で測定し、原料蛋白質に含まれ
ているＰｈｅの総量との割合を算出し、その値が予め設
定した特定の範囲内に達したときに直ちに分解反応を停
止し、遊離したＰｈｅを除去することにより、簡便に、
Ｐｈｅ含量の少ないペプチド混合物が得られることを見
い出し、本発明を完成した。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２２】本発明の目的は、特にＰＫＵ患者が日常的
に摂取することが可能である、品質が良好なフェニルア
ラニン含量の少ないペプチド混合物を簡便に製造し得る
新規な方法を提供することにある。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３２】ゲル濾過剤又は活性炭をカラムに充填し、
このカラムに分解液を通液する。溶出液としては水又は
芳香族アミノ酸の吸着性を高めるため２〜１５％のエタ
ノール水溶液を使用することができる。芳香族アミノ酸
の除去操作は、分解液にゲル濾過剤又は活性炭を投入
し、所定時間静置し、芳香族アミノ酸を吸着させるバッ
チ法式により実施することもできる。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３８】（３）遊離Ｐｈｅ量の測定方法 遊離アミノ酸濃度測定用酵素膜センサー（旭化成工業社
製）を装着したバイオテックアナライザー（旭化成工業
社製）により遊離アミノ酸量を測定し、この値と予め予
備実験により求めた遊離Ｐｈｅ率との相関値から分解液
中の遊離Ｐｈｅ量を測定した。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４１】試験例１ この試験は、従来から採用されているペプチド混合物の
製造方法、即ち、反応時間を指標にして酵素分解を停
止する方法、分解率を指標にして酵素分解を停止する
方法、及び本発明の方法［酵素膜センサー（バイオテ
ックアナライザー。旭化成工業社製）］とにより、ペプ
チド混合物を製造し、得られたペプチド混合物中の遊離
Ｐｈｅ量、及びこのペプチド混合物から遊離Ｐｈｅを除
去して得られるＰｈｅ含量の少ないペプチド混合物のＰ
ｈｅ含量に及ぼす影響を比較検討した。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４３】２）試験方法 各分解液の遊離Ｐｈｅ量及び各試料中の全Ｐｈｅ量を、
それぞれ前記の方法により測定し、５回の結果の平均値
と標準偏差を算出した。

【手続補正８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４８】３）試験結果 この試験結果は表２に示すとおりである。表２から明ら
かなように、各方法で製造した分解液の遊離Ｐｈｅ量の
標準偏差は、の本発明の方法が最も小さく、５回反復
して製造した場合でも品質が安定しており、次いでの
方法の変動が少なく、の方法は最も変動が大きく品質
が不安定であることが認められた。また、これらの３種
類の方法により製造した試料中の全Ｐｈｅの値及び標準
偏差も、の本発明の方法が最も低値を示し、品質が安
定していることが認められた。尚、酵素の種類、原料蛋
白質の種類を変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得
られた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ２３Ｊ 3/34 Ａ２３Ｌ 1/305 // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＤ (72)発明者 川口 靖 神奈川県座間市東原５−１−83 森永乳業 株式会社栄養科学研究所内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 フェニルアラニン含量の少ない一定品質
   のペプチド混合物の製造法であって、１種若しくは２種
   以上の蛋白質からなる原料蛋白質の水溶液又は予め軽度
   に加水分解した原料蛋白質の水溶液に、１種又は２種以
   上の蛋白分解酵素を添加し、原料蛋白質又は予め軽度に
   加水分解した原料蛋白質の加水分解を開始し、加水分解
   により分解液中に遊離したフェニルアラニンの量を経時
   的に、かつ短時間で測定し、原料蛋白質又は予め軽度に
   加水分解した原料蛋白質に含まれるフェニルアラニンの
   総量に対する遊離したフェニルアラニンの量の割合を算
   出し、その算出した値が予め設定された特定の範囲内に
   達したときに直ちに加水分解を停止し、分解液中の遊離
   したフェニルアラニンを除去することを特徴とするフェ
   ニルアラニン含量の少ないペプチド混合物の製造法。
2. 【請求項２】 遊離したフェニルアラニンの量の測定
   が、酵素膜センサーを用いて行われる請求項１に記載の
   フェニルアラニン含量の少ないペプチド混合物の製造
   法。