JP2000516635A - 加水分解度の高い植物性ペプトンを得る方法およびその利用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明の方法は、植物性単離物から出発してポリフェノールを除去する最初の工程と、次にまず非特異的なエンドプロテアーゼで、続いて特異的なエンドプロテアーゼおよびエクソプロテアーゼで２回加水分解処理する工程を包含する。このようにして得られる加水分解されたペプトンは、農産食物および医療薬物業界に利用可能であり、特にヒト，動物用および臨床的栄養補給の分野に利用可能である。

Description

【発明の詳細な説明】 加水分解度の高い植物性ペプトンを得る方法およびその利用法 発明の技術分野 本発明は、農産食物および医療薬物業界の技術分野に関し、特にヒト，動物用 および病院で用いられる（臨床的）栄養補給に関連する。 より具体的には、本発明は上記技術分野に多大の利益をもたらす加水分解度の 高い植物性ペプトンを得る方法を提供する。 発明に対する従来技術の説明 十分に大量にかつ合理的な価格で各種タイプの加水分解物を入手可能とするこ とは非常に重要であり、医療の観点からは望ましいが、特別食の調剤に使用する ことは現在非常に高価なため、殆ど利用されてない。 現行の社会特に先進国の社会では、一般的な栄養補給，微生物の培養，飲料水 Ziajku S.,Dzwolak W and Zubel J.,1994,Milk Science International,49,7]を 必要としない。今日では、組成および特性が十分に明らかにされた加水分解物は 市場で入手できないか、あるいは既存のものは非常に高価で価格を低減する必要 があるかのいずれかの理由で、上記加水分解物の要求がある。アミノ酸組成が明 7〜971］は、滋養業界および医療薬物業界の双方にとって非常に望ましい［Furs tP.,1992,Clin.Nutr.10,519〜529］。したがって、例えば遊離アミノ酸の混合物 または分岐したアミノ酸（ＡＡＲ）に富むペプチドのいずれかを含有するＡＡＲ に富む加水分解物は、各種の肝臓病理学特に脳疾患の治療に満足すべき結果をも って使用されてきた［Grunggreiff K.,Kleine F.D.,Musie H.E.,Diete U.,Frank e D.,Klanck S.,Page I.,Kleine S.,Losene B and Pfeiffer K.P.,1993,Z-Gasko enterol,31,235〜241;Rossi-Fanelli F.,1990,Adv.Exp.Med.Biol.272,227〜2 33］。 蛋白質（肉粉）に富む残渣や慣用されてない蛋白源（植物性蛋白）［Anuariod e Estadistica Agraria 1996,農務省技術部編集，Fisheries and Food;Boatri rdorica-Falomir C.,Olivares-Vazquez M.R.,1991 J.Food Sci.53,1396〜1398］ からの蛋白加水分解物の製造は、食品業界においてプロセスが十分に確立してい る。 さらに、酵素加水分解は、化学的加水分の場合と異なって、ある種のアミノ酸 残渣の破壊または変質が生じないため非常に有効なプロセスであり、アミノ酸の 栄養価が実用上変化することなく維持されるような温度，ｐＨおよび圧力の合理 的な条件下に行われる。酵素加水分解において、加水分解物の中和は、回避され るため、例えばダイエット食品や非経口製剤においてある種の適用に加水分解物 の使用を制限する塩の含有量が高い。 近年、商業的規模での酵素による蛋白加水分解プロセスの適用について、数多 くの研究がなされてきた。上記タイプのプロセスの利益は大きく、簡単な蛋白加 水分解物の製造には問題がないけれども、市場の需要に応じて明らかにされた加 水分解物、すなわち十分に明らかにされたものの製造についてはなお問題があり 、当該分野において最大限の挑戦が試みられている。可能ならば、後者のタイプ の加水分解物は次の特性を兼ね備えるべきである。(ｉ)含まれるアミノ酸（アミ ノグラム）と共にその大きさの分布（オリゴペプチド，テトラ−トリ−ジペプチ ドのペプチドおよび遊離アミノ酸の％）に関する完全に明らかにされた組成、(i i)苦みフレーバが存在しないか無視し得ること、および(iii)低アレルギーであ ること。 化学的アプローチ（酸・塩基の使用）および酵素によるアプローチ（酵素の使 用）の双方を含む蛋白加水分解物を得る継続中の特許は、一般的であり、用いる 基質が示されてないだけでなく、酵素加水分解の場合に作用させる酵素も示され ておらず、勿論詳細な説明も含まれてない（特許第４８９３５８号，出願番号２ ２７８／７９、工業所有権登録：ネスレ）。 発明の詳細な記述 本発明は、表題に示したとおり、加水分解度の高い植物性ペプトンを得る方法 に関する。 より具体的には、酵素により加水分解度の高い（ＧＨ５０％）植物性蛋白質の 加水分解物を得る方法が本明細書に記載されており、明確に述べるならば用いる 基質［ひまわり，ナタネ，ヒヨコマメ，レンズマメ，ルピナスおよびブドウかす ］ならびに商業名を含む作用させる酵素が記載されている。プロセスは“特製化 された加水分解物”といわれてきた物を得る根拠となる。 本発明の主要な目的は、全ての場合にポリフェノールの除去を伴う基質の調製 を包含することにある。全ての植物性蛋白単離物中に存在する前者（ポリフェノ ール）を除去することが必要である。というのは、上記基質は一般にプロテアー ゼの酵素活性を阻害するため、プロセスの効果的な操作にとって上記の除去が絶 対に必要である。 本発明の第二の重要な目的は、蛋白質に存在するアレルギー性“エピトープ” の加水分解に対して１種以上のプロテアーゼでの処理が抵抗を受けることに基づ いて、加水分解プロセスの最適化を図ることにある。この理由のため、最初の処 理において、特異的な活性がない（１種または）複数種のエンドプロテアーゼで 蛋白質を加水分解して、一旦実用上一定の加水分解度を達成し（基質に対して１ ２〜１５％）、第二の工程において、より特異的なエンドプロテアーゼおよびエ クソプロテアーゼの混合物を一緒に添加して（５０％以上の加水分解度が得られ る）、複数種の加水分解物における苦みフレーバの存在の可能性をなくすだけで なく、アレルギー性“エピトープ”の破壊の可能性が殆ど全体に及ぶようにする 。各基質に用いられる蛋白分解酵素としては、ひまわり蛋白に対してアルカラー ゼ，ケラーゼおよびフレーバ酵素；アブラナに対してＬ−６００およびフレーバ 酵素；ヒヨコマメ，レンズマメおよびルピナス蛋白に対してゴッグレット（gogl et）およびフレーバ酵素；ブドウかす蛋白に対してアルカラーゼおよびカラーゼ である。加水分解物は濃縮され、微細化されて乾燥製品とする。 以下、本発明において用いる上述の蛋白分解酵素の特性および詳細を示す。 アルカラーゼ：より具体的には、アルカラーゼ２.４Ｌはバクテリアのプロテ アーゼであり、非常に効果があって特に全てのタイプの蛋白質の加水分解に対し て効果が発現する。上記酵素は、選別されたバシルス・リシェニホルメス（Baci llus Licheniformes）の菌株から産生され、分子量がほぼ27,300ダルトンのエン ドペプチダーゼである。また、全濃度にわたって水に易可溶性であり、その密度 は１.１８ｇ／ｍｌである。グラム当たり２.４アンソン単位（Ａｕ／ｇ）の活性 を有し、最適なｐＨは８であり、最適な温度は５０〜６０℃である。そして、液 体の形態で入手可能であり、ノボ・ノルディスク・バイオインダストリアル社（ Novo Nordisk Bioindustrial,S.A.）という会社から入手可能である。 フレーバ酵素：より具体的には、フレーバ酵素1,000ＭＧは、アスペルギルス ・オリゼー（Aspergillus oryzae）の発酵により産生され、エンドプロテアーゼ およびエクソペプチダーゼ活性を有する。上記酵素は、エンド−とエクソ−プロ テアーゼの複合体を形成しているため、エンドプロテアーゼが異なる毎に分子量 が異なる。また、水に易可溶性であり、1,000ＬＡＰＵ／ｇの活性を有し、最適 なｐＨは７であり、最適な温度は５０℃である。そして、粒状物の形態で手に入 れることができ、ノボ・ノルディスク・バイオインダストリアル社から入手可能 である。 ケラーゼ：これは微生物の酵素であり、ストレプトミセス・フラディアエ（St reptomyces Fradiae）から得られる。上記酵素は、エンド−とエクソ−ペプチダ ーゼの混合物であり、セリンプロテアーゼ様の挙動を示し、酸素の存在下で安定 である。非毒性であって抗生物質を含まず、バクテリアの混入がない。また、水 に易可溶性であり、アンソン法による活性は１０^-8カタール単位／ｍｇである。 分子量はほぼ20,000ダルトンである。最大活性を示すｐＨは８であり、最適な温 度は５５℃である。そして、粉末の形態で手に入れることができ、コンパニア・ エスパノラ・デ・ラ・ペニシリナ・ワイ・アンチビオチコス社（Compania Espan ola de la Penicilina y Antibioticos,S.a．；CEPA，S.a.）で生産されている 。 Ｌ−６００：これは微生物のプロテアーゼ・セリンである。この酵素は、分子 量がほぼ22,500ダルトンであり、最適なｐＨが1０で最適な温度が６０℃のエン ドープロテアーゼである。また、水に易可溶性であり、660,000ＤＵ／ｍｌ（Del f/ml）の活性を有する。そして、液体の形態で手に入れることができ、ＭＫＣ社 から入手可能である。 上記に従って、農産廃棄物（ひまわり，アブラナ， ブドウかす，ルピナス等 ）からの蛋白質濃縮物および単離物を中規模の設備で調製することにより、本発 明のプロセスを達成することができる。上記蛋白質濃縮物および単離物は、プロ テアーゼの使用により各種タイプの加水分解物を得るための出発点となる。しか も、実用的なレベルで次の物を得ることが可能である。臨床的栄養補給を目的と する分岐したアミノ酸であるグルタミン酸に富む加水分解物；子牛および養豚の 栄養補給を目的とする硫黄原子含有のアミノ酸に富む加水分解物、ならびに子供 の栄養補給を目的とする低アレルギーの加水分解物。 図面の簡単な記述 本明細書に添付した唯一の図面は、本発明の方法の独特な実施の説明図を示す 。該図は、順次正しい調製プロセスを達成すべき各工程および物質の流れを包含 する。 参照番号の意味は次のとおりである。 １．ひまわりのケーキ １０．噴霧器 ２．蛋白質抽出槽 １１．乾燥した単離物 ３．アルカリ性溶液 １２．蛋白質 ４．遠心分離 １３．酵素反応槽 ５．可溶性成分 １４．酵素溶液 ６．可溶性蛋白質 １５．加水分解物 ７．沈殿槽 １６．浄化器 ８．酸溶液 １７．ミクロ／限外濾過 ９．遠心分離 １８．噴霧器 １９．営業用の加水分解物 発明の具体例 本発明を以下の実施例によって更に説明するが、本発明の範囲の限定を意図す るものではない。 該実施例において、加水分解度が５０％以上のひまわり植物性蛋白質の酵素加 水分解物を得るために採用されるプロセスを詳細に記載する。 実施例 脱脂処理したひまわり粉（ＨＧ）の分別がプロセスの最初の工程である。浮遊 ／沈降塔システムによって、リグソセルロース成分（ＦＬＣ），可溶性成分（Ｆ Ｓ）および蛋白質成分（ＦＰ）の分離を行う。水：エタノール（９０：１０）で 洗浄することにより、上記工程で得られる蛋白質成分を処理槽内で概成分に存在 するフェノール類の除去プロセスに付す。この工程が完了すると、蛋白質の可溶 化を行う。後者を実施するために、ポリフェノールが存在しない蛋白質成分をア ルカリ性溶液で酸素含有媒体中に抽出する。この工程では、上部攪拌機，遮断器 ，試薬添加装置，ｐＨおよび温度制御器を備えた抽出槽が使用される。同様に、 浄化用遠心分離器およびデカンタも使用される。 アルカリ性酸素含有媒体中に得られる蛋白抽出物を遠心分離し、上部攪拌機， 酸添加装置およびｐＨ制御器を備えた処理槽内において抽出物が等電点で沈降す る。今までに記載されたプロセスにより、蛋白単離物の調製物が得られ、酵素加 水分解の基質として使用される。 好適な濃縮の単離物をアルカラーゼで加水分解度が１２％になるまで加水分解 した後、ケラーゼおよびフレーバ酵素を添加する。蛋白分解酵素としてエンドペ プチダーゼおよびエクソペプチダーゼを使用する。加水分解度（ＧＨ）をアルダ ー−ニッセン（1986，Elsevier App/.Scc.Publi.）により記載のｐＨスタット法 で測定する。攪拌，水および試薬添加装置ならびにｐＨおよび温度制御器を備え たステンレススチール製の反応器が使用される。 加水分解プロセスが終了すると、浄化フィルタを通過させて懸濁液およびミク ロエマルジョン中の固形物を除去する。その後、限外濾過により分別すると特製 化されたペプチドが得られ、最終的に得られる物質を保存するために乾燥する。 全プロセスにおける物質 初期重量ｋｇ 蛋白質％ 最終物ｋｇ 収率(％) ＨＧ 5,000 ２５ 1,250 １００ ＦＰ 1,500 ５０ 750 ６０ 単離物 650 ９０ 585 ４７ 加水分解物 468 ９５ 445 ３６

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，Ｂ Ｇ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ， ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ (72)発明者 ミラン ロドリグェズ，フランシスコ スペイン国 イー―41012 セビラ，アベ ニダ パドル ガルシア テジェロ，４, インスチチュト ド ラ グラサ（シー. エス．アイ．シー．），デプト ド フィ ジオロジア イ テクノロジア ド プロ ダクトス ベグ エタレス (72)発明者 バウティスタ パロマス，ジュアン スペイン国 イー―41004 セビラ，カル レ サン フェルナンド，ブロマトロジア イ トキシコロジア，デプト ド ビオ クイミカ，ファクルタド ド ファルマシ ア，ユニベルシダド ド セビラ (72)発明者 オリアス ジメネズ，ホセ マヌエル スペイン国 イー―41012 セビラ，アベ ニダ パドル ガルシア テジェロ，４, インスチチュト ド ラ グラサ（シー. エス．アイ．シー．），デプト ド フィ ジオロジア イ テクノロジア ド プロ ダクトス ベグ エタレス

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記の工程ａ）〜ｃ）を包含することを特徴とする加水分解度の高い植物 性ペプトンを得る方法、 ａ）植物性蛋白単離物をポリフェノール除去工程に付し、 ｂ）（Ｉ）約１２〜１５％に殆ど一定した加水分解度が得られるまで、ポリフ ェノールが存在しない蛋白単離物を特異的活性のない１種またはそれ以上の エンドプロテアーゼでの最初の加水分解処理に付し、 (II)５０％またはそれより高い加水分解度に達するまで、上記工程で得られ る加水分解生成物をより特異的なエンドプロテアーゼおよびエクソプロテア ーゼの混合物での第二の加水分解処理に付し、 ｃ）得られる加水分解物を濃縮し、そして噴霧する。 ２．植物性基質が、ひまわり，ナタネ，ヒヨコマメ，レンズマメ，ルピナスお よびブドウかすから選ばれることを特徴とする請求項１記載の方法。 ３．蛋白分解酵素が、アルカラーゼ，ケラーゼ，フレーバ酵素およびＬ−６０ ０から選ばれることを特徴とする請求項１記載の方法。 ４．請求項１〜３のいずれかに記載の方法によって得られる加水分解度の高い 植物性ペプトンまたは植物性加水分解物。 ５．臨床，動物および子供の栄養補給を目的とする滋養製品の製造に使用され る請求項４記載のペプトンまたは植物性加水分解物の使用法。