WO2017110984A1 - 限外ろ過膜を用いたオリゴ糖ペプチドの精製法 - Google Patents

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貴史 大貫
隆宏 宮内
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第一三共株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a method for simply and efficiently purifying a sialylglycopeptide contained in an egg yolk component using cross-flow ultrafiltration.
  • Sialylglycopeptide (Sialyl GlycoPeptide: hereinafter referred to as “SGP”), which is an oligosaccharide peptide contained in chicken egg yolk, is useful as a raw material for pharmaceuticals because the contained oligosaccharide chain is human.
  • Patent Document 1 As a method for purifying SGP, in Patent Document 1 and the like, a plurality of operations of precipitating with a water-soluble organic solvent such as ethanol to the extracted solution after a plurality of extraction operations from a defatted egg yolk-containing material into an aqueous solution are performed.
  • a method is known in which the obtained precipitate is dissolved in water, dissolved in water, adsorbed onto an ODS-based reverse phase resin (a kind of resin for reverse phase partition chromatography) and eluted.
  • Patent Document 2 the technique known before Patent Document 1 requires a plurality of concentrated desalting operations, is insufficient in terms of purity and yield (Patent Document 2), and is not suitable for mass purification. This was due to purification by column chromatography (Non-patent Document 1).
  • Patent Document 3 discloses a method for purifying SGP using removal of unnecessary proteins in a solution by mixing and separating a protein removal agent such as synthetic silica gel into an egg yolk component solution.
  • Ultrafiltration is a method for concentrating or removing components in a solution by permeating the solution through a membrane.
  • Each ultrafiltration membrane has its own exclusion limit molecular weight.
  • concentration solution molecules larger than the limit exclusion molecular weight of the membrane are blocked by the membrane, so that the pre-permeation solution (hereinafter “concentrated solution”) is blocked. ))
  • Concentrated solution a pre-permeation solution
  • Ultrafiltration is a wide range of fields such as water purification, impurity removal and sterilization in the production of beverages, foods, pharmaceuticals, etc., dialysis in medicine, separation and concentration in protein and enzyme production, and separation and concentration of samples in research fields.
  • the inventors of the present invention have made extensive studies on an efficient purification method of SGP, and an aqueous solution of egg yolk components is used in combination with a primary membrane that can permeate SGP and a secondary membrane that cannot permeate SGP.
  • the present inventors completed the present invention by further finding out that high-molecular-weight and low-molecular-weight impurities can be removed by using the ultrafiltration system and that efficient purification of SGP can be achieved.
  • a peptide degradation product of SGP containing the same sugar chain as sialylglycopeptide (SGP) or SGP by crossflow ultrafiltration characterized by comprising the following steps A and B (hereinafter collectively) A purification method of “SGP substance”, Step A: A step of obtaining a permeated solution by cross-flow ultrafiltration using a primary membrane that allows the SGP material to permeate the aqueous solution containing the SGP material and does not allow proteinaceous impurities to pass through, and Step B: A step of obtaining a concentrate from the permeated solution of Step A by a cross-flow ultrafiltration process using a secondary membrane that does not allow SGP substances to permeate.
  • the purification method according to (1) wherein the SGP substance is SGP, and the aqueous solution containing the SGP substance in Step A is an aqueous solution containing an egg yolk component of birds.
  • the purification method according to (2) wherein the aqueous solution containing a bird's egg yolk component is an aqueous solution of defatted egg yolk powder.
  • the primary membrane is an ultrafiltration membrane with an exclusion limit molecular weight of 10 k to 50 kDa
  • the secondary membrane has an exclusion limit molecular weight of 10 kDa or less, and has an exclusion limit molecular weight smaller than that of the primary membrane.
  • the purification method of (2) which is an outer filtration membrane.
  • the primary membrane is a cellulose ultrafiltration membrane having an exclusion limit molecular weight of 30 to 50 kDa, or a PES ultrafiltration membrane having an exclusion limit molecular weight of 10 to 30 KDa, and the secondary membrane is 10 kDa or less.
  • the purification method according to (4) which is a cellulose ultrafiltration membrane having an exclusion limit molecular weight or a PES ultrafiltration membrane having an exclusion limit molecular weight of 10 KDa or less.
  • the SGP substance is a peptide degradation product of SGP containing the same sugar chain as SGP, and the aqueous solution containing the SGP substance in Step A is a reaction solution obtained by treating purified SGP with peptidase.
  • the purification method of (1) is a cellulose ultrafiltration membrane having an exclusion limit molecular weight of 30 to 50 kDa, or a PES ultrafiltration membrane having an exclusion limit molecular weight of 10 to 30 KDa, and the secondary membrane is 10 kDa or less.
  • the purification method according to (1) further including a step of recovering a fraction containing the SGP substance by column chromatography using a resin capable of separating the SGP substance from the concentrated liquid obtained in the step B.
  • the resin capable of separating the SGP substance is a reverse phase resin, a normal phase resin, an ion exchange resin, a gel filtration resin, or a synthetic adsorption resin.
  • the method of the present invention can easily remove high molecular weight impurities such as proteins and low molecular weight impurities such as amino acids from egg yolk components without adding special additives.
  • the cross-flow ultrafiltration system can be automated, it is possible to efficiently purify SGP in a short time and with little effort. Further, in the ultrafiltration step, the solution other than the target concentrated purified liquid (recovered external liquid) is returned to the starting liquid again, whereby the loss of SGP can be reduced and the yield can be improved.
  • the membrane used can be washed and reused repeatedly, there are few consumables and the running cost can be kept low.
  • FIG. 1 is a chart of HPLC measurement results of SGP standard products.
  • FIG. 2 is a chart of LC / MS measurement results of SGP standard products.
  • FIG. 3 is a chart of 1 H-NMR measurement results of SGP standard products.
  • FIG. 4 is a chart of the HPLC measurement results of the glycopeptide purified in Example 1.
  • FIG. 5 is a chart of LC / MS measurement results of the glycopeptide purified in Example 1.
  • 6 is a chart of 1 H-NMR measurement results of the glycopeptide purified in Example 1.
  • FIG. FIG. 7 is a chart of HPLC measurement results of the glycopeptide purified in Example 2.
  • FIG. 8 is a chart of LC / MS measurement results of the glycopeptide purified in Example 2.
  • FIG. 10 shows the relative protein concentration in each treatment solution when cross-flow type ultrafiltration treatment using membranes of each exclusion limit molecular weight in regenerated cellulose-based UF membranes Vivaflow 50R and Pellicon XL 50 (Ultracel). It is a graph showing a bar graph) and a SGP recovery rate (a line graph). The vertical axis shows the relative protein concentration (%) and the SGP recovery rate (%), and the ratio (%) of both. The horizontal axis represents each exclusion limit molecular weight in each UF membrane and the type of each treatment liquid (A: permeate, B: DF permeate, C: DF concentrate).
  • A permeate
  • B DF permeate
  • C DF concentrate
  • FIG. 11 shows the relative protein concentration (bar graph) in each treatment solution when cross-flow type ultrafiltration treatment using membranes of each exclusion limit molecular weight in Peva-based UF membranes Vivaflow 50 and Pellicon XL 50 (Biomax). ) And the SGP recovery rate (line graph). The vertical axis shows the relative protein concentration (%) and the SGP recovery rate (%), and the ratio (%) of both. The horizontal axis represents each exclusion limit molecular weight in each UF membrane and the type of each treatment liquid (A: permeate, B: DF permeate, C: DF concentrate).
  • A permeate
  • B DF permeate
  • C DF concentrate
  • FIG. 12 shows the relative protein concentration (bar graph) and SGP recovery in the cross-flow type ultrafiltration treatment using membranes of each exclusion limit molecular weight in Kick Start and Minimate, which are PES-based UF membranes. It is a graph showing a rate (line graph). The vertical axis shows the relative protein concentration (%) and the SGP recovery rate (%), and the ratio (%) of both. The horizontal axis represents each exclusion limit molecular weight in each UF membrane and the type of each treatment liquid (A: permeate, B: DF permeate, C: DF concentrate).
  • A permeate
  • B DF permeate
  • C DF concentrate
  • FIG. 13 shows relative amounts of various amino acids in each treatment solution when cross-flow type ultrafiltration treatment using membranes of each exclusion limit molecular weight in regenerated cellulose-based UF membranes Vivaflow 50R and Pellicon XL 50 (Ultracel). It is a graph showing concentration (black bar: phenylalanine, white bar: tryptophan, hatched bar: tyrosine). The vertical axis shows the relative amino acid concentration (%). The horizontal axis represents each exclusion limit molecular weight in each UF membrane and the type of each treatment liquid (A: permeate, B: DF permeate, C: DF concentrate).
  • A permeate
  • B DF permeate
  • C DF concentrate
  • FIG. 14 shows the relative concentrations of various amino acids in each treatment solution when cross-flow type ultrafiltration treatment using membranes of each exclusion limit molecular weight is performed on Vivaflow 50 and Pellicon XL 50 (Biomax), which are PES-based UF membranes. It is a graph showing (black bar: phenylalanine, white bar: tryptophan, hatched bar: tyrosine). The vertical axis shows the relative amino acid concentration (%). The horizontal axis represents each exclusion limit molecular weight in each UF membrane and the type of each treatment liquid (A: permeate, B: DF permeate, C: DF concentrate).
  • A permeate
  • B DF permeate
  • C DF concentrate
  • the present invention comprises the following steps A and B, a method for purifying an SGP material by cross-flow ultrafiltration, Step A: A step of obtaining a permeated solution by cross-flow ultrafiltration using a primary membrane that allows the SGP material to permeate the aqueous solution containing the SGP material and does not allow proteinaceous impurities to pass through, and Step B: A step of obtaining a concentrate from the permeated solution of Step A by a cross-flow ultrafiltration process using a secondary membrane that does not allow SGP substances to permeate.
  • Step A A step of obtaining a permeated solution by cross-flow ultrafiltration using a primary membrane that allows the SGP material to permeate the aqueous solution containing the SGP material and does not allow proteinaceous impurities to pass through
  • Step B A step of obtaining a concentrate from the permeated solution of Step A by a cross-flow ultrafiltration process using a secondary membrane that does not allow SGP substances to permeate.
  • SGP substance means a peptide degradation product of SGP containing sialylglycopeptide (SGP) or the same sugar chain as SGP.
  • sialyl glycopeptide Sialyl GlycoPeptide: hereinafter referred to as“ SGP ”: means reduction of sialylglycan consisting of 11 sugars represented by the following structural formula (I) and sequence formula (II): An oligosaccharide in which the 1-position carbon of GlcNAc at the terminal and the nitrogen atom derived from the side chain amide group at the 4-position Asn of Lys-Val-Ala-Asn-Lys-Thr- (SEQ ID NO: 1) are ⁇ -N glycosidic bonded It is a glycopeptide.
  • SGP can be purified from avian egg yolk, but purified SGP is commercially available and can be purchased.
  • HPLC chart, LC / MS spectrum, and 1 H-NMR spectrum (measured under the conditions described in Example 1) of SGP manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. are as shown in FIG. 1, FIG. 2, and FIG. 3, respectively. Therefore, it is possible to identify that the obtained glycopeptide is SGP.
  • the “SGP product” is a product containing SGP as one of main components, such as research reagents, industrial raw materials, pharmaceutical additives, food additives, and the like.
  • the SGP purified by the method of the present invention is processed into a state (freeze-dried powder, solution, etc.) according to the product form, enclosed in an appropriate container, packaged, and used as a product. Manufactured. Since SGP obtained by the purification method of the present invention has high purity, it is also useful as a raw material for such SGP products.
  • SGP can be detected or quantified by HPLC or the like using a resin capable of separating SGP.
  • HPLC conditions include the following conditions.
  • HPLC 1260 Infinity LC (manufactured by Agilent Technologies, Inc.) Column: Poroshell 120 EC-C18 2.7 ⁇ m ⁇ 3.0 ⁇ 50 mm (manufactured by Agilent Technologies, Inc.), guard column: Poroshell 120 EC-C18 2.7 ⁇ m ⁇ 3.0 ⁇ 5 mm (manufactured by Agilent Technologies, Inc.) (Or, column: Inertsil ODS-3 3 ⁇ m ⁇ 3.0 ⁇ 50 mm (manufactured by GL Sciences)) Column temperature: 40 ° C Mobile phase A: H 2 O solution containing 0.1% HCOOH (v / v) Mobile phase B: MeCN solution containing 0.1% HCOOH (v / v) Gradient (mobile phase B%): 0% (0 minutes), 10% (5 minutes), 30% (7 minutes), 30% (8 minutes) Flow rate: 0.6 ml / min Detection wavelength: 210 nm [HPLC analysis: 1260 Infinity LC (manu
  • SGP contained in the solution can be calculated as a peak area value belonging to SGP in the obtained HPLC chart by subjecting the target solution to the above-mentioned HPLC.
  • recovery rate (%) (SGP peak area value of target solution ⁇ target solution amount) / (SGP peak area value of starting material solution ⁇ starting material solution amount) ⁇ 100
  • the purity of the test SGP can be calculated as a relative purity with the purity of the standard SGP as 100%.
  • the standard product SGP for example, a commercially available SGP manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. can be used.
  • a predetermined amount of an aqueous solvent such as water is added to a precisely weighed test SGP, and a completely dissolved test SGP solution is subjected to HPLC measurement under the above conditions, and in the obtained HPLC chart The peak area value of the test SGP is measured.
  • the same operation is performed for the standard SGP, and after preparing a standard SGP solution having the same concentration as the SGP, HPLC measurement under the same conditions is performed, and the purity of the test SGP is calculated by the following formula: Can do.
  • Test SGP purity (%) (Test SGP peak area value / standard product SGP peak area value) ⁇ 100
  • the “SG degradation product” means the same sugar chain structure as that of SGP among the degradation products in which the peptide part of SEQ ID NO: 1 contained in the above-mentioned SGP is decomposed and purified by a peptide degrading enzyme treatment. It means the substance that you have.
  • the SG degradation product of the present invention includes SG-Asn (formula (III) shown below) in which the peptide part contained in SGP obtained by actinase treatment of SGP is deleted leaving asparagine (Asn) to which a sugar chain is bound. )) And the like.
  • the starting material used in the purification method of the present invention is not particularly limited as long as it is an aqueous solution containing an SGP substance, and various materials can be used.
  • the SGP substance is an SG degradation product, it is preferable to use a reaction solution obtained by treating purified SGP with a peptide degrading enzyme. Therefore, below, the purification method of SGP is explained in full detail.
  • SGP is known to be contained in the egg yolk of avian eggs, and since the sugar chain structure contained is human, it is difficult for humans to cause allergic reactions even if ingested or taken.
  • the “aqueous solution containing a bird's egg yolk component” means a solution obtained by mixing the egg yolk component of a bird's egg with an aqueous solvent.
  • the origin of the egg is not particularly limited as long as it is a bird, and examples thereof include chickens, quails, pigeons, ostriches, and crows, but chicken-derived eggs are preferred.
  • the egg yolk is separated from the whole egg white from the whole egg as it is, dried as dried egg yolk, degreased defatted egg yolk, or powdered egg yolk powder or defatted egg yolk powder of the present invention Can be used in the method. Egg yolk powder, defatted egg yolk powder, etc.
  • aqueous solvents can be used as long as they are water-based aqueous solvents that do not substantially contain components that denature proteins. Preferably it is water.
  • the egg yolk component-containing solution used in the ultrafiltration step can be used as a solution part in which egg yolk components such as egg yolk, defatted egg yolk, and their powder are mixed with an aqueous solvent to separate insoluble matters.
  • Ultrafiltration is a method for concentrating or removing components in a solution by applying pressure to the solution and permeating through an ultrafiltration membrane.
  • the ultrafiltration membrane also referred to as “UF membrane”
  • an exclusion limit molecular weight is individually set, and in the components in the solution, molecules larger than the limit exclusion molecular weight of the membrane are blocked by the membrane. It is concentrated in a pre-permeation solution (hereinafter “concentrated solution”). On the other hand, such a polymer component is removed from the permeate.
  • concentration solution a pre-permeation solution
  • the present invention is characterized by efficiently purifying components belonging to an intermediate molecular weight region by employing a combination of membranes having different exclusion limit molecular weights in ultrafiltration.
  • the dead-end method since the membrane is installed perpendicular to the pressure against the liquid, that is, the direction of the liquid flow, the initial filtration efficiency is high, but when processing a solution with many impurities, particles are deposited on the membrane, Clogging is likely to occur and the filtration efficiency is reduced.
  • the cross-flow method has a feature that the film is installed in parallel with the direction of the liquid flow, so that the surface of the film is washed with the liquid flow so that clogging due to accumulation of particles on the film is difficult to occur.
  • the “primary membrane” is an ultrafiltration membrane capable of transmitting SGP. Since the primary film has a role of removing impurities larger than SGP from the permeate, it is preferable to employ a film having a molecular weight as low as possible out of the films that permeate SGP.
  • the “secondary membrane” is an ultrafiltration membrane that cannot transmit SGP. Since the secondary film has a role of removing impurities smaller than SGP from the concentrated liquid, it is preferable to employ a film having an exclusion limit molecular weight as high as possible among films through which SGP cannot permeate.
  • the shape of the ultrafiltration membrane includes a flat membrane type and a hollow fiber type, and is not particularly limited, but is preferably a flat membrane type. Examples of the material for the ultrafiltration membrane include regenerated cellulose (RC), polyethersulfone (PES), polysulfone (PS), polyacrylonitrile (PAN), and cellulose acetate (CA).
  • the separation behavior of SGP may differ depending on the material, but it is possible to select an appropriate membrane by confirming the behavior of standard SGP products for multiple membranes in advance. it can.
  • the exclusion limit molecular weight of an ultrafiltration membrane is defined by a filtration test using a standard substance, but the type of standard substance, test conditions, and the like vary depending on the manufacturer.
  • the standard substance is a kind of substance that is significantly different from the SGP
  • the SGP may exhibit a separation behavior different from that of the standard substance. Therefore, the actual SGP test result may differ from the set exclusion limit molecular weight.
  • Such separation behavior is also affected by the material of the membrane.
  • the value of the exclusion molecular weight of the membrane is taken as a guide, and an appropriate membrane can be selected by confirming the separation behavior of SGP with respect to the membrane to be used before the actual purification operation.
  • the primary membrane and the secondary membrane used in the present invention can be selected by the following method based on the separation behavior of SGP.
  • the target aqueous solution of SGP is supplied to the ultrafiltration device to be used, permeated through various ultrafiltration membranes, and the distribution of SGP in each of the concentrated solution and the permeate is confirmed, whereby the SGP for the membrane is obtained. Confirm the separation behavior.
  • a film through which SGP permeates (a film having the lowest exclusion limit molecular weight is preferable in such a film) is selected as a primary film, and a film through which SGP cannot permeate (the highest exclusion limit in such a film).
  • a membrane having a molecular weight is preferred) can be selected as the secondary membrane.
  • the primary membrane is a membrane that is permeable to SGP, preferably a membrane that is permeable to SGP and is less permeable to polymer components such as proteins, and more preferably a membrane having an exclusion limit molecular weight of 10 to 50 kDa. Can be adopted.
  • a regenerated cellulose membrane has an exclusion limit molecular weight of 30 to 50 kDa, more preferably 30 kDa.
  • a film of 10 to 30 kDa is preferable.
  • the secondary membrane is a membrane that cannot permeate SGP, preferably a membrane that cannot permeate SGP and that can penetrate many low-molecular components such as amino acids, and more preferably an exclusion limit molecular weight of 10 kDa or less.
  • the film can be used. In this case, if it is a regenerated cellulose film, its exclusion limit molecular weight is 10 kDa or less, preferably 10 or 5 kDa.
  • a PES film In the case of a PES film, it is 10 kDa or less, preferably 5 kDa.
  • a system constructed by attaching devices such as pumps, pressure gauges, ultrafiltration membranes, etc., to the flow passages such as hoses and pipes may be adopted.
  • a cross-flow ultrafiltration device can also be used.
  • SARTOFLOW Slice 200 Benchtop Crossflow System SARTOFLOW Advanced Lu
  • TAFus AX s TA System TAF Af s System
  • QuixStand System UniFlux 10, UniFlux 30, UniFlux 120, UniFlux 400 (manufactured by GE Healthcare UK Ltd.)
  • Labscale TFF System Coem 1 TFF System Merck KGaA Co., Ltd.
  • Minimeito TFF System Minim III TFF System, (manufactured by PALL Co.
  • Vivaflow series 50R series: regenerated cellulose UF membrane, 50 series: PES UF membrane
  • Pellicon series Ultracel: regenerated cellulose UF membrane, Biomax: PES UF membrane (Merck KGaA)
  • Kick Start series PES UF membrane, GE Healthcare UK Ltd.
  • Minimate series PES UF membrane, PALL Co
  • Examples of the ultrafiltration membrane using a dedicated holder include the Sartocon Slice 200 cassette, the Sartocon Slice cassette, the Sartocon cassette, the Sartocube (Hydrostart: regenerated cellulose UF membrane, PES UF membrane) (manufactured by Sartorius AG), Pellicon 2 cassette P (Ultracel: regenerated cellulose-based UF membrane, Biomax: PES-based UF membrane) (manufactured by Merck KGaA), T-Series TFF cassette (Delta: regenerated cellulose-based UF membrane, Omega: PES-based UF membrane) (manufactured by PALL Co.) ), Kick Lab Packet, Kick Lab cassette, Kick Lab SCU cassette, Kick Flow cassette (PES) Mention may be made of the UF membrane) (GE Healthcare UK, Ltd.
  • ultrafiltration membranes There are various types of ultrafiltration membranes depending on the material, shape, exclusion limit molecular weight, etc.In the present invention, depending on the type and state of the starting liquid, the type of ultrafiltration device to be applied, etc. Appropriate ones can be selected.
  • Ultrafiltration operation In the method of the present invention, in the ultrafiltration step, the starting liquid is permeated through the primary membrane, the permeated liquid is permeated through the secondary membrane, and the concentrated liquid is recovered as a concentrated purified liquid of the target SGP substance. It is characterized by that.
  • a preliminary test is performed using a solution of the target SGP substance, and the transmembrane pressure (TMP), the permeation flux (Flux), etc. are obtained, and the operating conditions are optimized from the correlation. be able to. Further, it is possible to scale up by increasing the film area by performing optimization.
  • TMP transmembrane pressure
  • Flux permeation flux
  • the same conditions as those used in the purification process of SGP may be adopted. It can be selected appropriately.
  • the operation is preferably in the range of 0.01 MPa to 0.5 MPa, more preferably in the range of 0.05 MPa to 0.3 MPa.
  • the operation is preferably in the range of 0.01 MPa to 0.5 MPa, more preferably in the range of 0.05 MPa to 0.3 MPa.
  • the temperature is preferably 4 ° C to 60 ° C, more preferably 15 ° C to 40 ° C.
  • the concentrated liquid of the primary membrane and the permeated liquid of the secondary membrane are not normally recovered, but such recovered external liquid may also contain SGP.
  • SGP contained in the recovered external liquid can be recovered, and this is repeated as necessary. The yield of can be improved.
  • SGP can be further purified from the concentrated and purified liquid obtained through the ultrafiltration step using various column fillers.
  • Examples of column fillers used for such purification include synthetic adsorption resins, reverse phase resins, normal phase resins, ion exchange resins, gel filtration resins, and the like.
  • the reverse phase resin is a resin in which a hydrophobic functional group such as a butyl group (C4), an octyl group (C8), an octadecyl group (C18), a triacontyl group (C30), or a phenyl group is added to a base material of silica gel.
  • Synthetic adsorption resin is a filler made of porous cross-linked polymer.
  • Synthetic adsorption resin is a filler made of porous cross-linked polymer.
  • styrene-divinylbenzene synthetic adsorbent styrene-divinylbenzene modified synthetic adsorption resin, methacrylic synthetic adsorption resin, phenol System synthetic adsorption resin and the like. Since fillers such as ODS-based reverse phase resins known to be usable for SGP purification are based on silica gel, they cannot be washed with an alkaline solution.
  • the resin can be regenerated by washing with an alkaline solution in addition to washing with an organic solvent, so that impurities can be sufficiently removed. It is possible to reuse the synthetic adsorption resin.
  • a synthetic adsorption resin various synthetic adsorption resins can be adopted as long as they can adsorb SGP, but styrene-divinylbenzene synthetic adsorption resin is preferable, and styrene-divinyl is more preferable.
  • Benzene-based modified synthetic adsorption resin can be adopted as long as they can adsorb SGP, but styrene-divinylbenzene synthetic adsorption resin is preferable, and styrene-divinyl is more preferable.
  • Specific products include SEPABEADS SP207SS (Mitsubishi Chemical Corporation).
  • SGP can be purified by eluting with a mobile phase according to the separation mode of chromatography and collecting the fraction containing SGP in the eluate.
  • the conditions of the solution after ultrafiltration may be appropriately adjusted in accordance with the column filler to be used and the chromatography mode.
  • a filter aid such as celite is appropriately mixed with the solution, and only the solution portion is recovered.
  • the SGP contained in the elution fraction can be monitored under the above-mentioned HPLC conditions. If the elution is performed under the same conditions as before, the elution fraction of SGP can be specified from the elution time.
  • Such purification conditions can be set as appropriate according to the type and properties of the column packing employed.
  • the concentrated purified solution is allowed to permeate through a column packed with SEPABEADS SP207SS, the column is washed with water, and then eluted with a 2% acetone water concentration gradient from water. it can.
  • the obtained purified SGP solution may be stored frozen as it is, but may also be stored after concentration or freeze-drying as necessary.
  • Example 1 Purification of SGP using ultrafiltration membrane-1> [Primary filtration treatment]
  • Hydrosart registered trademark
  • Sartconcon Slice Casset inclusion limit molecular weight: 30K, membrane area: 0.1 m 2 , material: regenerated cellulose membrane, manufactured by Sartorius AG
  • membrane holder Used in a cross flow filtration method under the condition of a transmembrane pressure difference (TMP) of about 0.05 MPa using a liquid feed pump (Liquiport NE 1.300, manufactured by KNF).
  • TMP transmembrane pressure difference
  • the permeate 2 was added to the concentrate 3 obtained, and the secondary filtration was performed again with good stirring to obtain 1.5 L of the permeate and 150 mL of the concentrate (concentrate 4).
  • the permeate 3 was added to the concentrate 4 thus obtained, and the secondary filtration treatment was performed again with good stirring to obtain 2 L of the permeate and 50 mL of the concentrate (concentrate 5).
  • To the concentrated solution 5 thus obtained 1.5 L of water was added, and the secondary filtration treatment was performed again with good stirring.
  • 3 L of a permeate was finally obtained.
  • glycopeptide fraction obtained by washing the inside of the cross flow path with water was added to the concentrated solution to obtain 720 mL (concentrated solution 6).
  • the concentrated solution 6 was freeze-dried to obtain 12 g of a glycopeptide fraction.
  • the obtained glycopeptide fraction and SGP standard product (SGP manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) were subjected to 1 H-NMR measurement, LC / MS measurement and HPLC analysis under the following conditions.
  • the measurement results of the standard products by HPLC, LC / MS and 1 H-NMR are shown in FIG. 1, FIG. 2 and FIG. 3, respectively.
  • the measurement results of the obtained glycopeptide fraction by HPLC, LC / MS and 1 H-NMR are shown in FIGS. 4, 5 and 6, respectively.
  • the obtained glycopeptide was compared with the standard product by 1 H-NMR measurement and LC / MS measurement, the same mass spectrum and 1 H-NMR spectrum as the standard product were obtained. It was confirmed that SGP represented by Formula (II) was included. Moreover, in the result of HPLC, the purity of the obtained SGP was 47% by the relative area value ratio of the peak attributed to SGP between the obtained SGP and the standard product.
  • HPLC 1260 Infinity LC (manufactured by Agilent Technologies, Inc.) Column: Poroshell 120 EC-C18 2.7 ⁇ m ⁇ 3.0 ⁇ 50 mm (manufactured by Agilent Technologies, Inc.), guard column: Poroshell 120 EC-C18 2.7 ⁇ m ⁇ 3.0 ⁇ 5 mm (manufactured by Agilent Technologies, Inc.) Column temperature: 40 ° C Mobile phase A: H 2 O solution containing 0.1% HCOOH (v / v) Mobile phase B: MeCN solution containing 0.1% HCOOH (v / v) Gradient (mobile phase B%): 0% (0 minutes), 10% (5 minutes), 30% (7 minutes), 30% (8 minutes) Flow rate: 0.6 ml / min Detection wavelength: 210 nm.
  • the concentrated solution 8 obtained above was applied to the column at a flow rate of 250 mL / min, washed with 50 L of water at a flow rate of 1 L / min, developed with a 2% aqueous acetone (v / v) flow rate of 1 L / min, and eluted.
  • Fraction 1 was fractionated every 5 L as elution fractions 2-7 (elution fractions 1-7).
  • the elution fractions 4 to 6 were combined and lyophilized to obtain 29.7 g of glycopeptide.
  • the measurement results of the obtained glycopeptide by HPLC, LC / MS and 1 H-NMR are shown in FIGS. 7, 8 and 9, respectively.
  • the obtained glycopeptide has a mass spectrum and 1 H-NMR spectrum similar to those of the standard product by comparison with data of the standard product (FIG. 1, FIG. 2 and FIG. 3) by 1 H-NMR measurement and LC / MS measurement. From the obtained results, it was confirmed to be SGP represented by the above formulas (I) and (II). Moreover, in the result of HPLC, the purity of the obtained SGP was 100% due to the relative area value ratio of the peak attributed to SGP between the obtained SGP and the standard product.
  • Vivaflow 50R used exclusion molecular weights 5K, 10K, 30K, 100K (Sartorius AG), Pellicon XL 50 (Ultracel) series 5K, 10K, 30K (Merck KGaA). .
  • Vivaflow50 series is 5K, 10K, 30K, 50K, 100K (manufactured by Sartorius AG), Pellicon XL 50 (Biomax) series is 5K, 10K, 30K, 50K (manufactured by Merck KGaA), Kvick Start series 5K, 10K, 30K, 50K (manufactured by GE Healthcare UK Ltd.), and the Minimate series used 5K, 10K, 30K, 50K (manufactured by PALL Co.).
  • the Vivaflow 50R series was operated at a flow acceleration of 200 mL / min, the Vivaflow 50 series was operated at a flow acceleration of 50 mL / min, and the other ultrafiltration membranes were operated at a flow acceleration of 40 mL / min to obtain 160 mL of permeate and 40 mL of concentrate ( Permeate and concentrate).
  • diafiltration DF was performed under the condition of transmembrane pressure difference (TMP) 0.1 MPa while continuously adding 200 mL of water to the concentrate.
  • the Vivaflow 50R series was operated at a flow acceleration of 200 mL / min, the Vivaflow 50 series was operated at a flow acceleration of 50 mL / min, and the other ultrafiltration membranes were operated at a flow acceleration of 40 mL / min to obtain 200 mL of permeate and 40 mL of concentrate ( DF permeate and DF concentrate).
  • the measurement result of protein content and the measurement result of SGP recovery are shown in FIG. 10 (regenerated cellulose UF membrane), FIG. 11 and FIG. 12 (PES UF membrane).
  • the measurement result of amino acid content is shown in FIG. 13 (regenerated cellulose UF membrane), FIG. 14 and FIG. 15 (PES UF membrane).
  • the SGP recovery rate in the treatment solution is high in the DF concentrate (C) in the 5K and 10K membranes when treated with the Vivaflow 50R series membrane, and the permeate (A) and the DF permeate in 30K and 100K. (B) was high.
  • the SGP recovery rate in the treatment solution is high in the DF concentrated solution (C) in the 5K membrane, and in the 10K and 30K membranes, the permeate (A) and the DF permeate (B ) was high.
  • the result of having measured the amino acid content in each process liquid by said UF membrane is shown in FIG. 13 (regenerated cellulose UF membrane).
  • the protein concentration in the treatment solution is high in DF concentrate (C) for 5K, 10K and 30K membranes, and permeate (A) and DF permeation for 50K and 100K membranes when treated with Vivaflow 50 series membranes. It was high with the liquid (B).
  • DF concentrate (C) for 5K, 10K and 30K membranes
  • A permeate
  • DF permeation for 50K and 100K membranes when treated with Vivaflow 50 series membranes. It was high with the liquid (B).
  • Pellicon XL 50 (Biomax) series membranes the protein concentration in the treated solution was higher in the DF concentrate (C) in the 5K, 10K, 30K and 50K membranes.
  • the protein concentration in the treatment solution was higher in DF concentrate (C) in 5K, 10K, 30K and 50K membranes.
  • the protein concentration in the treatment solution is higher in the DF concentrate (C) in the 5K and 10K membranes, and in the 30K and 50K membranes, the DF concentrate (C) and permeate ( A) and DF permeate (B).
  • the DF concentrate (C) is high in the 5K membrane, and the permeate (A) in the 10K, 30K, 50K, and 100K membranes.
  • DF permeate (B) When treated with a Pellicon XL 50 (Biomax) series membrane, the SGP recovery rate in the treated solution is DF concentrate (C), permeate (A), and DF permeate (B) for the 5K membrane, respectively.
  • the permeated liquid (A) and the DF permeated liquid (B) were high.
  • the SGP recovery rate in the treatment solution is high for DF concentrate (C) for 5K membranes, DF concentrate (C) for permeation for 10K, 30K and 50K membranes. It was contained in each of the liquid (A) and the DF permeate (B).
  • the SGP recovery rate in the treatment solution is included in each of the DF concentrate (C), permeate (A), and DF permeate (B) in the 5K and 10K membranes, In the 30K and 50K membranes, the permeate (A) and DF permeate (B) were higher.
  • the result of having measured the amino acid content in each process liquid by said UF membrane is shown to FIG.

Abstract

本発明は、ＳＧＰ物質を効率よく、簡便に精製することを目的とし、ＳＧＰ物質を含有する水溶液を、ＳＧＰ物質を透過させ、且つ、タンパク性不純物が透過しない１次膜を用いたクロスフロー方式の限外ろ過処理により透過液を得る工程（工程A）、及び、 工程Ｂ：工程Ａの透過液を、ＳＧＰ物質が透過せず、且つ、低分子不純物が透過する２次膜を用いたクロスフロー方式の限外ろ過処理により濃縮液を得る工程（工程Ｂ）、を含むことを特徴とする、クロスフロー方式限外ろ過によるＳＧＰ物質の精製方法などを提供する。

Description

限外ろ過膜を用いたオリゴ糖ペプチドの精製法
　本発明は、卵黄成分に含まれるシアリルグリコペプチドを、クロスフロー方式の限外ろ過を利用して、簡便且つ効率的に精製する方法に関する。
　ニワトリの卵黄に含まれるオリゴ糖ペプチドであるシアリルグリコペプチド（Ｓｉａｌｙｌ　ＧｌｙｃｏＰｅｐｔｉｄｅ：以下、「ＳＧＰ」という）は、含まれるオリゴ糖鎖がヒト型であるため、医薬品の原料として有用である。
　ＳＧＰの精製方法としては、特許文献１等において、ニワトリの脱脂卵黄含有物から、複数回の水性溶液への抽出操作に次いで、当該抽出液に対するエタノール等の水溶性有機溶媒により沈殿させる操作を複数回行い、得られた沈殿を水に溶解して、ＯＤＳ系逆相樹脂（逆相分配クロマトグラフィー用樹脂の一種）に吸着させ、溶出する方法が知られていた。
　また、特許文献１以前に知られていた技術は、複数の濃縮脱塩操作を必要とし、且つ純度や収率の点で不十分であり（特許文献２）、また、大量精製には不向きなカラムクロマトグラフィーによる精製（非特許文献１）によるものであった。
　特許文献３は、合成シリカゲルのような除タンパク剤を卵黄成分溶液に混合させ、分離することで、溶液中の不要なタンパク質を除去することを利用したＳＧＰの精製方法を開示している。
　限外ろ過（Ｕｌｔｒａ　Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）は、溶液を膜に透過させることによって、溶液中の成分を濃縮、又は、除去するための方法である。限外ろ過膜には、個別に排除限界分子量が設定されており、溶液中の成分中、膜の限界排除分子量よりも大きな分子は膜に阻止されることで透過前液（以下、「濃縮液」）中に濃縮され、透過液からはこのような分子が除去される。限外ろ過は、水の浄化、飲料、食品、医薬品等の製造における不純物除去及び除菌、医療における透析、タンパク質や酵素の生産における分離、濃縮、研究分野におけるサンプルの分離・濃縮など、幅広い分野で活用されているが、ＳＧＰの精製に用いられた報告は無い。
国際特許公開公報　WO2011/027868 国際特許公開公報　WO96/02255号 国際特許公開公報　WO2014/208742号
Akira Seko, etal., Biochimica et BiophysicaActa, (1997), Vol. 1335, p.23-32
　従来知られていた方法で、高純度のＳＧＰを工業スケールで精製するには、有機溶媒を用いた抽出や添加物の添加・分離といった操作が必要であったため、多くの時間と労力が必要であった。
　本発明者らは、ＳＧＰの効率的な精製方法について、鋭意検討を重ね、卵黄成分の水溶液を、ＳＧＰが透過可能な１次膜とＳＧＰが透過できない２次膜を組み合わせて用いたクロスフロー方式の限外ろ過システムにより、高分子量と低分子量の不純物を除去し、ＳＧＰの効率的な精製を達成できることを見出し、さらに検討を重ねることで本発明を完成した。
　本発明は、以下の発明を提供する。
（１）　以下の工程Ａ及びＢを含むことを特徴とする、クロスフロー方式限外ろ過によるシアリルグリコペプチド（ＳＧＰ）又はＳＧＰと同一の糖鎖を含む、ＳＧＰのペプチド分解物（以下、合わせて「ＳＧＰ物質」という）の精製方法、
工程Ａ：ＳＧＰ物質を含有する水溶液を、ＳＧＰ物質を透過させ、且つ、タンパク性不純物が透過しない１次膜を用いたクロスフロー方式の限外ろ過処理により透過液を得る工程、及び、
工程Ｂ：工程Ａの透過液を、ＳＧＰ物質が透過しない２次膜を用いたクロスフロー方式の限外ろ過処理により濃縮液を得る工程。
（２）　ＳＧＰ物質が、ＳＧＰであり、工程ＡにおけるＳＧＰ物質を含有する水溶液が、鳥類の卵黄成分を含む水溶液であることを特徴とする、（１）の精製方法。
（３）　鳥類の卵黄成分を含有する水溶液が、鶏卵の脱脂卵黄粉の水溶液である、（２）の精製方法。
（４）　１次膜が、１０ｋ～５０ｋＤａの排除限界分子量の限外ろ過膜であり、２次膜が１０ｋＤａ以下の排除限界分子量であり、且つ、１次膜よりも小さい排除限界分子量を有する限外ろ過膜である、（２）の精製方法。
（５）　１次膜が、３０～５０ｋＤａの排除限界分子量を有するセルロース系限外ろ過膜、又は、１０～３０ＫＤａの排除限界分子量を有するＰＥＳ系限外ろ過膜であり、２次膜が１０ｋＤａ以下の排除限界分子量を有するセルロース系限外ろ過膜、又は、１０ＫＤａ以下の排除限界分子量を有するＰＥＳ系限外ろ過膜である、（４）の精製方法。
（６）　ＳＧＰ物質が、ＳＧＰと同一の糖鎖を含む、ＳＧＰのペプチド分解物であり、工程ＡにおけるＳＧＰ物質を含有する水溶液が、精製されたＳＧＰをペプチダーゼ処理した反応液であることを特徴とする、（１）の精製方法。
（７）　工程Ｂで得られた濃縮液を、ＳＧＰ物質を分離可能な樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーにより、ＳＧＰ物質を含有する画分を回収する工程を、さらに含む（１）の精製方法。
（８）　ＳＧＰ物質を分離可能な樹脂が、逆相樹脂、順相樹脂、イオン交換樹脂、ゲルろ過樹脂または合成吸着樹脂である（６）の精製方法。
（９）　ＳＧＰ物質を分離可能な樹脂が、スチレン－ジビニルベンゼン系合成吸着樹脂、スチレン－ジビニルベンゼン系修飾型合成吸着樹脂、メタクリル系合成吸着樹脂またはフェノール系合成吸着剤である（７）の精製方法。
（１０）　ＳＧＰ物質を分離可能な樹脂が、スチレン－ジビニルベンゼン系修飾型合成吸着樹脂である（８）の精製方法。
（１１）　（１）～（１０）のいずれかの方法で精製されたＳＧＰ物質を、適切な形態で包装する工程を含む、ＳＧＰ物質製品の製造方法。
　本発明の方法は、卵黄成分から、特別な添加剤等を加えずに、タンパク質のような高分子量の不純物とアミノ酸のような低分子量の不純物を簡便に除去できる。また、クロスフロー方式の限外ろ過システムは自動化が可能であるため、短時間、且つ、少ない労力でＳＧＰを効率的に精製することが可能である。また、限外ろ過工程において、目的とする濃縮精製液以外の溶液（回収外液）を、再度出発液に戻すことによって、ＳＧＰのロスを低減させ、収率を向上させることができる。さらに、使用される膜は洗浄して繰り返し再利用できるため、消耗材が少なく、ランニングコストを低く抑えることが可能である。
図１は、ＳＧＰ標準品のＨＰＬＣ測定結果のチャートである。 図２は、ＳＧＰ標準品のＬＣ／ＭＳ測定結果のチャートである。 図３は、ＳＧＰ標準品の１Ｈ－ＮＭＲ測定結果のチャートである。 図４は、実施例１で精製された糖ペプチドのＨＰＬＣ測定結果のチャートである。 図５は、実施例１で精製された糖ペプチドのＬＣ／ＭＳ測定結果のチャートである。 図６は、実施例１で精製された糖ペプチドの１Ｈ－ＮＭＲ測定結果のチャートである。 図７は、実施例２で精製された糖ペプチドのＨＰＬＣ測定結果のチャートである。 図８は、実施例２で精製された糖ペプチドのＬＣ／ＭＳ測定結果のチャートである。 図９は、実施例２で精製された糖ペプチドの１Ｈ－ＮＭＲ測定結果のチャートである。 図１０は、再生セルロース系ＵＦ膜であるＶｉｖａｆｌｏｗ５０ＲおよびＰｅｌｌｉｃｏｎ　ＸＬ　５０（Ｕｌｔｒａｃｅｌ）における、各排除限界分子量の膜を用いたクロスフロー式限外ろ過処理した際の、各処理液中の相対タンパク質濃度（棒グラフ）及びＳＧＰ回収率（折れ線グラフ）を表すグラフである。縦軸は、相対タンパク質濃度（％）及びＳＧＰ回収率（％）、両方の割合（％）を示す。横軸は、それぞれのＵＦ膜における各排除限界分子量と、各処理液の種類（Ａ：透過液、Ｂ：ＤＦ透過液、Ｃ：ＤＦ濃縮液）を表す。 図１１は、ＰＥＳ系ＵＦ膜であるＶｉｖａｆｌｏｗ５０およびＰｅｌｌｉｃｏｎ　ＸＬ　５０（Ｂｉｏｍａｘ）における、各排除限界分子量の膜を用いたクロスフロー式限外ろ過処理した際の、各処理液中の相対タンパク質濃度（棒グラフ）及びＳＧＰ回収率（折れ線グラフ）を表すグラフである。縦軸は、相対タンパク質濃度（％）及びＳＧＰ回収率（％）、両方の割合（％）を示す。横軸は、それぞれのＵＦ膜における各排除限界分子量と、各処理液の種類（Ａ：透過液、Ｂ：ＤＦ透過液、Ｃ：ＤＦ濃縮液）を表す。 図１２は、ＰＥＳ系ＵＦ膜であるＫｖｉｃｋ　ＳｔａｒｔおよびＭｉｎｉｍａｔｅにおける、各排除限界分子量の膜を用いたクロスフロー式限外ろ過処理した際の、各処理液中の相対タンパク質濃度（棒グラフ）及びＳＧＰ回収率（折れ線グラフ）を表すグラフである。縦軸は、相対タンパク質濃度（％）及びＳＧＰ回収率（％）、両方の割合（％）を示す。横軸は、それぞれのＵＦ膜における各排除限界分子量と、各処理液の種類（Ａ：透過液、Ｂ：ＤＦ透過液、Ｃ：ＤＦ濃縮液）を表す。 図１３は、再生セルロース系ＵＦ膜であるＶｉｖａｆｌｏｗ５０ＲおよびＰｅｌｌｉｃｏｎ　ＸＬ　５０（Ｕｌｔｒａｃｅｌ）における、各排除限界分子量の膜を用いたクロスフロー式限外ろ過処理した際の、各処理液中の各種アミノ酸の相対濃度（黒バー：フェニルアラニン、白バー：トリプトファン、斜線バー：チロシン）を表すグラフである。縦軸は、相対アミノ酸濃度（％）を示す。横軸は、それぞれのＵＦ膜における各排除限界分子量と、各処理液の種類（Ａ：透過液、Ｂ：ＤＦ透過液、Ｃ：ＤＦ濃縮液）を表す。 図１４は、ＰＥＳ系ＵＦ膜であるＶｉｖａｆｌｏｗ５０およびＰｅｌｌｉｃｏｎ　ＸＬ　５０（Ｂｉｏｍａｘ）における、各排除限界分子量の膜を用いたクロスフロー式限外ろ過処理した際の、各処理液中の各種アミノ酸の相対濃度（黒バー：フェニルアラニン、白バー：トリプトファン、斜線バー：チロシン）を表すグラフである。縦軸は、相対アミノ酸濃度（％）を示す。横軸は、それぞれのＵＦ膜における各排除限界分子量と、各処理液の種類（Ａ：透過液、Ｂ：ＤＦ透過液、Ｃ：ＤＦ濃縮液）を表す。 図１５は、ＰＥＳ系ＵＦ膜であるＫｖｉｃｋ　ＳｔａｒｔおよびＭｉｎｉｍａｔｅにおける、各排除限界分子量の膜を用いたクロスフロー式限外ろ過処理した際の、各処理液中の各種アミノ酸の相対濃度（黒バー：フェニルアラニン、白バー：トリプトファン、斜線バー：チロシン）を表すグラフである。縦軸は、相対アミノ酸濃度（％）を示す。横軸は、それぞれのＵＦ膜における各排除限界分子量と、各処理液の種類（Ａ：透過液、Ｂ：ＤＦ透過液、Ｃ：ＤＦ濃縮液）を表す。
　以下において、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、以下の工程Ａ及びＢを含むことを特徴とする、クロスフロー方式限外ろ過によるＳＧＰ物質の精製方法、
工程Ａ：ＳＧＰ物質を含有する水溶液を、ＳＧＰ物質を透過させ、且つ、タンパク性不純物が透過しない１次膜を用いたクロスフロー方式の限外ろ過処理により透過液を得る工程、及び、
工程Ｂ：工程Ａの透過液を、ＳＧＰ物質が透過しない２次膜を用いたクロスフロー方式の限外ろ過処理により濃縮液を得る工程。
を提供する。
　＜ＳＧＰ物質、シアリルグリコペプチド＞
本発明において、「ＳＧＰ物質」とは、シアリルグリコペプチド（ＳＧＰ）又はＳＧＰと同一の糖鎖を含む、ＳＧＰのペプチド分解物を意味する。
本発明において、「シアリルグリコペプチド（Ｓｉａｌｙｌ ＧｌｙｃｏＰｅｐｔｉｄｅ：以下、「ＳＧＰ」という）：とは、以下の構造式（Ｉ）及び配列式（ＩＩ）で示される、11個の糖からなるシアリルグリカンの還元末端のＧｌｃＮＡｃの１位炭素と、Ｌｙｓ－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－（配列番号１）の４位Ａｓｎの側鎖アミド基に由来する窒素原子が、β-Ｎグリコシド結合した、オリゴ糖ペプチドである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
（ＩＩ）
ＳＧＰは、鳥類の卵黄から精製することができるが、精製されたＳＧＰが市販されており、購入することもできる。例えば、東京化成工業（株）製のＳＧＰのＨＰＬＣチャート、ＬＣ／ＭＳスペクトル及び１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（実施例１に記載の条件で測定）は、それぞれ図１、図２及び図３に示すようなピークを示すため、これを標準品として、得られた糖ペプチドがＳＧＰであることを同定することができる。
本発明において、「ＳＧＰ製品」とは、ＳＧＰを主要な構成の一つとして含む製品であり、例えば、研究試薬、工業用原料、医薬品添加剤、食品添加剤等である。ＳＧＰ製品として製造される場合、本発明の方法で精製されたＳＧＰは、製品形態に応じた状態（凍結乾燥粉末、溶液等）に処理され、適切な容器に封入されて、包装され、製品として製造される。本発明の精製方法で得られるＳＧＰは高純度であるため、このようなＳＧＰ製品の原料としても有用である。
　ＳＧＰは、ＳＧＰを分離可能な樹脂を用いたＨＰＬＣ等により検出又は定量することができ、そのようなＨＰＬＣの条件としては、例えば、以下の条件を挙げることができる。
[逆相カラムを用いたＨＰＬＣ分析条件]
ＨＰＬＣ：１２６０　Ｉｎｆｉｎｉｔｙ　ＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）
カラム：Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ　１２０　ＥＣ－Ｃ１８　２．７μｍ　φ３．０×５０ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）、ガードカラム：Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ　１２０　ＥＣ－Ｃ１８　２．７μｍ　φ３．０×５ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）
（もしくは、カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３　３μｍ　φ３．０×５０ｍｍ（ジーエルサイエンス（株）製））
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：０．１％ＨＣＯＯＨを含むＨ２Ｏ溶液（ｖ／ｖ）
移動相Ｂ：０．１％ＨＣＯＯＨを含むＭｅＣＮ溶液（ｖ／ｖ）
グラジエント（移動相Ｂ%）：０％（０分）、１０％（５分）、３０％（７分）、３０％（８分）
流速：０．６ｍｌ／分
検出波長：２１０ｎｍ
[順相カラムを用いたＨＰＬＣ分析条件]
ＨＰＬＣ：１２６０　Ｉｎｆｉｎｉｔｙ　ＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ　Ａｍｉｄｅ　３μｍ　φ３．０×７５ｍｍ（ジーエルサイエンス（株）製）
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：０．１％ＨＣＯＯＨを含むＨ２Ｏ溶液（ｖ／ｖ）
移動相Ｂ：０．１％ＨＣＯＯＨを含むＭｅＣＮ溶液（ｖ／ｖ）
グラジエント（移動相Ｂ%）：７０％（０分）、３０％（６分）、１０％（６．０１分）、１０％（７．５分）
流速：０．６ｍｌ／分
検出波長：２１０ｎｍ。
　溶液中に含まれるＳＧＰは、対象溶液を上記のＨＰＬＣに供し、得られたＨＰＬＣチャートにおける、ＳＧＰに帰属するピーク面積値として算出することができる。例えば、出発材料溶液のＳＧＰ含有量に対する、対象溶液のＳＧＰの回収率を算出する場合、以下の式により算出することができる。
回収率（％）＝（対象溶液のＳＧＰピーク面積値×対象溶液量）／（出発原料溶液のＳＧＰピーク面積値×出発原料溶液量）×１００
　また、被検ＳＧＰの純度は、標準品のＳＧＰの純度を１００％とした相対純度として算出することができる。標準品ＳＧＰとしては、例えば、市販されている東京化成工業（株）製のＳＧＰ等を利用することができる。測定方法としては、正確に秤量した被検ＳＧＰに、水等の水性溶媒を一定量加え、完全に溶解させた被検ＳＧＰ溶液を、上記の条件でＨＰＬＣ測定を行い、得られたＨＰＬＣチャートにおける、被検ＳＧＰのピーク面積値を測定する。同様に、標準品ＳＧＰについても同様の操作を行い、被ＳＧＰと同一の濃度の標準品ＳＧＰ溶液を調製後、同一条件のＨＰＬＣ測定を行い、以下の式によって被検ＳＧＰの純度を算出することができる。
被検ＳＧＰ純度（％）＝（被検ＳＧＰピーク面積値／標準品ＳＧＰピーク面積値）×１００
本発明において、「ＳＧ分解物」とは、上述したＳＧＰにおいて、含まれる配列番号１のペプチド部分が、ペプチド分解酵素処理により分解されて精製される分解物のうちＳＧＰと同一の糖鎖構造を有する物質を意味する。本発明のＳＧ分解物としては、ＳＧＰをアクチナーゼ処理することで得られる、ＳＧＰに含まれるペプチド部分が、糖鎖が結合するアスパラギン（Ａｓｎ）を残して欠失したＳＧ－Ａｓｎ（下記式（III））等を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
（ＩＩＩ）
ＳＧ－Ａｓｎの分析においては、上述したＳＧＰの分析条件を採用することができる。
　＜出発物＞
　本発明の精製方法に用いる出発物としては、ＳＧＰ物質を含有する水溶液であれば特に限定されず、様々なものを用いることができる。ＳＧＰ物質がＳＧ分解物である場合、精製されたＳＧＰをペプチド分解酵素で処理した反応液を用いることが好ましい。そのため、以下においては、ＳＧＰの精製方法について詳述する。
　ＳＧＰは、鳥類の卵の卵黄に含まれていることが知られており、含まれる糖鎖構造がヒト型であるため、ヒトが摂取又は服用しても、アレルギー反応を起こしにくい。
　本発明において、「鳥類の卵黄成分を含む水性溶液」とは、鳥類の卵の卵黄成分を水性溶媒と混合させた溶液を意味する。卵の由来は、鳥類であれば特に限定されず、ニワトリ、ウズラ、ハト、ダチョウ、カラス等をあげることができるが、好ましくはニワトリ由来の卵である。卵黄は、全卵から卵白と分離させたものをそのまま、乾燥させた乾燥卵黄として、脱脂処理をした脱脂卵黄として、又は、それらを粉末状にした卵黄粉、若しくは
脱脂卵黄粉として、本発明の方法に用いることができる。鶏卵の卵黄粉、脱脂卵黄粉などは、販売されており、購入することができる（ヨークプロテインＨ（キユーピー（株））、サニープロＤＦ（太陽化学（株））等）。
卵黄成分を溶解又は懸濁させる溶媒としては、水を主成分とする水性溶媒であり、タンパク質を変性させる成分を実質的に含まないものであれば、様々な水性溶媒を用いることができるが、好ましくは水である。限外ろ過工程に用いられる卵黄成分含有溶液は、卵黄、脱脂卵黄、それらの粉末等の卵黄成分を、水性溶媒と混合させ、不溶物を分離した溶解液部として用いることができる。
　＜クロスフロー限外ろ過法＞
　限外ろ過（Ｕｌｔｒａ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）は、溶液に圧力を加えて限外ろ過膜を透過させることによって、溶液中の成分を濃縮、又は、除去するための方法である。限外ろ過膜（「ＵＦ膜」ともいう）には、個別に排除限界分子量が設定されており、溶液中の成分中、膜の限界排除分子量よりも大きな分子は膜に阻止されることで、透過前液（以下、「濃縮液」）中に濃縮される。一方で、透過液からは、このような高分子成分が除去される。本発明は、限外ろ過において、異なる排除限界分子量の膜を組み合わせて採用することにより、その中間の分子量領域に属する成分を、効率的に精製することを特徴とする。
限外ろ過の方式には、主に、デッドエンド方式とクロスフロー（タンジェンシャルフロー）方式の２種類がある。デッドエンド方式は、液体に対する圧力、すなわち液流の方向と垂直に膜が設置されているため、初期のろ過効率は高いが、不純物が多い溶液を処理する場合は、膜に粒子が堆積し、目詰まりし易く、ろ過効率が低下してしまう。一方で、クロスフロー方式は、膜が液流の方向と平行に設置されているため、膜表面が液流で洗浄されることで膜への粒子の堆積による目詰まりを起こしにくい特徴がある。本発明においては、卵黄成分のような不純物を多く含む水溶液から糖ペプチドを効率的に精製するためクロスフロー方式の限外ろ過を採用する。
限外ろ過には、その材質、形状、排除限界分子量等により多様な種類が存在し、本発明においては、出発液の種類や状態、適用する限外ろ過装置の種類等に応じて、適宜適切なものを選択することができる。
本発明において、「１次膜」とは、ＳＧＰが透過可能な限外ろ過膜である。１次膜は、ＳＧＰよりも大きな不純物を透過液から排除する役割を有するため、ＳＧＰを透過する膜の中で、できるだけ低い排除限界分子量の膜を採用することが好ましい。
また、「２次膜」とは、ＳＧＰが透過不可能な限外ろ過膜である。２次膜は、ＳＧＰよりも小さい不純物を濃縮液から除去する役割を有するため、ＳＧＰが透過できない膜の中で、できるだけ高い排除限界分子量の膜を採用することが好ましい。
限外ろ過膜の形状には、平膜タイプ、中空糸タイプ等があり、とくに限定はされないが、好ましくは平膜タイプである。限外ろ過膜の材質には、再生セルロース系（ＲＣ）、ポリエーテルスルホン系（ＰＥＳ）、ポリスルホン系（ＰＳ）、ポリアクリロニトリル系（ＰＡＮ）、酢酸セルロース系（ＣＡ）等がある。同じ限界排除分子量が設定された膜でも、材質によりＳＧＰの分離挙動が異なる場合があるが、事前に複数の膜に対するＳＧＰの標準品の挙動を確認することで、適切な膜を選定することができる。
限外ろ過膜の排除限界分子量は、標準物質を用いたろ過試験によって規定されるが、標準物質の種類や試験条件等はメーカーにより異なる。また、標準物質がＳＧＰと性質が大きく異なる種類の物質である場合、ＳＧＰが標準物質とは異なる分離挙動を示すことがある。そのため、実際のＳＧＰの試験結果が、設定された排除限界分子量とは異なる場合もある。また、このような分離挙動は、膜の材質にも影響を受ける。そのため、膜の排除限界分子量の値は目安として捉え、実際の精製操作の前に、使用を予定している膜に対するＳＧＰの分離挙動を確認することによって、適切な膜を選択することができる。
本発明に用いる１次膜及び２次膜は、ＳＧＰの分離挙動に基づき、以下の方法により選択することができる。目的とするＳＧＰの水溶液を、使用する限外ろ過装置に供し、各種の限外ろ過膜を透過させ、その濃縮液と透過液の、それぞれにおけるＳＧＰの分布を確認することによって、当該膜に対するＳＧＰの分離挙動を確認する。このとき、ＳＧＰが透過する膜（このような膜において、最低の排除限界分子量を有する膜が好ましい）を１次膜に選択し、ＳＧＰが透過できない膜（このような膜において、最高の排除限界分子量を有する膜が好ましい）を２次膜として選択することができる。本発明においては、1次膜と２次膜として、異なる材質やメーカーの膜を組み合わせて使用してもよい。
１次膜としてはＳＧＰを透過する膜であり、好ましくはＳＧＰが透過し、且つ、タンパク質等の高分子成分の透過が少ない膜であり、より好ましくは、１０～５０ｋＤａの排除限界分子量の膜を採用することができる。この場合、再生セルロース系膜であれば排除限界分子量が３０～５０ｋＤａ、より好ましくは３０ｋＤａのものである。また、ＰＥＳ系膜であれば、１０～３０ｋＤａのものが好ましい。
また、２次膜としては、ＳＧＰが透過できない膜であり、好ましくはＳＧＰが透過できず、且つ、アミノ酸等の低分子成分の多くが透過できる膜であり、より好ましくは１０ｋＤａ以下の排除限界分子量の膜を採用することができる。この場合、再生セルロース系膜であれば排除限界分子量が１０ｋＤａ以下、好ましくは１０又は５ｋＤａのものである。また、ＰＥＳ膜であれば、１０ｋＤａ以下、好ましくは５ｋＤａのものである。
クロスフロー方式を採用した限外ろ過には、ホースやパイプ等の流路部に、ポンプ、圧力計、限外ろ過膜等のデバイスを取り付けて構築したシステムを採用しても良く、一体型のクロスフロー限外ろ過装置を利用することもできる。
一体型のクロスフロー限外ろ過装置としては、例えばＳＡＲＴＯＦＬＯＷ　Ｓｌｉｃｅ２００　Ｂｅｎｃｈｔｏｐ　Ｃｒｏｓｓｆｌｏｗ　Ｓｙｓｔｅｍ、ＳＡＲＴＯＦＬＯＷ　Ａｄｖａｎｃｅｄ、ＳａｒｔｏＪｅｔ　Ｓｙｓｔｅｍ、ＳＡＲＴＯＦＬＯＷ　Ａｌｐｈａ　ｐｌｕｓ、ＳＡＲＴＯＦＬＯＷ　Ｂｅｔａ　ｐｌｕｓ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　ＡＧ社製）、ＡＫＴＡｃｒｏｓｓｆｌｏｗ、ＡＫＴＡ　ｆｌｕｘ　ｓ、ＡＫＴＡ　ｆｌｕｘ　６、Ｍｉｄｊｅｔ　Ｓｙｓｔｅｍ、ＱｕｉｘＳｔａｎｄ　Ｓｙｓｔｅｍ、ＵｎｉＦｌｕｘ　１０、ＵｎｉＦｌｕｘ　３０、ＵｎｉＦｌｕｘ　１２０、ＵｎｉＦｌｕｘ　４００（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　ＵＫ　Ｌｔｄ．社製）、Ｌａｂｓｃａｌｅ　ＴＦＦ　Ｓｙｓｔｅｍ、Ｃｏｇｅｎｔ　μＳｃａｌｅ　ＴＦＦ　Ｓｙｓｔｅｍ、Ｃｏｇｅｎｔ　Ｍ１　ＴＦＦ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｅｒｃｋ　ＫＧａＡ社製）、ミニメイト　ＴＦＦ　Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｉｍ　ＩＩＩ　ＴＦＦ　Ｓｙｓｔｅｍ、セントラメイト　５００Ｓ　ＴＦＦＳｙｓｔｅｍ（ＰＡＬＬ　Ｃｏ．社製）、ＫｒｏｓＦｌｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ＩＩｉ　ＴＦＦ　Ｓｙｓｔｅｍ、ＫＭＰｉ　ＴＦＦ　Ｓｙｓｔｅｍ、ＫｒｏｓＦｌｏ　Ｐｉｌｏｔ　Ｐｌｕｓ　ＴＦＦ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｉｎｃ．社製）、ＰｕｒｅＴｅｃ　ＴＦＦ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＳｃｉＬｏｇ，　Ｉｎｃ．社製）などを挙げることができる。
また、クロスフロー方式の限外ろ過システムを構築する場合、流路部のホースやパイプ、ポンプ、圧力計等は一般的に入手可能な材料や機器を採用することができる。限外ろ過膜は、専用ホルダと多様な膜が市販されており、適宜適切な膜をホルダにセットし、流路部に組み込むことができる。
限外ろ過膜、外装が一体となり、専用ホルダを必要とせず、簡便な接続方法で利用可能なカートリッジ型の多様な限外ろ過膜が市販されており、適宜選択することができる。このような、カートリッジ型限外ろ過膜としては、平膜タイプのものは、Ｖｉｖａｆｌｏｗシリーズ（５０Ｒシリーズ：再生セルロース系ＵＦ膜、５０シリーズ：ＰＥＳ系ＵＦ膜）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　ＡＧ社製）、Ｐｅｌｌｉｃｏｎシリーズ（Ｕｌｔｒａｃｅｌ：再生セルロース系ＵＦ膜、Ｂｉｏｍａｘ：ＰＥＳ系ＵＦ膜）（Ｍｅｒｃｋ　ＫＧａＡ社製）、Ｋｖｉｃｋ　Ｓｔａｒｔシリーズ（ＰＥＳ系ＵＦ膜、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　ＵＫ　Ｌｔｄ．社製）、Ｍｉｎｉｍａｔｅシリーズ（ＰＥＳ系ＵＦ膜、ＰＡＬＬ　Ｃｏ．社製）等を挙げることができる。中空糸タイプのカートリッジ型限外ろ過膜としては、ＭｉｄＧｒｅｅシリーズ、Ｘａｍｐｌｅｒシリーズ（ＰＳ系ＵＦ膜）（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　ＵＫ　Ｌｔｄ．社製）、ｍｉｃｒｏｚａペンシル型モジュールシリーズ、ｍｉｃｒｏｚａラボモジュールシリーズ（ＰＡＮ系ＵＦ膜、ＰＳ系ＵＦ膜）（旭化成ケミカルズ（株）製）、モルセップシリーズ（ＰＡＮ系ＵＦ膜、ＰＥＳ系ＵＦ膜、ＣＡ系ＵＦ膜）（ダイセン・メンブレン・システムズ（株）製）、ＭｉｃｒｏＫｒｏｓシリーズ、ＭｉｄｉＫｒｏｓシリーズ、ＭｉｎｉＫｒｏｓシリーズ、ＫｒｏｓＦｌｏシリーズ、ＣｅｌｌＦｌｏシリーズ（ＰＥＳ系ＵＦ膜、ＰＳ系ＵＦ膜）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｉｎｃ．社製）等を挙げることができる。専用ホルダを用いる限外ろ過膜としては、Ｓａｒｔｏｃｏｎ　Ｓｌｉｃｅ　２００　カセット、Ｓａｒｔｏｃｏｎ　Ｓｌｉｃｅ　カセット、Ｓａｒｔｏｃｏｎ　カセット、Ｓａｒｔｏｃｕｂｅ（Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ：再生セルロース系ＵＦ膜、ＰＥＳ系ＵＦ膜）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　ＡＧ社製）、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２　カセット、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ３　カセット（Ｕｌｔｒａｃｅｌ：再生セルロース系ＵＦ膜、Ｂｉｏｍａｘ：ＰＥＳ系ＵＦ膜）（Ｍｅｒｃｋ　ＫＧａＡ社製）、Ｔ－Ｓｅｒｉｅｓ　ＴＦＦ　カセット（Ｄｅｌｔａ：再生セルロース系ＵＦ膜、Ｏｍｅｇａ：ＰＥＳ系ＵＦ膜）（ＰＡＬＬ　Ｃｏ．社製）、Ｋｖｉｃｋ　Ｌａｂ　Ｐａｃｋｅｔ、Ｋｖｉｃｋ　Ｌａｂカセット、Ｋｖｉｃｋ　Ｌａｂ　ＳＣＵカセット、Ｋｖｉｃｋ　Ｆｌｏｗ　カセット（ＰＥＳ系ＵＦ膜）（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　ＵＫ　Ｌｔｄ．社製）等を挙げることができる。
限外ろ過膜には、その材質、形状、排除限界分子量等により多様な種類が存在し、本発明においては、出発液の種類や状態、適用する限外ろ過装置の種類等に応じて、適宜適切なものを選択することができる。
＜限外ろ過操作＞
本発明の方法において、限外ろ過工程は、出発液を１次膜に透過させ、その透過液を２次膜に透過させ、その濃縮液を目的物であるＳＧＰ物質の濃縮精製液として回収することを特徴とする。実際の精製処理前に、目的とするＳＧＰ物質の溶液を用いて予備試験を行い、膜間差圧（ＴＭＰ）、透過流束（Ｆｌｕｘ）などを求め、その相関から運転条件の最適化を行なうことができる。また、最適化を行なうことにより、膜面積を大きくすることでスケールアップを行なうことが可能である。ＳＧＰ以外のＳＧＰ物質を目的物とする場合には、ＳＧＰの精製処理で用いた条件と同一の条件を採用できる場合もあり、必要に応じて微調整することで、目的物に最適な条件を適宜選択することができる。
限外ろ過処理時の操作圧力に特に制限は無いが、高い圧力で操作を行なった場合、膜の閉塞や、膜や周辺設備へのダメージが生じる場合がある。また、０．０１ＭＰａといった低い圧力で操作を行なった場合、ろ過速度の低下により、作業効率が低下する恐れがある。好ましくは０．０１ＭＰａ～０．５ＭＰａの範囲の操作であり、より好ましくは０．０５ＭＰａ～０．３ＭＰａの範囲である。
限外ろ過処理時の温度に特に制限は無いが、高い温度で操作を行った場合、液体の粘度が下がるため、ろ過速度の上昇させることができる。しかし、膜へのダメージが生じる場合がある。さらには、別途、加温装置等の設備投資が必要となる。また、低い温度で操作を行った場合、液体の粘度の上昇によるろ過速度の低下や、液体の凍結などが生じる場合がある。好ましくは４℃～６０℃であり、より好ましくは１５℃～４０℃である。
ここで、１次膜の濃縮液と２次膜の透過液（併せて、「回収外液」）は、通常回収されないが、このような回収外液にもＳＧＰが含まれる場合がある。このような回収外液を、次の限外濾過操作の出発液と合わせて用いることによって、回収外液中に含まれるＳＧＰを回収することができ、必要に応じてこれを繰り返すこれにより、ＳＧＰの収率を向上させることが可能である。
＜限外ろ過処理液からのＳＧＰ物質の精製＞
　上記の限外ろ過操作工程を経て得られた濃縮精製液から、様々なカラム充填剤を用いて、ＳＧＰをさらに精製することができる。このような精製に用いられるカラム充填剤としては、合成吸着樹脂、逆相樹脂、順相樹脂、イオン交換樹脂、ゲルろ過樹脂等を挙げることができる。逆相樹脂としては、ブチル基（Ｃ４）、オクチル基（Ｃ８），オクタデシル基（Ｃ１８）、トリアコンチル基（Ｃ３０）、フェニル基等の疎水性官能基を、シリカゲルの基材へ付加させた樹脂であり、特にオクタデシル基を付加したＯＤＳ系逆相樹脂（Ｗａｋｏｇｅｌ　１００Ｃ１８（和光純薬工業（株））を用いたＳＧＰの精製については、特許文献１に記載されている。また、イオン交換樹脂であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ　ＤＥＡＥ－６５０Ｍ（東ソー（株））、ＣＭ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｃ－２５（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　ＵＫ　Ｌｔｄ．）、Ｄｏｗｅｘ　５０Ｗｘ２（Ｔｈｅ　Ｄｏｗ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いたＳＧＰの精製、ゲルろ過樹脂であるＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－５０（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　ＵＫ　Ｌｔｄ．）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　ＵＫ　Ｌｔｄ．）を用いたＳＧＰの精製については、非特許文献１に、それぞれ記載されており、これらの文献に記載の条件を参考に、適宜精製することができる。
　＜合成吸着樹脂＞
　本発明は、精製工程におけるカラム充填剤として、合成吸着樹脂を採用するＳＧＰの精製方法を提供する。合成吸着樹脂とは、多孔質架橋構造ポリマーからなる充填剤であり、ポリマーの種類により、スチレン-ジビニルベンゼン系合成吸着剤、スチレン-ジビニルベンゼン系修飾型合成吸着樹脂、メタクリル系合成吸着樹脂、フェノール系合成吸着樹脂等が挙げられる。ＳＧＰの精製に利用できることが知られていたＯＤＳ系逆相樹脂等の充填剤は、シリカゲルを基材とするため、アルカリ性溶液を用いた洗浄ができない。そのため有機溶媒を用いた洗浄だけでは不純物の除去が不十分であるため、再利用することができなかった。しかし、カラム充填剤として、合成吸着樹脂を採用することによって、有機溶媒を用いた洗浄に加え、アルカリ性溶液を用いた洗浄により樹脂回生が可能であることから、不純物の除去が十分に行なうことができ、合成吸着樹脂を再利用することが可能である。このような合成吸着樹脂としては、ＳＧＰを吸着できるものであれば様々な合成吸着樹脂を採用することができるが、好ましくは、スチレン-ジビニルベンゼン系合成吸着樹脂であり、より好ましくはスチレン-ジビニルベンゼン系修飾型合成吸着樹脂である。具体的な製品としてはＳＥＰＡＢＥＡＤＳ　ＳＰ２０７ＳＳ（三菱化学（株））等を挙げることができる。
ＳＧＰを精製する方法としては、上記工程で得られた濃縮精製溶液を、カラム充填剤を充填したカラムに透過させ、必要に応じて、クロマトグラフィーの分離モードに応じた適切な溶媒で洗浄し、クロマトグラフィーの分離モードに応じた移動相を用いて溶出させ、溶出液にＳＧＰが含まれる画分を回収することで、ＳＧＰを精製できる。この精製工程の前に、必要であれば、用いるカラム充填剤やクロマトグラフィーのモードに併せて、限外ろ過後溶液の条件を適宜調整しても良い。この溶液条件の変更により不溶物が生じる場合は、適宜、セライト等のろ過助剤を溶液に混合させ、溶解液部のみを回収する操作を行う。溶出画分に含まれるＳＧＰは上記のＨＰＬＣ条件でモニターすることもできるし、以前と同一条件による溶出であれば、溶出時間からＳＧＰの溶出画分を特定することもできる。このような精製の条件は、採用するカラム充填剤の種類、性質に応じて、適宜設定することができる。
例えば、カラム充填剤としてＳＥＰＡＢＥＡＤＳ　ＳＰ２０７ＳＳを用いる場合、濃縮精製液を、ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ　ＳＰ２０７ＳＳを充填したカラムに透過させ、カラムを水で洗浄した後、水から２％アセトン水の濃度勾配で溶出を行うことができる。
　得られた精製ＳＧＰ溶液は、そのまま凍結保存しても良いが、必要に応じて、濃縮又は凍結乾燥して保存することもできる。
　以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。ここに示された実施例は、本発明の実施態様の一例に過ぎず、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
＜実施例１．限外ろ過膜を用いたＳＧＰの精製－１＞
[１次ろ過処理]
　１次膜として、Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ（登録商標）／Ｓａｒｔｏｃｏｎ　Ｓｌｉｃｅ　Ｃａｓｓｅｔ（排除限界分子量：３０Ｋ、膜面積：０．１ｍ２、材質：再生セルロース膜、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　ＡＧ社製）を膜ホルダー（Ｓａｒｔｃｏｎ　Ｓｌｉｃｅ　Ｈｏｌｄｅｒ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　ＡＧ社製）に装着して用い、送液ポンプ（リキポート　ＮＥ１．３００、ＫＮＦ社製）を用いて膜間差圧（ＴＭＰ）約０．０５ＭＰaの条件下で、クロスフロー式ろ過法で行う処理を１次ろ過処理とする。
脱脂卵黄粉（キユーピー（株））４ｋｇに水２０Ｌを添加し、１５分間よく撹拌した後、ＦＩＬＴＥＲ　ＰＡＰＥＲ　Ｎｏ．２（東洋濾紙（株））を用いたビフネルロート上で吸引ろ過を行なった。得られた水抽出液は、エバポール・ラボ（大川原製作所（株））を用いて、３．２Ｌになるまで濃縮を行なった。
得られた濃縮液は、よく攪拌しながら上記の１次ろ過処理をし、透過液２．６Ｌ、濃縮液６５０ｍＬを得た（透過液１および濃縮液１）。
得られた濃縮液１に水１．５Ｌを添加し、よく攪拌しながら、再度上記の１次ろ過処理を行ない、透過液１．５Ｌ、濃縮液６５０ｍＬを得た（透過液２および濃縮液２）。
得られた濃縮液２に水１．５Ｌを添加し、よく攪拌しながら、上記の１次ろ過処理し、透過液１．９Ｌを得た（透過液３）。
[２次ろ過処理]
２次膜として、Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ（登録商標）／Ｓａｒｔｏｃｏｎ　Ｓｌｉｃｅ　Ｃａｓｓｅｔ（排除限界分子量：１０Ｋ、膜面積：０．１ｍ２、材質：再生セルロース膜、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　ＡＧ社製）を膜ホルダー（Ｓａｒｔｃｏｎ　Ｓｌｉｃｅ　Ｈｏｌｄｅｒ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　ＡＧ社製）に装着して用い、ポンプ（リキポート　ＮＥ１．３００、ＫＮＥ社製）を用いて膜間差圧（ＴＭＰ）約０．０５ＭＰaの条件下で、クロスフロー式ろ過法による処理を２次ろ過処理とする。
上記透過液１は、よく攪拌しながら２次ろ過処理を行い、透過液２．４Ｌ、濃縮液１５０ｍＬを得た（濃縮液３）。
得られた濃縮液３に、透過液２を添加し、よく攪拌しながら、再度２次ろ過処理を行ない、透過液１．５Ｌ、濃縮液１５０ｍＬを得た（濃縮液４）。
得られた濃縮液４に、透過液３を添加し、よく攪拌しながら、再度２次ろ過処理を行い、透過液２Ｌ、濃縮液５０ｍＬを得た（濃縮液５）。
得られた濃縮液５に、水１．５Ｌを添加し、よく攪拌しながら、再度２次ろ過処理を行なった。２次ろ過処理中の濃縮液側に、さらに水１．５Ｌを添加し、２次ろ過処理を継続することで、最終的に透過液３Ｌを得た。また、クロスフロー経路内を水洗浄した洗浄水を濃縮液に加え、７２０ｍＬを得た（濃縮液６）。濃縮液６を凍結乾燥することで、１２ｇの糖ペプチド画分を得た。
得られた糖ペプチド画分とＳＧＰの標準品（東京化成工業（株）製ＳＧＰ）について１Ｈ－ＮＭＲ測定、ＬＣ／ＭＳ測定及び以下の条件によるＨＰＬＣ分析を行った。標準品のＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ及び１Ｈ－ＮＭＲによる測定結果を、それぞれ図１、図２及び図３に示す。得られた糖ペプチド画分のＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ及び１Ｈ－ＮＭＲによる測定結果をそれぞれ図４、図５および図６に示す。
得られた糖ペプチドは１Ｈ－ＮＭＲ測定及びＬＣ／ＭＳ測定による標準品との比較により、標準品と同様のマススペクトル及び１Ｈ－ＮＭＲスペクトルが得られたことから、上記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表されるＳＧＰを含むことが確認された。また、ＨＰＬＣの結果において、得られたＳＧＰと標準品との、ＳＧＰに帰属するピークの相対面積値比により、得られたＳＧＰの純度は４７％であった。
［ＨＰＬＣ測定］
ＨＰＬＣ：１２６０　Ｉｎｆｉｎｉｔｙ　ＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）
カラム：Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ　１２０　ＥＣ－Ｃ１８　２．７μｍ　φ３．０×５０ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）、ガードカラム：Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ　１２０　ＥＣ－Ｃ１８　２．７μｍ　φ３．０×５ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：０．１％ＨＣＯＯＨを含むＨ２Ｏ溶液（ｖ／ｖ）
移動相Ｂ：０．１％ＨＣＯＯＨを含むＭｅＣＮ溶液（ｖ／ｖ）
グラジエント（移動相Ｂ％）：０％（０分）、１０％（５分）、３０％（７分）、３０％（８分）
流速：０．６ｍｌ／分
検出波長：２１０ｎｍ。
［ＬＣ／ＭＳ測定］
ＭＳ：６１３０　Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ　ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）
イオン化：ＥＳＩ
モード：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ＨＰＬＣ：１２６０　Ｉｎｆｉｎｉｔｙ　ＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）
カラム：Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ　１２０　ＥＣ－Ｃ１８　２．７μｍ　φ３．０×５０ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）、ガードカラム：Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ　１２０　ＥＣ－Ｃ１８　２．７μｍ　φ３．０×５ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：０．１％ＨＣＯＯＨを含むＨ２Ｏ溶液（ｖ／ｖ）
移動相Ｂ：０．１％ＨＣＯＯＨを含むＭｅＣＮ溶液（ｖ／ｖ）
グラジエント（移動相Ｂ％）：０％（０分）、１０％（５分）、３０％（７分）、３０％（８分）
流速：０．６ｍｌ／分
検出波長：２１０ｎｍ。
［１Ｈ－ＮＭＲ測定］
ＮＭＲ：ＡＶＡＮＣＥ５００（５００ＭＨｚ、ブルカー・バイオスピン（株）社製）
溶媒：ＤＥＵＴＥＲＩＵＭ　ＯＸＩＤＥ＋０．１％ＴＭＳＰ（ｅｕｒｉｓｏ－ｔｏｐ社製）
また、上記と同様の操作により、脱脂卵黄粉１ｋｇから、１．４ｇの糖ペプチド画分が得られ、同様の分析により当該糖ペプチド画分にＳＧＰを含むことが確認された（ＳＧＰ純度：４５％）。
＜実施例２．限外ろ過膜を用いたＳＧＰの精製－２＞
本実施例において、１次ろ過処理及び２次ろ過処理には、実施例１と同一の条件を採用した。
[１次ろ過処理]
脱脂卵黄粉（キユーピー（株））２０ｋｇに水１００Ｌを添加し、１５分間よく撹拌した後、ビフネルロート上で吸引ろ過を行なった。得られた水抽出液は、エバポール・ラボ（大川原製作所（株））を用いて、５．１Ｌになるまで濃縮を行なった。
得られた濃縮液は、よく攪拌しながら１次ろ過処理し、透過液３Ｌ、濃縮液２．１Ｌを得た（透過液１および濃縮液１）。得られた濃縮液１に水３Ｌを添加し、よく攪拌しながら、再度１次ろ過処理し、透過液３Ｌ、濃縮液２．１得た（透過液２および濃縮液２）。さらに、得られた濃縮液２に水３Ｌを添加し、よく攪拌しながら、再度１次ろ過処理し、透過液３Ｌ、濃縮液２．１Ｌを得た（透過液３および濃縮液３）。さらに、得られた濃縮液３に水３Ｌを添加し、よく攪拌しながら、再度１次ろ過処理し、透過液３Ｌ、濃縮液２．１Ｌを得た。（透過液４および濃縮液４）
得られた濃縮液４に水３Ｌを添加し、よく攪拌しながら、上記の１次膜を用いたクロスフロー式ろ過法でろ過処理し、透過液３Ｌを得た。（透過液５）
[２次ろ過処理]
上記透過液１および２をよく攪拌しながら、上記の２次ろ過処理を行ない、透過液５Ｌ、濃縮液１Ｌを得た。（濃縮液５）
得られた濃縮液５、透過液３および透過液４を添加し、よく攪拌しながら、再度２次ろ過処理を行ない、透過液４．２Ｌ、濃縮液２．８Ｌを得た。（濃縮液６）
得られた濃縮液６、透過液５を添加し、よく攪拌しながら、再度２次ろ過処理を行ない、透過液４Ｌ、濃縮液１．８Ｌを得た。（濃縮液７）
得られた濃縮液７に、水２Ｌを添加し、よく攪拌しながら、再度２次ろ過処理を行なった。２次ろ過処理中の濃縮液側に、さらに水２Ｌを添加し、２次ろ過処理を継続することで、最終的に透過液４Ｌを得た。また、クロスフロー経路内を水洗浄した洗浄水を濃縮液に加え、２．９Ｌを得た。（濃縮液８）
合成吸着樹脂としてＳＥＰＡＢＥＡＤＳ ＳＰ２０７ＳＳ（三菱化学（株））５．３Ｌ（２００Φｘ１６９ｍｍ）をカラムに充填し、水で平衡化を行なった。該カラムに、上記で得られた濃縮液８を流速２５０ｍＬ／分で付した後、水５０Ｌ流速１Ｌ／分で洗浄後、２％アセトン水溶液（ｖ／ｖ）流速１Ｌ／分で展開し、溶出画分１として５Ｌ、溶出画分２～７として２．５Ｌ毎に分画した（溶出画分１乃至７）。
溶出画分４乃至６を合わせて、凍結乾燥することで、２９．７ｇの糖ペプチドを得た。
　得られた糖ペプチドのＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ及び１Ｈ－ＮＭＲによる測定結果をそれぞれ図７、図８および図９に示す。
得られた糖ペプチドは１Ｈ－ＮＭＲ測定及びＬＣ／ＭＳ測定による標準品のデータ（図1、図２および図３）との比較により、標準品と同様のマススペクトル及び１Ｈ－ＮＭＲスペクトルが得られたことから、上記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表されるＳＧＰであることが確認された。また、ＨＰＬＣの結果において、得られたＳＧＰと
標準品との、ＳＧＰに帰属するピークの相対面積値比により、得られたＳＧＰの純度は１００％であった。
また、上記と同様の操作により、２０ｋｇ、１５ｋｇ及び１０ｋｇの脱脂卵黄粉から、それぞれ２５．３ｇ（純度：１０３％）、１８．４ｇ（純度：１０６％）及び１１．８ｇ（純度：１０３％）のＳＧＰを得た。なお、ＳＧＰの確認及び純度測定は、上記と同じ方法で行った。
＜実施例３．多様な限外ろ過膜のＳＧＰ精製への適用検討＞
　次に、様々なＵＦ膜の、クロスフロー方式によるＳＧＰ精製への適用可能性について検討した。本発明の精製方法においては、不純物、特に不要なタンパク質が除去され、且つ、ＳＧＰが残存していることが重要であるため、限外ろ過膜で処理した後の各溶液（濃縮液、透過液）中のタンパク質とアミノ酸含量及びＳＧＰ回収率を指標とした検討を行った。
（１）限外ろ過膜のタンパク質とアミノ酸除去性能及びＳＧＰ回収率の検証
　本実施例のクロスフロー方式限外ろ過は、クロスフローシステムとして、ＡＫＴＡｃｒｏｓｓｆｌｏｗ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　ＵＫ　Ｌｔｄ．社製）を使用して、以下に示す異なる材質の各種ＵＦ膜（再生セルロース系ＵＦ膜、及び、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）系ＵＦ膜）について、脱脂卵黄粉中のタンパク質に対するタンパク質除去性能及びアミノ酸除去性能を評価し、また、脱脂卵黄粉中のＳＧＰに対する回収率を評価した。
［限外ろ過膜］
再生セルロース系ＵＦ膜として、Ｖｉｖａｆｌｏｗ５０Ｒシリーズは排除限界分子量５Ｋ、１０Ｋ、３０Ｋ、１００Ｋ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　ＡＧ社製）、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ　ＸＬ　５０（Ｕｌｔｒａｃｅｌ）シリーズは５Ｋ、１０Ｋ、３０Ｋ（Ｍｅｒｃｋ　ＫＧａＡ社製）、を使用した。
ＰＥＳ系ＵＦ膜として、Ｖｉｖａｆｌｏｗ５０シリーズは５Ｋ、１０Ｋ、３０Ｋ、５０Ｋ、１００Ｋ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　ＡＧ社製）、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ　ＸＬ　５０（Ｂｉｏｍａｘ）シリーズは５Ｋ、１０Ｋ、３０Ｋ、５０Ｋ（Ｍｅｒｃｋ　ＫＧａＡ社製）、Ｋｖｉｃｋ　Ｓｔａｒｔシリーズは５Ｋ、１０Ｋ、３０Ｋ、５０Ｋ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　ＵＫ　Ｌｔｄ．社製）、Ｍｉｎｉｍａｔｅシリーズは５Ｋ、１０Ｋ、３０Ｋ、５０Ｋ（ＰＡＬＬ　Ｃｏ．社製）、を使用した。
　［方法］
　脱脂卵黄粉（キユーピー（株））に対して１０倍量の水を添加し（濃度１００ｍｇ／ｍＬ）、１５分間よく撹拌した後、ＦＩＬＴＥＲ　ＰＡＰＥＲ　Ｎｏ．２（東洋濾紙（株））を用いたビフネルロート上で吸引ろ過を行ない、ろ液を脱脂卵黄水溶液としてクロスフローシステムへ供した。
まず１段階目として、脱脂卵黄水溶液２００ｍＬを、膜間差圧（ＴＭＰ）０．１ＭＰaの条件下でろ過を行なった。Ｖｉｖａｆｌｏｗ５０Ｒシリーズについては、流加速度２００ｍＬ／ｍｉｎ、Ｖｉｖａｆｌｏｗ５０シリーズについては、流加速度５０ｍＬ／ｍｉｎ、その他の限外ろ過膜については流加速度４０ｍＬ／ｍｉｎで運転し、透過液１６０ｍＬ、濃縮液４０ｍＬを得た（透過液および濃縮液）。
次に２段階目として、濃縮液に連続的に水２００ｍＬを加水しながら、膜間差圧（ＴＭＰ）０．１ＭＰaの条件下でダイアフィルトレーション（ＤＦ）を行った。Ｖｉｖａｆｌｏｗ５０Ｒシリーズについては、流加速度２００ｍＬ／ｍｉｎ、Ｖｉｖａｆｌｏｗ５０シリーズについては、流加速度５０ｍＬ／ｍｉｎ、その他の限外ろ過膜については流加速度４０ｍＬ／ｍｉｎで運転し、透過液２００ｍＬ、濃縮液４０ｍＬを得た（ＤＦ透過液およびＤＦ濃縮液）。
得られた透過液、ＤＦ透過液、ＤＦ濃縮液を水で２００ｍＬにメスアップ後、以下の方法でタンパク質含有量の測定、アミノ酸含有量の測定及びＳＧＰ回収率の測定を行った。タンパク質含有量の測定結果及びＳＧＰ回収率の測定結果を図１０（再生セルロース系ＵＦ膜）、図１１および図１２（ＰＥＳ系ＵＦ膜）に示す。また、アミノ酸含有量の測定結果を図１３（再生セルロース系ＵＦ膜）、図１４および図１５（ＰＥＳ系ＵＦ膜）に示す。
　ａ）Ｂｒａｄｆｏｒｄ法[Bradford, M. M.,Anal.Biochem. 72:248-254 (1976)]によるタンパク質含量の測定
　スタンダード（ＢＳＡ（牛血清アルブミン、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．））と各処理液の上澄み液をそれぞれ３０μＬ分注し、発色液（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．））１．５ｍＬをそれぞれに添加して、攪拌後、室温で１０分以上保持して、５９５ｎｍの吸光度を測定した。結果は、脱脂卵黄水溶液のタンパク質濃度を１００％としたときの相対タンパク質濃度（％）を図内に表示した。
ｂ）ＨＰＬＣによるアミノ酸含量の測定
実施例１のＨＰＬＣ条件により分析を行い、各種アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）のピーク面積値を測定した。同様に、脱脂卵黄水溶液及び各処理液の上澄み液各５μＬをＨＰＬＣへ注入し、実施例１のＨＰＬＣ条件により分析を行い、各種アミノ酸のピーク面積値を測定した。各種アミノ酸の回収率は、脱脂卵黄水溶液の各種アミノ酸のピーク面積値を１００％としたときの相対ピーク面積値（％）を図内に表示した。
ｃ）ＨＰＬＣによるＳＧＰ回収率の測定
実施例１のＨＰＬＣ条件により分析を行い、ＳＧＰのピーク面積値を測定した。同様に、脱脂卵黄水溶液及び各処理液の上澄み液各５μＬをＨＰＬＣへ注入し、実施例１のＨＰＬＣ条件により分析を行い、ＳＧＰのピーク面積値を測定した。ＳＧＰの回収率は、脱脂卵黄水溶液のＳＧＰのピーク面積値を１００％としたときの相対ピーク面積値（％）を図内に表示した。

［結果］
　再生セルロース系ＵＦ膜の結果は図１０に示される。Ｖｉｖａｆｌｏｗ５０Ｒシリーズの膜で処理した場合、処理溶液中のタンパク質濃度は、５Ｋ、１０Ｋ及び３０Ｋの膜においてはＤＦ濃縮液（Ｃ）が高く、１００Ｋの膜においては透過液（Ａ）が高かった。Ｕｌｔｒａｃｅｌシリーズの膜で処理した場合、処理溶液中のタンパク質濃度は、５Ｋ、１０Ｋ及び３０Ｋの膜においてはＤＦ濃縮液（Ｃ）が高かった。
　また、処理溶液中のＳＧＰ回収率は、Ｖｉｖａｆｌｏｗ５０Ｒシリーズの膜で処理した場合、５Ｋ及び１０Ｋの膜においてはＤＦ濃縮液（Ｃ）が高く、３０Ｋ及び１００Ｋにおいては透過液（Ａ）、ＤＦ透過液（Ｂ）が高かった。Ｕｌｔｒａｃｅｌシリーズの膜で処理した場合、処理溶液中のＳＧＰ回収率は、５Ｋの膜においてはＤＦ濃縮液（Ｃ）が高く、１０Ｋ及び３０Ｋの膜においては透過液（Ａ）、ＤＦ透過液（Ｂ）が高かった。
また、上記のＵＦ膜による各処理液中のアミノ酸含有量を測定した結果を図１３（再生セルロース系ＵＦ膜）に示す。この結果から分かるように、何れの膜においても、ＤＦ濃縮液（Ｃ）にアミノ酸が検出されなかった。
これらの結果から、各メーカー間で膜の分離性能に若干の差が見られるものの、再生セルロース系ＵＦ膜を用いる場合、１次膜として３０Ｋ付近の膜を選択することで、ＳＧＰとタンパク質などの不純物を分離することができると考えられ、２次膜として１０Ｋ以下の膜を選択することで、ＳＧＰとアミノ酸などの低分子の不純物を分離することができると考えられる。
ＰＥＳ系ＵＦ膜の結果は図１１および図１２に示される。処理溶液中のタンパク質濃度は、Ｖｉｖａｆｌｏｗ５０シリーズの膜で処理した場合、５Ｋ、１０Ｋ及び３０Ｋの膜においてはＤＦ濃縮液（Ｃ）が高く、５０Ｋ及び１００Ｋの膜においては透過液（Ａ）、ＤＦ透過液（Ｂ）で高かった。Ｐｅｌｌｉｃｏｎ　ＸＬ　５０（Ｂｉｏｍａｘ）シリーズの膜で処理した場合、処理溶液中のタンパク質濃度は、５Ｋ、１０Ｋ、３０Ｋ及び５０Ｋの膜においてはＤＦ濃縮液（Ｃ）が高かった。Ｋｖｉｃｋ　Ｓｔａｒｔシリーズの膜で処理した場合、処理溶液中のタンパク質濃度は、５Ｋ、１０Ｋ、３０Ｋ及び５０Ｋの膜においてＤＦ濃縮液（Ｃ）が高かった。Ｍｉｎｉｍａｔｅシリーズの膜で処理した場合、処理溶液中のタンパク質濃度は、５Ｋ及び１０Ｋの膜においてはＤＦ濃縮液（Ｃ）が高く、３０Ｋ及び５０Ｋの膜においてはＤＦ濃縮液（Ｃ）、透過液（Ａ）、ＤＦ透過液（Ｂ）のそれぞれに含まれていた。
　また、各処理液中のＳＧＰ回収率について、Ｖｉｖａｆｌｏｗ５０シリーズの膜で処理した場合、５Ｋの膜においてはＤＦ濃縮液（Ｃ）が高く、１０Ｋ、３０Ｋ、５０Ｋ及び１００Ｋの膜においては透過液（Ａ）、ＤＦ透過液（Ｂ）で高かった。Ｐｅｌｌｉｃｏｎ　ＸＬ　５０（Ｂｉｏｍａｘ）シリーズの膜で処理した場合、処理溶液中のＳＧＰ回収率は、５Ｋの膜においては、ＤＦ濃縮液（Ｃ）、透過液（Ａ）、ＤＦ透過液（Ｂ）のそれぞれに含まれ、１０Ｋ、３０Ｋ及び５０Ｋの膜においては透過液（Ａ）、ＤＦ透過液（Ｂ）で高かった。Ｋｖｉｃｋ　Ｓｔａｒｔシリーズの膜で処理した場合、処理溶液中のＳＧＰ回収率は、５Ｋの膜においてはＤＦ濃縮液（Ｃ）が高く、１０Ｋ、３０Ｋ及び５０Ｋの膜においてはＤＦ濃縮液（Ｃ）、透過液（Ａ）及びＤＦ透過液（Ｂ）のそれぞれに含まれていた。Ｍｉｎｉｍａｔｅシリーズの膜で処理した場合、処理溶液中のＳＧＰ回収率は、５Ｋ及び１０Ｋの膜においてはＤＦ濃縮液（Ｃ）、透過液（Ａ）及びＤＦ透過液（Ｂ）のそれぞれに含まれ、３０Ｋ及び５０Ｋの膜においては透過液（Ａ）及びＤＦ透過液（Ｂ）で高かった。
また、上記のＵＦ膜による各処理液中のアミノ酸含有量を測定した結果を図１４及び１５（ＰＥＳ系ＵＦ膜）に示す。この結果から分かるように、何れの膜においても、ＤＦ濃縮液（Ｃ）にアミノ酸が検出されなかった。
これらの結果から、各メーカー間で膜の分離性能に若干の差が見られるものの、ＰＥＳ系ＵＦ膜を用いる場合、１次膜として１０Ｋ～３０Ｋ付近の膜を選択することで、ＳＧＰとタンパク質などの不純物を分離することができると考えられ、また２次膜として５Ｋ以下の膜を選択することで、ＳＧＰとアミノ酸などの低分子の不純物を分離することができると考えられる。
　以上、本発明の方法に用いられる限外ろ過膜の重要な性質であるＳＧＰとタンパク質などの不純物の分離、ＳＧＰとアミノ酸などの低分子の不純物の分離が得られることが示された。これらの限外ろ過膜を組み合わせることでＳＧＰを選択的に精製することができると考えられる。

Claims (11)

  1. 　以下の工程Ａ及びＢを含むことを特徴とする、クロスフロー方式限外ろ過によるシアリルグリコペプチド（ＳＧＰ）又はＳＧＰと同一の糖鎖を含む、ＳＧＰのペプチド分解物（以下、合わせて「ＳＧＰ物質」という）の精製方法、
    工程Ａ：ＳＧＰ物質を含有する水溶液を、ＳＧＰ物質を透過させ、且つ、タンパク性不純物が透過しない１次膜を用いたクロスフロー方式の限外ろ過処理により透過液を得る工程、及び、
    工程Ｂ：工程Ａの透過液を、ＳＧＰ物質が透過しない２次膜を用いたクロスフロー方式の限外ろ過処理により濃縮液を得る工程。
  2. 　ＳＧＰ物質が、ＳＧＰであり、工程ＡにおけるＳＧＰ物質を含有する水溶液が、鳥類の卵黄成分を含む水溶液であることを特徴とする、請求項１の精製方法。
  3. 　鳥類の卵黄成分を含有する水溶液が、鶏卵の脱脂卵黄粉の水溶液である、請求項２の精製方法。
  4. 　１次膜が、１０ｋ～５０ｋＤａの排除限界分子量の限外ろ過膜であり、２次膜が１０ｋＤａ以下の排除限界分子量であり、且つ、１次膜よりも小さい排除限界分子量を有する限外ろ過膜である、請求項２の精製方法。
  5. 　１次膜が、３０～５０ｋＤａの排除限界分子量を有するセルロース系限外ろ過膜、又は、１０～３０ＫＤａの排除限界分子量を有するＰＥＳ系限外ろ過膜であり、２次膜が１０ｋＤａ以下の排除限界分子量を有するセルロース系限外ろ過膜、又は、１０ＫＤａ以下の排除限界分子量を有するＰＥＳ系限外ろ過膜である、請求項４の精製方法。
  6. 　ＳＧＰ物質が、ＳＧＰと同一の糖鎖を含む、ＳＧＰのペプチド分解物であり、工程ＡにおけるＳＧＰ物質を含有する水溶液が、精製されたＳＧＰをペプチダーゼ処理した反応液であることを特徴とする、請求項１の精製方法。
  7. 　工程Ｂで得られた濃縮液を、ＳＧＰ物質を分離可能な樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーにより、ＳＧＰ物質を含有する画分を回収する工程を、さらに含む請求項１の精製方法。
  8. 　ＳＧＰ物質を分離可能な樹脂が、逆相樹脂、順相樹脂、イオン交換樹脂、ゲルろ過樹脂または合成吸着樹脂である請求項６の精製方法。
  9. 　ＳＧＰ物質を分離可能な樹脂が、スチレン－ジビニルベンゼン系合成吸着樹脂、スチレン－ジビニルベンゼン系修飾型合成吸着樹脂、メタクリル系合成吸着樹脂またはフェノール系合成吸着剤である請求項７の精製方法。
  10. 　ＳＧＰ物質を分離可能な樹脂が、スチレン－ジビニルベンゼン系修飾型合成吸着樹脂である請求項８の精製方法。
  11. 　請求項１～１０のいずれかの方法で精製されたＳＧＰ物質を、適切な形態で包装する工程を含む、ＳＧＰ物質製品の製造方法。
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