CN103561758A - 通过沉降灭活/去除凝血因子的方法 - Google Patents

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Abstract

一种灭活或去除含蛋白质的溶液中的凝血因子的方法，所述凝血因子为FII，FVII，FVIIa，FIX，FIXa，FX，FXI和FXIa，所述含蛋白质的溶液从血液、血浆、血浆组分获得或通过重组手段获得，其中将所述含蛋白质的溶液与有机酸或其盐接触，同时进行搅拌。

Description

通过沉降灭活/去除凝血因子的方法
技术领域
本发明提供了一种灭活源自血液、血浆或者通过重组方法获得的蛋白制剂中凝血因子的方法。
引言
凝血因子作为凝血级联系统中接触活化或内源性凝血途径的一部分，在血液凝固和血凝块形成中发挥了重要作用。有证据表明，部分凝血因子，例如FXI，在药品制造过程中可能会被激活，所以剔除或至少灭活这些激活的凝血因子显得很有必要。更优选从要用于静脉内或皮下应用的医疗制剂中除去尽可能多的凝血因子，以避免在病人中发生不良和威胁健康的血凝块形式的血栓事件。
减少混有其他蛋白质，例如免疫球蛋白或白蛋白的溶液中的FXIa或FXI的方法是已知的，但包括耗时的层析法，在使用特定的亲和树脂时，这还意味着大量的成本投入。
Bouma等;J.Biol.Chem；1977；252（18）；6432-7教导了从不含可测量（小于0.01U/ml）FXIa的血浆中提纯FXI的方法，该方法包括四个连续的层析步骤，首先为DEAE层析，接着为QAE-和SP层析，以及利用SP-葡聚糖凝胶的第二层析步骤。在某些情况中，利用刀豆蛋白A琼脂糖亲和凝胶进行额外的层析纯化来消除γ-球蛋白（免疫球蛋白G）。
Komiyama等;Thromb.Res;1992;66;397-408描述了借助FXI的固定化抗体除去血小板浓缩物中FXI/FXIa的方法。
因此，本领域迫切需要一种光谱、高效、简单的去除凝血因子的方法。
发明概述
本发明的目的提供从包含激活的凝血因子及其未激活的酶原的来源中灭活和/或除去这些蛋白质的方法。本发明公开了从含有激活的和/或未激活的凝血因子，特别是凝血因子FXIa和FXI，但也包括FII，FVII，FVIIa，FIX，FIXa和FX的来源中灭活和/或去除这些凝血因子的方法。感兴趣的来源包括血液或血浆或其诸组分，特别是血浆中主要含有免疫球蛋白或白蛋白作为治疗活性蛋白的诸组分。
出乎意料地发现，将含凝血因子的免疫球蛋白G（IgG）溶液与有机酸或其盐接触，同时在约0℃至约40℃的温度下、约3.5至约6.0的pH范围下搅拌，不仅FXIa被灭活或去除，其他凝血因子同样被灭活或去除。所述的有机酸可以是C4到C10，饱和的或不饱和的有机酸或其盐，特别是碱土金属的盐，如钠盐。
在本发明的一个实施方式中，有机酸为丁酸（C4），戊酸（C5），己酸（C6），庚（C7），辛酸（C8），壬酸（C9），和/或癸酸（CIO）或其盐，如钠盐。优选地，有机酸是辛酸，或它的盐是辛酸钠盐，但戊酸和癸酸的盐也认为是非常适合的。
有机酸或其盐的施用浓度为5至50mmol/L。蛋白质和有机酸或其盐搅拌45至180分钟，优选地，55至120分钟，随后将产生的沉淀物与上清液分离。搅拌时可任选使用助滤剂如硅酸盐，例如选自以下的天然产生或合成的硅酸盐：硅藻土、煅制氧化硅、珍珠岩或沸石。这种灭活或去除步骤的优势在于可以将其引入提纯源自血液的蛋白质的任何已知方法的合适之处。得到的蛋白质溶液用现有技术中已知的方法进一步处理。方法特别适合用来制造免疫球蛋白制剂。
发明详述
本发明提供从包含凝血因子的来源中灭活和/或除去此类蛋白质的方法。这种来源的例子有主要含有免疫球蛋白，特别是免疫球蛋白G（IgG抗体）或白蛋白的蛋白质溶液。本发明可避免采用去除凝血因子FII，FVII，FVIIa，FIX，FIXa，FX，FXI和FXIa所用的层析操作。当然，可以为其它原因而额外采用层析法纯化步骤。
出乎意料的是，本研究发现，将含有凝血因子的复杂混合物的溶液，特别是血浆分级的I+II+III组分或类似组分，与有机酸或其盐，特别是钠盐，在1℃至40℃，特别是2℃到30℃的温度下，在约4至约6，特别是4.2到5.6的较宽pH范围内接触，能将所述的凝血因子灭活或去除到超出检测限的水平。当溶液与浓度至少为20mmol／L的辛酸或其盐接触时，还观察到XI因子抗原（FXI：Ag）的值降低到低于5mIU／mg IgG。在用有机酸或其盐处理期间，pH值可以在所述范围内变动，或在该范围内维持基本恒定，其中与固定值的偏差为+/-0.3。有机酸或其盐，特别是辛酸钠的施用浓度范围从5到50mmol/L，特别是从10到22mmol/L。在持续搅拌下，蛋白和有机酸或其盐接触45到180分钟，特别是55到120分钟。搅拌时可任选使用助滤剂，如硅酸盐，例如选自下组的天然产生的或合成硅酸盐：硅藻土、煅制氧化硅、珍珠岩或沸石；并在接触完成后与产生的沉淀物一起除去。沉淀物和上清液的分离可以使用通用已知的方法进行，可通过过滤，离心或沉降进行，这过程一般再需要60到120分钟。通过沉降来分离可能需要更长时间。一个沉淀和分离周期可能要持续5个小时，从开始沉淀到分离结束。特别是，如果第一次灭活或去除可能不足以完全灭活或去除有些凝血因子，这些凝血因子的残留量仍在检测限之上，可适当的进行第二次的灭活或去除步骤。将沉淀物和上清液分离的方法是众所周知的，包含沉降，过滤或离心或它们的组合。因此，利用有机酸或其盐进行的第二灭活可纳入作为备选项。该灭活或去除步骤可以引入提纯源自血液的蛋白质的任何已知方法的合适之处。产生的蛋白质溶液用现有技术已知的方法做进一步处理。常规处理包括用于去除残留量的有机酸或其盐的阴离子层析法，溶剂/去污剂处理（S/D处理），超滤和渗滤，制成制剂，无菌过滤和灌装到最终容器中。产品还可任选进行冻干处理。最终IgG产品的抗体浓度通常是在5-16%范围内，但抗体浓度最高约25%也是可能的。必须指出，由于静脉内施用时粘度的原因，浓度高于20%的产品需要特殊制成制剂。发现IgG抗体的回收能从下述处理中获益：用一种有机酸或盐在约2-8℃的低温下处理，随后用不同的有机酸或其盐在20-40℃的室温下处理。此类方法的一个例子为，先在2-8℃温度下用辛酸钠盐处理，将沉淀物分离后用戊酸钠盐或癸酸钠盐在20-40℃下处理溶液。
分析方法
为了确保在生产过程中凝血因子不发生活化或浓缩，在整个过程中都会取出进程中样品(in-process sample)来分析上述的凝血因子。所有进程中样品以及最终容器中的产品都测试凝血因子存在与否。由于灭活或去除，最迟到第二次有机酸或其盐处理后，不可能检测到凝血因子。即使在浓缩的最终产品中也没有达到或超过凝血因子的检测限。此外，用NATEM和凝血酶生成分析（TGA）分析最终产品中促凝活性，所有最终产品都没有检测到凝血活性。
促凝活性
基于血栓弹性描记法(thrombelastography)的原则，采用购自
Figure GDA0000417286460000031
公司的
Figure GDA0000417286460000032
凝血分析仪与
Figure GDA0000417286460000033
测试和购自的
Figure GDA0000417286460000042
试剂来测定缺乏XI因子的血浆的促凝活性测定。所有试验都是对最终产品进行检测（IgG浓度5％，10％和16％），超过3000秒（50分钟）后终止，显示没有促凝活性。
凝血酶生成分析
利用Technoclone公司的
Figure GDA0000417286460000043
TGA，对XI因子缺乏的血浆以及合并的正常血浆作凝血酶生成分析（TGA）。测定了时滞(Lag-time)，即凝血酶形成的起始，测定了凝血酶峰值和TTP（即到峰值时间）。结果汇总在表1，结果显示，，XI因子缺乏血浆（FXI-PD）中，有一定长度延长的时滞和TTP，并且凝血酶峰值减少至血浆合并值的10%左右。
表1：
Figure GDA0000417286460000044
分析因子FII,FVII,FVIIa,FIX,FIXa,FX,FXI和FXIa
除了FIXa和FXIa，使用Werfen集团ACL10000血凝仪和相关的检测试剂盒测定所述凝血因子的凝血活性，而FIXa和FXIa的测定是使用
Figure GDA0000417286460000045
因子检测试剂盒(BioMed)及其改进版。FXIa的凝血活性是基于
Figure GDA0000417286460000047
因子检测试剂盒测定的，试剂盒附加了重组FIX并用FXIa浓缩液来校准。虽然FIXa的初始校准曲线只允许作1.0mIU/ml的较低检测限分析，第二校准曲线（“低校准浓度曲线”）允许作0.32mIU/ml的较低检测限分析。因此，在分析结果的表中两个检测限都能体现。结果汇总在表2。以“<”给出的值表明未达到检测限，在表2中部分平均值显示为低于检测限的值，这表明并不是所有的值均低于检测限，这些平均值计算为“＜”所示结果的检测限的一半和高于检测限的那些结果的实测值之和。对于含所述检测限一半的计算值的另一种选择是用检测限的值进行计算作为最坏情况模拟(worst casescenario)，表现为0.015IU/ml FVII,8.4mIU/ml FVIIa,0.016IU/ml FIX,1.12mIU/ml FIXa and1.0mIU/ml FXIa。
万一有少许残留的FII因子的存在浓度低于0.014IU/mL的检测限，应理解为，该量是在0.001至0.014IU/ml FII的范围内。其他因子同样如此，FVII检测限是0.015IU/mL和范围是0.001至0.015IU/ml，FVIIa检测限8.4mIU/ml和范围0.1至8.4mIU/mL，FXI检测限0.016IU/mL和范围0.001至0.016IU/ml范围，FIXa检测限1.12mIU/mL和范围0.01至1.12mIU/mL，FX检测限0.015IU/ml和范围0.001至0.015IU/ml，FXI检测限0.014IU/ml和范围0.001至0.014IU/ml。同样对于FXIa，用低浓度校准曲线测定，检测限0.32mIU/mL和范围0.01至0.32mIU/ml，而初始使用的校准曲线只允许1mIU/ml检测限，因此相应的范围是0.01至1mIU/ml。
实施例1
将来自血浆分级的I+II+III组分溶解，并冷却至2-8℃，将pH保持恒定的4.80-4.95范围内，此时自该溶液抽取样品A。辛酸钠加入至终浓度20mmol/L，并将溶液搅拌90分钟，然后过滤。抽取样品B后，将过滤后的溶液加热至21-27℃，将pH保持恒定在约4.9的给定范围，再次加入辛酸盐至20mmol/L的浓度。搅拌60分钟，离心，从上清液中抽取样品C，对所有样品进行检测。将上清液作进一步处理：阴离子层析、病毒灭活（S/D处理）、超滤和渗滤、制成制剂、无菌过滤和灌装到最终产品中。
实施例2
进行基本上与实施例1相同的步骤，除了在第二步的沉降中每升溶液的辛酸盐加入量为10mmol/L，而非调整为20mmol/L。
实施例3和4：利用戊酸和癸酸的钠盐进行与实施例2相同的步骤。
上述实施例结果汇总为下列表格：
表2：实施例1和实施例2所述的方法中，没有观测到凝血活性的显著差异：虽然之后的实验（见表4至表7）显示，在加入沉淀剂之前，源材料中的凝血因子浓度显著较高，但本文所示的本发明方法设法去除了这些凝血因子。即使在IgG浓度为10％时也没有检测到凝血因子。
表2
Figure GDA0000417286460000061
表2（续）
表3：根据实施例3和4的步骤：
Figure GDA0000417286460000081
表4：pH值保持不变沉降
Figure GDA0000417286460000091
表4（续）：pH值保持不变沉降
Figure GDA0000417286460000092
表4（续）：pH值保持不变沉降
Figure GDA0000417286460000101
表4（续）：pH值保持不变沉降
表4（续）：pH值保持不变沉降
Figure GDA0000417286460000111
表4（续）：pH值保持不变沉降
Figure GDA0000417286460000112
表5：随pH值增加的沉降
Figure GDA0000417286460000121
表5（续）：随pH值增加的沉降
Figure GDA0000417286460000122
表6：随pH值降低的沉降
Figure GDA0000417286460000131
表6（续）：随pH值降低的沉降
Figure GDA0000417286460000132
表7：癸酸/盐沉降
Figure GDA0000417286460000141
表8：相同的起始材料进行的辛酸沉降，pH值和浓度的影响
Figure GDA0000417286460000142

Claims (15)

1.一种灭活或去除含蛋白质的溶液中的凝血因子的方法，所述凝血因子为FII，FVII，FVIIa，FIX，FIXa，FX，FXI和/或FXIa，所述含蛋白质的溶液从血液、血浆、血浆组分获得或通过重组手段获得，其中将所述含蛋白质的溶液与有机酸或其盐接触，同时进行搅拌。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机酸为C4至C10，饱和或不饱和的有机酸或其盐。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述有机酸选自丁酸（C4），戊酸（C5），己酸（C6），庚酸（C7），辛酸（C8），壬酸（C9），癸酸（CIO）或其盐类。
4.如权利要求1-3之任一所述的方法，其特征在于，所述有机酸是辛酸或癸酸，或这些酸的盐。
5.如权利要求1-4之任一所述的方法，其特征在于，所述方法包括在约1℃至约40℃的温度下，将所述溶液与有机酸或其盐接触。
6.如权利要求1-5之任一所述的方法，其特征在于，所述方法包括：所述溶液与有机酸或其盐在约2℃至约8℃的温度下的第一次接触，所述溶液与相同的酸或其盐或不同的酸或其盐在约20℃至约30℃的温度下的第二接触。
7.如权利要求1-6之任一所述的方法，其特征在于，所述接触发生在4.0至6.0的pH范围内。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述接触发生在4.2至5.6的pH范围内。
9.如权利要求1-8之任一所述的方法，其特征在于，所述有机酸或其盐加入含蛋白质的溶液中达到浓度为5至50mmol/L。
10.如权利要求1-9之任一所述的方法，其特征在于，所述有机酸或其盐加入含蛋白质的溶液中达到浓度为10至22mmol/L。
11.如权利要求1-10之任一所述的方法，其特征在于，所述有机酸或其盐与含蛋白质溶液被搅拌45至180分钟。
12.如权利要求1-11之任一所述的方法，其特征在于，所述有机酸或其盐与含蛋白质溶液被搅拌55至120分钟。
13.如权利要求1-12之任一所述的方法，其特征在于，所述的有机酸或其盐与含蛋白质的溶液在有天然产生的或合成的硅酸盐存在下搅拌。
14.如权利要求1-13之任一所述的方法，其特征在于，搅拌后，通过选自过滤、沉降或离心的分离方法从含有有机酸或其盐的蛋白质溶液产生上清液。
15.如权利要求1-14之任一所述的方法，其特征在于，该方法还包括：阴离子交换层析，S/D处理，纳滤，超滤，渗滤，制成制剂，无菌过滤，填充到最终容器中和任选的冷冻干燥。
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