TW201534613A - 寡糖胜肽之純化方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係提供簡便地自卵黃成分純化唾液酸醣肽(sialylglycopeptide)的方法，其包含使含鳥類之卵黃成分的水性溶液與除蛋白質劑混合而獲得溶解液部的步驟。

Description

寡糖胜肽之純化方法
本發明係關於簡便地純化含於卵黃成分的寡糖胜肽之方法。
雞之卵黃所含的寡糖胜肽的唾液酸醣肽(Sialyl GlycoPeptide：以下，稱為「SGP」)，因所含寡糖鏈為人型，而有用於作為醫藥品之原料。
就SGP之純化方法而言，於專利文獻1等，已知自雞之脫脂卵黃含有物，對複數次之水性溶液的提取操作後，接著藉由對該提取液的乙醇等之水溶性有機溶劑而沉澱的提取操作進行複數次，將獲得的沉澱溶解於水，使吸附於ODS系逆相樹脂(逆相分配層析用樹脂之一種)，而溶出的方法。
又，專利文獻1以前所知的技術有必要作複數次之濃縮脫鹽操作，且於純度或產率的觀點為不充分(專利文獻2)，又，藉由管柱層析的純化並不適合大量純化(非專利文獻1)。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際專利公開公報WO2011/027868
[專利文獻2]國際專利公開公報WO96/02255號
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Akira Seko, et al., Biochimica et Biophysica Acta, (1997), Vol. 1335, p.23-32
於歷來已知的方法，於高純度之SGP之工業規格純化上，因有必須重複複數次使用多量有機溶劑的提取，危險的操作係有必要的，又，許多時間、設備、勞力係有必要的。
本發明者於SGP之純化方法，不斷專心檢討，發現於卵黃成分之水溶液，添加通常於蛋白質‧胜肽之純化上不使用的除蛋白質劑，去除不溶成分而SGP殘留於溶解液部，其他不要的蛋白質藉由除蛋白質劑而被除去，又，使獲得的溶解液部吸附於合成吸附樹脂，經溶出，可以高產率純化高純度之SGP，進而不斷檢討而完成本發明。
本發明提供以下之發明。
(1)一種唾液酸醣肽(SGP)之純化方法，其特徵為包含以下之步驟A，步驟A：使含鳥類之卵黃成分的水性溶液與除蛋白質劑混合，而獲得溶解液部的步驟。
(2)如(1)之方法，其中除蛋白質劑係合成二氧化矽系除蛋白質劑、具有蛋白質凝固作用的添加劑、或具有蛋白質分解作用的添加劑。
(3)如(2)之方法，其中合成二氧化矽系除蛋白質劑係合成矽膠或合成二氧化矽膠體。
(4)如(3)之方法，其中合成二氧化矽系除蛋白質劑係滿足粒徑：約1~50μm、比表面積：約100~1500m2/g、細孔容積：約0.5~3ml/g、平均細孔徑：約1~50nm的合成矽膠。
(5)如(1)之方法，其中含鳥類之卵黃成分的水性溶液係雞之卵黃或脫脂卵黃之水溶液。
(6)如(1)之方法，其中含鳥類之卵黃成分的水性溶液係事前去除不溶成分的溶液。
(7)如(1)之方法，其進一步包含將步驟A所獲得的溶解液部，藉由使用可將SGP分離的樹脂的管柱層析操作，將含有SGP的劃分加以回收的步驟。
(8)如(7)之方法，其中可將SGP分離的樹脂係逆相樹脂、順相樹脂、離子交換樹脂、凝膠過濾樹脂或合成吸附樹脂。
(9)如(8)之方法，其中合成吸附樹脂係苯乙烯-二乙烯苯系合成吸附樹脂、苯乙烯-二乙烯苯系修飾型合成吸附樹脂、甲基丙烯酸系合成吸附樹脂、酚系合成吸附樹脂。
(10)如(9)之方法，其中合成吸附樹脂係苯乙烯-二乙烯苯系修飾型合成吸附樹脂。
(11)一種SGP製品之製造方法，其包含將如(1)至(10)中任一項之方法所純化的SGP以適切形態加以包裝的步驟。
本發明之方法，由卵黃成分之SGP以外的蛋白質成分的除去操作，因進行一次對水溶液的除蛋白質劑之添加‧除去操作即結束，故短時間、且少勞力來純化SGP係可能的。又，於此步驟，因不使用有機溶劑，而為安全，亦不須特殊的設備。再者，就自除蛋白質操作後之溶液回收SGP的管柱層析操作所使用的管柱填充用樹脂而言，使用SEPABEADS SP207SS(三菱化學(股))之類的合成吸附樹脂，可進行藉由使用鹼性溶液的洗淨的樹脂再生操作。藉由此操作，將樹脂再利用係為可能的，進一步削減成本係可能的。又，以本發明之方法，因提供廢液之量亦少、可選擇作為合成吸附樹脂而再利用者，對環境亦為少的不良影響的方法。
第1圖係SGP標準品之HPLC測定結果的圖。
第2圖係SGP標準品之LC/MS測定結果的圖。
第3圖係SGP標準品之1H-NMR測定結果的圖。
第4圖係實施例1所純化的糖胜肽之HPLC測定結果的圖。
第5圖係實施例1所純化的糖胜肽之LC/MS測定結果的圖。
第6圖係實施例1所純化的糖胜肽之1H-NMR測定結果的圖。
第7圖係實施例2所純化的糖胜肽之HPLC測定結果的圖。
第8圖係表示將為合成矽膠的各種SYLORUTE作為添加劑，以各pH條件處理之際之處理後上清液的相對蛋白質濃度(柱狀圖)及SGP回收率(線圖)的圖。Y軸表示相對蛋白質濃度(%)及SGP回收率(%)、兩者之%。橫軸係表示各自之添加劑中的處理時溶液的pH。柱狀圖係白色條表示15分鐘處理、黑色條表示60分鐘處理的情形之相對蛋白質濃度。線圖中◆表示15分鐘處理、●表示60分鐘處理的情形之SGP回收率。
第9圖係表示將為合成矽膠的各種MIZUKASORB作為添加劑，以各pH條件處理之際之處理後上清液的相對蛋白質濃度(柱狀圖)及SGP回收率(線圖)的圖。Y軸表示相對蛋白質濃度(%)及SGP回收率(%)、兩者之%。橫軸係表示各自之添加劑中的處理時溶液之pH。柱狀圖係白色條表示15分鐘處理、黑色條表示60分鐘處理的情形之相對蛋白質濃度。線圖中◆表示15分鐘處理、●表示60分鐘處理的情形之SGP回收率。
第10圖係表示將為合成矽膠的各種CARPLEX、Microd KM-386P作為添加劑，於各pH條件處理之際之處理後上清液的相對蛋白質濃度(柱狀圖)及SGP回收率(線圖)的圖。Y軸係表示相對蛋白質濃度(%)及SGP回收率(%)、兩者之%。橫軸係表示各自之添加劑中的處理時溶 液之pH。柱狀圖係白色條表示15分鐘處理、黑色條表示60分鐘處理的情形之相對蛋白質濃度。線圖中◆表示15分鐘處理、●表示60分鐘處理的情形之SGP回收率。
第11圖係表示將為合成二氧化矽膠體的各種Coporoc作為添加劑，於各pH條件處理之際之處理後上清液的相對蛋白質濃度(柱狀圖)及SGP回收率(線圖)的圖。Y軸表示相對蛋白質濃度(%)及SGP回收率(%)、兩者之%。橫軸表示各自之添加劑中的處理時溶液之pH。柱狀圖係白色條表示15分鐘處理、黑色條表示60分鐘處理的情形之相對蛋白質濃度。線圖中◆表示15分鐘處理、●表示60分鐘處理的情形之SGP回收率。
第12圖係表示將為一般的過濾輔助劑的Celite 545、Fibracell BH-40、各種Topco Perlite作為添加劑，於各pH條件處理之際之處理後上清液的相對蛋白質濃度(柱狀圖)及SGP回收率(線圖)的圖。Y軸表示相對蛋白質濃度(%)及SGP回收率(%)、兩者之%。橫軸係表示各自之添加劑中的處理時溶液之pH。柱狀圖係白色條表示15分鐘處理、黑色條表示60分鐘處理的情形之相對蛋白質濃度。線圖中◆表示15分鐘處理、●表示60分鐘處理的情形之SGP回收率。
第13圖係表示將鞣酸及木瓜蛋白酶作為添加劑，於各pH條件下處理之際之處理後上清液的相對蛋白質濃度(柱狀圖)及SGP回收率(線圖)的圖。Y軸係表示相對蛋白質濃度(%)及SGP回收率(%)、兩者之%。橫軸係表示各自之添加劑中的處理時溶液之pH。柱狀圖係白色條表示15 分鐘處理、黑色條表示60分鐘處理(於木瓜蛋白酶，斜線條為20小時處理)的情形之相對蛋白質濃度。線圖中◆表示15分鐘處理、●表示60分鐘處理(於木瓜蛋白酶，▲表示20小時處理)的情形之SGP回收率。
第14圖係實施例4所純化的糖胜肽之HPLC測定結果的圖。
第15圖係實施例5所純化的糖胜肽之HPLC測定結果的圖。
第16圖係實施例6所純化的糖胜肽之HPLC測定結果的圖。
第17圖係實施例7所純化的糖胜肽之HPLC測定結果的圖。
第18圖係參考例1所純化的糖胜肽之HPLC測定結果的圖。
[實施發明之形態]
於以下詳細說明本發明。
本發明係提供一種唾液酸醣肽之純化方法，其特徵為含有以下之步驟A；步驟A：使含鳥類之卵黃成分的水性溶液與除蛋白質劑混合，而獲得溶解液部的步驟。
<混合‧分離>
於本發明，使2個以上之材料「混合」係意指使全部材料接觸，使各材料之成分均一地分布或溶解的狀態的操作。使混合的操作係只要可達成上述之混合狀態的操 作即可，並未特別限定，例如，可列舉振盪攪拌、藉由攪拌子的攪拌、藉由攪拌羽的攪拌等。此等之操作所需時間並未特別限定，例如，10秒鐘以上，較佳為5分鐘以上，更佳為15分鐘以上。進行此操作之際之溫度係只要各材料所含成分不會變質、變性的溫度即可，並未特別限定，但4℃至40℃為較佳。
於本發明，「獲得溶解液部」係意指除去溶液或混合液中所含的不溶物，僅回收溶劑中所溶解的溶解液部。就將溶解液部與不溶物分離的操作而言，可採用周知之各式各樣的方法。就代表的分離操作而言，可列舉過濾、離心分離等。過濾所使用的過濾器可使用濾紙、玻璃過濾器、膜過濾器、濾布等。又，就過濾的樣式而言，可採用自然過濾、吸引過濾、加壓過濾等。過濾器之種類、過濾樣式、離心分離之條件[旋轉數、時間、溫度]等係因應供給於分離的溶液等之狀態，可加以適宜選擇。又，為了使由溶液去除不溶物的效率提升，亦可於分離操作之前，於溶液等預先混合適宜Celite等之過濾輔助劑後，進行分離操作。就各自使用的過濾輔助劑而言，只要不具有除蛋白質效果者即可，可採用通常已知的各式各樣的過濾輔助劑。
於本發明，「溶解液部」係指於液體作為主成分的試料，去除不溶物所獲得之實質上不含不溶物的液體試料。溶解液部所含的各成分係至少取得該溶解液部的時點，以溶解於液體中的狀態下存在。當該溶解液部係於保存中，藉由液體條件之變更(pH、溫度等)，有 產生不溶物的情形，但如此不溶物可藉由過濾等之通常方法被去除，可回復為實質上不含不溶物的狀態。
<唾液酸醣肽>
於本發明，「唾液酸醣肽(Sialyl GlycoPeptide：以下，稱為「SGP」)：係指以下之結構式(I)及序列式(II)所示的由11個糖而成的唾液酸聚糖(sialylglycan)之還原末端的GlcNAc之第1位碳、與Lys-Val-Ala-Asn-Lys-Thr-(序列識別號1)之第4位Asn之來自側鏈醯胺基的氮原子係β-N糖苷鍵結的寡糖胜肽。
SGP係含於鳥類卵黃的糖胜肽，但經純化的 SGP已被販售，亦可購得。例如，東京化成工業(股)製之SGP之HPLC圖、LC/MS光譜及1H-NMR光譜(以實施例1記載之條件測定)係各自呈示如第1圖、第2圖及第3圖所示波峰，故將其作為標準品，可鑑定獲得的糖胜肽為SGP。
於本發明，「SGP製品」係含有SGP作為主要構成之一的製品，例如，研究試藥、工業用原料、醫藥品添加劑、食品添加劑等。作為SGP製品而製造的情形，以本發明之方法所純化的SGP係因應製品形態的狀態(冷凍乾燥粉末、溶液等)而被處理，被封入適當容器、被包裝、而製造為製品。以本發明之純化方法所獲得的SGP因係高純度，亦有用作為如此SGP製品之原料。
SGP係可藉由使用可將SGP分離的樹脂的HPLC等加以檢測或定量，就如此HPLC之條件而言，例如，可列舉以下之條件。
[使用逆相管柱的HPLC分析條件]
HPLC：1260 Infinity LC(Agilent Technologies,Inc.)
管柱：L-Column2 ODS 3μm 3.0×50mm(科學物質評價研究機構)
管柱溫度：40℃
移動相A：含0.1%HCOOH的H2O溶液(v/v)
移動相B：含0.1%HCOOH的MeCN溶液(v/v)
梯度(移動相B%)：0%(0分鐘)、10%(5分鐘)、30%(7分鐘)、30%(8分鐘)
流速：0.6ml/分鐘
檢測波長：210nm
[使用順相管柱的HPLC分析條件]
HPLC：1260 Infinity LC(Agilent Technologies,Inc.)
管柱：Inertsil Amide 3μm 3.0×75mm(GL Sciences(股))
管柱溫度：40℃
移動相A：含0.1%HCOOH的H2O溶液(v/v)
移動相B：含0.1%HCOOH的MeCN溶液(v/v)
梯度(移動相B%)：70%(0分鐘)、30%(6分鐘)、10%(6.01分鐘)、10%(7.5分鐘)
流速：0.6ml/分鐘
檢測波長：210nm。
溶液中所含的SGP係可由將對象溶液供給於上述之HPLC，將獲得的HPLC圖中的歸屬於SGP的波峰面積值而算出。例如，算出相對於起始材料溶液的SGP含量之對象溶液的SGP回收率的情形，可藉由以下之式加以算出。
回收率(%)=(對象溶液之SGP波峰面積值×對象溶液量)/(起始原料溶液之SGP波峰面積值×起始原料溶液量)×100
又，被驗SGP之純度係可將標準品之SGP之純度作為100%的相對純度而算出。就標準品SGP而言，例如，可利用市售的東京化成工業(股)製之SGP等。就測定方法而言，於正確秤量的被驗SGP中添加一定量之水等之水性溶劑，使完全溶解的被驗SGP溶液以上述之條件進行HPLC測定，測定獲得的HPLC圖中的被驗SGP之波峰 面積值。同樣地，於標準品SGP亦進行同樣之操作，調製與被驗SGP相同之濃度之標準品SGP溶液後，進行同一條件之HPLC測定，藉由以下之式可算出被驗SGP之純度。
被驗SGP純度(%)=(被驗SGP波峰面積值/標準品SGP波峰面積值)×100。
<含有卵黃成分之溶液>
SGP已知含於鳥類之卵之卵黃，因所含糖鏈結構為人型，即使人類攝取或服用，亦難以引起過敏反應。
於本發明，「含鳥類之卵黃成分的水性溶液」係意指使鳥類之卵之卵黃成分與水性溶劑混合的溶液。卵之來源只要為鳥類即可，並未特別限定，可列舉雞、鵪鶉、鴿子、鴕鳥、烏鴉等，但較佳為來自雞的卵。卵黃係可直接將與來自全卵的卵白分離者作為經乾燥的乾燥卵黃、作為經脫脂處理的脫脂卵黃、或作為將彼等作成粉末狀的卵黃粉或者脫脂卵黃粉，而用於本發明之方法。雞卵之卵黃粉、脫脂卵黃粉等係已經販售，可購入(卵黃蛋白質H(Kewpie(股))、Sunnypro DF(太陽化學(股))等)。
就使卵黃成分溶解或懸浮的溶劑而言，係以水作為主成分的水性溶劑，只要實質上不含使蛋白質變性的成分即可，可使用各式各樣的水性溶劑，但較佳為水。除蛋白質步驟所使用的含有卵黃成分的溶液係直接使用將卵黃、脫脂卵黃、彼等之粉末等之卵黃成分與水性溶劑混合者即可，但因應必要，可僅使用將不溶物分離的溶解液部。
<除蛋白質劑>
於本發明，「除蛋白質劑」係意指添加於含蛋白質的溶液中，具有使該溶液中之蛋白質量減少的效果(於本說明書稱為「除蛋白質效果」)的材料。就本發明所使用的除蛋白質劑之除蛋白質效果的樣式而言，只要使該溶液中之SGP含量不減少者即可，並未特別限定，例如如合成二氧化矽之吸附蛋白質者、如鞣酸之具有蛋白質凝固作用者、如木瓜蛋白酶之具有蛋白質分解作用者等，可採用各式各樣的除蛋白質劑，但較佳為使蛋白質吸附的除蛋白質劑，更佳為合成二氧化矽系除蛋白質劑。
就本發明所使用的合成二氧化矽系除蛋白質劑而言，可採用粉末狀之合成矽膠、膠體狀之合成二氧化矽膠體等各式各樣形態者。
就合成矽膠而言，只要具有除蛋白質效果者即可，並未特別限定，但例如，可列舉滿足如以下之性質，平均粒徑：約1~50(較佳為約2~30)μm左右、比表面積：約100~1500(較佳為約200~800)m2/g、細孔容積：約0.5~3(較佳為約1~2)ml/g、平均細孔徑：約1~50(較佳為約5~30)nm的合成矽膠。如此合成矽膠係作為過濾輔助劑被販售，具體而言，例如，可採用SYLOPUTE202、SYLOPUTE303、SYLOPUTE403(富士SILYSIA化學(股))、CARPLEX BS-303、CARPLEX BS-306(DSL‧Japan(股))、Microd KM-386P(KD corporation)、MIZUKASORB A751C、MIZUKASORB C-1、MIZUKASORB C-6(水澤化學工業(股))等。
就合成二氧化矽膠體而言，於本發明可適用帶負電者或帶正電者等各式各樣者。採用帶負電的合成二氧化矽膠體的情形，將處理時之溶液調整為酸性(pH3~4左右)可獲得良好的除蛋白質效果。又，於本發明，具有帶弱負電的合成二氧化矽膠體為較佳。就合成二氧化矽膠體而言，具體地，例如，可採用Coporoc 200、Coporoc 300、Coporoc 306(大塚食品(股))等。
<除蛋白質操作>
於本發明，使含有卵黃成分的溶液與除蛋白質劑混合之際之混合比率係依使用的除蛋白質劑之種類而異，例如，相對於溶液量，除蛋白質劑以0.1~50%(v/v或w/v)混合為宜。
又，因應必要，使與除蛋白質劑混合之前，可適宜調製含有卵黃成分的溶液之pH。依除蛋白質劑之種類，因pH依存地除蛋白質效果或對上清液之SGP回收率會變動，配合使用的除蛋白質劑來選擇適當的pH，可使SGP之純化效率提升。例如，各種SYLOPUTE、各種MIZUKASORB、各種CARPLEX、Microd KM-386P等係於pH3~6左右之弱酸性，除蛋白質效果為高、對上清液的SGP回收率亦有高的傾向，故為了使SGP之純化效率提升，將含有卵黃成分的水性溶液調整為弱酸性係較佳的。
使含有卵黃成分的溶液與除蛋白質劑混合的時間並未特別限定，但使用具有蛋白質分解作用的添加劑作為除蛋白質劑的情形，進行長時間處理時，SGP會受到分解等，處理後溶液之SGP含量有降低的情形。因 此，就使用具有蛋白質分解作用的除蛋白質劑的情形之混合時間而言，通常為5小時以下，較佳為3小時以下，更佳為2小時以下，最佳為1小時以下。
使卵黃成分溶液與除蛋白質劑混合後，使不溶物分離，獲得溶解液部。
以上述分離操作所獲得的溶解液部中之SGP之含量可藉由HPLC等之方法來確認。又，該溶解液部中之蛋白質含量可藉由周知之各式各樣的方法加以鑑定、定量。就蛋白質之鑑定方法而言，例如可利用SDS-PAGE等。又，就蛋白質之定量方法而言，可採用紫外吸光法(吸光度280nm)、布拉福(Bradford)法等。於如此蛋白質之鑑定、定量，未充分去除蛋白質的情形等時，重複上述之除蛋白質操作，或亦可組合適宜之複數的除蛋白質操作。
<自除蛋白質溶液之SGP純化>
自經過上述之除蛋白質步驟所獲得的除蛋白質溶液，使用各式各樣的管柱填充劑，可純化SGP。就如此純化所使用的管柱填充劑而言，可列舉合成吸附樹脂、逆相樹脂、順相樹脂、離子交換樹脂、凝膠過濾樹脂等。就逆相樹脂而言，為使丁基(C4)、辛基(C8)，十八基(C18)、三十基(C30)、苯基等之疏水性官能基附加於矽膠之基材的樹脂，尤其使用附加十八基的ODS系逆相樹脂(Wakogel 100C18(和光純藥工業(股))的SGP之純化，已記載於專利文獻1。又，使用為離子交換樹脂的Toyopearl DEAE-650M(TOSOH(股))、CM-Sephadex C-25(GE Healthcare UK Ltd.)、Dowex 50Wx2(The Dow Chemical Company)的SGP之純化、使用為凝膠過濾樹脂的Sephadex G-50(GE Healthcare UK Ltd.)、Sephadex G-25(GE Healthcare UK Ltd.)的SGP之純化，已各自記載於非專利文獻1，可參考此等之文獻記載之條件加以適宜純化。
<合成吸附樹脂>
本發明係提供採用合成吸附樹脂作為純化步驟中的管柱填充劑的SGP純化方法。合成吸附樹脂係指由多孔質交聯結構聚合物而成的填充劑，依據聚合物的種類，可列舉苯乙烯-二乙烯苯系合成吸附劑、苯乙烯-二乙烯苯系修飾型合成吸附樹脂、甲基丙烯酸系合成吸附樹脂、酚系合成吸附樹脂等。可利用於SGP純化者為已知的ODS系逆相樹脂等之填充劑，因將矽膠作為基材，無法使用鹼性溶液的洗淨。因此僅使用有機溶劑的洗淨，因不純物的去除並不充分，無法再利用。然而，藉由採用合成吸附樹脂作為管柱填充劑，除了使用有機溶劑的洗淨，因藉由使用鹼性溶液的洗淨而樹脂再生為可能的，可充分進行不純物之去除，再利用合成吸附樹脂係可能的。就如此合成吸附樹脂而言，只要可吸附SGP者即可，可採用各式各樣的合成吸附樹脂，但較佳為苯乙烯-二乙烯苯系合成吸附樹脂，更佳為苯乙烯-二乙烯苯系修飾型合成吸附樹脂。就具體的製品而言，可列舉SEPABEADS SP207SS(三菱化學(股))等。
就純化SGP的方法而言，使上述步驟所獲得的除蛋白質後之溶液通過填充管柱填充劑的管柱，因應 必要，以因應層析之分離模式的適切溶劑加以洗淨，使用因應層析之分離模式的移動相而使溶出，於溶出液回收含有SGP的劃分，可將SGP純化。於此純化步驟之前，若需要，合併使用的管柱填充劑或層析之模式，可適宜調整除蛋白質後溶液之條件。藉由此溶液條件之變更，產生不溶物的情形，適當地將Celite等之過濾輔助劑與溶液混合，進行僅回收溶解液部的操作。溶出劃分所含的SGP亦可以上述HPLC條件加以監測，若以與以前相同的條件來溶出，亦可由溶出時間特定SGP之溶出劃分。如此純化之條件係因應採用的管柱填充劑之種類、性質可加以適宜設定。
例如，使用SEPABEADS SP207SS作為管柱填充劑的情形，將除蛋白質後之溶液，調整為pH7以上之中性至鹼性(較佳為pH9附近)，僅使去除不溶物的溶解液部通過填充SEPABEADS SP207SS的管柱，管柱以水洗淨後，可以水-2%丙酮水之濃度梯度進行溶出。
獲得的純化SGP溶液係可直接冷凍保存，但因應必要，亦可濃縮或冷凍乾燥來保存。
[實施例]
以下，藉由實施例具體地說明本發明。本文所示實施例不過為本發明之實施態樣之一例，本發明並未限定於此等實施例。
<實施例1.使用合成矽膠的SGP純化-1>
於脫脂卵黃粉(Kewpie(股))500g中添加水5L，充分攪拌15分鐘後，以加壓過濾機(藪田機械(股))進行過濾。
於獲得的水提取液中添加250g之SYLOPUTE 403(富士SILYSIA化學(股))，充分攪拌15分鐘後，以加壓過濾機(藪田機械(股))進行過濾。
獲得的濾液以1M-NaOH調整為pH9，並充分攪拌。放置30分鐘後，添加100g之Celite 545(Imerys Minerals California,Inc.)，以加壓過濾機(藪田機械(股))進行過濾。
將作為合成吸附樹脂之SEPABEADS SP207SS(三菱化學(股))207mL(35Φx215mm)填充於管柱，將該樹脂以丙酮洗淨，接著以水洗淨後，以20mM-Na2HPO4平衡化。
將上述獲得的液以流速50mL/分鐘交付平衡化的該樹脂。交付濾液的該樹脂以水2L流速50mL/分鐘洗淨後，以2%丙酮水(v/v)流速25mL/分鐘加以展開，溶出液以每25mL劃分。(溶出劃分1至40)
合併溶出劃分18至26，藉由冷凍乾燥，獲得764.4mg之糖胜肽。
獲得的糖胜肽與標準品(東京化成工業(股)製SGP)，進行1H-NMR測定、LC/MS測定及以下之條件的HPLC分析。將標準品之HPLC、LC/MS及1H-NMR的測定結果各自示於第1圖、第2圖及第3圖。獲得的糖胜肽之HPLC、LC/MS及1H-NMR的測定結果各自示於第4圖、第5圖及第6圖。
獲得的糖胜肽藉由與1H-NMR測定及LC/MS測定的標準品之比較，因獲得與標準品同樣的質譜及 1H-NMR光譜，被確認為上述式(I)及式(II)所表示的SGP。又，於HPLC之結果，藉由獲得的SGP與標準品之歸屬於SGP的波峰的相對面積值比，獲得的SGP之純度為104%。
[HPLC測定]
HPLC：1260 Infinity LC(Agilent Technologies,Inc.)
管柱：L-Column2 ODS 3μm 3.0×50mm(科學物質評價研究機構)
管柱溫度：40℃
移動相A：含0.1%HCOOH的H2O溶液(v/v)
移動相B：含0.1%HCOOH的MeCN溶液(v/v)
梯度(移動相B%)：0%(0分鐘)、10%(5分鐘)、30%(7分鐘)、30%(8分鐘)
流速：0.6ml/分鐘
檢測波長：210nm。
[LC/MS測定]
MS：6130 Quadrupole LC/MS(Agilent Technologies,Inc.)
離子化：ESI
模式：正
HPLC：1260 Infinity LC(Agilent Technologies,Inc.)
管柱：L-Column2 ODS 3μm 3.0×50mm(科學物質評價研究機構)
管柱溫度：40℃
移動相A：含0.1%HCOOH的H2O溶液(v/v)
移動相B：含0.1%HCOOH的MeCN溶液(v/v)
梯度(移動相B%)：0%(0分鐘)、10%(5分鐘)、30%(7分鐘)、30%(8分鐘)
流速：0.6ml/分鐘
檢測波長：210nm。
[1H-NMR測定]
NMR：AVANCE500(500MHz、Bruker BioSpin(股))
溶劑：DEUTERIUM OXIDE+0.1%TMSP(euriso-top)。
<實施例2.使用合成矽膠的SGP純化-2>
藉由與實施例1同樣之操作，自脫脂卵黃粉進行糖胜肽之純化，合併管柱溶出劃分20至30而冷凍乾燥，獲得694.1mg之糖胜肽。
獲得的糖胜肽係藉由與1H-NMR測定及LC/MS測定的標準品比較，確認為SGP。
於獲得的SGP，以與實施例1相同條件進行HPLC分析(第7圖)。由此HPLC之結果，與實施例1同樣地算出純度的結果，獲得的SGP之純度係102%。
<實施例3.多樣的除蛋白質劑對SGP純化之適用檢討>
其次，檢討各式各樣的除蛋白質劑、各式各樣的一般的過濾輔助劑、各式各樣的添加劑對SGP純化的適用可能性。
關於本發明之純化方法，於供給管柱層析的溶液，除去不純物，尤其除去不要的蛋白質，且SGP會 殘存係重要的，故進行以除蛋白質劑等處理後溶液中之蛋白質含量及SGP回收率作為指標的檢討。
脫脂卵黃粉中之蛋白質除去性能及SGP回收率之檢證
合成矽膠、合成二氧化矽膠體、一般的過濾輔助劑、具有蛋白質凝固作用的添加劑、及具有蛋白質分解作用的添加劑，評價對脫脂卵黃粉中之蛋白質的蛋白質除去性能，又，評價對脫脂卵黃粉中之SGP的回收率。
[添加劑]
作為合成矽膠，使用SYLOPUTE202(富士SILYSIA化學(股))、SYLOPUTE303(富士SILYSIA化學(股))、SYLOPUTE403(富士SILYSIA化學(股))、MIZUKASORB A751C(水澤化學工業(股))、MIZUKASORB C1(水澤化學工業(股))、MIZUKASORB C6(水澤化學工業(股))、CARPLEX BS-303(DSL.Japan(股))、CARPLEX BS-306(DSL.Japan(股))、Microd KM-386P(KD Corporation)。
作為合成二氧化矽膠體，使用Coporoc 200(大塚食品(股))、Coporoc 300(大塚食品(股))、Coporoc 306(大塚食品(股))。
作為一般的過濾輔助劑，使用Celite 545(Imerys Minerals California,Inc.)、Fibracell BH-40(Imerys Minerals California,Inc.)、Topco Perlite No.31(東興Pearlite工業(股))、Topco Perlite No.31(東興Pearlite工業(股))。
作為具有蛋白質凝固作用的添加劑，使用鞣 酸(東京化成工業(股))。作為具有蛋白質分解作用的添加劑，使用木瓜蛋白酶(和光純藥工業(股))。
[方法]
對脫脂卵黃粉(Kewpie(股))添加10倍量之水(濃度100mg/mL)，充分攪拌15分鐘後，以FILTER PAPER No.2(東洋濾紙(股))進行過濾。獲得的脫脂卵黃水溶液係調整為pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8後，各自分注10mL。
關於合成矽膠及一般的過濾輔助劑，於分注液添加5%(w/v)，於室溫使攪拌接觸15分鐘及60分鐘。
關於二氧化矽膠體，於分注液添加5%(v/v)，於室溫使攪拌接觸15分鐘及60分鐘。
關於鞣酸，於分注液添加1%(w/v)，於室溫使攪拌接觸15分鐘及60分鐘。
關於木瓜蛋白酶，於分注液添加1%(w/v)，於室溫使攪拌接觸15分鐘及60分鐘，於50度使攪拌接觸20小時。
實驗中的攪拌係全部以往復式震盪器(reciprocal shaker)進行。
各處理試料係以10,000rpm旋轉5分鐘離心分離，回收獲得的上清液，以下列方法進行蛋白質含量之測定及SGP回收率之測定。結果示於第8圖~第13圖。
a)藉由布拉福法[Bradford,M.M.,Anal.Biochem.72：248-254(1976)]之蛋白質含量的測量
將標準品及上清液各自分注15μL，各自添加發色液 1.5mL，攪拌後，於室溫保持10分鐘以上，並測定。又，於發色液，使用Coomassie Protein Assay Reagent(Thermo Fisher Scientific,Inc.)，標準品係使用BSA(牛血清白蛋白，Thermo Fisher Scientific,Inc.)，測定波長係作為吸光度595nm。結果，脫脂卵黃水溶液之蛋白質濃度作為100%時之相對蛋白質濃度(%)示於圖內。
b)HPLC所致的SGP回收率之測定
藉由實施例1之HPLC條件進行分析，測定SGP之波峰面積值。同樣地，對HPLC注入脫脂卵黃水溶液及各上清液各5μL，藉由實施例1之HPLC條件進行分析，測定SGP之波峰面積值。SGP之回收率係同樣地，將脫脂卵黃水溶液之SGP之波峰面積值作為100%時之相對波峰面積值(%)表示於圖內。
[結果]
如第8~10圖所示，顯示於以各種合成矽膠處理的溶液，具有蛋白質濃度低，合成二氧化矽為高的除蛋白質效果。另一方面顯示，該處理後溶液中之SGP回收率為高、SGP未吸附於合成二氧化矽，溶解於溶液中。又，此等之效果係因處理時之溶液之pH而受到若干影響，於較酸性之條件，除蛋白質效果及SGP回收率同時有高的傾向。然而，認為於任一者之條件，自處理後之溶液可純化高純度之SGP。
藉由合成二氧化矽膠體的處理之情形，如第11圖所示，依種類而顯示相異的傾向。於Coporoc 200，呈現一定之除蛋白質效果及SGP回收率，認為於任一者之pH亦 可純化高純度之SGP。另一方面，於Coporoc 300及306，於pH3或4附近，顯示充分的除蛋白質效果及SGP回收率，但pH6以上時，有所謂處理後溶液之蛋白質濃度為高的結果。於膠體狀之合成二氧化矽，亦呈現具有高的除蛋白質效果。
Celite 545、Fibracell BH-40、各種珍珠體(pearlite)等之一般的過濾輔助劑，如第12圖所示，判斷為無除蛋白質效果。據此，於作為過濾輔助劑之一般的二氧化矽中，Celite之類的天然二氧化矽係無除蛋白質效果，藉由採用合成二氧化矽，於本發明之方法所使用的添加劑，呈現有獲得為重要性質之除蛋白效果。
合成二氧化矽以外之除蛋白質效果為已知的鞣酸或木瓜蛋白酶，如第13圖所示，關於鞣酸，並未依存於pH，呈現一定的除蛋白質效果及SGP回收率。木瓜蛋白酶處理的情形，除蛋白質效果、SGP回收率同時依pH而大幅變動，呈現較酸性的條件係適切的。又，以20小時之木瓜蛋白酶處理，因SGP之回收率降低，處理時間應為數小時以下，認為15分鐘~60分鐘左右為適切的。
<實施例4.使用合成矽膠的SGP純化-3>
於脫脂卵黃粉(Kewpie(股))500g中添加水5L，充分攪拌15分鐘後，以加壓過濾機(藪田機械(股))進行過濾。
於獲得的水提取液中添加MIZUKASORB A751C(水澤化學工業(股))250g，充分攪拌15分鐘後，以加壓過濾機(藪田機械(股))進行過濾。
獲得的濾液係以1M-NaOH調整為pH9，並充 分攪拌。放置30分鐘後，添加Celite 545(Imerys Minerals California,Inc.)100g，以加壓過濾機(藪田機械(股))進行過濾。
將作為合成吸附樹脂之SEPABEADS SP207SS(三菱化學(股))207mL(35Φx215mm)填充於管柱，將該樹脂以丙酮洗淨，接著以水洗淨後，以20mM-Na2HPO4平衡化。
於將上述所獲得的濾液以流速50mL/分鐘交付於平衡化的該樹脂。交付濾液的該樹脂以水2L流速50mL/分鐘洗淨後，以2%丙酮水(v/v)流速25mL/分鐘展開，溶出液以每25mL加以劃分。(溶出劃分1至40)
合併溶出劃分17至22，經冷凍乾燥而獲得733.8mg之糖胜肽。
獲得的糖胜肽係藉由與1H-NMR測定及LC/MS測定的標準品之比較，確認為SGP。於獲得的SGP，以與實施例1相同條件進行HPLC分析，算出純度(第14圖、純度：98%)。
<實施例5.使用合成矽膠的SGP純化-4>
藉由與實施例4同樣之操作，自脫脂卵黃粉進行糖胜肽之純化，合併管柱溶出劃分17至22而冷凍乾燥，獲得784.1mg之糖胜肽。
獲得的糖胜肽藉由與1H-NMR測定及LC/MS測定的標準品之比較，確認為SGP。於獲得的SGP，以與實施例1相同條件進行HPLC分析，算出純度(第15圖、純度：99%)。
<實施例6.使用ODS系逆相樹脂的SGP純化>
於脫脂卵黃粉(Kewpie(股))500g中添加水5L，充分攪拌15分鐘後，以加壓過濾機(藪田機械(股))進行過濾。
於獲得的水提取液中添加MIZUKASORB A751C(水澤化學工業(股))250g，充分攪拌15分鐘後，以加壓過濾機(藪田機械(股))進行過濾。
獲得的濾液係以1M-NaOH調整為pH6.5，並充分攪拌。放置30分鐘後，添加Celite 545(Imerys Minerals California,Inc.)100g，以加壓過濾機(藪田機械(股))進行過濾。
將作為ODS系逆相樹脂之Wakogel 100C18(和光純藥工業(股))192mL(35Φx200mm)填充於管柱，將該樹脂以乙腈洗淨，接著以水洗淨後，以20mM-HCOONH4平衡化。
將上述獲得的濾液以流速50mL/分鐘交付平衡化的該樹脂。交付濾液的該樹脂以水2L流速50mL/分鐘洗淨後，以1%乙腈水(v/v)流速25mL/分鐘展開，將溶出液以每25mL加以劃分。(溶出劃分1至14)，再以2%乙腈水(v/v)流速25mL/分鐘展開，將溶出液以每25mL加以劃分。(溶出劃分15至40)
合併溶出劃分8至24，經冷凍乾燥，獲得565.6mg之糖胜肽。
獲得的糖胜肽係藉由與1H-NMR測定及LC/MS測定的標準品之比較，確認SGP。於獲得的SGP，以與實施例1相同的條件進行HPLC分析，算出純度(第16 圖、純度：98%)。
<實施例7.使用乾燥卵黃粉的SGP純化>
於乾燥卵黃粉No.1(Kewpie(股))500g中添加水5L，充分攪拌15分鐘後，添加Celite 545(Imerys Minerals California,Inc.)1kg，以吸引過濾罐(SUGIYAMA-GEN(股))進行過濾。
於獲得的水提取液中添加MIZUKASORB A751C(水澤化學工業(股))250g，充分攪拌15分鐘後，以吸引過濾罐(SUGIYAMA-GEN(股))進行過濾。
獲得的濾液以1M-NaOH調整為pH9，並充分攪拌。放置30分鐘後，添加Celite 545(Imerys Minerals California,Inc.)100g，以吸引過濾罐(SUGIYAMA-GEN(股))進行過濾。
將作為合成吸附樹脂之SEPABEADS SP207SS(三菱化學(股))207mL(35Φx215mm)填充於管柱，將該樹脂以丙酮洗淨，接著以水洗淨後，以20mM-Na2HPO4平衡化。
將上述所獲得的濾液以流速50mL/分鐘交付於平衡化的該樹脂。交付濾液的該樹脂以水2L流速50mL/分鐘加以洗淨後，以2%丙酮水(v/v)流速25mL/分鐘展開，將溶出液以各25mL加以劃分。(溶出劃分1至40)
合併溶出劃分18至21，經冷凍乾燥，獲得212.2mg之糖胜肽。
獲得的糖胜肽藉由與1H-NMR測定及LC/MS測定的標準品比較，確認為SGP。於獲得的SGP，以與實 施例1相同條件下進行HPLC分析，算出純度(第17圖、純度：93%)。
<參考例1.使用一般的過濾輔助劑的SGP純化>
於與實施例4同樣之方法，使用一般的過濾輔助劑Celite 545(Imerys Minerals California,Inc.)250g替換合成矽膠(MIZUKASORB A751C)，合併管柱溶出劃分14至24，經冷凍乾燥，獲得955.0mg之糖胜肽。
獲得的糖胜肽藉由與1H-NMR測定及LC/MS測定的標準品之比較，確認為SGP。於獲得的SGP，以與實施例1相同的條件下進行HPLC分析，算出純度(第18圖、純度：83%)。
如實施例3所示，Celite 545因不具除蛋白質效果，於本參考例，溶液中之不要的蛋白質未被充分去除，結果，即使經合成吸附劑的分離操作後，與使用除蛋白質劑的其他實施例比較，獲得的SGP之純度並不充分。由此顯示，為了獲得高純度之SGP，將含有卵黃成分的溶液，與具有除蛋白質效果的過濾輔助劑混合‧分離，而將溶解液部之不要的蛋白質充分地去除係重要的。
<110> 第一三共股份有限公司
<120> 醣肽之純化方法
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<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 雞(Gallus gallus domesticus)
<400> 1

Claims (11)

  1. 一種唾液酸醣肽(sialylglycopeptide)之純化方法，其特徵為包含以下之步驟A，步驟A：使含鳥類之卵黃成分的水性溶液與除蛋白質劑混合而獲得溶解液部的步驟。
  2. 如請求項1之方法，其中除蛋白質劑係合成二氧化矽系除蛋白質劑、具有蛋白質凝固作用的添加劑、或具有蛋白質分解作用的添加劑。
  3. 如請求項2之方法，其中合成二氧化矽系除蛋白質劑係合成矽膠(silica gel)或合成二氧化矽膠體(silica colloid)。
  4. 如請求項3之方法，其中合成二氧化矽系除蛋白質劑係滿足粒徑：約1~50μm、比表面積：約100~1500m2/g、細孔容積：約0.5~3ml/g、平均細孔徑：約1~50nm的合成矽膠。
  5. 如請求項1之方法，其中含鳥類之卵黃成分的水性溶液係雞之卵黃或脫脂卵黃之水溶液。
  6. 如請求項1之方法，其中含鳥類之卵黃成分的水性溶液係事前去除不溶成分的溶液。
  7. 如請求項1之方法，其進一步包含將步驟A所獲得的溶解液部，藉由使用可將唾液酸醣肽分離的樹脂的管柱層析，而將含有唾液酸醣肽的劃分回收的步驟。
  8. 如請求項7之方法，其中可將唾液酸醣肽分離的樹脂係逆相樹脂、順相樹脂、離子交換樹脂、凝膠過濾樹脂或合成吸附樹脂。
  9. 如請求項8之方法，其中合成吸附樹脂係苯乙烯-二乙烯苯系合成吸附樹脂、苯乙烯-二乙烯苯系修飾型合成吸附樹脂、甲基丙烯酸系合成吸附樹脂或酚系合成吸附劑。
  10. 如請求項9之方法，其中合成吸附樹脂係苯乙烯-二乙烯苯系修飾型合成吸附樹脂。
  11. 一種SGP製品之製造方法，其包含將如請求項1至10中任一項之方法所純化的SGP以適切形態加以包裝的步驟。
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