JP5611105B2 - 糖ペプチド誘導体及びその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、遊離アミノ基にジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーが結合する糖ペプチド誘導体及びその製造方法に関する

近年、生命分子として、ＤＮＡなどの核酸及びタンパク質に加え、糖鎖が注目されている。膜タンパク質や細胞外などに存在する糖鎖は、細胞間の認識及び相互作用に関わる働きを有すると考えられている。そして、細胞間の認識や相互作用における変化が癌、慢性疾患、感染症、及び老化などを引き起こす原因であると考えられている。例えば、癌化した細胞においては、糖鎖に構造変化が起こっていることが知られている。また、インフルエンザウイルスなどの病原性ウイルスなどは、ある特定の糖鎖を認識し結合することにより、細胞に侵入し感染することが知られている。そこで、疾患時における生体中の糖鎖の構造変化を検出することができれば慢性疾患や感染症の有用な診断につながるものと考えられる。

ところで、ウイルスが感染と脱出に糖鎖を利用することは公知であり、特にインフルエンザウイルス感染は、ウイルス表面に存在するヘマグルチニンが喉や肺表面にある糖鎖受容体に結合することで開始される。そこで、ウイルス表面のヘマグルチニンと粘膜細胞上皮に存在するシアル酸糖鎖との結合認識機構を利用することでウイルス感染防止又は感染の迅速診断が可能になると考えられる。

ウイルスと糖鎖との特異的相互作用に加え、糖鎖をナノ粒子に固定することで、ナノ粒子の特徴もまた利用することができる。また、このバイオデバイスをウイルスの濃縮に用いることで、感染初期における低濃度のインフルエンザウイルス液であっても高感度分析を可能にすることが期待される。
特許文献１及び２には「硫黄原子（Ｓ）−金（Ａｕ）結合」を活用することで、表面に金を有する支持体とオリゴ糖とを結合するための芳香族アミノ基を有するチオクト酸誘導体がリンカーとして開示されている。しかし、１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドのペプチド部分のアミノ基に対してジスルフィド基又はチオール基を含有したリンカーが導入された構造のものは開示されていない。

特開２００４−１５７１０８号公報 特開２００９−２５６２６１号公報

本発明は、医療及び医薬品開発の分野又はウイルス感染診断の分野において有効なリサーチツールを提供することを課題とする。

本発明は、以下のとおりである。
〔１〕
下記式（１）で表される糖ペプチドのＬｙｓ(リジン)残基の遊離アミノ基のうち、少なくとも一つの遊離アミノ基にジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーが結合する糖ペプチド誘導体。
式（１）：
〔２〕
前記ジスルフィド基含有リンカーが下記式（２）で表されるリンカーであり、前記チオール基含有リンカーが下記式（３）で表されるリンカーである、〔１〕に記載の糖ペプチド誘導体。
式（２）：
（式中、Ｒ_１は、炭素数１〜８の２価のアルキル基を表す。）
式（３）：
（式中、Ｒ_２は、ハロゲンで置換されていてもよい、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルキルチオ基、若しくは炭素数２〜５のアルカノイル基、又は水素原子を表し、Ｒ_３は炭素数１〜８の２価のアルキル基を表す。）
〔３〕
前記遊離アミノ基のすべてに前記ジスルフィド基含有リンカー又は前記チオール基含有リンカーが結合する、〔１〕又は〔２〕に記載の糖ペプチド誘導体。
〔４〕
前記糖ペプチドが、下記式（４）で表される構造である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の糖ペプチド誘導体。
式（４）：
〔５〕
前記ジスルフィド基含有リンカー又は前記チオール基含有リンカーを前記遊離アミノ基に導入して糖ペプチド誘導体を得る導入工程を含む、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の糖ペプチド誘導体の製造方法。
〔６〕
鳥類卵脱脂卵黄を水又は塩溶液で抽出して糖ペプチドを含む抽出液を得る抽出工程、前記抽出液からアルコール沈殿させて、糖ペプチドを含む沈殿物を得る沈澱工程、前記沈殿物を脱塩して、糖ペプチドを得る脱塩工程、前記ジスルフィド基含有リンカー又は前記チオール基含有リンカーを前記遊離アミノ基に導入して糖ペプチド誘導体を得る導入工程を含む、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の糖ペプチド誘導体の製造方法。
〔７〕
前記ジスルフィド基含有リンカー又は前記チオール基含有リンカーの導入後、糖ペプチド誘導体を含む反応液を水溶性有機溶媒に添加して糖ペプチド誘導体を沈殿させる工程をさらに含む、〔５〕又は〔６〕に記載の製造方法。
〔８〕
前記水溶性有機溶媒が、炭素数１〜５のアルコール、エーテル、アセトニトリル及びアセトンからなる群から選択される少なくとも一種以上の溶媒である、〔７〕に記載の製造方法。
〔９〕
〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の糖ペプチド誘導体が、金表面に保持されている担体。

本発明に係る糖ペプチド誘導体はジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーを有するので表面に金を有する支持体と接触させることで固定化することが容易であり、シアル酸含有糖鎖を固定化した金粒子を容易に製造することができる。本発明に係る糖ペプチド誘導体は１分子あたり最大３分子のジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーを結合することができるので表面に金を有する支持体と接触させることで固定化することがより容易である。また、本発明に係る糖ペプチド誘導体の製造方法によれば、ジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーの導入された糖ペプチド誘導体を製造することができる。

製造例１において製造された糖ペプチドのＨＰＬＣチャートを示す。 製造例１において製造された糖ペプチドの^１Ｈ−ＮＭＲチャートを示す。 製造例１において再度ＯＤＳ樹脂で精製された糖ペプチドのＨＰＬＣチャートを示す。 製造例２において製造された糖ペプチドのＨＰＬＣチャートを示す。 実施例１において製造された、ジスルフィド基含有リンカーを導入した糖ペプチド誘導体のＨＰＬＣチャートを示す。 実施例２において製造された、ジスルフィド基含有リンカーを導入した糖ペプチド誘導体のＨＰＬＣチャートを示す。 実施例３において製造された、アセチルチオ基含有リンカーを導入した糖ペプチド誘導体のＨＰＬＣチャートを示す。 実施例４において４９０ｎｍにおける吸光度を測定した結果を示す。 実施例５において４９０ｎｍにおける吸光度を測定した結果を示す。

以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。

（糖ペプチド誘導体）
本実施の形態の糖ペプチド誘導体は、下記式（１）で表される糖ペプチド（配列番号１）のＬｙｓ(リジン)残基の遊離アミノ基のうち、少なくとも一つの遊離アミノ基にジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーが結合する糖ペプチド誘導体である（以下、単に、「糖ペプチド誘導体」と記載する場合がある。）。
式（１）：

式（１）で表される糖ペプチド（以下、単に、「糖ペプチド」と記載する場合がある。）の糖鎖の還元末端には、アミノ酸６残基からなるペプチド鎖がＡｓｎを介して結合している。Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、及びＴｈｒは、アミノ酸の３文字表記であり、それぞれ、リジン、バリン、アラニン、アスパラギン、及びスレオニンを意味する。
アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸であっても、Ｄ−アミノ酸であってもよく、ラセミ体などを含め、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の任意の比率の混合物であってもよいが、Ｌ−アミノ酸であることが好ましい。また、各アミノ酸は、各アミノ酸と等価な誘導体であってもよい。

上記式（１）で表される糖ペプチドは、Ｎ末端がＬｙｓ残基であることが好ましいが、ペプチド配列中に、２つのＬｙｓ残基を有する。Ｎ末端のＬｙｓ残基は、２つの遊離したアミノ基を有し、アスパラギン（Ａｓｎ）とスレオニン（Ｔｈｒ）に結合するＬｙｓ残基は、１つの遊離アミノ基を有する。
すなわち、式（１）で表される糖ペプチドにおいて、Ｌｙｓ残基の遊離アミノ基は、下記構造における−ＮＨ_２のいずれかとして存在している。

したがって、本実施の形態の糖ペプチド誘導体においては、Ｌｙｓ残基に由来する合計３個の遊離アミノ基のうち少なくとも一つの遊離アミノ基にジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーが結合し、合計３個の遊離アミノ基の残りの遊離アミノ基は、そのまま遊離のアミノ基（−ＮＨ_２）として存在している。糖ペプチド誘導体としては、３個の遊離アミノ基のうち、全ての、すなわち、３個の遊離アミノ基にジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーが結合していてもよい。

式（１）で表される糖ペプチドとしては、下記式（４）で表される構造であることが好ましい（配列番号２）。
式（４）：

本実施の形態の糖ペプチド誘導体においては、下記式（５）で表される糖ペプチド誘導体として、少なくとも一つのＲがジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーであってもよい。
式（５）：

式（５）で表される構造において、Ｒが全てＨ（水素原子）である場合には、本実施の形態における好適な形態としての糖ペプチドを意味する。
上記式で示されているように、糖ペプチド誘導体の糖鎖は、１１個の糖残基からなる２分岐複合型糖鎖であり、２ヶ所の非還元末端にシアル酸を有する。

本実施の形態において、「ジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーが結合する」とは、糖ペプチド誘導体におけるリジン残基中の３ヶ所の遊離アミノ基に、ジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーが結合していることを意味する。
ジスフフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーとしては、遊離アミノ基と結合し得る部分を有し、且つ、ジスルフィド基又はチオール基を有するリンカーであり得る。遊離アミノ基と結合し得る部分と、ジスルフィド基又はチオール基とが、リンカー内に存在していれば特に限定されるものでもないが、原子数として、１〜２０個の原子分離れて存在していることが好適である。
ジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーは、リンカー全体として、炭素数２〜２０、好ましくは、炭素数１２以下のリンカーであることが好適である。
また、ジスルフィド基含有リンカーとチオール基含有リンカーは、遊離アミノ基と、特に限定されないが、アミド結合、Ｃ−Ｎ結合、カーバメート結合などのＮの公知の共有結合により結合していることが好ましく、アミド結合であることが好ましい。アミド結合の場合、遊離アミノ基と結合し得る部分とは、Ｃ＝Ｏ基が該当する。

ジスルフィド基含有リンカーとしては、ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を有するリンカーであり、下記式（２）で表されるリンカーであることが好ましい。
式（２）：
（式中、Ｒ_１は、炭素数１〜８の２価のアルキル基を表す。）

炭素数１〜８の２価のアルキル基とは、２個の結合手を有するアルキル基を意味し、特に限定されるものではないが、一般式として、−Ｃ_ｎＨ_２ｎ−、より具体的には、−（ＣＨ_２）_ｎ−として表すこともできる基である。アルキル基としては、直鎖状であってもよく、分岐鎖を有していてもよい。

チオール基含有リンカーとしては、チオール基（−ＳＨ）が保護又は無保護のリンカーであり、実質として、−Ｓ−構造を有するリンカーを意味し、無保護チオール基含有リンカーとしては、−ＳＨ構造を有するリンカーを意味する。
チオール基含有リンカーとしては、下記式（３）で表されるリンカーであることが好ましい。
式（３）：
（式中、Ｒ_２は、ハロゲンで置換されていてもよい、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルキルチオ基、若しくは炭素数２〜５のアルカノイル基、又は水素原子を表し、Ｒ_３は炭素数１〜８の２価のアルキル基を表す。）

チオール基含有リンカーとしては、式（３）において、Ｒ_１が水素原子である場合には、無保護チオール基含有リンカーを意味する。
また、式（３）において、Ｒ_１が炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルキルチオ基、若しくは炭素数２〜５のアルカノイル基である場合には、保護チオール基含有リンカーを意味する。炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルキルチオ基、若しくは炭素数２〜５のアルカノイル基は、ハロゲンで置換されていてもよい。Ｒ_１としては、チオールに対する保護基である公知の基であってよく、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、メチルチオ基、エチルチオ基、プロピルチオ基、イソプロピルチオ基、ブチルチオ基、アセチル基、ピバロイル基、トリクロロアセチル基が挙げられる。

ジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーは、３ヶ所の遊離アミノ基の少なくとも１つ、好ましくは２つ、さらに好ましくは３ヶ所に結合している。２ヶ所以上の遊離アミノ基にジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーが結合している場合、ジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーは同一のものでも異なるものでもよい。

本実施の形態の糖ペプチド誘導体としては、Ｎ末端Ｌｙｓ残基の構造として下記構造のいずれかであり得る。
上記構造中、Ｒはリジン残基の遊離アミノ基と結合するジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーを表し、Ｒが、下記式（２）又は式（３）で表される構造であることが好ましい。
式（２）：
式（３）：
（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、及びＲ_３については、明細書中の上記記載と同様である。）

本実施の形態の糖ペプチド誘導体としては、ペプチド鎖中で、Ａｓｎ残基とＴｈｒ残基に結合するＬｙｓ残基の構造として下記構造のいずれかであり得る。
上記構造中、Ｒはリジン残基の遊離アミノ基と結合するジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーを表し、Ｒが、上記式（２）又は式（３）で表される構造であることが好ましい。
各構造におけるＲは、同一であっても、異なっていてもよい。

（糖ペプチド誘導体の製造方法）
本実施の形態の糖ペプチド誘導体の製造方法は、ジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーを糖ペプチドのリジン残基の遊離アミノ基に導入する導入工程を含む。
導入工程により、ジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーが糖ペプチドに導入され、糖ペプチド誘導体を得ることができる。
ジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーを導入するとは、遊離アミノ基とジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーが結合することを意味する。

本実施の形態の糖ペプチド誘導体の製造方法は、鳥類卵脱脂卵黄を水又は塩溶液で抽出して糖ペプチドを含む抽出液を得る抽出工程、前記抽出液からアルコール沈殿させて、糖ペプチドを含む沈殿物を得る沈殿工程、前記沈殿物を脱塩して、糖ペプチドを得る脱塩工程、及びジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーを糖ペプチドのペプチド中のリジン残基のアミノ基に導入して糖ペプチド誘導体を得る導入工程を含むことが好ましい。
斯かる製造方法によれば、抽出工程、沈殿工程、及び脱塩工程により、鳥類卵脱脂卵黄より工業的規模で選択的に、安価且つ簡便に糖ペプチドを精製することができるので、これにジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーを導入して、安価且つ簡便に糖ペプチド誘導体を製造することができる。

（抽出工程）
抽出工程とは、鳥類卵脱脂卵黄を、水又は塩溶液に懸濁し、糖ペプチドの混合物などを抽出して、糖ペプチドの粗精製物である抽出液を得る工程である。なお、ここでいう糖ペプチドは、本実施の形態の１１糖の２分岐複合型糖鎖以外を含む糖ペプチド以外の糖ペプチドも含む。
鳥類卵脱脂卵黄としては、市販の脱脂卵黄を用いてもよく、鳥類卵から調製した鳥類卵脱脂卵黄を用いてもよい。
鳥類卵としては、特に限定されるものではないが、例えば、ニワトリ、ウズラ、アヒル、カモ、ダチョウ、及びハトなどの卵が挙げられ、卵黄内に含まれる糖ペプチドの量が多いので、鶏卵などが好ましい。
鳥類卵としては、生の卵であってもよく、乾燥して得られる卵の乾燥粉末であってもよく、鶏卵卵黄又は鶏卵卵黄粉末などを用いることが好ましい。

鳥類卵脱脂卵黄は、例えば、鳥類卵の全卵又は卵黄を、有機溶媒により脱脂処理することにより得ることができる。
脱脂処理する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、鳥類卵に有機溶媒を添加して、沈殿物と有機溶媒層を分離する方法などが挙げられる。
脱脂処理に用いられる有機溶媒としては、アセトン、メタノール、エタノール、及び２−プロパノールなどが挙げられ、これらの溶媒は単独で用いてもよく、２種以上の混合溶媒として用いてもよい。
脱脂処理において、鳥類卵に添加する有機溶媒の量としては、特に限定されるものではないが、鳥類卵に対して、質量で１〜５倍の有機溶媒を用いることにより脱脂処理を行うことができる。
また、脱脂処理を行う温度としては、特に限定されるものではないが、０〜２５℃で行うことができる。

鳥類卵に有機溶媒を添加した後、有機溶媒と鳥類卵とをよく撹拌することにより、有機溶媒により鳥類卵に含まれる脂分を除去することができる。
有機溶媒と沈殿物とを分離する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、２，０００〜１０，０００ｒｐｍで５〜３０分遠心分離してもよい。
有機溶媒を用いた脱脂処理は、２〜６回行うことが好ましい。

鳥類卵脱脂卵黄に水又は塩溶液を添加して、鳥類卵脱脂卵黄から糖ペプチドを含む抽出液を抽出する方法は、特に限定されるものではないが、抽出工程において用いられる塩溶液としては、塩化ナトリウム水溶液及びリン酸緩衝液などが挙げられる。これらの塩溶液は単独で用いてもよく、２種以上の混合溶媒として用いてもよい。
塩溶液の濃度は、０．０００１〜２．０％（ｗ／ｖ）であってもよく、鳥類卵脱脂卵黄に添加する水又は塩溶液の量は、特に限定されるものではないが、鳥類卵脱脂卵黄に対して、質量で、０．１〜５０倍の水又は塩溶液を用いることができる。
また、糖ペプチドの抽出を行う温度は、特に限定されるものではないが、４〜２５℃で行うことができる。糖ペプチドの抽出を行うｐＨは、特に限定されるものではないが、ｐＨ５〜ｐＨ９で行うことができる。

鳥類卵脱脂卵黄に水又は塩溶液を添加した後、鳥類卵脱脂卵黄と水又は塩溶液とをよく撹拌することにより、糖ペプチドを含む抽出液を抽出することができる。
水又は塩溶液で抽出した糖ペプチドを含有する抽出液と鳥類卵脱脂卵黄とを分離する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、２，０００〜１０，０００ｒｐｍで５〜３０分遠心分離してもよい。
水又は塩溶液を用いた抽出処理は、２〜６回行うことが好ましい。
抽出工程は、水を用いて行うことが好ましい。

（沈殿工程）
沈殿工程とは、抽出工程で得られた、糖ペプチドを含む抽出液を水溶性有機溶媒に添加することにより、抽出液を濃縮するだけでなく精製度の向上した糖ペプチドを沈殿物として得る工程である。沈殿工程においては、抽出液に水溶性有機溶媒を添加して粗精製物として、沈殿物を沈殿させてもよい。
本実施の形態において、水溶性有機溶媒とは、水と相溶性を有する有機溶媒であれば特に限定されないが、例えば、水と相溶性を有する炭素数１〜５の有機溶媒などが挙げられる。炭素数１〜５の有機溶媒とは、溶媒分子中の炭素数が１〜５であることを意味する。
該溶媒として、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、エチレングリコール、グリセリン等のアルコール系、又はジエチルエーテル、ジオキサン、ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン等のエーテル系、アセトニトリル等のニトリル系、アセトン等のケトン系、ジメチルホルムアミド等のアミド系、及びジメチルスルホキシド等のスルホキシド系からなる群から選択される溶媒が挙げられる。これら低分子量溶媒は、１種で用いてもよく、２種以上の混合溶媒として用いてもよい。
水溶性有機溶媒としては、炭素数１〜５のアルコールであることが好ましく、沈殿工程において、水溶性有機溶媒がアルコールである場合、該沈殿工程は、抽出液をアルコールに添加してアルコール沈殿する工程（以下、「アルコール沈殿工程」と記載する場合がある。）であり、抽出工程で得られた、糖ペプチドを含有する抽出液をアルコールに添加することにより、抽出液を濃縮するだけでなく精製度の向上した糖ペプチドを沈殿物として得るアルコール沈殿工程である。

以下、沈殿工程をアルコール沈殿工程として説明するが、アルコール以外の炭素数１〜５の水溶性有機溶媒を用いた沈殿工程においても同様に実施することができる。用いる水溶性有機溶媒量や沈殿させる際の溶媒温度などの条件は、溶媒ごとに適宜選択することができるが、以下に例示するアルコール沈殿工程と同様に設定することができる。

アルコール沈殿工程に用いられるアルコールの量は、特に限定されるものではないが、抽出液に対して、質量で２〜２０倍のアルコールを用いることができる。またアルコール沈殿工程に用いられるアルコールは、炭素数１〜５個のアルコールであればよく、好ましくは炭素数１〜３個のアルコールである。炭素数１〜３個のアルコールとしては具体的には、メタノール、エタノール、２−プロパノール（イソプロパノール）を挙げることができ、中でもエタノールが好ましい。
本実施の形態において、アルコール沈殿工程において用いるアルコールは１種類であってもよいし、アルコールの混合物又は他の溶媒との混合物であってもよい。
アルコール溶媒が混合物である場合、例えば、メタノール又は２−プロパノールをエタノールに対し０．０１〜５０％添加した混合溶媒を用いてもよい。また、エタノールに対しアセトン、アセトニトリル又はジエチルエーテルを０．０１〜５０％添加した混合溶媒を用いてもよい。

糖ペプチドを含む沈殿物を分離する温度は、特に限定されるものではないが、４〜２５℃で行うことができる。

アルコール沈殿工程で用いる、先の抽出工程により得られた抽出液は、ろ過することで、清澄な抽出液とすることもでき、また、減圧濃縮などにより濃縮した抽出液として用いてもよい。

アルコール沈殿工程において、糖ペプチドを含む沈殿物を分離する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、２，０００〜１０，０００ｒｐｍで５〜３０分遠心分離してもよく、４〜２５℃で静置することで分離してもよい。
得られた糖ペプチドを含む沈殿物を、水又は塩溶液に溶解し、再度アルコール沈殿工程を行うことにより、より精製された沈殿物を得ることができる。

（脱塩工程）
脱塩工程とは、沈殿工程で得られた糖ペプチドを含有する沈殿物から塩を除去する工程である。
脱塩工程は、脱塩方法として知られた種々の公知の方法で行うことができるが、例えば、イオン交換樹脂、イオン交換膜、ゲルろ過、透析膜、限外ろ過膜又は逆浸透膜などを用いて脱塩することも可能である。脱塩工程としては、例えば、沈殿工程で得られた沈殿物を樹脂に保持させて水で洗浄することにより脱塩することもできる。

沈殿物を樹脂に保持させる方法は、吸着、担持など公知の結合様式を利用した方法とすることができる。また、沈殿物は、水で洗浄する際に沈殿物が洗浄液と共に流出しない程度に、保持されていればよい。
また、樹脂としては、逆相分配クロマトグラフィー充填用樹脂等が挙げられ、逆相分配クロマトグラフィー充填用樹脂とは、シリカゲル系、ポリマー系を代表的とする樹脂を意味しポリ(スチレン／ジビニルベンゼン)ポリマーゲル樹脂、ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂、ポリヒドロキシメタクリレート樹脂、スチレンビニルベンゼン共重合体樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリメタクリレート樹脂、化学結合型シリカゲル樹脂などが挙げられる。
化学結合型シリカゲル樹脂とは、例えば、多孔性シリカゲルにジメチルオクタデシルクロロシランの様なシランカップリング剤を反応させて製造するＯＤＳ樹脂などが挙げられ、シリカゲルに対し、同様の手法で異なるシリル化剤を用いることで、オクタデシル、ジメチルオクタデシル、メチルオクタデシル、ジメチルオクチル、オクチル、フェニル、シアノプロピル、アミノプロピル基からなる群から選択される基を化学結合させることで得られる樹脂等も挙げられる。又は炭素数２２のドコシル基又は炭素数３０のトリアコンチル基を結合して得られる樹脂であってもよい。

脱塩工程は、脱塩した後に樹脂に保持されている糖ペプチドを、有機溶媒水溶液により溶出する工程を含むことが好ましい。溶出工程を行うことにより糖ペプチドの純度を向上させることができる。
溶出工程では、例えば、糖ペプチドを保持させたＯＤＳ樹脂などのシリカゲル樹脂に対し、質量で１〜５０倍の有機溶媒水溶液を用いて樹脂から溶出させることができる。また水洗浄の工程では、糖ペプチドができるだけ、水と共に流出せず、有機溶媒水溶液による溶出工程によって溶出することが好ましい。
溶出工程に用いる有機溶媒は、例えば、アセトニトリル、メタノール、及びエタノールからなる群から選択される少なくとも１種を含有するものが挙げられる。有機溶媒水溶液の濃度は０．１〜２０％(ｖ／ｖ)であり、好ましくは０．５〜２０％(ｖ／ｖ)であり、より好ましくは１０％(ｖ／ｖ)以下、さらに好ましくは５％(ｖ／ｖ)以下である。
有機溶媒水溶液により糖ペプチドを溶出する工程においては、水から徐々に濃度を上げていき、有機溶媒水溶液である溶出液にグラジエントをかけて溶出を行ってもよい。

脱塩工程又は溶出工程を行う温度は、特に限定されるものではないが、４〜２５℃で行うことができる。

脱塩工程は、樹脂を用いた脱塩工程以外にも、分離膜を用いることにより沈殿工程で得られた沈殿物から脱塩することが可能である。
斯かる脱塩工程としては、例えば、限外ろ過膜又は逆浸透膜を用いることで沈殿物の脱塩を行うことができる。
脱塩工程に用いる膜としては、例えば、ポリアクリロニトリル、ポリスルフォン、ポリエーテルスルフォン、ポリビニリデンフルオライド、ポリテトラフルオロエチレン、芳香族ポリアミド、酢酸セルロース、ポリビニルアルコールを構成基材とする平膜又は中空糸膜、スパイラル膜又はチューブラー膜であってもよい。さらにはイオン交換樹脂、イオン交換膜、ゲルろ過、透析膜、限外ろ過膜又は逆浸透膜で脱塩することも可能である。

樹脂を用いた脱塩方法以外で（例えば分離膜による方法で）脱塩工程を行った後の処理液中に含まれる糖ペプチドを精製する方法としては、公知のペプチド、糖質、糖ペプチド等の精製方法を用いることができるが、例えば、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィーなどが挙げられる。逆相クロマトグラフィーに用いられる担体としては、例えば、シリカを基材としてオクタデシル、ジメチルオクタデシル、メチルオクタデシル、ジメチルオクチル、オクチル、フェニル、シアノプロピル、アミノプロピル、ドコシル、トリアコンチル基などを充填剤表面に固定化したものが用いられるが、その中でＯＤＳ樹脂などが挙げられる。

ＯＤＳ樹脂などのシリカゲル樹脂充填剤を用いたカラムクロマトグラフィーによる精製方法においては、沈殿により得られた糖ペプチド中に含まれる塩を脱塩する工程を含んでいてもよく、有機溶媒水溶液により糖ペプチドを溶出する工程を含んでいてもよい。
糖ペプチドを添加して保持させたシリカゲル樹脂に対し、質量で、１〜５０倍の水を用いて樹脂を洗浄することにより糖ペプチドの脱塩を行うことができる。

溶出された糖ペプチドは、有機溶媒水溶液の減圧濃縮及び乾燥などにより粉末状の糖ペプチドとして得ることができる。
本実施の形態において、得られた糖ペプチドは、再度アルコール沈殿工程又は脱塩工程を行ってさらに精製してもよい。

（導入工程）
導入工程とは、ジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーを糖ペプチドのペプチド部分に存在する３個の遊離アミノ基のうちのいずれか１個の遊離アミノ基に導入する工程をいう。用いるジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーの量、反応液のｐＨ、反応時間、反応温度などの反応条件を選択することにより、３個の遊離アミノ基に対しジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーを遊離アミノ基の１〜３ヶ所に導入することができる。ジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーの増加による金表面との反応性向上のために、ジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーは好ましくは２ヶ所、より好ましくは３ヶ所全ての遊離アミノ基に導入することが好ましい。
ジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーは、上述した本実施の形態の糖ペプチド誘導体について挙げたものを使用することができる。

例えば上記式（２）又は式（３）で表されるカルボキシル基を有するジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーをペプチドの遊離アミノ基に導入する方法は、特に限定されないが、通常のペプチド合成に用いる縮合方法を用いればよい。
例えば、式（２）又は式（３）で表されるリンカーのカルボン酸の、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、ニトロフェノール、又はペンタフルオロフェノールなどの活性エステルを用いて、必要に応じて、当該活性エステルを溶解できるアセトン、アセトニトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒と水との混合溶媒中で、有機アミンなどの有機塩基、炭酸水素ナトリウム、リン酸緩衝液又は炭酸緩衝液などの無機塩基の存在下、氷冷下もしくは室温下で１５分〜１日、糖ペプチドと反応させてもよい。
式（２）又は式（３）で表されるリンカーのＮ−ヒドロキシコハク酸イミドの活性エステルを例示すると、下記式（６）で表される活性エステルであることが挙げられる。
式（６）：

以下、本実施の形態の製造方法の説明においては、ジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーを生成する反応試薬（上記活性エステルを含む。）を含めて、「ジスルフィド基又はチオール基含有リンカー」と総称して記載する。
糖ペプチド誘導体を製造する際に、添加するジスルフィド基又はチオール基含有リンカーを糖ペプチドの遊離アミノ基（糖ペプチド１モルあたり３モルの遊離アミノ基を有する）に対して過剰量、例えば総アミノ基のモル数に対して１．１倍から５倍のモル数のジスルフィド基又はチオール基含有リンカーを添加することで、糖ペプチドの全アミノ基にジスルフィド基又はチオール基含有リンカーを導入することができる。

本実施の形態の製造方法において、導入工程におけるジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーの導入後、糖ペプチド誘導体を含む反応液を水溶性有機溶媒に添加して糖ペプチド誘導体を沈殿させる工程をさらに含んでいてもよい。
必要に応じて炭素数１〜５のアルコール、アセトン、アセトニトリル又はジエチルエーテル（エーテル）等を添加したアルコール沈殿工程及び必要に応じて脱塩工程を組み合わせて、糖ペプチド誘導体を精製してもよい。
脱塩を行った後に、有機溶媒水溶液により溶出することにより精製された糖ペプチド誘導体を得ることができる。

糖ペプチド誘導体を添加して、糖ペプチド誘導体を保持させたＯＤＳ樹脂などのシリカゲル樹脂に対し、質量で、１〜５０倍の有機溶媒水溶液を用いて樹脂から溶出させることにより高純度の糖ペプチド誘導体を得ることができる。

有機溶媒水溶液としては、例えば、アセトニトリル、メタノール、及びエタノールからなる群から選択される少なくとも１種の有機溶媒の水溶液などが挙げられ、有機溶媒水溶液の濃度は０．１〜７０％(ｖ／ｖ)であり、好ましくは１〜５０％(ｖ／ｖ)である。有機溶媒水溶液により糖ペプチド誘導体を溶出する工程においては、水から徐々に濃度を上げていき、有機溶媒水溶液である溶出液にグラジエントをかけて溶出を行ってもよい。

溶出された糖ペプチド誘導体は、有機溶媒水溶液の減圧濃縮及び乾燥などにより粉末状の糖ペプチド誘導体として得ることができる。本実施の形態において、得られた糖ペプチド誘導体は、再度アルコール沈殿工程又は脱塩工程を行ってさらに精製してもよい。

本実施の形態においては、糖ペプチド誘導体が、金表面に保持されている担体も提供する。
該担体の一態様として、本実施の形態の糖ペプチド誘導体は、例えば、緩衝液中で表面に金を有する支持体と接触させることで固定化することが容易であり、シアル酸含有糖鎖を固定化した金粒子を容易に製造することができ、この粒子を用いてウイルス種の判別やウイルスの濃縮ができるので有用である。

インフルエンザウイルス表面には、ヘマグルチニンとノイラミニダーゼが存在する。インフルエンザウイルスは、これらのたんぱく質の種類の違いによって鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１型を含む１４４の亜種に分類されている。インフルエンザウイルスの宿主細胞への感染は、ウイルス表面たんぱく質であるヘマグルチニンが細胞表面のシアル酸含有糖鎖を受容体として認識して結合することによって開始される。ヒトインフルエンザウイルスはＮ−アセチルノイラミン酸−α−２，６−ガラクトースを有する糖鎖に対し高い結合親和性を示す。このことから、本実施の形態におけるシアル酸含有糖固定化金ナノ粒子はインフルエンザウイルスとの親和性が強く、低濃度のインフルエンザウイルス液であっても濃縮効果が期待され、高感度分析を可能にすることが期待される。

以下、本実施の形態を実施例及び比較例によってさらに具体的に説明するが、本実施の形態はこれらの実施例のみに限定されるものではない。なお、本実施の形態に用いられる測定方法は以下のとおりである。

［ＨＰＬＣ分析］
１）糖ペプチドの分析例
カラム（Ｃａｄｅｎｚａ ＣＤ−Ｃ１８ (Ｉｍｔａｋｔ、１５０×２ｍｍ）を備えたＧＬサイエンス製ＨＰＬＣ ＧＬ−７４００システムを用いて、以下の測定条件によりＨＰＬＣ分析を行った。
測定条件（製造例１）：
グラジエント；２％→１７％（１５ｍｉｎ）、ＣＨ_３ＣＮ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ０．１％ＴＦＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
流速；０．３ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ；２１４ｎｍ
測定条件（製造例２）：
グラジエント；２％→１７％（１５ｍｉｎ）→９０％（２０ｍｉｎ）、ＣＨ_３ＣＮ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ０．１％ＴＦＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
流速；０．３ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ；２１４ｎｍ

２）ジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーが導入された糖ペプチド誘導体の分析例
測定条件：
グラジエント；２０％→１００％（２０ｍｉｎ）、ＣＨ_３ＣＮ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ０．１％ＴＦＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
流速；０．３ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ；２１４ｎｍ

［^１Ｈ−ＮＭＲ測定］
糖ペプチドの分析例
Ｄ_２Ｏ ０．４ｍＬに試料 ２ｍｇを溶解して、ＪＥＯＬ製ＪＮＭ−６００（６００ＭＨｚ）で^１Ｈ−ＮＭＲを測定した。

[ＬＣ／ＭＳ測定]
以下の測定条件でＬＣ／ＭＳ測定を行った。用いたＬＣ及びＭＳのシステムは以下のとおりである。
ジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーが導入された糖ペプチド誘導体の分析例
ＬＣ:アジレント製１１００シリーズ
カラム：Ｃａｄｅｎｚａ ＣＤ−Ｃ１８ (Ｉｍｔａｋｔ、１５０×２ｍｍ）
カラム温度：４０℃
流速；０．２ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ：２１４ｎｍ
グラジエント；２％→１００％（３０ｍｉｎ）、ＣＨ_３ＣＮ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ０．０５％Ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
ＭＳ：サーモエレクトロン製ＬＣＱ
イオン化：ＥＳＩ
モード：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ、Ｎｅｇａｔｉｖｅ

［製造例１］鶏卵卵黄からの糖ペプチドの製造
鶏卵卵黄１０個にエタノール３５０ｍＬを添加し、よく撹拌した。８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで沈殿物を得た。得られた沈殿物にエタノール３００ｍＬを添加し、よく撹拌後、遠心分離し、上清を除去する操作を３回繰り返して、沈殿物として脱脂卵黄１５０ｇを得た。
得られた脱脂卵黄１５０ｇに水２００ｍＬを添加し、よく撹拌した。８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を得た。デカンテーションにより得られた沈殿物に水１００ｍＬを添加し、よく撹拌後、遠心分離し、上清を回収する操作を３回繰り返した。回収した上清をグラスフィルターにて濾過後、１００ｍＬまで減圧濃縮した。その後、得られた濃縮溶液をエタノール７００ｍＬに注加し、生じた沈殿物を、８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで回収した。得られた沈殿物を水に溶解し、再度エタノールに注加した。この操作を３回繰り返した。ここで生じた沈殿物を回収することで粗精製糖ペプチド１．５８ｇを得た。
ＯＤＳ樹脂としてシリカゲル樹脂Ｗａｋｏｇｅｌ（１００Ｃ１８）２５ｇをガラスカラムに充填し、該樹脂をメタノールで洗浄後、水で置換した。粗精製糖ペプチド１．５ｇを水５ｍＬに溶解し水で置換後の樹脂に添加した。粗精製糖ペプチドを添加した樹脂を水１００ｍＬで洗浄後、２％アセトニトリル水溶液で糖ペプチドを溶出した。溶出液を凍結乾燥することで１１７ｍｇの糖ペプチドを得た。
得られた糖ペプチドのＨＰＬＣ及び^１Ｈ−ＮＭＲによる測定結果をそれぞれ図１及び２に示す。ＨＰＬＣによる純度では９５％であった。得られた糖ペプチドは標品（東京化成製）との比較により上記式（４）で表される構造であることが分かった。
ＯＤＳ樹脂としてシリカゲル樹脂Ｗａｋｏｇｅｌ（１００Ｃ１８）２５ｇをガラスカラムに充填し、該樹脂をメタノールで洗浄後、水で置換した。得られた糖ペプチド５０ｍｇを水１ｍＬに溶解し水で置換後の樹脂に再度添加した。糖ペプチドを添加した樹脂を水１００ｍＬで洗浄後、２％アセトニトリル水溶液で糖ペプチドを溶出した。溶出液を凍結乾燥することで３０ｍｇの糖ペプチドを得た。
得られた糖ペプチドのＨＰＬＣによる測定結果を図３に示す。ＨＰＬＣによる純度では９９％であった。

［製造例２］脱脂卵黄からの糖ペプチドの製造
脱脂卵黄粉末（キューピー製）２００ｇに蒸留水５００ｍＬを添加し、よく撹拌した。６，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を得た。デカンテーションにより得られた沈殿物に水３００ｍＬを添加し、よく撹拌後、遠心分離し、上清を回収する操作を３回繰り返した。回収した上清を更に６，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、上清を回収しその後、２００ｍＬまで減圧濃縮した。その後、得られた濃縮溶液をエタノール１．３Ｌに注加し、生じた沈殿物を、６，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで回収した。得られた沈殿物を水３００ｍＬに溶解し、再度エタノール１．５Ｌに注加した。この操作を３回繰り返した。ここで生じた沈殿物を回収することで粗精製糖ペプチド２．５ｇを得た。
ＯＤＳ樹脂としてシリカゲル樹脂Ｗａｋｏｇｅｌ（１００Ｃ１８）１００ｇをガラスカラムに充填し、該樹脂をメタノールで洗浄後、水で置換した。粗精製糖ペプチド２．５ｇを水２０ｍＬに溶解し水で置換後の樹脂に添加した。粗精製糖ペプチドを添加した樹脂を水２００ｍＬで洗浄後、２％アセトニトリル水溶液で糖ペプチドを溶出した。溶出液を凍結乾燥することで２００ｍｇの糖ペプチドを得た。
得られた糖ペプチドのＨＰＬＣによる測定結果を図４に示す。ＨＰＬＣによる純度では９５％であった。得られた糖ペプチドは標品（東京化成製）との比較により上記式（４）で表される構造であることが分かった。

［実施例１］ジスルフィド基含有リンカーが導入された糖ペプチド誘導体の製造（１）
４３８ｍｇの（Ｒ）−(＋)−１，２−Ｄｉｔｈｉｌａｎｅ−３−ｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ（アルドリッチ製）をジメチルホルムアミド１４ｍＬに溶解し、２０ｍｇのＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン、４０６ｍｇの水溶性カルボジイミド、２９３ｍｇのＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを加え室温で６時間攪拌した。反応液を減圧下で濃縮後、２０ｍＬの酢酸エチルを添加し、有機溶媒層を１０％（ｗ/ｗ）クエン酸水溶液、飽和食塩水、飽和重曹水、飽和食塩水の順で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥し、その後減圧留去することで（Ｒ）−(＋)−１，２−Ｄｉｔｈｉｌａｎｅ−３−ｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄの粗精製コハク酸イミドエステル３２３ｍｇを得た。
続いて、製造例２で得られた糖ペプチド１２ｍｇを水−ジメチルホルムアミド（２／１：体積比）２ｍＬに加え、さらに０．２ｍＬの１Ｍ重曹水を加えた。その後２６ｍｇの（Ｒ）−(＋)−１，２−Ｄｉｔｈｉｌａｎｅ−３−ｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄの粗精製コハク酸イミドエステルを加え１２時間反応を行った。反応溶液にエタノール−アセトン（１／１：体積比）１０ｍＬを加えジスルフィド基含有リンカーとして、（Ｒ）−(＋)−１，２−Ｄｉｔｈｉｌａｎｅ−３−ｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄが導入された粗精製糖ペプチド誘導体を沈殿させた。８，０００ｒｐｍで５分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで沈殿を回収した。得られた沈殿物を水に溶解し、再度エタノール−アセトン（１／１：体積比）１０ｍＬに注加した。この操作を３回繰り返した。ここで生じた沈殿物を回収することで糖ペプチド誘導体１０ｍｇを得た。
得られた糖ペプチド誘導体のＨＰＬＣによる測定結果を図５に示す。反応生成物についてＬＣ／ＭＳ測定を行った。その結果、１１．４分に検出されるピークは検出イオンが１７１５．４(［Ｍ＋２Ｈ］^２＋)及び１７１３．５(［Ｍ−２Ｈ]^２−)であることから推定分子量３４２８．９であり、糖ペプチドの３個のアミノ基に３個のジスルフィド基含有リンカーが導入された化合物であることが推定された。

［実施例２］ジスルフィド基含有リンカーが導入された糖ペプチド誘導体の製造（２）
１０３１ｍｇの（±）−α−Ｌｉｐｏｉｃ ａｃｉｄ（シグマ製）をジメチルホルムアミド１４ｍＬに溶解し、２０ｍｇのＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン、９５８ｍｇの水溶性カルボジイミド、６９０ｍｇのＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを加え室温で６時間攪拌した。反応液を減圧下で濃縮後、２０ｍＬの酢酸エチルを添加し、有機溶媒層を１０％（ｗ/ｗ）クエン酸水溶液、飽和食塩水、飽和重曹水、飽和食塩水の順で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥し、その後減圧留去することで（±）−α−Ｌｉｐｏｉｃ ａｃｉｄの粗精製コハク酸イミドエステル２００ｍｇを得た。
続いて、製造例２で得られた糖ペプチド１４ｍｇを水−ジメチルホルムアミド（２／１：体積比）３ｍＬに加え、さらに０．１ｍＬの１Ｍ重曹水を加えた。その後２３ｍｇの（±）−α−Ｌｉｐｏｉｃ ａｃｉｄの粗精製コハク酸イミドエステルを加え１８時間反応を行い、エタノール−アセトン（１／１：体積比）１０ｍＬを加えジスルフィド基含有リンカーとして、（±）−α−Ｌｉｐｏｉｃ ａｃｉｄが導入された粗精製糖ペプチド誘導体を沈殿させた。８，０００ｒｐｍで５分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで沈殿を回収した。得られた沈殿物を水に溶解し、再度エタノール−アセトン（１／１：体積比）１０ｍＬに注加した。この操作を３回繰り返した。ここで生じた沈殿物を回収することで糖ペプチド誘導体１２．７ｍｇを得た。
得られた糖ペプチド誘導体のＨＰＬＣによる測定結果を図６に示す。反応生成物についてＬＣ／ＭＳ測定を行った。その結果、１２．８分に検出されるピークは検出イオンが１７１５．４([Ｍ＋２Ｈ]^２＋)及び１７１３．５([Ｍ−２Ｈ]^２−)であることから推定分子量３４２８．９であり、糖ペプチドの３個のアミノ基に３個のジスルフィド基含有リンカーが導入された化合物であることが推定された。

［実施例３］アセチルチオ基含有リンカーが導入された糖ペプチド誘導体の製造
９５１ｍｇの６−Ａｃｅｔｈｙｌｔｈｉｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ（アルドリッチ製）をジメチルホルムアミド７ｍＬに溶解し、２０ｍｇのＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン、１１５０ｍｇの水溶性カルボジイミド、５７５ｍｇのＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを加え室温で６時間攪拌した。反応液を減圧下で濃縮後、２０ｍＬの酢酸エチルを添加し、有機溶媒層を１０％（ｗ/ｗ）クエン酸水溶液、飽和食塩水、飽和重曹水、飽和食塩水の順で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥し、その後減圧留去することで６−Ａｃｅｔｈｙｌｔｈｉｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄの粗精製コハク酸イミドエステル１２００ｍｇを得た。
続いて、で得られた糖ペプチド１６ｍｇを水−ジメチルホルムアミド（２／１：体積比）３ｍＬに加え、さらに０．１ｍＬの１Ｍ重曹水を加えた。その後１１ｍｇの６−Ａｃｅｔｈｙｌｔｈｉｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄの粗精製コハク酸イミドエステルを加え１８時間反応を行い、エタノール−アセトン（１／１：体積比）１０ｍＬを加えアセチルチオ基含有リンカーとして、６−Ａｃｅｔｈｙｌｔｈｉｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄが導入された粗精製糖ペプチド誘導体を沈殿させた。８，０００ｒｐｍで５分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで沈殿を回収した。得られた沈殿物を水に溶解し、再度エタノール−アセトン（１／１：体積比）１０ｍＬに注加した。この操作を３回繰り返した。ここで生じた沈殿物を回収することで糖ペプチド誘導体１６．４ｍｇを得た。
得られた糖ペプチド誘導体のＨＰＬＣによる測定結果を図７に示す。反応生成物についてＬＣ／ＭＳ測定を行った。その結果、１１．３分に検出されるピークは検出イオンが１６９１．４([Ｍ＋２Ｈ]^２＋)及び１６８９．６([Ｍ−２Ｈ]^２−)であることから推定分子量３３８１．０であり、糖ペプチドの３個のアミノ基に３個のアセチルチオ基が導入された化合物であることが推定された。

［実施例４］
金粒子としてブリティッシュ バイオセル インターナショナル(Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｌｔｄ．)製のＧｏｌｄ Ｃｏｌｌｏｉｄ，２０ｎｍ(ＥＭＧＣ２０)を用いた。実施例１で得られた糖ペプチド誘導体０．６３ｍｇを６３０μＬの水に溶解しその後ＥＭＧＣ２０溶液６３０μＬに加え４℃で終夜静置した。その後各サンプルの入ったチューブを１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心することで金粒子を沈殿させ上清を除去した。その後沈殿に５００μＬの水を加え撹拌し、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、さらに上清を除去することで金粒子を洗浄した。この操作を３回繰り返した。
沈殿した金粒子に対し、ＰＢＳで希釈した生化学バイオビジネス製Ｂｉｏｔｉｎ−ＳＳＡ(Sambucus sieboldiana)の１０μｇ／ｍＬ溶液を５００μＬ加え４℃で終夜静置した。比較対象として水５００μＬを同一金粒子に加え４℃で終夜静置したものを用意した。その後各サンプルの入ったチューブを１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心することで糖ペプチド−Ｂｉｏｔｉｎ−ＳＳＡが結合した金粒子を沈殿させ上清を除去した。その後沈殿に５００μＬのＰＢＳを加え撹拌し、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、さらに上清を除去することで金粒子を洗浄した。この操作を３回繰り返した。
次に生化学バイオビジネス製ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを１０％グリセリン−ＰＢＳ溶液により溶解し１ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。この溶液をＰＢＳにて１５０００倍に希釈したものを金粒子に対し５００μＬ加え撹拌しその後４℃で終夜静置した。その後各サンプルの入ったチューブを１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心することで金−糖ペプチド−ＳＳＡ−ｂｉｏｔｉｎ−ａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰの順で結合した金粒子を沈殿させ上清を除去した。その後沈殿に５００μＬのＰＢＳを加え撹拌し、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、さらに上清を除去することで金粒子を洗浄した。この操作を３回繰り返した。
この金粒子に対しクエン酸リン酸緩衝液、オルトフェニレンジアミン(ＯＰＤ)及び過酸化水素水を加えて調製した発色基質溶液２００μＬを加え発色させ、その後１Ｎ ＨＣｌを２００μＬ添加することで反応を停止させ、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を９６穴プレートに移し、プレートリーダーにて４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を図８に示す。
その結果、実施例１で得られた糖ペプチド誘導体を金粒子と反応させた群は、比較対照群に比べて有意にＳＳＡとの結合能が高いことが確認された。このことから糖ペプチド誘導体と結合した金粒子はその特異性がＮｅｕ５Ａｃ(α２−６)Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃであると報告されているレクチンＳＳＡ(Sambucus sieboldiana)と結合している可能性が示唆された。

［実施例５］
実施例４と同様に、金粒子としてブリティッシュバイオセルインターナショナル(Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｌｔｄ．)製のＧｏｌｄ Ｃｏｌｌｏｉｄ，２０ｎｍ(ＥＭＧＣ２０)を用いて、実施例４と同様の手法により、実施例１の糖ペプチド誘導体が結合した金粒子を製造した。
沈殿した金粒子に対し、ＰＢＳで希釈したアブカム（ａｂｃａｍ）製Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ Ｈ１ ｐｒｏｔｅｉｎ(ＨＡと表記する)の５μｇ／ｍＬ溶液を５００μＬ加え４℃で終夜静置した。比較対象として水５００μＬを同一金粒子に加え４℃で終夜静置したものを用意した。その後各サンプルの入ったチューブを１２，０００ｒｐｍで５分間遠心することで糖ペプチド−ＨＡが結合した金粒子を沈殿させ上清を除去した。その後沈殿に５００μＬのＰＢＳを加え撹拌し、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、さらに上清を除去することで金粒子を洗浄した。この操作を４回繰り返した。
沈殿した金粒子に対し、アブカム（ａｂｃａｍ）製の抗ＨＡ−マウスＩｇＧモノクローナル抗体５０μｇ／ｍＬ溶液を２５０μＬ加え４℃で終夜静置した。その後各サンプルの入ったチューブを１２，０００ｒｐｍで５分間遠心することで糖ペプチド−ＨＡ−抗ＨＡマウス抗体が結合した金粒子を沈殿させ上清を除去した。その後沈殿に５００μＬのＰＢＳを加え撹拌し、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、さらに上清を除去することで金粒子を洗浄した。この操作を４回繰り返した。
沈殿した金粒子に対し、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ−ウサギポリクローナル抗体０．２５μｇ／ｍＬ溶液を各チューブに４５０μＬ加え４℃で終夜静置した。その後各サンプルの入ったチューブを１２，０００ｒｐｍで５分間遠心することで糖ペプチド−ＨＡ−抗ＨＡマウス抗体−抗マウス抗体ウサギ抗体−ＨＲＰが結合した金粒子を沈殿させ上清を除去した。その後沈殿に５００μＬのＰＢＳを加え撹拌し、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、さらに上清を除去することで金粒子を洗浄した。この操作を４回繰り返した。
この金粒子に対しクエン酸リン酸緩衝液、オルトフェニレンジアミン(ＯＰＤ)及び過酸化水素水を加えて調製した発色基質溶液２００μＬを加え発色させ、その後１Ｎ ＨＣｌを２００μＬ添加することで反応を停止させ、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を９６穴プレートに移し、プレートリーダーにて４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を図９に示す。
その結果、実施例１で得られたジスルフィド基含有リンカー導入糖ペプチド誘導体を金粒子と反応させた群は、ＨＡとの結合に関して、比較対照群に比べて有意に結合能が高いことが確認された。このことからジスルフィド基含有リンカー導入糖ペプチド誘導体と結合した金粒子はヒト型インフルエンザＡウイルスと結合している可能性が示唆された。

本発明の糖ペプチド誘導体は、医療及び医薬品開発の分野又はウイルス感染診断の分野において有効なリサーチツールとして産業上の利用可能性を有する。

Claims (8)

1. 下記式（１）で表される糖ペプチドのＬｙｓ(リジン)残基の遊離アミノ基のうち、少なくとも一つの遊離アミノ基にジスルフィド基含有リンカー又はチオール基含有リンカーが結合する糖ペプチド誘導体であって、
   式（１）：
   前記ジスルフィド基含有リンカーが下記式（２）で表されるリンカーであり、前記チオール基含有リンカーが下記式（３）で表されるリンカーである、糖ペプチド誘導体。
   式（２）：
   （式中、Ｒ１は、炭素数１〜８の２価のアルキル基を表す。）
   式（３）：
   （式中、Ｒ２は、ハロゲンで置換されていてもよい、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルキルチオ基、若しくは炭素数２〜５のアルカノイル基、又は水素原子を表し、Ｒ３は炭素数１〜８の２価のアルキル基を表す。）
2. 前記遊離アミノ基のすべてに前記ジスルフィド基含有リンカー又は前記チオール基含有リンカーが結合する、請求項１に記載の糖ペプチド誘導体。
3. 前記糖ペプチドが、下記式（４）で表される構造である、請求項１又は請求項２に記載の糖ペプチド誘導体。
   式（４）：
   
4. 前記ジスルフィド基含有リンカー又は前記チオール基含有リンカーを前記遊離アミノ基に導入して糖ペプチド誘導体を得る導入工程を含む、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体の製造方法。
5. 鳥類卵脱脂卵黄を水又は塩溶液で抽出して糖ペプチドを含む抽出液を得る抽出工程、前記抽出液からアルコール沈殿させて、糖ペプチドを含む沈殿物を得る沈澱工程、前記沈殿物を脱塩して、糖ペプチドを得る脱塩工程、前記ジスルフィド基含有リンカー又は前記チオール基含有リンカーを前記遊離アミノ基に導入して糖ペプチド誘導体を得る導入工程を含む、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体の製造方法。
6. 前記ジスルフィド基含有リンカー又は前記チオール基含有リンカーの導入後、糖ペプチド誘導体を含む反応液を水溶性有機溶媒に添加して糖ペプチド誘導体を沈殿させる工程をさらに含む、請求項４又は請求項５に記載の製造方法。
7. 前記水溶性有機溶媒が、炭素数１〜５のアルコール、エーテル、アセトニトリル及びアセトンからなる群から選択される少なくとも一種以上の溶媒である、請求項６に記載の製造方法。
8. 請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体が、金表面に保持されている担体。