TWI636037B

TWI636037B - 烴基羧基甜菜鹼以及用於避免在鹼性環境下產生霍夫曼離去效應的方法

Info

Publication number: TWI636037B
Application number: TW105100991A
Authority: TW
Inventors: 周禮君; 黃俊仁; 陳雯灝; 陳昭文
Original assignee: 國立中正大學
Priority date: 2015-07-01
Filing date: 2016-01-13
Publication date: 2018-09-21
Also published as: TW201718477A

Abstract

本發明揭露一種以式(1)表示之烴基羧基甜菜鹼：其中，n2>0，A表示C1-C20烷基或單鍵；R₁、R₂、R₃、及R₄各獨立地選自於氫原子、氘原子、C1-C20烷基、C2-C20烯基及C2-C20炔基；X係選自SH、SOCH₃、SCH₃、NH₂、SiCl₃、Si(OCH₃)₃、Si(OCH₂CH₃)₃、

Description

烴基羧基甜菜鹼以及用於避免在鹼性環境下產生霍夫曼離去效應的方法

本發明是有關於一種化合物及修飾生物材料之方法，特別是有關於一種烴基羧基甜菜鹼以及利用其修飾生物材料之方法。

傳統的羧基甜菜鹼(Carboxyl betaine，CB)分子雖然具有不錯的抗非特異性吸附能力，但是在分子本身的穩定性上卻差強人意。如第1圖所示，在CB中的酸基的一號碳位置上所鍵結的氫易受環境中的羥基反應而產生霍夫曼離去效應。因此，CB在鹼性環境中的穩定性差。

有鑑於上述習知技藝之問題，本發明之目的就是在提供一種避免在鹼性環境下產生霍夫曼離去效應的烴基羧基甜菜鹼，以及利用所述之烴基羧基甜菜鹼於修飾生物材料之方法。

根據本發明之一目的，提出一種避免在鹼性環境下產生霍夫曼離去效應的烴基羧基甜菜鹼：其中，n₂>0，A表示C1-C20烷基或單鍵；R₁、R₂、R₃、及R₄各獨立地選自於氫原子、氘原子、C1-C20烷基、C2-C20烯基及C2-C20炔基；X係選自SH、SOCH₃、SCH₃、NH₂、SiCl₃、Si(OCH₃)₃、Si(OCH₂CH₃)₃、

根據本發明之一目的，提出一種修飾生物材料之方法，包含於生物材料上形成自組裝奈米薄膜，其中自組裝奈米薄膜係以上述之烴基羧基甜菜鹼形成。

承上所述，依本發明之避免在鹼性環境下產生霍夫曼離去效應的烴基羧基甜菜鹼以及其於修飾生物材料之方法，可具有一或多個下述優點：

(1)本發明之烴基羧基甜菜鹼，因為受立體障礙的影響而不易與環境中的羥基反應，因此在鹼性環境中的穩定性佳。

(2)經本發明之烴基羧基甜菜鹼修飾過之生物材料可具有較佳之抗非特異性吸附能力。

(3)經本發明之烴基羧基甜菜鹼修飾過之生物材料在以鹼性溶液處理過後仍可具有優越之抗非特異性吸附能力。

a、b、c、d‧‧‧打入抗原

e、g‧‧‧打入緩衝液

f‧‧‧打入抗體

第1圖為習知技術中羧基甜菜鹼與環境中的羥基進行霍夫曼離去效應的示意圖。

第2圖為根據本發明之實施例之將本發明之烴基羧基甜菜鹼修飾在奈米金表面之示意圖。

第3圖為羧基甜菜鹼及本發明之羧基-α-甲基甜菜鹼修飾在奈米金表面後經鹼性溶液處理前後之非特異性吸附測試圖。

第4圖為羧基甜菜鹼及本發明之羧基-α-甲基甜菜鹼經由1M氫氧化鈉處理前後，於不同酸鹼度的緩衝溶液中之對BSA非特異性吸附測試圖。

第5圖為本發明之羧基-α-甲基甜菜鹼修飾在奈米金表面後再修飾抗體進行生化感測之即時偵測圖。

第6圖為第5圖經標準化所得之數據圖。

第7圖為羧基甜菜鹼及本發明之羧基-α-甲基甜菜鹼修飾在金薄膜表面後對金黃色葡萄球菌之抗生物汙染測試圖。

第8圖為本發明之羧基-β-甲基甜菜鹼修飾在金薄膜表面後對牛血清蛋白BSA之抗生物汙染測試圖。

本文中所用之「C1-C20烷基」指在主鏈中具有1至20個碳原子的線型、分支型或環狀脂肪族單價烴基，而C1-C20烷基的非限制性實施例可包含甲基、乙基、丙基、異丁基、第二丁基、第三丁基、戊基、異戊基、己基、環丙基、環丁基、環戊基、環己基以及環庚基。

本文中所用之「C2-C20烯基」指在沿著C2-C20烷基之碳鏈的一個或多個位置含有至少一個碳-碳雙鍵的烴基(例如，在C2-C20烷基的中間或末端)，而C2-C20烯基的非限制性實施例可包含乙烯基、丙烯基、丁烯基、環戊烯基、環己烯基及環庚烯基。

本文中所用之「C2-C20炔基」指在沿著C2-C20烷基之碳鏈的一個或多個位置含有至少一個碳-碳三鍵的烴基(例如，在C2-C20烷基的中間或末端)，而C2-C20炔基的非限制性實施例可包含乙炔基、丙炔基及環辛炔基。

本文中所用之「生物材料」係指廣泛應用於生物系統的材料，包含但不限於，金屬、陶瓷與高分子材料，例如，鈦金屬、矽樹酯(Silicons)、鐵氟龍(Teflon)與尼龍(Nylon)等。

本文中所用之「修飾」係指物理或化學的修飾技術，包含但不限於物理氣相沉積法(Physical vapor deposition，PVD)、化學氣相沉積法(Chemical vapor deposition，CVD)、電化學沉積法(Electrochemical deposition)與溶膠凝膠法(Sol Gel process)。

本文中所用之「自組裝分子」係指不需要借助外力而可進行緊密排列的一種特殊分子，自組裝分子的排列速度常因溶劑或是分子本身的凡德瓦力(van der Waals Force)的作用力而造成影響，一般來說，當自組裝分子的骨架愈長，則分子本身的疏水性作用力便會隨著上升，進而加速自組裝分子的排列。

本發明提供一種避免在鹼性環境下產生霍夫曼離去效應的烴基羧基甜菜鹼，其中所述之烴基羧基甜菜鹼可由以下式(1)所表示：其中，n₂>0，A表示C1-C20烷基或單鍵；R₁、R₂、R₃、及R₄各獨立地選自於氫原子、氘原子、C1-C20烷基、C2-C20烯基及C2-C20炔基；X係選自SH、SOCH₃、SCH₃、NH₂、SiCl₃、Si(OCH₃)₃、Si(OCH₂CH₃)₃、

在一實施例中，式(1)係由以下式(2)或式(3)表示：

其中，式(2)及式(3)中之n₂、A、R₁、R₂、R₃、R₄、及X之定義與上述結合式(1)所述之定義相同。在一實施例中，式(3)中之A為單鍵，且R₃及R₄中之其一為C1-C20烷基，另一為氫原子；較佳者，R₃或R₄中之其一為甲基，另一為氫原子。在一實施例中，式(2)中A為單鍵，且R₁及R₂中之其一為C1-C20烷基，另一為氫原子；較佳者，R₁或R₂中之其一為甲基，另一為氫原子。

在一實施例中，X為，其中n₂、A、R₁、R₂、R₃、R₄、及X之定義與上述結合式(2)及式(3)所述之定義相同。

在一實施例中，由式(1)表示之烴基羧基甜菜鹼為

由於本發明之烴基羧基甜菜鹼為一自組裝分子，故當其修飾於生物材料上時，其會在生物材料上自組裝形成一自組裝奈米薄膜，如第2圖(a)及2圖(b)所示。本發明之烴基羧基甜菜鹼可直接修飾於生物材料上，或是使用含有保護基於其上之本發明之烴基羧基甜菜鹼如第2圖(c)所示地以下列步驟修飾於生物材料上：(1)生成含有保護基於其上之本發明之烴基羧基甜菜鹼，其可為羧基-α-甲基甜菜鹼甲酯(carboxy-alpha-methyl-betaine methyl ester)或羧基-β-甲基甜菜鹼甲酯(carboxy-beta-methyl-betaine methyl ester)；(2)將上述含有保護基之烴基羧基甜菜鹼修飾於生物材料上；(3)除去上述含有保護基之烴基羧基甜菜鹼上之保護基；以及(4)對去保護之烴基羧基甜菜鹼進行離子交換反應。

以下將參照合成實例進一步說明本發明。

合成實例1：化合物1的製備

2-羥乙基二硫化物(1.55g,10mmol)與三甲基胺(2.5g,25mmol)溶於二氯甲烷，再加入MsCl(2.5g,22mmol)於溶液中，0℃反應30分鐘。之後，反應物在真空下濃縮，再加入檸檬酸溶液(100ml,10% v/v)，濃稠液體再利用二氯甲烷萃取兩次(2X,100ml)，有機層再用碳酸氫鈉溶液萃取兩次(2X,100ml)，之後，利用硫酸鈉乾燥有機層，最後濃縮，得到黃色油狀2-甲基硫醯基-乙基二硫醚(2-methylsulfonyl-ethyl disulfide)。

2-甲基硫醯基-乙基二硫醚(2.8g,10mmol)加入含有二甲基胺之THF溶液(25ml,1M)，於室溫下反應8小時，之後，於真空下濃縮，NaOH溶液(200ml,2M)加入，並用二氯甲烷萃取兩次(2×200ml)。利用硫酸鈉乾燥有機層，而後過濾濃縮，得到黑色油狀N,N-二甲基-乙基二硫醚(N,N-dimethyl-ethyl disulfide)，產率為90%。

N,N-二甲基-乙基二硫醚(2.1g,10mmol)溶於(R)-(+)-3-溴異丁酸甲酯、(4.5g,25mmol)無水乙腈中60℃攪拌反應16小時，反應後得到固體，利用乙醚洗三次，並在真空下乾燥得到黃色油狀物。此油狀物在TFA(TFA：H₂O=99：1)溶液中室溫下反應15分鐘，之後真空乾燥移除 TFA，加入Ag₂O飽和溶液以溶解固體，再以過濾方式移除不可溶物，溶液利用真空乾操後便可得到為黃色固體之化合物1，羧基-α-甲基甜菜鹼二硫醚(α-mCB disulfide)，反應整體產率為74%。

合成實例2：化合物2的製備

2-羥乙基二硫化物(1.55g,10mmol)與三甲基胺(2.5g,25mmol)溶於二氯甲烷，再加入MsCl(2.5g,22mmol)於溶液中，0℃反應30分鐘。之後，反應物在真空下濃縮，再加入檸檬酸溶液(100ml,10% v/v)，濃稠液體再利用二氯甲烷萃取兩次(2X,100ml)，有機層再用碳酸氫鈉溶液萃取兩次(2X,100ml)，之後，利用硫酸鈉乾燥有機層，最後濃縮，得到黃色油狀2-甲基硫醯基-乙基二硫醚。2-甲基硫醯基-乙基二硫醚(2.8g,10mmol)加入含有二甲基胺之THF溶液(25ml,1M)，於室溫下反應8小時，之後，於真空下濃縮，NaOH溶液(200ml,2M)加入，並用二氯甲烷萃取兩次(2×200ml)。利用硫酸鈉乾燥有機層，而後過濾濃縮，得到黑色油狀N,N-二甲基-乙基二硫醚。

2.33M的N,N-二甲基-乙基二硫醚與3.5M的β-丁內酯在0℃下混合於無水乙腈，20分鐘後，移到室溫下反應三天，白色固體產物利用丙酮清洗三次，而後再加入乙醇溶解後，在丙酮再結晶得到白色固體，經過濾與真空乾糙後得到白色粉末，此為產物羧基-β-甲基甜菜鹼二硫醚(β-mCB disulfide)。

以下利用上述合成之化合物1及化合物2作為例示，以第2圖中所示之兩種化合物修飾在金表面以進一步詳細說明本發明。

實施例1

將有奈米金修飾之光纖經過簡易的清洗，並且以氧電漿除去表面的有機雜質後，泡入含有1mM化合物1之DMSO溶液中室溫下以進行12小時的修飾，以獲得基材1。

實施例2

將鍍有金薄片之玻璃基材經過簡易的清洗，並且以氧電漿除去表面的有機雜質後，泡入其中含有1mM化合物2之DMSO溶液中室溫下以進行12小時的修飾，以獲得基材2。

測試分析

以下就不同方面測試基材1的抗非特異性吸附能力

測試1

於光纖式生物感測系統中分別測試以本發明之羧基-α-甲基甜菜鹼與羧基甜菜鹼修飾之基材以1M氫氧化鈉處理前後之抗非特異性吸附能力，其結果顯示於第3圖。如第3圖所示，在基材表面上之奈米裸金(bare Au)沒有修飾任何自組裝分子，於高濃度(49rmg/ml)的牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)之抗非特異性吸附測試中，若以緩衝溶液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗，奈米裸金表面會貼附較多的BSA。而以習知技術的羧基甜菜鹼(CB)自組裝分子修飾之基材於1M氫氧化鈉溶液處理前後，因霍夫曼離去效應而使抗非特異性吸附能力產生較大的差異。而以本發明的烴基羧基甜菜鹼(α-mCB)自組裝分子修飾之基材1在1M 氫氧化鈉溶液處理前後的抗非特異性吸附能力並沒有明顯差異。由此可知，由於本發明將羧基甜菜鹼(CB)中的酸基的碳鏈上所鍵結的一個或兩個氫以C1-C20烷基、C2-C20烯基或C2-C20炔基取代，因為所取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基或C2-C20炔基的空間立體障礙較氫原子大，故不易與環境中的羥基反應，因此不會產生霍夫曼離去效應，進而提高本發明的烴基羧基甜菜鹼在鹼性環境中的穩定度。

測試2

蛋白質吸附測試在光纖式生物感測系統下執行，49mg/ml牛血清白蛋白(BSA)配製於PBS溶液中，蛋白質溶液與表面接觸約90秒後，用PBS將蛋白質溶液移除。第4圖為於不同酸鹼值下，經由1M氫氧化鈉處離前後之羧基甜菜鹼(CB)、本發明之烴基羧基甜菜鹼，於此為羧基-α-甲基甜菜鹼(α-mCB)、以及市面上所能購得含硫醇之四聚乙烯醇(TEG)之自組裝分子之非特異性吸附測試結果。在測試中可以發現羧基甜菜鹼的自組裝分子於氫氧化鈉處理後，其抗非特異性吸附能力有明顯的下降，而在不同的酸鹼值下，羧基甜菜鹼自組裝分子的BSA吸附量也有著明顯的不同。相較之下，本發明之烴基羧基甜菜鹼自組裝分子則似乎不會受到霍夫曼離去效應的影響，無論於酸或鹼性溶液下，基材1表面皆有本發明之烴基羧基甜菜鹼構築成之同時具有雙離子性的高親水性單分子薄膜，因而具有一高抗非特異性吸附之能力，無論BSA表面呈現何種電荷，皆會與本發明之烴基羧基甜菜鹼自組裝分子產生排斥而達到較好的抗非特異性吸附效果。

而TEG自組裝分子為傳統抗非特異性吸附之主要結構，由於其並不具有正負電荷的結構，故在不同酸鹼度下皆不會影響其抗非特異性吸附的能力，於此實驗中也可以看到在不同酸鹼度下TEG自組裝分子都展現了不錯的抗非特異性吸附能力。

測試3

請參見第5圖。先打入醋酸鈉水溶液並等待訊號平穩，接著打入EDC/NHS混合溶液(此時，因折射率產生變化，故在訊號上有明顯的改變)，此時EDC會將基材1表面的本發明之烴基羧基甜菜鹼分子上之酸基進行活化並接上NHS做一酯化反應，等待一段時間後以去離子水進行表面多餘EDC/NHS的沖洗，沖洗後打入以HEPES配置之抗體(如箭號f所示)，並靜置數分鐘等待反應生成，此時活化後的酸基會與抗體上之N端進行醯胺鍵結而進而固定於基材1上，待反應時間結束後，以碳酸氫鈉水溶液做為沖洗，藉由碳酸氫鈉之鹼性環境做為NHS於酸基上的離去反應，藉以達到去活化的目的；最後以PBS緩衝溶液平穩訊號後便可以濃度低至高依序打入抗原(如箭號a、b、c及d所示)進行生化感測，測試結束後以平衡訊號之PBS緩衝溶液之訊號做為起始訊號，個別處理各抗原濃度下所生成的訊號，並且對濃度做圖，其結果如第5圖所示。

由於本發明之烴基羧基甜菜鹼同時兼具有抗非特異性吸附及固定生化分子的能力，因此僅需以單一的自組裝分子層，即能進行官能化薄膜的修飾。如第5圖所示，當本發明的烴基羧基甜菜鹼自組裝分子(羧基-α-甲基甜菜鹼)以EDC/NHS(1-(3-二甲基胺丙基)-3-乙基碳二亞胺/N-羥基琥珀醯亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide/N-hydroxysuccinimide))進行醯胺鍵結合修飾上抗體後，由第5圖可知，以人造血清進行測試，有抗體修飾之烴基羧基甜菜鹼的光纖依舊有不錯的感測能力。並且，將第5圖標準化後可得一線性關係圖(見第6圖)。由第6圖可知，本發明的烴基羧基甜菜鹼的偵測極限(limit of detection，LOD)為1.8+0.6 x 10^-7g/ml。

第7圖為本發明之羧基-α-甲基甜菜鹼修飾在金薄膜表面後對金黃色葡萄球菌(S.aureous)之抗生物汙染測試圖。由第7圖可知，本發明的羧基-α-甲基甜菜鹼經1M氫氧化鈉溶液處理後(α-mCB-NaOH)相較於習知的羧基甜菜鹼(CB)經1M氫氧化鈉溶液處理後(CB-NaOH)，對金黃色葡萄球菌之抗生物汙染具有較佳的抗吸附能力。

第8圖為本發明之羧基-β-甲基甜菜鹼(β-mCB)修飾在金薄膜表面後對牛血清蛋白BSA之抗生物汙染測試圖。將基材2(第2圖(a))裝置於SPR生物感測器進行牛血清(BSA)蛋白質非特異性吸附測試，經過10分鐘的蛋白質吸附後，以PBS緩衝液沖洗，由第8圖可知，BSA被移除於表面，基材2可避免蛋白質貼附，因此本發明之羧基-β-甲基甜菜鹼具有優異之抗吸附能力。

羧基甜菜鹼為相當良好的抗非特定生物分子吸附的雙離子材料。而由上述實驗，我們可以發現，由於本發明之烴基羧基甜菜鹼可避免在鹼性環境下產生霍夫曼離去效應，因此，本發明之烴基羧基甜菜鹼除了具有與羧基甜菜鹼同樣優異之抗非特定生物分子吸附能力外，相較於羧基甜菜鹼，本發明之烴基羧基甜菜鹼於鹼性溶液中更加穩定。因此，本發明之烴基羧基甜菜鹼可用於修飾生物材料，以使該生物材料於鹼性溶液中維持優異之抗非特異性吸附能力，避免生物材料與血液接觸時，血液與材料之間常出現血漿蛋白被吸附或是血小板的貼覆，而造成生物材料功能性的喪失。

以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。

Claims

一種烴基羧基甜菜鹼，其由以下式(1)表示：
其中，n₂>0但不包含n₂>22，A表示C1-C20烷基或單鍵；R₁、R₂、R₃、及R₄各獨立地選自於氫原子、氘原子、C1-C20烷基、C2-C20烯基及C2-C20炔基；X係選自於SH、SOCH₃、SCH₃、NH₂、SiCl₃、Si(OCH₃)₃、Si(OCH₂CH₃)₃、
及
，其中m>0但不包含m>3，其中R₁、R₂、R₃、及R₄中之至少其一不為氫原子。
如申請專利範圍第1項所述之烴基羧基甜菜鹼，其中式(1)係由以下式(2)或式(3)表示：
其中，n₂、A、R₁、R₂、R₃、R₄、及X與式(1)之定義相同，R₁與R₂中之至少其一不為氫原子，且R₃與R₄中之至少其一不為氫原子。
如申請專利範圍第2項所述之烴基羧基甜菜鹼，其中A為單鍵，且R₁、R₂、R₃、及R₄中之其一為C1-C20烷基，其餘為氫原子。
如申請專利範圍第2項所述之烴基羧基甜菜鹼，其中R₁、R₂、R₃、及R₄中之其一為甲基，其餘為氫原子。
如申請專利範圍第2項所述之烴基羧基甜菜鹼，其中X為
其中，n₂、A、R₁、R₂、R₃及R₄與式(1)之定義相同。
如申請專利範圍第1項所述之烴基羧基甜菜鹼，其中由式(1)表示之烴基羧基甜菜鹼為：
一種修飾生物材料之方法，包含：於一生物材料上形成一自組裝奈米薄膜，其中該自組裝奈米薄膜係以如申請專利範圍第1項所述之烴基羧基甜菜鹼形成。
如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該烴基羧基甜菜鹼為未包含保護基之烴基羧基甜菜鹼或包含保護基之烴基羧基甜菜鹼。
如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該烴基羧基甜菜鹼為包含保護基之烴基羧基甜菜鹼時，進一步包含以下步驟：對修飾於該生物材料上之包含保護基之烴基羧基甜菜鹼進行去保護；以及對經去保護之烴基羧基甜菜鹼進行離子交換反應。
如申請專利範圍第8項所述之方法，其中包含保護基之烴基羧基甜菜鹼為羧基-α-甲基甜菜鹼甲酯或羧基-β-甲基甜菜鹼甲酯。