JP6236278B2 - 体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材 - Google Patents

Description

本発明は体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材、その吸着材を充填したＩｇＧ型抗体吸着器及びその吸着器を備える体液浄化デバイスに関する。

近年、医学、特に内科学、血液学、免疫学及び臨床検査学の飛躍的な進歩によって、疾患の原因又は疾患の進行と密接な関係を持っていると考えられる血液中の悪性物質が明らかになりつつある。例えば、血液中に存在する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を本体とする自己抗体及び免疫複合体は、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症等、生体免疫機能に関係した自己免疫疾患の原因及び病態の進行と密接な関係を持っていると考えられている。

そこで、血液及び血漿等の体液成分から、上記自己抗体及び免疫複合体を特異的に吸着し除去することで、上述の疾患の進行を防止し、疾患の症状を軽減せしめ、更には疾患の治癒を早めることが期待されている。体液中の自己抗体及び免疫複合体を除去する技術としては、全血を血球成分と血漿成分とに分離し、血漿中に含まれる上記自己抗体及び免疫複合体を吸着材によって吸着し、除去する方法がある。

特公昭６３−０５３９７１号公報 特公平３−０６５１９０号公報 米国特許６０１３７６３号明細書

未来材料、第８巻、１１号（２００８）、ｐｐ２８−３４ 米国科学アカデミー紀要、第９３巻（１９９６）、ｐｐ５６８８−５６９２

従来、このような目的に使用する吸着材としては、水不溶性担体にリガンドとして疎水性アミノ酸であるトリプトファンを固定化した吸着材が知られている（特許文献１）。さらにＩｇＧ型抗体と特異的に相互作用するプロテインＡ及び抗ヒト免疫グロブリン抗体等の生物由来のＩｇＧ型抗体結合性物質、所謂、生物学的リガンドを、水不溶性担体に固定化した吸着材が知られている（非特許文献１）。

しかしながら、トリプトファンをリガンドとして水不溶性担体に固定化させた吸着材は、治療効果が認められる一方で、ＩｇＧ型抗体を吸着する容量が十分に大きいとは言えない。さらに、上記吸着材は病因物質ではないフィブリノーゲン（Ｆｂｇ）も吸着除去し、選択吸着性が悪いという欠点がある。

一方で、生物学的リガンドの一例であるプロテインＡを水不溶性担体に固定化させた吸着材は、ＩｇＧ型抗体に対して特異的吸着性能を有している（特許文献２）。そのため上記吸着材は、トリプトファンをリガンドとした吸着材が有する上述のような問題を解決可能であると考えられる。しかしながら、これらの生物学的リガンドは一般的に原料の確保が困難で製品コストがかかるという不利な点がある。さらに、上記吸着材を体液に接触させて使用する際、上記生物学的リガンドが体液中に溶出して重大な副作用を生じる危険がある。加えて、上記生物学的リガンドの製造工程で混入する可能性がある未知のウィルス又は病原菌に由来する感染のリスクがあるといった難点も含んでいる。

上記リガンドを固定する担体としては、通常のアフィニティクロマトグラフィーに用いられるセルロース及びデキストラン等のポリサッカライド粒子及びシリカビーズ等の多孔質ガラスがよく知られている。しかしながら、これらの担体は血液と接触した際に、補体系が活性する等の危険がある。したがって、上述の担体は、血液に対する適合性（血液適合性）が高いとは言えず、血液を浄化する用途（血液浄化用途）には向いていない。

近年の分子生物学及び機器分析技術の発展に伴い、タンパク質の詳細な構造情報とその機能解明が飛躍的に進み、巨大なタンパク質の機能を小さなペプチドで達成することが可能となってきている。例えば、非特許文献２では、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインから結合に関与するモチーフを抽出し、タンパク質のサイズを極小化しながらプロテインＡと同等の結合親和性を有するペプチドの獲得を達成している。これらの知見から、米国特許６０１３７６３号公報（特許文献３）では、アフィニティクロマトグラフィー用途を指向した該ペプチドの報告がある。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症等の自己免疫疾患の病因物質と考えられる自己抗体及び免疫複合体の構成単位であるＩｇＧ型抗体を、高い吸着容量で高選択的に吸着することが可能で、未知のウィルス又は病原菌の混入リスクも無く、血液適合性の高い体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材、その吸着材を充填したＩｇＧ型抗体吸着器、及びその吸着器を備える体液浄化デバイスを提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ある特定のアミノ酸配列を有するペプチドを、ＩｇＧ型抗体を結合させるためのリガンドとし、上記リガンドが体液浄化用の水不溶性担体に固定化されている吸着材が、アフィニティクロマトグラフィーの用途のみならず、体液浄化用の治療器（体液浄化デバイス）としても有用であり、血液、血漿及び血清等の体液中から、自己抗体及び免疫複合体を構成するＩｇＧ型抗体を驚くほど高い吸着容量且つ、高選択的に吸着することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下に関する。
［１］
水不溶性担体と、
上記水不溶性担体に固定されたペプチドと、を含み、
上記ペプチドが配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材。
［２］
上記アミノ酸配列における５番目の残基Ｘがシステイン残基であり、当該システイン残基と、上記アミノ酸配列における３４番目のシステイン残基とが、互いにジスルフィド結合を形成している、［１］に記載の体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材。
［３］
上記ペプチドが、上記ペプチドが有する少なくとも１つのシステイン残基のメルカプト基によって、直接又はリンカーを介して、上記水不溶性担体に固定化されている、［１］に記載の体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材。
［４］
上記ペプチドが、上記ペプチドが有する少なくとも１つのリジン残基の側鎖のアミノ基によって、直接又はリンカーを介して、上記水不溶性担体に固定化されている、［１］又は［２］に記載の体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材。
［５］
上記ペプチドが、上記ペプチドが有する少なくとも１つのグルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基の側鎖のカルボキシル基によって、直接又はリンカーを介して、上記水不溶性担体に固定化されている、［１］又は［２］に記載の体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材。
［６］
上記ペプチドが、上記ペプチドのカルボキシ末端のカルボキシル基によって、直接又はリンカーを介して、上記水不溶性担体に固定化されている、［１］又は［２］に記載の体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材。
［７］
上記ペプチドが、上記ペプチドのアミノ末端のアミノ基によって、直接又はリンカーを介して、上記水不溶性担体に固定化されている、［１］又は［２］に記載の体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材。
［８］
上記リンカーがオリゴエチレングリコール又はポリエチレングリコールである、請求項［３］〜［７］のいずれかに記載の体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材。
［９］
上記ペプチドが、上記水不溶性担体１ｍＬあたり、０．１〜１００μｍｏｌ固定化されている、［１］〜［８］のいずれかに記載の体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材。
［１０］
上記水不溶性担体が粒子状の多孔質体であって、上記水不溶性担体の排除限界分子量が１５万〜１０００万である、［１］〜［９］のいずれかに記載の体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材。
［１１］
上記水不溶性担体がポリビニルアルコール又はその架橋体である、［１］〜［１０］のいずれかに記載の体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材。
［１２］
液体を流入させる入口ポートと、上記液体を流出させる出口ポートを有する容器と、
上記容器に充填された［１］〜［１１］のいずれかに記載の体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材と、を備えるＩｇＧ型抗体吸着器。
［１３］
［１２］に記載のＩｇＧ型抗体吸着器を備える体液浄化デバイスであって、
上記ＩｇＧ型抗体吸着器に流入する液体が血液、血漿、及び血清からなる群から選ばれる体液である、体液浄化デバイス。

本発明に係る体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材は、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症等、自己免疫疾患の病因物質と考えられる自己抗体及び免疫複合体の構成単位であるＩｇＧ型抗体を、未知のウィルス又は病原菌の混入リスク無く、高い吸着容量で吸着することが可能である。すなわち、本発明に係る体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材は、血漿又は血清から未知のウィルス又は病原菌の混入リスク無く、高い吸着容量且つ、高い選択性でＩｇＧ型抗体を吸着することが可能な血液適合性の高い体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材である。

体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材を使用した体外循環モジュールの一実施形態を示す模式断面図である。 実施例において製造した各担体におけるＩｇＧ型抗体の吸着率を示すグラフである。

以下、本発明について詳細に述べる。以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。

本実施形態における「ＩｇＧ型抗体」とは、ＩｇＧクラスと同様のＦｃ領域を有するタンパク質であれば、タンパク質分子内のＦｃ領域以外の領域が変性、及び／又は、欠損したタンパク質であってもよい。

本明細書においては、当該分野の常法に従って、各種アミノ酸残基を一文字表記で記載し、ペプチドのアミノ酸配列はアミノ末端からカルボキシ末端方向へ左から右へ記載する。

本発明の体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材（以下、「ＩｇＧ型抗体吸着材」、「吸着材」という場合がある。）は、水不溶性担体と、上記水不溶性担体に固定されたペプチドと、を含み、上記ペプチドが配列番号１に記載のアミノ酸配列（ＦＮＭＱＸＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＲＤＤＣ）を有する（ただし、残基Ｘはシステイン残基又はグルタミン残基を示す）。上記ペプチドは本発明においてリガンドとして使用しうる。

上記ペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を欠損無く連続して有していればどのようなペプチドであってもよいが、好ましくは配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。さらに、上記ペプチドは、上記アミノ酸配列における５番目の残基Ｘがシステイン残基であり、当該システイン残基と、上記アミノ酸配列における３４番目のシステイン残基とが、互いにジスルフィド結合を形成していてもよい。

上記ペプチドの全長は、アミノ酸残基で３４〜２００残基であることが好ましく、アミノ酸残基で３４〜１００残基であることがより好ましい。

上記ペプチドのうち非環状のペプチドは、当該技術において、それ自体公知のペプチド合成方法に従って合成することが出来る。例えばＦｍｏｃ固相合成法、フラグメント縮合法等の液相合成法が挙げられる。操作が簡便である点から、ペプチド合成方法は固相合成法であることが好ましい。また、本発明のペプチドのうち、環状になっているペプチドは、非環状ペプチドを得た後これを環化して得ることができる。

水不溶性担体とは、水に溶けない担体を意味する。上記水不溶性担体は、体液浄化用水不溶性担体であることが好ましい。体液浄化用水不溶性担体とは、吸着材が血液等の体液に接触した場合、体液中に溶け出さない担体であって、タンパク質に対する非特異的な吸着が少ない、ブラジキニン産生能が低い、補体活性能が低い等、血液適合性等の体液適合性が高い担体を意味する。上記体液浄化用水不溶性担体は、ポリビニルアルコールが架橋したもの（架橋化ＰＶＡ）であることが好ましい。

リガンドを固定化する際に使用する担体としては、親水性の表面を有し、かつリガンドとの間で共有結合を形成させるために利用し得るアミノ基、カルボキシル基、水酸基等の反応性の官能基を有するものが好ましい。また、上記水不溶性担体は吸着させ得る有効表面積が広い多孔性であるもの（多孔質体）が好ましい。

上記水不溶性担体は粒子状、繊維状、シート状、中空糸状等の任意の形状を用いることが出来る。リガンドの保持量又は吸着材としての取扱い性を考慮すると、水不溶性担体は粒子状のものが好ましい。

球状担体又は、粒子状担体の平均粒径は、２５μｍ〜２５００μｍであることが好ましい。担体の比表面積と体液との流通性の面から、上記平均粒径は５０μｍ〜１５００μｍであることがより好ましい。

これら担体を例示すると、旭化成マイクロキャリア（旭化成株式会社製）及びＣＭ−セルロファイン（登録商標）ＣＨ（排除限界タンパク質分子量：約３×１０^６、生化学工業株式会社販売）等のセルロース系担体、特公平１−０４４７２５号公報に記載の全多孔質活性化ゲル、ＣＭ−トヨパール（登録商標）６５０Ｃ（排除限界タンパク質分子量：５×１０^６、東ソー株式会社製）等のポリビニル系担体、ＣＭ−トリスアクリルＭ（ＣＭ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ Ｍ）〔排除限界タンパク質分子量：１×１０^７、スウェーデン国ファルマシア−ＬＫＢ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）社製〕等のポリアクリルアミド系担体、及び、セファロースＣＬ−４Ｂ（ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂ）〔排除限界タンパク質分子量：２×１０^７、スウェーデン国ファルマシア−ＬＫＢ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）社製〕等のアガロース系担体等の有機質担体、並びに、ＣＰＧ−１０−１０００〔排除限界タンパク質分子量：１×１０^８、平均細孔径：１００ｎｍ、米国エレクトローニュークレオニクス（Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ）社製〕等の多孔性ガラス等の無機質担体が挙げられるが、体液浄化用水不溶性担体として最も好ましくは、ポリ酢酸ビニル製の球状多孔質体（旭硝子株式会社製、平均粒径１００μｍ、排除限界分子量約１００万以上、排除限界分子量約１００万以上、樹脂１ｍＬに充填できる分子量４万のプルランの量が０．２０ｍＬ／ｍＬ以上）がよい。

水不溶性担体としては、粒子状の多孔質体が好ましく、例えば、架橋化ＰＶＡ粒子等の多孔性重合体粒子を用いることができる。粒子状の多孔質体は、リガンドを固定化できるものである。本実施形態の目的吸着物質であるＩｇＧ型抗体の分子量が約１５万であることから、粒子状の多孔質体の排除限界分子量（タンパク質）は、１５万〜１０００万であることが好ましい。最も好ましい排除限界分子量は１００万〜５００万である。

リガンドの水不溶性担体への担持方法としては、公知の担体活性化方法及び固定化法を用いることができる。例えば、担体がアミノ基又はカルボキシル基を有する場合には、ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合試薬の存在下で、リガンドと縮合反応させる方法、及び、担体とリガンドとをグルタルアルデヒド等の２個以上の官能基を有する化合物を用いて結合させる方法が挙げられる。また、担体が水酸基を有する場合には、例えば、臭化シアン等のハロゲン化シアンを担体に作用させ、リガンドのアミノ基の部分で反応させる方法、及び、エピクロロヒドリン等のエポキシ基を有する化合物を担体に作用させ、リガンドのアミノ基やメルカプト基の部分で反応させる方法が挙げられる。さらに、担体の水酸基をマレイミド基へと変換することで、エポキシド化担体とは異なり、メルカプト基を有するリガンドのみを選択的に固定化させることも可能である。

必要に応じて、水不溶性担体とリガンドとの間に任意の長さの分子（リンカー）を導入したものを吸着材として使用することもできる。リンカー分子としては、ポリメチレン鎖、オリゴエチレングリコール鎖、ポリエチレングリコール鎖、ポリアラニン鎖等が挙げられる。例えば、アガロースの水酸基とポリエチレングリコールジグリシジルエーテルの片側のグリシジル基を反応、結合させ、残ったグリシジル基とリガンドを反応、結合させることができる。

本実施形態では、ペプチドが、ペプチドが有する少なくとも１つのシステイン残基のメルカプト基によって、直接又はリンカーを介して、水不溶性担体に固定化されていてもよいし、ペプチドが、ペプチドが有する少なくとも１つのリジン残基の側鎖のアミノ基によって、直接又はリンカーを介して、水不溶性担体に固定化されていてもよいし、ペプチドが、ペプチドが有する少なくとも１つのグルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基の側鎖のカルボキシル基によって、直接又はリンカーを介して、水不溶性担体に固定化されていてもよい。また、ペプチドが、ペプチドのカルボキシ末端のカルボキシル基によって、直接又はリンカーを介して、水不溶性担体に固定化されていてもよいし、ペプチドが、ペプチドのアミノ末端のアミノ基によって、直接又はリンカーを介して、水不溶性担体に固定化されていてもよい。

水不溶性担体に対するペプチドの固定化量は、少なすぎると吸着能力が低くなる傾向にあり、多すぎても吸着容量の増大は飽和する。よって、水不溶性担体１ｍＬあたり、０．１〜１００μｍｏｌの範囲が好ましく、より好ましくは０．１〜５０μｍｏｌ、さらに好ましくは０．５〜１０μｍｏｌの範囲である。なお、ペプチドの固定化量は、ペプチド導入反応前後の反応溶液の吸光度を紫外可視分光光度計で測定し、反応前後の吸光度の差分に基づいて算出される。

ＩｇＧ型抗体吸着材は、液体を流入させる入口ポートと、上記液体を流出させる出口ポートを有する容器内に充填保持されることによって、ＩｇＧ型抗体吸着器として使用することができる。このようなＩｇＧ型抗体吸着器としては、例えば、ＩｇＧ型抗体吸着材を使用した体外循環モジュールが挙げられる。

図１はＩｇＧ型抗体吸着材を使用した体外循環モジュールの一実施形態を示す模式断面図である。図１に示す体外循環モジュール１は、円筒２の一端開口部に、内側にフィルター３を張ったパッキン４を介して体液を流入させる入口ポート５（導入口）を有するキャップ６をネジ嵌合し、円筒２の他端開口部に内側にフィルター３’を張ったパッキン４’を介して体液を流出させる出口ポート７（導出口）を有するキャップ８をネジ嵌合して容器を形成し、フィルター３及び３’の間隙にＩｇＧ型抗体吸着材を充填保持させて吸着材層９を形成してなるものである。体外循環モジュール１は、例えば、自己抗体及び免疫複合体を除去するための体液浄化デバイスとして使用することができる。

吸着材層９には、ＩｇＧ型抗体吸着材を単独で充填してもよく、他の吸着材と混合して充填してもよい。また、ＩｇＧ型抗体吸着材と他の吸着材とが積層するように充填してもよい。他の吸着材としては、例えば、幅広い吸着能を有する活性炭等を用いることができる。これによって吸着材の相乗効果による広範な臨床効果が期待できる。吸着材層９の容積は、体外循環に用いる場合、５０ｍＬ〜７００ｍＬ程度が適当である。

体液浄化デバイスを体外循環で用いる場合には、大きく次の二通りの方法がある。一つの方法は、体内から取り出した血液を遠心分離機又は膜型血漿分離器を使用して、血漿成分と血球成分とに分離した後、血漿成分を上記体液浄化デバイスに通過させ、浄化した後、血球成分とあわせて体内に戻す方法である。他の一つの方法は、体内から取り出した血液を直接、上記体液浄化デバイスに通過させ、浄化する方法である。

血液又は血漿等の体液の通過速度については、ＩｇＧ型抗体吸着材の吸着能率が非常に高いため、吸着材の粒度を粗くすることができ、また充填度を低くできるので、吸着材層の形状の如何にかかわりなく、高い通過速度を与えることができる。そのため多量の体液を処理することができる。

体液の通液方法としては、臨床上の必要に応じ、あるいは設備の設置状況に応じて、連続的に通液してもよいし、または断続的に通液使用してもよい。

このような本発明の体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材は、体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着剤としても把握し得る。なお、本発明の体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材及びＩｇＧ型抗体吸着器は、体液浄化デバイス用ＩｇＧ型自己抗体吸着材及びＩｇＧ型自己抗体吸着器として用いてもよい。本明細書において、「自己抗体」とは、自己の細胞又は組織（移植されたものも含む）に対して産生される抗体を意味する。

以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（実施例１）
１．ペプチドの合成方法
Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂（ライフテクノロジー社製、置換率０．１６ｍｏｌ／ｇ）３ｇ（０．４８ｍｍｏｌ）にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を加えて十分に膨潤させた。膨潤させた樹脂を含む懸濁液に３０％ピペリジン２０ｍＬを添加し１分間振とう後、再度、３０％ピペリジンを２０ｍＬ添加して１０分間振とうした。上記樹脂をＤＭＦで十分洗浄した後、少量取り出した樹脂に１％２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）と１０％Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を２μＬずつ添加した。５分静置して樹脂が赤く呈色されることを確認することで、Ｆｍｏｃ基が脱保護されアミノ基が露出したと判断した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸４．８ｍｍｏｌ、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＣＴＵ）４．８ｍｍｏｌ，ＤＩＥＡ９．６ｍｍｏｌの混合液２０ｍＬを樹脂に添加し、室温で３０分間振とうさせることでアミノ酸を付加した。ＤＭＦで樹脂を洗浄後、少量の樹脂に１％ＴＮＢＳと１０％ＤＩＥＡを２μＬずつ添加した、５分静置して樹脂が赤く呈色されないことを確認することで、アミノ基が全て反応したと判断した。５％無水酢酸２０ｍＬを樹脂に加え５分間振とうして、未反応のアミノ基をアセチル化した。この工程を繰り返すことで目的のペプチドを合成した。

ペプチド合成した樹脂はジエチルエーテルで洗浄後、乾燥させた。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：アニソール：エチルメチルスルフィド：１．２−エタンジチオール＝９３：３：３：１（体積比）に調整したクリベージ溶液４０ｍＬを加え、室温で４時間静置して脱保護及び脱樹脂反応をした。得られた上清に氷冷したジエチルエーテルを加えてペプチドを析出させ、遠心分離して上清を捨てた。得られた沈殿をジエチルエーテルで数回洗浄した後、十分に乾燥させた。得られたペプチドは０．１％ＴＦＡ水溶液に溶解し、逆相ＨＰＬＣで目的のペプチドを精製した。

２．ペプチド固定化担体の作製方法
ポリ酢酸ビニル製の球状多孔質体（旭硝子株式会社製、平均粒径１００μｍ、排除限界分子量約１００万以上、樹脂１ｍＬに充填できる分子量４万のプルランの量が０．２０ｍＬ／ｍＬ以上）１８ｇをジメチルスルホキシド（和光純薬工業株式会社製）１８０ｍＬに投入し、そこに、エピクロロヒドリン（和光純薬工業株式会社製）１３７ｍＬ、水酸化ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）の水溶液（２１ｇ／３１．５ｍＬ）及び水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）８８ｍｇを添加し、３０℃で５時間反応させてエポキシ基を導入した。反応後、エポキシ基を導入した球状多孔質体をメタノール（和光純薬工業株式会社製）で洗浄し、その後、純水で洗浄してエポキシ活性化担体を得た。得られた担体は、１．０Ｍのチオ硫酸ナトリウム水溶液（和光純薬工業株式会社製）２ｍＬと、活性化担体１ｍＬに１％フェノールフタレインエタノール溶液（和光純薬工業株式会社製）２滴を滴下し、８０℃で赤色の呈色が確認されなくなるまで０．１Ｍの塩酸（和光純薬工業株式会社製）を加え、「活性化量（単位樹脂体積量あたりのエポキシ基の物質量）＝塩酸濃度（体積モル濃度）×塩酸滴定量（体積量）／樹脂量（体積量）」の式によって、導入されたエポキシ基の量を求め、１１０μｍｏｌ／ｍＬ以上であることを確認した。

次に、エポキシ化担体を３０ｍＬ秤量し、アンモニア水（濃度：２８−３０％、関東化学株式会社製）を４５ｍＬ加え、４０℃で９０分間反応することで、エポキシ基をアミノ基に変換した。得られたアミノ化担体は元素分析によって、定量的にエポキシ基からアミノ基となっていることを確認した。

次に、アミノ化担体を５ｍＬ秤量し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業株式会社製）で膨潤させた後、１０ｍＭのＳｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ（米国サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）のＤＭＳＯ溶液１０ｍＬを加え、３０℃で３時間反応させた。反応後、ＤＭＳＯで洗浄し、その後純水で洗浄することで、マレイミド化担体を得た。

得られたマレイミド化担体を１．５ｍＬ秤量し、２．４ｍＭのペプチド（配列番号１のアミノ酸配列からなり、残基Ｘがグルタミン残基であるペプチド）ＰＢＳ溶液５ｍＬを加えた。その後、３７℃で１７時間反応させることで、ペプチド中のメルカプト基と担体中のマレイミド基を共有結合させた。反応後、純水で洗浄することで、ペプチド固定化担体を得た。ペプチドの固定化量は、ペプチド導入反応前後の反応溶液の吸光度（２０２ｎｍ）を紫外可視分光光度計で測定し、その吸光度の差分に基づいて算出した。

健常人から採取したＣＰＤ加血液（Ｃｉｔｒａｔｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ加血液）を遠心分離にて血漿分離し、健常人ヒト血漿を得た。次に得られたペプチド固定化担体を０．５ｍＬ秤量し、その６倍容の健常人ヒト血漿を加え、３７℃で１７．５分間振とうさせた。振とう後、遠心分離にてペプチド固定化担体を除き、上澄み血漿中に含まれる血漿タンパク質（ＩｇＧ、Ｆｂｇ、アルブミン（Ａｌｂ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ））を測定することで、ペプチド固定化担体への吸着率を算出した。

（比較例１）
実施例１で作製したエポキシ化担体を１０ｍＬ秤量し、４６ｍＭのトリプトファン（和光純薬工業株式会社製）炭酸緩衝溶液２０ｍＬを加え、５０℃で１６時間反応させることで、トリプトファンを担体に共有結合させた。反応後、純水で洗浄することでトリプトファン固定化担体を得た。トリプトファンの固定化量は、トリプトファン導入反応前後の反応溶液の吸光度（２８０ｎｍ）を紫外可視分光光度計で測定し、その吸光度の差分に基づいて算出した。このトリプトファン固定化担体を用いて、実施例１と同様の方法で健常人ヒト血漿におけるタンパク質吸着試験を実施した。

（比較例２）
実施例１で作製したアミノ化担体を用いて、実施例１と同様の方法で健常人ヒト血漿におけるタンパク質吸着試験を実施した。

実施例１、並びに、比較例１及び２の結果を表１及び図２に示す。

表１に示すように、ペプチド固定化担体を用いた実施例１は、リガンド固定化量がトリプトファンの１０分の１以下であるにもかかわらず、極めて高いＩｇＧ吸着率を示した。また、トリプトファン固定化担体と比較して、他の血漿タンパク質成分を吸着することなく、ＩｇＧに選択的に吸着することも示された。

本発明の体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材は、例えば、医療産業及び製薬業等で利用可能である。特に、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症等の自己免疫疾患の病因物質と考えられる自己抗体及び免疫複合体の構成単位であるＩｇＧ型抗体を、未知のウィルス又は病原菌の混入リスク無く、高い吸着容量で高選択的に吸着することが可能であり、血液適合性も高いことから、自己免疫疾患の治療に有用である。

１…体液浄化デバイス（体外循環モジュール）、２…円筒、３、３’…フィルター、４、４’…パッキン、５…入口ポート（体液導入口）、６…キャップ、７…出口ポート（体液導出口）、８…キャップ、９…ＩｇＧ型抗体吸着材。

Claims (7)

1. 水不溶性担体と、
   前記水不溶性担体に固定されたペプチドと、を含み、
   前記ペプチドが配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、前記アミノ酸配列における５番目の残基Ｘがグルタミン残基であり、前記ペプチドが、前記アミノ酸配列における３４番目のアミノ酸残基であるシステイン残基のメルカプト基によって、直接又はリンカーを介して、前記水不溶性担体に固定化されている、体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材。
2. 前記リンカーがオリゴエチレングリコール又はポリエチレングリコールである、請求項１に記載の体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材。
3. 前記ペプチドが、前記水不溶性担体１ｍＬあたり、０．１〜１００μｍｏｌ固定化されている、請求項１又は２に記載の体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材。
4. 前記水不溶性担体が粒子状の多孔質体であって、前記水不溶性担体の排除限界分子量が１５万〜１０００万である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材。
5. 前記水不溶性担体がポリビニルアルコール又はその架橋体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材。
6. 液体を流入させる入口ポートと、前記液体を流出させる出口ポートを有する容器と、
   前記容器に充填された請求項１〜５のいずれか一項に記載の体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着材と、を備えるＩｇＧ型抗体吸着器。
7. 請求項６に記載のＩｇＧ型抗体吸着器を備える体液浄化デバイスであって、
   前記ＩｇＧ型抗体吸着器に流入する液体が血液、血漿、及び血清からなる群から選ばれる体液である、体液浄化デバイス。

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