JPH0114791B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、生体免疫機能に起因する各種疾患と
密接な関係をもつと考えられている自己抗体およ
び／または免疫複合体などを選択的に吸着除去す
る体液浄化用吸着材に関する。 周知の如く体液、例えば血液中に発現する自己
抗体および／または免疫複合体は、癌、免疫増殖
性症候群、および慢性関節リウマチ、全身性エリ
テマトーデス等の自己免疫疾患、あるいはアレル
ギー、臓器移植時の拒絶反応等の生体免疫機能に
関係した疾患および現象の原因あるいは進行と密
接な関係をもつていると考えられている。 そこで、血液、血漿等の体液成分から、上記自
己抗体および／または免疫複合体を特異的に吸着
除去することによつて、上記の如き疾患の進行を
防止し、症状を軽減せしめ、さらには治癒を早め
ることが期待されていた。 本発明者らは、自己抗体および／または免疫複
合体などを高い効率で選択的に吸着し、非選択的
な吸着が少なく、安全性があり、滅菌操作も簡単
に行なうことができ、体液浄化あるいは再生用に
適した吸着材を提供することを目的に鋭意研究し
た結果、担体に被吸着物質と化学的な選択的相互
作用をなす特別な化学構造を有する物質を保持さ
せてなる種々の吸着材を見出し、先に特許出願し
た（特開昭57−121619、特開昭57−134164、特開
昭57−192560、特開昭58−61752）。 本発明は、先の発明に関し、被吸着物質と選択
的相互作用をなす物質について、より詳細に検討
した結果なされたものであり、上記吸着材の改良
に関する。 本発明の目的に対して用いられる吸着材の性質
として望まれることは、 (1) 自己抗体、免疫複合体を選択的に、かつ高い
効率で吸着すること、 (2) 目的物質以外の物質を吸着し難いこと、 (3) 凝固線溶系を活性化しないこと、 (4) 滅菌できること、 (5) 機械的強度が充分あること、 などである。 本発明者らは、体液浄化用吸着材として、さら
に高い効率で自己抗体、免疫複合体を吸着でき
る、すなわち、コンパクトでプライミングボリユ
ームの少ない吸着器とすることができる吸着材を
提供することを目標にして、さらに鋭意研究を重
ねた。 担体に対し各種化合物を固定化して、自己抗体
および／または免疫複合体に対する吸着特性を評
価したところ、担体に固定化された化合物の持つ
電荷と骨格構造の炭素数において、ある特定の条
件を満たす場合、すなわち、担体に固定化された
化合物に負電荷が多く、骨格構造の炭素数が比較
的多い場合には、自己抗体および／または免疫複
合体の吸着能力が高くなることを見出し、さら
に、担体に固定化された化合物の分子量が比較的
小さい場合には、たとえ、その化合物が担体から
外れて生体に入つたとしても、抗原性を有しない
ことを確認して、本発明を完成するに至つた。 すなわち、本発明は、担体の表面に、１分子中
に負電荷を有する置換基を少なくとも２個持ち、
かつ、骨格構造に少なくとも６個の炭素を持つ有
機低分子化合物部を有することを特徴とする自己
抗体および／または免疫複合体の吸着材であり、
負電荷を有する置換基は、カルボキシル基また
は／およびスルホン酸基であることが好ましい。 本発明で言う有機低分子化合物部とは、その１
分子中に負電荷を有する置換基を２個以上持ち、
かつ、骨格構造の炭素数が６個以上のものを言う
のであるが、分子量は10⁴以下であるのが好まし
く、10³以下であるのが望ましい。ここで、負電
荷を有する置換基とは、カルボキシル基
（COO^-、COOH、COONa）、スルホン酸基
（SO₃ ^-、SO₃H、SO₃Na）、リン酸基（PO₃ ^-、
PO₃H、PO₃Na）などのように、血液、体液等の
中性電解液中で負電荷を示す特性基を言う。 本発明で言う有機低分子化合物部を例示する
と、ベンゼンジスルホン酸、ナフタレンジカルボ
ン酸のように負電荷を有する置換基を２個以上持
ち、かつ芳香族性を持つた環状化合物、スクシノ
カナバニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギ
ン酸のように、負電荷を有する置換基を２個以上
持つた長鎖脂肪族化合物等が挙げられる。芳香族
性を持つた化合物は、いずれも有用に用いること
ができるが、ベンゼン、ナフタレン、フエナント
レン等のベンゼン系芳香族環、ジベンゾフラン、
フロメン、ベンゾフラン等の含酸素芳香族環、チ
アナフテン、チアントレン等の含イオウ芳香族
環、フエナントリジン、キノリン、アクリジン等
の含窒素６員環、インドール、アルバゾール等の
含窒素５員環などの芳香族環に有する置換基を２
個以上導入したものが良好な結果を与える。これ
らの中では、ベンゼン系芳香族環に負電荷を有す
る置換基を２個以上導入したものが特に良好な結
果を与える。 本発明で言う有機低分子化合物部の骨格構造が
有する炭素数は、有機低分子化合物部の含有する
炭素のうち負電荷を有する置換基、すなわち、カ
ルボキシル基の炭素を除く全ての炭素を言う。こ
こで、カルボキシル基の炭素を除いたのは、カル
ボキシル基が親水的であり、主に負電荷の効果の
みを示すからである。カルボキシル基以外の置換
基の炭素数、すなわち、アルコキシル基、アルデ
ヒド基、アルコキシルカルボニル基などが含む炭
素は数える。 この有機低分子化合物部の含有する炭素と自己
抗体および／または免疫複合体との間に疎水性相
互作用力（フアンデルワールス力）が働く。 有機低分子化合物部は、吸着材の表面に露出し
ている必要があり、なるべく広い表面積を持つ構
造体上に散在していることが望ましい。 負電荷を有する置換基のクーロン力と骨格構造
炭素の疎水性相互作用力とが相乗的に働くことに
より、自己抗体および／または免疫複合体の選択
的吸着能力を向上させることが可能になる。負電
荷を有する置換基の数は多いほど、自己抗体およ
び／または免疫複合体の吸着能力が上がる。有機
低分子化合物部の負電荷を有する置換基が１個の
場合は、有機化合物部の骨格構造により多くの炭
素を必要とする。本発明では、負電荷を有する置
換基は少なくとも２個あるのが望ましい。 本発明において、有機低分子化合物部骨格構造
中の炭素数は６個以上であるが、自己抗体およ
び／または免疫複合体の吸着能力を向上させると
いう意味で好ましいのは、不飽和結合を有する炭
素の場合６個以上、望ましくは10個以上であり、
また、単結合だけの炭素のみの場合には10個以上
が好ましく、15個以上が望ましい。また、上限は
分子量により規定されるが、炭素数で500個以下
が好ましく、50個以下が望ましい。 有機化合物部が塩素、沃素等の疎水性置換基を
持つ場合は、置換基のないものに比べ、目的吸着
物質の吸着特性が向上する。これに対し、水酸
基、チオール基、アミド基等、非解離性親水性置
換基を多く持つ有機化合物部の場合には、置換基
のないものに比べ、目的吸着物質に対する吸着性
が落ちてくるので好ましくない。非解離性親水性
置換基の数は、有機化合物部の骨格構造炭素２個
に対し１個未満が好ましく、望ましくは炭素３個
に対し１個未満である。これらのことは、炭素の
結合様式の違い、置換基の種類等によつて、目的
吸着物質に及ぼす疎水性相互作用力が異なるため
と考えられる。 有機化合物部の分子量は、たとえ、結合が外れ
て生体内に入つたとしても、抗原性の点で10⁴以
下が好ましい。より好ましくは10³以下である。 以下、本発明の吸着材を製造する方法につい
て、担体を活性化し、リガンドを結合する通常の
アフイニテイークロマトグラフイー用吸着体の製
造方法にしたがつた製造方法を例にあげて説明す
る。 担体は１分子中に負電荷を有する置換基を少な
くとも２個持ち、かつ、骨格構造に少なくとも６
個の炭素を持つ有機低分子化合物を結合できれば
よく、親水性担体、疎水性担体いずれも使用でき
るが、疎水性担体を用いる場合には、時に担体へ
のアルブミンの非選択的吸着が生じるため、親水
性担体の方が好ましい結果を与える。 不溶性担体の形状は、粒子状、繊維状、中空糸
状、膜状等いずれの公知の形状も用いうるが、１
分子中に負電荷を有する置換基を少なくとも２個
持ち、かつ、骨格構造に少なくとも６個の炭素を
持つ有機低分子化合物の保持量、吸着材としての
取扱い性よりみて、粒子状、繊維状のものが好ま
しい。 球状または粒子状担体の平均粒径は25〜2500μ
ｍのものを利用できるが、その比表面積（吸着材
としての吸着能力）と体液の流通面より、50〜
1500μｍのものが好ましい。 担体の比表面積は５m²／ｇ以上が好ましく、55
m²／ｇ以上が望ましい。 使用できる粒子状担体としては、アガロース
系、デキストラン系、セルロース系、ポリアクリ
ルアミド系、ガラス系、シリカ系、活性炭系等の
担体であるが、ゲル構造を有する親水性担体が良
好な結果を与える。また、通常固定化酵素、アフ
イニテイークロマトグラフイに用いられる公知の
担体は、特別な限定なく使用することができる。 粒子状担体としては、多孔性粒子、特に多孔性
重合体を用いることもできる。本発明で用いられ
る多孔性重合体粒子は、その表面に負電荷を有す
る置換基を少なくとも２個持ち、かつ、骨格構造
に少なくとも６個の炭素を持つ有機低分子化合物
を固定化できるものであり、排除限界分子量（タ
ンパク質）としては、本発明の目的吸着物質の分
子量が15万（IgG）より免疫複合体特にIgM免疫
複合体の場合には1000万に達するので、15〜1000
万が好ましい。本発明の目的に最も汎用的な排除
限界分子量は100〜500万である。 重合体組成は、ポリアミド系、ポリエステル
系、ポリウレタン系、ビニル化合物の重合体等、
多孔性構造をとりうる公知の重合体を用いること
ができるが、特に親水性モノマーにより親水化し
たビニル化合物系多孔性重合体粒子が好ましい結
果を与える。 繊維状担体を用いる場合には、その繊維径が
0.02デニールないし10デニール、より好ましくは
0.1デニールないし５デニールの範囲にあるもの
がよい。繊維径が大きすぎる場合には、グロブリ
ン系化合物の吸着量および吸着速度が低下する
し、小さすぎる場合には、凝固系の活性化、血球
粘着、目づまりをおこしやすい。用いうる繊維状
担体としては、再生セルロース系繊維、ナイロ
ン、アクリル、ポリエステル等公知の繊維を一般
に用いることができる。 負電荷を有する置換基を少なくとも２個持ち、
かつ、骨格構造に少なくとも６個の炭素を持つ有
機低分子化合物を不溶性担体に結合する方法は、
共有結合、イオン結合、物理吸着、包埋あるいは
重合体表面への沈殿不溶化等あらゆる公知の方法
を用いることができるが、結合物の溶出性よりみ
て、共有結合により固定、不溶化して用いること
が好ましい。そのため通常固定化酵素、アフイニ
テイークロマトグラフイで用いられる公知の担体
の活性化方法およびリガンドの結合方法を用いる
ことができる。 活性化方法を例示すると、ハロゲン化シアン
法、エピクロルヒドリン法、ビスエポキシド法、
ハロゲン化トリアジン法、ブロモアセチルブロミ
ド法、エチルクロロホルマート法、１，1′−カル
ボニルジイミダゾール法等をあげることができ
る。本発明の活性化方法は、リガンドのアミノ
基、水酸基、カルボキシル基、チオール基等の活
性水素を有する求核反応基と置換および／または
付加反応できればよく、上記の例示に限定される
ものではないが、化学的安定性、熱的安定性等を
考慮すると、エポキシドを用いる方法が好まし
く、特にエピクロルヒドリン法が推奨できる。 担体に本発明で言う有機低分子化合物を２種類
以上結合してもさしつかえない。 以上、本発明吸着材の製造方法として、担体を
活性化した後、１分子中に負電荷を有する置換基
を少なくとも２個持ち、かつ、骨格構造に少なく
とも６個の炭素を持つ有機低分子化合物を結合す
る方法について詳細に説明したが、本発明は、こ
れに限定されるものではない。 すなわち、本発明は、１分子中に負電荷を有す
る置換基を少なくとも２個持ち、かつ、骨格構造
に少なくとも６個持つ有機低分子化合物部を担体
の表面に有することにより、その効果を発揮する
ものであり、製造方法に左右されるものではな
い。 本発明の吸着材は、体液の導出入口を備えた容
器内に充填保持して使用することができる。 図面において、１は本発明自己抗体および／ま
たは免疫複合体の吸着材を使用した吸着装置の一
例を示すものであり、円筒２の一端開口部に、内
側にフイルター３を張つたパツキング４を介して
体液導入口５を有するキヤツプ６をネジ嵌合し、
円筒２の他端開口部に内側にフイルター３′を張
つたパツキング４′を介して体液導出口７を有す
るキヤツプ８をネジ嵌合して容器を形成し、フイ
ルター３および３′の間隙に吸着材を充填保持さ
せて吸着材層９を形成してなるものである。 吸着材層９には、本発明の該吸着材を単独で充
填してもよく、他の吸着材と混合もしくは積層し
てもよい。他の吸着材としては、例えばDNA等
の他の悪性物質（抗原）の吸着材や、幅広い吸着
能を有する活性炭等を用いることができる。これ
により吸着材の相乗効果による広範な臨床効果が
期待できる。吸着材層９の容積は、体外循環に用
いる場合、50〜400ml程度が適当である。 本発明の装置を体外循環で用いる場合には、大
略次の二通りの方法がある。一つには、体内から
取り出した血液を遠心分離機もしくは模型血漿分
離器を使用して、血漿成分と血球成分とに分離し
た後、血漿成分を該装置に通過させ、浄化した
後、血球成分と合わせて体内にもどす方法であ
り、他の一つは、体内から取り出した血液を直接
該装置に通過させ、浄化する方法である。 また、血液もしくは血漿の通過速度について
は、該吸着材の吸着能率が非常に高いため、吸着
材の粒度を粗くすることができ、また充填度を低
くできるので、吸着材層の形状の如何にかゝわり
なく、高い通過速度を与えることができる。その
ため多量の体液処理をすることができる。 体液の通過方法としては、臨床上の必要に応
じ、あるいは設備の装置状況に応じて、連続的に
通液してもよいし、また断続的に通液使用しても
よい。 本発明の吸着材は、以上述べてきたように、体
液中の自己抗体および／または免疫複合体を高率
かつ選択的に吸着除去し、非常にコンパクトな吸
着装置が組めると共に、簡便かつ安全に用いられ
る。 本発明の吸着材は、自己血漿、自己血液等の体
液を浄化、再生する一般的な用法に適用可能であ
り、癌、免疫増殖性症候群、慢性関節リウマチ、
全身性エリテマトーデス等の膠原病、重症筋無力
症等の自己免疫疾患、アレルギー、臓器移植時の
拒絶反応等の生体免疫機能に関係した疾患および
現象、あるいは腎炎等の腎臓病、肝炎等の肝臓病
などの体外循環治療に有効に利用できる。 以下実施例により、本発明の実施の態様をより
詳細に説明する。 実施例 １ CNBr活性化セフアローズ4B（スエーデン、フ
アルマシア社製）に、通常の方法によつて、負電
荷を２個以上持ち、炭素数が６個以上の有機化合
物を結合せしめ、過剰の活性基をエタノールアミ
ンでブロツキングした。各種有機化合物の保持量
は、残余有機化合物の１級アミノ基を４−フエニ
ルスピロ〔フラン−２（3H），1′−フタラン〕−
３，3′−ジオン（“フルラム”ロシユ社製）と
反応結合させ算出した。 吸着実験は、ACD加リウマチ患者血漿３容と
吸着材１容とを混合し、37℃、３時間インキユベ
ートした後、上清の血漿を評価した。評価は、リ
ウマチ因子、免疫複合体、免疫グロブリンＧにつ
いて行なつた。 リウマチ因子の測定は、ラテツクス凝集テス
ト、受身感作血球凝集テストにて行つた。ラテツ
クス凝集テストは、ポリスチレンラテツクス粒子
にヒト−γ−グロブリンを吸着させたものに、リ
ウマチ因子を含む患者血漿を作用させると、ラテ
ツクス粒子が凝集する性質を検出法として測定す
るものであり、通常血漿の希釈系列を作成して、
ラテツクス粒子が凝集しなくなる血漿希釈倍率で
リウマチ因子濃度を評価するものである。リウマ
チ因子を高濃度に含む血漿は、陰性になる希釈倍
率が高くなり、低濃度の血漿は逆に低くなる。 受身感作血球凝集テストは、ヒツジ赤血球にウ
サギ−γ−グロブリンを吸着させたものであり、
他はラテツクス凝集テストと同じである。一般
に、受身感作血球凝集テストの方がラテツクス凝
集テストよりリウマチ因子特異性が高いとされて
いる。グリシン食塩緩衝液で希釈系列を作成し
て、ラテツクス凝集テストにてリウマチ因子の陰
性になる希釈倍率を求めた。ラテツクス凝集テス
トは、日本凍結乾燥研究所のキツトを用いて行つ
た。同様に受身感作血球凝集テスト〔RAHAテ
スト、富士臓器製薬(株)製〕にて評価した。 免疫複合体は、ポリエチレングリコール沈降法
にて行なつた。この方法は、ポリエチレングリコ
ールにより沈降分取した免疫複合体をシングル・
ラジアル・イムノ・デイフユージヨン法にて、免
疫グロブリン量を定量することにより、免疫複合
体量を定量するものである。この方法の操作方
法、条件は以下のとおりである。 (1) 検体1.0mlを試験管に入れ、８％PEG（ポリエ
チレングリコール、平均分子量6000〜7500）を
1.0ml加え、撹拌し、４℃で60分放置する。 (2) ４℃、1000ｇ、60分間遠心し、上清を除去
後、得られた沈殿をPBS（リン酸緩衝生理食塩
水）に再溶解し、1.0mlとする。 (3) (1)、(2)をさらに２回繰り返し、混入するモノ
メリツクな免疫グロブリンを洗浄する。 (4) 最終的に得られた免疫複合体のPBS浮遊液
をシングル・ラジアル・イムノ・デイフユージ
ヨン法にて、免疫グロブリンＧを定量する。 免疫グロブリンＧの定量は、シングル・ラジア
ル・イムノ・デフユージヨン法にて定量した。使
用したリウマチ患者血漿の値は、リウマチ因子の
ラテツクスが1280、RAHAが5120、免疫複合体
（免疫グロブリンＧを測定）が60mg／dl、免疫グ
ロブリンＧが1600mg／dlであつた。 吸着実験の結果を表１に示した。表１より、１
分子中に負電荷を有する置換基を少なくとも２個
持ち、かつ、骨格構造に少なくとも６個の炭素を
持つ有機低分子化合物部を有する吸着材がリウマ
チ因子、免疫複合体を選択的に吸着し、免疫グロ
ブリンＧの非選択的な吸着が少ないことがわか
る。なお、表１のうち、骨格構造中の炭素数は、
活性化に用いられた試薬であるCNBrが持つ炭素
の数も含んでいる。

【表】

【表】 比較例 １ 負電荷が１個以下、または炭素数が５個以下の
有機化合物を用いて、実施例１と同様に吸着材を
調製し、実施例１と同様の実験を行なつた。結果
を表２に示した。これより、負電荷が１個以下、
または炭素数が５個以下の有機化合物では、リウ
マチ因子、免疫複合体の吸着性能が落ちることが
わかる。

【表】 実施例 ２ 酢酸ビニル100ｇ、トリアリルイソシアヌレー
ト52.0ｇ（架橋度Ｘ＝0.35）、酢酸エチル100ｇ、
ヘプタン100ｇ、ポリ酢酸ビニル（重合度500）
7.5ｇおよび２，2′−アゾビスイソブチロニトリ
ル3.8ｇよりなる均一混合液と、ポリビニルアル
コール１重量％、リン酸二水素ナトリウム二水和
物0.05重量％およびリン酸水素二ナトリウム十二
水和物1.5重量％を溶解した水400mlとをフラスコ
に入れ、十分撹拌したのち65℃で18時間、さらに
75℃で５時間加熱撹拌して懸濁重合を行ない、粒
状共重合体を得た。過水洗、ついでアセトン抽
出後、カセイソーダ46.5ｇおよびメタノール２
よりなる溶液中で40℃で18時間、共重合体のエス
テル交換反応を行なつた。得られたゲルの平均粒
径は150μｍ、単位重量あたりのビニルアルコー
ル単位（qOH）は10.0meq／ｇ、比表面積は60
m²／ｇ、デキストランによる排除限界分子量は６
×10⁵であつた。 次に、得られたゲル10ｇ（乾燥重量）をジメチ
ルスルホキシド120ml中に懸濁し、これにエピク
ロルヒドリン78.3ml、30％水酸化ナトリウム10ml
を加え、30℃で５時間撹拌しながら活性化反応を
行なつた。反応後ジメチルスルホキシドで洗浄
し、水洗し、吸引脱水した。次にこの活性化ゲル
を７−アミノ−１，３−ナフタレン−ジスルホン
酸2.5ｇを含む0.1M炭酸ナトリウムバツフアー
（PH9.8）160ml中に懸濁した。50℃で14時間、撹
拌しながら固定化反応を行ない、その後60.6mg／
mlのトリス（ヒドロキシエチル）アミノメタン溶
液33mlを加え、さらに50℃５時間、撹拌しながら
ブロツキング反応（残存活性基をブロツクする）
を行つた。この後、充分水洗して体液浄化用吸着
材を得た。 この吸着材に固定化された７−アミノ−１，３
−ナフタレン−ジスルホン酸の量は200μmol／ｇ
（乾燥重量）であつた。 この吸着材に固定化された有機化合物の炭素数
は13、負電荷数は２である。 この吸着材を内径30mm、長さ70mmのカラムに充
填し、ACD加リウマチ患者血漿を５ml／minの
流速で150ml流した。このとき、カラム内の吸着
材の充填体積低下、目詰まり、流量低下はみられ
ず、カラム前後の圧力損失は15mmHg以下であつ
た。 カラム通過前後の血漿蛋白を分析したところ、
リウマチ因子は吸着前がラテツクスで320、
RAHAで2560であつたのに対し、吸着後では両
者とも陰性化した。また、免疫複合体（Ｃ／ｑ固
相法EIAで測定）も吸着前が20μｇ／mlであつた
のに対し、吸着後は3μｇ／ml以下に低下した。
これに対し、免疫グロブリンＧは1320mg／dlが
1210mg／dlに下がつただけであつた。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明の吸着材を容器に充填した吸着装
置の一例を示す模式図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 担体の表面に、１分子中に負電荷を有する置
   換基を少なくとも２個持ち、かつ、骨格構造に少
   なくとも６個の炭素を持つ有機低分子化合物部を
   有することを特徴とする自己抗体および／または
   免疫複合体の吸着材。 ２ 負電荷を有する置換基がカルボキシル基また
   は／およびスルホン酸基である特許請求の範囲第
   １項記載の自己抗体および／または免疫複合体の
   吸着材。