JPH043987B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、生体免疫機能に起因する各種疾患と
密接な関係をもつと考えられている自己抗体およ
び／または免疫複合体などを選択的に吸着除去す
る体液浄化用吸着材に関し、特に直接潅流法を適
用する全血用に適した吸着材に関する。 周知の如く体液、例えば血液中に発現する自己
抗体および／または免疫複合体は、癌、免疫増殖
性症候群、および慢性関節リウマチ、全身性エリ
テマトーデス等の自己免疫疾患、あるいはアレル
ギー、臓器移植時の拒絶反応等の生体免疫機能に
関係した疾患および現象の原因あるいは進行と密
接な関係をもつていると考えられている。 そこで、血液、血漿等の体液成分から、上記自
己抗体および／または免疫複合体を特異的に吸着
除去することによつて、上記の如き疾患の進行を
防止し、症状を軽減せしめ、さらには治瘉を早め
ることが期待されていた。 本発明者らは、自己抗体および／または免疫複
合体などを高い効率で選択的に吸着し、非選択的
な吸着材が少なく、安全性があり、滅菌操作も簡
単に行なうことができ、体液浄化あるいは再生に
適した吸着材を提供することを目的に鋭意研究し
た結果、担体に被吸着物質と化学的な選択的相互
作用をなす特別な化学構造を有する物質を保持さ
せてなる種々の吸着材を見出し、先に特許出願し
た（特願昭56−7152、特願昭56−18923、特願昭
56−76776、特願昭56−159444）。 本発明は、先の発明に関し、被吸着物質と選択
的相互作用をなす物質について、より詳細に検討
した結果なされたものであり、上記吸着材の改良
に関する。 本発明に目的に対して用いられる吸着材の性質
として望まれることは、 (1) 自己抗体、免疫複合体を選択的に、かつ高い
効率で吸着すること、 (2) 目的物質以外の物質を吸着し難いこと、 (3) 凝固線溶系を活性化しないこと、 (4) 滅菌できること、 (5) 機械的強度が充分あること などである。 本発明者らは、体液浄化用吸着材として、高い
効率で自己抗体、免疫複合体を吸着できる吸着性
能を維持した上で、非選択的吸着の少ない、すな
わち、自己抗体および／または免疫複合体以外の
生体成分を吸着することが少なく、凝固線溶系を
活性化することが少ない吸着材を提供することを
目標にして、さらに鋭意研究を重ねた。 各種担体に対し各種化合物を固定化して、自己
抗体および／または免疫複合体に対する吸着特
性、共存蛋白質の非選択的吸着性等を評価したと
ころ、担体として負電荷を有するものを用い、こ
の担体に骨格構造の炭素数が６以上の有機低分子
化合物を固定化した吸着材が自己抗体および／ま
たは免疫複合体を良く吸着し、また、フイブリノ
ーゲンのように生体にとつて有用な蛋白質を吸着
し難くなることを見出し、さらに、担体に固定化
された化合物の分子量が比較的小さい場合には、
たとえ、その化合物が担体から外れて生体に入つ
たとしても抗原性を有しないことを確認して、本
発明を得るに至つた。 すなわち、本発明は、負電荷を有する不溶性有
機物担体に、骨格構造に少なくとも６個の炭素を
持つ有機低分子化合物が結合していることを特徴
とする自己抗体および／または免疫複合体の吸着
材であり、上記担体の蛋白排除限界分子量は15万
から1000万の範囲にあるのが好ましい。 本発明で言う負電荷を有する不溶性有機物担体
とは、カルボキシルメチル−ポリアクリルアミド
系担体、アミノヘキシルスクシニル化セルロー
ス、スルホエチル−セルロース、リン酸エステル
−セルロース、カルボキシヘキシル−アガロース
等や、スチレンジビニルベンゼンのような高分子
基体にスルホン酸基がカルボキシル基のような陽
イオン交換基を結合させたイオン交換樹脂等のよ
うに、担体自身が血液、体液等の中性電解質液中
で負電荷を示すものを言う。また、負電荷を持た
ない担体に負電荷を持つた被膜をコートしたもの
でもよい。骨格構造に少なくとも６個の炭素を持
つ有機低分子化合物とは、骨格構造の炭素数が６
個以上のものであり、分子量が10⁴以下、好まし
くは10³以下の有機物を言う。中でも、芳香族性
を持つた環状化合物は良い結果を与える。 芳香族性を持つた化合物は、いずれも有用に用
いることができるが、ベンゼン、ナフタレン、フ
エナントレン等のベンゼン系芳香族環、ジベンゾ
フラン、フロメン、ベンゾフラン等の含酸素芳香
族環、チアナフテン、チアントレン等の含イオウ
芳香族環、フエナントリジン、キノリン、アクリ
ジンン等の含窒素６員環、インドール、カルバゾ
ール、等の含窒素５員環などの芳香族環が良好な
結果を与える。これらの中では、ベンゼン系芳香
族環が特に良好な結果を与える。 本発明で言う有機低分子化合物の骨格構造が有
する炭素数は、有機低分子化合物の含有する炭素
のうち、カルボキシル基の炭素を除く全ての炭素
を言う。ここで、カルボキシル基の炭素を除いた
のは、カルボキシル基が親水的であり、主に負電
荷の効果のみを示すからである。カルボキシル基
以外の置換基の炭素数、すなわち、アルコキシル
基、アルデヒド基、アルコキシカルボニル基など
が含む炭素数は数える。 有機低分子化合物の含有する炭素と自己抗体お
よび／または免疫複合体との間に疎水性相互作用
力（フアンデルワールス力）が働く。 負電荷を有する不溶性有機物担体のクーロン力
と、有機低分子化合物の疎水性相互作用力とが相
乗的に働くことにより、自己抗体および／または
免疫複合体の選択的吸着能力を維持した上で、フ
イブリノーゲンのような生体にとつて有用な成分
の非選択的な吸着を抑制することが可能になる。 負電荷を有する不溶性有機物担体の負電荷を示
す官能基部位の数は、多いほど自己抗体および／
または免疫複合体の吸着能力が上り、また、フイ
ブリノーゲンのような生体にとつて有用な蛋白の
非選択的吸着が抑制される。負電荷を示す官能基
部位は、単位表面積当り0.02μmol／m²以上ある
ことが好ましく、より好ましくは0.2μmol／m²か
ら200μmol／m²、さらに好ましくは2μmol／m²か
ら200μmol／m²である。 負電荷を有する不溶性有機物担体に結合する有
機低分子化合物骨格構造中の炭素数は多いほど自
己抗体および／または免疫複合体の吸着能力は上
るが、フイブリノーゲンのような蛋白の非選択的
な吸着も増える。これは、蛋白と負電荷を有する
不溶性有機物担体に結合された有機低分子化合物
との相互作用において、クーロン力が吸着選択性
の向上に重要な役割を果しており、本発明の目的
吸着物質である自己抗体および／または免疫複合
体の吸着能力を維持した上で、共存蛋白であるフ
イブリノーゲンの吸着選択性を向上させるために
は負電荷が重要な役割を果しているということを
意味する。 本発明において、負電荷を有する不溶性有機物
担体に結合する有機低分子化合物骨格構造中の炭
素数は６個以上であるが、自己抗体および／また
は免疫複合体の吸着能力を向上させるという意味
で好ましいのは、不飽和結合を有する炭素の場合
６個以上、望ましくは10個以上であり、また、単
結合だけの炭素のみの場合には10個以上が好まし
く、15個以上が望ましい。また、上限は分子量に
より規定されるが、炭素数で500個以下が好まし
く、50個以下が望ましい。有機化合物が塩素、沃
素等の疎水性置換基を持つ有機化合物の場合は、
置換基のないものに比べ目的吸着物質の吸着特性
が向上する。これに対し、水酸基、チオール基、
アミド基等の非解離性親水性置換基を多く持つ有
機化合物の場合には、置換基のないものに比べ目
的吸着物質に対する吸着性が落ちてくるので好ま
しくない。非解離性親水性置換基の数は、有機化
合物の骨格構造炭素２個に対し１個未満が好まし
く、望ましくは炭素３個に対し１個未満である。
これらのことは、炭素の結合様式の違い、置換基
の種類等によつて目的吸着物質に及ぼす疎水性相
互作用力が異なるためと考えられる。 負電荷を有する不溶性有機物担体に結合する有
機化合物の分子量は、たとえ、結合が外れて生体
中に入つてとしても、抗原性の点で10⁴以下が好
ましい。より好ましくは10³以下である。 本発明で用いられる負電荷を有する不溶性有機
物担体は、親水性担体、疎水性担体いずれも使用
できるが、疎水性担体を用いる場合には、時に担
体へのアルブミンの非特異的吸着が生じるため、
親水性担体の方が好ましい結果を与える。 負電荷を有する不溶性有機物担体の形状は、粒
子状、繊維状、中空糸状、膜状等いずれの公知の
形状も用いうるが、骨格構造に少なくとも６個の
炭素を持つ有機化合物の保持量、吸着材としての
取扱い性よりみて、粒子状、繊維状のものが好ま
しい。 球状または粒子状担体の平均粒径は25〜
2500μmのものを利用できるが、その比表面積
（吸着材としての吸着能力）と体液の流通面より、
50〜1500μmのものが特に好ましい。 担体の比表面積は５m²／ｇ以上が好ましく、55
m²／ｇ以上が望ましい。 粒子状担体としては、多孔性粒子、特に多孔性
重合体を用いることもできる。本発明に用いられ
る多孔性重合体粒子は、その表面に負電荷を有す
る官能基を多く持ち、かつ、骨格構造に少なくと
も６個の炭素を持つ有機低分子化合物を固定化し
得るものであり、排除限界分子量（タンパク質）
としては、本発明の目的吸着物質の分子量が15万
（IgG）より免疫複合体特にIgM免疫複合体の場
合には1000万に達するので、15〜1000万が好まし
い。本発明の目的に最も汎用的な排除限界分子量
は100〜500万である。 繊維状担体を用いる場合には、その繊維径が
0.02デニールないし10デニール、より好ましくは
0.1デニールないし５デニールの範囲にあるもの
がよい。繊維径が大きすぎる場合には、グロブリ
ン系化合物の吸着量および吸着速度が低下する
し、小さすぎる場合には、凝固系の活性化、血球
粘着、目づまりをおこしやすい。 骨格構造に少なくとも６個の炭素を持つ有機低
分子化合物を負電荷を有する不溶性有機物担体に
結合する方法は、共有結合、イオン結合、物理吸
着、包埋あるいは重合体表面への沈殿不溶化等あ
らゆる公知の方法を用いることができるが、結合
物の溶出性よりみて、共有結合により固定、不溶
化して用いることが最も好ましい。そのため通常
固定化酵素、アフイニテイクロマトグラフイで用
いられるリガンドの結合方法を用いることができ
る。 また、負電荷を有する官能基の一部を利用して
有機化合物を共有結合させてもかまわない。 本発明の吸着材は、体液の導出入口を備えた容
器内に充填保持して使用することができる。 図面において、１は本発明に係る自己抗体およ
び／または免疫複合体の吸着材を使用した吸着装
置の一例を示すものであり、円筒２の一端開口部
に、内側にフイルター３を張つたパツキング４を
介して体液導入口５を有するキヤツプ６をネジ嵌
合し、円筒２の他端開口部に内側にフイルター
３′を張つたパツキング４′を介して体液導出口７
を有するキヤツプ８をネジ嵌合して容器を形成
し、フイルター３および３′の間隙に吸着材を充
填保持させて吸着材層９を形成してなるものであ
る。 吸着材層９には、本発明の該吸着材を単独で充
填してもよく、他の吸着材と混合もしくは積層し
てもよい。他の吸着材としては、例えばDNA等
の他の悪性物質（抗原）の吸着材や、幅広い吸着
能を有する活性炭等を用いることができる。これ
により吸着材の相乗効果によるより広範な臨床効
果が期待できる。吸着材層９の容積は、体外循環
に用いる場合、50〜400ml程度が適当である。 本発明の装置を体外循環で用いる場合には、大
略次の二通りの方法がある。一つには、体内から
取り出した血液を遠心分離機もしくは模型血漿分
離器を使用して、血漿成分と血球成分とに分離し
た後、血漿成分を該装置に通過させ、浄化した
後、血球成分と合わせて体内にもどす方法であ
り、他の一つは体内から取り出した血液を直接該
装置に通過させ、浄化する方法である。 また、血液もしくは血漿の通過速度について
は、該吸着材の吸着能率が非常に高いため、吸着
材の粒度を粗くすることができ、また充填度を低
くできるので、吸着材層の形状の如何にかゝわり
なく、高い通過速度を与えることができる。その
ため多量の体液処理をすることができる。 体液の通液方法としては、臨床上の必要に応
じ、あるいは設備の装置状況に応じて、連続的に
通液してもよいし、また断続的に通液使用しても
よい。 本発明の吸着材は、以上述べてきたように、体
液中の自己抗体および／または免疫複合体を高率
かつ選択的に吸着除去し、非常にコンパクトな吸
着装置が組めると共に、非選択的吸着が少ないの
で、簡便かつ安全に用いられる。 本発明の吸着材は、自己血漿、自己血液等の体
液を浄化、再生する一般的な用法に通用可能であ
り、癌、免疫増殖性症候群、慢性関節リウマチ、
全身性エリテマトーデス等の膠原病、重症筋無力
症等の自己免疫疾患、アレルギー、臓器移植時の
拒絶反応等の生体免疫機能に関係した疾患および
現象、あるいは腎炎等の腎臓病、肝炎等の肝臓病
などの体外循環治療に有効に利用できる。 また、負電荷を有する不溶性有機物担体を用い
ているため、血小板の粘着、凝集が抑制される。
したがつて、全血用の体外循環治療器としても有
効に利用できる。 以下実施例により、本発明の実施の態様を詳細
に説明する。 実施例 １ 負電荷を有する不溶性担体としてカルボキシヘ
キシル−セフアロース4B（スウエーデン・フアル
マシア社製）を用い、この担体にカルボジイミド
を作用させる通常の方法で骨格構造に６個以上の
炭素を持つ有機化合物を固定化した。このとき、
カルボジイミドによる活性化率を低くおさえ、負
電荷を有する官能基を約半分残すようにした。過
剰の活性基はエタノールアミンでブロツキングし
た。各種有機化合物の保持量は、残余有機化合物
の１級アミノ基を４−フエニルスピロ〔フラン−
２（3H）、1′−フタラン〕−３，3′−ジオン（“フル
ラム ”ロシユ社製）と反応結合させ算出した
が、固定量は２mg／ml（担体）に合わせた。 吸着実験は、ACD加リウマチ患者血漿３容と
吸着材10容とを混合し、37℃、３時間インキユベ
ートした後、上澄の血漿を評価した。 評価は、リウマチ因子、免疫複合体、フイブリ
ノーゲン、免疫グロブリンＧについて行なつた。 リウマチ因子の測定は、ラテツクス凝集テス
ト、受身感作血球凝集テストにて行つた。 ラテツクス凝集テストは、ポリスチレンラテツ
クス粒子にヒト−γ−グロブリンを吸着させたも
のに、リウマチ因子を含む患者血漿を作用させる
と、ラテツクス粒子が凝集する性質を検出法とし
て測定するものであり、通常血漿の希釈系列を作
成して、ラテツクス粒子が凝集しなくなる血漿希
釈倍率でリウマチ因子濃度を評価するものであ
る。リウマチ因子を高濃度に含む血漿は、陰性に
なる希釈倍率が高くなり、低濃度の血漿は逆に低
くなる。 受身感作血球凝集テストは、ヒツジ赤血球にウ
サギ−γ−グロブリンを吸着させたものであり、
他はラテツクス凝集テストと同じである。一般
に、受身感作血球凝集テストの方がラテツクス凝
集テストよりリウマチ因子特異性が高いとされて
いる。 グリシン食塩緩衝液で希釈系列を作成して、ラ
テツクス凝集テストにてリウマチ因子の陰性にな
る希釈倍率を求めた。ラテツクス凝集テストは、
日本凍結乾燥研究所のキツトを用いて行つた。同
様に受身感作血球凝集テスト〔RAHAテスト、
富士臓器製薬(株)製〕にて評価した。 免疫複合体は、ポリエチレングリコール沈降法
にて行なつた。この方法は、ポリエチレングリコ
ールにより沈降分取した免疫複合体をシングル・
ラジアル・イムノ・デイフユージヨン法にて、免
疫グロブリン量を定量することにより、免疫複合
体量を定量するものである。この方法の操作方
法、条件は、以下のとおりである。 (1) 検体1.0mlを試験管に入れ、８％PEG（ポリエ
チレングリコール、平均分子量6000〜7500）を
1.0ml加え、撹拌し、４℃で60分放置する。 (2) ４℃、1000ｇ、60分間遠心し、上澄を除去
後、得られた沈殿をPBS（リン酸緩衝生理食塩
水）に再溶解し、1.0mlとする。 (3) (1)、(2)をさらに２回繰り返し、混入するモノ
メリツクな免疫グロブリンを洗浄する。 (4) 最終的に得られた免疫複合体のPBS浮遊液
をシングル・ラジアル・イムノ・デフユージヨ
ン法にて、免疫グロブリンＧを定量する。 フイブリノーゲン、免疫グロブリンＧの定量
は、シングル・ラジアル・イムノ・デフユージヨ
ン法にて定量した。 使用したリウマチ患者血漿の値は、リウマチ因
子のラテツクスが160、RAHAが640、免疫複合
体（免疫グロブリンＧを測定）が45mg／dl、フイ
ブリノーゲンが280mg／dl、免疫グロブリンＧが
1280mg／dlであつた。 吸着実験の結果を表１に示した。表１より、負
電荷を有する不溶性有機担体に、骨格構造に少な
くとも６個の炭素を持つ有機低分子化合物が結合
している吸着材がリウマチ因子、免疫複合体を選
択的に吸着し、フイブリノーゲン、免疫グロブリ
ンＧの非選択的な吸着が少ないことがわかる。

【表】 比較例 １ 負電荷を持たない担体としてセフアロース4B
（スウエーデン、フアルマシア社製）を用い、通
常の方法によりCNBrで活性化した後、β−フエ
ニル−エチラミンを固定化した。β−フエニル−
エチラミンの炭素数は８、固定化量は2.1mg／ml
（担体）であつた。 吸着実験は実施例１と同じ血漿を用い、同様に
実験した。 結果は、RAHAタイターは640が320に、ラテ
ツクス・タイターは160が80に、免疫複合体は45
が28mg／dlに下つたが、フイブリノーゲンは280
が175mg／dlに下つてしまつた。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明の吸着材を容器に充填した吸着装
置の一例を示す模式図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 負電荷を有する不溶性有機物担体に、骨格構
   造に少なくとも６個の炭素を持つ有機低分子化合
   物が結合していることを特徴とする自己抗体およ
   び／または免疫複合体の吸着材。 ２ 負電荷を有する不溶性有機物担体の蛋白質排
   除限界分子量が15万から1000万の範囲にある特許
   請求の範囲第１項記載の自己抗体および／または
   免疫複合体の吸着材。