CN102917724B - 具有抗幽门螺旋杆菌活性的豌豆蛋白肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包括豌豆蛋白水解产物的组合物，用于治疗和/或预防哺乳动物中胃肠病原体（尤其是幽门螺旋杆菌）感染和/或与所述胃肠病原体感染相关的疾病。

Description

具有抗幽门螺旋杆菌活性的豌豆蛋白肽
技术领域
本发明涉及由胃肠道病原体，尤其是幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori），引起的感染的治疗和/或预防。
背景技术
胃肠道感染是许多人的主要问题，尤其是具有受损的免疫系统或胃肠道疾病的婴儿和病人。所产生的疾病可能威胁生命。胃肠道感染经常由大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella）、弯曲杆菌（Campylobacter）、牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）、梭菌（Clostridium）、肠杆菌（Enterobacter）和螺旋杆菌（Helicobacter）（例如幽门螺旋杆菌）引起。
幽门螺旋杆菌（H.pylori）是革兰氏阴性、微量需氧的、有鞭毛的细菌，感染之后定殖在人的胃粘膜。已将幽门螺旋杆菌感染与严重的胃疾病关联起来，例如胃炎、消化性溃疡和胃癌。幽门螺旋杆菌已被世界卫生组织分类为I类致癌原。幽门螺旋杆菌感染通常是慢性的，并且没有专门治疗的话大多数不能痊愈。
幽门螺旋杆菌感染主要在童年早期获得。大多数儿童在生命最初5年内被感染。到10岁时，在发展中国家总体患病率大于75%，而在发达国家10%的儿童被感染，但较低社会经济阶层的儿童中患病率可以上升到30%-40%。
关于通过抗生素治疗和通过疫苗接种预防的问题，应该预防幽门螺旋杆菌粘附并因此感染胃粘膜，最好通过饮食经口干预。
根除幽门螺旋杆菌感染的治疗需要3到4种抗生素药物疗法。治疗非常昂贵，并且有增加细菌菌株抗生素耐药性和不成功治疗后再次感染的风险。对儿童进行治疗可能是降低感染发生率以及与幽门螺旋杆菌相关疾病有关的发病率和死亡率的最经济方法。到目前为止，在治疗儿童的需求方面没有指导方针。还没有可用的人疫苗。预防和治疗疫苗已经在动物模型中成功，但是转换到人疫苗仍然很难，部分是因为对胃的免 疫学了解仍然很少。
关于用抗生素治疗和用疫苗接种预防的问题，应该预防幽门螺旋杆菌粘附到胃粘膜。没有所述细菌的粘附，导致胃炎或可能导致癌症的相关炎症的风险可能最小。已经证实，饮食调节可以在体内和体外用于支持幽门螺旋杆菌感染的治疗或预防。
EP 1178104涉及一种包括特定精油和/或从所述精油分离的纯的特定化合物的营养组合物，用于预防和治疗螺旋杆菌样生物体的感染。所述营养组合物还可以含有碳水化合物源、脂肪源和/或食用蛋白质（dietary protein）源，豌豆蛋白是其中之一。
JP 2005255679描述了一种通过用蛋白酶处理酪乳获得的多肽，所述多肽不仅具有幽门螺旋杆菌到胃粘膜的粘附抑制效应，还具有将幽门螺旋杆菌从幽门螺旋杆菌携带者的胃粘膜剥离的效应。
JP 2001335504描述了一种包括大豆蛋白的酶水解产物作为活性成分的幽门螺旋杆菌增殖抑制剂。
WO 2008/043424公开了一种用于治疗和/或预防哺乳动物中胃肠病原体（尤其是幽门螺旋杆菌）感染和/或与所述胃肠病原体感染相关的疾病的组合物。所述组合物包括豌豆蛋白水解产物、完整豌豆蛋白和/或驼乳蛋白水解产物。公开了通过使用胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶进行的水解获得的豌豆蛋白水解产物。
DE 10317935描述了酪蛋白用于制备用于预防或治疗螺旋杆菌感染和用于预防由螺旋杆菌感染导致的疾病的组合物的用途。
发明内容
本发明涉及一种包括具体豌豆蛋白肽的组合物，用于治疗和/或预防哺乳动物中胃肠病原体感染和/或与所述胃肠病原体感染相关的疾病，所述感染尤其是由选自螺旋杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、牙龈卟啉单胞菌、弯曲杆菌、梭菌和肠杆菌的胃肠病原体引起的感染。本发明进一步涉及具体豌豆蛋白水解产物（非胰凝乳蛋白酶水解产生）在制备用于治疗和/或预防具体如上所述感染或疾病的组合物中的用途。
本发明人已经发现，特定豌豆蛋白水解产物能够抑制幽门螺旋杆菌粘附到胃粘膜细胞。对粘附的抑制使这些蛋白组分尤其适合用于治疗和/或预防螺旋杆菌感染的方法。所述豌豆蛋白水解产物已经通过用胰蛋 白酶水解豌豆蛋白分离物获得。分离并鉴定了负责对粘附的抑制的肽。本发明的肽Asp-Phe-Leu-Glu-Asp-Ala-Phe-Asn-Val-Asn-Arg(SEQ ID NO:1)和Glu-Leu-Ala-Phe-Pro-Gly-Ser-Ala-Gln-Glu-Val-Asp-Arg(SEQ ID NO:2)是豌豆豆球蛋白A和豌豆球蛋白的组成部分，被发现可以抑制幽门螺旋杆菌粘附到胃细胞。因为这些肽有胰凝乳蛋白酶切割位点，所以所述豌豆蛋白水解产物可以通过使用蛋白酶进行的水解获得（优选通过胰蛋白酶，条件是所述蛋白酶不是胰凝乳蛋白酶），或者通过使用蛋白酶制剂进行的水解获得（优选为基本没有胰凝乳蛋白酶活性的胰蛋白酶制剂）。
本发明的豌豆蛋白水解产物和/或豌豆蛋白肽可以容易地添加到婴儿配方、幼儿产品和年轻人产品中。该蛋白组分的容易且安全的应用使得本发明特别重要，因为可以避开使用药物时通常遇到的副作用的问题和昂贵的多药物治疗。本发明的豌豆蛋白水解产物和/或豌豆蛋白肽还适合被成人使用。本发明的豌豆蛋白水解产物和/或豌豆蛋白肽不必是单独地给予（例如给予婴儿），而是可以在营养组合物内共同给予。
因为婴儿期中仅母乳喂养的持续期延长可具有对抗慢性幽门螺旋杆菌感染和因此的胃癌风险的长期保护效应，所以尤其还需要保护接受婴儿配方的婴儿免受幽门螺旋杆菌感染。
具体实施方式
因此，本发明涉及一种用于治疗和/或预防和/或减少哺乳动物中胃肠病原体感染和/或与胃肠病原体感染相关的疾病的风险的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物包括豌豆蛋白水解产物的组合物，条件是所述豌豆蛋白水解产物不是通过使用蛋白酶胰凝乳蛋白酶进行的水解而获得。优选地，所述豌豆蛋白水解产物是通过使用除胰凝乳蛋白酶之外的蛋白酶进行的水解而获得的。
本发明还可以表述为一种包括豌豆蛋白水解产物的组合物用于制备治疗和/或预防哺乳动物中胃肠病原体感染和/或与胃肠病原体感染相关的疾病的组合物的用途，条件是所述豌豆蛋白水解产物不是通过使用蛋白酶胰凝乳蛋白酶进行的水解而获得。
本发明还可以表述为一种包括豌豆蛋白水解产物的组合物，其可以用于治疗和/或预防哺乳动物中胃肠病原体感染和/或与胃肠病原体感染 相关的疾病，条件是所述豌豆蛋白水解产物不是通过使用蛋白酶胰凝乳蛋白酶进行的水解而获得。
在一方面，本发明涉及一种用于治疗和/或预防和/或减少哺乳动物中胃肠病原体感染和/或与胃肠病原体感染相关的疾病的风险的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物包括至少一种肽的组合物，所述肽选自Xaan-Asp-Phe-Leu-Glu-Asp-Ala-Phe-Asn-Val-Asn-Arg-Xaam和Xaan-Glu-Leu-Ala-Phe-Pro-Gly-Ser-Ala-Gln-Glu-Val-Asp-Arg-Xaam，其中每个Xaa可以独立地是任何氨基酸，n和m独立地是0-10的整数。
本发明还可以表述为一种包括肽的组合物用于制备治疗和/或预防哺乳动物中胃肠病原体感染和/或与胃肠病原体感染相关的疾病的组合物的用途，其中所述肽选自Xaan-Asp-Phe-Leu-Glu-Asp-Ala-Phe-Asn-Val-Asn-Arg-Xaam和Xaan-Glu-Leu-Ala-Phe-Pro-Gly-Ser-Ala-Gln-Glu-Val-Asp-Arg-Xaam，其中每个Xaa可以独立地是任何氨基酸，n和m独立地是0-10的整数。
本发明还可以表述为一种包括至少一种肽的组合物，所述肽选自Xaan-Asp-Phe-Leu-Glu-Asp-Ala-Phe-Asn-Val-Asn-Arg-Xaam和Xaan-Glu-Leu-Ala-Phe-Pro-Gly-Ser-Ala-Gln-Glu-Val-Asp-Arg-Xaam，其中每个Xaa可以独立地是任何氨基酸，n和m独立地是0-10的整数，所述组合物用于治疗和/或预防哺乳动物中胃肠病原体感染和/或与胃肠病原体感染相关的疾病。
在另一方面，本发明还涉及一种含有脂质、蛋白质和碳水化合物组分的组合物，其中所述脂质组分提供总卡路里的5%-50%，所述蛋白质组分提供总卡路里的5%-50%，所述碳水化合物组分提供总卡路里的15%-90%，其中所述蛋白质组分包括(i)至少一种由豌豆蛋白水解产物组成的蛋白质源，条件是所述豌豆蛋白水解产物不是通过使用蛋白酶胰凝乳蛋白酶进行的水解获得，以及(ii)至少一种氮源，所述氮源选自乳蛋白、乳蛋白水解产物、卵蛋白、卵蛋白水解产物、大豆蛋白、大豆蛋白水解产物、小麦蛋白、小麦蛋白水解产物、稻蛋白、稻蛋白水解产物、游离氨基酸和它们的混合物。
在又一方面，本发明涉及一种含有脂质、蛋白质和碳水化合物组分的组合物，其中所述脂质组分提供总卡路里的5%-50%，所述蛋白质组分提供总卡路里的5%-50%，所述碳水化合物组分提供总卡路里的 15%-90%，其中所述蛋白质组分包括(i)至少一种肽，所述肽选自Xaan-Asp-Phe-Leu-Glu-Asp-Ala-Phe-Asn-Val-Asn-Arg-Xaam和Xaan-Glu-Leu-Ala-Phe-Pro-Gly-Ser-Ala-Gln-Glu-Val-Asp-Arg-Xaam，其中每个Xaa可以独立地是任何氨基酸，n和m独立地是0-10的整数，以及(ii)至少一种氮源，所述氮源选自乳蛋白、乳蛋白水解产物、卵蛋白、卵蛋白水解产物、大豆蛋白、大豆蛋白水解产物、小麦蛋白、小麦蛋白水解产物、稻蛋白、稻蛋白水解产物、游离氨基酸和它们的混合物。
蛋白质
本发明提供了一种组合物及其用于本发明的治疗的用途，其含有通过除胰凝乳蛋白酶之外的蛋白酶获得的豌豆蛋白水解产物。优选地，所述豌豆蛋白水解产物是通过使用除胰凝乳蛋白酶之外的蛋白酶进行的水解而获得的，更优选地，所述豌豆蛋白水解产物是通过使用胰蛋白酶进行的水解而获得的。更优选地，本发明提供了胰蛋白酶水解获得的特定豌豆蛋白降解肽，即Xaan-Asp-Phe-Leu-Glu-Asp-Ala-Phe-Asn-Val-Asn-Arg-Xaam和Xaan-Glu-Leu-Ala-Phe-Pro-Gly-Ser-Ala-Gln-Glu-Val-Asp-Arg-Xaam，其中每个Xaa可以独立地是任何氨基酸，n和m独立地是0-10的整数。因此，n和m可以独立地是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个优选的实施方案中，所述肽Xaan-Asp-Phe-Leu-Glu-Asp-Ala-Phe-Asn-Val-Asn-Arg-Xaam和Xaan-Glu-Leu-Ala-Phe-Pro-Gly-Ser-Ala-Gln-Glu-Val-Asp-Arg-Xaam中的每一种的计算分子量为1kDa到2.5kDa，优选为1kDa到2kDa，优选为1kDa到1.5kDa。在一个实施方案中，n和m为0。因为这些肽有胰凝乳蛋白酶切割位点，并且因为这些肽的较小片段被发现是没有活性的，所以所述豌豆蛋白水解产物不能通过使用胰凝乳蛋白酶或通过使用胰蛋白酶加胰凝乳蛋白酶进行的水解而获得。一旦吃下这些肽，它们将在人肠道中被进一步降解。但是，因为胰凝乳蛋白酶和其他酶作为羧基和氨基肽酶只在十二指肠释放，所述肽仍然以其活性形式存在于胃中，即幽门螺旋杆菌主要存在的位置。因为这些肽还被发现来源自豌豆蛋白豆球蛋白A或豌豆球蛋白，所述豌豆蛋白水解产物优选为通过除胰凝乳蛋白酶之外的蛋白酶而获得的豌豆豆球蛋白A和/或豌豆球蛋白水解产 物，其中所述蛋白酶优选为胰蛋白酶。除胰凝乳蛋白酶之外的蛋白酶商业制剂可能含有少量胰凝乳蛋白酶污染，因此可能显示一些胰凝乳蛋白酶活性。对于制备本发明的水解产物这是可以接受的。少量的胰凝乳蛋白酶活性不会导致对所述SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的肽的实质水解。蛋白酶制剂尤其是胰蛋白酶制剂中的一些残留胰凝乳蛋白酶活性被认为只会影响包括序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的水解产物中肽的产量。水解豌豆蛋白的方法是本领域中已知的。因此，优选地，所述SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的肽来源于豌豆蛋白，但是其还可以由不同的源提供。因此，在一个实施方案中，所述SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的肽是以食品级蛋白的形式提供的。在一个实施方案中，所述SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的肽是以豌豆蛋白水解产物的形式提供的。
通过凝胶过滤色谱法（一种基于交联的琼脂/葡聚糖基质的色谱方法），测定了本发明蛋白水解产物中最有效的抗螺旋杆菌粘附的肽和/或复合糖（glycoconjugate）的分子量范围。已发现，有效的抗螺旋杆菌粘附的肽在300-10000Da范围内。优选地，有效的抗螺旋杆菌粘附的肽在500-5000Da范围内。因此，基于本发明蛋白水解产物的总重量计，本发明的蛋白水解产物优选含有至少1wt.%的分子量为300-10000Da的肽和/或复合糖（优选为肽），优选为至少5wt.%，更优选为至少50wt.%，最优选为至少75wt.%。更优选地，基于本发明蛋白水解产物的总重量计，本发明的蛋白水解产物包括至少1wt.%的分子量为500-5000Da的肽和/或复合糖（优选为肽），优选为至少5wt.%，更优选为至少50wt.%，最优选为至少75wt.%。除非另外指明，本文所提及的分子量是通过凝胶过滤色谱法测定的。
所述豌豆蛋白水解产物优选以每天0.1-100g的量给予，优选为每天0.5-10g的量。所述本发明豌豆蛋白肽可以以较低剂量给予，即每天0.005-50g的量，优选为每天0.05-5g的量。
最优选地，本发明的豌豆肽是以豌豆蛋白水解产物的形式给予。或者，本发明的豌豆肽可以是合成的或是通过基因修改的（微）生物表达的。
优选地，所述组合物包括豌豆蛋白水解产物，更优选小于10kDa的豌豆蛋白水解产物级分，更优选小于7.5kDa，因为给予所述水解产 物在预防幽门螺旋杆菌粘附方面是最有效的。优选的豌豆蛋白水解产物级分具有大约2kDa的平均分子量。优选的豌豆蛋白水解产物级分在1kDa至2.5kDa范围内具有高浓度。因此，优选使用通过胰蛋白酶水解获得的大小在1至2.5kDa的豌豆肽。优选地，基于豌豆蛋白水解产物的总重量计，所述豌豆蛋白水解产物包括多于35wt.%，更优选地多于40wt.%的大小在1kDa至2.5kDa的肽。
胃肠病原体
本发明的方法涉及哺乳动物中胃肠病原体感染和/或与所述胃肠病原体感染相关的疾病的治疗和/或预防，尤其是哺乳动物中选自螺旋杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、牙龈卟啉单胞菌、弯曲杆菌、梭菌和肠杆菌的胃肠病原体引起的感染和/或与所述胃肠病原体感染相关的疾病的治疗和/或预防。
本发明特别提供用于哺乳动物中螺旋杆菌感染和/或与螺旋杆菌感染相关的疾病的治疗和/或预防。所述螺旋杆菌优选地选自幽门螺旋杆菌、Helicobacter bizzozeronii、H.salomonis、海尔曼螺杆菌（Helicobacter heilmannii）和猫胃螺杆菌（Helicobacter felis）。优选地，本发明提供了对哺乳动物中幽门螺旋杆菌感染和/或与幽门螺旋杆菌感染相关的疾病的治疗和/或预防。
食品组合物
已发现，本发明的豌豆蛋白水解产物和/或豌豆蛋白肽可以有利地应用于食物，例如婴儿食品和临床营养物，尤其是婴儿营养物。本发明的营养组合物优选地包括脂质组分、蛋白质组分和碳水化合物组分。
因此，本发明还涉及包括本发明的豌豆蛋白水解产物和/或豌豆蛋白肽的营养组合物及其在本发明的方法中的用途，其中所述脂质组分提供总卡路里的5%-50%，所述蛋白质组分提供总卡路里的5%-50%，所述碳水化合物组分提供总卡路里的15%-90%。本发明的组合物优选地用作婴儿配方，其中所述脂质组分提供总卡路里的35%-50%，所述蛋白质组分提供总卡路里的7.5%-12.5%，所述碳水化合物组分提供总卡路里的40%-55%。为了计算所述蛋白质组分在总卡路里的百分数%，需要对蛋白质、肽和氨基酸进行总计。
除本发明的豌豆蛋白水解产物和/或豌豆蛋白肽之外，本发明的组合物优选地含有额外的氮源，用于营养目的。所述额外的氮源优选地选自蛋白质、肽、氨基酸及它们的混合物。因此，在一个优选的实施方案中，本发明组合物的蛋白质成分包括：(i)至少一种蛋白质源，所述蛋白质源选自不是通过胰凝乳蛋白酶水解获得的豌豆蛋白水解产物和/或豌豆蛋白肽；和(ii)至少一种氮源，所述氮源选自乳蛋白、卵蛋白、大豆蛋白、小麦蛋白、稻蛋白、游离氨基酸和它们的混合物。优选地，本发明的组合物包括(i)不是通过胰凝乳蛋白酶水解获得的豌豆蛋白水解产物和/或豌豆蛋白肽，以及(ii)至少一种氮源，所述氮源选自水解牛乳清、非水解牛乳清、水解牛酪蛋白、非水解牛酪蛋白和非水解大豆蛋白。优选地，所述豌豆蛋白水解产物是通过胰蛋白酶水解获得的。
当本发明的蛋白质成分（尤其是本发明的豌豆蛋白水解产物和/或豌豆蛋白肽）与额外的氮源组合给予时，基于蛋白质总重量计，本发明的组合物优选地包括0.1-50wt.%的本发明豌豆蛋白水解产物和/或豌豆蛋白肽，尤其是1-10wt.%的本发明豌豆蛋白水解产物和/或豌豆蛋白肽。
当本发明的蛋白质成分（尤其是本发明的豌豆蛋白水解产物）与额外的氮源组合给予时，基于蛋白质总重量计，本发明的组合物优选地包括1-50wt.%的本发明豌豆蛋白水解产物和/或豌豆蛋白肽，尤其是1-10wt.%的本发明豌豆蛋白水解产物。
当本发明的蛋白质成分（尤其是本发明的豌豆蛋白肽）与额外的氮源组合给予时，基于蛋白质总重量计，本发明的组合物优选包括0.1-50wt.%的本发明豌豆蛋白水解产物和/或豌豆蛋白肽，尤其是0.1-10wt.%的本发明的豌豆蛋白水解产物和/或豌豆蛋白肽。
可消化性碳水化合物源可以添加到所述营养配方中。本发明的组合物优选地含有乳糖。
在一个优选的实施方案中，本发明的蛋白质成分（尤其是本发明的豌豆蛋白水解产物和/或豌豆蛋白肽）的抗胃肠病原体的抗感染作用，可通过与可溶、非消化性、可发酵的寡糖共同给予而提高。这些寡糖的给予可刺激乳酸菌（例如双歧杆菌和乳酸杆菌）的生长，预防胃肠病原体的定殖和感染。因此，本发明的豌豆蛋白水解产物和/或豌豆蛋白肽以及本发明的寡糖在这方面起协同作用。
优选地，本发明的组合物包括聚合度（DP）在2-250，更优选3-60之间的非消化性寡糖。所述非消化性寡糖优选地选自低聚果糖（例如菊粉）、低聚半乳糖（例如反式低聚半乳糖或β低聚半乳糖）、低聚葡糖（例如低聚龙胆二糖、低聚黑曲霉糖和环糊精寡糖）、低聚阿拉伯糖、低聚甘露糖、低聚木糖、低聚岩藻糖、低聚阿拉伯半乳糖、低聚葡甘露糖、低聚半乳甘露糖、包括唾液酸的寡糖和糖醛酸寡糖。优选地，所述组合物包括与非消化性寡糖结合的阿拉伯树胶。
优选地，本发明的组合物包括低聚果糖、低聚半乳糖和/或半乳糖醛酸寡糖，更优选低聚半乳糖，最优选反式低聚半乳糖。在一个优选的实施方案中，所述组合物包括反式低聚半乳糖和低聚果糖的混合物。优选地，本发明的组合物包括聚合度为2-10的低聚半乳糖和/或聚合度为2-60的低聚果糖。所述低聚半乳糖优选地选自反式低聚半乳糖、乳糖-N-四糖（LNT）、乳糖-N-新四糖（neo-LNT）、岩藻糖乳糖、岩藻糖基化的LNT和岩藻糖基化的neo-LNT。在一个特别优选的实施方案中，本发明的方法包括给予反式低聚半乳糖（[半乳糖]n-葡萄糖；其中n为1-60的整数，即2、3、4、5、6、…、59、60；优选地，n选自2、3、4、5、6、7、8、9或10）。例如，有以VivinalTM(Borculo Domo Ingredients,Netherlands)商标销售的反式低聚半乳糖（TOS）。优选地，所述反式低聚半乳糖的糖是β连接的。
低聚果糖是包括β连接的果糖单元链的非消化性寡糖，其聚合度或平均聚合度为2-250，更优选10-100。低聚果糖包括菊粉、果聚糖和/或混合型的多聚果糖。一种尤其优选的低聚果糖是菊粉。适合用于所述组合物的低聚果糖也已经是可以市购的，例如 HP(Orafti)。
糖醛酸寡糖优选地通过果胶降解获得。糖醛酸寡糖优选地为半乳糖醛酸寡糖。因此，本发明的组合物优选地包括聚合度在2-100的果胶降解产物。优选地，所述果胶降解产物是用苹果果胶、甜菜果胶和/或柑橘果胶制备。优选地，所述组合物包括反式低聚半乳糖、低聚果糖和果胶降解产物。反式低聚半乳糖:低聚果糖:果胶降解产物的重量比优选地为(20-2):1:(1-3)，更优选(12-7):1:(1-2)。
优选地，所述糖醛酸寡糖具有一个（优选两个）末端糖醛酸单元，其可以是游离的或酯化的。优选地，所述末端糖醛酸单元选自半乳糖醛酸（galacturonic acid）、葡糖醛酸（glucuronic acid）、古洛糖醛酸 （guluronic acid）、艾杜糖醛酸（iduronic acid）、甘露糖醛酸（mannuronic acid）、核糖醛酸（riburonic acid）和阿卓糖醛酸（altruronic acid）。这些单元可以是游离的或酯化的。在一个甚至更优选的实施方案中，所述末端己糖单元（即糖醛酸）具有双键，其优选地位于末端己糖单元的C4和C5位置之间。优选地，所述末端己糖单元之一包括所述双键。这些糖醛酸单元中的所述羧酸基团可以是游离的或（部分）酯化的，优选地是至少部分甲基化的。
用于本发明的糖醛酸寡糖优选地制备自果胶、果胶酸盐、藻酸盐、软骨素、透明质酸、肝素、乙酰肝素、细菌碳水化合物、唾液酸聚糖（sialoglycans）、岩藻依聚糖（fucoidan）、低聚岩藻糖或角叉菜胶，更优选地制备自果胶和/或藻酸盐。所述糖醛酸寡糖优选地是通过使用裂解酶、裂合酶和/或多聚半乳糖醛酸内切酶的酶法消化而制备。优选地，使用果胶的水解产物或裂解产物。所述糖醛酸寡糖优选地是通过用果胶裂解酶、果胶裂合酶、多聚半乳糖醛酸内切酶和/或果胶酶对果胶进行酶法消化而获得。
该糖醛酸寡糖可预防肠病原体的粘附。包括本发明的豌豆蛋白肽/水解产物和所述糖醛酸寡糖的组合物将具有提高的抗幽门螺旋杆菌作用。
一种优选的寡糖是唾液酸乳糖，更优选3’-唾液酸乳糖，因为这种寡糖也干扰幽门螺旋杆菌粘附。额外包括唾液酸乳糖（优选3’-唾液酸乳糖）的本发明组合物因此将具有提高的抗幽门螺旋杆菌作用。
优选地，所述组合物每100ml包括80mg到2g非消化性寡糖，更优选每100ml包括150mg到1.50g，甚至更优选每100ml包括300mg到1g。基于干重计，所述组合物优选地包括0.25wt.%到20wt.%，更优选0.5wt.%到10wt.%，甚至更优选1.5wt.%到7.5wt.%。
因此，在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，所述组合物包括选自反式低聚半乳糖、低聚果糖、糖醛酸寡糖和唾液酸乳糖的非消化性寡糖，以及
a)豌豆蛋白水解产物，条件是所述豌豆蛋白水解产物不是通过使用蛋白酶胰凝乳蛋白酶进行的水解而获得的，或者优选通过使用除胰凝乳蛋白酶之外的蛋白酶进行的水解而获得的豌豆蛋白水解产物；和/或
b)至少一种肽，所述肽选自 Xaan-Asp-Phe-Leu-Glu-Asp-Ala-Phe-Asn-Val-Asn-Arg-Xaam和Xaan-Glu-Leu-Ala-Phe-Pro-Gly-Ser-Ala-Gln-Glu-Val-Asp-Arg-Xaam，其中每个Xaa可以独立地是任何氨基酸，n和m独立地是0-10的整数。
大便不规则（例如硬大便、大便量不足、腹泻）是具有幽门螺旋杆菌感染或幽门螺旋杆菌感染风险的许多婴儿和生病受试者中的特别问题。这些受试者经常接受液体食品。已发现，大便问题可以通过在液体食品中给予本发明的豌豆蛋白水解产物成分和/或豌豆蛋白肽而减少，所述液体食品的重量克分子渗透压浓度为50-500mOsm/kg，更优选100-400mOsm/kg。当本发明的豌豆蛋白水解产物和/或豌豆蛋白肽与抗生素治疗一起使用或在抗生素治疗之后使用时，大便问题的预防尤其重要。鉴于以上所述，同样重要的是所述液体食品不具有过量的卡路里密度，但仍然提供足够卡路里以喂养受试者。因此，所述液体食品优选的卡路里密度为0.1-2.5kcal/ml，甚至更优选的卡路里密度为0.5-1.5kcal/ml，最优选0.6-0.8kcal/ml。
应用
本发明提供了一种用于治疗和/或预防哺乳动物（优选人受试者）中胃肠病原体（尤其是幽门螺旋杆菌）感染和/或与胃肠病原体（尤其是幽门螺旋杆菌）感染相关的疾病的组合物和方法，所述方法包括将本发明的豌豆蛋白水解产物和/或豌豆蛋白肽给予所述哺乳动物或人受试者。在人中与胃肠病原体感染相关的疾病包括持续性慢性胃炎、腹泻、腹痛、溃疡和/或胃癌。在人中与幽门螺旋杆菌感染相关的疾病包括持续性慢性胃炎、溃疡和/或胃癌。本发明还提供了在哺乳动物（优选处于换这些疾病的风险中或需要治疗的人受试者）中对这些疾病的治疗和/或预防。
本发明涉及哺乳动物中（优选人或宠物（companion animal），更优选人）中的治疗和/或预防。本发明的组合物可有利地给予a)年龄在0-5岁的婴儿，优选0-2岁的婴儿，和/或b)患有胃十二指肠疾病的患者，尤其是患有消化性溃疡的患者。
本发明还特别适合于在用一种或多种抗生素治疗哺乳动物后，预防胃肠病原体（尤其是幽门螺旋杆菌）的再次感染。
实施例1：豌豆蛋白水解产物级分抑制幽门螺旋杆菌粘附到胃粘膜
1.1：抗粘附测定 
幽门螺旋杆菌ATCC 700824(J99)被培养2或3代，以最小化OMP基因的相变转换（phase-variable switching）的风险。将幽门螺旋杆菌在补充5%去纤维蛋白绵羊血（Oxoid,UK）的胰蛋白酶大豆琼脂（Trypic Soy Agar，Becton Dickinson,Germany）上，于微量需氧条件和37℃下孵育48小时。将人胃上皮细胞（AGS细胞）在组织培养瓶（75cm2,Sarstedt,USA）和六孔板（Sarstedt,USA）中补充10%FCS的有L-谷氨酰胺的RPMI 1640（PAA,Germany）中，于5%CO2中培养。
将琼脂上培养的幽门螺旋杆菌收获并重悬在无菌碳酸盐缓冲液（pH 9.0）中，至密度为每ml中约1.0×108个细菌。加入10μl FITC溶液（1%在DMSO中），与所述细菌孵育45分钟。通过将所述细菌沉淀（3150×g,5min）来终止荧光标记。将细菌在PBS中洗涤两次，以去除过量的FITC并轻轻重悬备用。
关于测试化合物针对AGS细胞上FITC标记幽门螺旋杆菌的抗粘附活性的体外试验是通过流式细胞计数方法（Niehues&Hensel,2009J.Pharm.Pharamcol.61:1303-1307）完成的。
1.2所述豌豆蛋白水解产物的生物测定指导的分级分离
将50g豌豆蛋白分离物（ F85F，84%w/w蛋白质，来自Roquette Frères(Lestrem,France)）溶解在50℃的1.5L蒸馏水中。通过加入0.56g胰蛋白酶（Novo PTN 6.0S,Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark）开始水解。通过加入NaOH将pH控制在7.0。使所述反应持续2小时。通过在85℃下维持5分钟热灭活所述酶而停止所述过程。通过在20℃下以3800g离心20分钟将沉淀材料沉淀，并将上清在板框装置中用700cm2 10kDa NMWCO PES膜（UltranLab,Schleicher&Schuell,Dassel,Germany）超滤。将渗余物冻干并用于所述豌豆蛋白肽的进一步分离。
如1.1所述测定抗幽门螺旋杆菌的活性。豌豆蛋白本身没有显示任何针对幽门螺旋杆菌的抗粘附活性。在将所述豌豆蛋白水解产物超滤后，在渗余物级分中发现抗粘附活性（用0.5mg/ml有56%细菌粘附），在渗透物级分没有发现抗粘附活性。
使用填充有 HW-50S（Tosoh Bioscience GmbH, Stuttgart,Germany）的42×5.0cm ID柱通过分子排阻色谱法（SEC）将所述10kDa渗余物分级分离。含有2%（v/v）2-丙醇的0.1M碳酸氢铵用作流动相。在4℃下以4ml/min的流速操作柱子。在UV 220nm下监测洗脱化合物，以7ml间隔收集级分并合并以得到4个主要级分，即F1到F4。F1洗脱体积为约0-220ml，在0.5mg/ml下显示出76%的粘附，F2洗脱体积为约220-310ml，在0.5mg/ml下显示出94%的粘附活性，F3洗脱体积为约310-500ml，在0.5mg/ml下显示出25%的粘附活性，F4洗脱体积为约500-720ml，在0.5mg/ml下显示出118%的粘附活性。
F3的进一步纯化是使用填充有 CG-161S树脂（Tosoh Bioscience GmbH,Stuttgart,Germany）的11.8×1.0cm ID柱通过反相色谱法（RPC）实现的。使用的流动相为在蒸馏水中0.1%(v/v)的TFA（A）和在2-丙醇中0.1%(v/v)的TFA（B）。用从5%B开始到60%B的线性梯度以7个柱体积，流速0.85ml/min，UV 220nm完成洗脱。以每个4ml收集级分并合并以获得三个主要级分：F3.1到F3.3。在进一步分析前冻干所述级分。
F3.1洗脱体积为约3-33ml，在0.5mg/ml下显示出109%的粘附活性，F3.2洗脱体积为约33-54ml，在0.5mg/ml下显示出112%的粘附活性，F3.3洗脱体积为约54-85ml，在0.5mg/ml下显示出40%的粘附活性，0.2mg/ml下显示出70%的粘附活性，0.1mg/ml下显示出78%的粘附活性。 
分子大小分布是用校准Superdex肽10/300GL（Calibration Superdex Peptide 10/300 GL,Amersham Biosciences Cat.No.17-5176-01）测定的。将2%w/v的样品（离心后的上清液）稀释于30%CAN/水的0.1%TFA溶液中。通过UV在214nm下检测肽。大小分布（总面积的百分数）如下：
因此，级分F3的平均分子量为约2kDa，肽的最高量在1kDa至2.5kDa范围内。
1.3所述肽的鉴定 
为清楚地鉴定活性肽，通过MALDI-TOF-TOF串MS分析研究了级分F3.1、F3.2和F3.3。存在于活性级分中、但不存在于无活性混合物中的肽信号被特别地选择，用于后续的基于串联MS的氨基酸测序。6种肽序列（S1到S6）被通过该方法测定（序列在表1给出），并清楚地被具有整合的ParagonTM算法的ProteinPilotTM软件套件（Applied Biosystems,Darmstadt,Germany）鉴定。选择如下的参数以使得可以通过所述ParagonTM算法将所述氨基酸指定到MALDI串联MS数据中：样品类型：鉴定；半胱氨酸烷基化：无；消化：胰蛋白酶；仪器：4800；特殊因子：无；种类：无限制；ID焦点：生物修饰；数据库：Uniprot/Swiss-Prot（包括污染物数据库的2007年1月23日的版本，二者都为FASTA格式）；搜索力度：完全。
肽S1到S6被鉴定为来自豌豆豆球蛋白A或豌豆球蛋白的肽片段。随后，合成各种肽以进一步清楚地测试抗粘附性质（Thermo Fisher Scientific(Ulm,Germany)）。十一肽S3被发现是最大活性的化合物，显著地减少幽门螺旋杆菌的粘附分别达81%和83%（75resp.150μM对应于0.1resp.0.2mg/ml）。还有S5，其抑制粘附达6%到17%（75resp.150μmol），是从豌豆蛋白胰蛋白酶消化获得的活性肽中被评估的两个。
表1：肽S1到S6和合成肽S3A到S3H的序列，以及在以所述各个肽预处理后所述细菌后FITC标记的幽门螺旋杆菌对AGS细胞的粘附平均值（±SEM）。数据涉及未处理的幽门螺旋杆菌对照（=100%）。阳性对照：3’唾液酸乳糖（15mM）。
如WO 2008/043424的实施例中所述进行类似的实验。简而言之， 通过纳米反相色谱法（C18）将所述豌豆蛋白消化物进行微分级分离，将每个级分在线点在MALDI靶上。通过MALDI-TOF质谱检查了832个点的每一个中所要求保护的肽S3（m/z 1339）和S5（m/z 1418）的存在情况。结论是，根本不能鉴定肽S5。只发现有痕量肽S3。
1.4幽门螺旋杆菌的原位粘附抑制
为确认这些结果，在对人胃组织的原位测定中研究了级分F3以及肽S3的抗粘附活性。根据Lengsfeld et al,2004,J.Agricul.Food Chem:52,1495-1503以人胃粘膜的组织学切片和FITC标记的幽门螺旋杆菌进行原位实验，并通过荧光显微镜法进行评估。FITC标记的幽门螺旋杆菌到上皮细胞的粘附是通过荧光显微镜法和成像进行评价。上皮表面上粘附细菌的数量是在双盲条件下进行评估。最大粘附表示为总的100%粘附。所述荧光区域强度通过 软件（Olympus,Germany）计算，将阴性对照的荧光区域标准化为100%。
以级分F3预处理的（1.0mg/ml）幽门螺旋杆菌在该测试系统中显示了强烈减少的粘附（约70%抑制）。并且，S3（300μM）强烈地减少了所述细菌粘附（约40%抑制）。这些数据清楚地确认了F3和S3的抗粘附活性。在另一方面，所述生物测定指导的分级分离还指示了一种非线性活性谱：所述抗粘附效应在所述肽纯化步骤中不是稳定增加的，而是对于所分离和检测的个体肽来说是在变小的。这清楚地指示，在所述混合物中存在其他活性化合物，以协同方式影响了所述混合物的抗粘附性质。
1.5结构-活性关系
对于所述活性的十一肽S3多种片段的结构活性关系，合成了长度不同的肽（S3A到S3H，见表1）。功能测试证明了与天然肽S3相比抑制强度普遍损失。只有肽S3D、E、F和G轻微地阻断了粘附（约10%降低）。如果与S3氨基酸序列相比，带有末端和完整三肽序列即Asp-Ala-Phe的同源基序可以被鉴定。因此，所述合成的三肽（Asp-Ala-Phe）S3H被检测并显示为无活性的，这可能意味着该序列如果在整合到更长的肽链中可能是官能化的。本发明人推测最可能的是，S3中发现的至少11个氨基酸的完整肽序列对于S3抑制细菌粘附的活性是必要的，这是由于可能形成对于与受体靶相互作用来说必需的三维肽折叠。
某种二级结构和三维肽折叠的存在可以改变肽的功能性。用分子操作环境（MOE）软件对不同肽进行的初步构象建模实验表明了十一肽S3的高度折叠，这在低分子肽片段S3A到S3H中是明显不存在的（数据未给出）。
1.6粘附预防的特异性
所述活性肽对幽门螺旋杆菌外膜蛋白（OMP）的特异性是根据以前描述的方法[Walz,et al2005,Glycobiology,15，700-708;Valkonen et al,1994,62(9),3640-3648]通过斑点杂交复合糖测定法证明的。
在0.2μm孔径的聚偏氟乙烯（PVDF）膜上点上2μl的含有1μg糖蛋白和拟糖蛋白的溶液。
用于这些实验的幽门螺旋杆菌粘附素的一般配体的代表性选择是与OMP BabA相互作用的Lewisb和H型I血型抗原缀合物，与所述OMP HpaA特异性相互作用的3’-唾液酸乳糖，已知与OMP SabA相互作用的唾液酸-Lewis a和层粘连蛋白，以及具有尚未测定的细菌粘附素亲和性的纤连蛋白。进一步地，将人血清白蛋白（HSA）和牛血清白蛋白（BSA）用作对照，以排除幽门螺旋杆菌对所述膜上斑点化合物的非特异性结合。另外，将6’-唾液酸乳糖用于证明HpaA对3’-唾液酸乳糖的结合特异性。测量了粘附的经预处理的和未经处理的标记细菌的荧光。
在以F3预处理幽门螺旋杆菌的情况中，观察到了细菌与Lewisb-、H型I-和3’-唾液酸乳糖-HSA缀合物以及与纤连蛋白的相互作用的强烈减少。F3还较小的程度影响了对唾液酸Lewisa缀合物物的结合，但不影响对斑点层粘连蛋白的结合。这些发现清楚地表明，F3可与幽门螺旋杆菌粘附素BabA、HpaA、纤连蛋白结合粘附特异性地相互作用，与SabA以较不强烈的方式相互作用。
相比之下，肽S3和S5只展示出对Lewisb-HSA介导的粘附的抑制，说明对BabA粘附素有抑制，而对其他粘附素没有显著影响。
总之，这些抑制说明了来自F3的肽对BabA、HpaA、SabA的已知受体结构和对尚未鉴定的对ECM蛋白纤连蛋白有亲和性的粘附素有强的模拟或额外结合位点。所述纯化的肽的活性显著小于所述更复杂的级分，这是由于所述纯化的肽对单一细菌粘附素的单价抑制。相比之下，使用复杂的异种混合物能够以多靶点策略与幽门螺旋杆菌OMP相互作 用，从而导致对负责细菌粘附的几种蛋白质的阻断。这清楚地证明，在对于一个粘附过程的不同相关OMP的情况下，使用复杂混合物可能比高度纯化的单一化合物更有效。
本发明实施例1的结果表明了使用豌豆蛋白水解产物和/或豌豆肽治疗和/或预防哺乳动物中幽门螺旋杆菌感染和/或与幽门螺旋杆菌感染相关的疾病的优势。

Claims (15)

1.一种包括豌豆蛋白水解产物的组合物用于制备治疗和/或预防哺乳动物中胃肠病原体感染和/或与胃肠病原体感染相关的疾病的组合物的用途，其中所述豌豆蛋白水解产物是通过在不存在胰凝乳蛋白酶的情况下使用胰蛋白酶进行的水解而获得的，其中以所述豌豆蛋白水解产物的总重量计，所述豌豆蛋白水解产物具有多于35wt.％的大小在1至2.5kDa之间的肽，并且其中所述胃肠病原体为幽门螺旋杆菌。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述豌豆蛋白水解产物是通过水解豌豆蛋白豆球蛋白A或豌豆球蛋白获得的。
3.一种包括肽的组合物用于制备治疗和/或预防哺乳动物中胃肠病原体感染和/或与胃肠病原体感染相关的疾病的组合物的用途，其中所述肽选自-Asp-Phe-Leu-Glu-Asp-Ala-Phe-Asn-Val-Asn-Arg和-Glu-Leu-Ala-Phe-Pro-Gly-Ser-Ala-Gln-Glu-Val-Asp-Arg，并且其中所述胃肠病原体是幽门螺旋杆菌。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述肽被包括于豌豆蛋白水解产物中。
5.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其中所述与感染相关的疾病选自胃炎、消化性溃疡和胃癌。
6.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其中所述哺乳动物为(i)年龄在0-5岁的婴儿或(ii)患有胃十二指肠疾病的患者。
7.根据权利要求1-4任一项所述的用途，用于在用一种或多种抗生素治疗所述哺乳动物后预防所述病原体的再次感染。
8.一种含有脂质、蛋白质和碳水化合物组分的组合物，其中所述脂质组分提供总卡路里的5％-50％，所述蛋白质组分提供总卡路里的5％-50％，所述碳水化合物组分提供总卡路里的15％-90％，其特征在于，所述蛋白质组分包括(i)至少一种由豌豆蛋白水解产物组成的蛋白质源，其中所述豌豆蛋白水解产物是通过在不存在胰凝乳蛋白酶的情况下使用胰蛋白酶进行的水解获得的，并且以所述豌豆蛋白水解产物的总重量计，所述豌豆蛋白水解产物具有多于35wt.％的大小在1至2.5kDa之间的肽，以及(ii)至少一种氮源，所述氮源选自乳蛋白、乳蛋白水解产物、卵蛋白、卵蛋白水解产物、大豆蛋白、大豆蛋白水解产物、小麦蛋白、小麦蛋白水解产物、稻蛋白、稻蛋白水解产物、游离氨基酸和它们的混合物。
9.一种含有脂质、蛋白质和碳水化合物组分的组合物，其中所述脂质组分提供总卡路里的5％-50％，所述蛋白质组分提供总卡路里的5％-50％，所述碳水化合物组分提供总卡路里的15％-90％，其特征在于，所述蛋白质组分包括：(i)至少一种由肽组成的蛋白质源，所述肽选自-Asp-Phe-Leu-Glu-Asp-Ala-Phe-Asn-Val-Asn-Arg和-Glu-Leu-Ala-Phe-Pro-Gly-Ser-Ala-Gln-Glu-Val-Asp-Arg，以及(ii)至少一种氮源，所述氮源选自乳蛋白、乳蛋白水解产物、卵蛋白、卵蛋白水解产物、大豆蛋白、大豆蛋白水解产物、小麦蛋白、小麦蛋白水解产物、稻蛋白、稻蛋白水解产物、游离氨基酸和它们的混合物。
10.根据权利要求8或9所述的组合物，其包括选自水解牛乳清、非水解牛乳清、水解牛酪蛋白、非水解牛酪蛋白、水解大豆蛋白和非水解大豆蛋白中的至少一种。
11.根据权利要求8或9所述的组合物，其包括可溶、非消化性、可发酵的寡糖。
12.一种组合物，包括选自反式低聚半乳糖、低聚果糖、糖醛酸寡糖和唾液酸乳糖的非消化性寡糖，以及
a.豌豆蛋白水解产物，其是通过在不存在胰凝乳蛋白酶的情况下使用胰蛋白酶进行的水解获得的，并且以所述豌豆蛋白水解产物的总重量计具有多于35wt.％的大小在1至2.5kDa之间的肽；和/或
b.至少一种肽，所述肽选自-Asp-Phe-Leu-Glu-Asp-Ala-Phe-Asn-Val-Asn-Arg-和-Glu-Leu-Ala-Phe-Pro-Gly-Ser-Ala-Gln-Glu-Val-Asp-Arg。
13.根据权利要求8，9或12的任一项所述的组合物，其具有50-500mOsm/kg的重量克分子渗透压浓度。
14.根据权利要求8，9或12的任一项所述的组合物，其为营养组合物或药物组合物的形式。
15.根据权利要求8，9或12的任一项所述的组合物，用于在哺乳动物中用于治疗和/或预防胃肠病原体感染和/或与所述胃肠病原体感染相关的疾病，其中所述胃肠病原体为幽门螺旋杆菌。
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