TW202409294A - 含有唾液酸之糖鏈的製造方法 - Google Patents

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松尾聡子
西內祐二
石井一之
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日商糖鎖工學研究所股份有限公司
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Abstract

本發明係以提供一種由雞蛋製造更高純度(均一性)之含有糖鏈之組成物的方法為目的。 解決手段為提供一種由源自雞蛋之糖鏈萃取物製造以高純度含有所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈之組成物的方法。前述方法其特徵為：對源自雞蛋之糖鏈萃取物進行將所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈濃化的處理。

Description

含有唾液酸之糖鏈的製造方法
本案係有關於一種含有唾液酸之糖鏈的製造方法，更具體而言，係有關於一種由雞蛋製造以高純度含有所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈之組成物的方法。本案又有關於一種以高純度含有所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈之組成物。
眾所皆知糖鏈在生物體內發揮各種作用，除醫藥有效成分的修飾、醫藥品的製造外，亦使用於檢驗方法等。用於此類用途之糖鏈，基於品質或精確度觀點係要求高均一性。
迄此，作為糖鏈的製造方法的1種，已知有由存在於雞蛋之糖蛋白質中分離純化之方法(非專利文獻1、專利文獻1及2)。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本特開2003-128703號 [專利文獻2]日本特開2011-162762號 [非專利文獻]
[非專利文獻1]Liu et al., “Improved isolation and characterization procedure of sialylglycopeptide from egg yolk powder”, Carbohydrate Research 452 (2017) 122-128
[發明所欲解決之課題]
本案係以提供一種由雞蛋製造更高純度(均一性)之含有糖鏈之組成物的方法為目的。 [解決課題之手段]
由雞蛋所製造之糖鏈，迄此咸認其非還原末端所具有的唾液酸係全為α2,6-鍵結型。本案發明人等此次發現，透過採用與向來一般所使用者不同之分析，於萃取自雞蛋之糖鏈混合物中，非還原末端的一部分或全部具有α2,3-鍵結型唾液酸之糖鏈以微量雜質形式含有，而終至完成本案發明。
本發明係包含以下特徵：
(1)一種製造方法，其係由源自雞蛋之糖鏈萃取物製造以高純度含有所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈之組成物的方法，其特徵為： 對前述源自雞蛋之糖鏈萃取物進行將所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈濃化的處理。
(2)如(1)之製造方法，其中， 前述糖鏈為二唾液酸糖鏈。
(3)如(1)之製造方法，其中， 前述糖鏈為下述化合物： 之形態。
(4)如(1)之製造方法，其中， 前述濃化處理係包含將所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈與任一非還原末端具有α2,3鍵結型唾液酸之糖鏈分離。
(5)如(4)之製造方法，其中， 前述分離係藉由液相層析法來進行。
(6)如(1)之製造方法，其中， 前述濃化處理係包含將任一非還原末端具有α2,3鍵結型唾液酸之糖鏈進行酵素處理或藉由酸水解之處理。
(7)如(6)之製造方法，其中， 前述酵素處理係包含使用α2,3唾液酸酶之處理。
(8)如(1)之製造方法，其中， 前述濃化處理係包含所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈或任一非還原末端具有α2,3鍵結型唾液酸之糖鏈形成衍生物。
(9)如(1)之製造方法，其中， 進一步包含對糖鏈導入脂溶性取代基。
(10)如(9)之製造方法，其中， 脂溶性取代基的導入方法為唾液酸羧基的酯化、硫酯化、醯胺化或醯肼化。
(11)如(9)之製造方法，其中， 脂溶性取代基為導入至唾液酸之羧酸的苯甲基。
(12)一種組成物，其係藉由如(1)至(11)中任一項之製造方法所製成。
(13)一種組成物，其係實質上由所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈所構成。
(14)如(13)之組成物，其中， 前述糖鏈為二唾液酸糖鏈。
(15)如(13)之組成物，其中， 前述糖鏈為下述化合物： 之形態。
(16)如(13)之組成物，其中， 全部糖鏈中的至少97%為所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈。
(17)如(13)之組成物，其中， 全部糖鏈中的至少98%為所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈。
(18)如(13)之組成物，其中， 全部糖鏈中的至少99%為所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈。
(19)如(13)之組成物，其中， 全部糖鏈中的至少95%為所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈，且 以未達全部糖鏈的2%含有任一非還原末端具有α2,3鍵結型唾液酸之糖鏈。
(20)一種方法，其係由包含所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈與任一非還原末端具有α2,3鍵結型唾液酸之糖鏈的糖鏈混合物，製造以高純度含有所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈之組成物的方法，其特徵為： 藉由將前述糖鏈混合物，進行以下步驟： (a)供予至使用HILIC管柱之液相層析法； (b)使在非還原末端之任一處具有α2,3鍵結型唾液酸之糖鏈分解或變性後，供予至液相層析法；或 (c)使所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈形成衍生物後，供予至液相層析法， 而將前述糖鏈純化。
(21)如(20)之製造方法，其中， 前述糖鏈為二唾液酸糖鏈。
(22)如(20)之製造方法，其中， 前述糖鏈為下述化合物： 之形態。
(23)如(20)之製造方法，其中， 前述分解係包含將任一非還原末端具有α2,3鍵結型唾液酸之糖鏈進行酵素處理或藉由酸水解之處理。
(24)如(23)之製造方法，其中， 前述酵素處理係包含使用α2,3唾液酸酶之處理。
(25)如(20)之製造方法，其中， 前述變性係包含使所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈或任一非還原末端具有α2,3鍵結型唾液酸之糖鏈的任一者或兩者形成衍生物。
本業者應理解，任意組合以上所述之本發明的一個或多個特徵之發明亦包含於本發明之範圍。 [發明之效果]
根據本案，可提供一種由雞蛋製造更高純度(均一性)之含有糖鏈之組成物的方法。
[實施發明之形態] 1.序
於本案一樣態中，係有關於一種由源自雞蛋之糖鏈萃取物製造以高純度含有所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈之組成物的方法(以下亦稱「本案之製造方法(1)」)。
於本案別的樣態中，係有關於一種由包含所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈與任一非還原末端具有α2,3鍵結型唾液酸之糖鏈的糖鏈混合物，製造以高純度含有所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈之組成物的方法(以下亦稱「本案之製造方法(2)」)。
於本案另一樣態中，係有關於一種藉由本發明之製造方法(1)或(2)所記載之方法所製造的組成物。
於本案又一樣態中，係有關於一種實質上由所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈所構成的組成物。
本案中，「源自雞蛋之糖鏈萃取物」係指萃取分離自雞蛋，較佳為其蛋黃之特定的唾液酸糖鏈所構成的劃分。「源自雞蛋之糖鏈萃取物」典型上為二唾液酸糖鏈所構成的劃分。
「源自雞蛋之糖鏈萃取物」所含之糖鏈能以游離糖鏈、糖胺基酸、醣肽等任意形態萃取而出，本業者可適宜選擇期望之形態。
本案一實施形態中，「源自雞蛋之糖鏈萃取物」係主要以唾液酸醣肽(SGP)之形態取得。所述實施形態中，於取自雞蛋的糖鏈萃取程序中，未進行使用肽酶之處理。
本案別的實施形態中，「源自雞蛋之糖鏈萃取物」係主要以糖鏈天門冬醯胺之形態取得。所述實施形態中，於取自雞蛋之糖鏈萃取程序中，係進行使用肽酶之處理。
本案中，「源自雞蛋之糖鏈萃取物」係指藉由可用於取得源自雞蛋(較佳為蛋黃)之糖鏈化合物的任意手法所取得之含有糖鏈之組成物。作為可用於取得源自雞蛋(較佳為蛋黃)之糖鏈化合物的手法，非限定於此，可舉出例如因參照而載入本案之上述專利文獻1及2、非專利文獻1等所記載之手法。
「源自雞蛋之糖鏈萃取物」，舉例而言，可藉由對生蛋黃進行苯酚萃取且隨後使用6根尺寸排除及離子交換管柱進行純化程序而取得(A.Seko et al., Biochim. Biophys. Acta-Gen. Subj. 1335(1997)23.)。上述程序中，為替代尺寸排除層析法，亦可採用多孔質石墨碳管柱(PGC)管柱層析法(Y.Zou et al., J. Carbohydr. Chem. 31(2012) 436.)。此外，上述程序可經由二乙醚萃取去除脂質而予以最佳化(B.Sun et al.,Carbohydr.Res.396(2014)62)。
又，要取得「源自雞蛋之糖鏈萃取物」，亦可使用生蛋黃丙酮水溶液進行萃取，且隨後採用活性碳管柱純化。
又，要取得「源自雞蛋之糖鏈萃取物」，亦可使用二乙醚洗淨蛋黃粉末並藉由乙醇水溶液進行萃取，且隨後採用活性碳管柱純化(L.Liu et al., Carbohydrate. Res. 452(2017)122)。
又，要取得「源自雞蛋之糖鏈萃取物」，亦可使用脫脂蛋黃粉末水溶液進行萃取，且隨後採用採用ODS純化(日本特開2011-162762號)。
2.製造方法(1) 本案之製造方法(1)，其特徵為對前述源自雞蛋之糖鏈萃取物進行將所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈濃化的處理。
於一實施形態中，藉由本案之製造方法(1)所濃化的糖鏈為下述形態： 。
本案之製造方法(1)中，所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈的濃化可透過由前述糖鏈以外的糖鏈分離來進行。前述分離只要是可基於分子量、電荷、其他化學性質來分離物質的手法則不特別限制，較佳使用液相管柱層析法。
本案之一實施形態中，所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈的濃化係藉由包含將所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈與任一非還原末端具有α2,3鍵結型唾液酸之糖鏈分離的處理來進行。所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈與任一非還原末端具有α2,3鍵結型唾液酸之糖鏈僅有非還原末端之糖鏈的鍵結形式不同，分子量皆同。本案發明人等此次發現，兩種糖鏈之混合物可藉由使用HILIC管柱的液相層析法來分離。從而，於一實施形態中，所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈與任一非還原末端具有α2,3鍵結型唾液酸之糖鏈的分離可採用使用液體HILIC管柱的層析法。
別的實施形態中，在供予至分離處理前，係進行將任一非還原末端具有α2,3鍵結型唾液酸之糖鏈分解的處理。前述分解係包含例如藉由酵素僅特異性地將α2,3鍵結型唾液酸分解的處理或酸水解。可使用於前述酵素處理之酵素，非限定於此，可舉出利用α2,3唾液酸酶、非特異性唾液酸酶、具有唾液酸酶活性之唾液酸轉移酶等。
別的實施形態中，在供予至分離處理前，係進行將任一非還原末端具有α2,3鍵結型唾液酸之糖鏈變性的處理。前述變性除例如α2,3鍵結型唾液酸的內酯化外，亦可舉出藉由酯化、硫酯化、醯胺化、醯肼化等而導入取代基等。就內酯化而言，α2,3鍵之唾液酸，已知若使唾液酸1位羧酸活化則可於分子內形成內酯(Glycoconj.J.(2021) 38：157-166)，而利用此性質。
別的實施形態中，在供予至分離處理前，係進行使所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈形成衍生物的處理。前述形成衍生物可舉出例如唾液酸羧基的酯化、硫酯化、醯胺化、醯肼化等。形成衍生物之糖鏈有時直接利用，亦可包含去除取代基之步驟。 如上述之分離前的前處理，基於可使α2,6鍵結型唾液酸的分離更容易，且可使用適於大量生產的一般管柱而言係有其優點。
3.製造方法(2) 本案之製造方法(2)，其特徵為藉由將糖鏈混合物，進行以下步驟： (a)供予至使用HILIC管柱之液相層析法； (b)使在非還原末端之任一處具有α2,3鍵結型唾液酸之糖鏈分解或變性後，供予至液相層析法；或 (c)使所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈形成衍生物後，供予至液相層析法， 而將前述糖鏈純化。
該實施形態中之糖鏈混合物只要是包含所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈與任一非還原末端具有α2,3鍵結型唾液酸之糖鏈的糖鏈混合物則不特別限制，除萃取自雞蛋或其蛋黃的任意糖鏈萃取物外，亦包含藉由化學合成所製造之糖鏈的混合物、藉由基因重組技術所培養之糖鏈的混合物等。
一實施形態中，藉由本案之製造方法(2)所純化的糖鏈為下述形態： 。
前述分解係包含例如藉由酵素特異性地優先將α2,3鍵結型唾液酸分解的處理。可使用於前述酵素處理之酵素，非限定於此，可舉出利用α2,3唾液酸酶、非選擇性唾液酸酶、具有唾液酸酶活性之唾液酸轉移酶等。
別的實施形態中，在供予至分離處理前，係進行將任一非還原末端具有α2,3鍵結型唾液酸之糖鏈變性之處理。前述變性可舉出例如α2,3鍵結型唾液酸的內酯化、酯化、硫酯化、醯胺化、醯肼化等。
別的實施形態中，在供予至分離處理前，係進行使非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈形成衍生物的處理。前述形成衍生物可舉出例如唾液酸羧基的酯化、硫酯化、醯胺化、醯肼化等。形成衍生物之糖鏈有時直接利用，亦可包含去除取代基之步驟。
本案之一實施形態中，本案之製造方法(1)或(2)係進一步包含對經濃化或純化之糖鏈導入脂溶性取代基。前述取代基的導入，典型上係導入至唾液酸的羧酸基。藉此，可使糖鏈更穩定。前述取代基對唾液酸的羧酸基的導入為本業者之技術範圍內。
一實施形態中，作為可使用於本案之脂溶性取代基的導入方法，可舉出唾液酸羧基的酯化、硫酯化、醯胺化、醯肼化等。
別的實施形態中，作為可使用於本案之脂溶性取代基，非限定於此，可舉出苯甲基、苯乙醯基。
4.組成物 藉由上述製造方法所製造的組成物係實質上由所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈所構成的組成物。
於本案一實施形態中，「實質上由…所構成」可意指組成物所含之全部糖鏈中，至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%為所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈。
於本案又一實施形態中，「實質上所構成」可意指組成物所含之全部糖鏈中，至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%為所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈，且任一非還原末端具有α2,3鍵結型唾液酸之糖鏈為全部糖鏈的未達2.5%、未達2.4%、未達2.3%、未達2.2%、未達2.1%、未達2.0%、未達1.9%、未達1.8%、未達1.7%、未達1.6%、未達1.5%、未達1.4%、未達1.3%、未達1.2%、未達1.1%、未達1.0%、未達0.9%、未達0.8%、未達0.7%、未達0.6%、未達0.5%、未達0.4%、未達0.3%、未達0.2%或未達0.1%。
此外，本說明書中所使用之用語係為了說明特定的實施形態而使用者，並非意圖限定發明。
又，本說明書中使用之「包含」之用語，除應作前後文明顯不同理解時，係意指記述之事項(構件、步驟、要素、數字等)存在，且不排除此外之事項(構件、步驟、要素、數字等)存在。
除非有不同定義，否則此處所使用的所有用語(包含技術用語及科學用語)係具有與本發明所屬技術之本業者所廣泛理解為相同的意義。此處所使用的用語，除非明示不同定義，否則應解釋為具有與本說明書及相關技術領域之意義整合性的意義，不應以理想化或過度形式化的意義來解釋。
第1、第2等用語有時係為了表現各種要素而使用，惟應理解此等要素不應受該等用語所限定。此等用語係僅用於將其中一要素與其他要素區分，例如將第1要素記載為第2要素，同樣將第1要素記載為第2要素不悖離本發明範圍而為可能。
以下根據實施例更具體地說明本發明；然而，本發明可藉由各種形態具體化，不應解釋為限定於此處所記載之實施例。 [實施例]
(參考例1)二唾液酸糖鏈天門冬醯胺混合物的合成 將乙醇(EtOH、67mL)攪拌的同時打入1顆蛋黃。攪拌約5小時後進行過濾，進一步以EtOH(30mL)進行洗淨。對所得沉澱再度添加EtOH(83mL)進行攪拌1夜後進行過濾，其次，將沉澱以EtOH(30mL)洗淨。其次，藉由將沉澱乾燥，而得到3g脫脂蛋黃(Delipidated Egg Yolk)。
使所得脫脂蛋黃溶解於磷酸緩衝液(pH= 7.0、30mL)後，添加疊氮化鈉(10mg)。進而，添加Orientase ONS(HBI公司製、1.0g)，靜置於50℃下約24小時。以薄層層析法(TLC)確認反應結束後，將反應液使用Celite(註冊商標)(Celite Corporation)進行過濾。將濾液濃縮後，以凝膠過濾管柱層析法(Sephadex G-25、2.5×100cm、水)純化。回收含目標糖之劃分並濃縮，接著進行冷凍乾燥。
對所得乾燥粉末(約430mg)添加Tris-HCl・氯化鈣緩衝液(pH=7.5、43mL)、疊氮化鈉(21mg)，使該粉末溶解。進而，添加鏈黴菌蛋白酶E(43mg)，一邊每隔12小時確認pH=7.5一邊靜置24小時。確認pH有變化時，則藉由三羥基甲基胺基甲烷水溶液或鹽酸水溶液調整成pH=7.5。靜置24小時後，對反應液再度添加鏈黴菌蛋白酶E(21.5mg)，邊再次確認pH=7.5邊使其反應約48小時。確認pH有變化時，則藉由三羥基甲基胺基甲烷水溶液或鹽酸水溶液調整成pH=7.5。以TLC確認反應結束後，進行Celite過濾。將濾液濃縮後，以凝膠過濾管柱層析法(Sephadex G-25、2.5×100cm、水)純化。回收含有目標二唾液酸糖鏈化合物之劃分並濃縮，接著進行冷凍乾燥，而得到二唾液酸糖鏈天門冬醯胺混合物。
(參考例2)以Fmoc基保護天門冬醯胺之胺基氮之二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc的合成 將參考例1中所得之二唾液酸糖鏈天門冬醯胺混合物(120mg)溶於水(1.5mL)中，添加碳酸氫鈉(26mg)。進而，添加溶有Fmoc-OSu[N-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)oxysuccinimide] (68mg)的二甲基甲醯胺(DMF、2.5mL)後，於室溫下使其反應2小時。以TLC確認原料消失後，使用蒸發器予以濃縮。對殘渣添加水(15mL)、二乙醚(25mL)並攪拌10分鐘。其次，去除二乙醚層後，將水層以二乙醚(15mL)洗淨，進一步濃縮後，進行冷凍乾燥。其次，將所得殘留物，使用ODS管柱(Wakogel 100C18)，施加梯度予以純化。回收含有糖鏈之劃分並濃縮後，進行冷凍乾燥。將所得殘留物以HPLC分取管柱純化(YMC-Pack R&D ODS、D-ODS-5-A、20×250mm、乙腈/25mM乙酸銨水溶液=20/80、7.5 mL/min)。分取約15分鐘後出現的主繞射峰後，予以濃縮。其次，以ODS管柱進行脫鹽處理。進行冷凍乾燥，獲得13.3mg之目標之天門冬醯胺之胺基氮由Fmoc基保護的糖鏈天門冬醯胺化合物，即二唾液酸糖鏈天門冬醯胺‐Fmoc。
(參考例3)(1S,2S(3))二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc(GT-25034)的調製
對GT-25002(50mg、MW：2267.8、22 μmol、GlyTech, Inc.)添加蛋白酶抑制劑(將0.5mL、cOmplete、Roche、11836170001、1錠溶於水(0.5mL)中)、2mM PMSF/DMSO(40μL)、Bacterial Alkaline Phosphatase (40μL、Roche、03359123001、14Unit/μL)、1M MOPS緩衝液(1.0mL、pH=7.0、Nacalai Tesque、23442-81)、BSA(50mg、SIGMA、A3159-50G)、水(9.4mL)，對HPLC分析用分注50μL。對分注後的糖鏈水溶液(約11mL)，添加α2、3-sialyltransferase(291mUnit、40Unit/mL、JT、ish-467)、Cytidine 5’-monophospho-β-D-N-acetylneuraminic acid、disodium salt(CMP-唾液酸、247mg、SANYO FINE公司製)並於30℃搖晃。6小時後，將反應溶液8μL用水(32μL)稀釋，並注射5μL來進行HPLC分析。於HPLC分析中，確認17.5分溶出之原料峰衰減及15.5分溶出之新波峰生成。藉由質譜分析，確認生成之新波峰為GT-25034，而結束反應。反應結束後，藉由HPLC進行純化，濃縮後，藉由ODS載體進行脫鹽，而以產量37mg(MW：2560.4、15μmol、產率66%)得到(1S、2S(3))二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc。 HPLC分析條件(ODS)：(CAPCELL PAK C18 UG120 250×4.6mm、流速 0.70mL/min、移動相A：25mM 乙酸銨水溶液、B：乙腈、梯度 A85%→A75%(20分)→A5%(25分)→A85%(45分)) HPLC純化條件：(CAPCELL PAK C18 UG120 250×20mm、流速 7.0mL/min、移動相A：25mM 乙酸銨水溶液、B：乙腈、梯度 A80%→A80%(5分)→A75%(25分)→A10%(30分)→A80%(45分))
(參考例4)((1S(3),2S)二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc(GT-25035)的調製
對GT-25006(50mg、MW：2267.8、22μmol、GlyTech, Inc.)添加蛋白酶抑制劑(0.5mL、cOmplete、Roche、11836170001、1錠溶於水(0.5mL)中)、2mM PMSF/DMSO(0.04mL)、Bacterial Alkaline Phosphatase (0.04mL、Roche、03359123001、14Unit/μL)、1M MOPS緩衝液(1.0mL、pH=7.0、Nacalai Tesque 23442-81)、BSA (50mg、SIGMA、A3159-50G)、水(9.4mL)，對HPLC分析用分注50μL。對分注後的糖鏈水溶液(約11mL)，添加α2、3-sialyltransferase(291mUnit、40Unit/mL、JT、ish-467)、Cytidine 5’-monophospho-β-D-N-acetylneuraminic acid、disodium salt(CMP-唾液酸、247mg、SANYO FINE公司製)並於30℃搖晃。7小時後，將反應溶液8μL用水(32μL)稀釋，並注射5μL來進行HPLC分析(分析條件)。於HPLC分析中，確認17.0分溶出之原料峰衰減及14.5分溶出之新波峰生成。質譜分析的結果，確認為GT-25035，而結束反應。反應結束後，藉由HPLC進行純化，濃縮後，藉由ODS載體進行脫鹽，而以產量34.3mg(MW：2560.35、13.4μmol、產率61%)得到(1S、2S(3))二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc。 HPLC分析條件(ODS)：(CAPCELL PAK C18 UG120 250× 4.6mm、流速 0.70mL/min、移動相A：25mM 乙酸銨水溶液、B：乙腈、梯度 A85%→A75%(20分)→A5%(25分)→A85% (45分)) HPLC純化條件：(CAPCELL PAK C18 UG120 250×20mm、流速 7.0mL/min、移動相A：25mM 乙酸銨水溶液、B：乙腈、梯度 A80%→A80%(5分)→A75%(25分)→A10%(30分)→A80%(45分))
(參考例5)(1S(3),2S(3))二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc (GT-25025)的調製
將GT-25022(5g、MW：1977.84、2.5mmol、GlyTech, Inc.)溶解於水(45mL)，並添加MOPS緩衝液(5.0mL、pH=7.0、Nacalai Tesque 23442-81)後，對HPLC分析用分注200μL。對分注後的糖鏈水溶液(約50mL)，添加Bacterial Alkaline Phosphatase(0.3mL、Roche、03359123001、14Unit/μL)、α2,3-sialyltransferase(500mg)、Cytidine 5’-monophospho-β-D-N-acetylneuraminic acid、disodium salt (CMP-唾液酸、5g、SANYO FINE公司製)並於4℃搖晃。27小時後，將反應溶液2μL用水(198μL)稀釋，並注射10μL來進行HPLC分析。於HPLC分析中，確認12.5分溶出之原料峰衰減及8.0分溶出之新波峰生成。藉由質譜分析，確認生成之新波峰為GT-25025，而結束反應。反應結束後，藉由HPLC進行純化，濃縮後，藉由電透析進行脫鹽，而以產量5.4g(MW：2560.35、2.1mmol、產率83%)得到(1S(3)、2S(3))二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc。 HPLC分析條件：(CAPCELL PAK C18 UG120 250×4.6mm、流速 0.70mL/min、移動相A：25mM 乙酸銨水溶液、B：乙腈、等位沖提(A：80%、B：20%) HPLC純化條件：(SP-300―5-ODS-BIO 250×30mm、流速 25mL/min、移動相A：25mM 乙酸銨水溶液、B：乙腈、梯度 A95%→A95%(10分)→A85%(10.1分)→A82%(40分)
(實施例1)二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc的分析 將參考例2中所得之二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc(5mg、2.0μmol)溶解於水中，定容至10.0mL。將定容之糖鏈水溶液10μL注射至HPLC進行分析。其結果，確認23分附近溶出之二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc波峰(94.9%)的後方24分附近溶出之顯示等質量的另一波峰(3.7%)(圖1)。比較參考例3、4、5中所調製之含有α2,3-唾液酸的二唾液酸糖鏈與HPLC上之保持時間的結果，24分附近溶出之波峰係與GT-25034、GT-25035一致(圖2)。 HPLC分析條件：(Asahipak NH2P-50 4E 5μm 250×4.6mm、流速 0.70mL/min、移動相A：0.5% 磷酸水溶液、B：含0.5%磷酸 90%乙腈水溶液、梯度A25%→A75%(25分)→ A90%(26分)→A90%(28分)→A25%(29分)→A25%(45分)) 24分鐘附近溶出之波峰的ESI-MS：Calcd for C 103H 154N 8O 66[M+H] +2559.89、[M+2H] +21280.45、[M+3H] +3853.96、found 1280.44、853.95.
(實施例2)二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc的雜質解析 將參考例2中所得之二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc(200mg)溶解於水(4mL)中後，以乙腈(12mL)稀釋。稀釋後，將微微白濁的糖鏈水溶液藉由HPLC純化並冷凍乾燥。(HPLC純化條件)冷凍乾燥後，以ODS載體進行脫鹽，而得到雜質純化品(2.4mg)(圖3)。 將所得雜質純化品與藉由參考例2、3、4、5所調製之糖鏈進行比較分析的結果，分別與GT-25034、GT-25035一致(圖4)。 HPLC純化條件：(Asahipak NH2P-90 20F 300×20mm、流速 7mL/min、移動相A：0.5%磷酸水溶液、B：含0.5%磷酸 90%乙腈水溶液、梯度A25%→A25%(5分)→A75%(60分) HPLC分析條件(ODS(1))：(CAPCELL PAK C18 UG120 250×4.6mm、流速 0.70mL/min、移動相A：25mM 乙酸銨水溶液、B：乙腈、等位沖提(A：80%、B：20%) HPLC分析條件(ODS(2))：(CAPCELL PAK C18 UG120 250×4.6mm、流速 0.70mL/min、移動相A：25mM 乙酸銨水溶液、B：乙腈、等位沖提(A：82%、B：18%) HPLC分析條件(HILIC)：(Asahipak NH2P-50 4E 5μm 250×4.6mm、流速 0.70mL/min、移動相A：0.5%磷酸水溶液、B：含0.5%磷酸 90%乙腈水溶液、梯度 A25%→ A75%(25分)→A90%(26分)→A90%(28分)→A25%(29分)→A25% (45分))
(實施例3)雜質的結構鑑定 藉由唾液酸水解酵素將實施例2中調製之雜質分解。
對溶解於水(5μL)之雜質(50μg)添加100mM 乙酸鈉水溶液(44μL)、α2,3-唾液酸酶(5mUnit、TAKARA、4455)並於37℃使其反應1.5小時。1.5小時後，將反應溶液(10μL)用水(90μL)稀釋，並注射10μL而進行HPLC分析。HPLC的結果，確認10.5分、11.5分之原料峰完全消失，於14分生成新波峰。質譜分析的結果，確認生成之新波峰為由雜質切斷唾液酸的1個殘基之單唾液酸型。
另一方面，同樣對溶解於水(5μL)之雜質(50μg)添加100mM 乙酸鈉水溶液(44μL)、α2,3-2,6-2,8-唾液酸酶(10mUnit、Neuraminidase、SANYO FINE)並於37℃使其反應1.5小時。1.5小時後，將反應溶液(10μL)用水(90μL)稀釋，並注射10μL而進行HPLC分析。HPLC分析的結果，確認10.5分、11.5分之原料峰完全消失，於17.5分生成新波峰。質譜分析的結果，確認生成之新波峰為由雜質切斷唾液酸的2個殘基之唾液酸型(圖5)。 HPLC分析條件(ODS)：(CAPCELL PAK C18 UG120 250× 4.6mm、流速 0.70mL/min、移動相A：25mM 乙酸銨水溶液、B：乙腈 等位沖提(A：80%、B：20%)
(實施例4)GT-25001之酵素消化物的分析 藉由唾液酸水解酵素將GT-25001分解。
對溶解於水(5μL)之GT-25001(50μg)添加100mM 乙酸鈉水溶液(44μL)、α2,3-唾液酸酶(5mUnit、TAKARA、4455)並於37℃使其反應1.5小時。1.5小時後，將反應溶液(10μL)用水(90μL)稀釋，並注射10μL而進行HPLC分析。HPLC分析的結果，確認由11分之原料峰無變化(圖6)。 另一方面，同樣對溶解於水(5μL)之GT-25001(50μg)添加100mM 乙酸鈉水溶液(44μL)、α2,3-2,6-2,8-唾液酸酶(10mUnit、Neuraminidase、SANYO FINE)並於37℃使其反應。1.5小時後，將反應溶液(10μL)用水(90μL)稀釋，並注射10μL而進行HPLC分析。HPLC分析的結果，確認11分之原料峰完全消失，於17.5分生成新波峰。質譜分析的結果，確認生成之新波峰為由GT-25001切斷唾液酸的2個殘基之唾液酸型(圖6)。 HPLC分析條件(ODS)：(CAPCELL PAK C18 UG120 250× 4.6mm、流速 0.70mL/min、移動相A：25mM 乙酸銨水溶液、B：乙腈、等位沖提(A：80%、B：20%)
(實施例5)GT-25025之酵素消化物的分析 藉由唾液酸水解酵素將GT-25025分解。
對溶解於水(5μL)之GT-25025(50μg)添加100mM 乙酸鈉水溶液(44μL)、α2,3-唾液酸酶(5mUnit、TAKARA、4455)並於37℃使其反應1.5小時。1.5小時後，將反應溶液(10μL)用水(90μL)稀釋，並注射10μL而進行HPLC分析。HPLC分析的結果，確認11分之原料峰完全消失，於17.5分生成新波峰。質譜分析的結果，確認生成之新波峰為由GT-25025切斷唾液酸的2個殘基之唾液酸型(圖7)。
另一方面，同樣對溶解於水(5μL)之GT-25025(50μg)添加100mM 乙酸鈉水溶液(44μL)、α2,3-2,6-2,8-唾液酸酶(10mUnit、Neuraminidase、SANYO FINE)並於37℃使其反應1.5小時。1.5小時後，將反應溶液(10μL)用水(90μL)稀釋，並注射10μL而進行HPLC分析。HPLC分析的結果，確認11分之原料峰完全消失，於17.5分生成新波峰。質譜分析的結果，確認生成之新波峰為由GT-25025切斷唾液酸的2個殘基之唾液酸型(圖7)。 HPLC分析條件(ODS)：(CAPCELL PAK C18 UG120 250×4.6mm、流速 0.70mL/min、移動相A：25mM 乙酸銨水溶液、B：乙腈、等位沖提(A：80%、B：20%)
(實施例6)由雞蛋取得之二唾液酸糖鏈天門冬醯胺混合物的批次間差的分析 由作為原料的多個製造批次之脫脂蛋黃，依循參考例1、2調製二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc。將所得二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc(5mg、2.0μmol)溶解於水中，定容至10.0mL。將定容之糖鏈水溶液10μL注射至HPLC進行分析。其結果，確認在所有批次中，以約3.5%至5.0%的範圍包含相當於雜質之GT-25034、GT-25035之24分附近溶出的波峰(圖8)。 HPLC分析條件：(Asahipak NH2P-50 4E 5μm 250×4.6mm、流速 0.70mL/min、移動相A：0.5%磷酸水溶液、B：含0.5%磷酸90%乙腈水溶液、梯度A25%→A75%(25分)→A90%(26分)→A90%(28分)→A25%(29分)→A25%(45分))
(實施例7)二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc的純化 將參考例2中所得之二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc(50mg、20μmol)溶解於75%乙腈溶液(2.5mL)。注射至HPLC管柱中，以勿使雜質之GT-25034、GT-25035混入的方式進行純化。藉由將包含GT-25001的劃分進行脫鹽，而得到混有0.2%之GT-25034、GT-25035的GT-25001(36mg、14μmol、產率70%)。 HPLC分取條件：(Asahipak NH2P-90 20F 300×20mm、流速 8mL/min、移動相A：5%乙酸/含3%三乙胺之水溶液、B：含2%乙酸 乙腈溶液、梯度A25%→A25%(5分)→A65%(5.1～65分)
(實施例8)二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc混合物所含之雜質的去除(1) 將參考例2中所得之二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc(2g)溶解於包含100mM 乙酸鈉及10mM 氯化鈣的緩衝液(pH=5.5、20mL)，添加α2,3-唾液酸酶(2Unit、TAKARA、4455)於37℃使其反應。16小時後，將反應溶液(1μL)用水(50μL)稀釋後，添加乙腈(50μL)，並注射20μL而進行HPLC分析。HPLC分析的結果，確認32分之波峰(GT-25001)未變化，27分之波峰(GT-25034、GT-25035混合物)完全消失，於11分生成新波峰。質譜分析的結果，確認生成之新波峰為由GT-25034、GT-25035切斷唾液酸的1個殘基之單唾液酸型(圖9)。
確認反應結束後，將反應液以80℃加熱10分鐘並冷卻。將所得酵素處理溶液以HPLC管柱純化，並將包含GT-25001之劃分以ODS載體進行脫鹽，而得到GT-25034、GT-25035混合物為0.3%以下的GT-25001(1.4g、產率70%)(圖10)。 HPLC分析條件：(Asahipak NH2P-50 4E 5μm 250×4.6mm、流速 0.70mL/min、移動相A：5%乙酸、含3%三乙胺之水溶液、B：含2%乙酸之乙腈、等位沖提(A：60%、B：40%) HPLC分取條件：(SP-300-5-ODS-BIO 5μm 250×30mm、流速 25mL/min、移動相A：25mM乙酸銨水溶液、B：乙腈、梯度 A90%→A80%(30分) ESI-MS：Calcd for C 103H 154N 8O 66[M+H] +2559.89,[M+2H] +21280.45,[M+3H] +3853.96, found 1280.44, 853.95.
(實施例9)二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc所含之雜質的去除(2)(藉由內酯化形成衍生物) 對參考例2中所得之二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc(50mg)添加500mM HOBt、500mM DIC，於室溫下使其反應1小時。1小時後，將反應溶液(10μL)以乙腈/水混液(7：3,90μL)稀釋後，注射5μL而進行HPLC分析。HPLC分析的結果，確認28分之波峰(GT-25001)未大幅變化，24分之波峰(GT-25034、GT-25035混合物)完全消失(圖11)。 HPLC分取條件：(CAPCELL PAK UG120 C18 5μm 250× 4.6mm、流速0.7mL/min 展開溶劑A：水/三氟乙酸(1000：1)、B：乙腈/三氟乙酸(1000：1) 梯度A99%→ A70%(30分) HPLC分析取條件：(ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide、1.7μm 150×2.1mm、流速0.35mL/min、移動相A：50mM 甲酸銨(pH4.4)、B：乙腈、梯度A30%→A30%(66分)
(實施例10)二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc所含之雜質的去除(3)(藉由苯甲基形成衍生物(酯化)) 對參考例2中所得之二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc(25mg)添加NMP/DMF/水(84：15：1)(250μL)，於40℃攪拌1小時使其溶解。1小時後，加入苄基溴(8.6μL、3.6當量)，於40℃攪拌。6小時後，添加1M 碳酸鈉(50μL)並於室溫攪拌2小時後，用ODS管柱予以純化。藉由固相萃取進行脫鹽後，進行冷凍乾燥，而得到2.5mg之唾液酸經Bn化的GT-25001。為確認去除雜質，而對所得之唾液酸經Bn化的GT-25001(1mg)添加100mM 氫氧化鈉(10μL)，於40℃使其反應1小時，而將Bn基及Fmoc基去保護。其後，添加1M碳酸氫鈉(10μL)、乙腈(20μL)、Fmoc-OSu(2.4mg)，進行再Fmoc化。將此溶液進行固相萃取去除夾雜物後，進行減壓濃縮。對濃縮液添加水，調成試料溶液。分析試料溶液的結果，確認24分之波峰(GT-25034、GT-25035混合物)完全消失(圖12)。 HPLC分取條件：(CAPCELL PAK UG120 C18 5μm 250×20mm、流速 7.0mL/min 展開溶劑A：25mM乙酸銨、B：乙腈 梯度A75%→A70%(30分) HPLC分析取條件：(ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide、1.7μm 150×2.1mm、流速0.35mL/min、移動相A：50mM 甲酸銨(pH4.4)、B：乙腈、梯度A30%→A30%(66分)
(實施例11)SGP所含之雜質的去除(藉由2,3-唾液酸酶形成衍生物) 將SGP(TCI公司製、S0523、2mg、1.6μmol)溶於100mM乙酸鈉緩衝液(pH5.5)，添加α2,3-唾液酸酶(0.5U/mU,TAKARA,4455)2μL，於37℃反應2小時並予以純化，而得到去除雜質的SGP(0.6mg、產率33%)。對去除雜質的SGP添加水調整成2mg/mL，而調成SGP水溶液。對SGP水溶液(7.5μL)添加水(15.3μL)、5% RapiGest溶液(6μL)，於90℃培養3分鐘。使溶液回至室溫，添加Rapid PNGase(1.2μL)，於50℃培養3分鐘。對此溶液添加GlycoWorks RapiFluor-MS標記化試劑(12μL)，靜置於室溫下5分鐘。對此溶液添加乙腈(358μL)予以稀釋，使用GlycoWorks HILIC μElution Plate將RFMS標記化糖鏈進行固相萃取，經冷凍乾燥後再溶解於溶劑中而調成試料溶液。分析試料溶液的結果，確認α2,6/α2,3及α2,3/α2,6所衍生的雜質消失(圖13)。 HPLC分取條件：(CAPCELL PAK UG120 C18 5μm 250×4.6mm、流速0.7mL/min 展開溶劑A：水/三氟乙酸(1000：1)、B：乙腈/三氟乙酸(1000：1)梯度A99%→ A70%(30分) HPLC分析取條件：(ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide、1.7μm 150×2.1mm、流速0.35mL/min、移動相A：50mM 甲酸銨(pH4.4)、B：乙腈、梯度A25%→A31%(66分)
[圖1]表示二唾液酸糖鏈天門冬醯胺混合物的分析結果。上圖表示將依循參考例2而由雞蛋取得、調製之二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc混合物以HILIC模式進行HPLC分析的結果。下圖表示藉由HILIC模式下之HPLC所闡明之次要繞射峰(3.7%)的質譜分析結果(ESI-MS)。 [圖2]表示圖1中所闡明之次要繞射峰的HPLC分析結果。 [圖3]表示參考例2中所得之二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc混合物與實施例2中取得之雜質之HILIC模式下的HPLC結果(左圖)及藉由該HPLC所闡明之雜質之ODS模式下的HPLC結果(右圖)。 [圖4]表示實施例2中取得之雜質的HPLC分析結果。圖中，縱軸表示吸光度(mAU)、橫軸表示時間(分鐘)。 [圖5]表示實施例2中取得之雜質之酵素處理(α2,3-唾液酸酶或α2,3-2,6-2,8-唾液酸酶)反應產物的HPLC分析結果。 [圖6]表示GT-25001之酵素處理(α2,3-唾液酸酶或α2,3-2,6-2,8-唾液酸酶)反應產物的HPLC分析結果。 [圖7]表示GT-25025之酵素處理(α2,3-唾液酸酶或α2,3-2,6-2,8-唾液酸酶)反應產物的HPLC分析結果。 [圖8]表示由脫脂蛋黃調製之二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc混合物之批次間的雜質量的比較。 [圖9]表示依循參考例2而由雞蛋取得、調製之二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc混合物之酵素處理(α2,3-唾液酸酶)反應產物的HPLC結果。 [圖10]表示依循參考例2而由雞蛋取得、調製之二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc混合物之酵素處理(α2,3-唾液酸酶)反應產物及其純化後的HPLC結果。 [圖11]表示依循參考例2而由雞蛋取得、調製之二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc混合物之縮合反應後的HPLC結果。 [圖12]表示依循參考例2而由雞蛋取得、調製之二唾液酸糖鏈天門冬醯胺-Fmoc混合物之Bn化處理後，將Bn基及Fmoc基去保護，再度進行Fmoc化之反應產物的HPLC結果。 [圖13]表示市售SGP之酵素處理(α2,3-唾液酸酶)後，將糖鏈切斷及進行標記化之反應產物的HPLC結果。

Claims (25)

  1. 一種製造方法，其為由源自雞蛋之糖鏈萃取物製造以高純度含有所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈之組成物的方法，其特徵係： 對前述源自雞蛋之糖鏈萃取物進行將所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈濃化的處理。
  2. 如請求項1之製造方法，其中， 前述糖鏈為二唾液酸糖鏈。
  3. 如請求項1之製造方法，其中， 前述糖鏈為下述化合物： 之形態。
  4. 如請求項1之製造方法，其中， 前述濃化處理係包含將所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈與任一非還原末端具有α2,3鍵結型唾液酸之糖鏈分離。
  5. 如請求項4之製造方法，其中， 前述分離係藉由液相層析法來進行。
  6. 如請求項1之製造方法，其中， 前述濃化處理係包含將任一非還原末端具有α2,3鍵結型唾液酸之糖鏈進行酵素處理或酸水解所致之處理。
  7. 如請求項6之製造方法，其中， 前述酵素處理係包含α2,3唾液酸酶所致之處理。
  8. 如請求項1之製造方法，其中， 前述濃化處理係包含所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈或任一非還原末端具有α2,3鍵結型唾液酸之糖鏈之衍生物化。
  9. 如請求項1之製造方法，其中， 進一步包含對糖鏈導入脂溶性取代基。
  10. 如請求項9之製造方法，其中， 脂溶性取代基的導入方法為唾液酸羧基的酯化、硫酯化、醯胺化或醯肼化。
  11. 如請求項9之製造方法，其中， 脂溶性取代基為導入至唾液酸之羧酸的苯甲基。
  12. 一種組成物，其係藉由如請求項1至11中任一項之製造方法所製成。
  13. 一種組成物，其係實質上由所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈所構成。
  14. 如請求項13之組成物，其中， 前述糖鏈為二唾液酸糖鏈。
  15. 如請求項13之組成物，其中， 前述糖鏈為下述化合物： 之形態。
  16. 如請求項13之組成物，其中， 全部糖鏈中的至少97%為所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈。
  17. 如請求項13之組成物，其中， 全部糖鏈中的至少98%為所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈。
  18. 如請求項13之組成物，其中， 全部糖鏈中的至少99%為所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈。
  19. 如請求項13之組成物，其中， 全部糖鏈中的至少95%為所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈，且 以未達全部糖鏈的2%含有任一非還原末端具有α2,3鍵結型唾液酸之糖鏈。
  20. 一種方法，其為由包含所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈與任一非還原末端具有α2,3鍵結型唾液酸之糖鏈的糖鏈混合物，製造以高純度含有所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈之組成物的方法，其特徵係： 將前述糖鏈混合物，藉由以下步驟： (a)供予使用HILIC管柱之液相層析法； (b)使非還原末端之任一具有α2,3鍵結型唾液酸之糖鏈分解或變性後，供予液相層析法；或 (c)使所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈衍生物化後，供予液相層析法， 而將前述糖鏈純化。
  21. 如請求項20之製造方法，其中， 前述糖鏈為二唾液酸糖鏈。
  22. 如請求項20之製造方法，其中， 前述糖鏈為下述化合物： 之形態。
  23. 如請求項20之製造方法，其中， 前述分解係包含將任一非還原末端具有α2,3鍵結型唾液酸之糖鏈進行酵素處理或酸水解所致之處理。
  24. 如請求項23之製造方法，其中， 前述酵素處理係包含α2,3唾液酸酶所致之處理。
  25. 如請求項20之製造方法，其中， 前述變性係包含使所有非還原末端具有α2,6鍵結型唾液酸之糖鏈或任一非還原末端具有α2,3鍵結型唾液酸之糖鏈的任一者或兩者衍生物化。
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