WO2023219065A1 - シアル酸含有糖鎖の製造方法 - Google Patents

シアル酸含有糖鎖の製造方法 Download PDF

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WO2023219065A1
WO2023219065A1 PCT/JP2023/017322 JP2023017322W WO2023219065A1 WO 2023219065 A1 WO2023219065 A1 WO 2023219065A1 JP 2023017322 W JP2023017322 W JP 2023017322W WO 2023219065 A1 WO2023219065 A1 WO 2023219065A1
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WO
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sugar chain
sialic acid
linked sialic
sugar
production method
Prior art date
Application number
PCT/JP2023/017322
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English (en)
French (fr)
Inventor
貴博 山本
健文 村瀬
聡子 松尾
祐二 西内
一之 石井
洋文 落合
真人 野口
Original Assignee
株式会社糖鎖工学研究所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社糖鎖工学研究所 filed Critical 株式会社糖鎖工学研究所
Publication of WO2023219065A1 publication Critical patent/WO2023219065A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds

Definitions

  • the present disclosure provides a method for producing a sialic acid-containing sugar chain, and more specifically, a method for producing a highly purified composition containing a sugar chain having ⁇ 2,6-linked sialic acid at all non-reducing ends from chicken eggs. Regarding the method.
  • the present disclosure also relates to a composition containing highly purified sugar chains having ⁇ 2,6-linked sialic acids at all non-reducing ends.
  • sugar chains play a variety of roles in living organisms, and are used in the modification of active pharmaceutical ingredients, the manufacture of pharmaceuticals, and assays. Sugar chains used in such applications are required to have high uniformity from the viewpoint of quality and precision.
  • Non-Patent Document 1 Patent Documents 1 and 2.
  • An object of the present disclosure is to provide a method for producing a sugar chain-containing composition with higher purity (uniformity) from chicken eggs.
  • sugar chains produced from chicken eggs have been thought to have all sialic acids at their non-reducing ends of the ⁇ 2,6-linked type.
  • the inventors of the present application found that some non-reducing terminals were detected as trace impurities in a sugar chain mixture extracted from chicken eggs. It was also discovered that all of them contain sugar chains having ⁇ 2,3-linked sialic acid, and the present invention was completed.
  • the present invention includes the following features:
  • a method for producing a composition containing highly purified sugar chains having ⁇ 2,6-linked sialic acid at all non-reducing ends from a sugar chain extract derived from chicken eggs comprising: The sugar chain extract derived from chicken eggs is subjected to a treatment to enrich sugar chains having ⁇ 2,6-linked sialic acid at all non-reducing ends. Production method.
  • the sugar chain is a disialo sugar chain, Production method.
  • the manufacturing method according to (1) The sugar chain is the following compound: is in the form of Production method.
  • the enrichment treatment involves separating sugar chains having ⁇ 2,6-linked sialic acid at all non-reducing ends from sugar chains having ⁇ 2,3-linked sialic acid at any non-reducing end. including, Production method.
  • the manufacturing method according to (1) includes enzymatic treatment or acid hydrolysis treatment of sugar chains having ⁇ 2,3-linked sialic acid at any non-reducing end. Production method.
  • the manufacturing method according to (6), The enzyme treatment includes treatment with ⁇ 2,3 sialidase, Production method.
  • the manufacturing method according to (1) includes derivatization of a sugar chain having ⁇ 2,6-linked sialic acid at all non-reducing ends or a sugar chain having ⁇ 2,3-linked sialic acid at any non-reducing end. , Production method.
  • the manufacturing method according to (9), The method for introducing the fat-soluble substituent is esterification, thioesterification, amidation, or hydrazidation of the sialic acid carboxy group. Production method.
  • the fat-soluble substituent is a benzyl group introduced into the carboxylic acid of sialic acid, Production method.
  • composition consisting essentially of sugar chains having ⁇ 2,6-linked sialic acids at all non-reducing ends.
  • composition according to (13), The sugar chain is a disialo sugar chain, Production method.
  • the manufacturing method according to (13), The sugar chain is the following compound: is in the form of Composition.
  • composition according to (13) At least 97% of all sugar chains are sugar chains having ⁇ 2,6-linked sialic acid at all non-reducing ends. Composition.
  • composition according to (13) At least 98% of all sugar chains are sugar chains having ⁇ 2,6-linked sialic acid at all non-reducing ends. Composition.
  • composition according to (13) At least 99% of all sugar chains are sugar chains having ⁇ 2,6-linked sialic acid at all non-reducing ends. Composition.
  • composition according to (13) At least 95% of all sugar chains are sugar chains that have ⁇ 2,6-linked sialic acids at all non-reducing ends, and have ⁇ 2,3-linked sialic acids at any non-reducing end. Contains less than 2% of the total sugar chains, Composition.
  • a method for producing a composition containing a highly purified sugar chain having ⁇ 2,6-linked sialic acid at the non-reducing end of The sugar chain mixture is as follows: (a) Subjecting to liquid chromatography using a HILIC column (b) Subjecting to liquid chromatography after decomposing or denaturing a sugar chain having ⁇ 2,3-linked sialic acid at either non-reducing end or (c) derivatizing the sugar chain having ⁇ 2,6-linked sialic acid at all non-reducing ends, and then purifying the sugar chain by subjecting it to liquid chromatography. Method.
  • the manufacturing method according to (20), The sugar chain is a disialo sugar chain, Production method.
  • the manufacturing method according to (20), The decomposition includes treating a sugar chain having an ⁇ 2,3-linked sialic acid at any non-reducing end by enzymatic treatment or acid hydrolysis. Production method.
  • the manufacturing method according to (23), The enzyme treatment includes treatment with ⁇ 2,3 sialidase, Production method.
  • a method for producing a sugar chain-containing composition with higher purity (uniformity) from chicken eggs is provided.
  • FIG. 1 shows the analysis results of a mixture of disialoglycosylated asparagine chains.
  • the above figure shows the results of HPLC analysis in HILIC mode of the disialoglycosylated asparagine-Fmoc mixture obtained and prepared from chicken eggs according to Reference Example 2.
  • the figure below shows the mass spectrometry results (ESI-MS) of a minor peak (3.7%) revealed by HPLC in HILIC mode.
  • FIG. 2 shows the HPLC analysis results of the minor peaks revealed in FIG.
  • Figure 3 shows the HPLC results in HILIC mode (left figure) of the disialoglycosylated asparagine-Fmoc mixture obtained in Reference Example 2 and the impurities obtained in Example 2, and the ODS of the impurities revealed by the HPLC.
  • FIG. 4 shows the HPLC analysis results of impurities obtained in Example 2.
  • the vertical axis shows absorbance (mAU) and the horizontal axis shows time (minutes).
  • FIG. 5 shows the results of HPLC analysis of the reaction product of the enzyme treatment ( ⁇ 2,3-sialidase or ⁇ 2,3-2,6-2,8-sialidase) of impurities obtained in Example 2.
  • FIG. 6 shows the results of HPLC analysis of the enzyme treatment ( ⁇ 2,3-sialidase or ⁇ 2,3-2,6-2,8-sialidase) reaction product of GT-25001.
  • FIG. 7 shows the results of HPLC analysis of the enzyme treatment ( ⁇ 2,3-sialidase or ⁇ 2,3-2,6-2,8-sialidase) reaction product of GT-25025.
  • FIG. 8 shows a comparison of the amount of impurities between lots of the disialoglycosylated asparagine-Fmoc mixture prepared from defatted egg yolk.
  • FIG. 9 shows the HPLC results of the enzyme-treated ( ⁇ 2,3-sialidase) reaction product of the disialoglycosylated asparagine-Fmoc mixture obtained and prepared from chicken eggs according to Reference Example 2.
  • FIG. 10 shows the enzyme-treated ( ⁇ 2,3-sialidase) reaction product of the disialoglycosylated asparagine-Fmoc mixture obtained and prepared from chicken eggs according to Reference Example 2, and the HPLC results after its purification.
  • FIG. 11 shows HPLC results after a condensation reaction of a disialo-sugar chain asparagine-Fmoc mixture obtained and prepared from chicken eggs according to Reference Example 2.
  • FIG. 12 shows the HPLC results of the reaction product obtained by Bn conversion treatment of the disialoglycosylated asparagine-Fmoc mixture obtained and prepared from chicken eggs according to Reference Example 2, deprotecting the Bn group and Fmoc group, and performing Fmoc conversion again. show.
  • FIG. 13 shows HPLC results of a reaction product obtained by enzymatically treating commercially available SGP ( ⁇ 2,3-sialidase), cutting off sugar chains, and labeling.
  • the present disclosure provides a method for producing a composition containing highly purified sugar chains having ⁇ 2,6-linked sialic acid at all non-reducing ends from a sugar chain extract derived from chicken eggs (hereinafter referred to as (also referred to as "manufacturing method (1) of the present disclosure”).
  • the present disclosure includes a sugar chain having ⁇ 2,6-linked sialic acid at all non-reducing ends and a sugar chain having ⁇ 2,3-linked sialic acid at any non-reducing end.
  • a method for producing a composition containing highly purified sugar chains having ⁇ 2,6-linked sialic acids at all non-reducing ends from a sugar chain mixture (hereinafter also referred to as "production method (2) of the present disclosure") Regarding.
  • the present disclosure relates to a composition produced by the method described in production method (1) or (2) of the present invention.
  • the present disclosure relates to a composition consisting essentially of sugar chains having ⁇ 2,6-linked sialic acids at all non-reducing ends.
  • the "sugar chain extract derived from chicken eggs” is a fraction consisting of specific sialyl sugar chains extracted and separated from chicken eggs, preferably the egg yolks thereof.
  • the “sugar chain extract derived from chicken eggs” is typically a fraction consisting of disialo-sugar chains.
  • sugar chains contained in the "sugar chain extract derived from chicken eggs” can be extracted in any form such as free sugar chains, sugar amino acids, and glycopeptides, and those skilled in the art can appropriately select the desired form. Can be done.
  • the "sugar chain extract derived from chicken eggs” is obtained mainly in the form of sialyl glycopeptide (SGP).
  • SGP sialyl glycopeptide
  • the "sugar chain extract derived from chicken eggs” is obtained mainly in the form of asparagine sugar chains.
  • treatment with peptidase is performed in the sugar chain extraction process from chicken eggs.
  • sugar chain extract derived from chicken eggs refers to a sugar chain-containing composition obtained by any method that can be used to obtain sugar chain compounds from chicken eggs (preferably egg yolks). Methods that can be used to obtain sugar chain compounds from chicken eggs (preferably egg yolks) include, but are not limited to, the above-mentioned Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Document 1, which are incorporated herein by reference. Examples include methods described in .
  • the "sugar chain extract derived from chicken eggs” can be obtained, for example, by phenol extraction of raw egg yolk, followed by a purification process using six size exclusion and ion exchange columns (A. Seko et al. , Biochim. Biophys. Acta-Gen. Subj. 1335 (1997) 23.).
  • porous graphite carbon column (PGC) column chromatography can be used instead of size exclusion chromatography (Y. Zou et al., J. Carbohydr. Chem. 31 (2012) 436.).
  • PPC porous graphite carbon column
  • the above process can also be optimized by removal of lipids via diethyl ether extraction (B. Sun et al., Carbohydr. Res. 396 (2014) 62).
  • washing of egg yolk powder with diethyl ether, extraction with an aqueous ethanol solution, and subsequent purification using an activated carbon column can also be used (L. Liu et al., Carbohydrate.Res. .452 (2017) 122).
  • the production method (1) of the present disclosure is characterized in that the sugar chain extract derived from chicken eggs is subjected to a treatment to enrich sugar chains having ⁇ 2,6-linked sialic acid at all non-reducing ends. .
  • the sugar chain enriched by the production method (1) of the present disclosure has the following form.
  • enrichment of sugar chains having ⁇ 2,6-linked sialic acids at all non-reducing ends is performed by separation from sugar chains other than the sugar chains.
  • the separation is not particularly limited as long as it can separate substances based on molecular weight, charge, and other chemical properties, but liquid column chromatography is preferably used.
  • the enrichment of sugar chains having ⁇ 2,6-linked sialic acids at all non-reducing ends includes the enrichment of sugar chains having ⁇ 2,6-linked sialic acids at all non-reducing ends. This is carried out by a treatment that includes separation from a sugar chain having an ⁇ 2,3-linked sialic acid at either non-reducing end. A sugar chain that has ⁇ 2,6-linked sialic acid at all non-reducing ends and a sugar chain that has ⁇ 2,3-linked sialic acid at any non-reducing end have a binding mode in the sugar chain at the non-reducing end. The only difference is that the molecular weights are the same.
  • the present inventors have recently discovered that a mixture of both sugar chains can be separated by liquid chromatography using a HILIC column. Therefore, in one embodiment, it is possible to separate a sugar chain having ⁇ 2,6-linked sialic acid at all non-reducing ends from a sugar chain having ⁇ 2,3-linked sialic acid at any non-reducing end. Chromatography using a liquid HILIC column is used.
  • a sugar chain having an ⁇ 2,3-linked sialic acid at any non-reducing end is decomposed before being subjected to a separation process.
  • the decomposition includes, for example, a treatment in which only ⁇ 2,3-linked sialic acid is specifically decomposed using an enzyme, and acid hydrolysis.
  • Enzymes that can be used in the enzyme treatment include, but are not limited to, ⁇ 2,3 sialidase, non-specific sialidase, and the use of sialyltransferases having sialidase activity.
  • a sugar chain having an ⁇ 2,3-linked sialic acid at any non-reducing end is subjected to a treatment before being subjected to a separation treatment.
  • modification include lactonization of ⁇ 2,3-linked sialic acid, as well as introduction of substituents by esterification, thioesterification, amidation, hydrazidation, and the like. Lactonization is known to form a lactone within the molecule when ⁇ 2,3-linked sialic acid activates the carboxylic acid at the 1-position of sialic acid (Glycoconj. J. (2021) 38: 157-166 ), which makes use of its properties.
  • a treatment is performed to derivatize sugar chains having ⁇ 2,6-linked sialic acids at all non-reducing ends.
  • the derivatization include esterification, thioesterification, amidation, and hydrazidation of sialic acid carboxy groups.
  • the derivatized sugar chain may be used as it is, or may include a step of removing substituents.
  • the pretreatment before separation as described above has the advantage that it facilitates the separation of ⁇ 2,6-linked sialic acid and allows the use of a conventional column suitable for mass production.
  • a sugar chain mixture is prepared as follows: (a) Subjecting to liquid chromatography using a HILIC column; (b) subjecting to liquid chromatography after decomposing or denaturing a sugar chain having an ⁇ 2,3-linked sialic acid at any of its non-reducing ends; or (c) subjecting it to liquid chromatography at any of its non-reducing ends;
  • the method is characterized in that after derivatizing a sugar chain having bound sialic acid, the sugar chain is purified by subjecting it to liquid chromatography.
  • the sugar chain mixture in this embodiment includes a sugar chain having ⁇ 2,6-linked sialic acid at all non-reducing ends and a sugar chain having ⁇ 2,3-linked sialic acid at any non-reducing end.
  • a sugar chain having ⁇ 2,6-linked sialic acid at all non-reducing ends includes any sugar chain extract extracted from chicken eggs or egg yolks, mixtures of sugar chains produced by chemical synthesis, and sugar chains cultured by genetic recombination technology. Also includes mixtures.
  • the sugar chain purified by the production method (2) of the present disclosure has the following form.
  • the decomposition includes, for example, a process of specifically preferentially decomposing ⁇ 2,3-linked sialic acid using an enzyme.
  • Enzymes that can be used in the enzyme treatment include, but are not limited to, ⁇ 2,3 sialidase, non-selective sialidase, and the use of sialyltransferases having sialidase activity.
  • a sugar chain having an ⁇ 2,3-linked sialic acid at any non-reducing end is subjected to a treatment before being subjected to a separation treatment.
  • modification include lactonization, esterification, thioesterification, amidation, and hydrazidation of ⁇ 2,3-linked sialic acid.
  • a sugar chain having an ⁇ 2,6-linked sialic acid at the non-reducing end is derivatized before being subjected to the separation process.
  • the derivatization include esterification, thioesterification, amidation, and hydrazidation of sialic acid carboxy groups.
  • the derivatized sugar chain may be used as it is, or may include a step of removing substituents.
  • the production method (1) or (2) of the present disclosure further includes introducing a fat-soluble substituent into the enriched or purified sugar chain.
  • the substituent is typically introduced into the carboxylic acid group of the sialic acid. This allows the sugar chain to be stabilized. Introduction of said substituents to the carboxylic acid group of sialic acid is within the skill of those skilled in the art.
  • methods for introducing a fat-soluble substituent that can be used in the present disclosure include esterification, thioesterification, amidation, hydrazidation, and the like of a sialic acid carboxy group.
  • fat-soluble substituents that can be used in the present disclosure include, but are not limited to, benzyl groups and phenacyl groups.
  • composition produced by the above production method consists essentially of sugar chains having ⁇ 2,6-linked sialic acid at all non-reducing ends.
  • substantially comprises at least 97%, at least 98%, at least 99%, at least 99.1%, at least 99.2% of all sugar chains contained in the composition. , at least 99.3%, at least 99.4%, at least 99.5%, at least 99.6%, at least 99.7%, at least 99.8%, or at least 99.9% of all non-reducing ends It can mean that it is a sugar chain having ⁇ 2,6-linked sialic acid.
  • substantially consists of refers to at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, at least 99% of all sugar chains contained in the composition. .1%, at least 99.2%, at least 99.3%, at least 99.4%, at least 99.5%, at least 99.6%, at least 99.7%, at least 99.8%, or at least 99. 9% of all sugar chains have ⁇ 2,6-linked sialic acids at all non-reducing ends, and 9% of all sugar chains have ⁇ 2,3-linked sialic acids at any non-reducing end.
  • first, second, etc. may be used to describe various elements, it is understood that these elements should not be limited by these terms. These terms are only used to distinguish one element from another; for example, a first element may be referred to as a second element; similarly, a first element may be referred to as a second element; It is possible to write this without departing from the scope of the present invention.
  • sodium azide 21 mg
  • actinase E 43 mg
  • the mixture was allowed to stand for 24 hours while checking that the pH was 7.5 every 12 hours. If a change in pH was confirmed, the pH was adjusted to 7.5 with an aqueous trishydroxymethylaminomethane solution or an aqueous hydrochloric acid solution. After standing for 24 hours, actinase E (21.5 mg) was added to the reaction solution again, and the reaction was allowed to proceed for about 48 hours while checking that the pH was 7.5.
  • the pH was adjusted to 7.5 with an aqueous trishydroxymethylaminomethane solution or an aqueous hydrochloric acid solution. After confirming the completion of the reaction by TLC, the mixture was filtered through Celite. After concentrating the filtrate, it was purified by gel filtration column chromatography (Sephadex G-25, 2.5 x 100 cm, water). Fractions containing the desired disialo-sugar chain compound were collected and concentrated, and then freeze-dried to obtain a mixture of disialo-sugar chain asparagine.
  • the main peak that appeared after about 15 minutes was collected and concentrated.
  • desalting treatment was performed using an ODS column.
  • 13.3 mg of the desired disialo-sugar chain asparagine-Fmoc which is a sugar chain asparagine compound in which the amino group nitrogen of asparagine is protected with an Fmoc group, was obtained.
  • GT-25002 50 mg, MW: 2267.8, 22 ⁇ mol, GlyTech, Inc.
  • protease inhibitor 0.5 mL, cOmplete, Roche, 11836170001, 1 tablet dissolved in water (0.5 mL)
  • 2 mM PMSF/ DMSO 40 ⁇ L
  • Bacterial Alkaline Phosphatase 40 ⁇ L, Roche, 03359123001, 14 Units/ ⁇ L
  • BSA 50 ⁇ L mg, SIGMA, A3159 -50G
  • water (9.4 mL) was added, and 50 ⁇ L was dispensed for HPLC analysis.
  • HPLC analysis conditions ODS: (CAPCELL PAK C18 UG120 250 x 4.6 mm, flow rate 0.70 mL/min, mobile phase A: 25 mM ammonium acetate aqueous solution, B: acetonitrile, gradient A85% ⁇ A75% (20 minutes) ⁇ A5 % (25 minutes) ⁇ A85% (45 minutes))
  • HPLC purification conditions (CAPCELL PAK C18 UG120 250 x 20 mm, flow rate 7.0 mL/min, mobile phase A: 25 mM ammonium acetate aqueous solution, B: acetonitrile, gradient A80% ⁇ A80% (5 minutes) ⁇ A75% (25 minutes) ⁇ A10% (30 minutes) ⁇ A80% (45 minutes))
  • GT-25006 50 mg, MW: 2267.8, 22 ⁇ mol, GlyTech, Inc.
  • protease inhibitor 0.5 mL, cOmplete, Roche, 11836170001, 1 tablet dissolved in water (0.5 mL)
  • 2 mM PMSF/ DMSO 0.4 mL
  • Bacterial Alkaline Phosphatase 0.04 mL, Roche, 03359123001, 14 Unit/ ⁇ L
  • B SA 50mg, SIGMA, A3159-50G
  • water (9.4 mL) were added, and 50 ⁇ L was dispensed for HPLC analysis.
  • HPLC analysis conditions ODS: (CAPCELL PAK C18 UG120 250 x 4.6 mm, flow rate 0.70 mL/min, mobile phase A: 25 mM ammonium acetate aqueous solution, B: acetonitrile, gradient A85% ⁇ A75% (20 minutes) ⁇ A5 % (25 minutes) ⁇ A85% (45 minutes))
  • HPLC purification conditions (CAPCELL PAK C18 UG120 250 x 20 mm, flow rate 7.0 mL/min, mobile phase A: 25 mM ammonium acetate aqueous solution, B: acetonitrile, gradient A80% ⁇ A80% (5 minutes) ⁇ A75% (25 minutes) ⁇ A10% (30 minutes) ⁇ A80% (45 minutes))
  • Bacterial Alkaline Phosphatase (0.3 mL, Roche, 03359123001, 14 Unit/ ⁇ L), ⁇ 2,3-sialyltransferase (500 mg), Cytidine 5 were added to the sugar chain aqueous solution (about 50 mL) after dispensing.
  • HPLC analysis conditions (CAPCELL PAK C18 UG120 250 x 4.6 mm, flow rate 0.70 mL/min, mobile phase A: 25 mM ammonium acetate aqueous solution, B: acetonitrile, isocratic (A: 80%, B: 20%)
  • HPLC purification conditions (SP-300-5-ODS-BIO 250 x 30 mm, flow rate 25 mL/min, mobile phase A: 25 mM ammonium acetate aqueous solution, B: acetonitrile, gradient A95% ⁇ A95% (10 minutes) ⁇ A85% ( 10.1 minutes) ⁇ A82% (40 minutes)
  • Example 1 Analysis of disialo-glycan asparagine-Fmoc
  • Disialo-glycan asparagine-Fmoc (5 mg, 2.0 ⁇ mol) obtained in Reference Example 2 was dissolved in water and the volume was adjusted to 10.0 mL. After a fixed volume of the sugar chain aqueous solution, 10 ⁇ L was injected into HPLC and analyzed. As a result, after the disialoglycosylated asparagine-Fmoc peak (94.9%) eluting around 23 minutes, another peak (3.7%) showing the same mass eluting around 24 minutes was confirmed (Figure 1). .
  • Example 2 Impurity analysis of disialo-glycan asparagine-Fmoc
  • Disialo- glycan asparagine-Fmoc 200 mg obtained in Reference Example 2 was dissolved in water (4 mL), and then diluted with acetonitrile (12 mL). After dilution, the slightly cloudy sugar chain aqueous solution was purified by HPLC and freeze-dried. (HPLC purification conditions) After lyophilization, an impurity purified product (2.4 mg) was obtained by desalting using an ODS carrier (FIG. 3).
  • Example 3 Estimation of structure of impurity The impurity prepared in Example 2 was decomposed with a sialic acid hydrolase.
  • Example 6 Analysis of lot-to-lot differences in disialo-glycan asparagine mixture obtained from chicken eggs
  • disialo-glycan asparagine-Fmoc was prepared from defatted egg yolks of multiple production lots according to Reference Examples 1 and 2.
  • the obtained disialo-sugar chain asparagine-Fmoc (5 mg, 2.0 ⁇ mol) was dissolved in water and the volume was adjusted to 10.0 mL. After a fixed volume of the sugar chain aqueous solution, 10 ⁇ L was injected into HPLC and analyzed.
  • Example 7 Purification of disialo-glycan asparagine-Fmoc
  • Disialo- glycan asparagine-Fmoc 50 mg, 20 ⁇ mol obtained in Reference Example 2 was dissolved in a 75% acetonitrile solution (2.5 mL). The mixture was injected into an HPLC column and purified to avoid contamination with impurities GT-25034 and GT-25035. By desalting the fraction containing GT-25001, GT-25001 (36 mg, 14 ⁇ mol, yield 70%) containing 0.2% of GT-25034 and GT-25035 was obtained.
  • HPLC preparative separation conditions (Asahipak NH2P-90 20F 300 x 20 mm, flow rate 8 mL/min, mobile phase A: aqueous solution containing 5% acetic acid/3% triethylamine, B: acetonitrile solution containing 2% acetic acid, gradient A 25% ⁇ A 25% (5 minutes) ⁇ A65% (5.1-65 minutes)
  • Example 8 Removal of impurities contained in disialoglycosylated asparagine-Fmoc mixture (1)
  • HPLC analysis conditions (Asahipak NH2P-50 4E 5 ⁇ m 250 x 4.6 mm, flow rate 0.70 mL/min, mobile phase A: 5% acetic acid, aqueous solution containing 3% triethylamine, B: acetonitrile containing 2% acetic acid, isocratic ( A: 60%, B: 40%)
  • HPLC preparative separation conditions (SP-300-5-ODS-BIO 5 ⁇ m 250 x 30mm, flow rate 25mL/min, mobile phase A: 25mM ammonium acetate aqueous solution, B: acetonitrile, gradient A90% ⁇ A80% (30 minutes)
  • ESI-MS Calcd for C 103 H 154 N 8 O 66 [M+H] + 2559.89, [M+2H] +2 1280.45, [M+3H] +3 853.96, found 1280.44, 853.95.
  • Example 9 Removal of impurities contained in disialoglycan asparagine-Fmoc (2) (derivatization by lactonization) 500 mM HOBt and 500 mM DIC were added to the disialoglycosylated asparagine-Fmoc (50 mg) obtained in Reference Example 2, and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour. After 1 hour, the reaction solution (10 ⁇ L) was diluted with an acetonitrile/water mixture (7:3, 90 ⁇ L), and 5 ⁇ L was injected for HPLC analysis.
  • HPLC preparative separation conditions (CAPCELL PAK UG120 C18 5 ⁇ m 250 x 4.6 mm, flow rate 0.7 mL/min, developing solvent A: water/trifluoroacetic acid (1000:1), B: acetonitrile/trifluoroacetic acid (1000:1) Gradient A99% ⁇ A70% (30 minutes)
  • HPLC analysis conditions (ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide, 1.7 ⁇ m 150 x 2.1 mm, flow rate 0.35 mL/min, mobile phase A: 50 mM ammonium formate (pH 4.4), B: acetonitrile, gradient A 30% ⁇ A30 % (66 minutes)
  • Example 10 Removal of impurities contained in disialo sugar chain asparagine-Fmoc (3) (derivatization (esterification) with benzyl group) NMP/DMF/water (84:15:1) (250 ⁇ L) was added to the disialoglycosylated asparagine-Fmoc (25 mg) obtained in Reference Example 2, and the mixture was stirred at 40° C. for 1 hour to dissolve. After 1 hour, benzyl bromide (8.6 ⁇ L, 3.6 eq) was added and stirred at 40°C. After 6 hours, 1M sodium carbonate (50 ⁇ L) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours, and then purified using an ODS column.
  • This solution was diluted by adding acetonitrile (358 ⁇ L), and the RFMS-labeled sugar chain was subjected to solid phase extraction using GlycoWorks HILIC ⁇ Elution Plate, and after freeze-drying, it was redissolved in a solvent to prepare a sample solution. As a result of analyzing the sample solution, it was confirmed that impurities derived from ⁇ 2,6/ ⁇ 2,3 and ⁇ 2,3/ ⁇ 2,6 had disappeared (FIG. 13).
  • HPLC preparative separation conditions (CAPCELL PAK UG120 C18 5 ⁇ m 250 x 4.6 mm, flow rate 0.7 mL/min, developing solvent A: water/trifluoroacetic acid (1000:1), B: acetonitrile/trifluoroacetic acid (1000:1) ) Gradient A99% ⁇ A70% (30 minutes)
  • HPLC analysis conditions (ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide, 1.7 ⁇ m 150 x 2.1 mm, flow rate 0.35 mL/min, mobile phase A: 50 mM ammonium formate (pH 4.4), B: acetonitrile, gradient A 25% ⁇ A31 % (66 minutes)

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Abstract

【課題】　本発明は、鶏卵からより高い純度（均一性）の糖鎖含有組成物を製造する方法を提供することを目的とする。　【解決手段】　鶏卵由来の糖鎖抽出物から、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖を高純度で含む組成物を製造する方法が提供される。前記方法は、鶏卵由来の糖鎖抽出物において、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖を富化する処理を行うことを特徴とする。　

Description

シアル酸含有糖鎖の製造方法
　本開示は、シアル酸含有糖鎖の製造方法、より具体的には、鶏卵から、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖を高純度で含む組成物を製造する方法に関する。本開示はまた、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖を高純度で含む組成物に関する。
　糖鎖は、生体内において様々な役割を担っていることが明らかになっており、医薬有効成分の修飾、医薬品の製造のほか、アッセイなどにも用いられている。このような用途に用いられる糖鎖は、品質や精度の観点から高い均一性が求められている。
　これまでに、糖鎖の製造方法の１つとして、鶏卵に存在する糖タンパク質から単離精製する方法が知られている（非特許文献１、特許文献１および２）。
特開２００３－１２８７０３号 特開２０１１－１６２７６２号
　本開示は、鶏卵からより高い純度（均一性）の糖鎖含有組成物を製造する方法を提供することを目的とする。
　鶏卵から製造された糖鎖は、これまでは、その非還元末端に有するシアル酸が全てα２，６－結合型であると考えられてきた。本願発明者らは、今般、従来から一般的に用いられてきたものとは異なる分析を用いることによって、鶏卵から抽出された糖鎖混合物の中に、微量の不純物として、非還元末端の一部または全てにα２，３－結合型のシアル酸を有する糖鎖が含まれていることを見出し、本願発明を完成させるに至った。
　本発明は以下の特徴を包含する：
　（１）鶏卵由来の糖鎖抽出物から、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖を高純度で含む組成物を製造する方法であって、
　前記鶏卵由来の糖鎖抽出物において、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖を富化する処理を行うことを特徴とする、
製造方法。
　（２）（１）に記載の製造方法であって、
　前記糖鎖は、ジシアロ糖鎖である、
製造方法。
　（３）（１）に記載の製造方法であって、
　前記糖鎖は、下記の化合物：
の形態である、
製造方法。
　（４）（１）に記載の製造方法であって、
　前記富化する処理は、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖を、いずれかの非還元末端にα２，３結合型のシアル酸を有する糖鎖と分離することを含む、
製造方法。
　（５）（４）に記載の製造方法であって、
　前記分離は、液体クロマトグラフィーによって行う、
製造方法。
　（６）（１）に記載の製造方法であって、
　前記富化する処理は、いずれかの非還元末端にα２，３結合型のシアル酸を有する糖鎖を酵素処理または酸加水分解による処理することを含む、
製造方法。
　（７）（６）に記載の製造方法であって、
　前記酵素処理は、α２，３シアリダーゼによる処理を含む、
製造方法。
　（８）（１）に記載の製造方法であって、
　前記富化する処理は、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖またはいずれかの非還元末端にα２，３結合型のシアル酸を有する糖鎖の誘導体化を含む、
製造方法。
　（９）（１）に記載の製造方法であって、
　糖鎖に脂溶性の置換基を導入することをさらに含む、
製造方法。
　（１０）（９）に記載の製造方法であって、
　脂溶性の置換基の導入方法は、シアル酸カルボキシ基のエステル化、チオエステル化、アミド化、またはヒドラジド化である、
製造方法。
　（１１）（９）に記載の製造方法であって、
　脂溶性の置換基がシアル酸のカルボン酸に導入されたベンジル基である、
製造方法。
　（１２）（１）から（１１）のいずれかに記載の製造方法によって製造された組成物。
　（１３）全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖から実質的になる組成物。
　（１４）（１３）に記載の組成物であって、
　前記糖鎖は、ジシアロ糖鎖である、
製造方法。
　（１５）（１３）に記載の製造方法であって、
　前記糖鎖は、下記の化合物：
の形態である、
組成物。
　（１６）（１３）に記載の組成物であって、
　全糖鎖のうちの少なくとも９７％は、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖である、
組成物。
　（１７）（１３）に記載の組成物であって、
　全糖鎖のうちの少なくとも９８％は、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖である、
組成物。
　（１８）（１３）に記載の組成物であって、
　全糖鎖のうちの少なくとも９９％は、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖である、
組成物。
　（１９）（１３）に記載の組成物であって、
　全糖鎖のうちの少なくとも９５％は、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖であり、かつ
　いずれかの非還元末端にα２，３結合型のシアル酸を有する糖鎖を全糖鎖の２％未満で含む、
組成物。
　（２０）全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖といずれかの非還元末端にα２，３結合型のシアル酸を有する糖鎖とを含む糖鎖混合物から、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖を高純度で含む組成物を製造する方法であって、
　前記糖鎖混合物を、以下：
（ａ）ＨＩＬＩＣカラムを用いた液体クロマトグラフィーに供すること
（ｂ）非還元末端のいずれかにα２，３結合型のシアル酸を有する糖鎖を分解または変性させた後に、液体クロマトグラフィーに供すること；または
（ｃ）全ての非還元末端のα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖を誘導体化させた後に、液体クロマトグラフィーに供すること
により、前記糖鎖を精製することを特徴とする、
方法。
　（２１）（２０）に記載の製造方法であって、
　前記糖鎖は、ジシアロ糖鎖である、
製造方法。
　（２２）（２０）に記載の製造方法であって、
　前記糖鎖は、下記の化合物：
の形態である、
製造方法。
　（２３）（２０）に記載の製造方法であって、
　前記分解は、いずれかの非還元末端にα２，３結合型のシアル酸を有する糖鎖を酵素処理または酸加水分解による処理することを含む、
製造方法。
　（２４）（２３）に記載の製造方法であって、
　前記酵素処理は、α２，３シアリダーゼによる処理を含む、
製造方法。
　（２５）（２０）に記載の製造方法であって、
　前記変性は、全ての非還元末端のα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖またはいずれかの非還元末端にα２，３結合型のシアル酸を有する糖鎖のいずれかまたは両方を誘導体化することを含む、
製造方法。
　以上述べた本発明の一または複数の特徴を任意に組み合わせた発明も、本発明の範囲に含まれることを、当業者であれば理解するであろう。
　本開示によれば、鶏卵からより高い純度（均一性）の糖鎖含有組成物を製造する方法が提供される。
図１は、ジシアロ糖鎖アスパラギン混合物の分析結果を示す。上図は、参考例２に従って鶏卵から取得、調製されたジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃ混合物をＨＩＬＩＣモードでＨＰＬＣ分析した結果を示す。下図は、ＨＩＬＩＣモードでのＨＰＬＣによって明らかにされたマイナーピーク（３．７％）の質量分析結果（ＥＳＩ－ＭＳ）を示す。 図２は、図１で明らかにされたマイナーピークのＨＰＬＣ分析結果を示す。 図３は、参考例２で得られたジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃ混合物と実施例２で取得された不純物のＨＩＬＩＣモードでのＨＰＬＣ結果（左図）、および当該ＨＰＬＣによって明らかにされた不純物のＯＤＳモードでのＨＰＬＣ結果（右図）を示す。 図４は、実施例２で取得された不純物のＨＰＬＣ分析結果を示す。図中、縦軸は吸光度（ｍＡＵ）、横軸は時間（分）をそれぞれ示す。 図５は、実施例２で取得された不純物の酵素処理（α２，３－シアリダーゼまたはα２，３－２，６－２，８－シアリダーゼ）反応産物のＨＰＬＣ分析結果を示す。 図６は、ＧＴ－２５００１の酵素処理（α２，３－シアリダーゼまたはα２，３－２，６－２，８－シアリダーゼ）反応産物のＨＰＬＣ分析結果を示す。 図７は、ＧＴ－２５０２５の酵素処理（α２，３－シアリダーゼまたはα２，３－２，６－２，８－シアリダーゼ）反応産物のＨＰＬＣ分析結果を示す。 図８は、脱脂卵黄から調製されたジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃ混合物のロット間における不純物量の比較を示す。 図９は、参考例２に従って鶏卵から取得、調製されたジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃ混合物の酵素処理（α２，３－シアリダーゼ）反応産物のＨＰＬＣ結果を示す。 図１０は、参考例２に従って鶏卵から取得、調製されたジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃ混合物の酵素処理（α２，３－シアリダーゼ）反応産物、およびその精製後のＨＰＬＣ結果を示す。 図１１は、参考例２に従って鶏卵から取得、調製されたジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃ混合物の縮合反応後のＨＰＬＣ結果を示す。 図１２は、参考例２に従って鶏卵から取得、調製されたジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃ混合物のＢｎ化処理後、Ｂｎ基及びＦｍｏｃ基を脱保護し、再度Ｆｍｏｃ化を行った反応産物のＨＰＬＣ結果を示す。 図１３は、市販のＳＧＰの酵素処理（α２，３－シアリダーゼ）後、糖鎖を切断および標識化した反応産物のＨＰＬＣ結果を示す。
１．序
　本開示は、一態様において、鶏卵由来の糖鎖抽出物から、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖を高純度で含む組成物を製造する方法（以下、「本開示の製造方法（１）」とも称する）に関する。
　本開示は、別の態様において、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖といずれかの非還元末端にα２，３結合型のシアル酸を有する糖鎖とを含む糖鎖混合物から、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖を高純度で含む組成物を製造する方法（以下、「本開示の製造方法（２）」とも称する）に関する。
　本開示は、さらに別の態様において、本発明の製造方法（１）または（２）に記載の方法によって製造された組成物に関する。
　本開示は、さらに別の態様において、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖から実質的になる組成物に関する。
　本開示において、「鶏卵由来の糖鎖抽出物」とは、鶏卵、好ましくはその卵黄から抽出・分離された特定のシアリル糖鎖からなる画分である。「鶏卵由来の糖鎖抽出物」は、典型的には、ジシアロ糖鎖からなる画分である。
　「鶏卵由来の糖鎖抽出物」に含まれる糖鎖は、遊離の糖鎖、糖アミノ酸、糖ペプチドなど、任意の形態で抽出することができ、当業者は、適宜所望の形態を選択することができる。
　本開示の一実施形態において、「鶏卵由来の糖鎖抽出物」は、主にシアリルグリコペプチド（ＳＧＰ）の形態で取得される。かかる実施形態では、鶏卵からの糖鎖抽出プロセスにおいて、ペプチダーゼによる処理は行われない。
　本開示の別の実施形態において、「鶏卵由来の糖鎖抽出物」は、主に糖鎖アスパラギンの形態で取得される。かかる実施形態では、鶏卵からの糖鎖抽出プロセスにおいて、ペプチダーゼによる処理が行われる。
　本開示において、「鶏卵由来の糖鎖抽出物」は、鶏卵（好ましくは卵黄）からの糖鎖化合物の取得に用いることができる任意の手法によって取得された糖鎖含有組成物を指す。鶏卵（好ましくは卵黄）からの糖鎖化合物の取得に用いることができる手法として、これに限定されるものではないが、例えば、参照によって本願に組み入れる、上記特許文献１および２、非特許文献１などに記載される手法を挙げることができる。
　「鶏卵由来の糖鎖抽出物」は、例示的に、生卵黄に対するフェノール抽出とその後の６本のサイズ排除およびイオン交換カラムを用いた精製プロセスによって取得することができる（Ａ．Ｓｅｋｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ－Ｇｅｎ．Ｓｕｂｊ．１３３５（１９９７）２３．）。上記プロセスにおいて、サイズ排除クロマトグラフィーに代えて、多孔質グラファイトカーボンカラム（ＰＧＣ）カラムクロマトグラフィーを用いることもできる（Ｙ．Ｚｏｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．３１（２０１２）４３６．）。また、上記プロセスは、ジエチルエーテル抽出を介した脂質の除去によって、最適化することができる（Ｂ．Ｓｕｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３９６（２０１４）６２）。
　また、「鶏卵由来の糖鎖抽出物」の取得には、生卵黄アセトン水溶液による抽出と、その後の活性炭カラム精製を用いることもできる。
　また、「鶏卵由来の糖鎖抽出物」の取得には、卵黄粉末のジエチルエーテル洗浄とエタノール水溶液による抽出と、その後の活性炭カラム精製を用いることもできる（Ｌ．Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ．Ｒｅｓ．４５２（２０１７）１２２）。
　また、「鶏卵由来の糖鎖抽出物」の取得には、脱脂卵黄粉末水溶液による抽出と、その後のＯＤＳ精製を用いることもできる（特開２０１１－１６２７６２号）。
２．製造方法（１）
　本開示の製造方法（１）は、前記鶏卵由来の糖鎖抽出物において、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖を富化する処理を行うことを特徴とする。
　一実施形態において、本開示の製造方法（１）によって富化される糖鎖は、下記の形態である。
　本開示の製造方法（１）において、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖の富化は、前記糖鎖以外の糖鎖からの分離によって行われる。前記分離には、分子量、電荷、その他の化学的性質に基づいて物質を分離することができる手法であれば、特に制限されないが、液体カラムクロマトグラフィーを用いることが好ましい。
　本開示の一実施形態において、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖の富化は、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖を、いずれかの非還元末端にα２，３結合型のシアル酸を有する糖鎖と分離することを含む処理によって行われる。全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖と、いずれかの非還元末端にα２，３結合型のシアル酸を有する糖鎖は、非還元末端の糖鎖における結合様式の違いしかなく、分子量も同一である。本願発明者らは、今般、両糖鎖の混合物は、ＨＩＬＩＣカラムを用いた液体クロマトグラフィーによって分離できることを見出した。したがって、一実施形態において、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖と、いずれかの非還元末端にα２，３結合型のシアル酸を有する糖鎖との分離には、液体ＨＩＬＩＣカラムを用いたクロマトグラフィーが用いられる。
　別の実施形態では、分離する処理に供する前に、いずれかの非還元末端にα２，３結合型のシアル酸を有する糖鎖を分解する処理を行う。前記分解には、例えば酵素よって特異的にα２，３結合型のシアル酸のみを分解する処理や酸加水分解が含まれる。前記酵素処理に使用することができる酵素として、これに限定されるものではないが、α２，３シアリダーゼ、非特異的なシアリダーゼ、シアリダーゼ活性を有するシアル酸転移酵素の利用などを挙げることができる。
　別の実施形態では、分離する処理に供する前に、いずれかの非還元末端にα２，３結合型のシアル酸を有する糖鎖を変性する処理を行う。前記変性には、例えばα２，３結合型のシアル酸のラクトン化の他、エステル化、チオエステル化、アミド化、ヒドラジド化などによる置換基の導入などを挙げることができる。ラクトン化は、α２，３結合のシアル酸は、シアル酸１位カルボン酸を活性化させると分子内でラクトンを形成することが知られており（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．（２０２１）　３８：　１５７－１６６）、その性質を利用するものである。
　別の実施形態では、分離する処理に供する前に、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖を誘導体化する処理を行う。前記誘導体化には、例えばシアル酸カルボキシ基のエステル化、チオエステル化、アミド化、ヒドラジド化などを挙げることができる。誘導体化された糖鎖はそのまま利用することもあるし、置換基を除去する工程を含んでも良い。
　上記のような分離前の前処理は、α２，６結合型のシアル酸の分離を容易にし、大量生産に適した通常のカラムを使用することができる点で利点を有する。
３．製造方法（２）
　本開示の製造方法（２）は、糖鎖混合物を、以下：
（ａ）ＨＩＬＩＣカラムを用いた液体クロマトグラフィーに供すること； 
（ｂ）非還元末端のいずれかにα２，３結合型のシアル酸を有する糖鎖を分解または変性させた後に、液体クロマトグラフィーに供すること；または
（ｃ）全ての非還元末端のα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖を誘導体化させた後に、液体クロマトグラフィーに供すること
により、前記糖鎖を精製することを特徴とする。
　当該実施形態における糖鎖混合物は、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖と、いずれかの非還元末端にα２，３結合型のシアル酸を有する糖鎖とを含む糖鎖混合物であれば特に制限されず、鶏卵またはその卵黄から抽出された任意の糖鎖抽出物の他、化学合成によって製造された糖鎖の混合物、遺伝子組み換え技術によって培養された糖鎖の混合物なども含む。
　一実施形態において、本開示の製造方法（２）によって精製される糖鎖は、下記の形態である。
　前記分解には、例えば酵素よって特異的にα２，３結合型のシアル酸を優先的に分解する処理が含まれる。前記酵素処理に使用することができる酵素として、これに限定されるものではないが、α２，３シアリダーゼ、非選択的なシアリダーゼ、シアリダーゼ活性を有するシアル酸転移酵素の利用などを挙げることができる。
　別の実施形態では、分離する処理に供する前に、いずれかの非還元末端にα２，３結合型のシアル酸を有する糖鎖を変性する処理を行う。前記変性には、例えばα２，３結合型のシアル酸のラクトン化、エステル化、チオエステル化、アミド化、ヒドラジド化などを挙げることができる。
　別の実施形態では、分離する処理に供する前に、非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖を誘導体化する処理を行う。前記誘導体化には、例えばシアル酸カルボキシ基のエステル化、チオエステル化、アミド化、ヒドラジド化などを挙げることができる。誘導体化された糖鎖はそのまま利用することもあるし、置換基を除去する工程を含んでも良い。
　本開示の一実施形態において、本開示の製造方法（１）または（２）は、富化または精製された糖鎖に脂溶性の置換基を導入することをさらに含む。前記置換基の導入は、典型的には、シアル酸のカルボン酸基に導入される。これにより糖鎖を安定化させることができる。シアル酸のカルボン酸基への前記置換基の導入は、当業者の技術的範囲内である。
　一実施形態において、本開示に使用することができる脂溶性の置換基の導入方法として、シアル酸カルボキシ基のエステル化、チオエステル化、アミド化、ヒドラジド化などを挙げることができる。
　別の実施形態において、本開示に使用することができる脂溶性の置換基として、これに限定されるものではないが、ベンジル基、フェナシル基を挙げることができる。
４．組成物
　上記の製造方法によって製造された組成物は、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖から実質的になる組成物である。
　本開示の一実施形態において、「実質的になる」は、組成物に含まれる全糖鎖のうち、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％が、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖であることを意味しうる。
　本開示の別の実施形態において、「実質的になる」は、組成物に含まれる全糖鎖のうち、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％が、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖であり、かつ、いずれかの非還元末端にα２，３結合型のシアル酸を有する糖鎖が全糖鎖の２．５％未満、２．４％未満、２．３％未満、２．２％未満、２．１％未満、２．０％未満、１．９％未満、１．８％未満、１．７％未満、１．６％未満、１．５％未満、１．４％未満、１．３％未満、１．２％未満、１．１％未満、１．０％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、または０．１％未満であることを意味しうる。
　なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
　また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
　異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語および科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書および関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、または、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
　第１の、第２のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられる場合があるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第１の要素を第２の要素と記し、同様に、第１の要素は第２の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、しかしながら、本発明はいろいろな形態により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
（参考例１）ジシアロ糖鎖アスパラギン混合物の合成
　エタノール（ＥｔＯＨ、６７ｍＬ）を撹拌しているところに、卵黄１個を割り入れた。約５時間撹拌した後に濾過を行い、さらにＥｔＯＨ（３０ｍＬ）で洗浄を行った。得られた沈殿に、再度ＥｔＯＨ（８３ｍＬ）を加えて１晩撹拌を行った後に濾過を行い、次いで、沈殿をＥｔＯＨ（３０ｍＬ）で洗浄した。次いで、沈殿を乾燥させることで、脱脂卵黄（Ｄｅｌｉｐｉｄａｔｅｄ　Ｅｇｇ　Ｙｏｌｋ）が３ｇ得られた。
　得られた脱脂卵黄を、リン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０、３０ｍＬ）に溶解させた後、アジ化ナトリウム（１０ｍｇ）を加えた。さらに、オリエンターゼＯＮＳ（ＨＢＩ社製、１．０ｇ）を加え、５０℃で約２４時間静置させた。反応の終了を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にて確認した後、反応液をセライト（登録商標）（Ｃｅｌｉｔｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて濾過した。濾液を濃縮後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５、２．５×１００ｃｍ、水）で精製した。目的とする糖が含まれる画分を回収して濃縮し、次いで、凍結乾燥を行った。
　得られた乾燥粉末（約４３０ｍｇ）に、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ・塩化カルシウム緩衝液（ｐＨ＝７．５、４３ｍＬ）、アジ化ナトリウム（２１ｍｇ）を加えて、当該粉末を溶解させた。さらに、アクチナーゼＥ（４３ｍｇ）を加え、１２時間毎にｐＨ＝７．５であることをチェックしながら２４時間静置させた。ｐＨの変化が確認された場合、トリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液、あるいは塩酸水溶液によってｐＨ＝７．５に調整した。２４時間静置後、反応液に再度アクチナーゼＥ（２１．５ｍｇ）を加え、再びｐＨ＝７．５であることをチェックしながら約４８時間反応させた。ｐＨの変化が確認された場合、トリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液、あるいは塩酸水溶液によってｐＨ＝７．５に調整した。反応の終了をＴＬＣで確認した後、セライト濾過を行った。濾液を濃縮後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５、２．５×１００ｃｍ、水）で精製した。目的とするジシアロ糖鎖化合物が含まれる画分を回収して濃縮し、次いで凍結乾燥を行って、ジシアロ糖鎖アスパラギン混合物を得た。
（参考例２）Ｆｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃの合成
　参考例１で得られたジシアロ糖鎖アスパラギン混合物（１２０ｍｇ）を、水（１．５ｍＬ）に溶かし、炭酸水素ナトリウム（２６ｍｇ）を加えた。さらに、Ｆｍｏｃ－ＯＳｕ〔Ｎ－（９－Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ〕（６８ｍｇ）を溶かしたジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、２．５ｍＬ）を加えた後、室温で２時間反応させた。原料消失をＴＬＣで確認後、エバポレーターを用いて濃縮した。残渣に、水（１５ｍＬ）、ジエチルエーテル（２５ｍＬ）を加えて１０分間撹拌した。次いで、ジエチルエーテル層を除いた後、水層をジエチルエーテル（１５ｍＬ）で洗浄し、さらに、濃縮後、凍結乾燥を行った。次いで、得られた残留物を、ＯＤＳカラム（ワコーゲル１００Ｃ１８）を用い、グラジエントをかけて精製した。糖鎖が含まれている画分を回収し、濃縮後、凍結乾燥を行った。得られた残留物をＨＰＬＣ分取カラムにて精製した（ＹＭＣ－Ｐａｃｋ　Ｒ＆Ｄ　ＯＤＳ、Ｄ－ＯＤＳ－５－Ａ、２０×２５０ｍｍ、アセトニトリル／２５ｍＭ　酢酸アンモニウム水溶液＝２０／８０、７．５ｍＬ／ｍｉｎ）。約１５分後に出てくるメインピークを分取後、濃縮した。次いで、ＯＤＳカラムにて脱塩処理を行った。凍結乾燥し、目的とする、Ｆｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギン化合物である、ジシアロ糖鎖アスパラギン‐Ｆｍｏｃが、１３．３ｍｇ得られた。
（参考例３）（１Ｓ，２Ｓ（３））ジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃ（ＧＴ―２５０３４）の調製
　ＧＴ－２５００２（５０ｍｇ、ＭＷ：２２６７．８、２２μｍｏｌ、ＧｌｙＴｅｃｈ，　Ｉｎｃ．）にプロテアーゼ阻害剤（０．５ｍＬ、ｃＯｍｐｌｅｔｅ、Ｒｏｃｈｅ、１１８３６１７０００１、１錠を水（０．５ｍＬ）に溶解）、２ｍＭ　ＰＭＳＦ／ＤＭＳＯ（４０μＬ）、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（４０μＬ、Ｒｏｃｈｅ、０３３５９１２３００１、１４Ｕｎｉｔ／μＬ）、１Ｍ　ＭＯＰＳ緩衝液（１．０ｍＬ、ｐＨ＝７．０、ナカライテスク、２３４４２－８１）、ＢＳＡ（５０ｍｇ、ＳＩＧＭＡ、Ａ３１５９－５０Ｇ）、水（９．４ｍＬ）を加え、ＨＰＬＣ分析用に５０μＬを分注した。分注後の糖鎖水溶液（約１１ｍＬ）に対して、α２、３－ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（２９１ｍＵｎｉｔ、４０Ｕｎｉｔ／ｍＬ、ＪＴ、ｉｓｈ－４６７）、Ｃｙｔｉｄｉｎｅ　５’－ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏ－β－Ｄ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ　ａｃｉd、ｄｉｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ（ＣＭＰ-シアル酸、２４７ｍｇ、サンヨーファイン社製）を加えて３０℃で振盪した。６時間後、反応溶液８μＬを水（３２μＬ）で希釈し、５μＬをインジェクションすることでＨＰＬＣ分析を行った。ＨＰＬＣ分析において１７．５分に溶出する原料ピークの減衰、および１５．５分に溶出する新しいピークの生成を確認した。質量分析により、生成した新しいピークがＧＴ－２５０３４であることを確認し、反応を終了した。反応終了後、ＨＰＬＣによって精製し、濃縮後、ＯＤＳ担体によって脱塩することによって、（１Ｓ、２Ｓ（３））ジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃを収量３７ｍｇ（ＭＷ：２５６０．４、１５μｍｏｌ、収率６６％）で得た。
ＨＰＬＣ分析条件（ＯＤＳ）：（ＣＡＰＣＥＬＬ　ＰＡＫ　Ｃ１８　ＵＧ１２０　２５０×４．６ｍｍ、流速　０．７０ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａ：２５ｍＭ　酢酸アンモニウム水溶液、Ｂ：アセトニトリル、グラジエント　Ａ８５％→Ａ７５％（２０分）→Ａ５％（２５分）→Ａ８５％（４５分））
ＨＰＬＣ精製条件：（ＣＡＰＣＥＬＬ　ＰＡＫ　Ｃ１８　ＵＧ１２０　２５０×２０ｍｍ、流速　７．０ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａ：２５ｍＭ　酢酸アンモニウム水溶液、Ｂ：アセトニトリル、グラジエント　Ａ８０％→Ａ８０％（５分）→Ａ７５％（２５分）→Ａ１０％（３０分）→Ａ８０％（４５分））
（参考例４）（（１Ｓ（３），２Ｓ）ジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃ（ＧＴ―２５０３５）の調製
　ＧＴ－２５００６（５０ｍｇ、ＭＷ：２２６７．８、２２μｍｏｌ、ＧｌｙＴｅｃｈ，　Ｉｎｃ．）にプロテアーゼ阻害剤（０．５ｍＬ、ｃＯｍｐｌｅｔｅ、Ｒｏｃｈｅ、１１８３６１７０００１、１錠を水（０．５ｍＬ）に溶解）、２ｍＭ　ＰＭＳＦ／ＤＭＳＯ（０．０４ｍＬ）、　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（０．０４ｍＬ、Ｒｏｃｈｅ、０３３５９１２３００１、１４Ｕｎｉｔ／μＬ）、１Ｍ　ＭＯＰＳ緩衝液（１．０ｍＬ、ｐＨ＝７．０、ナカライテスク　２３４４２－８１）、ＢＳＡ（５０ｍｇ、ＳＩＧＭＡ、Ａ３１５９－５０Ｇ）、水（９．４ｍＬ）を加え、ＨＰＬＣ分析用に５０μＬを分注した。分注後の糖鎖水溶液（約１１ｍＬ）に対して、α２、３－ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（２９１ｍＵｎｉｔ、４０Ｕｎｉｔ／ｍＬ、ＪＴ、ｉｓｈ－４６７）、Ｃｙｔｉｄｉｎｅ　５’－ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏ－β－Ｄ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ　ａｃｉd、ｄｉｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ（ＣＭＰ-シアル酸、２４７ｍｇ、サンヨーファイン社製）を加えて３０℃で振盪した。７時間後、反応溶液８μＬを水（３２μＬ）で希釈し、５μＬをインジェクションすることでＨＰＬＣ分析（分析条件）を行った。ＨＰＬＣ分析において１７．０分に溶出する原料ピークの減衰、および１４．５分に溶出する新しいピークの生成を確認した。質量分析の結果、ＧＴ―２５０３５であることを確認し、反応を終了した。反応終了後、ＨＰＬＣによって精製し、濃縮後、ＯＤＳ担体によって脱塩することによって、（１Ｓ、２Ｓ（３））ジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃを収量３４．３ｍｇ（ＭＷ：２５６０．３５、１３．４μｍｏｌ、収率６１％）で得た。
ＨＰＬＣ分析条件（ＯＤＳ）：（ＣＡＰＣＥＬＬ　ＰＡＫ　Ｃ１８　ＵＧ１２０　２５０×４．６ｍｍ、流速　０．７０ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａ：２５ｍＭ　酢酸アンモニウム水溶液、Ｂ：アセトニトリル、グラジエント　Ａ８５％→Ａ７５％（２０分）→Ａ５％（２５分）→Ａ８５％（４５分））
ＨＰＬＣ精製条件：（ＣＡＰＣＥＬＬ　ＰＡＫ　Ｃ１８　ＵＧ１２０　２５０×２０ｍｍ、流速　７．０ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａ：２５ｍＭ　酢酸アンモニウム水溶液、Ｂ：アセトニトリル、グラジエント　Ａ８０％→Ａ８０％（５分）→Ａ７５％（２５分）→Ａ１０％（３０分）→Ａ８０％（４５分））
（参考例５）（１Ｓ（３），２Ｓ（３））ジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃ（ＧＴ―２５０２５）の調製
　ＧＴ－２５０２２（５ｇ、ＭＷ：１９７７．８４、２．５ｍｍｏｌ、ＧｌｙＴｅｃｈ，　Ｉｎｃ．）を水（４５ｍＬ）に溶解し、ＭＯＰＳ緩衝液（５．０ｍＬ、ｐＨ＝７．０、ナカライテスク　２３４４２－８１）を加えた後に、ＨＰＬＣ分析用に２００μＬを分注した。分注後の糖鎖水溶液（約５０ｍＬ）に対して、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（０．３ｍＬ、Ｒｏｃｈｅ、０３３５９１２３００１、１４Ｕｎｉｔ／μＬ）、α２，３－ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（５００ｍｇ）、Ｃｙｔｉｄｉｎｅ　５’－ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏ－β－Ｄ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ　ａｃｉd、 ｄｉｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ（ＣＭＰ-シアル酸、５ｇ、サンヨーファイン社製）を加えて４℃で振盪した。２７時間後、反応溶液２μＬを水（１９８μＬ）で希釈し、１０μＬをインジェクションすることでＨＰＬＣ分析を行った。ＨＰＬＣ分析において１２．５分に溶出する原料ピークの減衰、および８．０分に溶出する新しいピークの生成を確認した。質量分析により、生成した新しいピークがＧＴ－２５０２５であることを確認し、反応を終了した。反応終了後、ＨＰＬＣによって精製し、濃縮後、電気透析によって脱塩することによって、（１Ｓ（３）、２Ｓ（３））ジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃを収量５．４ｇ（ＭＷ：２５６０．３５、２．１ｍｍｏｌ、収率８３％）で得た。
ＨＰＬＣ分析条件：（ＣＡＰＣＥＬＬ　ＰＡＫ　Ｃ１８　ＵＧ１２０　２５０×４．６ｍｍ、流速　０．７０ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａ：２５ｍＭ　酢酸アンモニウム水溶液、Ｂ：アセトニトリル、アイソクラティック（Ａ：８０％、Ｂ：２０％）
ＨＰＬＣ精製条件：（ＳＰ－３００―５－ＯＤＳ－ＢＩＯ　２５０×３０ｍｍ、流速　２５ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａ：２５ｍＭ　酢酸アンモニウム水溶液、Ｂ：アセトニトリル、グラジエント　Ａ９５％→Ａ９５％（１０分）→Ａ８５％（１０．１分）→Ａ８２％（４０分）
（実施例１）ジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃの分析
　参考例２で得られたジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃ（５ｍｇ、２．０μｍｏｌ）を水に溶解し、１０．０ｍＬに定容した。定容した糖鎖水溶液後１０μＬをＨＰＬＣにインジェクションして分析した。その結果、２３分付近に溶出するジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃピーク（９４．９％）の後方２４分付近に溶出する同質量を示す別のピーク（３．７％）を確認した（図１）。参考例３、４、５で調製したα２，３-シアル酸を含有するジシアロ糖鎖とＨＰＬＣ上での保持時間を比較した結果、２４分付近に溶出したピークはＧＴ－２５０３４、ＧＴ－２５０３５と一致した（図２）。
ＨＰＬＣ分析条件：（Ａｓａｈｉｐａｋ　ＮＨ２Ｐ－５０　４Ｅ　５μｍ　２５０×４．６ｍｍ、流速　０．７０ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａ：０．５％　リン酸水溶液、Ｂ：０．５％リン酸含有　９０％アセトニトリル水溶液、グラジエント　Ａ２５％→Ａ７５％（２５分）→Ａ９０％（２６分）→Ａ９０％（２８分）→Ａ２５％（２９分）→Ａ２５％（４５分））
２４分付近に溶出したピークのＥＳＩ－ＭＳ：Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ１０３Ｈ１５４Ｎ８Ｏ６６［Ｍ＋Ｈ］＋　２５５９．８９、　［Ｍ＋２Ｈ］＋２　１２８０．４５、［Ｍ＋３Ｈ］＋３　８５３．９６、ｆｏｕｎｄ　１２８０．４４、８５３．９５．
（実施例２）ジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃの不純物解析
　参考例２で得られたジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃ（２００ｍｇ）を水（４ｍＬ）に溶解した後、アセトニトリル（１２ｍＬ）で希釈した。希釈後、薄く白濁した糖鎖水溶液をＨＰＬＣによって精製し、凍結乾燥した。（ＨＰＬＣ精製条件）凍結乾燥後、ＯＤＳ担体にて脱塩することによって、不純物精製品（２．４ｍｇ）を得た（図３）。
　得られた不純物精製品を参考例２、３、４、５によって調製された糖鎖と比較分析した結果、ＧＴ－２５０３４、ＧＴ－２５０３５がそれぞれ一致した（図４）。
ＨＰＬＣ精製条件：（Ａｓａｈｉｐａｋ　ＮＨ２Ｐ－９０　２０Ｆ　３００×２０ｍｍ、流速　７ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａ：０．５％リン酸水溶液、Ｂ：０．５％リン酸含有　９０％アセトニトリル水溶液、グラジエントＡ２５％→Ａ２５％（５分）→Ａ７５％（６０分）
ＨＰＬＣ分析条件（ＯＤＳ（１））：（ＣＡＰＣＥＬＬ　ＰＡＫ　Ｃ１８　ＵＧ１２０　２５０×４．６ｍｍ、流速　０．７０ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａ：２５ｍＭ　酢酸アンモニウム水溶液、Ｂ：アセトニトリル、アイソクラティック（Ａ：８０％、Ｂ：２０％）
ＨＰＬＣ分析条件（ＯＤＳ（２））：（ＣＡＰＣＥＬＬ　ＰＡＫ　Ｃ１８　ＵＧ１２０　２５０×４．６ｍｍ、流速　０．７０ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａ：２５ｍＭ　酢酸アンモニウム水溶液、Ｂ：アセトニトリル、アイソクラティック（Ａ：８２％、Ｂ：１８％）
ＨＰＬＣ分析条件（ＨＩＬＩＣ）：（Ａｓａｈｉｐａｋ　ＮＨ２Ｐ－５０　４Ｅ　５μｍ　２５０×４．６ｍｍ、流速　０．７０ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａ：０．５％リン酸水溶液、Ｂ：０．５％リン酸含有　９０％アセトニトリル水溶液、グラジエント　Ａ２５％→Ａ７５％（２５分）→Ａ９０％（２６分）→Ａ９０％（２８分）→Ａ２５％（２９分）→Ａ２５％（４５分））
（実施例３）不純物の構造推定
　実施例２で調製した不純物をシアル酸加水分解酵素によって分解した。
　水（５μＬ）に溶解した不純物（５０μｇ）に１００ｍＭ　酢酸ナトリウム水溶液（４４μＬ）、α２，３－シアリダーゼ（５ｍＵｎｉｔ、ＴＡＫＡＲＡ、４４５５）を加えて３７℃で１．５時間反応させた。１．５時間後、反応溶液（１０μＬ）を水（９０μＬ）で希釈し、１０μＬをインジェクションすることでＨＰＬＣ分析した。ＨＰＬＣの結果、１０．５分、１１．５分の原料ピークが完全に消失し、１４分に新しいピークの生成を確認した。質量分析の結果、生成した新しいピークは、不純物からシアル酸１残基が切断されたモノシアロ体であることが確認された。
　一方で、同様に水（５μＬ）に溶解した不純物（５０μｇ）に１００ｍＭ　酢酸ナトリウム水溶液（４４μＬ）、α２，３－２，６－２，８－シアリダーゼ（１０ｍＵｎｉｔ、Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ、サンヨーファイン）を加えて３７℃で１．５時間反応させた。１．５時間後、反応溶液（１０μＬ）を水（９０μＬ）で希釈し、１０μＬをインジェクションすることでＨＰＬＣ分析した。ＨＰＬＣ分析の結果、１０．５分、１１．５分の原料ピークが完全に消失し、１７．５分に新しいピークの生成を確認した。質量分析の結果、生成した新しいピークは、不純物からシアル酸２残基が切断されたアシアロ体であることが確認された（図５）。
ＨＰＬＣ分析条件（ＯＤＳ）：（ＣＡＰＣＥＬＬ　ＰＡＫ　Ｃ１８　ＵＧ１２０　２５０×４．６ｍｍ、流速　０．７０ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａ：２５ｍＭ　酢酸アンモニウム水溶液、Ｂ：アセトニトリル　アイソクラティック（Ａ：８０％、Ｂ：２０％）
（実施例４）ＧＴ－２５００１の酵素消化物の分析
　ＧＴ－２５００１をシアル酸加水分解酵素によって分解した。
　水（５μＬ）に溶解したＧＴ－２５００１（５０μｇ）に１００ｍＭ　酢酸ナトリウム水溶液（４４μＬ）、α２、３－シアリダーゼ（５ｍＵｎｉｔ、ＴＡＫＡＲＡ、４４５５）を加えて３７℃で１．５時間反応させた。１．５時間後、反応溶液（１０μＬ）を水（９０μＬ）で希釈し、１０μＬをインジェクションすることでＨＰＬＣ分析した。ＨＰＬＣ分析の結果、１１分の原料ピークから変化がないことが確認された（図６）。
　一方で、同様に水（５μＬ）に溶解したＧＴ－２５００１（５０μｇ）に１００ｍＭ　酢酸ナトリウム水溶液（４４μＬ）、α２，３－２，６－２，８－シアリダーゼ（１０ｍＵｎｉｔ、Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ、サンヨーファイン）を加えて３７℃で反応させた。１．５時間後、反応溶液（１０μＬ）を水（９０μＬ）で希釈し、１０μＬをインジェクションすることでＨＰＬＣ分析した。ＨＰＬＣ分析の結果、１１分の原料ピークが完全に消失し、１７．５分に新しいピークの生成を確認した。質量分析の結果、生成した新しいピークは、ＧＴ－２５００１からシアル酸２残基が切断されたアシアロ体であることが確認された（図６）。
ＨＰＬＣ分析条件（ＯＤＳ）：（ＣＡＰＣＥＬＬ　ＰＡＫ　Ｃ１８　ＵＧ１２０　２５０×４．６ｍｍ、流速　０．７０ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａ：２５ｍＭ　酢酸アンモニウム水溶液、Ｂ：アセトニトリル、アイソクラティック（Ａ：８０％、Ｂ：２０％）
（実施例５）ＧＴ－２５０２５の酵素消化物の分析
　ＧＴ－２５０２５をシアル酸加水分解酵素によって分解した。
　水（５μＬ）に溶解したＧＴ－２５０２５（５０μｇ）に１００ｍＭ　酢酸ナトリウム水溶液（４４μＬ）、α２、３－シアリダーゼ（５ｍＵｎｉｔ、ＴＡＫＡＲＡ、４４５５）を加えて３７℃で１．５時間反応させた。１．５時間後、反応溶液（１０μＬ）を水（９０μＬ）で希釈し、１０μＬをインジェクションすることでＨＰＬＣ分析した。ＨＰＬＣ分析の結果、１１分の原料ピークが完全に消失し、１７．５分に新しいピークの生成を確認した。質量分析の結果、生成した新しいピークは、ＧＴ－２５０２５からシアル酸２残基が切断されたアシアロ体であることが確認された（図７）。
　一方で、同様に水（５μＬ）に溶解したＧＴ－２５０２５（５０μｇ）に１００ｍＭ　酢酸ナトリウム水溶液（４４μＬ）、α２，３－２，６－２，８－シアリダーゼ（１０ｍＵｎｉｔ、Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ、サンヨーファイン）を加えて３７℃で１．５時間反応させた。１．５時間後、反応溶液（１０μＬ）を水（９０μＬ）で希釈し、１０μＬをインジェクションすることでＨＰＬＣ分析した。ＨＰＬＣ分析の結果、１１分の原料ピークが完全に消失し、１７．５分に新しいピークの生成を確認した。質量分析の結果、生成した新しいピークは、ＧＴ－２５０２５からシアル酸２残基が切断されたアシアロ体であることが確認された（図７）。
ＨＰＬＣ分析条件（ＯＤＳ）：（ＣＡＰＣＥＬＬ　ＰＡＫ　Ｃ１８　ＵＧ１２０　２５０×４．６ｍｍ、流速　０．７０ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａ：２５ｍＭ　酢酸アンモニウム水溶液、Ｂ：アセトニトリル、アイソクラティック（Ａ：８０％、Ｂ：２０％）
（実施例６）鶏卵から取得されるジシアロ糖鎖アスパラギン混合物のロット間差の分析
　原料として複数の製造ロットの脱脂卵黄から、ジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃを参考例１、２に従って調製した。得られたジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃ（５ｍｇ、２．０μｍｏｌ）を水に溶解し、１０．０ｍＬに定容した。定容した糖鎖水溶液後１０μＬをＨＰＬＣにインジェクションして分析した。その結果、全てのロットにおいて、不純物であるＧＴ－２５０３４、ＧＴ－２５０３５に相当する２４分付近に溶出するピークを約３．５％から５．０％の範囲で含むことを確認した（図８）。
ＨＰＬＣ分析条件：（Ａｓａｈｉｐａｋ　ＮＨ２Ｐ－５０　４Ｅ　５μｍ　２５０×４．６ｍｍ、流速　０．７０ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａ：０．５％リン酸水溶液、Ｂ：０．５％リン酸含有　９０％アセトニトリル水溶液、グラジエント　Ａ２５％→Ａ７５％（２５分）→Ａ９０％（２６分）→Ａ９０％（２８分）→Ａ２５％（２９分）→Ａ２５％（４５分））
（実施例７）ジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃの精製
　参考例２で得られたジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃ（５０ｍｇ、２０μｍｏｌ）を７５％アセトニトリル溶液（２．５ｍＬ）に溶解した。ＨＰＬＣカラムにインジェクションし、不純物であるＧＴ－２５０３４、ＧＴ－２５０３５が混入しないように精製を行った。ＧＴ－２５００１を含む画分を脱塩することによって、ＧＴ－２５０３４、ＧＴ－２５０３５の混入が０．２％であるＧＴ－２５００１（３６ｍｇ、１４μｍｏｌ、収率７０％）を得た。
ＨＰＬＣ分取条件：（Ａｓａｈｉｐａｋ　ＮＨ２Ｐ－９０　２０Ｆ　３００×２０ｍｍ、流速　８ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａ：５％酢酸／３％トリエチルアミン含有水溶液、Ｂ：２％酢酸酸含有　アセトニトリル溶液、グラジエントＡ２５％→Ａ２５％（５分）→Ａ６５％（５．１～６５分）
（実施例８）ジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃ混合物に含まれる不純物の除去（１）
　参考例２で得られたジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃ（２ｇ）を１００ｍＭ　酢酸ナトリウムおよび１０ｍＭ　塩化カルシウムを含む緩衝液（ｐＨ＝５．５、２０ｍＬ）に溶解し、α２，３－シアリダーゼ（２Ｕｎｉｔ、ＴＡＫＡＲＡ、４４５５）を加えて３７℃で反応させた。１６時間後、反応溶液（１μＬ）を水（５０μＬ）で希釈した後、アセトニトリル（５０μＬ）を加え、２０μＬをインジェクションすることでＨＰＬＣ分析した。ＨＰＬＣ分析の結果、３２分のピーク（ＧＴ－２５００１）は変化することなく、２７分のピーク（ＧＴ－２５０３４、ＧＴ－２５０３５混合物）が完全に消失し、１１分に新しいピークの生成を確認した。質量分析の結果、生成した新しいピークはＧＴ－２５０３４、ＧＴ－２５０３５からシアル酸１残基が切断されたモノシアロ体であることが確認された（図９）。
　反応の終了を確認後、反応液を８０℃で１０分間加熱し、冷却した。得られた酵素処理溶液をＨＰＬＣカラムで精製し、ＧＴ－２５００１を含む画分をＯＤＳ担体で脱塩することによって、ＧＴ－２５０３４、ＧＴ－２５０３５混合物が０．３％以下のＧＴ－２５００１（１．４ｇ、収率７０％）を得た（図１０）。
ＨＰＬＣ分析条件：（Ａｓａｈｉｐａｋ　ＮＨ２Ｐ－５０　４Ｅ　５μｍ　２５０×４．６ｍｍ、流速　０．７０ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａ：５％酢酸、３％トリエチルアミン含有水溶液、Ｂ：２％酢酸含有アセトニトリル、アイソクラティック（Ａ：６０％、Ｂ：４０％）
ＨＰＬＣ分取条件：（ＳＰ－３００－５－ＯＤＳ－ＢＩＯ ５μｍ　２５０×３０ｍｍ、流速　２５ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａ：２５ｍＭ　酢酸アンモニウム水溶液、Ｂ：アセトニトリル、グラジエント　Ａ９０％→Ａ８０％（３０分）
ＥＳＩ－ＭＳ：Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ１０３Ｈ１５４Ｎ８Ｏ６６［Ｍ＋Ｈ］＋　２５５９．８９，［Ｍ＋２Ｈ］＋２　１２８０．４５,［Ｍ＋３Ｈ］＋３　８５３．９６,　ｆｏｕｎｄ　１２８０．４４,　８５３．９５．
（実施例９）ジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃに含まれる不純物の除去（２）（ラクトン化による誘導体化）
　参考例２で得られたジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃ（５０ｍｇ）に５００ｍＭ　ＨＯＢｔ、５００ｍＭ　ＤＩＣを加え、室温で１時間反応させた。１時間後、反応溶液（１０μＬ）をアセトニトリル／水混液（７：３，９０μＬ）で希釈した後、５μＬをインジェクションすることでＨＰＬＣ分析した。ＨＰＬＣ分析の結果、２８分のピーク（ＧＴ－２５００１）は大きく変化することなく、２４分のピーク（ＧＴ－２５０３４、ＧＴ－２５０３５混合物）が完全に消失したことを確認した（図１１）。
ＨＰＬＣ分取条件：（ＣＡＰＣＥＬＬ　ＰＡＫ　ＵＧ１２０　Ｃ１８　５μｍ　２５０×４．６ｍｍ、流速０．７ｍＬ／ｍｉｎ　展開溶媒Ａ：水／トリフルオロ酢酸（１０００：１）、Ｂ：アセトニトリル／トリフルオロ酢酸（１０００：１）　グラジエントＡ９９％→Ａ７０％（３０分）
ＨＰＬＣ分析取条件：（ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　Ｇｌｙｃａｎ　ＢＥＨ　Ａｍｉｄｅ、１．７μｍ　１５０×２．１ｍｍ、流速０．３５ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａ：５０ｍＭ　ギ酸アンモニウム（ｐＨ４．４）、Ｂ：アセトニトリル、グラジエントＡ３０％→Ａ３０％（６６分）
（実施例１０）ジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃに含まれる不純物の除去（３）（ベンジル基による誘導体（エステル）化）
　参考例２で得られたジシアロ糖鎖アスパラギン－Ｆｍｏｃ（２５ｍｇ）にＮＭＰ／ＤＭＦ／水（８４：１５：１）（２５０μＬ）を加え、４０℃で１時間撹拌し、溶解させた。１時間後、ベンジルブロミド（８．６μＬ、３．６当量）を加え、４０℃で撹拌した。６時間後、１Ｍ　炭酸ナトリウム（５０μＬ）を加え、室温で２時間撹拌した後、ＯＤＳカラムで精製した。固相抽出により脱塩した後、凍結乾燥を行い、シアル酸がＢｎ化されたＧＴ－２５００１を２．５ｍｇ得た。不純物除去の確認のため、得られたシアル酸がＢｎ化されたＧＴ－２５００１（１ｍｇ）に１００ｍＭ　水酸化ナトリウム（１０μＬ）を加え、４０℃で１時間反応させ、Ｂｎ基及びＦｍｏｃ基を脱保護した。その後、１Ｍ　炭酸水素ナトリウム（１０μＬ）、アセトニトリル（２０μＬ）、Ｆｍｏｃ－ＯＳｕ（２．４ｍｇ）を加え、再Ｆｍｏｃ化を行った。この溶液を固相抽出し、夾雑物を除去した後、減圧濃縮した。濃縮液に水を加え、試料溶液とした。試料溶液を分析した結果、２４分のピーク（ＧＴ－２５０３４、ＧＴ－２５０３５混合物）が完全に消失したことを確認した（図１２）。
ＨＰＬＣ分取条件：（ＣＡＰＣＥＬＬ　ＰＡＫ　ＵＧ１２０　Ｃ１８　５μｍ　２５０×２０ｍｍ、流速　７．０ｍＬ／ｍｉｎ　展開溶媒Ａ：２５ｍＭ酢酸アンモニウム、Ｂ：アセトニトリル　グラジエントＡ７５％→Ａ７０％（３０分）
ＨＰＬＣ分析取条件：（ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　Ｇｌｙｃａｎ　ＢＥＨ　Ａｍｉｄｅ、１．７μｍ　１５０×２．１ｍｍ、流速０．３５ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａ：５０ｍＭ　ギ酸アンモニウム（ｐＨ４．４）、Ｂ：アセトニトリル、グラジエントＡ３０％→Ａ３０％（６６分）
（実施例１１）ＳＧＰに含まれる不純物の除去（２，３－シアリダーゼによる誘導体化）
　ＳＧＰ（ＴＣＩ社製、Ｓ０５２３、２ｍｇ、１．６μｍｏｌ）を１００ｍＭ　酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に溶かし、α２，３－シアリダーゼ（０．５Ｕ／ｍＵ,ＴＡＫＡＲＡ，４４５５）を２μＬ加え、３７℃で２時間反応し、精製することで、不純物を除去したＳＧＰ（０．６ｍｇ、収率３３％）を得た。不純物を除去したＳＧＰに水を加え２ｍｇ／ｍＬに調整し、ＳＧＰ水溶液とした。ＳＧＰ水溶液（７．５μＬ）に水（１５．３μＬ）、５％　ＲａｐｉＧｅｓｔ溶液（６μＬ）を加え、９０℃で３分間インキュベートした。溶液を室温に戻し、Ｒａｐｉｄ　ＰＮＧａｓｅ（１．２μＬ）を加え、５０℃で３分間インキュベートした。この溶液にＧｌｙｃｏＷｏｒｋｓ　ＲａｐｉＦｌｕｏｒ－ＭＳ標識化試薬（１２μＬ）を加え、室温で５分間静置した。この溶液にアセトニトリル（３５８μＬ）を加え希釈し、ＧｌｙｃｏＷｏｒｋｓ　ＨＩＬＩＣ　μＥｌｕｔｉｏｎ　Ｐｌａｔｅを用いてＲＦＭＳ標識化糖鎖を固相抽出し、凍結乾燥後に溶媒に再溶解して試料溶液とした。試料溶液を分析した結果、α２，６／α２，３及びα２，３／α２，６に由来する不純物の消失を確認した（図１３）。
ＨＰＬＣ分取取条件：（ＣＡＰＣＥＬＬ　ＰＡＫ　ＵＧ１２０　Ｃ１８　５μｍ　２５０×４．６ｍｍ、流速０．７ｍＬ／ｍｉｎ　展開溶媒Ａ：水／トリフルオロ酢酸（１０００：１）、Ｂ：アセトニトリル／トリフルオロ酢酸（１０００：１）　グラジエントＡ９９％→Ａ７０％（３０分）
ＨＰＬＣ分析取条件：（ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　Ｇｌｙｃａｎ　ＢＥＨ　Ａｍｉｄｅ、１．７μｍ　１５０×２．１ｍｍ、流速０．３５ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａ：５０ｍＭ　ギ酸アンモニウム（ｐＨ４．４）、Ｂ：アセトニトリル、グラジエントＡ２５％→Ａ３１％（６６分）

Claims (25)

  1. 　鶏卵由来の糖鎖抽出物から、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖を高純度で含む組成物を製造する方法であって、
    　前記鶏卵由来の糖鎖抽出物において、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖を富化する処理を行うことを特徴とする、
    製造方法。
  2. 　請求項１に記載の製造方法であって、
    　前記糖鎖は、ジシアロ糖鎖である、
    製造方法。
  3. 　請求項１に記載の製造方法であって、
    　前記糖鎖は、下記の化合物：
    の形態である、
    製造方法。
  4. 　請求項１に記載の製造方法であって、
    　前記富化する処理は、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖を、いずれかの非還元末端にα２，３結合型のシアル酸を有する糖鎖と分離することを含む、
    製造方法。
  5. 　請求項４に記載の製造方法であって、
    　前記分離は、液体クロマトグラフィーによって行う、
    製造方法。
  6. 　請求項１に記載の製造方法であって、
    　前記富化する処理は、いずれかの非還元末端にα２，３結合型のシアル酸を有する糖鎖を酵素処理または酸加水分解による処理することを含む、
    製造方法。
  7. 　請求項６に記載の製造方法であって、
    　前記酵素処理は、α２，３シアリダーゼによる処理を含む、
    製造方法。
  8. 　請求項１に記載の製造方法であって、
    　前記富化する処理は、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖またはいずれかの非還元末端にα２，３結合型のシアル酸を有する糖鎖の誘導体化を含む、
    製造方法。
  9. 　請求項１に記載の製造方法であって、
    　糖鎖に脂溶性の置換基を導入することをさらに含む、
    製造方法。
  10. 　請求項９に記載の製造方法であって、
    　脂溶性の置換基の導入方法は、シアル酸カルボキシ基のエステル化、チオエステル化、アミド化、またはヒドラジド化である、
    製造方法。
  11. 　請求項９に記載の製造方法であって、
    　脂溶性の置換基がシアル酸のカルボン酸に導入されたベンジル基である、
    製造方法。
  12. 　請求項１から１１のいずれか１項に記載の製造方法によって製造された組成物。
  13. 　全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖から実質的になる組成物。
  14. 　請求項１３に記載の組成物であって、
    　前記糖鎖は、ジシアロ糖鎖である、
    製造方法。
  15. 　請求項１３に記載の製造方法であって、
    　前記糖鎖は、下記の化合物：
    の形態である、
    組成物。
  16. 　請求項１３に記載の組成物であって、
    　全糖鎖のうちの少なくとも９７％は、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖である、
    組成物。
  17. 　請求項１３に記載の組成物であって、
    　全糖鎖のうちの少なくとも９８％は、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖である、
    組成物。
  18. 　請求項１３に記載の組成物であって、
    　全糖鎖のうちの少なくとも９９％は、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖である、
    組成物。
  19. 　請求項１３に記載の組成物であって、
    　全糖鎖のうちの少なくとも９５％は、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖であり、かつ
    　いずれかの非還元末端にα２，３結合型のシアル酸を有する糖鎖を全糖鎖の２％未満で含む、
    組成物。
  20. 　全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖といずれかの非還元末端にα２，３結合型のシアル酸を有する糖鎖とを含む糖鎖混合物から、全ての非還元末端にα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖を高純度で含む組成物を製造する方法であって、
    　前記糖鎖混合物を、以下：
    （ａ）ＨＩＬＩＣカラムを用いた液体クロマトグラフィーに供すること
    （ｂ）非還元末端のいずれかにα２，３結合型のシアル酸を有する糖鎖を分解または変性させた後に、液体クロマトグラフィーに供すること；または
    （ｃ）全ての非還元末端のα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖を誘導体化させた後に、液体クロマトグラフィーに供すること
    により、前記糖鎖を精製することを特徴とする、
    方法。
  21. 　請求項２０に記載の製造方法であって、
    　前記糖鎖は、ジシアロ糖鎖である、
    製造方法。
  22. 　請求項２０に記載の製造方法であって、
    　前記糖鎖は、下記の化合物：
    の形態である、
    製造方法。
  23. 　請求項２０に記載の製造方法であって、
    　前記分解は、いずれかの非還元末端にα２，３結合型のシアル酸を有する糖鎖を酵素処理または酸加水分解による処理することを含む、
    製造方法。
  24. 　請求項２３に記載の製造方法であって、
    　前記酵素処理は、α２，３シアリダーゼによる処理を含む、
    製造方法。
  25. 　請求項２０に記載の製造方法であって、
    　前記変性は、全ての非還元末端のα２，６結合型のシアル酸を有する糖鎖またはいずれかの非還元末端にα２，３結合型のシアル酸を有する糖鎖のいずれかまたは両方を誘導体化することを含む、
    製造方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2003128703A (ja) * 2001-06-19 2003-05-08 Yasuhiro Kajiwara 糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003128703A (ja) * 2001-06-19 2003-05-08 Yasuhiro Kajiwara 糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
K. MARINO, J. A. LANE, J. L. ABRAHAMS, W. B. STRUWE, D. J. HARVEY, M. MAROTTA, R. M. HICKEY, P. M. RUDD: "Method for milk oligosaccharide profiling by 2-aminobenzamide labeling and hydrophilic interaction chromatography", GLYCOBIOLOGY, OXFORD UNIVERSITY PRESS, vol. 21, no. 10, 1 October 2011 (2011-10-01), pages 1317 - 1330, XP055116105, ISSN: 09596658, DOI: 10.1093/glycob/cwr067 *
LIU LIN; PRUDDEN ANTHONY R.; BOSMAN GERLOF P.; BOONS GEERT-JAN: "Improved isolation and characterization procedure of sialylglycopeptide from egg yolk powder", CARBOHYDRATE RESEARCH, PERGAMON, GB, vol. 452, 1 January 1900 (1900-01-01), GB , pages 122 - 128, XP085274839, ISSN: 0008-6215, DOI: 10.1016/j.carres.2017.10.001 *
MANCERA-ARTEU MONTSERRAT; GIMENEZ ESTELA; BARBOSA JOSé; SANZ-NEBOT VICTORIA: "Identification and characterization of isomericN-glycans of human alfa-acid-glycoprotein by stable isotope labelling and ZIC-HILIC-MS in combination with exoglycosidase digestion", ANALYTICA CHIMICA ACTA, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 940, 9 August 2016 (2016-08-09), AMSTERDAM, NL , pages 92 - 103, XP029737718, ISSN: 0003-2670, DOI: 10.1016/j.aca.2016.07.043 *
PONGRACZ TAMAS; VERHOEVEN ASWIN; WUHRER MANFRED; DE HAAN NOORTJE: "The structure and role of lactone intermediates in linkage-specific sialic acid derivatization reactions", GLYCOCONJUGATE JOURNAL, CHAPMAN & HALL, BOSTON, vol. 38, no. 2, 18 January 2021 (2021-01-18), Boston , pages 157 - 166, XP037433114, ISSN: 0282-0080, DOI: 10.1007/s10719-020-09971-7 *
TAKEMAE, YOSHIHIRO ET AL.: "Changes in receptor binding of swine influenza virus by egg culture", NIPPON JUISHIKAI ZASSHI - JOURNAL OF THE VETERINARY MEDICALASSOCIATION, NIPPON JUISHIKAI, TOKYO,, JP, vol. 64, 1 January 2011 (2011-01-01), JP , pages 682 - 684, XP009550439, ISSN: 0446-6454 *

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