CN117242187A - 制造糖肽的方法 - Google Patents

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CN117242187A CN202280032160.7A CN202280032160A CN117242187A CN 117242187 A CN117242187 A CN 117242187A CN 202280032160 A CN202280032160 A CN 202280032160A CN 117242187 A CN117242187 A CN 117242187A
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Abstract

本发明涉及制造糖肽的方法，其包括对鸟类抗体的Fc区域进行改性的工序；以及用蛋白质分解酶将经改性的Fc区域分解的工序，糖肽为糖二肽或糖三肽。

Description

制造糖肽的方法
技术领域
本发明涉及制造糖肽的方法。
背景技术
糖链是单糖以枝状连结的生物体高分子，由于作为基本键合单元的单糖具有多个键合点，因此其结构复杂。
生物体内的糖链存在于蛋白质、细胞表面，参与蛋白质、细胞的识别、信息传递。
其中，作为抗体药物的有效成分的抗体通常具有糖链结构，但是其差异会导致副作用的出现、药效的差异。因此，可期待实现糖链结构的均一化将会带来副作用的抑制、药效的提高及血浆半衰期的延长这样的抗体药物的品质、功能提高。
另外，已知糖链结构的异常与癌症等疾病相关，并且已经尝试利用糖链来阐明疾病的机理。另外，在阐明疾病的机理的同时，也尝试了在诊断药中的应用。
通过有机合成能够得到具有均一性的糖链。然而，为了根据糖链结构的多样性而立体选择性且位置选择性地进行有机合成，需要多段反应，并且能够合成的量也有限。
专利文献1中，作为能够将天然糖链导入特定基质的衍生物，公开了将天然来源的糖天冬酰胺进行Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)化而得到的Fmoc糖天冬酰胺、以及衍生自Fmoc糖天冬酰胺的活性酯衍生物。
非专利文献1公开了，能够提供使用了Fmoc-Asn高甘露糖糖链型寡糖的具有单一寡糖的糖蛋白的高效制造方法。实际上，还公开了制备保持单一寡糖的促红细胞生成素(22-28位)和白介素13(28-43位)。
另外，非专利文献2公开了从蛋黄中的IgY制备G1M9的天冬酰胺键合型糖链的方法，所述糖链是经单糖基化的高甘露糖糖链型的聚糖。
此外，专利文献2中公开了从脱脂蛋黄中将糖数11-5的复合型糖链纯化的方法。
另外，专利文献3-4中公开了11糖唾液酸寡糖肽的制造方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平11-255807号公报
专利文献2：日本专利第4237752号
专利文献3：日本专利第5680576号
专利文献4：日本专利第5566226号
非专利文献
非专利文献1：Carbohydrate Research(2012)vol.364,pp 41-48非专利文献2：Carbyhydrate Research(2015)vol 411,pp37-41
发明内容
发明所要解决的课题
但是，在上述现有技术中，关于高甘露糖型糖链，仅实现了仅键合天冬酰胺的糖天冬酰胺的制造。另外，关于与糖链键合的肽，提出了Asn-X-Thr/Ser(X为脯氨酸以外的任意氨基酸)的序列，但没有分离包含该序列的高甘露糖型糖肽的例子。
本申请所要解决的课题在于提供新的制造糖肽的方法。
用于解决课题的手段
本申请的发明人进行深入研究，结果发现从鸟类抗体的Fc区域获得糖肽的新的制造糖肽的方法，从而完成了本发明。
即，本发明如下所述。
[1]制造糖肽的方法，其包括：
对鸟类抗体的Fc区域进行改性的工序；以及
用蛋白质分解酶将经改性的Fc区域分解的工序，
糖肽为糖二肽或糖三肽。
[2]如[1]所述的方法，其中，糖肽的糖链由8～12糖构成。
[3]如[1]或[2]所述的方法，其中，在对鸟类抗体的Fc区域进行改性的工序中，Fc区域通过热或有机溶剂而改性。
[4]如[1]至[3]中任一项所述的方法，其中，鸟类抗体为IgY。
[5]制造糖链或糖天冬酰胺的方法，其还包括用分解酶将由[1]至[4]中任一项所述的方法得到的糖二肽或糖三肽分解的工序。
[6]对糖肽进行分离纯化的方法，其包括：
对鸟类抗体的Fc区域进行改性的工序；以及
用蛋白质分解酶将经改性的Fc区域分解的工序，
糖肽为糖二肽或糖三肽。
[7]糖二肽或糖三肽，其为来源于鸟类抗体的Fc区域的糖二肽或糖三肽，
具有由8～12糖构成的糖链。
[8]N-键合型糖三肽，其为来源于鸟类抗体的Fc区域的糖三肽，
具有由8～12糖构成的糖链，
三肽具有Asn-Gly-Thr/Ser，糖链与Asn键合(此处，Asn、Thr及Ser的1个以上的残基可以被保护。)。
[9]N-键合型糖二肽，其为来源于鸟类抗体的Fc区域的糖二肽，
具有由8～12糖构成的糖链，
二肽具有Asn-Gly，糖链与Asn键合(此处，Asn及Gly的1个以上的残基可以被保护。)。
发明的效果
根据本发明，能够提供从鸟类抗体的Fc区域获得糖肽的新的制造糖肽的方法。另外，通过本发明，能够提供新型糖二肽及糖三肽。
附图说明
[图1]示出质谱中的、糖数为8～12的糖三肽衍生物组的质量峰。
[图2]示出质谱中的、糖数为8～12的糖二肽衍生物组的质量峰。
[图3]示出经分取的糖数不同的糖三肽衍生物的质谱结果。
[图4]示出糖数为12的糖三肽衍生物(Glc1Man9GlcNAc2-Asn(Fmoc)-Gly-Thr)的1H-NMR数据。
[图5]示出糖数为12的糖二肽衍生物(Glc1Man9GlcNAc2-Asn(Fmoc)-Gly)的质谱结果。
[图6]示出糖数为12的糖二肽衍生物(Glc1Man9GlcNAc2-Asn(Fmoc)-Gly)的1H-NMR数据。
[图7]示出质谱中的、糖数为12的糖天冬酰胺衍生物(Glc1Man9GlcNAc2-Asn-Fmoc)的质量峰。
[图8]示出质谱中的、糖数为12的糖链(Glc1Man9GlcNAc2)的质量峰。
[图9]示出质谱中的、糖数为11的糖链的质量峰。
[图10]示出质谱中的、确认了经分离纯化的糖数11的糖天冬酰胺衍生物的糖链未被切断的结果。
具体实施方式
以下，对用于实施本发明的方式详细地进行说明。需要说明的是，本发明不限于以下的实施方式，可以在其主旨的范围内进行各种变形而实施。
本发明中的制造糖肽的方法包括：
对鸟类抗体的Fc区域进行改性的工序；以及
用蛋白质分解酶将经改性的Fc区域分解的工序。
由本发明的制造糖肽的方法得到的糖肽为糖二肽或糖三肽。
(糖二肽或糖三肽)
由本发明制造的糖二肽及糖三肽为来源于鸟类抗体的Fc区域的糖肽，因此作为其结构，具有存在于鸟类抗体的Fc区域的结构。
即，利用本发明的制造方法，能够得到存在于鸟类抗体的Fc区域的糖链作为糖二肽或糖三肽。
糖二肽优选为来源于鸟类抗体的Fc区域的糖二肽，糖三肽优选为来源于鸟类抗体的Fc区域的糖三肽。
糖二肽及糖三肽的肽部分分别为包含鸟类抗体的Fc区域中的糖链所键合的氨基酸的二肽或三肽。
因此，由本发明制造的糖二肽及糖三肽均是将鸟类抗体的Fc区域中存在的糖链作为糖二肽或糖三肽切出而得的，因此其结构成为来源于鸟类抗体的Fc区域中存在的糖链、以及由糖链所键合的氨基酸和该氨基酸所键合的氨基酸构成的肽序列的结构。
糖二肽或糖三肽的糖链部分的结构只要是鸟类抗体的Fc区域中存在的糖链部分的结构即可，没有特别限定，优选为由8～12糖构成的糖链。
糖二肽优选为来源于鸟类抗体的Fc区域的糖二肽，且具有由8～12糖构成的糖链，糖三肽优选为来源于鸟类抗体的Fc区域的糖三肽，且具有由8～12糖构成的糖链。
作为由8～12糖构成的糖链，可以是作为高甘露糖型糖链已知的糖链。
作为高甘露糖型糖链，可举出由以下的示意图表示的糖链。
[化学式1]
作为8～12糖的糖链结构，示出14种结构。
2个□(四角)所键合的右侧的连接键为与肽的连接键，2个□是指N-乙酰葡糖胺，右端存在的N-乙酰葡糖胺形成所谓的糖链的还原末端。
以下，以12糖的情况为例进行说明。
从上起称为C-臂、B-臂、A-臂，A-臂的还原末端为葡萄糖。
A-臂的非还原末端的葡萄糖、和还原末端的2个N-乙酰葡糖胺以外的糖均为甘露糖。
各糖间的键只要是来源于鸟类抗体的Fc区域的结构中存在的键即可，没有特别限定，可以为α键、β键。糖链所键合的羟基的位置也只要是来源于鸟类抗体的Fc区域的结构中存在的位置即可，没有特别限定，可以为1→2键、1→3键、1→4键、1→6键。
N-乙酰葡糖胺、葡萄糖、甘露糖各自通常为D糖。
作为由8～12糖构成的糖链，优选为具有以下具体示出的结构的糖链。需要说明的是，方便起见，将还原末端的N-乙酰葡糖胺所键合的氨基酸记载为Asn(天冬酰胺)。以下作为具体例记载的化合物是糖数为8-12的糖天冬酰胺。
也将N-乙酰葡糖胺与Asn键合的糖肽称为N-键合型糖肽，根据糖链所键合的肽的氨基酸数，也分别称为N-键合型糖三肽、N-键合型糖二肽、N键合型糖天冬酰胺。
12糖的情况下，糖链可以具有以下的结构。
以下的结构中，例如，α1→2是指非还原末端侧的甘露糖在1位与还原末端侧的甘露糖的2位羟基进行α键合。另外，β1→N是指还原末端的N-乙酰葡糖胺在1位与糖肽的肽中的Asn的N进行β键合。在以下所示的8-11糖的情况下的糖链中也同样。
Glc1Man9GlcNAc2
[化学式2]
11糖的情况下，糖链可以具有以下的结构。Glc1Man8GlcNAc2
[化学式3]
Man9GlcNAc2
[化学式4]
10糖的情况下，糖链可以具有以下的结构。Glc1Man7GlcNAc2
[化学式5]
Man8GlcNAc2
[化学式6]
9糖的情况下，糖链可以具有以下的结构。
Man7GlcNac2
[化学式7]
8糖的情况下，糖链可以具有以下的结构。
Man6GlcNAc2
[化学式8]
糖二肽或糖三肽的肽部分的结构只要是鸟类抗体的Fc区域中存在的肽部分的结构即可，没有特别限定，优选为含有Asn的二肽或三肽。
二肽中的Asn可以为N末端氨基酸，也可以为C末端氨基酸，优选为N末端氨基酸。
二肽中的另一氨基酸只要是来源于鸟类抗体的Fc区域中存在的肽部分的结构的氨基酸即可，没有特别限定，优选为Gly(甘氨酸)。
Asn和Gly各自可以为L-氨基酸，也可以为D-氨基酸，优选为L-氨基酸，二肽优选具有来源于H2N-Asn-Gly-COOH这样的二肽的结构。此处，H2N-为Asn中存在的氨基，-COOH为Gly中存在的羧基。
三肽中的Asn可以为N末端氨基酸，也可以为C末端氨基酸，还可以为位于中央的氨基酸，优选为N末端氨基酸。
在N末端具有Asn的三肽优选具有来源于上述H2N-Asn-Gly-COOH这样的二肽的结构，该情况下，C末端的氨基酸没有特别限定，作为鸟类抗体的Fc区域中存在的肽部分的结构，优选为Thr(苏氨酸)、或Ser(丝氨酸)。
Asn和Gly以及Thr或Ser各自可以为L-氨基酸，也可以为D-氨基酸，优选为L-氨基酸，三肽优选具有来源于H2N-Asn-Gly-Thr/Ser-COOH这样的三肽的结构。此处，H2N-为Asn中存在的氨基，-COOH为Thr或Ser中存在的羧基。
糖三肽优选为N-键合型糖三肽，其为来源于鸟类抗体的Fc区域的糖三肽，具有由8～12糖构成的糖链，三肽具有Asn-Gly-Thr/Ser，糖链与Asn键合。
糖三肽中，Asn、Thr及Ser的1个以上的残基可以被保护。
糖二肽优选为N-键合型糖二肽，其为来源于鸟类抗体的Fc区域的糖二肽，具有由8～12糖构成的糖链，二肽具有Asn-Gly，糖链与Asn键合。
糖二肽中，Asn及Gly的1个以上的残基可以被保护。
Asn、Thr及Ser的1个以上的残基被保护的情况、Asn及Gly的1个以上的残基被保护的情况下的被保护是指利用以往已知的氨基酸的保护基来保护各氨基酸。Asn、Gly、Thr及Ser的1个以上的残基被保护的情况下，也称为糖天冬酰胺衍生物、糖二肽衍生物、糖三肽衍生物，可以分别包含在本发明的糖天冬酰胺、糖二肽、糖三肽中。
Asn为L-Asn的情况下，具有以下的结构，但由于键合有糖链，因此糖链键合在存在于氨基酸侧链的CONH2基上，例如，Asn为N末端氨基酸的情况下，以COOH基与Gly的NH2基形成酰胺键，从而形成二肽。
[化学式9]
Asn为存在于N末端的氨基酸的情况下，剩下的NH2基能够以游离的状态存在，因此该氨基可以被保护。
Gly具有以下的结构，但在Gly为存在于C末端的氨基酸的情况下，以NH2基与Asn的COOH基形成酰胺键。
[化学式10]
因此，剩下的COOH基能够以游离的状态存在，因此该羧基可以被保护。
Ser或Thr分别为L-Ser或L-Thr的情况下，具有以下的结构，但在Ser或Thr为存在于C末端的氨基酸的情况下，以NH2基与Gly的COOH基形成酰胺键。
[化学式11]
Ser或Thr为存在于C末端的氨基酸的情况下，剩下的COOH基能够以游离的状态存在，另外，存在OH基，因此该羧基及羟基可以被保护。
作为氨基、羧基、羟基的保护基，各自可以利用已知的保护基，例如，选择Greene’sProtective Groups in Organic Synthesis中记载的保护基即可。
作为氨基的保护基的例子，可举出Fmoc基、叔丁氧基羰基(Boc)基、苄氧基羰基(Cbz或Z)基、对甲氧基苄氧基羰基(Z(OMe)或pMZ)基、2-(对联苯基)异丙氧基羰基(Bpoc)基等。
作为羧基的保护基的例子，可举出甲基酯基、乙基酯基、苄基酯基、叔丁基酯基等。甲基酯基、乙基酯基、苄基酯基、叔丁基酯基分别为由甲基醇、乙基醇、苄基醇、叔丁基醇与羧基形成酯所带来的保护基。
作为羟基的保护基的例子，可举出乙酰(Ac)基、苯甲酰(Bz)基、甲氧基甲(MOM)基、苄(Bn)基、叔丁(t-Bu)基等。作为羟基的保护基，可以是三甲基甲硅烷(TMS)基、三乙基甲硅烷(TES)基、叔丁基二甲基甲硅烷(TBS)基、三异丙基甲硅烷(TIPS)基、叔丁基二苯基甲硅烷(TBDPS)基等作为甲硅烷基系保护基已知的基团。
糖二肽或糖三肽的氨基、羧基可以以游离的状态(NH2或COOH)存在，也可以作为NH3 +或COO-存在，还可以为它们的组合。
另外，糖二肽或糖三肽的氨基、羧基可以为盐的状态。此处，盐的情况下，没有特别限定，例如，可以为盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐等无机酸盐、乙酸盐、丙酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、三氟乙酸盐等有机酸盐等，例如，可以为钠盐、钾盐、钙盐、镁盐等碱金属盐或者碱土金属盐。
本发明中的制造糖肽的方法包括对鸟类抗体的Fc区域进行改性的工序。
所谓鸟类抗体的Fc区域，是指构成重链的区域，是具有引发抗体与抗原结合后的反应的效应物(effector)功能的区域。
本发明中，由于制造来源于鸟类抗体的Fc区域的糖肽，因此只要能够从Fc区域切出糖肽，则可以没有特别限定地利用Fc区域。
即，本发明中被改性的Fc区域可以为Fc区域的全部区域中的全部，也可以是其一部分。另外，只要能够使Fc区域改性而获得糖肽，则Fc区域可以使用Fc片段，也可以不将Fc区域制成片段，而是由鸟类抗体直接制造糖肽。
对鸟类抗体的Fc区域进行改性的工序可以是对鸟类抗体的Fc片段进行改性的工序，也可以是对未从鸟类抗体进行片段化的Fc区域、即鸟类抗体自身进行改性的工序。
Fc片段没有特别限定，只要利用以往已知的方法获得鸟类抗体，并形成其Fc片段即可。
鸟类抗体没有特别限定，只要是来源于鸟类的抗体即可，抗体的所有氨基酸序列来源于鸟类。
作为鸟类，可举出鸡、鹅、鸭等，优选为鸡。
鸟类抗体的同种型(isoform)也没有特别限定，可举出IgY、IgA、IgM，优选为IgY。
鸟类抗体可以利用以往已知的方法从鸟类的蛋、血液中获得。其中，从鸡蛋中能够获得许多IgY，因此也可以利用来源于鸡蛋的抗体。
鸟类抗体的Fc片段可通过对作为鸟类抗体的IgY进行例如木瓜蛋白酶分解而得到。
(Fc区域的改性)
所谓对鸟类抗体的Fc区域进行改性的方法，是指使Fc区域的立体结构变化的方法。通过改变Fc区域的立体结构，使其变化为与蛋白质分解酶的反应性，从而在与蛋白质分解酶反应时得到不同的氨基酸数的糖肽。
作为对鸟类抗体的Fc区域进行改性的方法，只要可使Fc区域的立体结构变化即可，没有特别限定，例如，可举出利用热或有机溶剂进行改性的方法。
在进行热处理来对Fc区域进行改性的情况下，从基于蛋白质分解酶的反应性的观点考虑，优选在以下这样的反应条件下实施。
反应温度没有特别限定，优选为70℃-100℃的范围内的温度，更优选为75℃-95℃的范围内的温度，进一步优选为80℃-90℃的范围内的温度。
反应时间没有特别限定，优选为1分钟-20分钟的范围内的时间，更优选为5分钟-10分钟的范围内的时间。
作为进行热处理时的包含鸟类抗体的Fc区域的溶液的溶剂，例如，优选为水，可以为缓冲液，也可以为水溶液。
在进行有机溶剂处理来对Fc区域进行改性的情况下，作为所使用的有机溶剂，没有特别限定，可举出丙酮、甲醇、乙醇、2-丙醇、氯仿、乙酸乙酯等。
作为有机溶剂，可以使用1种溶剂，也可以使用2种以上溶剂的混合溶剂。
另外，关于水溶性的有机溶剂，可以利用包含有机溶剂的水溶液对鸟类抗体的Fc区域进行改性。
反应时间没有特别限定，优选为1小时-24小时的范围内的时间，更优选为3小时-12小时的范围内的时间。
反应温度没有特别限定，例如，可以为室温。
在有机溶剂处理中，可以使鸟类抗体的Fc区域直接浸渍在有机溶剂中或直接与有机溶剂接触来处理，但也可以对包含鸟类抗体的Fc区域的溶液添加有机溶剂，也可以对有机溶剂添加包含鸟类抗体的Fc区域的溶液。
(经改性的Fc区域的分解)
作为将经改性的鸟类抗体的Fc区域分解的方法中使用的蛋白质分解酶，可以使用链丝菌蛋白酶E(Actinase E)、链霉蛋白酶(pronase)、Orientase等，从基质特异性的观点考虑，优选链丝菌蛋白酶E。
作为利用蛋白质分解酶将鸟类抗体的Fc区域分解的方法，反应温度没有特别限定，优选为25℃-50℃的范围内的温度，更优选为35℃-45℃的范围内的温度。
反应时间没有特别限定，优选为12小时-168小时的范围内的时间，更优选为24小时-96小时的范围内的时间。
通过用蛋白质分解酶将经改性的鸟类抗体的Fc区域分解，能够得到糖二肽或糖三肽。
经蛋白质分解酶分解后的糖二肽或糖三肽的纯化方法没有特别限定，可利用以往已知的方法实施。
针对基于蛋白质分解酶的处理液，可以在使蛋白质分解酶失活后，例如利用柱色谱等将糖二肽或糖三肽粗纯化。
另外，可以在对所得到的糖二肽或糖三肽导入保护基后进一步进行纯化。
针对糖二肽或糖三肽的保护基的导入反应没有特别限定，可利用以往已知的方法来实施。
导入了保护基的糖二肽或糖三肽的纯化也没有特别限定，可利用以往已知的方法来实施。
利用本发明的糖肽的制造方法得到的糖二肽或糖三肽可以进一步通过利用分解酶、优选蛋白质分解酶进行分解而得到糖天冬酰胺。
蛋白质分解酶没有特别限定，例如，可举出链丝菌蛋白酶E、羧肽酶、氨肽酶等，优选链丝菌蛋白酶E和羧肽酶。
利用本发明的糖肽的制造方法得到的糖二肽或糖三肽通过进一步用分解酶进行分解，能够得到在还原末端没有键合氨基酸的糖链。
作为所使用的N聚糖酶，没有特别限定，优选为PNGaseF。
本发明的糖肽的制造方法可以为对糖肽进行分离纯化的方法。
即，作为本发明的一个方式，可以为对糖肽进行分离纯化的方法，其包括：
对鸟类抗体的Fc区域进行改性的工序；以及
用蛋白质分解酶将经改性的Fc区域分解的工序，
糖肽为糖二肽或糖三肽。
在对糖肽进行分离纯化的方法中，可以直接应用针对本发明的糖肽的制造方法记载的事项。
由本发明的方法得到的糖肽能够作为研究试剂、工业用原料、药物添加物而利用。例如，已知在糖尿病、阿尔茨海默病等折叠性疾病中，高甘露糖型的8-12糖的产生比率会在生物体内发生变化，本发明的糖肽能够作为分析疾病的征兆的糖肽型探针而利用。另外，糖肽被期待作为抗糖链抗体的抗原的应用、由将糖链引入蛋白质药物而带来的功能调节。
已知糖链的功能、利用酶进行的糖链的识别根据所键合的氨基酸数而变化，其中，含有共有序列的任意肽显示出具有优越的性质。
共有序列是指在生物体内在蛋白质上生物合成N-键合型糖链时所需的3个氨基酸构成的序列，为Asn-X-Thr/Ser(X为脯氨酸以外的任意氨基酸)。
本发明发现，在生物体内与糖链的代谢有关的PNGase的活性在糖天冬酰胺与糖三肽、糖二肽中不同。通过该反应，也能够得到作为未实现有效制造的、未键合氨基酸的糖链。因此，通过本发明得到的糖三肽、糖二肽具有与糖天冬酰胺不同的性质，产生糖天冬酰胺所无法获得的效果。
实施例
以下，通过实施例及比较例，进一步具体地说明本实施方式，但本实施方式不仅限于这些实施例。需要说明的是，本实施方式中使用的测定方法如下所示。
[HPLC分析]
日本分光公司制LC-2000系列PLUS
色谱柱：INERTSIL Amide column 5μm，10×250mm
流速：5mL/min
UV：273nm
梯度：CH3CN/NH4HCO2(100mM、pH4.5)＝65/35→50/50(60min)
[质谱]
岛津公司制AXIMA-CFRplus
离子化：MALDI
模式：正离子(Positive)
[1H-NMR]
JEOL制JNE-ECA500型FTNMR波谱仪(500MHz)
溶剂：D2O
＜实施例1＞
(a)对约180mg的包含IgY的Fc区域的级分，添加5倍量的乙醇，静置一晚。通过离心分离将沉淀物回收，使其溶解于Tris-盐酸·氯化钙缓冲液(pH＝8.0，90mL)中，添加叠氮化钠(0.38mg)。进而，加入链丝菌蛋白酶E(科研制药公司制，36mg)，于37℃反应48小时。
(b)反应结束后，通过离心分离将上清液回收。使用填充了Cotton的柱，在梯度(CH3CN/H2O＝90/10→0/100)条件下进行纯化，回收包含糖肽的级分。
(c)将回收的级分浓缩，使得到的残留物(约11.6mg)溶解于水·丙酮溶剂(水/丙酮＝3/2，1mL)中，添加碳酸氢钠(3.9mg)。添加N-(9-芴甲氧羰基氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu，7.8mg)，于室温反应6小时，使用蒸发器进行浓缩。使用反相柱(Sep-Pak C-18，Waters公司制)，在梯度(H2O/CH3OH＝90/10→60/40)条件下进行纯化，得到作为目标物的糖数8-12的高甘露糖型糖三肽衍生物组(7.7mg)。利用质谱，确认了作为目标物的糖数为8～12的高甘露糖型糖三肽衍生物组的质量峰(图1)。
＜实施例2＞
(a)将约180mg的包含IgY的Fc区域的级分于85℃孵育10分钟，调整为Tris-盐酸·氯化钙缓冲液(pH＝8.0，90mL)，添加叠氮化钠(0.38mg)。进而添加链丝菌蛋白酶E(科研制药公司制，36mg)，于37℃反应48小时。
(b)反应结束后，通过离心分离将上清液回收。使用填充了Cotton的柱，在梯度(CH3CN/H2O＝90/10→0/100)条件下进行纯化，回收包含糖肽的级分。
(c)将回收的级分浓缩，使得到的残留物(约11.4mg)溶解于水·丙酮溶剂(水/丙酮＝3/2，1mL)中，添加碳酸氢钠(3.8mg)。添加N-(9-芴甲氧羰基氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu，7.5mg)，于室温反应6小时，使用蒸发器进行浓缩。使用反相柱(Sep-Pak C-18，Waters公司制)，在梯度(H2O/CH3OH＝90/10→60/40)条件下进行纯化，得到作为目标物的糖数8-12的高甘露糖型糖三肽衍生物组(7.5mg)。利用质谱，确认了作为目标物的糖数为8～12的高甘露糖型糖二肽衍生物组的质量峰(图2)。
＜实施例3＞
(a)针对实施例1中得到的高甘露糖型糖三肽衍生物组，利用HPLC制备柱分别将12糖、11糖、10糖、9糖、8糖纯化。示出分取的糖数不同的糖三肽衍生物的质谱结果(图3)。
分取约47分钟后出现的主峰，利用凝胶过滤色谱进行脱盐处理。减压浓缩后进行真空干燥时，得到糖数为12的糖三肽衍生物(Glc1Man9GlcNAc2-Asn(Fmoc)-Gly-Thr)约2.6mg。示出所得到的化合物的1H-NMR数据(图4)。
＜实施例4＞
(a)针对实施例2中得到的高甘露糖型糖二肽衍生物组，利用HPLC制备柱分别将12糖、11糖、10糖、9糖、8糖纯化。
分取约47分钟后出现的主峰，利用凝胶过滤色谱进行脱盐处理。减压浓缩后以真空进行干燥时，得到糖数为12的糖二肽衍生物(Glc1Man9GlcNAc2-Asn(Fmoc)-Gly)约2.4mg。示出所得到的化合物的质谱结果(图5)及1H-NMR数据(图6)。
＜实施例5＞
(a)将糖数为12的糖二肽衍生物(Glc1Man9GlcNAc2-Asn(Fmoc)-Gly)1.0mg溶解于Tris-盐酸·氯化钙缓冲液(pH＝8.0，900μL)中，添加10％叠氮化钠水溶液，将摩尔浓度调整为0.05％。进而添加链丝菌蛋白酶E(科研制药公司制，0.2mg)，于37℃反应48小时。利用质谱，确认了氨基酸被切断的糖天冬酰胺衍生物(Glc1Man9GlcNAc2-Asn-Fmoc)的质量峰(图7)。
＜实施例6＞
(a)将1μg的经分离纯化的糖数12的糖三肽衍生物(Glc1Man9GlcNAc2-Asn(Fmoc)-Gly-Thr)溶解于反应液(pH＝7.5，50mM磷酸缓冲液，1％ NP-40)中，添加PNGase F(NEWENGLAND BioLabs公司制，4μg)，于37℃反应2小时。利用质谱，确认了肽数为0个且糖数为12的糖链(Glc1Man9GlcNAc2)的质量峰(图8)。
＜实施例7＞
(a)将1μg的经分离纯化的糖数11的糖二肽衍生物溶解于反应液(pH＝7.5，50Mm磷酸缓冲液，1％ NP-40)中，添加PNGase F(NEW ENGLAND BioLabs公司制，4μg)，于37℃反应2小时。利用质谱，确认了肽数为0个且糖数为11的糖链的质量峰(图9)。
＜实施例8＞
(a)将1μg的经分离纯化的糖数11的糖天冬酰胺衍生物溶解于反应液(pH＝7.5，50Mm磷酸缓冲液，1％ NP-40)中，添加PNGase F(NEW ENGLAND BioLabs公司制，4μg)，于37℃反应2小时。利用质谱，确认了糖链的切断未进行(图10)。

Claims (9)

1.制造糖肽的方法，其包括：
对鸟类抗体的Fc区域进行改性的工序；以及
用蛋白质分解酶将经改性的Fc区域分解的工序，
糖肽为糖二肽或糖三肽。
2.如权利要求1所述的方法，其中，糖肽的糖链由8～12糖构成。
3.如权利要求1所述的方法，其中，在对鸟类抗体的Fc区域进行改性的工序中，Fc区域通过热或有机溶剂而改性。
4.如权利要求1所述的方法，其中，鸟类抗体为IgY。
5.制造糖链或糖天冬酰胺的方法，其还包括用分解酶将由权利要求1至4中任一项所述的方法得到的糖二肽或糖三肽分解的工序。
6.对糖肽进行分离纯化的方法，其包括：
对鸟类抗体的Fc区域进行改性的工序；以及
用蛋白质分解酶将经改性的Fc区域分解的工序，
糖肽为糖二肽或糖三肽。
7.糖二肽或糖三肽，其为来源于鸟类抗体的Fc区域的糖二肽或糖三肽，
具有由8～12糖构成的糖链。
8.N-键合型糖三肽，其为来源于鸟类抗体的Fc区域的糖三肽，
具有由8～12糖构成的糖链，
三肽具有Asn-Gly-Thr/Ser，糖链与Asn键合，此处，Asn、Thr及Ser的1个以上的残基可以被保护。
9.N-键合型糖二肽，其是来源于鸟类抗体的Fc区域的糖二肽，
具有由8～12糖构成的糖链，
二肽具有Asn-Gly，糖链与Asn键合，此处，Asn及Gly的1个以上的残基可以被保护。
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