LU87014A1 - Nouveaux derives peptidiques,leur preparation et leur utilisation comme medicaments - Google Patents

Description

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ju ·. ’ ' Λ.Γ Λ ’-i Jei'F·.·'r·. :·~>:α ? i·.*C .·:· res r ., .* :¾ Service de L Pr,-prêté in"· '"?

î!____ ________________' LUXEMBOURG

Demande de Brevet d’invention *£** ........_......................_......................._........................................................._......... . ... ( 1) * I. Requête

La société dite: SMDOZ S.A., Lichtstrasse 35, CH-4002 Baie, Suisse, ^ représentée par Monsieur Louis ËMRÏNGËR, avocat, demeurant a Luxembourg agissant en sa qualité de mandataire déposefntj ce sept octobre 190 0-q uatre - vin qt-s ept.......... ..................................... ^ 4) à.........../] Ί ..........heures, au Ministère de l’Économie et des Classes Moyennes, à Luxembourg: 1. la présente requête pour l’obtention d’un brevet d'invention concernant: ........................................Nouveaux dérivés.....peptidiques..,, .leur.....préparation ........

....................................... et.....leur.....util isati on.....comme.....raëdi caments ................................_............. .........................................

2. la description en langue...............................................................de l’invention en trois exemplaires; 3..................J.................................. planches de dessin, en trois exemplaires; 4. la quittance des taxes versées au Bureau de l’Enregistrement à Luxembourg, le 6.10.1987........ . ; 5. la délégation de pouvoir, datée de................................................................................... le........ 5.10.1987 ......; 6. le document d'ayant cause (autorisation); revendique!nt) pour la susdite demande de brevet la priorité d’une (des) demande(s) de (7} ...................................................^revet............. ......................._..................... déposée(s) éaK (8)¾ is fépuBÎGiiê Fédé-ah d'A'lecagns______________-......._ le (9) 13 ocioare 1935 sms les no.s P 36 34 797.3. P 35 34 826.0, P 35 34 825.2 et le P avril 1557 ............. _________________ sous le N° (10) P 37 12 62Ô.1 au nanjte Κ©Ο2-ΡίΤ0>Τ-®!ΒΗ, Ma,"boldtstr. 3, ÎPffi'' Lörrach, ADe®*«, e‘ er Süess il 1? aafli D37 saus le ns. 231¾¾¾ au "sç dêjf $[pçs3nte _ éïitf élisent) domicile pour lui (elle) et. si désigné, pour son mandataire, à Luxembourg 141, rue AlD&rl

Un den..2 6.5 2.......Luxembourg. ... -ni; sollicite(nt) la délivrance d’un brevet d’invention pour 1 objet décrit et représenté dans les annexes susmentionnées, avec ajournement de cette délivrance à _.....„..............six................. ...... mois. (13)

Le déposant/mandataire:.........' 'S................ *14» ''-'LITProcès-verbal de Dépôt

La susdite demande de brevet d'invention a été déposée au Ministère de l'Economie et des Classes Moyennes. Service de la Propriété IntelleçtMeîîelfi-uxembourg. en date du: α j OfT

........... 3 ÿ --•c.'.vrr·. v ΐη / J'.-vECî'·· Pr. le M!-ûsre de î'Ecrnomie et des Oa«ts M.-vcnnes.

x L à...... J 1................heures fl/ ._'· " . V- Lp.d. .

r β ï i - y i 5 ·. sr.'v :S · Le chef du service*·de laijropriété intellectuelle.

<V y / rn Y , A6S0Q7_n y·’_________*Ά/_____ _____________.

L U T A E.V°LlCATONSRELATI\ÎSAUFOP.MrCx:RE&E-i!î;P6'î ' 7/ I 1 . t Iieb”Dcri^üi:deccri3?iii2jc'adc;:i».'r a. r74ve. pnn. "E £».·· kr κ b'w*et principe No......^ . ..du.......... “ - c·* ».r düôt^.andsar. lorsque ce!u:*-c es» ur, particiLer ou ier-dcri·: ' .r^’.n : s . Lu. Lxnic jundicut ί:ό!Γ'.·»·>:' eu Siî-nt NUiiü· ••i-rsau? lt r's- .. - ô ' <r·^- A f » . . .*· γε.γΤ:. Dolnoir. «:2res>x dt nbîncstüiri c.T'seüc'r rr’Drio:. r:> ~ d’un iwjvrir s'j’v ? Ιίΐιι: ”rco.»r^r .. s—1:·.* i * L - * 100-6962 REVENDICATION DE LA PRIORITÉ de la demande de brevet En République Fédérale d'Allemagne et en Suisse Du 13 octobre 1986 3 x 14 avril 1987 17 août 1987 MEMOIRE DgsSÎiPW déposé à l'appui d'une demande de

BREVET D'INVENTION

au

LUXEMBOURG

au nom de: SANDOZ S.A.

pour: Nouveaux dérivés peptidiques, leur préparation et leur utilisation comme médicaments J ί < * -ft - 1 «

La présente invention a pour objet de nouveaux dérivés de peptides, leur préparation et leur utilisation comme médicaments.

L'invention concerne en particulier un dérivé 5 glucosylé d'un peptide biologiquement actif, lequel dérivé possède une durée d'action prolongée par rapport au peptide non modifié et contient au moins sur un des restes d'ami no-acides, un reste glucidique fixé au groupe amino du reste d'amino-acide par une liaison 10 autre qu'une liaison N-glucosidique directe et, lorsque le dérivé est un produit de condensation d'un glucide contenant un groupe carboxy avec un peptide ayant moins de 8 restes d'amino-acides,par une liaison autre qu'une liaison ami de.

15 Ces composés seront désignés par la suite les composés de l'invention.

Par peptide non modifié, on entend le peptide de structure correspondante ne possédant aucun reste glucidique.

20 La Demanderesse a trou-vé en outre que les composés de l'invention se signalent par des propriétés pharmacologiques particulièrement intéressantes et surprenantes, spécialement par une durée d'action plus longue, par exemple comme décrit ci-après.

25 On a trouvé que l'incorporation d'un ou plusieurs restes glucidiques même lorsqu'ils sont liés de manière différente qu'une glucosydation normale par exemple de Asn ou Ser, entraîne de telles propriétés.

Ces restes glucidiques sont introduits 30 de préférence sur des groupes amino d' amino-acides éloignés du site actif du peptide.

/ i y s r 4 " % τ 2

Le ternie peptide utilisé dans la présente demande comprendles peptides, par exemple les di- et tri-peptides, les oligo-peptides, les polypeptides et les protéines. De préférence, le peptide contient 5 plus de 7 restes d* amino-acides. Avantageusement, le peptide contient de 8 à 32 restes d'amîno-acides.

Par reste d1 ami no-acide, on entend également un reste d'amino-alcool correspondant aux restes d'amino-acides.

Le terme peptide biologiquement actif utilisé 10 dans la présente demande couvre en particulier les composés ayant une activité pharmacologique ou thérapeutique, par exemple les composés ayant une activité hormonale-, enzymatique ou immunomodulatrice, ou qui stimulent ou inhibent une telle activité. Ces 15 peptides biologiquement actifs englobent les peptides naturels isolés de source naturelle ou par fermentation de cellules, par exemple par génie gênitique, ou obtenus par synthèse, et également leurs dérivés ou analogues.

20 Par dérivés et analogues de ces peptides, on entend en particulier les peptides naturels dans lesquels un ou plusieurs restes d'amino-acides ont été supprimés et/ou substitués par un ou plusieurs autres restes d'amino-acides et/ou dans lesquels un ou plusieurs 25 groupes fonctionnels ont été remplacés par un ou plusieurs autres groupes fonctionnels et/ou dans lesquels un ou plusieurs groupes ont été remplacés par un ou plusieurs autres groupes isostères. En général, le terme couvre tous les dérivés modifiés d'un peptide 30 biologiquement actif qui présentent un effet qualitativement similaire à celui du peptide non modifié.

T 3 j *

t ' T

Ψ

Le glucide utilisé peut être par exemple n'importe quel mono-,di- ou oligo-saccharide connu, spécialement un mono-, di- ou triose ou l'un de ses dérivés, par exemple l'un de ses dérivés aminé et/ou 5 carboxylé.et/ou réduit et/ou estërifië.

Le glucide peut être couplé par exemple I un groupe amino N-terminal et/ou à au moins un groupe amino du peptide, présent dans la chaîne latérale de ce peptide.

10 Le glucide peut être couplé par l'un de ses groupes fonctionnels au peptide soit directement, soit indirectement par l'intermédiaire d'un pont, par exemple un groupe alkylènecarbonyle. Ce couplage peut être réalisé selon les méthodes connues, spécialement 15 comme décrit ci-après.

Les composés préférés de l'invention sont ceux dans lesquels le reste glucidique est fixé à un groupe amino du peptide par une liaison autre qu'une liaison N-glucosidique directe ou une liaison amide.

20 Un groupe de composés de l'invention peut être préparé par réarrangement d'Amadori ou de Heyns.

L'invention comprend également les compositions pharmaceutiques administrables par voie orale contenant un composé de l'invention, spécialement ceux ayant 25 au moins 8 restes d'amino-acides.

La présente invention concerne en particulier les dérivés glucosylës suivants de peptides biologiquement actifs a) de formule I 30 ,08 G,^ /XCH NH-P (1 ) / ' 1 * 0 t * + î '4 dans laquelle _.A ai- 5 représente le reste désoxy d’un cétose, le groupe , CH2 de ce reste étant lié au groupe NH d'un peptide biologiquement actif, et P représente le reste d'un peptide biologiquement actif de formule NH2-P, dans laquelle le groupe 10 NH2 représente le groupe amino N-terminal du peptide P ou un groupe amino situé dans une chaîne latérale du peptide P, b) de formule II · TV- 15 (II)

NH-P

dans laquelle a2

20 J

représente le reste désoxy d'un aldose, la liaison libre de ce reste étant lié au groupe NH d'un peptide biologiquement actif, et 25 P représente le reste d'un peptide biologiquement actif de formule NH2-P» dans laquelle le groupe NH2 représente le groupe amino N-terminal du peptide P ou un groupe amino situé dans une chaîne latérale du peptide P, 30 c) de formule III G3-CO-NR -P (III) dans laquelle t / 5 » i

* ' τ V

%

GjCO représente le reste d'un acide uronique ou d'un acide polyhydroxymono- ou di-carboxylique, R représente l'hydrogène ou un groupe alkyle y en Cj-C3 ou alcanoyle en et 5 P représente le reste d'un peptide biologiquement actif de formule NHg-P, contenant au moins 8 restes d'ami no-acides ,

NR étant situé sur le groupe amino N-terminal du peptide P

y ou dans un chaîne latérale du peptide P, 10 d) de formule IVa, IVb, IVc ou IVd >"\ ?y .--o ^y y— NH-Q-N .p(IVa) GV . ^O-Q'-N -P {iyb) 15 vX™ .'Ry(ivc) dvd) mî-Q"'-N-p dans lesquelles 20 P représente le reste d'un peptide biologiquement actif de formule N^-P, les restes

.--O

°4 )^' <3'4 V°‘ 25 ’* mm/ ,.'*-0 OH ,—0 1.X», v>” nH* 30 représentent des restes glucidiques, R représente l'hydrogène ou un groupe alkyle en C-j -C3 ou alcanoyle en C-j -C^ et / 6 » · * * * * » Q, Q1 , Q" et Q"* représentent des groupes couplant le reste du peptide avec le reste du glucide, le groupe NH lié à P représentant le groupe amino N-ter-minal du peptide P ou un groupe amino situé dans la chaîne 5 latérale du peptide P, ou e) de formule IVa ou IVb H0H2C-(CH0H)c-CY-CH2-NH-P (Va) 10 H0H2C-(CH0H)c-CH-CH20H (Vb)

NHP

dans lesquelles

15 Y représente H2 ou H, OH

c signifie 2 ou 3 ou 4, et P représente un reste d'un peptide biologiquement actif de formule NH2~P , le groupe NH lié à P représentant le groupe amino 20 N-terminal du peptide P ou un groupe amino situé dans la chaîne latérale du peptide P, et n'importe lequel des groupes hydroxy libresdans le reste du polyol du composé de formule Va ou Vb est éventuellement lié par une liaison glucosidique à un mono- , di- ou 25 oligosaccharide réducteur ou à un sucre aminé, ainsi que les sels d'addition d'acides et les complexes de ces dérivés , avec les conditions que a) dans les composés de formule I ci-dessus, P soit autre qu'un reste d'un peptide de la gastrine ayant 30 un groupe terminal se terminant par -Asp-Phe-NH2, b) lorsque dans les composés de formule IVb Q' signifie un cycle phênyle contenant un radical divalent / 1* 7 * · t * * ou lorsque dans les composés de formule IVd Q"' signifie le reste d'un acide aliphatique diçarboxy-lique, P-NH^ soit autre qu'une insuline naturelle, c) lorsque dans les composés de formule III G3-CO 5 représente le reste d'un acide muramique éventuel lement N-acylé, le second reste d'amino acideà l'extrémité N-terminale du peptide P-NHRy soit autre que le reste d'un acide amino-dicarboxy1ique .

Tous les restes glucidiques mentionnés ci-dessus 10 peuvent être des mono-, di- ou oligosaccharides. Ces glucides peuvent contenir des heptoses, des hexoses et/ou des pentoses qui peuvent exister sous forme pyranniques ou furannique.

Dans toutes les formules I 3 V représentées 15 ci-dessus, seul un reste de glucide est représenté par reste de peptide. Cependant, l'invention couvre également des dérivés glucosylës de peptides ayant plus qu'un groupe amino libre sur le reste peptidique, ces dérivés contenant 2 ou 3 restes glucidiques par 20 reste peptidique .

L'invention concerne en outre tous les peptides biologiquement actifs qui comportent plus d'un reste glucidique lié comme indiqué précédemment.

Les peptides glucosylës contiennent de 25 préférence 1 à 3 restes de mono-saccharide, qui peuvent être liés ensemble pour former un disaccharide ou un tri-saccharide.

Dans tous les composés mentionnés précédemment, le symboleindique que la liaison peut être en 30. position a ou ß.

Dans la formule I, le reste oa / 'iX·

V

8 V , # » * * représente de préférence a) un reste de formule Via 5 |A^V/» (VIa) J)jLp- s 10 dans laquelle l'un des symboles Ga et G, signifie l'hydrogène et

a D

1'autre OH, l'un des symboles Gc et G^ signifie l'hydrogène et l'autre OH ou un reste glucosyloxy dans lequel 15 le reste glucosyle peut dériver d'un mono-, di- ou oligosaccharide réducteur, l'un des symboles Ge et G^ représente l'hydrogène et 1 ' autre OH, l'un des symboles G^ et G^ représente l'hydrogène 20 et l'autre OH ou CHgOH, par exemple dans laquelle les symboles Gg à Gh sont choisis de telle manière que le reste de formule Via correspondeà un reste pouvant être obtenu par réarrangement d'Amadori à partir d'un 25 mono-, di- ou oligosaccharide naturel ou accessible par synthèse.

i . ! > * * « / » * · • 9

Comme exemples de restes glucidiques <je formule Via, on peut citer les restes désoxyfructosyle, désoxytagatosyle, désoxysorbosyle, a-glucosyl-(1-4)-désoxyfructosyle, a-glucosyl(1-4)-a-glucosyl(1-4)-5 désoxyfructosyle b) Un reste de formule VIb

g /K

/ \ .08 / \-^ (VIb)

10 V

^

Gd Gb dans laquelle 15 l'un des symboles Gg et G^ signifie l'hydrogène et 1'autre OH, l'un des symboles Gc et signifie l'hydrogène et l'autre OH ou · glucosyloxy dans lequel le reste glucosyle peut dérivér d'un mono-, di- ou oligo-20 saccharide réducteur, l'un des symboles Ge et G^ signifie l'hydrogène et l'autre signifie l'hydrogène , COOH, CH20H, CH2-0-P(0)-(0H)2 ou CH20-glucosyle, dans lequel le reste glucosyle peut dériver d'un mono-, di- ou 25 oligosaccharide réducteur, par exemple dans laquelle les symboles Ga à G^ sont choisis de telle manière que le reste de formule VIb correspondes un reste qui peut être obtenu par réarran-gement d'Amadori à partir d'un mono-, di- ou oligo-30 saccharide naturel ou accessible par synthèse.

Les restes de formule VIb peuvent être obtenus par exemple par rëarrangement d'Amadori à partir de saccharides tels que le gentiobiose, ν' > 10 * * • * le mêlibiose, le ribose, le xylose ou à partir des acides uroniques tels que l'acide glucuronique ou galacturonique.

Dans la formule II, le reste de formule signifie de préférence a) un reste de formule V11a 10 a *

G ,-O

•/I \ / ^ V® J (VIIa> at£—f 15 ai =b dans laquelle l'un des symboles G et G. signifie l'hydrogène

d D

et l'autre une liaison directe, 20 l'un des symboles Gc et G^ signifie l'hydrogène et 1'autre OH, l'un des symboles G0 et G^ signifie l'hydrogène et llautre OH ou glucosyloxy dans lequel le reste glucosyle peut dériver d'un mono-, di- ou oligo-25 saccharide réducteur, l'un des symboles Gg et G^ signifie l'hydrogène et l'autre CH20H ou CH2-0-g 1ucosyle, dans lequel le reste glucosyle peut dériver d'un mono-, di- ou oligosaccharide réducteur, 30 par exemple dans laquelle les symboles GQ à Gh sont choisis de telle manière que le reste de formule V11a ^^ correspondes un reste qui peut être obtenu par rëarran- λ * V * '· π gement de Heyns à partir d'un mono-, di- ou oligocétose naturel ou accessible par synthèse, b) un reste de formule V11b îx\

Îml-J

Gd % 10 dans laquelle l'un des symboles G, et G. signifie l'hydrogène a u et l'autre une liaison directe, l'un des symboles Gc et G^ signifie l'hydrogène 15 et 1'autre OH , l'un des symboles Gg et G^. signifie l'hydrogène et l'autre CH^OH ou CH^-O-glucosyle , dans lequel le reste glucosyle peut dériver d'un mono-, di-ou oligosaccharide réducteur, 20 par exemple dans laquelle les symboles Ga à G^ sont choisis de telle manière que le reste de formule V11b correspondeà un reste qui peut être obtenu par rëarrangement de Heyns à partir d'un mono-, di- ou oligocêtose naturel ou accessible 25 par synthèse.

Les restes de formule V11a ou V11b peuvent être obtenus par exemple par réarrangement de Heyns d'un glucide tel que le D-fructose, le lactulose, le L-sorbose, le D-tagatose ou le D-ribulose.

30 Dans la formule III, l'acide polyhydroxy- mono- ou di-carboxylique , contient par exemple aU ra01"nS ^ 9rouPes hydroxy et peut également contenir * 4# * * * r 12 d'autres substituants, par exemple des groupes ami-no ou acêtylamino.

Comme exemples de tels acides polyhdroxy-carboxyliques, on peut citer les acides oniques 5 dérivés des glucides tels que l'acide gluconique, ou les acides ariques tels que l'acide glucarique, ainsi que l'acide quinique, l'acide acëtylmuramique, l'acide acétylneuraminique et l'acide D-glucosamini que. ·

Comme exemples d'acides uroniques on peut 10 citer l'acide glucuronique et l'acide gaiacturonique.

Dans les composés de formule IV, G^, G^, G]| et G^' ont les significations données précédemment pour G.j ou Gg.

Le symbole Q ou Q' relie un groupe NH2 du 15 peptide avec un groupe NH2 ou OH du reste glucidique et signifie par exemple le reste d'un acide dicarboxy-1 ique ou de préférence un reste -C^-CO dans lequel b signifie de O à 6. Le reste peut être ramifié.

Q' signifie par exemple un reste 20 ^ -AqS-NH-CO-CHj-CHj- CO, ou en particulier un reste "^b^b"*·^” (b = Par exemple de 1 16). Q signifie par exemple un reste -CH2-C0-· 25 Q signifie spécialement -CO- ou -CS- ; -NH-Q"- et -NH-Q"'-signifient un reste qui relie le groupe NH2 du peptide avec le reste glucidique, spécialement les restes d'acides w-aminocarboxyliques. Ils peuvent signifier par exemple un reste -NH-C^H^-CO - .

30 Les composés de formule V préférés sont ceux de formule Va » spécialement ceux dans lesquels n signifie 3.

» 13 \ί :

Tous les restes P mentionnés précédemment sont des restes de peptides biologiquement actifs.

De tels peptides comprennent tous les peptides naturels ou synthétiques ainsi que, comme indiqué 5 au début de la présente demande, les dérivés et analogues de ces peptides ayant une activité hormonale,enzymatique ou immunomodulatrice. Cette activité peut être aussi bien stimulante qu'inhibitrice. A titre d'exemples, on peut citer les peptides suivants : la somatostatine, 10 la calcitonine, 1'oxytocine, 1 a vasopressine, l'insuline, la LH (hormone 1 utëinisanté), la LHRH ( gonadorëline) le GRF (Facteur déclenchant la sécrétion de l'hormone somatotrope), la gastrine, la substance P, la cathepsine, les encêpha-lines, ainsi que tous leurs dérivés et analogues 15 ayant une activité similaire à celle du peptide ou ayant une activité antagoniste.

Les composés de l'invention contiennent de préférence au moins 8 restes d1 amino-acides, par exemple de 8 à 32, spécialement de 8 à 20, en particulier de 8 à 20 10 restes d'amino-acides.

Les peptides préférés sont ceux correspondant aux formules I et II.

Pour des raisons de simplicité, dans les formules précédentes et suivantes le reste glucidique 25 est représenté sous forme pyrannique. Il va de soi que l'invention comprend également les formes furanniques et les formes linéaires de ces glucides, pour autant qu'elles existent pour les glucides concernés.

L'invention concerne également un procédé 30 de préparation des composés de Vinvention. Ces composés peuvent être préparés selon les méthodes généralement connues pour la synthèse de composés de ce type.

/

K

• 14 * ·* * k

Les composés de l'invention peuvent être préparés par exemple comme suit : a) on élimine au moins un groupe protecteur présent dans un peptide glucosylë de l'invention protégé, ou 5 b) on couple par une liaison amide deux unités peptidiques, dont chacune contient au moins un amino-acide ou un amino alcool sous forme protégée ou non protégée et dont une unité peptidique contient le reste glucidique , le couplage étant effectué 10 de telle manière qu'on obtient la séquence d'amino- acidesdêsirée, et éventuellement on met en oeuvre l'étape a) du procédé, ou c) on introduit au moins un reste glucidique éventuellement protégé dans un peptide protégé ou non protégé et éventuellement 15 on met en oeuvre l'étape a) du procédé, ou d) on transforme un groupe fonctionnel d'un peptide glucosylë de l'invention protégé ou non protégé, en un autre groupe fonctionnel ou bien on élimine ce groupe fonctionnel, et éventuellement 20 on met en oeuvre l'étape a) du procédé, ou e) on oxyde un peptide glucosylë de l'invention dans lequel Te groupe mercapto des restes Cys sont sous forme libre, de manière· à produire un peptide dans lequel les deux restes Cys sont reliés par un pont -S-S.

25 Comme indiqué au début de cette description, le r terme "glucide" tel qu'utilisé dans la présente demande, couvre également les dérivés de glucides tels que les oses aminés , les oses oxydés et réduits ou les oses estérifiés.

30 Les réactions ci-dessus peuvent être effectuées de manière analogue au procédé décrit dans les exemples suivants, en particulier les procédés a) et b) peuvent 15 * ¥ m être effectués selon la synthèse de l'invention décrite ci-après. Si on le désire, Tes groupes protecteurs qui sont appropriés pour être utilisés dans les peptides ou les glucides peuvent être utilisés 5 dans ces réactions pour protéger des groupes fonctionnels qui ne participent pas à la réaction. Le terme groupe protecteur comprend une résine polymère ayant des groupes fonctionnels.

Les composés de formule I peuvent être 10 préparés en faisant réagir en milieu légèrement acide un peptide protégé ayant un groupe amino libre avec un mono-, di- ou oligosaccharide réducteur ou un acide uronique correspondant ou un ester · de cet acide (rëarrangement de Amadori), et en éliminant ensuite 15 les groupes protecteurs.

Cette réaction peut être effectuée de manière· classique pour un réarrangement d'Amadori.

L'acide ajouté peut être par exemple l'acide acétique glacial. Lorsqu'on fait réagir avec un acide uronique, 20 il n'est pas nécessaire d'ajouter un autre acide.

On utilise de préférence un excès de glucide, par exemple 10 équivalents pour un équivalent de peptide. La réaction peut être effectuée dans un solvant polaire tel que le méthanol, de préférence à des températures 25 d'environ 60 à 70°C.

Les composés de formule II peuvent être préparés en faisant réagir en milieu faiblement acide un peptide protégé ayant un groupe amino libre avec un cétose (rëarrangement de Heyns). La réaction peut 30 être effectuée sous les mêmes conditions qu'un réarrangement d'Amadori, comme indiqué ci-dessus.

» * * * 16

Les composés de formule III peuvent être préparés en faisant réagir un peptide protégé ayant un groupe amino libre avec un acide de formule Gg-COOH ou l'un de ses dérivés réactifs , et en éliminant 5 ensuite tous les groups protecteurs. Cette réaction peut être une amidation classique qui peut être effectuée de manière connue en soi. Comme dérivés réactifs de l'acide carboxylique, on peut utiliser en particulier l'halogênure d'acide. Les amides 10 peuvent également être préparés par exemple en faisant réagir l'acide libre en présence d'hydroxybenzotriazole et de dicyclohexylcarbodiimide.

Les composés de formule IVa, IVb, IVc et IVd peuvent être préparés 15 a) en faisant réagir d'abord le peptide avec le composé formant pont puis le produit obtenu avec le glucide, ou b) en faisant réagir d'abord le glucide avec le composé formant pont puis le composé formant pont glucosylé 20 ainsi obtenu avec le peptide.

Ces réactions peuvent être effectuées selon les méthodes connues. Les composés formés sont principalement des amides,des esters ou des acétals. Les composés de l'invention peuvent être purifiés selon 25 les méthodes connues.

Les composés de formule IVa dans laquelle Q signifie -CO- ou -CS- peuvent être préparés par exemple en couplant l'isocyanate otrl'iso-thiocyanate de glucosylé correspondant de formule

g4 N . C = L

/ 30 * 17 « * * * dans laquelle L signifie 0 ou S et G^ a la signification donnée précédemment , et dans laquelle les groupes hydroxy libres présents 5 dans G^ sont sous forme protégée, par exemple par acylation, avec un peptide P-NH2 sous forme protégée, et on élimine ensuite les groupes protecteurs.

La réaction peut être effectuée selon les 10 méthodes connues pour la préparation des dérivés de 1'urée.

Les composés de formule IVc et IVd peuvent être obtenus par exemple par réarrangement d'Amadori ou de Heyns , par exemple comme décrit 15 précédemment pour la préparation des composés de formule I et II.

Les composés de formule Va ou Vb peuvent être préparés par exemple a') par amination réductrice d'un aldose, d'un dësoxy-20 aldose ou d'un cétose avec le peptide P-NH2> ou b') par réduction du groupe hëmi-acëtal dans un composé de formule I ou II, chaque produit participant à la réaction pouvant, si on le désire, être protégé provisoirement.

25 L'amination réductrice et la réduction peuvent être effectuées selon les méthodes connues. L'amination réductrice peut être effectuée par exemple avec NaBH^CN, de préférence ä pH 7. La réduction du groupe hëmi-acëtal peut être effectuée avec du borohydrure, 30 par exemple avec NaBH^, de préférence à un pH dîenviron 6. Les produits de départ utilisés dans les réactions précédentes sont connus ou peuvent être Ιζ préparés selon les méthodes connues.

V

/ * 18

* X

v *

Une classe préférée de peptides glucosylës comprend les dérivés glucosylës des somatostatinés, contenant par exemple de 4 à 9 ami no-acides. Le terme somatostatine comprend les analogues de la somatostatine 5 et leurs dérivés. Les dérivés glucosylës particulièrement préférés sont les dérivés glucosylës de peptides de

formule VIII

Ï1 ?' ?vs“*l VS"^H2 (VIII) A-NH-CH-CO-M-CH-CO-B-C-D-E-NH-CS-r 10 1 2 3456 7 dans laquelle A représente l'hydrogène, ou un groupe alkyle en C^-C3 ou alcanoyle en C-j-C^, 15 >N-CH(Zj)-C0 signifie 1) un reste (L)- ou (D)-phénylalanine éventuellement substitué par des halogènes ou par des groupes NO,,, NH2, 0H>alkyle en C.j-C3 et/ou alcoxy en C^Cj, ou 20 2) le reste d'un a-amino-acide lipophile naturel ou d'un (D)-amino-acide correspondant autre que celui indiqué sous 1), Z.j dans le reste } N-CH(Z^ )-CO- représente le reste d'un amino-acide défini sous 1) et 2), 25 A' signifie l'hydrogène ou un groupe alkyle en -C3, Y .j et Y2 s i gni f i ent ,i ndëpendamment l'un de l'autre, 1 ) 1 ' hydrogène

2 ^ V

-CO-C- (CH2)m-H 30 Ah / «y λ r * ν 19 9 où m signifie un nombre entier de 1 à 4 inclus,

Ra signifie CH^ ou C2H^ et signifie H, CH^ ou C2HJ., 3) 5 -CO-CîT fS2 v (CHJ 2 « où n signifie un nombre entier de 1 à 5 inclus, 4) -C0-NHRc 10 où Rc signifie un groupe alkyle linéaire ou ramifié en c-j“Cg>

5 ) -CO-NH-CH-COOR

I 8

Rd 15 où Rd signifie le reste d'un α-amino-acide naturel (y compris l'hydrogène) situé sur l'atome de carbone a et R signifie un groupe alkyle en C^-Cg, ou IA ^ -«-««‘g- ?

U

* 25 dans laquelle

Ra et Rb * indépendamment l'un de l'autre, signifient' l'hydrogène , CH3 ou CgHg, R0 et Rn , indépendamment l'un de l'autre, signifient o y l'hydrogène, F, Cl, Br, alkyle en Cq-C3 ou alcoxy 30 en C-j-C-j, p signifie 0 ou 1, /q signifie 0 ou 1, et r signifie 0, 1 ou 2, » * •φβ- * r * 20 ou bien et Y2 forment ensemble une liaison, B signifie Phe ou Phe substitué dans le cycle phényle par F, Cl, Br, NO^ , NH^, OH, alkyle en C-|-C3 ou alcoxy en C^-C3, 5 C signifie L- ou D-Trp éventuellement substitué dans le cycle phényle par F, Cl, Br, NO^j NH2, OH, alkyle en C^-C3 ou alcoxy en C-j-Cg, D signifie Lys, dans lequel le groupe α-amino peut être substitué par un groupe méthyle, 10 E signifie Thr, Ser, Val, F signifie COOR-j, CH20R2» CO-NR-jR^ ou -CO- R.j signifie l'hydrogène ou un groupe alkyle en C-j-C^, R2 signifie l'hydrogène ou le reste d'un ester physio- 15 logiquement acceptable et physiologiquement hydro- lysable,

Rg signifie l'hydrogène ou un groupe alkyle en C.j-C3, phényle, ou phénylalkye en C^-C-jq, R3 signifiant uniquement l’hydrogène ou un groupe méthyle lorsque 20 R^ signifie -CH(Rg)-Xj, R^ signifie l'hydrogène ou un groupe alkyle en C-j-C^, ou -CH-X1 (IX) 25 Rg représente le reste d'un amino-acide naturel (y compris l'hydrogène) situé sur l'atome de carbone a, un groupe 0H-CH2-CH2 - ou OH(-CH2)3 , le groupe de formule IX pouvant avoir la configuration L ou D , X-j signifie COOR-j, CH20R2 ou 30 » k 21 «

Rg signifie l'hydrogène ou un groupe alkyle en C^-C^, signifie l'hydrogène ou un groupe alkyle en -C^, ou phénylalkyle en C^-C-jq, les restes B, D et E pouvant exister sous forme L 5 et les restes en position 2 et 7 ainsi que les restes Y^4)et Y24) pouvant exister indépendamment sous forme D ou L , ainsi que les sels et les complexes de ces composés.

De tels composés sont décrits dans le 10 brevet américain n° 4 395· 403 dont le contenu est incorporé à la présente demande à titre de référence.

Dans les dérivés polypeptidiques de formule VIII ci-dessus, les définitions suivantes , prises isolément ou en combinaison, sont préférées : 15 Lorsque >N-CH(Z^)-C0- a la définition donnée sous 1), ce reste est de préférence un reste de (L)- ou (D)-phénylalanine ou un reste de (L)- ou (D)-tyrosine (où Z signifie benzyle ou p-OH-benzyle), spécialement un reste (D)-phënylalanine.

20 Lorsque le reste >N-CH(Z^)-C0- a la défini tion donnée sous 2), Z1 signifie de préférence un groupe alkyle contenant 3 atomes de carbone, de préférence 4 atomes de carbone, ou plus, par exemple jusqu'à 7 atomes de carbone.

25 Le reste >N-CH(Z1)-C0- est plus préférablement un reste tel que défini sous 1).

Y-j et Yg ont de préférence les significations données ci-dessus sous 1, 2 ou 4, et tout particulièrement forment ensemble une liaison.

30 B signifie de préférence Phe ou Tyr.

C signifie de préférence -(D)-Trp.

D signifie de préférence Lys .

/ • 22 4 » * * * E signifie de préférence Thr.

F signifie de préférence CO-N*' R3, 5 spécialement co-h^r3 sCH(R5)-Xl dans lequel le radical -CH(Rg)-X-j a de préférence 10 la configuration L.

R3 signifie de préférence l'hydrogène,

Rg signifie de préférence CH2OH, CH-OH, i-butyl, CH2CH2OH ou (CH2)3-OH, ch3 15 spécialement CH2OH ou CH-OH, ch3

en particulier CH-OH

CHj 20 X1 signifie de préférence -CO-H * R6 Nr7 ou CH20R2» spécialement CH20R2, R2 signifie de préférence l'hydrogène.

25 R2> comme reste d'un ester , signifie de préférence HCO, alkylcarbonyle en C2-Cl2 ’ phënylalkyl -carbonyle en C8~C12 ou benzoyle.

Les restes en position 2 et 7 ont de préférence la configuration L.

30 Les dérivés glucosylés de somatostatine particulièrement préférés sont ceux qui ont un reste glucidique sur le groupe amino N-terminal, par exemple les composés de formule ; 23 • ) « s X îi r f2-s-Yi vsf2-

" - CH2-NH-CH -CO - N -CH-CO-B-C-D-E-NH-CH-F

5 (vmï)

-'"V

,0 \z hoa Ί Ï1 r ?VWl VSf2 NH“CH -CO-N-CH-CO-B-C-D-E - NB - CH - F A z a1 CH--S-Y. "tVIIIb) y -s-ca.

• . I 1 * i .

G -CO-N-CH - CO - N- CH - CO - B- C- D- S- NH-CH-F

15 3 ( Ville) .--q ? ïi f fr*-1! Vs-f2

q ‘ V-/0-Q'-N -CH-CO-N-CH-CO-B-C-D-E-NH-CH-F

20 (VUId ) _.-q a ^ a* a2-S-h Y2-s-ai2

G4 WnH-Q -N -CH -CO -N- CH-CO-B-C-D-E-NH-CH-F

25 dans laquelle Q sigrrifie CO ou CS

( Ville ) H Z1 A'CH2-S-Y1 y2‘S"CH2

Mil ! H0CH2-(CH0H)c-CY-CH2-N-CH-C0-N-CH-C0-B-C-D-E-NH-CH-F 30 (VlIIf) / Î 24 1 » * *

Les composés particulièrement préférés sont les composés de formule Villa, VlIIb, Ville et VlIIf.

Un groupe de composés comprend les composés de formule VlIIpa 5 ZL V CHj-S^ Y2"S-<:H2 ,\P-NH-CH-CO-N-CH-CO-B-C-D-E-NH-CH-F . .

1 2 3456 7 (Vlllap) 10 dans laquelle

Ap signifie le reste désoxy d'un cétose ou d'un acide uronique correspondant, le groupe CH^ de ce reste étant lié au groupe NH, ledit groupe désoxy pouvant 15 être obtenu par réaction . d'Amadori d'un aldose ou d'un acide uronique correspondant avec le groupe amino libre de la somatostatine et Z y A', Y1, B , C, D, E, ont les significations données précédemment pour la formule VIII.

'20 Un autre groupe de composés comprend les L· composés de formule VIIIp A Z A' CH,-S-Y. Y,-S-CH, «· .*41 2,2

G-CO-N-CH-CO-H-CH-CO-S-C-D-E-NH-CH-F

1 2 3 4 5 6 7 25 (VIIIPD) dans laquelle G représente le reste acyle d'un acide uronique, d'un acide polyhydroxycyclohexanecarboxylique, d'un acide 30 N-acêtylmuraminique ou d'un acide N-acétyl-neurami- nique, A représente l'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci-C3 ou alcanoyle en Ci -C^» * * 9 25 et Z, A', Y.j, B, C, D, E, Y2 et F ont les significations données précédemment.

Avantageusement, G signifie le reste d'un acide glucuronique, galacturonique ou quinique.

5 Un autre groupe de composés comprend les composés de formule VIIIpc A Z A' ca2-S-Yl Y2-S-CH2 Q-O-C H. -CO-N-CH-CO-N-CH-CO-B-C-D-E-NH-CH-F (VIIIpc) IQ n2n 1 2 3 4 S 6 7 dans laquelle Q représente l'hydrogène ou le reste glucosylique d'un 15 mono- , di- ou oligosaccharide, n signifie un nombre entier de 1 à 6 inclus, A signifie l'hydrogène, un groupe alkyle en -C3 ou alcanoyle en et Z , A', Yj, B, C, D, E, Y2 et F ont les significations 20 données précédemment.

Une autre classe préférée de peptides glucosylés comprend les dérivés glucosylés de la calcitonine.

Le terme calcitonine comprend les calcitonines se trouvant dans la nature (obtenues à partir de 25 sources naturelles, de cultures de cellules etc ou obtenues par synthèse) et leurs dérivés et analogues.

Les calcitonines naturelles qui peuvent être utilisées comprennent la calcitonine humaine, de saumon, d'anguille, de poulet, de boeuf, de mouton, 30 de rat ou de porc, spécialement la calcitonine humaine, de saumon, de poulet et d'anguille.

Les dérivés et analogues de ces calcitonines /comprennent en particulier les calcitonines naturelles 26 ft > dans lesquelles un ou plusieurs restes d'amino-acides ont été remplacés par un ou plusieurs autres restes d'amino-acides et/ou le pont S-S- a été remplacé par un pont alkylène, et/ou dans lesquels un ou plusieurs 5 restes d'amino-acides ont été supprimés.

Les dérivés glucosylës de calcitonines particulièrement préférés sont les dérivés glucosylés des calcitonines répondant S la formule X

io yi *2 R- (NH-CH-CO) e-As-NH-Ca-CO-Aa-A9-Zl-PreNH2 dans laquelle R signifie H ou R"C0 15 R"C0 représente le radical acyle d'un acide carboxy-1ique, Y.j représente le reste situé sur l'atome de carbone a d'un a-amino-acide, Y£ représente le reste situé sous l'atome de carbone a 20 d'un a-ami no-acide, ou un reste -ch2-s-s-ch2-ch-cooh, -ch2-s-s-ch2-ch2-cooh, NH2 -(CH2)s-C00H ou -CH2-S-Y3, 25 Y3 signifie un groupe alkyle en C-j-C^, benzyle éventuellement substitué par méthyle ou mëthoxy, ou ch3conh-ch2-, o signifie un nombre entier de 1 à 4, 30 Ag signifie Thr ou D-Thr s signifie un nombre entier de 3 à 5,

Ag représente le reste amino-acyle d'un L-a-amino-acide lipophile neutre, * s v « 27

Ag représente le reste amino-acyle d'un L- ou D-a-amino-acide lipophile neutre, et Z-j signifie un reste polypeptidique si tué en position 10 à 31 d'une calcitonine naturelle ou l'un de ses 5 dérivés ou analogues , qui possède une activité hypocalcêmiante, les 1 à 4 restes Y.j dans la formule X pouvant être identiques ou indépendamment différents , et, à l'exception du reste amino-acyle Ag, tous les restes 10 d'ami no-acides dans la formule X ont la configuration L ou D , ainsi que les sels et complexes de ces composés.

De tels composés sont décrits par exemple dans la demande de brevet britannique 2 184 729 15 dont le contenu est incorporé dans la présente demande à titre de référence.

Z-j dans la formule X signifie un reste peptidique qui peut être présent en position 10 à 31 dans de nombreuses calcitonines connues, par exemple dans 20 la calcitonine humaine, de saumon, d'angui11e , de poulet, de boeuf, de mouton, de rat ou de porc,ainsi que dans des dérivés et analogues de ces calcitonines ayant une activité similaire . Par dérivés et analogues de ces calcitonines, on entend spécialement des calcitonines 25 naturelles dans lesquelles un ou plusieurs restes d'amino-acides ont été remplacés par un ou plusieurs autres restes d'amino-acides, ou dans lesquelles le pont S-S a été remplacé par un pont alkylëne, ou dans lesquelles un ou plusieurs restes d'amino-acides 30 ont été supprimés. Ces restes peptidiques contiennent normalement 22 amino-acides»mais peuvent également /contenir de façon correspondante un nombre moins élevé de restes d'amino-acides par élimination m 28 a * A * de un ou plusieurs restes d'amin.o-acides (dérivés des-ami noacylés).

Z^ signifie de préférence a) Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr- 5 Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala b) Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr 10 c) Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-

Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr

Les composés de formule X dans laquelle a la définition de b) ou c), de préférence ceux 15 dans lesquels Z^ a la définition donnée sous c), sont spécialement préférés.

R"C0 signifie de préférence le reste acyle d'un acide carboxylique aliphatique, cycloaliphatique, aromatique ou hétérocyclique.

20 R" signifie de préférence a') un groupe alkyle linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, contenant de 1 à 17 atomes de carbone, spécialement un groupe alkyle saturé en C^-Cg, b') un groupe cycloalkyle en C^-C^ ou cycloalkylalkyle 25 dans lequel le reste cycloalkyle est en C5-C^ et le reste alkyle en C-j-C2» c')un groupe adamantyle, adamantylméthyle ou adaman-tyléthyle, ou d')un groupe phënyle, benzyle ou phénëtyle.

30 Dans les définitions données ci-dessus pour R", les groupes alkyle, cycloalkyle ou phënyle /y peuvent comporter des substituants usuels, par y exemple des halogènes ou des groupes NOg» OH, alcoxy,etc.

0 29 * t *-

Le reste R"CO peut être par exemple le reste α-dësamino ou d'un a-amino-acide naturel.

Pour R", les définitions a'), b*) et c') sont préférées.

Yj et Y£ comme restes se trouvant sur 5 l'atome de carbone a d'un α-amino-acide , représentent en particulier les restes qui sont liés sur l'atome de carbone a d'un a-amino-acide naturel» mais peuvent également signifier des restes d'autres a-amino-acides, par exemple de la 3-cyclohexylalanine 10 ou d'un acide a-amino-isobutyrique.

Lorsque o dans la formule X signifie 4, a) le reste aminoacyle N-terminal (correspondant au deuxième reste d'amino-acide dans la séquence des calcitonines naturelles] signifie de préférence Ser, 15 Gly ou Ala, b) le deuxième reste aminoacyle (correspondant au troisième reste d'ami no-acide dans la séquence des calcitonines naturelles) signifie de préférence Asn ou Ser, 20 c) le troisième reste amino-acyle (correspondant au quatrième reste d'amino-acide dans la séquence des calcitonines naturelles) signifie de préférence Leu, Asn, Ser, Phe, D-Leu ou le reste de la cyclo-hexylalanine, 25 d) le quatrième reste amino-acyle (correspondant au cinquième reste d'amino-acide dans la séquence des calcitonines naturelles) signifie de préférence Ser ou Ala.

Lorsque o dans la formule X signifie 3, 30 le N-terminal,le deuxième et le troisième reste d'amino-acide ont les mêmes définitions préférées que celles données ci-dessus pour le cas où o = 4 sous b).

/ * 30 » * « τ

Lorsque ο dans la formule X signifie 2, le N-terminal et le deuxième reste d'amino-acide ont les mêmes définitions préférées que celles données ci-dessus pour le cas oû o = 4 sous c) et d).

5 Lorsque o dans la formule X signifie 1, le N-terminal et le deuxième reste d'amino-acide signifient de préférence Ser ou Ala.

Ag signifie de préférenc Thr 10 v.

» 2 -NH-CH-co signifie de préférence Cys, un dérivé de la cystéine tel que donné ci-dessus pour Y£ ou un reste a-amino-acyle lipophile neutre, spécialement Ala ou 15 un autre reste a— amino-acyle lipophile neutre, tout parti culiêrement Ala.

Ag signifie de préférence le reste amino-acyle d'un a-amino-acide lipophile neutre, spécialement Val ou G1 y.

20 Ag signifie de préférence également le reste amino-acyle d'un a-amino-acide lipophile neutre, spécialement Leu ou Phe.

Dans les composés de formule X, o signifie de préférenc 2, R signifiant H ou R"C0 , ou en particu-25 lier o signifie 1 et R signifie R"C0.

Tous les restes d'amino-acides ont de préférence la configuration L.

Les calcitonines glucosylées (y compris les dérivés et analogues) sont spécialement celles qui sont 30 glucosyléessur le groupe amino N-terminal ou sur un ou plusieurs groupes amino situés dans une ou plusieurs ^ chaînes latérales, par exemple les composés de

U

31 0 • * * * formules Xla à Xlf .. o.

i V

'-'..Ach^-cIc (XU) 5 2

/ ’ \~OB

l2../ (XIb) \iH-Calc

A

10 G 3CO-N-Calc ( XIc )

VA

*'·***” ( Xld ) - · ·· 15 S4 V^/NH-Q-NH-Calc ( Xle ) (Q =C0 or CS) 20 ou HOH2C-(CHOH)-CY-C-H2NH-Calc (xIf j dans lesquelles Cale représente le reste d‘une calcitonine naturelle ou l'un de ses dérivés ou analogues, 25 lié au reste glucidique par l'intermédiaire d'un groupe ami no sur l'extrémité N-terminale ou dans une chaîne latérale.

Les dérivés de calcitonine de formule X peuvent être préparés selon les méthodes généralement 30 connues pour la synthèse de polypeptides de ce type. Les polypeptides correspondants aux formules ci-dessus ^ peuvent être préparés par exemple comme suit : 32 * * ♦ * a) on élimine au moins un groupe protecteur présent dans un polypeptide protégé ayant la séquence donnée dans la formule X, ou b) on couple par une liaison amide deux unités pepti- 5 d.iques dont chacune contient au moins un reste d'amino-acide ou l'un de ses dérivés, comme décrit pour la formule X, sous forme protégée ou non-protégée, les unités peptidiques étant telles qu'on obtient la séquence d'amino-acidescorrespondant à la formule X et, 10 si nécessaire, on met en oeuvre l'étape a) du procédé , ou c) on fait réagir un composé de formule X, dans laquelle R signifie l'hydrogène, sous forme protégée ou non-protégée, avec un acide formule R"C00H ou l'un 15 de ses dérivés réactifs et, si nécessaire, on met en oeuvre l'étape a) du procédé, ou d) pour préparer un composé de formule X dans laquelle Y2 signifieCHg-S-S-CHg-ÇH-CQQH ou CH,-S-S-ChL-CH.-COOH, nh2 2 2

20 on fait réagir un composé de formule XII

Y^ CH2-SH

R-(NH-CH-CO)o-As-NB-CH-CO-A8-Rg-Zl-ProNH2 ( XII ) 25 sous forme protégée ou non protégée,

avec un composé de formule XIII

CH,-S-R.n . 2 (ΧΠΙ) R^-V-CH-COR^ 30 dans laquelle R^q représente un groupe qui facilite lj{· la formation d'un pont S-S- avec l'atome de soufre yy? et l'autre groupe CH2SH présent dans le peptide Λ *

« V

» 33 de formule XII» R^l signifie l'hydrogène ou un groupe protecteur du groupe amino, R.J2 signifie OH ou un groupe protecteur du groupe 5 carboxy , et

V signifie l'hydrogène ou un groupe NH, ou bien on fait réagir un composé de formule XIV

f2"SR10 (XIV) 1 0 (NH-CH-CO) Q-A6-NH-Ca-CO-Ag-A9-21-ProNH2

sous forme protégée ou non protégée, dans laquelle R10 a la signification donnée précédemment, avec un composé de formule XV

15 ch2-sh r1£^-ch-cor3 (xv) et éventuellement on met en oeuvre l'étape a) du procédé.

20 Lorsque la préparation des produits de départ n'est pas décrite , ces composés sont connus ou peuvent être préparés et purifiés selon les méthodes connues.

Les produits finals de formule X peuvent être purifiés selon les méthodes habituelles de manière qu'ils 25 contiennent moins de 5% de sous-produits polypeptidiques. Les peptides utilisés comme produits de départ dans les étapes a) et b) du procédé peuvent de manière similaire être préparés de manière connue en solution ou selon le procédé en phase solide.

30 Les unités peptidiques qui contiennent un groupe -CH2-S-S-CH2-CH2-C00H ou CH2-S-S-CH2-CR(NH2)-C00H en tant que reste Y2» peuvent être préparés de manière analogue à l'étape d) du procédé mentionné précédemment.

» 34 A *· * *

Dans cette étape du procédé d), on utilise des composés de formule XIII ou XIV dans lesquels R.Jg signifie des restes connus qui réagissent avec les thiols j . ’.touten formant une liaison S-S-. R1Q 5 signifie en particulier S-alkyle, -S-C00alkyle, S<§T2 ou $-S03-.

Dans ces restes, alkyle signifie spécialement 10 un groupe alkyle inférieur contenant de 1 à 4 atomes de carbone. L'introduction de ces restes dans les composés ayant des groupes SH libres peut être effectuée de manière analogue aux méthodes connues dans la chimie du soufre.

15 Une autre classe préférée de composés de l'invention comprend un groupe d'antagonistes de la LH RH.

De préférence, les composés comprennent les dérivés glucosylës des composés de formule XVI

' 20 V'l'*lVl'VriVl'VV*2 (XVI ) dans laquelle R.j signifie H ou un groupe acyle en C-j-Cy, A-| signifie D-Phe, éventuellement substitué dans le 25 cycle phényle par F, Cl, Br, NH2> CH3 ou 0CH3, spécialement en position 4, un reste ß-D-naphtylalanine, D-Trp éventuellement substitué en position 5 ou 6 par F, Cl, Br, NH2, ou 0CH3 et/ou substitué en position 1 par un groupe formyle ou acëtyle, un reste proline, 30 3,4-dëhydroproline ou D-pyroglutamine B.| signifie D-Phe éventuellement substitué par F, Cl,

Br, NH2, CH3 ou CH30 dans le cycle phényle, » . i * * » 35 D-a-mëthylphënylalanine, éventuellement substituée en position 4 par Cl, ou ß-D-naphtylalanine.

C.| signifie D-Trp éventuellement substitué en position 5 5 ou 6 par F, Cl, Br, NHg et/ou 0CH3 et/ou en position 1 par HCO ou CH^CO, ß-D-naphtylalanine, 3-D-pyridylalanine, D-Tyr, ou 10 Phe éventuellement substitué par F, Cl, Br, NHg, CHg»ou.

ch3o, signifie Ser, E-j signifie Tyr ou·phënylalanine éventuellement substituée dans le cycle phênyle par ci, Br, NH2, CH3 ou CH30, 15 F-j signifie D-Phe, éventuellement substitué dans le cycle phênyle par F, Cl, Br, NH^, CH3 ou CH30, D-Trp éventuellement substitué en position 5 ou 6 par F, Cl, Br, NH^ ou CH30 et/ou en position 1 par formyle ou acétyle, 20 D Tyr, ß-D-naphtylalanine, D-Leu, D-Ile, D-Nle, DVal, D-Ser-(OtBu), D-Arg, éventuellement dialky1é par des groupes alkyle en Cj-Cg ou cycloalkyle en Cg-Cg, D-homoarginine éventuellement dialkylêe par des 25 groupes alkyle en C^-Cg ou cycloalkyle en Cg-Cg, D-His, D-His(Bzl), D-Lys ou D-Orn, tous les-deux éventuellement dialkylés par des groupes alkyle en C^-Cg ou cycloalkyle en

W

30 D-Phe (p-NH2) ou a-p-aminocyclohexylalantne, signifie Leu, Nie, Nva, Ν-α-méthylleucine, Trp, /Phe, Met ou Tyr, 36 « * * * H1 signifie Arg, Lys ou Orn éventuellement substitués par des groupes alkyle en C^-Cg ou cycloalkyle en C5’C6 * 1^ signifie Pro, hydroxyproline, ou 3,4-déhydroproiine, 5 et K-j signifie D-ATa.

Si on le désire, E] et F] peuvent être remplacés l'un par l'autre. D-j et peuvent, si on le désire, signifier des restes Cys liés par un pont S-S-. 10 Si on le désire, un des symboles et signifie Asp ou Glu et l'autre signifie Orn, l'acide diaminopropionique ou l'acide diaminobutyrique, et les restes et K1 sont liés par un pont amide.

Les significations préférées sont les 15 suivantes : R.| = acétyle ou formyle A-j = D-Phe, D-Phe (p-Cl ), ß-D-naphtylalanine, 3,4-dëhy-droproli ne, B-j = D-Phe éventuellement substitué comme indiqué 20 précédemment, C-j = D-Trp éventuellement substitué comme indiqué précédemment, D.j = Ser

Lorsque le reste est substitué, il est 25 de préférence mono-substitué.

(i) E.j = Tyr ou Phe éventuellement substitué comme indiqué précédemment,1orsque = D-Phe ou Lys, ou bien (ii) E-j = D-Phe ou Lys lorsque = Tyr ou Phe êventuel- 30 lement substitué comme indiqué précédemment, G.| = Leu H1 = Arg / ft ft ♦ » • 37 I-j = Pro K1 = D-Al a

Dans les antagonistes de la LHRH mentionnés ci-dessus, le reste glucidique est de préférence 5 fixé au groupe amino N-terminal ou à un groupe amino libre situé dans une chaîne latérale du peptide.

Les dérivés glucosylës ont de préférence les structures XVIa à XVIf suivantes dansl esquell es" NH^-LHRH antag." signifie un antagoniste de la LHRH 10 de formule XVI donnée précédemment: ?i VB (χν·>) - - - CH NH-LHRH-Antag.

15 "-V

/ °B ( XVIb) "\iH-.LËRH-Antag.

20 G3-CO-NH-LHHH-Antag. ( XVI c ) \-*/NH-Q-NH-LHBH-Antag. ( XVId ) 25 ^yyO-Q’-NH-LHRH-Antag, ( XVIe) * ^ 30 HOCH.C- (CHOH) -C-CH- -NH-LHRH-Antag. (XVIf) ^ C N 2

Y

« 38 * * t ·

Dans les formules XVIa à XVIf ci-dessus, pour des raisons de simplicité on a représenté uniquement un reste glucidique lié à un groupe amino. Cependant, la molécule peut contenir plus d'un reste 5 glucidique lorsque l'antagoniste de la LHRH contient plusieurs groupes amino. De préférence, la molécule contient deux restes glucidiques.

Les antagonistes de la LHRH , utilisés comme produits de départ, sont connus ou peuvent être préparés 10 selon les méthodes connues, par exemple comme décrit dans les demandes de brevet européen n° 81887 et 201260.

D'autres dérivés glucosylés préférés sont ceux qui dérivent des peptides suivants : 15 a) l'oxytocine et la vasopressine, ainsi que leurs g dérivés , par exemple la Lys -vasopressine et la Λ 8

Orn -vasopressine, b) l'insuline, c) le GRF et ses dérivés.

20 Les produits de départ et les composés de l'invention peuvent être préparés par synthèse en phase liquide ou en phase sol i de.

Les composés de l'invention peuvent être avantageusement préparés par synthèse en phase solide.

25 La demanderesse a trouvé un procédé spéciale ment avantageux pour la préparation de peptide-alcools qui comportent à l'extrémité C-terminale de la chaîne peptidique deux groupes alcool ou un groupe alcool et un groupe thiol. Le procédé est spécialement 30 approprié pour la préparation de peptide - alcools contenant un reste C-terminal thrêoninol, sérinol ou cystéinol.

l/ » * * * *·' 39

Des exemples de composés appropriés comprennent certaines des somatostatinés décrites précédemment.

La synthèse du peptide en phase solide s'est révélée être un procédé spécialement rapide 5 et favorable pour la préparation de peptides et est devenue par conséquent une méthode généralement courante.

Comme on le sait, un amino-acide est d'abord lié par ses groupes carboxy au groupe hydroxy ou 10 amino d'une résine synthétique insoluble pour former un groupement ester ou amide; les autres amino-acides sont ensuite ajoutés à cette résine dans l'ordre désiré et le polypeptide final est scindé à partir de la résine support.

15 Cette synthèse s'effectue sans problème pour des polypeptides normaux ayant des amino-acidés C-terminaux. Cependant, des polypeptide - alcools qui comportent à l'extrémité C-terminale un amino-alcool à la place d'un amino-acide, ne forment pas facilement 20 une liaison avec des résines support comportant des groupes OH ou NH2 et/ou ne sont pas facilement scindés lorsque la synthèse est terminée.

Les procédés suivants ont été proposés auparavant comme procédés possibles en phase solide pour la 25 préparation de peptide - alcools: a) préparation classique du polypeptide correspondant contenant à l'extrémité C-terminale un amino-acide (sous forme d'ester avec une résine comportant des groupes OH) et ensuite scission par réduction en 30 utilisant des hydrures du bore, le groupe carboxy étant transformé simultanément en fonction alcool (brevet américain n° 4 254 023 / 4).

, ! * • * 40 b) Addition de Γamino-alcool terminal sous forme d'ëther avec une résine hydroxyméthylêe en utilisant le carbonyl -diimidazole et, après synthèse du peptide, scission en utilisant HCl/TFA ou HBr/TFA 5 (Kun-hwa Hsieh et G.R. Marshall, ACS National

Meeting, New Orleans, 21-25, 3. 1977).

Cependant, ces deux procédés nécessitent des conditions de scission énergiques.

La demanderesse a trouvé que la scission du 10 peptide à partir de la résine , tout en formant simultanément le peptide-alcool C-terminal , est effectuée sous des conditions douces lorsque l'amino-alcool C-terminal èst relié à la résine par une liaison acêtal .

15 Selon l'invention, le peptide-alcool qui comporte à l'extrémité C-terminale de la chaîne peptidique deux groupes alcool ou un groupe alcool et un groupe thiol , est préparé par hydrolyse acide d'un acêtal du peptide-alcool avec unerésine polymère comportant 20 des groupes formylphënyle (désigné synthèse de l'invention dans la présente demande).

La réaction peut être illustrée schématiquement comme suit : fl

25 cS'x"ca H

-(cfr\„ >«»«·* -» 2 «ri

__ ÇHRl“XH

@.Z_/07CHO + Y-CO-NH-CH-CH,OH

30 '—' \ dir) jf t 41 I * * * où

0 est le reste d'une résine synthétique insoluble Z représente une liaison directe ou un reste qui relie la résine avec le groupe formylphényle acëtalisë 5 X signifie 0 ou S

R.j signifie l'hydrogène ou un groupe méthyle, et Y est le reste d'un peptide-alcool qui peut par exemple comporter des groupes protecteurs, le groupe CHO- éventuellement acêtalisé étant 10 situé en position mëta ou para du reste Z.

Pour des raisons de simplicité, dans les formules Iret Ilrdu schéma ci-dessus, on a représenté seulement un substituant sur la résine; il va de soi cependant qu'un certain nombre de ces groupes sont 15 liés à la molécule de la résine polymère. La scission du peptide-alcool a partir de la rêsine,par hydrolyse du groupe acétal , est effectuée comme mentionné ci-dessus sous des conditions acides, par exemple avec de l'acide trif1uoroacétique dilué. L'hydrolyse peut 20 être effectuée à la température ambiante.

Lorsque Z dans la formule Ir signifie une liaison directe, les restes phényle comportant les groupes acétal sont directement liés au reste polymère et appartiennent au polymère. Des exemples de tels 25 composés de formule Ir sont les acëtals d'une résine de polystyrène formylée(dans la formule Ir, 0signifie dans ce cas une chaîne polyéthylène).

Lorsque Z signifie un reste, ce reste contient dans ce cas un groupe qui résulte de la réaction 30 d'un groupe réactif , lié directement ou indirectement au polymère, avec un autre groupe réactif lié directement ;ÿj ou indirectement au groupe formyl phényl e ( acêtalisé).

SA I

42 Λ » ♦ *

Le reste Z peut être représenté par exemple par la formule Illr suivante: P 1 2 q ( 11 Ir) 5 dans laquelle

Ql = le reste d'un groupe réactif lié au polymère = le reste d'un groupe réactif lié au groupe formylphënyle (acëtalisê) 10 D = un reste qui relie le groupe Q1 au polymère E = un reste qui relie le groupe Q2 avec le groupe formylphënyle (acêtalisë) p et q , indépendamment l'un de l'autre, signifie 0 ou 1. Le groupe Q^-Qg signifie· de préférence un 15 groupe ester ou amide, spécialement un groupe carboxa-mide. signifie de préférence NH et Q2 signifie de préférence CO.

D et E, indépendamment l'un de l'autre, représentent par exemple des restes alkylènes ou alkylène-20 oxy contenant de 1 à 5 atomes de carbone. Les composés de formule Ir dans laquelle Z signifie un reste de formule Illr, sont par exemple des composés dans 1 esquels0-D-Q^ est le reste d'une résine de polystyrène aminomêthylêeet le reste 25 R]>

^ X-CH

30 signifie un reste de formule IVr / * 43

\ A

• * fl ^ ^X_CH\ /7TV:h ch-nh-co-y -«*-,0^ (IÏP) OR 2 5 dans laquelle R = l'hydrogène ou un groupe méthyle et m signifie 0 ou 1, le groupe acétal étant situé en position mêta ou para.

10 Dans ce cas, Z représente par conséquent -CH2-NH-CO-CH-(O)m-

R

et @ signifie le polystyrène.

15 Le reste IVr signifie de préférence un reste

''R

_ /X-CH 1 -CO-CS,-0-/o}-CH ^CH-NH-CO- Y w \o-ch2 20 A la place du polystyrène aminométhylé, on peut utiliser également d'autres polymères, spécialement ceux comportant des groupes NH2 ^^bre5 , par exemple les polyacrylamides comportant des groupes aminoéthyle. Comme mentionné ci-dessus, le groupe 25 formylphényle acétalisé est de préférence lié au polymère par une liaison amide. Cela garantitque la liaison du reste formylphényle acétalisé à la résine est stable durant la synthèse et la scission du polypeptide et que la scission a lieu sur la liaison acétal comme désiré 30 de sorte que d'une part le peptide-alcool est synthétisé et que, d'autre part, le reste formylphényle reste sur la résine.

/ «y » «

* V

44

Si on le désire, le peptide-alcool peut être fixé à une distance plus grande de la résine par incorporation d'un groupement dit groupement d'espacement ( spacer) entre les groupes réactifs du polymère 5 (spécialement les groupes amino) et les groupes réactifs du dérivé formylphënyle acëtalisé (spécialement les groupes carboxy). Pour certaines réactions sur le peptide alcool, cela peut avantageusement avoir lieu avant la scission (par exemple oxydation des 10 restes cystéines). Dans ce cas, le reste D ou E dans la formule Ilr contient en plus le groupement d'espacement et Q.j ou (?2 représentent le reste réactif du groupement d'espacement.

Le groupement d'espacement utilisé 15 peut être par exemple un acide <A>aminocarboxyl ique, tel que 1 ' aci de C-ami nocaproique.

Dans un cas spécifique, lorsqu'on utilise du polystyrène aminométhylé, un reste de formule IVr et l'acide £-aminocaproique comme groupement d'espa- 20 cernent, Z signifie -CH2-NH-CO-(CB2)g-NH-CO-CH-(0>m-

R

Les composés de formule Ir peuvent être ' préparés selon des méthodes qui sont usuelles dans 25 la technologie en phase solide , en utilisant comme produit de départ le composé de formule Vr *1

^X-CH

- /“VC a ^CH-NH-A .

so <Vr> » « 45 ♦ * % * dans laquelle A représente un groupe protecteur du groupe amino et le groupe acêtal est en position méta ou para du reste Z. A cet effet, on scinde d'abord le groupe protecteur A puis on fait réagir le groupe 5 amino libre avec 1‘amino-acide N-protëgé suivant etc.., jusqu'à ce que tous les amino-acides aient été ajoutés à la résine dans la séquence correspondant à celle du peptide-alcool désiré.

Les groupes protecteurs du groupe amino 10 qui doivent être choisis pour les amino-acides utilisés ou pour 1'amino-alcool, doivent être ceux qui sont scindés sous des conditions non acides, étant donné que sous des conditions acides il se produit une hydrolyse du groupe acëtal . Le groupe 15 CF3CÛ- ou le groupe FM0C- (9-fluorënylméthyloxycarbonyle) peuvent être utilisés , par exemple comme groupes protecteurs du groupe amino. Ces groupes protecteurs sont scindés en milieu basique selon les méthodes connues dans la chimie des peptides.

20 Uniquement les groupes protecteurs situés dans la chaîne latérale et le groupe protecteur du groupe amino du dernier amino-acide introduit peuvent être labiles aux acides et sont donc éliminés simultanément de la résine avec la libération . du peptide-25 alcool.

De préférence, les groupes Boc sont présents comme groupes protecteurs.

Comme bases, on utilise de préférence KOH, ou la pipêridine ou NaBH^.

30 La synthèse de la chaîne peptidique peut être effectuée de manière classique à partir d'un reste peptidique ayant des groupes amino libres et 4 46 t y 1 *· un amino-acide dont le groupe carboxy est libre ou acti vê.

La réaction peut être effectuée par addition par exemple d'hydroxybenzotriazole et de dicyclohexyl-5 carbodiimide.

Les composés de formule Vr peuvent être préparés par exemple a) par réaction d'une résine comportant un groupe aldéhyde et répondant à la formule Ilr 10 ©-î-@cal» (Hr) dans laquelle le groupe CHO est en position mëta 15 ou para du substituant Z, avec un amino-alcool N-protégé de formule

HX-CHR-j -CH(NHA) -CH2QH

éventuellement sous forme activée,ou 20 b) par réaction d'une résine de formule ®-<DÏ-e|

P

avec un composé de formule VIr /Ri

25 X-CH

, !—y. CH ^CH-NH-A (VIr) dans laquelle groupe acétal est en position mêta 30 ou para du groupe Qj -(E)-^ et

Qj et Q£ sont deux groupes réactifs qui réagissent ensemble pour former un pont Q1 — Q2.

t * c ► « 47 L'acétalisation du procédé a) peut être effectuée en présence d'un acide comme catalyseur.

Les acides appropriés comprennent les acides p-toluène-sulfonique et l'acide p-trifluoromëthyl phénylsulfonique.

5 Si on le désire, on peut utiliser le groupe triméthylsilyle comme groupe protecteur d'un alcool 1i bre.

Le procédé d'estérification b) peut être effectué sous des conditions très douces, par exemple 10 par réaction d'un dérivé d'un acide carboxylique avec un polymère comportant des groupes OH ou NH2·

Les composés de formule VIr peuvent être préparés par acétalisation d'un composé de formule

15 “O

avec un composé de formule

HX-CHR1-CH(NHA)-CH2QH

L'acétalisation peut être effectuée comme 20 indiqué dans le procédé a).

Durant la synthèse et la scission du peptide-alcool â partir de la résine, d'autres réactions peuvent être effectuées, par exemple élimination des groupes protecteurs, par exemple élimination 25 des groupes protecteurs du groupe thiol, ou oxydation des restes cystéines.

De tellés réactions peuvent être effectuées après scission du peptide-alcool en phase liquide.

Selon la synthèse de l'invention, on peut 30 préparer avec facilité des peptides pharmacologiquement actifs et d'autres peptides qui contiennent sur l'extrë-j. mité C-terminale2 groupes alcool ou un groupe ßL alcool et un groupe thiol .

48 1 · « >

Les exemples suivants illustrent la présente invention sans aucunement en limiter la portée.

Toutes les températures sont données en degrés Celsius 20 et les valeurs [a]Q sont non corrigées. Les abrévia-5 tions suivantes ont été utilisées :

AcOH = acide acétique

Boc = tert.-butoxycarbonyle

Bu^ = tert.-butyl DCCI = dicylcohexylcarbodiimide 10 DMF = diméthylformamide

Fmoc = 9-f1uorênylméthoxycarbonyle

MeOH = méthanol NEt3 = triéthylami ne

Thr-ol = reste thréoninol = CH^-CHOH-CHiCH^OHJ-NH-15 TFA = acide trifluoroacétique HO B t = N-hydroxybenzotriazole h p G R F = facteur déclenchant la sécrétion de l'hormone de croissance pancréatique humaine HOSu = N-hydroxy-succinimide.

20 Tous les peptides sont obtenus sous forme de polyacétates polyhydratés ayant une teneur en peptide de 70 à 90%.

La chromatographie en phase liquide (HPLC ) indique que les peptides contiennent moins de 5% 25 d'autres peptides.

Le facteur "F" mentionné dans les exemples suivants indique la teneur en peptide dans le produit obtenu ( F * 1 indique une teneur en peptide de 100%).

La différence jusqu'à 100% C( 1 - F) χ 100] est constituée 30 par de l'acide acétique et de l'eau.

Tous les sucres ont la configuration a , sauf indication contraire.

/ 49 * r * t

Exemple 1

Na-ft-désoxyf ructosyl -DPhe-dys-Phe-DTrp —Lys-Thr-Cys-Thr-ol > acétate 'kfor _ ho ^-Y **t,-{D)Pho-Cys~Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol Acecaed ho u A 400 mg de [Na-|i-désoxyfructosyl ]-D-Phe-Cys-Phe-DTrp-Lys(BOC)-Thr-Cys-Thr-ol on ajoute 3 ml 10 d'acide trifluoroacétique (100%) et on maintient à la température ambiante jusqu'à ce que tout le produit de départ soit dissous (5 minutes). Après addition de 20 ml d'éther diisopropylique, on sépare par filtration le composé du titre qui a précipité et on le lave 15 à 11 éther diisopropyl ique. Le composé est purifié par chromatographie sur gel de silice (êluant : CHC1 ^/MeOH/HOAc/I^O 7/3/0.5/0.5) et isole' sous forme d'un lyophilisât blanc. [a]*0 = -31,3° (c= 0,52 dans HOAc à 95%) F : 0,88.

20 Le produit de départ peut être préparé comme suit : _ a ) HrDPhe^çÿs-Phê-DT^-LyajBQÇ^Thr^çÿs^Thr^gl A une solution de 10 g de H-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol,acétate dans 10 ml de DMF, on 25 ajoute lentement goutte à goutte à la température ambiante 2,25 g de percarbonate de di-tert.-butyle dissous dans 30 ml de DMF. Après deux heures à la température ambiante, on élimine le solvant sous vide et on ajoute 200 ml d'éther dïisopropylique 30 au résidu. Le produit qui s'est formé est séparé

par filtration, lavé à l'éther diisopropylique et séché. Le produit brut est purifié par tj// chromatographie sur gel de silice (êluant : Ci^C^/MeOH

A/f 9/1) et ensuite isolé sous forme d'une poudre amorphe 50 t » * » blanche. Cot]D =29,8° (c = 1,28 dans le DMF). b ) N^-^-desox^fruçtosYl^DPhe^ÇŸs-Phe-DTrg-L^siBOÇ^-Thr-çfs^Thr^ol

On dissout 2 g de D-(+)-glucose et 0,5 g du composé de l'étape a) ci-dessus dans 20 ml 5 d'un mélange 9/1 (vol./vol.) de MeOH et de HOAc et on maintient à 60-70° pendant trois heures. Après évaporation , on reprend le produit dans un peu de méthanol et on fait précipiter le composé par addition d'éther diisopropylique. Le composé du 10 titre ainsi obtenu est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant : CHgClg/'^eOH 9/1).

Le produit est obtenu sous forme d'une poudre amorphe.

[a]p° = 12,0° (c = 1,04 dans le DMF).

En procédant de manière analogue à celle 15 décrite S l'exemple 1, on obtient les acétates des composés suivants dans lesquels SMS signifie le reste polypeptidique de formule -DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol .

20

Exemple 2 üiîi 31 y £2 1 ί 11 $ 1 cy ç £2 11

HO--H

\ _Λ H -<\0λ 25 f \ c}'

Jfc-jU-jîn·*« λ O** n

Comme produit de départ,on utilise le 20 o D( + )-maltose à la place du D-glucose. [a3q = -7,9° 30 (c = 0,71 dans AcOH 95¾) F : 0,91.

Exemple 3 nJj-Jœ “5lue o sylJ1 -4) rîrSlïSSSYl llzi f rue tosy1- S MS_ 51 ft * t ► * *·--· w-h» · */—°\T y-%· j/i σ\β» j\ Γ* % Ja |C *· ·/ · y\ μN—Y loJ N—Y —r 5 « «ft ft oft ' " '0 * F 5 0)78

Comme produit de départ,on utilise le 20 maltotriose à la place du D-glucose.[a]Q = +11,3° (c = 0,71 dans AcOH à 95¾).

1n Exemple '4 U ß ~

N -.acide fructofurannuronitjpe-SM'S

&' 1, *1-fCH.-SHS P : 0,88 10 oe t* Ä

Comme produit de départ,on utilise l’acide pn D - g 1 ucuroni que à la place du D-glucose. [a]g = -29,4° (c = 0,34 dans AcOH à 95¾).

20 Exemple 5

Na-dësoxysorbosyl-SMS

25 \0M 0H/| F : °>85 H0 I—f CHrsn%

Comme produit de départ, on utilise le 20 D(+)-galactose à la place du D-glucose . [α]β =-30,4° 30 (c = 0,50 dans AcOH à 95¾).

Exemple 6

// Na-[Q-ft-D-glucosyl-(1-4)-désoxyfructosyl]-SMS

4 r . 52 « * % *

Ί0-* H

H J 0 H J-0 0« M< MyQ 0«)j f—[ ? J-J CHj-shS > * o,3l

5 H OK L-J H

Comme produit de départ, on utilise le D( + )-cel1 obi ose. [a]p° = -28,1° (c = 0,47 dans AcOH 10 à 95%).

Exemple 7

Na-L(-) -désoxyf ructosyl -SMS.

H

15 OH J—OCHjSWS

/h \|

M« M

hN—/<* H GH F ·· °>91 20 Comme produit de départ, on utilise le L(-)-glucose à la place du D(+)-glucose.

[<x]j^ = -20° (c = 0,46 dans AcOH à 95%).

Exemple 8

N -[O-ß-D-glucosyl- (1-6) *Tiésoxy f ructosy 1 ] - SMS

25 ' l·

W--K Y

V—°\°—*n 0H

Kî* *A »k 30 OH^j—p hHX|cH£Sïi£

H OH OH H

/Comme produit de départ, on utilise le gentiobiose à la place du D-glucose.

« Λ » *· » 53

«I

[ct]jj° = 23,5° (c = 0,46 dans AcOH ä 95¾) F : 0,76 .

Exemple 9

Να- [0- ß-D-galactosy 1- ( 1- 4 ) -dësoxy f r u c t o s y 1 3 - S M S

t

5 H4-H( H

°v—®\n 14 .uOH Hyj O OH/j hN)—γ h wN—| chj- sms F : °>83 10 " 0H- 1

Comme produit de départ, on utilise le 20 D( + )-lactose à la place du D-glucose . [otHD = -29,3° (c = 0,55 dans AcOH à 95¾).

Exemple 10

1 ^ Na- ( Ο-α-çpl actosyl -( 1 -6 ) -désoxyf ructosy 1 ) -SMS H

HO--H

Ύ 1 20 \0H H λ “ Γ-Ι°+Ηη m H »0 /ÜN ___.

NK m I ! μ'_rCH^-(0)Phe-Cye-Phe-(0)Trp -Lys-Thr-Cys-Thr-ol

H0 H

25

Comme produit de départ, on utilise le mélibiose à la place du D-glucose.

30 [a]jj° * +8,4° (c = 0,5 dans AcOH à 95¾) F :0,76.

3 <r *" » 54

Exemple 11

[N-(l-dês3xy-D-fpuctosyl )-Tyr- 3-SMS

a 5 (--1 hcSs? HQ/LcH3-(Q)Phe-Cya-Tyr-(0)Trp-Lya-Thr-Cys-Thr-ol ho a

Comme produit de départ, on utilise la 10 Tyr3-$MS à la place de la SMS. [a]1= -32,2° (c = 0,9 dans AcOH à 95%) F : 0,87.

Exemple 12 [N-( α.’-D-gl ucopyr'anosyl - ( 1 -4)-1-dësoxy~ fructosyl),_Tyr3]-SM$__________________ 15 HO-i

J-Ο o 0H |___I

hq^nj /'vfloV H<^/^CHa*(Q)Phe»Cy3-Tyr-(0)Trp-Lys-Thc-Cys-Th^~ol OH ^ 20 F = 0,81

Comme produit de départ, on utilise le 3 D(+)-maltose à la place du D-glucose et la Tyr -SMS 25 à la place de la SMS. [a]^° = 4,7°(c=l,0 dans AcOH à 95%)

Exemple 13 HOCH2 H0lQr ,-, T Ph«-Cys-Ph*-<0)Trp-Ly*“Thr-Cyi-Thr-ol 55 * * • > «

Comme produit de départ, on utilise le D-glucoheptose ä la place du D-glucose.

Ca]p° = -12,9° (c * 1,0 dans AcOH à 95¾) F = 0,91.

Exemple 14

I-r-1 R* (TmfH

R -(D)Phe-Cys-Phe-(0)Trp-Lys -Thr-Cys -Thf- ol HO CH2“

HO

10

Comme produit de départ, on utilise le D(+)-glucose et la SMS non protégée sur le groupe i -NH2 de 1 a 1 y s i n.e.

[a]p° = -42,4° (c = 0,37 dans AcOH à 95%). F = 0,83.

15 Exemple 15 HO«^

_ / °\OH

I R I R* ( Ηθ)| 2Q R-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-o! HO\_/CH2-

HO

Comme produit de départ, on utilise le 25 glucoheptose et la SMS non protégée sur le groupe £-NH2 de 1 a 1 ys ine.

[α]ρ° = -9,3° (c = 0,41 dans AcOH à 95%). F = 0,84.

Exemple 16 30 Λ 56 * « ^ t Ο ΗΟ-Ρ -Ο C?2 oa OH K°Nj

\ HO A. ι I

\ [/ CHj- (0) Fh*-Cy*«Ph»-<OlTfp-Ly*"Thf-Cy*-Thf-ol

5 OH

Comme produit de départ, on utilise le D-glucose-6-phosphate à la place du D-glucose. tal2D° * -19,5° (c = 1,0 dans AcOH ä 95%). F = 0,89.

1 g Exemple 17 <°i* --· \_J CHg- (0) Ph*-Cyi-Phe40ÎTrp-i.y*-Thf-Cy*-Thf-ol

c OH0H

15

Comme produit de départ, on utilise le 20 D-ribose à la place du D-glucose. [et]D = -31,8° (c = 1,0 dans AcOH à 95%).

20 Exemple 18

Na-dësoxyfructosyl - (D)Phe-Cys[C0C(CH,) ,3-Phe-(D)-Trp-Lys-Thr-Cys [C0C(CH3)33-Thr-ol a) Désoxyfructosyl-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys(BOC)-Thr-Cys-

Thr^ol_________________________________________________ 25

On mélange 0,58 g du composé de l'exemple 1 dans 10 ml de DMF avec 0,08 ml de NEt3 puis avec 0,12 ml de (B0C)2°· 0n agite le mélange pendant environ 15 heures § la température ambiante, on le concentre sous vide 30 et on le délaye dans de l'éther. On sépare le produit qui a précipité par filtration. On dissout le résidu dans /un peu de méthanol et on fait précipiter le produit 57 4 * » " avec un peu d'eau et on le sèche, ce qui donne le composé du titre.

[a]jj° = +14,5° (c = 0,7 dans le DMF).

b ) N®-dès oxyfructosy1-(D)-Ph*‘-Cys-Phe-(D)Trp-Lys(BOCJ-Thr- 5 SX2lïll£l2i———————————__________—— A 0,51 g du composé de l'étape a) ci-dessus dans un mélange de 10 ml de dioxanne et de 2 ml de tampon NEt^/AcÛH à, pH 8,6 , on ajoute sous argon 10 un total de 0,4 g de dithioërythritol. On agite le mélange pendant environ 15 heures â la température ambiante et on le concentre sous vide. On sépare par centrifugation le produit qui a précipité, on lave le résidu avec un peu d'eau et on le sèche sous vide.

15 On obtient ainsi le composé du titre.

[α]η° = +3,8° (c = 0,8 dans le DMF). c )N® -dësoxyfructosy 1- (D) Phe'-Cys[COC (CH3) 31 -Phe-(D)Trp-Lys-(BOC)-Thr-Cys(COC(CH3)3l-Thr-ol 20 On dissout sous argon 0,38 g du composé de l'étape b) ci-dessus dans 25 ml de N-mëthylpyrrolidone, on ajoute à 0° 0,3 ml de N-méthylmorpholine et 0,31 ml de chlorure de pivaloyle , on agite pendant environ 16 heures à 0% et on délaye dans un mélange 25 d'éther et d'éther diisopropylique. On sépare par centrifugation le produit qui a précipité. Le résidu est dissous dans un peu de DMF et on fait précipiter le produit par addition de mëthanol et d'eau. Le produit est centrifugé , séché'sous vide 30 et utilisé pour la réaction suivante sans autre purification.

9 58 « * * f d ) Na-dés oxyfructosyl-(D)Phe-Cys[COC(CH3)31-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys CCOC(CH3)3]-Thr-ol

On dissout ä 0° le résidu de l'étape c) 5 ci-dessus dans 5 ml d'un mélange 9:1 de TFA et d'eau et on agite pendant 15 minutes. On fait précipiter le produit par addition d'un mélange éther/10% Hcl 5N/étner. On filtre le produit, on le lave à l'éther et on le sèche. Le résidu est purifié 10 par chromatographie sur gel de silice avec un mélange CHCl3/Me0H/Ac0H/H20. On réunit les fractions contenant le produit désiré, on les concentre sous vide tout en ajoutant de l'eau puis on les lyophylise. On obtient ainsi le composé du 15 titre. [a]jj° = -15,3° ( c = 1,0 dans AcOH à 95%).

F : 0,88.

Exemple 19 2-{(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-olJ-2- 2q dêsoxy-D-g.1 ucose

S

ho--a -

\ OH H /VOH

Λ V ___ B (D)Phe-Cys-Ph«-(0)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol 30

On dissout 2 g de D-(-)-fructose et 1 g n/ de H-(D)-Phe-Cys-Phe-(D)-Trp-Lys(BOC)-Thr-Cys-Thr-ol yf( (préparé comme décrit à l'exemple la) dans 100 ml à 59 % * 1 1 dlun mélange 9/1 de MeOH et de AcOH et on maintient à 65° pendant 16 heures. Après évaporation, on dissout le produit dans un peu de méthanol et on fait précipiter le produit avec de l'éther diiso-5 propylique. Pour éliminer le groupe protecteur (scission du groupe BQC),on utilise le produit brut ainsi obtenu, sans purification préalable.

On mélange 1 g du produit brut ainsi obtenu avec 20 ml d'acide trifluoroacêtique (100¾) et on 10 maintient à la température ambiante jusqu'à ce que le produit de départ soit dissous (5 minutes). On ajoute ensuite 200 ml d'éther diisopropylique, on sépare par filtration le produit qui a précipité et on le lave à l'éther diisopropylique. On purifie le composé du 15 titre par chromatographie sur gel de silice (êluant : CHCl3/me0H/Ac0H/H20 7/3/0,5/0,5) et on l'isole sous forme d'un lyophilisât blanc. on [a]p = -6,7° (c = 0,3 dans AcOH à 95%) F : 0,73.

Un second produit, le mélange 1:1 suivant 20 d1 isomèresayant la configuration inverse sur l'atome de carbone du reste glucidique, peut être obtenu: HOT_0 / \oh,—-1

NmO ΙΟ» Μι«.0*$·*Λ··10Ι i»*·».»*·»»»«"Cfi·»··».«· mQ NJ 1/ 25 _, (0^Ν4^ι·ηι«<{0ΐΪ?|·4.μ·Τΐΐ(·(μ·ΓΙΐΜΐ 30 Exemple 20 o * 2-ÇT^ r_-SMS 2-2^iésgxY-D;glucose 60 ψ % · * τ HO«j (ζ^ >Η 5 Γ— -1 (Ο)Phe-Cys-Tyr-(0)Trp-Uyo-Thr-Cys-Thr-ol

En procédant de manière analogue à celle décrite à l'exempe 19 et en utilisant comme produit 10 de départ la Tyr^—SMS à la place de la SMS , on obtient le composé du titre.

[a]20 _ -2,9° (c = 1 »0 dans AcOH à 95%) p. q,95

Exemple 21 G1ucuronamide du 15 H-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol J t---- , c-(0)Phe-Cys~Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol

h J-O

20 “«

On traite 170 mg du glucuronamide du H-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-(BOC)-Thr-Cys-Thr-ol par 3 ml d'acide trifluoroacêtique à 100% jusqu'à obtenir une dissolution complète (5 minutes). On fait précipiter le 25 composé du titre sous forme de trifluoroacëtate par addition de 20 ml d'éther diisopropylique. Après filtration, séchage et Chromatograph!e sur gel de silice (éluant : CHC13/Me0H/Ac0H/H20 713/0,5/0,5), on obtient le composé du titre à l'état pur sous forme 30 d'un lyophilisât (acétate).

20 [a]p = -29,2° (c = 0,48 dans AcOH à 95%) F : 0,85.

Le produit de départ peut être obtenu comme /suit : 61 r « » A une solution refroidie ä -30°C de 450 mg de H-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys(BOC)-Thr-Cys-Thr-ol, 117 mg d'acide glucuronique et de 135 mg de HOBT dans du diméthy1formamide, on ajoute une solution ä 135 mg 5 de DCCI dans 2 ml de DMF . Après 48 heures avec décongélation simultanée à la température ambiante, on sépare la dicyclohexylurée par filtration et on fait précipiter le composé du titre par addition de 20 ml d'éther diisopropylique. Après filtration, séchage 10 et chromatographie sur gel de silice (éluant ; CH2C1 MeOH 9:1), on obtient le composé du titre ä l'état pur, Ca]p°= +16,7°(c = 0,50 dans le DMF).

Exemple 22

Quinamide du H-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol 15 ’kk ,—^—, -j^C-(0)Phe-Cy3-Phe-(0)Trp-tys-Thc-Cys-Thc-ol

20 » J

En procédant de la manière analogue à celle décrite ä l'exemple 21 et en utilisant comme 25 produit de départ l'acide L(-)-quinique, on obtient le composé du titre.

[a]*0 = -50° (c = 0,44 dans AcOH à 95%) F: 0,97.

Exemple 23

Sialamide du H-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-'Cys-Thr-ol

30 HO OH--J

\-^^L-p^.Q-^C(0)Phe-Cys-Phe-(0)Trp-Lys-Thc-Cys-Thr-ol /acn—

H OH

62 % * * *

En procédant de manière analogue ä celle décrite à l'exemple 21 et en utilisation comme produit de départ l'acide sialique , on obtient le composé du titre.

5 [a]p°= -60,8° (c = 0,6 dans AcOH à 95¾) F : 0,95.

Exemple 24

Na- (o-ß-D-glucosyl-ojcyacetyi) -DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol 10 m kî~.\0CHac^a ,_

Ku 'Vv(0)Phe-Cys-Phe»(0)rrp-Lys-rhr-Cy*-rhr»ol tt ·* 15 On dissout 250 mg de (tétra-O-acétyl-0-ß- D-glucosyl)-oxyacêtyl-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-(BOC)-Thr-Cys-Thr-ol dans 10 ml de mêthanol et on règle ä un pH de 10 avec quelques gouttes d'une solution IN de NaOCH^ dans du mêthanol. Après réaction pendant 15 minutes, 20 on neutralise la solution avec une résine échangeuse d'ion (par exemple AMBERLYST® 15, H+) et on sépare la résine par filtration. On concentre le filtrat et on traite le résidu pendant 5 minutes avec 3 ml d'acide trifluoroacétique. On fait précipiter le 25 composé du titre sous forme de trif1uoroacétate par addition de 20 ml d'éther diisopropylique et on l'isole à l'état pur sous forme d'un lyophilisât blanc après filtration , séchage et chromatographie sur gel de silice (ëluant : CHC13/Me0H/Ac0H/H20 7/3/0,5/0,5).

30 Ca]p°= -39,2° (c = 0,60 dans AcOH à 95¾ ) F:0,91.

Le produit de départ peut être préparé comme - λ suit : -/

V

,;r * * T * * j * 63 a) Ester benzyligue de 11 acide_têtra_-OTacëtyl 9ΐ2Ε22^1ΐ21^2211222 A une solution de 830 mg de glycolate de benzyle dans 50 ml de CH^C12* on ajoute 2,5 g de 5 tamis moléculaire 4 A pulvérisé et, après addition de 2,8 g de trifluoromëthane-sulfonate d'argent, on ajoute goutte à goutte une solution de 4,1 g d' acëtobromoglucose dans 50 ml de CH^C^. Après 15 minutes, on arrête la réaction par addition 10 de 4 mi de pyrîdine, on sépare les produits solides par filtration et on extrait le filtrat avec une solution à 10¾ de NaHSO^. Le composé du titre est isolé à l'état pur après chromatographie sur gel de silice ( éluant : CH7C1„ / MeOH 99/1).

?n c ^ 15 [o]p = -22,4° (c = 1,7 dans CHC13) .

b) Acide tétra-0-acêtyl -Ο-β-D-glucosyl-glycoligue

On dissout 800 mg d'ester benzylique de 1'acide tëtra-O-acëtyl-O-B-D-glucosyl-glycolique dans 40 ml d'un mélange à parts égales en volume ' 20 d'éthanol et d'eau , on ajoute 400 mg de charbon palladië à 10¾ et on hydrogène sous environ 3,45 bar dans un appareil "PARR".Le composé du titre est isolé à l'état cristallisé après filtration et concentrât!on sous vide.

25 [a]p° = -35,5° (c = 1,03 dans MeOH).

c) Na-(tetra-O-acetyl-O-ß-D-glucosyl-oxyacetyl)-DPhe- Çïâ;£5Sl2ï£SlÎÎZ2li2SilïÔïlSf2Zïîî£l2i————____ A une solution refroidie à -30°C et constituée 30 de 81 mg d'acide tëtra-0-acëtyl-0-ß-D-gucosyl- glycolique, de 225 mg de H-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys(BOC)-Thr-Cys-Thr-ol et de 45 mg de HOBT dans 2 ml de DMF, r\ -j

Jr * >- • . 64 on ajoute 45 mg de DCCI dissous dans 1 ml de DMF. Après 48 heures et après réchauffement à la température ambiante, on sépare la dicyclohexylurée par filtration et on ajoute 200 ml d'éther diiso-5 propylique au filtrat, ce qui fait précipiter le composé du titre.

En procédant de manière analogue à celle décrite à l'exemple 24, on peut préparer également les composés suivants dans lesquels SMS signifie 10 le reste polypeptidique de formule -DPhe-Cÿs-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cÿs-Thr-ol).

Exemple 25

Na- (O-ß-D-galactoayl-oxyacetyl)-SMS

15-----

M

Mi-f-H O .— ---1 o- —o OCH|C-(0)Phe-Cys-Ph«-(0)Trp-Lys-Thc-Cys-Thr-oi . » fl

îrt OH

[a]2° = -37,5° (c = 1 dans AcOH à 95¾) F : 0,95 25

Exemple 26

Na-(O-ß-cellobiosyl-oxyacetyl)-SMS

S

v 30 65 m * r * *

H H

HO-j-H μ·4-η 0 l/J, \π ^\?^V^°îphe*cya-Phe-(°)TrP-l-y5-Thc--cys- \oh m| ym M Thp-ol H0\J_ÿnj) h 0» U H ou [alp° = -32,5° (c = 1 dans AcOH à 95¾) F = 0,91.

10 ' Exemple 27

Na- (0—0—(D)-glucosyl-oxyisobutyryl)-SMS

15 "+" fflj0 __ _n »J i ( !

Hy Hl-C-(0)Phe-Cys-Ph.-(0)T rp-Lys-Thc-Cys-Thr-ol Μ* «Λ

MN_Y H

H OH

20 [a]p° » -32,9° (cal, dans AcOH à 95%) F : 0,93

Exemple 28

ΝΛ- (Ο-α- (D) -glucosyl-cc- (L) -oxyisoval^ryl) -SMS

25 Μ- -H Ql g -----1 H y”0 0-C-C-(0)Ph*-Cys-Ph«-(0)Ttp-Ly*-Thc-cÿ*-Thr-ol "kyH*

H OH

β ta]20 » -44,3e (c “ 1, dans' AcOH à 95%) F : 1/00 f Λ * * r 66

Exemple 29

[N-acetylrauramyl-(D)Phe1]-SMS

H

5 HO—H

VjOH

HO^fn hTnhac i ' !

' ° H3^-)Ç-Ç-(0)Phe-Cys-Phe-(0)Trp-Ly9-Thc-Cys-Thr-oL

H O

[α]ρ° » -15,4° (c » 0,13, dans AcOH à 95%) P j 0,9

Exemple 30 15 &:2i§l2£2!¥li£!n2Sâr5âïï2^1i§-§ H0"l_ h * i-1 y™" PtH-Cy*-Ph*-(D)Tfp*l.ys-Thf-Cyt-Thf-ol 20 Η^!γ

OH

A 620 mg de £-Fmoc-SMS dans 50 ml de CHgCN/HgO 3:1 , on ajoute 0,45 ml de triéthylamine 25 puis 272 mg d'isothiocyanate de 2,3,4,6-tétra-0- acétyl-ß-D-glucosyleet on maitient le mélange pendant une heure à la température ambiante.

Après évaporation du mélange sous vide , on reprend le résidu dans un peu de mëthanol et 30 on le traite par de l'éther diisopropylique, ce qui fait précipiter leproduit à l'état pratique-L·' ment pur.

f 67 « * * * » 9

Pour éliminer le groupe Fmoc et les groupes acétyle, on traite le produit dans 50 ml de méthanol absolu par une quantité catalytique de NaOCH3 IN dans du méthanol.Après 30 minutes (vérification 5 Par chromatographie en couche mince), on neutra lise le mélange par de l'acide acétique à 1% et on évapore sous vide . On reprend le résidu dans de l'eau et on l'extrait avec de l'acétate d'éthyle. La phase aqueuse est lyophilisée et Ie résidu est purifié 10 sur gel de silice et déminéralisé par exemple sur Duolite. On obtient ainsi le composé du titre sous forme d'un lyophilisât.

[a]*0 = -48,5° (c=l,AcOH à 95%) F : 1.

La Fmoc-SMS utilisée comme produit de 15 départ peut être préparée comme suit : A 5g d'acétate de SMS et 5 g de NaHCO^ dans 100 ml d'un mélange 3:1 de DMF et d'eau, on ajoute 1,6 g de Fmoc-HOSu. Après une heure à la température ambiante, on dilue le mélange avec 400 ml d'eau 20 et on l'extrait avec 250 ml d'un mélange 95:5 d'acétate d'éthyle et de méthanol. On sèche la phase organique sur Na^SO^ et on la concentre. Après chromatographie sur gel de silice, on obtient le produit sous forme d'une substance amorphe.

25 Ca]p° = 24.,.3 0 (c = 1,13 dans le DMF).

En procédant de manière analogue à celle décrite à l'exemple 30, on peut obtenir les composés suivants :

Exemple 31 λ / , 68 à HOv. <. ____ hs r----1 I Ph«*Cyj-Ph«-(0)Tia-tf»-Thr-Cy»-Tfc/*el

Ttv 5 HoT/

OH

20 [e]Q : -4,3 e (c - dans AcOH à 95%) p e 0^7 10 Comme produit de départ, on utilise l'iso- thiocyanate d'octa-acétyl-cellobiosyle.

Exemple 32 êz2l§l2222¥lS2C!îâ!!!2¥ll§ï!§ 15 HO^ j H 0 i" | Γ“®1Κ·Ι0) MK«Cyt· Ph«-10iTfp-ty**Thr-CyfTlif-«l »ot/

OH

“ 39'9 te" l* dans Ac^ à 95%) F = 0,81

Comme produit de départ, on utilise l'iso-25 cyanate de 2,3,4,6-tëtra-0-acêtyl-ß-D-glucosyle.

Exemple 33 ^§ll2Ëi2§ïl£§£-î52^1----

Ho ,---1 /~°xH-C-(0) Ph**Cyi-ph*-(0)Trp-Cy**Th#-Cy*-Thr-ol 30 >Æ/ Ψ i “ 69

Ca3§° * -37,9° (c * 1; dans fcOH à 95%) p s o,85

Comme produit de départ, on utilise l'iso-5 cyanate d'octa-acétyl-cellobiosyle.

Exemple 34

IiLeJSSï:3:S2iÔiS^l:§î!S

OH OH | “ " ' 1 (0ï Ph«-Cy*-Ph*-(OÏTfp-Ly*-Thf-Cy*-Thr-ol

OH OH

10

On traite 0,5 mg du composé du titre de l'exemple 1 dans 50 ml de mëthanol d'abord par NaBH^ puis par de l'acide acétique à 5%, sous des conditions telles que le pH ne dépasse pas 7. La quantité 15 totale de NaBH^ utilisée est d'environ 10 équivalents .

La réaction terminée (4-5 heures), on traite le mélange par de l'acide acétique pour détruire l'excès de NaBH^ et on concentre le mélange sous vide. Le résidu est déminéralisé par exemple sur 20 duolite et purifié sur gel de silice. Le produit principal est le composé du titre sous forme d'un lyophilisât, accompagné de 1-dësoxy-D-mannityl-SMS.

Ca]p = -17,6° (c = 1 dans AcOH à 95%) F = o,88.

Exemple 35

2 5 α-D-cjJ ucosyl ( 1 - 4jdé s oxy s o r b i_tyl -_SM!S

En procédant de manière analogue à celle décrite à l'exemple 34 et en utilisant comme produit de départ le composé du titre de l'exemple 2, on obtient le composé suivant : τη HO^ 30 HO^ 1 ^ u /—OH___ / K yCH.- (D) Ph*-Cys-Ph*-<0)Trp-t.y*-Thr-Cys-Thr-ol //// \?H / oV-/ / HX* 70 * ♦ „ Λt [α]ρ°* +1,6° (c = 1 dans AcOtf)f' F:0,9.

Exemple 36 ïn Dî* /.5« i-i r MO Ph#-Cy*-Ph*-{0)Tfp”Cyi“Tli^-Cy**Thr-o4

0 OH OH

5t

On traite 0,55 g de Boc-SMS 'Sans 30 ml d'un mélange 3:7 de dioxanne et d'eau pa'P 50 ml de NaBH3CN. On ajoute 250.mg de 2-dêsoxy-D-gl ucose, 10 on règle le pH du mélange à 7 avec du^Cl 0,1 n et on le chauffe à 100° pendant 6 heure!. On refroidit le mélange , on le congèle et on le lyéphilise. On reprend le résidu dans de l'acétate d'éthyle (50ml) et on l'extrait à l'eau. On sèche la phase organique 15 et on l'évapore sous vide. Le groupe BOC est éliminé selon les méthodes classiques à l'aide de TFA. Le produit est purifié sur gel de siliceet déminéralisé par exemple sur duolite, ce qui donne le composé du titre.· [a]jj° = 25,5° (c = 1 , AcOH à 95%) F:0,83.

20 En procédant de manière analogue , on peut préparer le composé de l'exemple 34 précédent (en partant du glucose) et le composé de l'exemple 35 précédent (en partant du maltose) .

Exemple 37 25 Na-i socaproyl-des(1-4)-[Al a7,n£- (1-dêsoxyfrùctosyl)-Lysl1,18] calcitonine de saumon___ “Y"» p* 7 Ju “ CH-CO-S*r-Thr-AI*-V*l-t«i-4»ly-ty*«Ceu-S*e-Clii-Cl«i-l.tu-Hl«-Ly«-le«-Cln-Thf«ryr- * à

30 Pro-Acç-Thf-Ain-Thc-CIy-Sèt-Cly-Thr-Pro-NHj . CHjCOOH

u -JÇ3Ï- JJ <· 71 * * t

On dissout 10,3 g de polyacétate dt !a-iso-caproyl-des(l-4)-[Ala^]-calcitonine de saumtr et 1,8 g de D(+)-glucose dans un mélange de 94 ml de : 1F et de 6 ml d'acide acétique . Après 2 heures à 50* on 5 fait précipiter entièrement le produit par e -iition d'éther, on l'essore, on le lave à l'éther ei on le sèche sous vide. Pour purifier le produit, c-r dissout environ 5 à 10 g de produit dans de l'eau, o=- injecte la solution sur une colonne à phase inversée de 10 4 x 25 cm (silicagel, C-18) et on chromâtigraphie avec un gradient d'eau et de 0 à 80% d'un më ange de solvants comprenant 38 parties d'eau, 60 parties d'acétonitri 1e et 2 parties d'acide phosphorique à 85%. Les fractions contenant le produit à l'état ?ur sont 15 réunies , filtrées sur une colonne d'environ 100 ml d'une résine ëchangeuse d'ions légèrement basique sous forme acétate,et lavées à l'eau. Le filtrat sst lyophilisé , ce qui donne le composé du titre sous forme de polyacétate , polyhydraté.

20 [a]p° = -34,8° (c = 0,73 dans CH3COOH I 95%) F:0,93.

Spectre de masse par bombardement d'atomes rapides : 3407 (MH+).

Le Na-i socaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-GlnTGlu-Leu-His-Lys-Leu-Gl n-Thr-Thr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NHg utilisé comme produit 25 de départ peut être préparé comme suit : a 1 Na-isocaproy1-Ser (Bu*) -Thr (Bu*) -Ala-Val-Leu-OCHj-phènyl- (p)OCH2-co-(polystyrène-1%-divinylbenzène)

On laisse gonfler 1 g de p-hydroxyméthyl-30 phênoxymêthyl-co(polystyrène-!%-divi nylbenzène) dans un mélange 1:4 (vol./vol.) de DMF et de chlorure de méthylène, on essore et on mélange avec V- 1 -»

a V

72 une solution de 0,74 g de Fmoc-leucine et 0,19 g de 1-hydroxybenzotriazole dans 5 ml du mélange de solvant mentionné ci-dessus. Tout en agitant, on ajoute 0,43 g de dicyclohexylcarbodiimide et 5 85 mg de 4-dimëthylaminopyridine, chacun dans 5 ml du même mélange de solvant. On agite le mélange pendant 16 heures à 20°, on l'essore et on le lave avec le mélange de solvant, puis avec du dimëthylformamide. On obtient ainsi le Fmoc-Leu- 10 0CH2-phényl-(p)-0CH2-co(polystyrëne-l%-divinyl- benzène).

Le groupe Na-Fmoc de ce produit ( 1,56 g correspondant à 0,7 mMole) est ëliminié par traitement avec de la pyridine (20¾ vol./vol.) dans du 15 DMF pendant 10 minutes. On lave bien avec du DMF et on ajoute ensuite 0,71 g de Fmoc-Val-0H, 0,28 g de 1-hydroxybenzotriazole et 0,32 ml de diisopropylcarbodiimide, chaque produit étant dissous dans 5 ml de DMF. Après 45 minutes, on essore le 20 mélange et on rince bien la résine avec du DMF. On répète l'élimination du groupe N - Fmoc ainsi que le couplage avec les amino_ acides suivants et dans l'ordre indiqué :

Fmoc-Ala-OH (0,65 g) , Fmoc-ThriBu^)-OH (0,83 g) 25 et Fmoc-Ser(But)-OH (0,80 g). Dans le dernier cycle de réaction (élimination du groupe protecteur Fmoc, acylation avec 1'amino-acide protégé), le dérivé d'amino-acide est remplacé par l'acide isocapro?que (0,41 g), la quantité de 1-hydroxybenzotriazole 30 est portée à 0,53 g et celle du diisopropylcarbodi- imi'de à 0,54 g, et le couplage est effectué pendant y 15 heures. La résine avec le peptide protégé est bien H lavée avec du DMF et du chlorure de méthylène et f 73 « * a Γ séchée sous vide à 40°C pendant 15 heures , ce qui donne la résine avec le peptide protégé sous forme d'une poudre incolore.

b ) N®;isogagroYl-Ser;Thr-Äla;Val-Leu;OH

5

On agite 1 g de composé du titre de l'exemple a) ci-dessus, dans un mélange de 5 ml d'acide trifluo-roacëtique et de 5 ml de chlorure de méthylène. On filtre le produit, on le lave avec 5 ml du même 10 mélange , puis avec du chlorure de méthylène, on concentre fortement sous vide et on fait précipiter entièrement par addition d'éther. On lave bien le précipité à l'éther et on le sèche sous vide sur hydroxyde de potassium solide , ce qui donne le 15 composé du titre sous forme d'une poudre amorphe incolore.

c ) Na-isocaproyl-Ser-Thr-Ala.-Val-Leu-Gly-Lys (Boc) -Leu-Ser-

Gln-Glu(OBu*)-Leu-His-Lya(Boc)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-

Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH, 20 __________________________________2-------------------- A une solution de 0,165 g du composé de l'étape b) ci-dessus dans 7 ml de DMF, on ajoute 0,59 g de chlorhydrate de H-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser-Gln-GluiOBu^J-Leu-His-Lys^oeJ-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-25 Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2, 0,017 g de 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-l,2,3-benzotriazine, 0,065 g de dicyclohexylcarbodiimide et suffisamment de N-ëthyl-N,N-diisopropylami ne pour qu'un échantillon du mélange réactionnel indique un pH d'environ 30 6 sur du papier pH humide. Après.16 heures, on fait précipiter le produit par addition d'éther et on le sèche. On obtient ainsi le composé du . c t 74 d) Na-isocaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-

Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-

Gly-Thr-Pro-NHj 5

On dissout 0,50 g du peptide partiellement protégé de l'étape c) ci-dessus dans un mélange d'acide triflu oroacêtique à 50¾ (vol./vol.) et de chlorure de méthylène. Après 1 heure, on ajoute 10 50 ml d'éther contenant 0,6 mMole de HCl. On filtre le produit , on le lave à l'éther et on le sèche sous vide. Le produit est purifié par chromatographie en phase inversée avec un gradient d'acé-tonitrile dans H^PO^ (2¾). Les fractions réunies 15 contenant la substance à l'état pur sont filtrées sur résine échangeuse d'ions basique sous forme acétate , et le filtrat est lyophilisé, ce qui donne le composé du titre sous forme de poly-acétate polyhydratê.

20 [a]jj° = -32,2° (c = 0,3 dans AcOH à 95¾) F : 0,87.

Exemple 38 a 7 £ N -isocaproyl-des-(l-4)-[Ala , N-(a-D-glucosyl(1-4)-dës-oxyfructosyl)-Lys * ] calcitonine de saumon

C” CH

25 's / J

co CH

<!h, a

I 2 7 lu M

CH2"C0"Sef-Thc-Alt-Val-Leu-GXy-4.y8-Leu-Sec-Gln-Glu-Leu-His-lys-leu-GXn-

R

Thr-Tyr.pro-Arg-Thr-Asn-Thr-GIy-Sec-GIy-Thc-Pco-NH2 . CH^OOH

30 / 75

Le dérivé di-N^· -maltulosyl ique correspondant est préparé de manière analogue ä celle décrite à l'exemple 37 en utilisant le monohydrate de D( + )-maltose à la place du D(+)-glucose. La durée de rëac-5 tion à 50°C est de 15 heures. L'isolement et la purification du produit sont identiques. On obtient le composé du titre sous forme de polyacêtate polyhydratë.

Spectre de masse par bombardement d'atomes rapides: 3730,9 (MH+).

10 [a]*0» -15,2° (c = 0,16 dans AcOH à 95¾). F: 0,97.

En procédant de manière analogue à celle décrite à l'exemple 37, on peut préparer les composés suivants :

Exemple 39 CL Ç 7 15 N -isocaproyl-[NL -(1-désoxyfructosyl)-Lys ]-calci- tonine de saumon-(5-32)amide

VjÇJL.

CH » Γ2 5 7 10 CH7-CQ-Ser-Thc-Ly3-Val-Leu-Gly-Lys-teu-Ser-Gln-Glu-Cev»-His-Lye-Leu-Gln-Thr- 32

Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thc-Pro-NH^ , 3 CHjCOOH

on 25 [a]J = -40,0a (c= 0,27 dans AcOH à 95¾) F : 0,84.

Exemple 40

Na,Lys^-N^ , Lys18N£ -tris-(T-dësoxyfructosyl)-cal ci-tonine de saumon <-» W ?- I* 3 Q R-Cy«-S*c-A*n-C*u-S*c-rhr-Cy»-V«l-C*u-CXy-4.y«-L«u-Ser-CIn-Clu-i.«u-Hi»-t.y*-C*u-Cln-Thr-

Tyr-?ro-Acg-Tht-A«i-Thr-CIy-Ser-Cly-Thr-f»e4H2 s 76

* \,OC

H* 5

_ _C "JO

LajD " 0,ύ (c = 0,38 dans AcOH à 95¾) F:0,75.

Exemple 41

Na-isocaproy1-des(1-4)-[N£-fi,dpSOxyfructosy1 )-1γ$7»ΊΊ >18] calcitonine de saumon-(5-32^am-ide 10 “V“5 h î' 101.. îi CH2-C0-StriThrM.y*-«ai-Leu-Cly-L;»^eu-S«r-CIn^lu-Leu-Hia-lys4.eu-Cln- rh„ r 32 mp—ryr- Ppo-Arg-Thp-A*n-lhr-Cly-Ser-Ciy-Thr-Pro-NH? 15 2 -..o:

MO

C«lJ°- · 37.4· ( c » 0» 155jAcOH, 95%) r“0J84 20

Exemple 42 et 7 N -guinoyl-CAla ]-calcitonine de saumon-(5-32)-amide 25

«O

j-' C0-Ser-rhr-Ala-Val-Leu-Gly-Lya-Lau-Ser-Gln-Glu-l.eu4üs-l.ys-Leu-Gln.

1iQ

32

Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Sac-Gly-Thr-Pro-NH, · 3 CH COOH

30

Le composé du titre est préparé de manière /? analogue à celle décrite à l'exemple 21.

[a]p°= -35,7° (c=0,37 dans AcOH à 95%) F:0,88.

4 * • » ft 77

Exemple 43 et 7 N -quinoyl-[Ala J-caTcitoniné de saumon-f4-32)-amide

MO

• "Ö" · · V-'CO-t*ü-Sec-rhf-Ai»-Wti-C«u-GIy4.y«4.«g-S*e-Cln-GXu-(.««-Hia-<.y»-<.*«-Cin.

4 32

rhP-Typ-pfe-Arq-Thc-A*n.Thp-Cly-Set-Cly-Thp-PW N«2 . 3 CHjCOOH

Le composé du titre est préparé de manière 10 analogue à celle décrite à l'exemple 21.

20 C<x3q =-39,3° (c= 0,29 dans AcOH à 95%) F:0,89.

Le [Ala7]-calcitonine de saumon -[5-32]-amideet le [Ala7]-calcitonine de saumori-(4-32)-amide nécessaires comme produits de départ pour les exemples tl5 42 et 43, peuvent être préparés de manière analogue à celle décrite pour le produit de départ de 1 ' exemple 37.

• Exemple 44 [N-désoxy-fructosyl-Cys^]-oxytocine 20 « O I-i N V CHj-Cyf-Tyc-Ili-Cln-Aan-Cys-PfO-Ltu-Gly-^

0· H

25

On dissout 0,5 g de D(+)-glucose et 0,5 g d'oxytocine dans 50 ml d'un mélange 9/1 de MeOH et de AcOH et on maintient le mélange pendant 3 heures à 65°. On concentre ensuite la solution par évaporation, on 30 la chromatographie sur gel de silice et on la débarrasse du sel sur Duolite (gradient : HgO/ëthanol/AcOH). On /obtient un lyophilisât blanc.

[ct]jj°= -23° (c = 0,32 dans AcOH à 95%) F: 0,95.

, * * * 78

Exemple 45

Ac-(D)-Phe(4-C1)-(D)Phe(4-Cl)-(D)Trp-Ser-Tyr-( D ) Lys« 10

On dissout 60 mg de Ac-(D)-Phe-(4-Cl)-(D)-Phe(4-Cl)-(D)-Trp-Ser-Tyr-(D)-Lys-Leu-Arg-Pro-(D)-Ala-NH2 et 72 mg de D( + )glucose dans un mélange de 10 ml 15 de MeOH et 1 ml de AcOH et on agite le mélange pendant învir'on 20 heures à 60°.On fait précipiter le produit par addition d'éther et on le centrifuge. On dissout le résidu dans environ 100 ml de HgO et on règle le pH à 8 avec une solution diluée de NaOH. On fait passer 20 le produit sur une colonne de Duolite ES 861 en ëluant avec un gradient HgO—> dioxanne-H20-AcOH (60:40:3). Les fractions contenant le produit désiré sont concentrées sous vide et lyophilisées. On obtient ainsi le composé du titre.

25 [a]p° = -25° (c = 0,5 dans AcOH â 95%) F : 0,83.

Exemple 46 ΝαΑ1 ,N^B^-tris(l-desoxyfructosyl)-insuline de porc On agite pendant 2 heures à 60° une suspension de 1 g (0,17 mmole) d'insuline de porc et 0,47 g 30 (2,6 mmole) de glucose dans 10 ml d'un mélange 9:1 de DMF et d'acide acétique. On élimine le solvant par évaporation à 30° sous vide poussé, on dissout le ^ résidu dans 300 ml d'eau, on règle le pH à 7 et on fait 79 « « * t passer la solution à travers une colonne déminéralisante (Duolite ES 861 , 2,5 x 15 cm). Le glucose est ëluë avec de l'eau et le peptide avec un mélange 59:39:2 d'isopropanol , d'eau et d'acide acétique glacial.

5 Après évaporation du solvant et lyophilisation, on dissout la: substance dans 300 ml d'eau et on la purifie par chromatographie en phase inversée (2 x 25 cm , RP 18, 10 nm, solution tampon : 57 mmoles NaClO^, 20 mmoles de triéthylamine, 8,4 mmoles d'acide phospho-10 rique, pH réglé à 3 avec NaOH 4N; gradient : 0-65¾ A-B: Tampon A : Tampon pH 3 / acêtonitrile 9:1

Tampon B : Tampon pH 3 / acêtonitrile 4:6).

Les fractions contenaht le composé du titre sont recueillies , réunies, concentrées , diluées avec 15 300 ml d'eau et passées à travers une colonne déminé ralisante comme décrit ci-dessus. Les sels sont éluês avec de l'eau et le peptide est élué avec un mélange 59:39:2 d'isopropanol, d'eau et d'acide acétique glacial. Les fractions appropriées sont réunies , concentrées et 20 lyophilisées, ce qui donne le- composé du titre.

2o

Ca]D =-56,3° (c = 0,5 dans AcOH ä 95¾) F : 0,88.

Exemple 47

Na,Lys^-Nf’.Lys^^ -N£-tri s-( 1 -désoxyfructosy 1 ) - 25 (0[Al£]-hpGRF-{1-29)-NH2 (3),Tyr-0-Aia-Aip-Me-ll*-W»-Thc-Ain-S«r-Tyc-Acg-l|n-V«l-l»w-Cly-GÂ-l.«i-S*r-Aia- 19

^f'J-Lva-Lau-t.tu-Gln-Aap-Ha-Met-Sae-ArgJ*^ . CHjCQOH

ρ 80 Λ m ψ

En procédant de manière analogue à celle décrite à l'exemple 37 et en utilisant comme produit de départ la [DAla2]hpGRF , on obtient le composé du ti tre.

5 [a]|^ = -5,6° (c = 0,2 dans AcOH à 95%) F : 0,82.

Exemple 48

Na,N^-bis(1-désoxyfructosyl)-Lys-vasopressine

R

R<ys-lyr-Pht-Gln-Asn-Cy*-Pro-ly*-€ly-NH? '· £K.

Oh

On agite pendant 2 à 4 heures S 65° une sus- g 15 pension de 118 mg (0,1 mmole) de Lys -vasopressine et 360 mg (2 mmoles) de glucose dans 5 ml d'un mélange 9:1 de mëthanol et d'acide acétique glacial. On élimine le solvant sous vide , on reprend le résidu dans 30 ml d'eau et on lyophilise la solution. Pour 20 éliminer l'excès de glucose, le peptide (solution dans 40 ml d'eau, pH 7,3).est adsorbê sur une colonne de Duolite (1,5 x 10 cm). Le glucose est éluê à l'eau et le peptide avec un mélange 59:39:2 d'iso-propanol , d'eau et d'acide acétique glacial. Après 25 évaporation sous vide et lyophilisation , on purifie le produit par chromatographie sur gel de silice (chloroforme/mêthanol/acide acétique glacial/ eau 7:4:1:1).

On réunit les fractions contenant la substance 30 pure, on les concentre et on les lyophilise. On obtient ainsi le composé du titre.

?n

CoÜq =-52° (c = 0,5 dans AcOH à 95%) F : 0,84.

81 r f

Exemple 49 *♦ * j * g Ac-(0)Phe(pCl)-(0)Ph*(pCl)-(0)Trp-Ser*ty«(M^)-(0)Ph*^*i-Arq-?re-OAItJ«2» Patate

En procédant de manière analogue à celle décrite à l'exemple 45 et en utilisant comme produit de départ le Ac-(D)-Phe(pCl)-(D)Phe(pCl)-(D)-Trp-Ser- 10 Lys-(D)-Phe-Leu-Arg-Pro(D)Ala-NHg acétate et le D(+)glucose, on obtient le composé du titre.

Ca]p° = -36° (c = 0,5 dans AcOH à 95¾) F = 0,86.

Exemple 50 H oh

15 ST

Μ oy ou i) (Q)Phe(pCl)-(D}Phe(pCl)-(D)Trp-Ser-Tyr-(D)Phe-leu-Arg-Pro- (0)A1«-HH2, Acetate.

20 En procédant de manière analogue à celle décrite à l'exemple 45 et en utilisant comme produit de départ le H-(D)-Phe)pCl)-(D)Phe(pCl)-(D)-Trp-Ser-Tyr-(D)-Phe-Leu-Arg-Pro-(D)Ala-NH2 acétate et le D(+)glucose, on obtient le composé du titre .

25 [a]jj° = -32° (c = 0,5 dans AcOH à 95¾) F:0,94.

Exemple 51 0-<O)Pha(pCl)-<O)Phe<pCl)-(O}rrp-S#r-Tyr-(O)â-Uu-Âr94»ro-(OMl«J«2 30 ®* O" Ηβ^-/C|t- « / 82 4 * * *

On agite pendant environ 3 heures à 60° 200 mg de H-(D)Phe(pCl)-(D)Phe(pCl)-(D)Trp-Ser-Tyr-(D) Lys-Leu-Arg-Pro-(D)Ala-NH2 et 520 mg de D(+)glucose dans un mélange 15:1 de DMF et de AcOH, On concentre 5 le mélange sous vide, on le fait précipiter par de l'éther , on le filtre et on sèche le produit.

Le résidu est purifié comme suit : 1) Adsorption sur Duolite ES 861 et ëlution avec un mélange dioxanne / H^o/AcOH.

10 2) Chromatographie sur colonne de gel de silice (mélange CHCl3/Ac0H/H20).

3) Chromatographie préparative (HPLC) sur phase inversée (Cjg-silicagel.).. Elution avec un gradient acétoni-trile dans H3P04 â 21.

15 On réunit les fractions contenant le composé du titre, on les filtre sur une colonne contenant une résine ëchangeuse d'ionsfaiblement basique sous forme acétate, on les concentre et on les lyophilise .

On obtient ainsi le composé du titre.

20 20 [a]p =-22,6° (c = 0,5 dans AcOH à 95¾) F : 0,63.

L'exemple suivant illustre le procédé en phase solide de préparation du peptide-alcool »-1 H-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-01

Exemple 52 25 1 ) N-ÇF3Ç0-thréoni nol ^açéta]___de_l ^açide_g;formyli2hénoxy-_ acétigue A 200 ml de mêthanol , on ajoute sous courant d'azote 105 g de L-thrëoninol . A la solution 30 limpide ainsi obtenue, on ajoute goutte S goutte à 0° une solution de 200 ml de trif1uoroacétate de méthyle dans 250 ml de mêthanol. Le mélange est main- / ------------------

« A

. * 83 bain de glace. Après une heure et demie, on ne peut plus déceler de thréoninol libre dans le mélange.

Par évaporation ä 40°, on obtient un résidu cristallisé blanc. On dissout le résidu à 70° dans 200 ml 5 d'acétate d'éthyle et on le fait précipiter par addition de 100 ml d'hexane. On refroidit le mélange à 0°, on filtre le produit, on le lave à l'hexane et on le sèche à la température ambiante. On obtient ainsi le N-tri-f1uoroacêtylthréoni nol.

10 Sous azote, on dissout 50,3 g (0,25 mole) du produit obtenu ci-dessus dans 1,25 litre de tëtrahydrofuranne et on ajoute goutte à goutte à la température ambiante 75 ml de triméthyl-ch 1orosi1ane. Immédiatement après, on ajoute un 15 mélange de 70 ml de triêthylami ne et de 250 ml de tëtrahydrofuranne. Il se forme une suspension blanche que l'on agite pendant 4 heures à la température ambiante. On filtre ensuite le mélange et on évapore le filtrat â environ 40°, ce qui donne 20 une huile.

On dissout l'huile dans 1,5 litre de chlorure de méthylène et on ajoute par portions 90,4 g d'acide p-formyl-phénoxyacêtique. On ajoute ensuite par portions 9 ml de trif1uorométhane-sulfonate de 25 triméthylsilyle, on agite le mélange pendant 24 heures ä la température ambiante, on le filtre et on lave bien le résidu avec du chlorure de méthylène.

On évapore le filtrat à 40° , ce qui donne 30 un produit résineux rouge orangé. On chromatographie ce produit sur gel de silice en utilisant de l'acétate d'éthyle comme ëluant. Par évaporation * 84 « * Λ f » des fractions appropriées, on obtient le composé du titre ayant une pureté de 97% (HPLC).

2) Synthêse_de_lta-pegti de protégé 17,2 g de polystyrène aminomêthylê (0,7% 5 en poids d'azote correspondant à 0,5 mmole de groupes amino-mëthyle par g de résine) sont mis en suspension dans 80 ml d'un mélange 4:1 de chlorure de méthylène et de DMF.et on y ajoute successivement 4,17 g du produit final de l'étape 1, 1,6 g 10 d'hydroxybenzotriazole et 4,0 g de DCCI. Après 2 heures d'agitation à la température ambiante, le test Kaiser est négatif. On filtre ensuite le mélange et on lave. On met à nouveau la résine en suspension dans 100 ml d'un mélange 3:1 de 15 tétrahydrofuranne et de méthanol et on ajoute par portions 10,4 g de borohydrure de sodium. On agite le mélange pendant 6 heures à la température ambiante, on le filtre et on lave la résine. On met à nouveau la résine en suspension dans un mélange 4:1 de chlo-20 rure de méthylène et de DMF et on ajoute 5,57 g de

Fmoc-Cys (S-t-Bu)OH, 1,74 g d ' hydroxy.benzotri azol e et 3,6 g de DCCI . Après élimination du groupe protecteur Fmoc avec de la pipéridine (2 x 20 minutes), on couple successivement dans l'ordre indiqué les 25 amirro-acides suivants protégés à l'azote par un groupe Fmoc , en utilisant de 1'hydroxybenzo-triazole et du DCCI : ThrOH, Lys (BOC)-OH, D-Trp0H, Phe-OH, Cys(S-tBu)OH et D-Phe-OH. On obtient ainsi le Fmoc-octapeptide sur résine.

30 Charge finale = 0,26 mmole/g.

3) Oxydation_et_scission

La résine ainsi obtenue est mise en suspen- /sion dans 100 ml d'un mélange 1:1 de trifluoro- 85 t * 0 r éthanol et de chlorure de méthylène. On ajoute ensuite 50 ml de tributylphosphine et on agite le mélange pendant 70 heures à la température ambiante. On filtre le mélange, on le lave et 5 on ajoute 100 ml d'un mélange 1:1 de tétrahydro- furanne et d'une solution IN d'acétate d'ammonium.

On ajoute ensuite 1,1 ml d'une solution aqueuse à 30% d'eau oxygénée et on agite le mélange I la température ambiante pendant 24 heures. On 10 ajoute ensuite un mélange de 20 ml diacide tri-f1uoroacétique, de 80 ml de chlorure de méthylène, de 10 ml d'eau et de 2 ml de thioanisole et on agite pendant 2 heures. Après filtration, on lave avec de l'acide trif1uoroacëtique et 15 du chlorure de méthylène. On ajoute 200 ml d'éther diëthylique au filtrat, on sépare par filtration le produit qui a précipité , on dissout le produit dans un tampon aqueux , on déminéralise la solution par traitement avec de la Duolite et on la lyophilise 20 sous forme d'acétate. On obtient ainsi 1'octa-peptide sous forme d'acétate.

Les composés des exemples précédents, par exemple les composés des exemples 1 et 2 peuvent être préparés de manière analogue.

25 Exemple 53

Préparation de la Na-[a-glucosyl(1-4)-désoxyfructosyl)-SMS (voir exemple 2)

En procédant comme décrit à l'exemple 52, on prépare 393 g de 1'octapeptide lié à la résine.

30 Les groupes protecteurs de la cystéine sont éliminés par réduction. Le peptide lié à la résine est oxydé en octapeptide cyclique par l'eau oxygénée dans un mélange de tétrahydrofuranne et d'eau.

·* 86

Après lavage dans du têtrahydrofuranne et ensuite dans du DMF , la résine est extraite par 3600 ml d'un mélange 8:1 de DMF et de AcOH. On traite la suspension par 526 g de D(; + )maltose 5 monohydratê· On chauffe le mélange à 60° et on l'agite pendant 18 heures à cette température.

Le mélange est refroidi et la résine est séparée par filtration et lavée successive ment avec du DMF et du méthanol puis avec du chlorure 10 de méthylène. Le peptide est scindé de la résine pendant 1 heure avec un mélange de 2900 ml de chlorure de méthylène et 716 ml d'acide trifluoroacêtique avec une trace d'eau.

On agite ensuite le filtrat·, . on ajoute par 15 portions 597 g de carbonate de sodium, on agite pendant 30 minutes et on filtre. On lave le résidu avec du chlorure de méthylène et du méthanol et on concentre le filtrat à sec. On le déminéralise à l'aide d'une colonne de polystyrène du type Duolite, ou en phase 20 liquide (HPLC) à phase inversée, par exemple sur gel de silice traité au silicone et comportant des groupes alcools gras ä chaîne longue (par exemple Labomatic, Suisse , marque HB-SIL-18-20-100). On obtient ainsi le composé du titre 25 à 1'état pur.

* ** 87 *

Les composés de T invention présentent d'intéressantes propriétés pharmacologiques et peuvent donc être utilisés en thérapeutique comme médicaments.

L'activité des composés de l'invention peut être mise en 5 évidence dans des essais biopharmaceutiques et pharmaceutiques classiques. Les composés sont en général au moins aussi puissants que le peptide non modifié (c'est-à-dire le peptide correspondant non glucosylé) après administration par injection ou par voie orale. Ils sont en général mieux absorbés, sont plus facilement 10 solubles dans l'eau, et ont une plus longue durée d'action.

Les composés de l'invention sont donc indiqués pour être utilisés pour les mêmes indications que celles des peptides non modifiés.

Les composés de l'invention peuvent être comparés aux 15 peptides non modifiés dans des essais classiques de biodisponibilité.

Les composés de l'invention peuvent par exemple être décelés dans le plasma sanguin sur une plus longue période après leur administration que les peptides non modifiés, comme il résulte 20 des essais de biodisponibilité classiques.

Les composés de l'invention et le peptide non modifié peuvent être administrés par voie orale ou intraveineuse par exemple à des chiens, en une seule dose suffisante pour obtenir l'effet thérapeutique désiré.

25 Les doses utilisées sont celles permettant de déceler le peptide ou l'un de ses métabolites dans le sang. La détection peut être effectuée selon les méthodes habituelles, par exemple selon la méthode de dosage radioimmunologique (RIA).

Dans l'essai mentionné plus haut, on a trouvé par exemple 30 que le composé de l'exemple 2 administré par voie orale, produit des concentrations dans le sang dix fois supérieures a celles obtenues avec l'octréotide.

î *· t Λ 88

La biodisponibilité absolue du composé de l'exemple 2 administré par voie orale ou intraveineuse, déterminée par 1'AUC (aire sous la courbe) est 5 fois supérieure à celle de l'octréotide. La demi-vie d'élimination par voie intraveineuse est d'environ 5 2,3 heures alors quelle est d'environ 0,5 heure pour l'octréotide.

De plus, les composés de l'invention présentent l'avantage d'être éliminés en grande partie par les reins. Ceci peut être mis en évidence par des essais classiques.

On fait jeûner des rats males (d'un poids de 225-375 g) 10 et on leur administre de l'eau par voie orale (50 ml/kg). On anesthésie les animaux au bout de 30 minutes avec, par exemple, de l'inactine (100 mg/kg par voie intrapéritonéale). On place une canule dans le canal biliaire et la vessie. On met a nu les deux veines jugulaires. Dans Tune d'entre elles, on pratique une 15 perfusion a 5¾ de glucose et 1 % d'éthanol (5 ml/heure) afin de stimuler la diurèse. On utilise l'autre veine pour effectuer des prélèvements de sang (0,5 ml) toutes les heures pendant 4 heures.

On administre le composé de l'invention et le peptide non modifié par voie sous-cutanée à une dose comprise entre environ 10 20 et environ 1000 microgrammes/kg. On détermine la concentration en composé selon les méthodes habituelles, par exemple par RIA.

Dans l'essai ci-dessus par exemple, les résultats suivants ont été obtenus avec le composé de l'exemple 2 et l'octréotide à raison de 10 microgramme/kg: 25 Pourcentage éliminé par voie

Biliaire Urinaire

Composé de l'exemple 2 1,6 36

Octréotide 22 19

Alors que l'octréotide est éliminé par voie biliaire et 30 urinaire, le composé de l'exemple 2 est essentiellement éliminé par voie urinaire.

f 89 « * f- *

On peut montrer une absorption améliorée des composés de l'invention par administration par voie orale, de la manière suivante:

On administre par voie orale le composé de l'invention et 5 le peptide non modifié a des rats OFA (par exemple 10 mg/kg). A divers intervalles de temps précis, par exemple 15, 30 et 60 minutes, on prélève des échantillons de sang et on analyse leur teneur en substance active, par exemple par RIA.

Dans cet essai, on a trouvé par exemple que le 10 composé de l'exemple 44, administré à une dose de 10 mg/kg, présente une absorption de 50 à 100 % supérieure à celle du peptide non modifié, l'oxytocine. Les résultats sont les suivants:

Taux plasmatiques chez le rat, après administration par voie orale. Les résultats sont donnés en ng/ml 15 15 minutes 30 minutes 60 minutes

Oxytocine 7,53 3,60 2,55

Composé de l'exemple 44 11,79 6,98 3,98

Les activités pharmacologiques des composés de l'invention peuvent être mises en évidence dans des essais pharma-20 cologiques usuels, par exemple après injection, et, si nécessaire, être comparées a celles des peptides non modifiés, par exemple en termes de puissance et de durée d'action.

On peut par exemple effectuer des essais pharmacologiques pour vérifier chez les animaux les effets des composés de 25 l'invention sur les hormones. Ainsi, les composés qui inhibitent la sécrétion d'hormones peuvent être soumis à des essais permettant de déterminer la baisse des taux sanguins de l'hormone.

Les composés de l'invention qui inhibitent la sécrétion de 1' hormone de croissance,en particulier les composés de formule 30 VIII, et plus particulièrement les composés de formule VIII a a f, et réduisent les concentrations de l'hormone de croissance dans le sang, peuvent être soumis aux essais suivants: / 90 « * * r *

On fait jeûner des singes rhésus (au moins 5 singes) maintenus sur des chaises et on leur administre le composé de l'invention dans un morceau de banane servant de véhicule. On administre les composés a une dose comprise entre environ 0,1 mg/kg 5 et environ 10 mg/kg par voie orale. On prélève du sang de la veine saphène par un cathéter. On mesure par RIA la concentration de l'hormone de croissance dans le sang.

Dans cet essai effectué sur des singes rhésus, on a trouvé par exemple que le composé de l'exemple 2 administré à une 10 dose de 0,1 mg/kg, provoque une baisse de la sécrétion de l'hormone de croissance d'environ 50 % pendant plus de 10 heures, alors que cet effet ne dure que 5 heures avec le peptide non modifié, l'octréotide.

Dans un autre essai, on décapite des rats mâles et on 15 prélève du sang 1 heure après administration de manière logarithmique du composé inhibant la sécrétion de l'hormone de croissance. On détermine le taux de l'hormone de croissance dans le sang par RIA. Dans cet essai, les composés de l'invention sont actifs a des doses comprises entre environ 0,02 et environ 30 20 microgrammes/kg par voie sous-cutanée. On ¾ trouvé, par exemple que les composés des exemples 1, 2, 21 et 24 administrés par voie sous-cutanée, ont respectivement une DI50 de 0,045, 0,190, 0,3 et 0,2 microgrammes/kg, la DI50 de la stomatostatine naturelle administrée par voie sous-cutanée dans le même essai étant de 93 25 microgrammes/kg (la DI50 indique la quantité de composé requise pour abaisser de 50% la teneur en hormone de croissance par rapport aux animaux témoins non traités).

Contrairement à la somatostine naturelle, les composés inhibiteurs de la sécrétion de l'hormone de croissance de 30 l'invention sont fortement actifs dans cet essai pendant une longue période (par exemple 6 heures).

91 * * • f L'activité inhibitrice de ces composés a été également mise en évidence après administration par voie orale a des rats mâles ayant des implants d'oestradiol. Dans cet essai, on observe des variations relativement minimes du taux de l'hormone de 5 croissance. L'essai est effectué de la manière suivante: A des rats mâles d'un poids d'environ 300 g, on implante sous la peau dorsale un tube (longueur= 50 mm, diamètre = 3 mm) de silastic avec 50 mg d'oestradiol, sous anesthésie a l'éther. On réutilise ces animaux plusieurs fois (1 a 6 mois plus tard) pour les 10 essais. On administre la substance a essayer par voie sous-cutanée ou par voie orale.

Juste avant, ainsi qu'a divers intervalles de temps après l'administration de la substance, on prélève environ 0,8 ml de sang du plexus rétro-orbital, on le centrifuge et on détermine le taux 15 de l'hormone de croissance dans le sérum par RIA.

Les composés de l'invention sont plus actifs après administration par voie orale que les peptides correspondants non modifiés, même après plusieurs heures. La DI50 de chaque composé des exemples 1 et 2 est, au bout de 2 heures, environ 17 a 40 fois plus 20 faible que celle du peptide non modifié, l'octréotide. D'autres résultats sont les suivants:

Composé de l'exemple DI50 par voie orale microgramme/kg 21 500 24 25 25 Octréotide 1400

Les composés de l'invention sont donc indiqués lorsqu'une inhibition de la sécrétion de l'hormone de croissance est nécessaire. Les indications comprennent le diabète sucré, la prévention et le traitement de 1'angiopathie et de la rétinopathie 30 proliférative, ainsi que de l'acromégalie.

L'action inhibitrice des composés de l'invention sur la sécrétion de l'hormone de croissance, inhibe également la sécrétion pancréatique. Cette inhibition peut être mise en évidence dans des 92 1 *

« F

* essais effectués chez l'animal. La méthode décrite dans Scand, J. Gastroint. _6, 423 (1975) par S.O. Konturek et col. peut être utilisée.

Les composés de l'invention qui inhibent la sécrétion 5 de l'hormone de croissance inhibent également la sécrétion du suc gastrique et augmentent le pH du suc gastrique de plusieurs unités.

Cette activité des composés de l'invention peut être mise en évidence par exemple dans l'essai suivant:

On administre les composés de l'invention qui inhibent la 10 sécrétion de l'hormone de croissance, a une dose comprise entre environ 0,05 mg/kg et environ 5 mg/kg, à des rats a jeun chez lesquels on a pratiqué une fistule dans l'estomac. Au bout d'1 heure, on ouvre la fistule et on prélève le suc gastrique toutes les 30 minutes. On note les volumes prélevés et on détermine la 15 concentration en acide.

Dans cet essai, le composé de l'exemple 2 provoque une augmentation du pH de 6 a 8 pendant 3,5 heures. L'octréotide a provoqué une augmentation des valeurs du pH de 6 à 7 pendant seulement 2 heures. Cet essai montre que le composé de l'exemple 2 20 est au moins 50 fois plus actif que la cimétidine.

Les composés de l'invention qui inhibent la sécrétion de l'hormone de croissance, en particulier les composés de formule VIII, peuvent donc être utilisés en thérapeutique pour le traitement des troubles gastro-intestinaux, par exemple pour les ulcères 25 gastriques, les saignements gastro-intestinaux, la pancréatite aigue et les tumeurs gastro-entéro-pancréatiques (par exemple, les vipomes insulinomes, glucagonomes etc).

Les composés de l'invention qui inhibent la sécrétion de l'hormone de croissance inhibent également la prolifération et/ou la 30 kératinisation des cellules épidermiques, et sont donc indiqués pour le traitement des maladies dermatologiques associés a une prolifération pathologique et/ou a une kératinisation des cellules épidermiques, spécialement pour le traitement du psoriasis.

93 à * *

* T

En outre, ces composés peuvent également être utilisés en thérapeutique dans le traitement de la démence sénile dégénérative, également la démence sénile du type Alzheimer (DSTA), ou dans le traitement des algies vasculaires de la face (céphalées 5 répétitives).

Pour toutes ces indications, les composés de l'invention qui inhibent la sécrétion de l'hormone de croissance sont avantageusement administrés a des doses comprises entre 2 microgrammes et 20 milligrammes. Si nécessaire, les composés peuvent 10 être administrés en doses fractionnées 2 a 4 fois par jour sous forme de doses unitaires, ou sous une forme à libération prolongée. Les doses unitaires peuvent comprendre entre 0,5 microgramme et 10 mg de substance active.

Les dérivés glucosylés- de la calcitonine et de ses 15 dérivés et analogues selon l'invention, plus particulièrement les dérivés de formule X, réduisent les taux de calcium dans le plasma sanguin. En outre, ils agissent comme antagonistes fonctionnels de la parathormone pour donner un bilan calcique positif en faveur de l'os. L'activité hypocalcémiante des nouveaux composés peut être 20 déterminée selon les méthodes habituelles, par exemple selon la méthode de M. Azria et col., exposée le 2-4 octobre 1984 lors du Symposium sur la calcitonine qui s'est tenu a Milan et publiée sous forme de brève communication dans "Current Cl i ni cal Practice Sériés" Ne 42, Excerpta Medica 1986, page 104. Dans cette méthode, on 25 utilise une électrode sélective pour l'ion calcium, afin de déterminer en continu la teneur en ions calcium dans le sang de jeunes lapins ou de chiens. On administre les composés par voie intra-veineuse à raison d'environ 0,1 à environ 10 microgrammes/kg, par exemple correspondant a environ 1 unité internationale par kg.

30 On effectue les mesures pendant 5 heures et on calcule les AUC.

i •. 94 .

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On peut également effectuer d'autres essais avec les composés de l'invention, par exemple l'essai décrit par M. Kumar et col., dans J. Endocrinology (1965), 33 page 469, et pratiqué sur des rats auxquels on administre différentes doses provoquant une 5 hypocalcémie, soit de 300 a 6000 U.I. par mg pour les composés de l'invention exerçant une activité hypocalcémiante.

On a trouvé, par exemple, que les composés des exemples 37 et 38 administrés par voie intraveineuse a des chiens (5pg/kg), ont une durée d'action bien plus longue que le peptide non modifié. 10 Dans cet essai, on observe après 3 heures une baisse du taux de calcium dans le sang comprise entre 15 et 18 % pour les composés 37 et 38; après 6 heures, on ne peut plus détecter de baisse de calcium dans le sang pour le peptide non modifié, alors qu'avec les composés des exemples 37 et 38, la baisse du taux de calcium était encore 15 aussi prononcée qu'après 3 heures.

Les composés hypocalcémiants de l'invention peuvent donc être utilisés en thérapeutique pour le traitement de tous les états nécessitant une baisse du taux de calcium dans le plasma sanguin ou un effet sur le métabolisme osseux, par exemple pour le traitement 20 de l'hypercalcémie résultant d'une déficience en thyrocalcitonine endogène due & la perte de la fonction sécrétrice des cellules C de la thyroïde ou a une hyperfonction de la glande parathyroïde. Ils peuvent également être utilisés pour le traitement de toutes les affections osseuses associées a une friabilité osseuse accrue ou 25 dans lesquelles une fixation du calcium dans les os est nécessaire, par exemple pour le traitement de l'ostéoporose d'origine diverse (par exemple post-climatérique, post-traumatique, consécutive à une corticothérapie ou a l'immobilisation, d'origine maligne etc), des fractures, de l'ostéomalacie, de l'ostéodystrophie rénale et 30 provoquée par le rachitisme, des douleurs, par exemple les douleurs osseuses associées a une ostéoporose, des troubles neuro-dystrophiques, de la maladie de Paget et pour la thérapie combinée avec le calcium ou les phosphates.

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95

Pour les indications ci-dessus liées au calcium, la dose quotidienne appropriée est comprise entre environ 5 et environ 1500 U.I., administrée quotidiennement en une seule fois ou, si nécessaire, tous les 2 ou 3 jours.

5 Les composés de l'invention, qui sont des dérivés glucosylés de la LHRH ou de ses analogues, inhibent la sécrétion de l'hormone lutéinisante, par exemple comme indiqué par l'inhibition de l'ovulation chez les animaux. Cet essai est effectué selon la méthode décrite par M. Marko et E. Flückiger, dans Experientia 30, 10 p. 1174-1176 (1974).

En général, ces composés de l'invention sont actifs a une dose comprise entre environ 0,0005 et environ 10 mg/kg. Par exemple, le composé de l'exemple 45 administré par voie sous-cutanée est actif a une dose de 0,01 mg/kg. L'effet inhibiteur des composés 15 sur la sécrétion de l'hormone lutéinisante peut également être déterminé in vitro. On prépare des cultures de cellules hypophysaires selon la méthode décrite par Vale (W. Vale et G. Grant, Enzymology 37, p. 82-93; 1975) et par M. Marko et D. Römer dans Life Sciences, 33, p. 233-240 (1983). On maintient des cellules primaires 20 pendant 4 jours dans un incubateur à 37eC. On lave ensuite les cellules et on les incube pendant 3 heures dans 1 ml d'un milieu contenant la LHRH ou le composé à essayer. A la fin de l'incubation, on récupère le surnageant et on détermine l'activité de l'hormone lutéinisante à l'aide de la méthode de dosage radioimmunologique 25 (RIA).

Dans cet essai, les composés de l'invention sont actifs en général à une concentration d'environ 10~12 a environ 10 -7, et inhibent la sécrétion de l'hormone lutéinisante induite par la LHRH en fonction de la dose.

30 Pour toutes les indications de la LHRH, la dose quotidienne appropriée est comprise entre 2 microgrammes et 20 mg de substance active. Si nécessaire, on peut administrer les « « ► * 4 • 96 composés en doses fractionnées 2 a 4 fois par jour sous forme de doses unitaires ou, si nécessaire, sous une forme à libération prolongée. De telles doses unitaires comprennent entre environ de 0,5 microgrammes et 10 mg de substance active.

5 On peut administrer les composés de l'invention selon les méthodes habituelles, par exemple par voie entérale, par voie orale, par exemple sous forme de solutions buvables, de comprimés ou de gélules, par voie nasale, par exemple sous forme de sprays liquides ou de poudre pour pulvérisations et de crèmes, ou par voie 10 parentérale, par exemple sous forme de solutions ou de suspensions injectables.

Pour le composé de l'exemple 2, une dose appropriée est comprise entre 3 et 10 mg administrée 3 fois par jour, par exemple par voie orale pour le traitement du diabète, des ulcères et de 15 l'acromégalie.

Les composés de l'invention peuvent être administrés sous n'importe qu'elle forme pharmaceutiquement acceptable, par exemple sous forme libre, c'est-a-dire de base libre, ou lorsque le composé est un acide, sous forme d'acide libre, ou sous forme d'un sel 20 pharmaceutiquement acceptable. Le sel peut être un sel d'addition d'acide ou, lorsque le composé est un acide, un sel cationique. On peut également administrer le composé sous forme de complexe. Les composés peuvent se présenter sous forme d'un solvat, par exemple d'un hydrate.

25 La présente invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant un composé de l'invention sous une forme pharmaceutiquement acceptable, en association avec au moins un véhicule ou diluant pharmaceutiquement acceptable. De telles compositions peuvent être préparées selon les méthodes 30 habituelles.

/ * , ' 97 « · ¥ * *

Une ampoule buvable ou une solution injectable peut contenir par ml, par exemple 0,5 mg du composé de l'exemple 2 sous forme d'acétate, 11,45 mg d'acide citrique, 6,32 mg de NaOH, 4,5 mg de NaCl.

5 La présente invention a également pour objet un composé de l'invention approprié pour l'une quelconque des utilisations indiquées plus haut, y compris l'abaissement de la sécrétion de l'hormone de croissance, le diabète sucré, la réduction des sécrétions gastriques et l'acromégalie pour les dérivés glucosylés 10 de peptides du type somatostatine.

La présente invention concerne également l'utilisation d'un composé de l'invention pour la préparation d'un médicament approprié pour l'utilisation dans le traitement des indications mentionnées plus haut, y compris l'abaissement de la sécrétion de 15 l'hormone de croissance, le diabète sucré, la réduction des sécrétions gastriques et l'acromégalie pour les dérivés glucosylés de peptides du type somatostatine.

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Claims (43)

1. Un dérivé glucosylé d'un peptide biologiquement actif, caractérisé en ce qu'il possède une durée d'action prolongée par rapport au peptide non modifié et contient au moins sur un des 5 restes d'ami no-acides, un reste glucidique fixé au groupe amino du reste d'amino-acide par une liaison autre qu'une liaison N-gluco-sidique directe et, lorsque le dérivé est un produit de condensation d'un glucide contenant un groupe carboxy avec un peptide ayant moins de 8 restes d'amino-acides, par une liaison autre qu'une liaison 10 amide.

2. Un dérivé glucosylé d'un peptide biologiquement actif, caractérisé en ce qu'il répond a) à la formule I 15 e'"V* m U) dans laquelle i'V-

20 K ./> c»:* représente le reste désoxy d'un cétose, le groupe CH2 de ce reste étant lié au groupe NH d'un peptide biologiquement actif, et 25. représente le reste d'un peptide biologiquement actif de formule NH2~P, dans laquelle le groupe NH2 représente le groupe amino N-terminal du peptide P ou un groupe amino situé dans une chaîne latérale du peptide P, / 99 * * t « b) de formule II G·' Υ^ΟΗ (Π) tfe-p 5 dans laquelle β'Γ^οβ représente le reste dêsoxy d*un aldose, la liaison 1) libre de ce reste étant lié au groupe NH d'un peptide biologiquement actif, et P représente le reste d'un peptide biologiquement actif de formule NH^-P, dans laquelle le groupe NHg représente le· groupe amino N-terminal du peptide P ou un 15 groupe amino situé dans une chaîne latérale du peptide P, c) à la formule III G3-C0-NRy-P (III) dans laquelle

20 G^CO représente le reste d'un acide uronique ou d'un acide polyhydroxymono- ou di-carboxylique, Ry représente l'hydrogène ou un groupe alkyle en ou alcanoyle en et P représente le reste d'un peptide biologiquement 25 actif de formule NH^-P» contenant au moins 8 restes d'amino-acides , NR étant situé sur le groupe amino N-terminal du peptide P y ou dans un chaîne latérale du peptide P, » 100 « Λ « * d) de formule IVa, IVb, IVc ou IVd -y .--o ^y ?#>-NH.Q.N -P «Va) . ^0-ς·-Ν-P (m) 5 /--0 OH R ' Η·)\. >* (IVc) ([Vd) Jit-ς" ·- N - P 10 dans lesquelles P représente le reste d'un peptide biologiquement actif de formule NH2-P, les restes -* O , - o 15 *«.> K y* / - -0. OH /""°v représentent des restes glucidiques, Ry représente T hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C3 ou alcanoyle en C1-C4 et

25 Q, Q1, Q" et Q1" représentent des goupes couplant le reste du peptide avec le reste du glucide, le groupe NH lié à P représentant le groupe amino N-terminal du peptide P ou un groupe amino situé dans la chaîne latérale du peptide P, ou / 4 * > ψ > 101 e) à la formule IVa ou IVb HOH2C-(CHOH)c-CY-CH2-NH-P (Va) HOH2C-(CHOH)c-CH-CH2OH (Vb)

5 NHP dans lesquelles Y représente H2 ou H, OH c signifie 2 ou 3 ou 4, et P représente un reste d'un peptide biologiquement actif de 10 formule NH2-P» le groupe NH lié a P représentant le groupe ami no N-terminal du peptide P ou un groupe amino situé dans la chaîne latérale du peptide P, et n'importe lequel des groupes hydroxy libres dans le reste du polyol du composé de formule Va ou Vb est éventuellement 15 lié par une liaison glucosidique a un mono-, di- ou oligosaccharide réducteur ou a un sucre aminé, ainsi que les sels d'addition d'acides et les complexes de ces dérivés , avec les conditions que a) dans les composés de formule I ci-dessus, P soit 20 autre qu'un reste d'un peptide de la gastrine ayant un groupe terminal se terminant par -Asp-Phe-NH2, b) lorsque dans les composés de formule IVb Q' signifie un cycle phényle contenant un radical divalent ou lorsque dans les composés de formule IVd Q"' 25 signifie le reste d'un acide aliphatique dicarboxy-lique, P-NH2 soit autre qu'une insuline naturelle, c) lorsque dans les composés de formule III G3~C0 représente le reste d'un acide muramique éventuellement N-acylé, le second reste d'amino acideà 30 l'extrémité N-termi nale du peptide P-NHR^ soit autre que le reste d'un acide amino-dicarboxylique . w 102 * H ' #

3. Un composé selon la revendication 2, caractérisé en ce que Q signifie CO ou CS.

4. Un composé selon l'une quelconque des revendications 1 a 3, caractérisé en ce que le peptide est un dérivé de la 5 somatostatine.

5. Un dérivé glucosylé de peptides de formule VIII il V ÎV5-*! vs^ (Vin) X-NH-ca-CO-N-ca-CO-B-C-D-5-NH-Ca-F I 2 3 4 S 6 7 10 dans laquelle A représente l'hydrogène, ou un groupe alkyle en C^-C^ ou alcanoyle en C^-C^, > N-CH ( Z-j ) -CO signifie 15 1) un reste (L)- ou (D)-phénylalanine éventuellement substitué par des halogènes ou par des groupes N02, NH2, OH.alkyle en -C^ et/ou alcoxy en C-j-C^, ou 2. le reste d'un α-amino-acide lipophile naturel 20 ou d’un (D)-amino-acide correspondant autre que celui indiqué sous 1), Z1 dans le reste ) N-CH(Z^)-C0- représente le reste d'un amino-acide défini sous 1) et 2), A' signifie l'hydrogène ou un groupe alkyle en -C3,

25 Y -J et Y 2 signifient .indépendamment l'un de l'autre, 1 ) 1'hydrogène 2. r ·' & -CO-C-(CH2)b-H "b / if * » * •ft 103 oö m signifie un nombre entier de 1 à 4 indus, Ra signifie CH3 ou C2Hg et signifie H, CH3 ou C2H5> i) 5 <a-crp2 (Ca,} 2 n où n signifie un nombre entier de 1 à 5 inclus, 4) -C0-NHRc 10 où Rc signifie un groupe alkyle linéaire ou ramifié en Cj-Cg, 5 ) -CO-NH-CH-COOR.’ I β Rd 15 où R^ signifie le reste d'un α-amino-acide naturel (y compris l'hydrogène) situé sur l'atome de carbone a et R signifie un groupe alkyle en C,-Cc, ou f%\ a* ». ’ \ H 25 dans laquelle R' et R/ , indépendamment l'un de l'autre, signifient a d l'hydrogène , CH3 ou C2H5> Rg et Rg , indépendamment l'un de l'autre, signifient l'hydrogène, F, Cl, Br, alkyle en C -j -C ^ ou alcoxy 30 en C^-C3> p signifie 0 ou 1, /q signifie 0 ou 1, et r si gni fi e 0, 1 ou 2, w a « * V » % 104 ou bien Y1 et Y^ forment ensemble une liaison, B signifie Phe ou Phe substitué dans le cycle phényle par F, Cl, Br, NO^ » NH^, OH, alkyle en C-j-C^ ou alcoxy en C^-C^, 5. signifie L- ou D-Trp éventuellement substitué dans le cycle phényle par F, Cl, Br, NO^, NH£, OH, alkyle en C^Cg ou alcoxy en C-j-Cg, 0 signifie Lys, dans lequel le groupe α-amino peut être substitué par un groupe méthyle, 10. signifie Thr, Ser, Val, F signifie COOR-j, CH2OR2J CO-NR^R^ ou -CO-n^^J \ signifie l'hydrogène ou un groupe alkyle en -C^» Rg signifie l'hydrogène ou le reste d'un ester physio-15 ' logiquement acceptable et physiologiquement hydro-1 y s a b 1 e , R^ signifie l'hydrogène ou un groupe alkyle en phényle, ou phénylalkye en C^-C·^, Rg signifiant uniquement l'hydrogène ou un groupe méthyle lorsque 20 R^ signifie -CH(Rg)-X^ , R^ signifie l'hydrogène ou un groupe alkyle en C-j-C-j, ou -CH-X^ (IX)

25 Rg représente le reste d'un amino-acide naturel (y compris l'hydrogène) situé sur l'atome de carbone a, un groupe OH-CH2-CH2 - ou OHf-CH^Îgi le groupe de formule IX pouvant avoir la configuration L ou D , X-| signifie C00R-|, ^ORg ou 30 nr7 fW'K 105 * 4 » P Rg signifie l'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C3, R7 signifie l'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C3, phényle ou phénylalkyle en C7-C10, les restes B, D et E pouvant exister sous forme L, et les 5 restes en position 2 et 7 ainsi que les restes Y]4) et Y24) pouvant exister indépendamment sous forme 0 ou L, ainsi que les sels et les complexes de ces composés.

6. La Not-Ca-glucosyl(l-4)-désoxyfructosyl)-SMS, où SMS signifie le reste _ 10 -(D)-Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys*Thr*Cys-Thr-ol

7. Un composés selon l'une quelconque des revendications 1 a 3, caractérisé en ce que le peptide est une calcitonine.

8. Un composé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la calcitonine est la calcitonine de saumon, d'anguille ou 15 humaine.

9. Un dérivé glucosylé d$ calcitonines répondant à la formule X

20 R- (NH-CH-CO) o-As-NH-Ca-CO-Aa-A9-ZL-ProNH2 dans laquelle R signifie H ou R"CQ R"CQ représente le radical acyle d'un acide carboxy-25 lique, Yj représente le reste situé sur l'atome de carbone a d1 un a-amino-acide, Y2 représente le reste situé sous l'atome de carbone a d'un a-amino-acide, ou un reste 30 -ch«-s-s-ch2-ch-cooh, -ch2-$-$-ch2-ch2-cooh,

2 I NH2 -(CH2)s-C0ÛH ou -CH2-S-Y3, 106 fc * « * Y3 signifie un groupe alkyle en Cj-C^, benzyle éventuellement substitué par méthyle ou mëthoxy, ou ch3conh-ch2-, o signifie un nombre entier de 1 à 4,

5 Ag signifie Thr ou D-Thr s signifie un nombre entier de 3 à 5, Ag représente le reste amino-acyle d'un L-a-amino-acide lipophile neutre, Ag représente le reste amino-acyle d'un L- ou D-a-amino-10 acide lipophile neutre, et signifie un reste polypeptidique si tué en position 10 à 31 d'une calcitonine naturelle ou l'un de ses dérivés ou analogues , qui possède une activité hypocalcémi ante, 15 les 1 à 4 restes Yj dans la formule X pouvant être identiques ou indépendamment différents , et, à l'exception du reste amino-acyle Ag, tous les restes d'amino-acides dans la formule X ont la configuration L ou D , 20 ainsi que les sels et complexes de ces composés.

10. Un composé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 3, caractérisé en ce que le peptide est un antagoniste de la LHRH.

11. Un dérivé glucosylé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'antagoniste de la LHRH correspond à la formule XVI VV^-VVVVVVVV^z {x v 1 ) 30 dans laquelle Ri signifie H ou un groupe acyle en C1-C7, A^signifie D-Phe, éventuellement substitué dans le cycle phényle par F, Cl, Br, NH2, CH3 ou OCH3, spécialement en position 4, un reste R-D-naphtylalamine, un reste / W- ê * * * Φ 107

0-Trp éventuellement substitué en position 5 ou 6 par F, Cl, Br, NH2, ou 0CH3 et/ou substitué en position 1 par un groupe formyle ou acëtyle, un reste proline, 3,4-dëhydroproline ou D-pyroglutamine 5 B1 signifie D-Phe éventuellement substitué par F, Cl, Br, NH2» CHg ou CH^O dans le cycle phényle, D-a-méthylphénylalanine, éventuellement substituée en position 4 par Cl, ou fJ-D-naphty 1 al anine.

10 C.j signifie D-Trp éventuellement substitué en position 5 ou 6 par F, Cl, Br, NH2 et/ou OCHg et/ou en position 1 par HCO ou CH^CO, ß-D-naphty lai anine,

3-D-pyri dylalanine,

15 D-Tyr, ou Phe éventuellement substitué par F, Cl, Br, NH2, CHg,ou CH30, D1 signifie Ser, signifie Tyr ou phénylalanine éventuellement substituée 20 dans le cycle phényle par Cl , Br, NHg, CHg ou CHgO, F-| signifie D-Phe, éventuellement substitué dans le cycle phényle par F, Cl, Br, NH2> CHj ou CH30, D-Trp éventuellement substitué en position 5 ou 6 par F, Cl, Br, NH2 ou CH30 et/ou en position 1 par 25 formyle ou acétyle, D Tyr, ß-D-naphtylalanine, D-Leu, D-Ile, D-Nle, DVal, D-Ser-(OtBu), D-Arg, éventuellement dialky1é par des groupes alkyle en Cj-Cg ou cycloalkyle en Cg-Cg,

30 D-homoarginine éventuellement dialkylêe par des groupes alkyle en C1-Cg ou cycloalkyle en Cg-Cg, D-His, D-His(Bzl), /D-Lys ou D-Orn, tous les deux éventuellement dialkylés par des groupes alkyle en C-j-Cg ou cycloalkyle en jpr J * * * Φ 108 C5”C6’ D-Phe (p-NHg) ou a-p-ami nocyclohexylalanine, G1 signifie Leu, Nie, Nva, Ν-α-méthylleucine, Trp, g Phe, Met ou Tyr, signifie Arg, Lys ou Orn éventuellement substitués par des groupes alkyle en C.|-Cg ou cycloalkyle en C5'C6 ’ 1^ signifie Pro, hydroxyproline, ou 3,4-dêhydroproiine, 10 et signifie D-Ala. et E| et F] peuvent être remplacés l'un par l'autre, D] et K]-pèuvent, si on le désire, signifier des restes Cys liés par un pont S-S, 15 un des symboles D] et K] signifie Asp ou Glu et l'autre signifie Orn, l'acide diaminopropionique ou l'acide diaminobutyrique, et les restes et sont liés par un pont amide. 20 ' 12. Un dérivé glucosylé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le reste glucoside est fixé au groupe ami no du peptide par une liaison autre qu'une liaison amide ou N-glucosidique directe.

13. Un dérivé glucosylé selon la revendication 1, 25 caractérisé en ce qu'il est préparé par réarrangement de Amadori ou de Heyns.

14. Un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'il contient un, deux ou trois restes glucidiques. . 109 4 * * Λ *

15. Un dérivé glucosylé selon l'une quelconque des revendications 1 a 14, caractérisé en ce que le peptide auquel est fixé le reste glucidique exerce une activité hormonale, inhibitrice d'une hormone, enzymatique, inhibitrice d'une enzyme ou immunomodu- 5 latrice.

16. Un composé selon l'une quelconque des revendications 1 a 15, caractérisé en ce qu'il se présente sous forme d'un sel ou d'un complexe.

17. Un composé selon Tune quelconque des revendications 10 là 14, sous forme libre ou sous forme d'un sel ou d'un complexe pharmaceutiquement acceptable, pour l'utilisation comme médicament.

18. Une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient un composé selon Tune quelconque des revendications 1 à 14, sous forme libre ou sous forme d'un sel ou d'un 15 complexe pharmaceutiquement acceptable, en association avec un véhicule ou diluant pharmaceutiquement acceptable.

19. Les composés de formule Ir Γι z—. rf*** ir 20 OÙ © est le reste d'une résine synthétique insoluble Z représente une liaison directe ou un reste qui relie 25 la résine avec le groupe formylphényle acétalisé X signifie 0 ou S Rj signifie l'hydrogène ou un groupe méthyle, et Y est le reste d'un peptide-alcool qui peut comporter des groupes protecteurs, / wr I 4 « * * I» no le groupe CHO acétalisé est situé en position méta ou para du reste Z et un nombre de groupes formylphényle (acétalisés) sont liés à la molécule de résine polymère, les composés de formule Vr 5 n Vr X ο-άΤ dans laquelle p) représente le reste d'une résine synthétique insoluble, 10. représente une liaison directe ou un reste qui relie la résine au groupe formylphényle acétalisé, X signifie 0 ou S, Rl signifie l'hydrogène ou un groupe méthyle et A représente un groupe protecteur du groupe ami no et le groupe 15 acétal est en position méta ou para du reste Z, et la résine comporte un nombre de groupes formylphényle acétalisés, les composés de formule VIr X-CH on /^ \ VIr

20. CH CH-NH-A 2 q\__/ 0-CH2 dans laquelle X signifie 0 ou S, Rl signifie H ou CH3, 25. représente un groupe protecteur du groupe ami no, E représente un reste qui relie le groupe Q12 avec le groupe formylphényle acétalisé, Q'2 représente un groupe réactif qui peut réagir avec un autre groupe réactif qui est lié a une résine synthétique, et 30 q signifie 0 ou 1 le groupe acétal étant en position méta ou para du groupe Q'2-(E)q-, les composés de formule j ” ^ jpr * » > * «ft ni dans laquelle (?) représente le reste d'une résine synthétique insoluble et V représente le reste qui relie la résine avec le groupe formylphényle, 5 le groupe formyle est en position méta ou para du groupe Z, et la résine comporte un nombre de groupes formylphényle.

20. Un procédé de préparation d'un composé tel que spécifié à la revendication 1, caractérisé en ce que a) on élimine au moins un groupe protecteur présent 10 dans un peptide glucosylé,selon la revendication 1,protégé, ou b) on couple par une liaison amide deux unités peptidiques, dont chacune contient au moins un amino-acide ou un amino alcool sous forme protégée ou non protégée et dont une unité peptidique contient ^ le reste glucidique , le couplage étant effectué de telle manière qu'on obtient la séquence d'amino-acidesdésirée, et éventuellement on met en oeuvre l'étape a) du procédé, ou c) on introduit au moins un reste glucidique éventuellement 20 ' protégé dans un peptide protégé ou non protégé et éventuellement on met en oeuvre l'étape a) du procédé, ou d) on transforme un groupe fonctionnel d'un peptide glucosylé selon la revendication 1, protégé ou non protégé, 25 en un autre groupe fonctionnel ou bien on élimine ce groupe fonctionnel, et éventuellement on met en oeuvre l'étape a) du procédé, ou e) on oxyde un peptide glucosylé, selon la revendication V> dans lequel le groupe mercapto des restes Cys sont sous forme libre, 30 de manière à produire un peptide dans lequel les deux restes Cys sont reliés par un pont -S-S. et on isole le composé obtenu sous forme libre ou sous forme d'un °U ^1111 COmi^eXe* F i * i > M v 112

21. Un procédé de préparation des composés spécifiés a la revendication 2, caractérisé en ce que a) on élimine au moins un groupe protecteur présent dans un peptide glucosylé , selon la revendication 2r.protégé,eu 5 b) on couple par une liaison amide deux unités peptidiques, dont chacune contient au moins un amino-acide ou un amino alcool sous forme protégée ou non protégée et dont une unité peptidique contient le reste glucidique , le couplage étant effectué ^ de telle manière qu'on obtient la séquence d’amino-acidesdésirée, et éventuellement on met en oeuvre l'étape a) du procédé, ou c) on introduit au moins un reste glucidique éventuellement ^ protégé dans un peptide protégé ou non protégé et éventuellement on met en oeuvre l'étape a) du procédé, ou d) on transforme un groupe fonctionnel d'un peptide glucosylé, selon la re/endication 2, protégé ou non protégé, en un autre groupe fonctionnel ou bien on élimine 20 ce groupe fonctionnel, et éventuellement on met en oeuvre l'étape a) du procédé, ou e) on oxyde un peptide glucosylq>, selon la revendication 2, dms lequel le groupe mercapto des restes Cys sont sous forme libre, de manière â produire un peptide dans lequel les 25 deux restes Cys sont reliés par un pont -S-S. et on isole le composé obtenu sous forme libre, ou sous forme d'un sel ou d'un complexe. 4 / * 4 i iß Λ * 113

22. Un procédé de préparation d'un peptide-alcool qui comporte à l'extrémité C-terminale de la chaîne peptidique 2 groupes alcool ou un groupe alcool et un groupe thiol, caractérisé en ce que le peptide-alcool est préparé par hydrolyse acide d'un acétal du 5 peptide-alcool et d'une résine contenant des restes formyl-phényle.

23. Un procédé selon la revendication 22 pour la préparation d'un peptide-alcool de formule __- CHR.-XH

10 Y-CO-NH-CH 1 \«ch2oh dans laquelle Y représente le reste d'un peptide-alcool Rl signifie l'hydrogène ou un groupe méthyle et 15 X signifie 0 ou S, caractérisé en ce qu'on hydrolyse sous des conditions acides une résine de formule Ir fL —^ X-CH ^^^o-cTrCi” qui porte le peptide-alcool, dans laquelle VP représente le reste d'une résine synthétique insoluble, et Z représente une liaison directe ou un reste qui relie la résine 25 avec le groupe formylphényle acétalisé, le groupe CHO acétalisé est situé en position méta ou para du groupe Z et un nombre de groupes formylphényle acétalisés sont liés à la molécule de la résine polymère.

24. Un procédé selon la revendication 23, caractérisé en 30 ce que Ä est un reste polystyrène. / / f « t— *r. A * 114

25. Un procédé selon la revendication 23 ou 24, caractérisé en ce que Z représente un groupe de formule -(D)p-Ql-Q2-(E)q- dans laquelle

5 Q]_ représente le reste d'un groupe réactif lié à la résine Q2 représente le reste d'un groupe réactif lié au groupe formyl- phényle acétalisé D représente un reste qui relie le groupe Qi au polymère E représente un reste qui relie le groupe Q2 avec le groupe 10 formylphényle acétalisé, et p et q, indépendamment Tun de T autre,signifient 0 ou 1.

26. Un procédé selon l'une quelconque des revendications 22 à 25, caractérisé en ce que Z représente un reste

15 -CH2-NH-C0-CH-(0)m- R dans lequel R = H ou CH3 m = 0 ou 1 et P représente un reste polystyrène.