SE518630C2 - Förfarande för framställning av en peptidalkohol - Google Patents

Description

»I n--u uu cow: à1s 630 2 omfattar termen alla modifierade derivat av biologiskt aktiva peptider, som uppvisar en kvalitativt liknande effekt som den omodifierade peptiden.

De använda sockerarterna kan t.ex. vara någon godtycklig känd mono- eller oligosackarid, speciellt en mono-, di- eller trios eller ett derivat därav, 5 t.ex. en amino- och/eller karboxylsyra och/eller reducerat och/eller förestrat derivat därav.

Sockret kan vara kopplat t.ex. till en N-terminal aminogrupp och/eller till minst en aminogrupp hos peptiden närvarande i dess sidokedja.

Sockret kan vara kopplat med en av sina funktionella grupper till 10 peptiden antingen direkt eller indirekt eller genom ett bryggkomponent, t.ex. en alkylenkarbonylgrupp.

Denna koppling kan ske på konventionellt sätt, speciellt som beskrivs nedan.

I en föredragen grupp av föreningarna enligt uppfinningen är sockerresten 15 bunden till en aminogrupp i peptiden genom en annan koppling än en direkt N- glykosid- eller direkt amidbindning.

En grupp av föreningarna enligt uppfinningen kan framställas med en Amadori- eller Heyns-omlagring.

Uppfinningen avser även orala läkemedelspreparat som innehåller en 20 förening enligt uppfinningen, speciellt sådana med minst 8 aminosyraenheter.

Föreliggande uppfinning avser särskilt följande sockerderivat av bio- logiskt aktiva peptider med formeln I E..ou :o n . G _! -=--; a) /uazua-r I ,"° J, oa dar G! af , 25 är deoxiresten av en ketos, varvid resten via GHz-gruppen är bunden till NH-gruppen i en biologiskt aktiv peptid, och P är resten av en biologiskt aktiv peptid med formeln NHZ-P, vari NH- gruppen är belägen på den N-terminala änden eller i en sidokedja hos peptiden P, 30 b) med formeln II - - -0 1' OR “a “" n -P nu arean » - ø . u: šw 63 0 ä* -2 " 3 är deoxiresten av en aldos, varvid gruppen via den fria bindningen är bunden till Nl-I-gruppen i en biologiskt aktiv peptid, och P är resten av en biologiskt aktiv peptid med formeln NHz-P, vari NH- gruppen är belägen på den N-terminala änden eller i en sidokedja hos 5 peptiden P, c) med formeln III GB-CO-NR -P III Y där GBCO är resten av en uronsyra, eller av en polyhydroximono- eller -dikarboxyl- syra, 10 Ry är väte, alkyl med 1 till 3 C-atomer eller alkanoyl med 1 till 4 C-atomer, och P är resten av en biologiskt aktiv peptid med formeln NHz-P, innehållande minst 8 aminosyraenheter, varvid NRy är belägen i den N-terminala änden eller i en sidokedja hos 15 peptiden P, d) med formeln IVa, IVb, IVc eller IVd R .' ' ' ray . NH - - - P R 6.4 Q ° ° - Y ~-- ä. _>t,°-Q-.~-p I V a _ _ I V b .g ' -0 ou , '34 ~- *fy . å' ll ' °° H¿-aH-Q'°_N- P 4-1. 'fy TV4 I V c -Q" " N ' P där 20 P betecknar resten av en biologiskt aktiv peptid med formeln HzN-P, .--0 ' --0 6:4 _ -w wø. f"0 OH G4 y G ._. 4-10 n . . v ~ . » ' ' ' " I 51-8 630 i " 4 är sockerrester, Ry är väte, alkyl med l till 3 C-atomer eller alkanoyl med 1 till 4 C-atomer, och Q, Q', Q" och Q"' är grupper som kopplar peptidresten till sockerresten, 5 varvid den till P bundna NH-gruppen är belägen i den N-terminala änden eller i en sidokedja hos peptiden, eller e) med formeln Va eller Vb HOHzC-(CHOPÛC-CY-CHZ-NH-P Va HOHZC-(CHOIÜC-çH-CHZOH Vb NHP 10 där Y är H2 eller H, OH c är 2 eller 3 eller 4 P är en rest av en biologiskt aktiv peptid med formeln l-lzN-P, varvid den till P bundna NI-l-gruppen är belägen i den N-terminala änden eller i en sidokedja hos peptiden P, och vilken som helst av de fria hydroxigrupperna i 15 polyoldelen av föreningarna med formeln V eventuellt är bunden på glykosyliskt sätt till en reducerande mono-, di- eller oligosackarid eller aminosockerart, liksom syraadditionssalter och komplex av dessa polypeptidderivat, med för- behållen att a) i de ovan angivna föreningarna med formeln I, P är annat än en rest av en 20 gastrinpeptid med en C-terminal grupp som slutar med -Asp-Phe-NHZ, *WE b) när i föreningarna med formeln IVb Q' är en fenylring-innehållande -;--§ tvåvärd grupp eller när i föreningarna med formeln IVd Q"' är resten av en alífatisk dikarboxylsyra, så är P-NHZ inte ett naturligt insulin, c) när i föreningarna med formeln III GB-CO är resten av en eventuellt N- 25 acylerad muraminsyra, så skall den andra aminosyraresten i den N-terminala änden av peptiden P-NHRy inte vara en rest av en aminodikarboxylsyra.

Ett gastrin är en peptid som ökar magsyrasekretion.

Alla de ovannämnda sockerresterna kan vara mono-, di- eller oligo- sackarider. Dessa sockerarter kan innehålla heptoser, hexoser och/eller pentoser, 3Û som kan existera som pyranoser eller furanoser.

I samtliga av de ovan angivna formlerna I till V har endast en sockerdel per peptidrest visats. Uppfinningen omfattar emellertid även sockerderivat av peptider med mer än en fri aminogrupp på peptidresten, varvid dessa derivat innehåller t.ex. 2 eller 3 sockerrester per peptidrest. 35 Uppfinningen avser dessutom alla biologiskt aktiva peptider som har mer e. . - v q n n ' ' " sis san ¿v;¿;¿;¿;¿æ 5 än en sockerrest som är bundna som definierats ovan.

Sockerpolypeptiderna innehåller företrädesvis l till 3 monosackarid- rester, som kan vara förenade med varandra som disackarid eller trisackarid.

I alla de ovannämnda föreningarna betyder linjen rv att bindningen kan 5 sitta i oi- eller ß-ställning.

I formeln I är E; o! företrädesvis: J C32' a) en rest med formeln VIa där 10 en av grupperna Ga och Gb är väte och den andra är OH, en av grupperna GC och G d är väte och den andra är OH eller O-glykosyl, där glykosylgruppen kan härledas från en reducerande mono-, di- eller oligosackarid, en av grupperna Ge och G f är väte och den andra är OH, en av grupperna G och Gh är väte och den andra är väte eller CHZOH, 15 t.ex. där grupperna Ga till Gh är valda så att resten med formeln VIa motsvarar »an-o 1 en grupp som kan erhållas med hjälp av en Amadori-omlagring av en naturlig eller en syntetiskt tillgänglig mono-, di- eller oligosackarid.

Följande rester kan nämnas som exempel på sockerrester med formeln VIa: ZÛ Deoxifruktosyl, deoxitagatosyl, deoxisorbosyl, a-glukosylfl-lÛ-deoxifruktosyl, a- glukosyl(l-4)-u-glukosyl(l-IQ-deoxifruktosyl. b) en rest med formeln Vlb o OH _ V I b GC C82 G g l G G . - v ~ v v ' ' ' ' " 518 650 f ä -- 6 där en av grupperna Ga och Gb är väte och den andra är OH, en av grupperna GC och G d är väte och den andra är OH eller O-glykosyl, vari glykosylgruppen kan härledas från en reducerande mono-, di- eller oligosackarid, 5 en av grupperna Ge och Gi är väte och den andra är väte, COOl-l, CHZOH, CH2-O-P(O)-(OH)2 eller CHZO-glykosyl, vari glykosylgruppen kan härledas frân en reducerande mono-, di- eller oligosackarid, t.ex. där grupperna Ga till G i är valda så att gruppen med formeln Vlb motsvarar en grupp som kan erhållas med hjälp av en Amadori-omlagring av en naturlig 10 eller en syntetiskt tillgänglig mono-, di- eller oligosackarid.

Rester med formeln VIb kan erhållas t.ex. med hjälp av en Amadori- omlagring av sackarider som gentiobios, melibios, ribos, xylos eller av uronsyror, såsom glukuronsyra eller galakturonsyra. ø P Iformeln II är å: 8 företrädesvis: \ \_ 15 - a) en rest med formeln VIla VlIa där en av grupperna Ga och Gb är väte och den andra är en fri bindning, en av grupperna GC och G d är väte och den andra är OH, en av grupperna Ge och G f är väte och den andra är OH eller O-glykosyl, vari Ö E i: 20 glykosylgruppen kan härledas från en reducerande mono-, di- eller oligosackarid, en av grupperna Gg och Gh är väte och den andra är CHZOH eller CHZ-O- glykosyl, vari glykosylgruppen kan härledas från en reducerande mono-, di- eller oligosackarid, t.ex. där grupperna G a till Gh är valda så att gruppen med formeln VlIa mot- 25 svarar en grupp som kan erhållas med hjälp av en Heyns-omlagring av en naturlig eller en syntetiskt tillgänglig mono-, di- eller oligoketos. b) en rest med formeln VIIb ~enn 10 15 20 25 30 5 8 63 0 =¿-_š._jš f: VIIb där en av grupperna Ga och Gb är väte och den andra är en fri bindning, en av grupperna GC och G d är väte och den andra är OH, en av grupperna G e och Gi är väte och den andra är CHZOH eller GHz-O- glykosyl, vari glykosylgruppen kan härledas från en reducerande mono-, di-eller oligosackarid, t.ex. där grupperna Ga till Gf är valda så att gruppen VIIb motsvarar en grupp som kan erhållas med hjälp av en Heyns-omlagring av en naturlig eller en syntetiskt tillgänglig mono-, di- eller oligoketos.

Rester med formeln VIIa eller VIIb kan exempelvis erhållas med hjälp av Heyns-omlagring av sockerarter som D-fruktos, laktulos, L-sorbos, D-tagatos eller D-ribulos.

I formeln III innehåller polyhydroximono- eller -dikarboxylsyran t.ex. minst 3 hydroxigrupper och kan även innehålla ytterligare substituenter, t.ex. amino- eller acetylaminogrupper.

Exempel på sådana polyhydroxikarboxylsyror är: "on-syror" härledda från sockerarter som glukonsyra, eller "arinsyror", såsom glukarinsyra, vidare kininsyra, acetylmuraminsyra, acetylneuraminsyra eller D- glukosaminsyra.

Exempel på uronsyror är glukuron- och galakturonsyror.

I föreningarna med formeln IV har Gu, L, Ga och GQ; de för G1 eller G2 ovan angivna definitionerna.

Gruppen Q eller Q' förenar en NHz-grupp i peptiden med en NHZ-eller HO-grupp i sockerresten och är t.ex. resten av en dikarboxylsyra eller företrädesvis en -CbHzb-CO-grupp, vari b är 0 till 6. Gruppen kan vara grenad. Q' betecknar exempelvis en -@-NH-CO-CH2-CH2-CO-, eller särskilt en -cbuzb-cogrupp (b t.ex. 1 nu e). Q är t.ex. en -cnz-co-reer. speeiem är Q -CO- eller -CS-. -NH-Q"- och -NH-Q"'~ anger grupper som förenar en NHz-grupp i peptiden med sockerresten, speciellt rester av w-aminokarboxylsyror. De kan exempelvis beteckna en -NH-Cbl-Izb-CO-grupp. 10 l5 20 25 30 35 » u « . nu 8 I fallet med en förening med formeln V är sådana med formeln Va föredragna, speciellt där C är 3.

Alla de ovannämnda resterna P är rester av biologiskt aktiva peptider.

Sådana peptider innefattar alla naturliga och syntetiska peptider (även derivat och analoger därtill) (se början av denna beskrivning) med hormonell, enzymatisk eller immunmodulerande aktivitet. Denna aktivitet kan vara både stimulerande och hämmande. Följande kan nämnas som exempel på sådana peptider: somatostatin, kalcitonin, oxytocin, vasopressin, insulin, LH, LHRH, GRF, gastrin, substans P, katepsin, encefaliner, liksom alla derivat till och analoger av dessa peptider som har liknande aktivitet som peptiderna eller som har antagoniserande aktivitet.

Föreningarna enligt uppfinningen innehåller företrädesvis minst 8 amino- syraenheter, t.ex. 8 till 32, speciellt 8 till 20, särskilt 8 till 10 aminosyror.

Föredragna peptider är de med formeln I och II.

I de ovannämnda och följande formlerna är för enkelhets skull socker- gruppen vanligtvis endast representerad av strukturen för pyranos. Givetvis omfattas även furanos och öppenkedjiga strukturer i uppfinningen, förutsatt att de existerar för sockerarterna ifråga.

Föreliggande uppfinning omfattar förfaranden för framställning av föreningar med de ovan angivna formlerna. De kan framställas med metoder som allmänt är kända för syntes av föreningar av detta slag.

Föreningarna enligt uppfinningen kan exempelvis framställas på följande sätt: a) minst en skyddsgrupp, som är närvarande i en sockerderivatiserad peptid, avlägsnas, eller b) två peptidenheter, av vilka var och en innehåller minst en aminosyra eller en aminoalkohol i skyddad eller oskyddad form och en peptidenhet inne- håller sockerresten, sammankopplas med en amidbindning, varvid peptidbind- ningen sker på sådant sätt att den önskade aminosyrasekvensen erhålls, och steg a) av förfarandet därefter eventuellt utförs, eller c) minst en eventuellt skyddad rest införs i en skyddad eller oskyddad peptid och steg a) av förfarandet därefter eventuellt utförs, eller d) en funktionell grupp i en oskyddad eller skyddad sockerderivatiserad peptid omvandlas till en annan funktionell grupp eller avlägsnas, så att man får en oskyddad eller skyddad glykosylerad peptid, och i det senare fallet steg a) av förfarandet utförs, eller e) en sockerderivatiserad peptid, i vilken merkaptogrupperna hos Cys-rester existerar i fri form, oxideras för framställning av en peptid, i vilken två Cys- - n v v nu u "v u| o I ' ' n _ , , , , a - o 1» n I _ a 1 o a n o s u .u u I I '.. 2.- -. .n ... s-n-.u u - I i . 1- u: u u n z ."' ' . q v n u. o. 0 -o ..- 10 15 20 25 30 35 . uu>n u I ' š':.:'..:=.'===- ==- v .. ... ... -_- --;_ g-g §":"2 . . : Äzxf v: :sl-n 0' 9 rester är förenade med en S-S-brygga.

Som angivits i början av denna beskrivning omfattar termen "socker" som det här används även sockerderivat, såsom aminosocker, oxiderade och reduce- rade socker eller förestrade socker.

De ovan angivna reaktionerna kan utföras på konventionellt sätt analogt med de förfaranden som beskrivs i de följande exemplen. Särskilt kan förfarande a) och b) utföras enligt den nedan beskrivna syntesen enligt uppfinningen. Där så önskas kan man i dessa reaktioner använda skyddsgrupper som är lämpliga för användning vid peptider eller sockerarter för funktionella grupper som inte deltar i reaktionen. Termen skyddsgrupp omfattar ett polymerharts med funktionella grupper.

Föreningarna med formeln I kan framställas genom att man låter en skyddad peptid med en fri aminogrupp i ett lätt surt medium reagera med en reducerande mono-, di- eller oligosackarid eller en motsvarande uronsyra eller ester därav (Amadori-omlagring), och perna. därefter avlägsnar skyddsgrup- Denna reaktion kan äga rum på konventionellt sätt för Amadori- omlagringen. Den tillsatta syran kan t.ex. vara isättika. Vid omsättning med uronsyra kan en ytterligare syra undvaras. Det är föredraget att använda ett överskott av kolhydrat, t.ex. l0 ekvivalenter på en ekvivalent peptidförening.

Reaktionen kan utföras i ett polärt lösningsmedel, såsom metanol, företrädesvis vid temperaturer av ca 60 till 70°C.

Föreningarna med formeln II kan framställas genom att man låter en skyddad peptid med en fri aminogrupp i ett lätt surt medium reagera med en ketos (Heyns-omlagring). Reaktionen kan utföras under samma betingelser som för Amadori-omlagringen (se ovan).

Föreningarna med formeln III kan framställas genom att man låter en skyddad peptid med en fri aminogrupp reagera med en syra med formeln GB-COOH eller ett reaktivt derivat av en sådan syra och därefter avlägsnar skyddsgruppen(-grupperna). Detta kan vara en konventionell amideringsreaktion, som kan utföras på känt sätt. I synnerhet syrahaliderna kan användas som reaktiva derivat av karboxylsyror. Amiderna kan t.ex. även framställas med de fria syrorna i närvaro av hydroxibensotriazol och dicyklohexylkarbodiimid.

Föreningarna med formeln IVa, IVb, IVc och IVd kan framställas genom att man a) låter peptiden först av allt reagera med bryggkomponenten och därefter låter produkten reagera med sockret, eller n v - u -u 10 15 20 25 30 35 .

DI Ill O I I ' v. ::.':::.::.

I II ' _ Il .n n. a: nz- :Iz :Hz-rg _ , : ::. .. l0 b) låter sockret först av allt reagera med bryggkomponenten och därefter låter den glykoliserade bryggkomponenten reagera med peptiden.

Dessa reaktioner kan utföras på konventionellt sätt. Vanligtvis är amid-, ester- eller acetalföreningarna enligt uppfinningen huvudprodukter. Före- ningarna enligt uppfinningen kan renas på konventionellt sätt.

Föreningar med formeln IVa, där Q är -CO- eller -CS-, kan exempelvis framställas genom koppling av motsvarande glykosylisocyanat eller glykosyliso- tiocyanat med formeln G4 NSC3L där L är O eller S och G4 har den ovan angivna definitionen, och där de fria hydroxylgrupper som är närvarande i G 4 är skyddade, t.ex. genom acylering, till en peptid P-NHZ i skyddad form, och därefter avspjälkning av skydds- grupperna.

Denna reaktion kan utföras på konventionellt sätt för framställning av karbamidderivat.

Föreningar med formeln IVc och IVd kan erhållas med hjälp av t.ex. en Amadori- eller Heyns-omlagring, t.ex. som beskrivits ovan för framställning av föreningar med formeln I och ll.

En förening med formeln Va eller Vb kan t.ex. framställas genom a') reduktiv aminering av en aldos, deoxialdos eller ketos med peptiden P-NH2-, eller b') reducering av hemiacetalgruppen i en förening med formeln I eller II, varvid om så önskas varje reaktant tillfälligt kan skyddas.

Den reduktiva amineringen och reduktionen kan utföras på konventionellt sätt. Den reduktiva amineringen kan exempelvis utföras med NaBH3CN. Före- draget pH är 7. Reduktion av hemiacetalgruppen kan utföras med borhydrider, t.ex. med NaBI-Iq. Föredraget pH är ca 6.

I den mån framställningen av utgångsmaterialen inte särskilt beskrivs här, är de kända eller kan framställas på konventionellt sätt, t.ex. med användning av metoder kända inom litteraturen eller som beskrivs här för analoga föreningar, eller genom den nedan beskrivna syntesen enligt uppfin- ningen.

En föredragen klass av föreningar enligt uppfinningen omfattar socker- derivat av somatostatinpeptider, t.ex. med 4 till 9 aminosyror. Termen somato- statinpeptider innefattar dess analoger eller derivat därav. Speciellt föredragna v o . u nu u 10 15 20 25 ll är sockerderivat av föreningar med formeln VIII: fl f' ?“2'“°*1 *fsfä A-NI-Cl-CO-N-C8-C0-3-ç-g-g-gg-çg-f VIII l 2 3 4 S 6 1 där A är väte, alkyl med l till 3 C-atomer eller alkanoyl med 1 till 4 C-atomer, >N-CH(Z 1)-CO är 1) en (L)- eller (D)-íenylalaninrest som eventuellt är substitue- rad med halogen, N02, NHZ, OH, alkyl med l till 3 C- atomer och/eller alkoxi med l till 3 C-atomer, eller 2) resten av en naturlig lipofil a-aminosyra eller av en mot- svarande (D)-aminosyra, annan än den som angivits under l), varvid Zl i>N-CH(Z1)-CO- betecknar en rest i en aminosyrarest definierad under l) och 2), A' är väte eller alkyl med 1 till 3 C-atomer, Yi och YZ oberoende av varandra är l) väte, R z) -co-c :CH ) -H , 2 m Rb där m är ett heltal från l till 4, R a är CHB eller C2H5 och Rb är H, CHB eller Czl-is, eller Zïflz 3) -co-cH \(cH2)n där n är ett heltal frän l till 5, eller 14) -CO-NHRC där RC är en rakkedjig eller grenad alkylgrupp med l till 6 C- atomer, eller 5) -CO-NH-CH-COORe Ra där R d är en grupp i en naturlig oz-aminosyra (inklusive väte) som är belägen på a-C-atomen, och Re är en alkylgrupp med 1 till 5 C-atomer, @ u v v en , a u- n. o 1 1 v , a v vc . o a o av z 1 _ 4 u. u v a v 0 I I v' :_ _ ' . uu .u nu .rv 4:a nu u. I . u w . f. .u u n 1 I a u o a »Q .- o n v ^ H ' 10 15 20 25 30 eller Y B C 111 73 'FU åns eso 12 n' n, . 6) -co-(uaip- c -tcazl :@a där R'a och RL oberoende av varandra är väte, CHB eller C2H5, R och R oberoende av varandra är väte, F, Cl, Br, alkyl med 1 8 9 till 3 C-atomer eller alkoxi med 1 till 3 C-atomer, p är O eller l, q är 0 eller l, och r är O, l eller 2, och YZ tillsammans betecknar en bindning, är Phe eller Phe som är substituerad i fenylgruppen med F, Cl, Br, N02, Nl-lz, OH, alkyl med 1 till 3 C-atomer eller alkoxi med 1 till 3 C-atomer, är L- eller D-Trp som eventuellt är substituerad i bensenringen med F, Cl, Br, N02, NHZ, OH, alkyl med 1 till 3 C-atomer eller alkoxi med 1 till 3 C-atomer, är Lys, där a-aminogruppen kan vara substituerad med metyl, är Thr, Ser, Val, är cooR 1, cuzoRz, Co-NR3R4 eller -eo-Üfi är väte eller alkyl med l till 3 C-atomer, är väte eller gruppen för en fysiologiskt godtagbar, fysiologiskt hydroly- serbar ester, är väte, alkyl med l till 3 C-atomer, fenyl eller fenylalkyl med 7 till 10 C-atomer, men när Ru betecknar -CH(R5)-X1, så betecknar den endast väte eller metyl, är väte, alkyl med l till 3 C-atomer eller Rs -cH-x xx 1 är en rest i en naturlig aminosyra (inklusive väte) som är belägen på a-C- atomen, eller en HO-CHz-Cl-lz- eller HO(-CH2)3-grupp, varvid gruppen IX kan ha L- eller D-konfiguration, /Rs är COOR CH OR eller CON' \R l' 22 7 är väte eller alkyl med 1 till 3 C-atomer, s | u ~ s.

Irønn »iaon 10 15 20 25 30 n »n u-u :q-.u-'z n I". mo: .- i: ' . ' . v , o o u o u s s .c z. z : . px: in nu nu un; nu. v. ' i n t I u s: v 1 n _ a s n ~ .n 1- n .i I I *I 13 är väte, alkyl med l till 3 C-atomer, fenyl eller fenylalkyl med 7 till 10 C-atomer, varvid grupperna B, D och E föreligger i L-form och grupperna i ställningarna 2 R7 och 7 liksom grupperna Yllr) och Yzli) oberoende av varandra föreligger i D- eller L-form, ' liksom salter och komplex av dessa föreningar.

Sådana föreningar beskrivs i US-PS 4 395 403, vars innehåll inklusive exemplen däri är införlivade häri genom hänvisning.

I polypeptidderivaten med den ovan angivna formeln VIII är följande definitioner eller kombinationer därav föredragna: Om >N-CH(Zl)-CO- har definition 1), är denna grupp företrädesvis en (L)- eller (D)-fenylalanin- eller en (L)- eller (D)-tyrosin-grupp (där Zl betecknar bensyl eller p-OH), speciellt (D)-fenylalanin-gruppen.

Om >N-Cl-I(Z1)-CO- har definition 2), är de grupper i vilka Zl är alkyl med 3, företrädesvis 4, eller fler C-atomer, t.ex. upp till 7 C-atomer, föredragna. >N-CH(Z1)-CO-gruppen är mest föredraget en grupp definierad under 1).

“ Y och Y har företrädesvis de betydelser som angivits ovan under l, 2 eller 4. l 2 Speciellt bildar de tillsammans en bindning.

B betecknar företrädesvis Phe eller Tyr.

C betecknar företrädesvis -(D)-Trp, D betecknar företrädesvis Lys.

E betecknar företrädesvis Thr.

F betecknar företrädesvis CO-N/RB, speciellt CO-N/R3 Mau \cH(R5)-x1 vari gruppen -CH(R5)-X1 företrädesvis har L-konfiguration.

R3 betecknar företrädesvis väte.

R 5 betecknar företrädesvis CHZOH, çH-OH, i-butyl, CHZCHZOH eller CH3 (CH2)3-OH, speciellt CHZOH eller çH-OH, särskilt (EH-OH.

CH3 Cl-I3 _. ._ . /Re .

X I betecknar foretradesvis -CO-N R eller CHZORZ, speciellt CHZORZ. 7 Rz betecknar företrädesvis väte.

Rz som gruppen för en ester betecknar företrädesvis HCO, alkylkarbonyl med 2 till 12 C-atomer, fenylalkylkarbonyl med 8 till 12 C-atomer eller bensoyl.

Grupperna i ställningarna 2 och 7 har företrädesvis L-konfiguration.

| J r 1 eo l ll: Speciellt föredragna socker-somatostatin-derivat är sådana som har en sockergrupp på den N-terminala aminogruppen, t.ex. föreningar med formeln - 0 ' ' ”Pa z' A- ca -s-w v -s-cn 2 1 z z- “u 1 . \~ _ _ 1\Cfi2-nu-ca-co - É - ca - co - a - c - o ~ 2 - nu - CB_- P _.° vma c on »ä f 3 fl f' 'fgfsfi Yz-S-G, Nu-ca-co - N - ca - co - 5 - C - 9 _ ¿ _ NB _ ån _ P VIIIb f fl f” 'f“2's"1. 'fsfä 5 ßa-co-n-ca-co-u-ca-co-a-c-o-e-ua-ca-r VIIIc 's ° 'f f*- f' É'2's"1 'fsffi Q; _ °°Q{'N ' C! - CO - N - CB - co - s - c - o - s - un - ca - r VIIId __ _ |i¿ gl ä. fgz-s-Yl y2-5.cg2 G5 H-Q -N - cs - co - N - ca - co - a - c - o - E - uu - ca - r " där Q är co eller cs ,HH VIIIe H z] Awnz-s-v] vz-s-cnz | n I | I HOCHZ-(CHOH) c-fiY-cHz-N-CH-CO-N-CH-CO-B-C-D-E-NH-CH-F Vlllf 10 Speciellt föredragna är föreningar med formeln VlIIa, VIIIb, VIIIe och VIIIf.

En grupp av föreningar omfattar sådana med formeln VIlIpa 21 A' ca:-s-vi Y -s-ca: Ap ' o o 2 - NI - CH - co - N - ca - co - a - c - o - E - ua - ca - r 1 2 a 4 s a VIIIpa :in-n -»|»a 10 15 20 25 5118 630 . '.' .. 'då i' i" ': 15 där AP är deoxigruppen för en ketos eller en motsvarande uronsyra, varvid l, där G Z, A', där Q n A Z, N, N, gruppen är kopplad till NH-gruppen via en GHz-grupp, varvid nämnda deoxigrupp kan erhållas genom en Amadori-reaktion mellan en aldos eller en motsvarande uronsyra och den fria aminogruppen i somatostatinet, och Y B, C, D, E, YZ är som definierats ovan med avseende på formeln VIII. 1! En annan grupp av föreningar omfattar föreningar med formeln VIIIpb Å 2 MCB-S-Y y-g-çg g | . I: I 2 .z -co-n-ca-co-u-ca-co-a-c-o-z-rm-ca-r 1 2 J 4 S 6 7 VIIIpb är en acylgrupp i en uronsyra, en polyhydroxicyklohexankarboxylsyra, N- acetylmuraminsyra eller N-acetyl-neuraminsyra, är väte, alkyl med l till 3 C-atomer eller alkanoyl med l till 4 C-atomer, Yl, B, C, D, E, YZ och F är som definierats ovan.

Lämpligtvis är G glukuronsyra, galakturonsyra eller kininsyra.

En annan grupp av föreningar omfattar sådana med formeln VIIIpc 'f ? f' ?'2'“"1 n-CO-Il-CH-CO-N-CI-CO-I-C-D-I-NB-Cfl-I' l. 2 3 4 S G 'I Yz-S-Cflz Q-O-Cnflz VIIIpc är väte eller glykosylgruppen i en mono-, di- eller oligosackarid, är ett heltal från l till 6, är väte, alkyl med l till 3 C-atomer eller alkanoyl med l till ü C-atomer, Y B, C, D, E, YZ och F är som definierats ovan.

I! En ytterligare föredragen klass av föreningar enligt uppfinningen omfattar sockerderivaten av kalcitoniner.

Termen kalcitonin omfattar kalcitoniner som är naturligt förekommande (antingen extraherade från naturliga källor, cellkulturer etc. eller framställda syntetiskt) och derivat och analoger.

Naturliga kalcitoniner som kan användas innefattar människo-, lax-, ål-, kyckling-, nötkreaturs-, får-, rått- eller griskalcitonin, speciellt människo-, lax-, kyckling- och ålkalcitoniner.

Derivat av och analoger till dessa kalcitoniner innefattar särskilt - - . . ~ n . u . - o ø n» sia eso 16 naturliga kalcitoninstrukturer, där en eller flera aminosyragrupper är ersatta med en eller flera andra aminosyragrupper och/eller S-S-bryggan är ersatt med en alkylenbrygga, och/eller där en eller flera aminosyragrupper har utelämnats.

Speciellt föredragna är sockerderivaten av kalcitoniner med den följande 5 formeln X Yi Yå R-(NH-CH -CO)o-A6-NH-CH -CO-Ag-Ag-Z l-ProNi-iz X där R är H eller R"CO, R"CO är acylgruppen i en karboxylsyra, 10 Yi är en grupp belägen på a-C-atomen i en a-aminosyra, Y'2 är en grupp belägen pä oz-C-atomen i en a-aminosyra, -CHZ-S-S-CHZ-çl-i-COOH, -CHZ-S-S-CHZ-CHZ-COOH, -(CI-l2)S-COOH NHZ eller -Cl-l2-S-Y3, ' Y3 är alkyl med l till Li C-atomer, bensyl som eventuellt är substituerad med 15 metyl eller metoxi, eller CH3CONH-CI-l -, o är ett heltal från 1 till 4, A 6 är Thr eller D-Thr, få s är ett heltal från 3 till 5, ' A8 är aminoacylgruppen i en neutral, lipofil L-u-aminosyra, 20 A9 är aminoacylgruppen i en neutral, lipofil L- eller D-a-aminosyra, och - Zl är en polypeptidgrupp som är belägen i ställningarna 10 till 31 i ett E naturligt kalcitonin eller ett derivat därav eller en analog därtill, som -¿--§ har hypokalcemisk aktivitet, _ _ varvid de l till 4 Yï-grupperna i formeln X oberoende av varandra kan vara lika g: 25 eller olika och, med undantag av aminoacylgruppen A 8, alla aminosyragrupperna i formeln X kan ha L- eller D-konfiguration, liksom salter och komplex av dessa föreningar.

Sådana föreningar finns exempelvis beskrivna i GB 2 184 729A, vars innehåll liksom de specifika exemplen införlivas häri genom hänvisning. 30 Z 1 i formeln X betecknar en peptidgrupp som kan vara närvarande i ställningarna 10 fram till 31 i olika kända kalcitoniner, t.ex. i människo-, lax-, âl-, kyckling-, nötkreaturs-, fâr-, rätt- eller griskalcitonin, liksom i derivat av och analoger till dessa kalcitoniner, som har liknande aktivitet. Med derivat av och analoger till dessa kalcitoniner förstås speciellt naturliga kalcitoniner, där en man; 10 l5 20 25 30 35 l7 eller flera aminosyragrupper är ersatta med en eller flera andra aminosyra- grupper, eller S-S-bryggan är ersatt med en alkylenbrygga, eller där en eller flera aminosyragrupper har utelämnats. Dessa peptidgrupper Z 1 innehåller normalt 22 aminosyror, men de kan även innehålla en motsvarande mindre mängd aminosyra- grupper genom utelämning av en eller flera aminosyragrupper (des-aminoacyl- derivat).

Zl betecknar företrädesvis a) Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-l-lis-Thr-Phe-Pro- Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala b) Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro- Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr c) Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro- Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr Föreningar med formeln X, där Zl har den under b) eller c) angivna definitionen, företrädesvis sådana där Z I har definitionen c), är speciellt I föredragna.

R"CO är företrädesvis acylresten av en alifatisk, cykloalifatisk, aromatisk eller heterocyklisk karboxylsyra.

R" är företrädesvis a') mättad eller omättad, rakkedjig eller grenad alkyl med 1 till 17 C- atomer, speciellt mättad alkyl med 3 till 9 C-atomer, b') cykloalkyl med 5 till 7 C-atomer eller cykloalkylalkyl där cyklo- alkylgruppen innehåller 5 till 7 C-atomer och alkylgruppen innehåller l eller 2 C-atomer, c') adamantyl, adamantylmetyl eller adamantyletyl, eller d') fenyl, bensyl eller fenetyl.

I de ovannämnda definitionerna för R" kan alkyl-, cykloalkyl- eller fenylgrupperna vara substituerade med sedvanliga substituenter, t.ex. med halogen, N02, OH, alkoxi, etc.

Resten R"CO kan t.ex. vara a-desaminoresten av en naturlig o-amino- syra. För R" är definitionerna a'), b') och c') föredragna.

Y'1 och Y'2 särskilt de grupper som är bundna till a-C-atomen i en naturlig a-aminosyra, men som grupper som återfinns på a-C-atomen i en a-aminosyra är grupper i andra a-aminosyror kan också komma ifråga, t.ex. i 3-cyklohexylalanin eller i en a-aminoisosmörsyra.

När o i formeln X betecknar l+, är :"':Ä"1"..' z: .' :':É.

I" 2". Ä: "z- :': :'"-": z: 10 15 20 25 30 18 a) den N-terminala aminoacylgruppen (motsvarande den andra aminosyra- gruppen i sekvensen för de naturliga kalcitoninerna) företrädesvis Ser, Gly eller Ala, b) den andra aminoacylgruppen (motsvarande den tredje aminosyragruppen i sekvensen för de naturliga kalcitoninerna) företrädesvis Asn eller Ser, c) den tredje aminoacylgruppen (motsvarande den fjärde aminosyragruppen i sekvensen för de naturliga kalcitoninerna) företrädesvis Leu, Asn, Ser, Phe, D- Leu eller cyklohexylalaningruppen, d) den fjärde aminoacylgruppen (motsvarande den femte aminosyragruppen i sekvensen för de naturliga kalcitoninerna) företrädesvis Ser eller Ala.

När o i formeln X är 3, har den N-terminala, den andra och den tredje aminosyragruppen samma föredragna definitioner som ovan för det fall när o = 4 under b).

När o i formeln X är 2, har den N-terminala och den andra aminosyra- gruppen samma föredragna definitioner som ovan för det fall när o = 4 under c) och d).

När o i formeln X är l, är den N-terminala och den andra aminosyra- gruppen företrädesvis Ser eller Ala.

A 6 är företrädesvis Thr.

Fä -NH-CH -CO betecknar företrädesvis Cys, ett derivat av cystein som angivits ovan för Y'2, eller en naturlig lipofil oi-aminoacylgrupp, speciellt Ala eller en annan neutral lipofil a-aminoacylgrupp, särskilt Ala.

A8 är företrädesvis aminoacylgruppen i en neutral lipofil c:- aminosyra, speciellt Val eller Gly.

A9 är också företrädesvis aminoacylgruppen i en neutral lipofil a- aminosyra, speciellt Leu eller Phe.

I föreningarna med formeln X är o företrädesvis 2, varvid R betecknar H eller R"CO, eller särskilt är o l och R är R"CO.

Samtliga aminosyragrupper har företrädesvis L-konfiguration.

De glykosylerade kalcitoninerna (inklusive derivat och analoger) är speciellt sådana som är glykosylerade pâ den N-terminala aminogruppen eller på en eller flera aminogrupper i en eller flera sidokedjor, t.ex. föreningar med formlerna 518 630 zwïua: ="=":= :=:_, ="=":= z 3 z 2. u. .n-.us z _I". z Q | - | u a . ~ . - - - m 318 630 19 _ . O OH X I a _ 5 a o p IQ\ ÉZ en xrb - - -Cale A o 3co-u-cne XIc A §"'°'°"H“° xId l, ' ' 0 s - G4 \VNH- Q-NH-cuc Xle __/ eller (Q = CO eller CS) Houzc-(cnon)¿cv-cnzun-caïc XI, Calc betecknar resten för ett naturligt kalcitonin eller för ett derivat av 10 eller en analog till ett sådant kalcitonin, som är bundet till sockerresten via en aminogrupp på den N-terminala änden eller i en sidokedja.

Kalcitoninderivaten med formeln X kan framställas med metoder som är allmänt kända för syntes av polypeptider av detta slag. Polypeptiderna med den ovan angivna formeln kan exempelvis framställas som följer: 15 a) minst en skyddsgrupp, som är närvarande i en skyddad polypeptid i den i ¿l§': formeln X angivna sekvensen, avlägsnas, eller i b) två peptidenheter, av vilka var och en innehåller minst en aminosyra eller ett derivat därav, såsom beskrivits för formeln X i skyddad eller oskyddad form, sammankopplas med hjälp av en amidbindning, varvid peptidbindningen 29 skall ske på sådant sätt att man får den aminosyrasekvens som ingår i formeln X, och steg a) av förfarandet därefter eventuellt utförs, eller c) en förening med formeln X, där R betecknar väte, i skyddad eller oskyddad form, omsätts med en syra med formeln R"COOH eller med ett reaktivt derivat av en sådan syra, och steg a) av förfarandet eventuellt utförs, 1 n i n a c q i . g u - . . Q - n » ~ I I I I H 518 630 šäbßfïffififidfif 20 eller d) för framställning av en förening med formeln X, där Y'2 betecknar CHZ-S-S-CHZ-CH-COOH eller CI-IZ-S-S-CI-IZ-CHZ-COOH, antingen en förening I NHZ med formeln XII fi ef” 5 n- (un-ca-co: o-As-ua-ca-co-Aa-Ag-zl-mimz X I I i skyddad eller oskyddad form får reagera med en förening med formeln XIII É“z's"1o au-v-ca-coan X I 1 I där Rloär en grupp som underlättar bildning av en S-S-brygga med S-atomen i den andra CHZSH-gruppen i peptiden med formeln XII, 10 ' R 1 l betecknar väte eller en aminoskyddsgrupp, Rlz betecknar OH eller en skyddsgrupp för karboxylgruppen, och V betecknar väte eller en NH-grupp, eller en förening med formeln XIV fi É“z's“1o 15 a- (uu-ca-co) Q-AE-un-cn-co-Aa-Ag-zl-vzømz X I V wr-v ':"É i skyddad eller oskyddad form, där Rio definieras som ovan, får reagera med en förening med formeln XV CE *SI I - XV RllVfCl-COR: och steg a) av förfarandet därefter eventuellt utförs. 20 Om framställningen av utgângsprodukterna inte specifikt beskrivs, är dessa föreningar kända eller kan framställas och renas med vanliga metoder.

Slutprodukterna med formeln X kan likaledes renas på vanligt sätt, så att de innehåller mindre än 596 polypeptid-biprodukter. De peptider som används som utgângsprodukter för förfarandena a) och b) kan likaledes framställas på känt 25 sätt i lösning eller med fastfasförfarande. swrn 10 l5 20 25 30 35 a ø ø Q no I n. n, o . . v 0- mv» u . to 1 u o - nu s o n . .. u q u . v . .o n u u I 1.. u» ~. .u v.. vnn~x n o . . n» 1- v l . u v - . 4 n a -u n a n a f n . 21 Framställning av peptidenheter som innehåller en grupp -CHZ-S-S-CHZ-CHZ-COOH eller -CHz-S-S-CHZ-Cl-KNHQ-COOH som Y'2-grupp kan ske analogt med det ovannämnda förfarandet d).

Vid detta förfarande d) används föreningar med formeln XIII eller XIV, i vilka Rio betecknar kända grupper som reagerar med merkaptaner under bildning av en S-S-bindning. Rw är särskilt S-alkyl, -S-COO-alkyl, Sw! eller S-SO3-.

I dessa grupper är alkyl speciellt lägre alkyl med l till li C-atomer.

Införandet av dessa grupper i föreningar med fria SH-grupper kan utföras analogt med metoder som är kända inom svavelkemin.

En ytterligare föredragen klass av föreningar innefattar en grupp av LHRH-antagonister.

Företrädesvis innefattar föreningarna sockerderivat av föreningar med formeln XVI ' R -A -B -C -D XVI 1111 -E-F-c-H-i-K-NH lllllll2 där R 1 är H eller en acylgrupp med l till 7 C-atomer, A1 är D-Phe, som eventuellt är substituerad i fenylringen med F, Cl, Br, NHZ, Cl-l3 eller CCI-IB, speciellt i iii-ställning, ß-D-naftylalanin, D-Trp som eventuellt är substituerad i 5- eller G-ställning med F, Cl, Br, NI-lz eller OCHB och/eller är substituerad i l-ställning med formyl eller acetyl, prolin, 3,4-dehydroprolin eller D-pyroglutamin, B 1 är D-Phe som eventuellt är substituerad med F, Cl, Br, NI-lz, CHB eller CHBO i fenylringen, D-a-metylfenylalanin, som eventuellt är substituerad i ü-ställning med Cl, eller B-D-naftylalanim C I är D-Trp som eventuellt är substituerad i 5- eller 6-ställning med F, Cl, Br, NHZ och/eller OCHB och/eller i l-ställning med HCO eller CHBCO, B-D-naftylalanin, B-D-pyridylalanin, D-Tyr, eller Phe som eventuellt är substituerad med F, Cl, Br, NHZ, CH3 eller CHBO, D 1 är Ser, E I är Tyr eller fenylalanin eventuellt substituerad med Cl, Br, NHZ, CH3 eller CHBO i fenylringen, Fl är D-Phe som eventuellt är substituerad i fenylringen med F, Cl, Br, NHZ, CHB eller Cl-IBO, D-Trp som eventuellt är substituerad i 5- eller G-ställning med F, Cl, Br, ~--|o 10 15 20 30 35 o - | o oo i n. n. n o o v of HI- o s o o o o o | oo o n o »o o o o o o o v oo o o o o oo. -o- o. nu oo. von-f' o v o . o u fo u v . o o v o o o a I. .o o U o o oo a 22 NHZ eller CH O och/eller i 1-ställning med formyl eller acetyl, D-Tyr, ß-D-naftylalanin, D-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Val, D-Ser(OtBu), D-Arg, eventuellt dialkylerad med (C 1_6)alkyl eller (C 5_6)cykloalkyl, 3 D-homoarginin som eventuellt är dialkylerad med (C1_6)alkyl eller (C 5_6)Cykloalkyl, D-His, D-Hisuszl), r D-Lys eller D-Orn, som båda eventuellt är dialkylerade med (C1_6)alkyl eller (C 5_ 6)cykloalkyl, D-Phe(p-NH2) eller a-p-aminocyklohexylalanin, är Leu, Nle, Nva, N-a-metylleucin, Trp, Phe, Met eller Tyr, är Arg, Lys eller Orn som eventuellt är substituerad med (C1_6)alkyl eller (C 5_6)cykloalkyl, är Pro, hydroxiprolin eller Bß-dehydroprolin, och är D-Ala.

Om så önskas kan El och F l ersättas med den andra. D I och K I kan om så önskas vara Cys som är kopplade med en S-S-brygga.

Om så önskas är den ena av D I och Kl Asp eller Glu och den andra Orn, diaminopropionsyra eller diaminosmörsyra, varvid resterna D l och K 1 är kopplade med en amidbrygga.

Föredragna betydelser är: acetyl eller formyl, D-Phe, D-Phe(p-Cl), ß-D-naítylalanin, BJL-dehydroprolin, D-Phe som eventuellt är substituerad såsom angivits ovan, D-Trp som eventuellt är substituerad såsom angivits ovan, Ser.

Eventuell substitution är företrädesvis monosubstitution.

El = Tyr eller Phe som eventuellt är substituerad såsom angivits ovan, nar D-Phe eller Lys eller D-Phe eller Lys, när Fl: El: Fl: Leu, Tyr eller Phe som eventuellt är substituerad såsom angivits ovan, Arg, Pro, D-Ala.

I de ovannämnda LHRH-antagonisterna är sockerresten företrädesvis 10 15 20 . > - » ø n . u v . .- l u.. n.. u ~ . u a p n n I u n . uu a n I n u. s o s o n o , po n n o n. .n v, :n u., vfvvn.v v p o n 4 la nr n r I n O I u u n a u »» .n v .-, o u nu - 23 bunden till den N-terminala aminogruppen eller till en fri aminogrupp i en sidokedja.

Sockerderivaten har företrädesvis följande strukturer, där HzN-LHRH- antagonist betecknar en LHRH-antagonist med formeln XVI: ,-° a G \1.

- - CHZNB-LBRH-Åntlq . o Gs-CO-Nfl-LERI-Åntlq . é. 3./ mrQ-Nn-Lflnn-Anuq. 4 \ é, ñ>~,o~Q~4uhLnnufium;q. 4 \ aocnzc- (cnomc -c-cu-z-un-mm-muq. XV 1 f 'l XVIa XVIb XVIc XVId Xvle I de ovan angivna formlerna XVIa till XVIf visas för enkelhets skull endast en sockerrest bunden till en aminogrupp. Emellertid kan om så önskas fler än en sockerrest vara närvarande. Företrädesvis är två sådana sockerrester närvarande. a) b) C) Utgängsmaterialen och syntesen för de omodifierade LHRH-antagonis- terna beskrivs exempelvis i EPA 81887 och 20l260A.

Ytterligare föredragna polypeptider är: oxytocin och vasopressin, liksom deras derivat, t.ex. Lyss-vasopressin och Orns-vasopressin, insulin, tillväxthormonfrisättande faktor. 10 15 20 25 30 35 S18 630 ¿n;g;-- 21+ Utgângsmaterialen och föreningarna enligt uppfinningen kan framställas med vätskefas- eller fastfassyntes.

Föreningarna enligt uppfinningen kan enkelt framställas med fastfas- syntes.

Vi har funnit ett speciellt lämpligt förfarande för framställning av peptidalkoholer, som i den C-terminala änden av peptidkedjan uppbär tvâ alkoholgrupper eller en alkoholgrupp och en tiolgrupp. Förfarandet är speciellt lämpligt för framställning av peptidalkoholer, som innehåller en C-terminal treoninol-, serinol- eller cysteinolgrupp.

Exempel på lämpliga föreningar innefattar vissa av de somatostatin- föreningar som beskrivs här.

Fastfaspeptidsyntes har visat sig vara ett speciellt snabbt och gynnsamt förfarande för framställning av peptider och har därför blivit en allmänt konventionell metod.

Som är känt binds först av allt en aminosyra medelst dess karboxylgrupp under bildning av en ester- eller amidgrupp till en hydroxylgrupp eller -aminogrupp hos ett olösligt syntetiskt harts; därefter adderas ytterligare aminosyror på denna i den önskade sekvensen, och slutligen klyvs den fullständiga polypeptiden av från bärarhartset.

Denna syntes fungerar utan problem för normala polypeptider med C- terminala aminosyror. Emellertid bildar polypeptidalkoholer, som i C-änden uppbär en aminoalkohol istället för en aminosyra, inte enkelt en bindning med bärarhartser uppbärande OH- eller NHZ-grupper och/eller avklyvs inte så lätt igen när syntesen slutat.

Följande har tidigare föreslagits som möjliga fastfasförfaranden för framställning av peptidalkoholer: a) konventionell framställning av motsvarande polypeptid som i C-änden innehåller en aminosyra (som ester av ett harts uppbärande Oki-grupper) och efterföljande klyvning genom reduktion med användning av borhydrider, varvid karboxylgruppen samtidigt omvandlas till en alkoholfunktion (US-patenten 4 254 023/ 4). b) addition av den terminala aminoalkoholen som eter till ett hydroxi- metylharts med användning av karbonyldiimidazol, och slutligen, efter syntes av peptiden, klyvning med användning av HCl/TFA eller HBr/TFA (Kun-hwa Hsieh och G.R. Marshall, ACS National Meeting, New Orleans, 21-25, 3, 1977).

Emellertid kräver bägge dessa metoder drastiska klyvningsbetingelser.

Vi har funnit att avklyvningen av peptiden från hartset, under samtidig bildning av den C-terminala peptidalkoholen, utförs under milda betingelser, om n ~ | . v. u -w-u e .- once 10 15 20 25 30 | n n | no | -.. sv. n n Q o 0- -..- o , 1 o a | 0 | nu . u u 1 v, 0 u p u 0 0 I nu v u n va. -xv v; nu 1.» :snuva b n n 1 1 -1 nu o - 1 n 0 I | u f - s un nu u t. a v en i 25 den C-terminala aminoalkoholen är bunden till hartset med hjälp av en acetalbindning.

I enlighet med uppfinningen framställs en peptidalkohol som i den C- terminala änden av peptidkedjan uppbär 2 alkoholgrupper eller en alkoholgrupp och en tiolgrupp genom sur hydrolys av en acetal av peptidalkoholen och ett polymerharts som uppbär formylfenylgrupper. Detta kallas syntesen enligt uppfinningen.

Reaktionen kan illustreras schematiskt på följande sätt: i* tf HL ___,“ ®_z \ /cn-ua-co-v O-CHZ s (IF canal-KH @.z_@°**° + v-co-m-ca-cuzoa (två där ® är gruppen för ett olösligt syntetiskt harts, Z är en direkt bindning eller en grupp som förbinder hartset med den (acetaliserade) formylfenylgruppen, X är O eller S, RI är väte eller metyl, och Y är gruppen för en peptidalkohol som kan uppbära skyddsgrupper, varvid den eventuellt acetaliseradeCl-IO-gruppen är belägen i m- eller p-ställning till gruppen Z. Av enkelhetsskäl har i formlerna I och Il i det ovan angivna schemat endast en substitutionsgrupp angivits på hartset; det bör emellertid stå klart att ett antal sådana grupper är bundna till en molekyl av hartspolymeren.

Avklyvning av peptidalkoholen från hartset genom hydrolys av acetalgruppen sker som nämnts ovan under sura betingelser, t.ex. med utspädd trifluorättiksyra.

Hydrolys kan utföras vid rumstemperatur.

Om Z i formeln Ir är en direkt bindning, är de fenylgrupper som uppbär acetalgrupper direkt bundna till polymergruppen och tillhör polymeren. Exempel på sådana föreningar med formeln I är acetalerna av ett formylerat polystyren- harts (i formeln Ir är ® då en polyetenkedja).

Om Z är en grupp, så innehåller denna grupp en grupp som är resultatet av reaktion mellan en reaktiv grupp, dvs. som är direkt eller indirekt bunden till polymeren, och en annan reaktiv grupp, som är direkt eller indirekt bunden till 10 15 20 25 v l.. in. n a nn anno n n nn nun u , n n n n n n nu n v n I f n I I n o n n n o! n u u nu nn. o» nnn ann sann-n. n n 1 1 en nn n n n n 0 0 n s n n n on nn n ,. n n nu n 26 den (acetaliserade) formylfenylgruppen. Gruppen Z kan exempelvis representeras av den följande formeln IIIr: -p-Q1-Q2-q- mf där QI _ gruppen för en reaktiv grupp som är bunden till polymeren, C22 _ gruppen för en reaktiv grupp som är bunden till den (acetaliserade) formylfenylgruppen, D = en grupp som förbinder gruppen Q 1 med polymeren, E = en grupp som förbinder gruppen Qz med den (acetaliserade) formylfenyl- BYUPPG", p och q oberoende av varandra är 0 eller 1.

Ql-Qz-gruppen är företrädesvis en ester eller amidgrupp, speciellt en karbonamidgrupp. Q l är företrädesvis NH, och QZ är företrädesvis CO.

D och E är oberoende av varandra t.ex. alkylen- eller alkylenoxigrupper med l till 5 C-atomer. Exempel på sådana föreningar med formeln Ir, där Z är en 'grupp med formeln IIIr, är föreningar där ®-D-Q1 är gruppen för ett aminometylerat polystyrenharts, och gruppen *i _, x-cu\ Q _: ca I ca-un-co-v 2 \ o-cuz är en grupp med formeln IVr R |1.

/ *CR ca uu co- _ _ - - r c-cn (o¿-@°{ o-ca/ O R 2 där R = väte eller metyl, och m = 0 eller l, varvid acetalgruppen åter är belägen i m- eller p-ställning.

I detta fall är sålunda Z -CH2-NH-CO-CH-(O)m- och P är polystyren.

I R / x-cíï -cu >cu-un-oo- Y \o-ca2 Istället för aminometylerad polystyren kan andra polymerer också Gruppen IVr är företrädesvis -CO-CB2-0-@ användas, speciellt sådana med fria NHZ-grupper, t.ex. polyakrylamider som . _ v.. u.. n a . > | . n . u . - . . 1. n . .o a . o . .o . u v o .. n u . v . n . .oc o o . x.. u. o. .n o.. sun.. > s . . f. .. o I . u . o v . . a. .n s ., o o . 27 uppbär aminoetylgrupper.

Som angivits ovan är den acetaliserade formylfenylgruppen företrädesvis bunden till polymeren med en amidbindning. Detta säkerställer att bindningen av den acetaliserade formylfenylgruppen till hartset är stabil under syntes av 5 polypeptiden och under klyvning, och att klyvning sker på acetalbindningen, såsom önskas, så att dels peptidalkoholen bildas och dels formylfenylgruppen förblir kvar på hartset. ' Om så önskas kan peptidalkoholen bindas längre bort från hartset genom införlivande av s.k. spacers mellan de reaktiva grupperna i polymeren (speciellt 10 aminogrupper) och de reaktiva grupperna i det acetaliserade formylfenylderi- vatet (speciellt karboxylgrupper). För vissa reaktioner på polypeptidalkoholen kan detta med fördel ske före klyvning (t.ex. oxidation av cysteingrupper). I detta fall innehåller gruppen D eller E i formeln IIlr dessutom spacern, och Ql eller Qz är den reaktiva gruppen i spacern. 15 Den använda spacern kan exempelvis vara en LO-aminokarboxylsyra, såsom å-aminokapronsyra.

I ett specifikt fall är vid användning av aminometylerad polystyren, en grupp med formeln IVr och E-aminokapronsyra som spacer, Z _:_ -CHZ-NH-co-(CH2)5-NH-co-cH-(o)m- ,.:: R ' 20 Föreningarna med formeln lr kan framställas med metoder som är vanliga inom fastfasteknik utgående från en förening med formeln Vr »soon ' ' /X-èfl =;--§ CI! \cn-uu-A ®=@\ f v. °'°“2 där A är en skyddsgrupp för aminofunktionen, och acetalgruppen sitter i m-eller p-ställning till gruppen Z. För detta ändamål avklyvs först av allt skyddsgruppen 25 A, varefter den fria aminogruppen får reagera med nästa N-skyddade aminosyra, etc., tills samtliga aminosyror adderats till hartset i den sekvens som motsvarar den önskade peptidalkoholen.

De aminoskyddsgrupper som skall väljas för de använda aminosyrorna eller för aminoalkoholen måste vara sådana som klyvs av under icke sura 30 betingelser, eftersom det under sura betingelser sker hydrolys av acetalgruppen.

CF3 användas som sådana aminoskyddsgrupper. Dessa skyddsgrupper avklyvs i basisk CO- eller FMOC-gruppen (9-fluorenylmetyloxikarbonyl) kan exempelvis miljö på ett sätt som är vanligt inom peptidkemin. :nosa xiuvp 10 15 25 518 630 " " 28 Endast skyddsgrupper i sidokedjorna och aminoskyddsgruppen i den sist tillförda aminosyran kan vara syralabila och avspjälkas sedan samtidigt från hartset med återbildning av peptidalkoholen.

Företrädesvis är Boc-grupper närvarande som skyddsgrupp.

Som baser används företrädesvis KOH eller piperidin eller NaBHu.

Uppbyggnaden av peptidkedjan kan utföras på konventionellt sätt från en peptidrest med fria aminogrupper och en aminosyra med fria eller aktiverade karboxylgrupper.

Reaktionen kan utföras med tillsats av t.ex. hydroxibensotriazol och dicyklohexylkarbodiimid.

Föreningar med formeln Vr kan framställas t.ex. genom att man a) låter ett harts som uppbär en aldehydgrupp med formeln IIr ®-=-@°°° nr där CHO-gruppen sitter i m- eller p-ställning till Z-substituenten, reagera med en N-skyddad aminoalkohol med formeln i-ix-cHR l-ciflNflfn-ci-izofl eventuellt i aktiverad form, eller b) låter ett harts med formeln (Q-ioiß; reagera med en förening med formeln VIr R /1 X-CB / . CH cn-un-A 92' mg \ o-caz/ där acetalgruppen sitter i m- eller p-ställning till Qï-(Üq-gruppen, och Qí och Q'2 VIr är två reaktiva grupper som reagerar med varandra för att bilda en Ql-QZ- brygga.

Acetaliseringen enligt förfarande a) kan ske i närvaro av en syra som katalysator. Lämpliga syror innefattar p-toluensulfonsyra och p-trifluormetylsul- fonsyra.

Om så önskas kan en trimetylsilylgrupp användas som skyddsgrupp för en fri alkohol. »nano »spur l0 15 20 25 30 35 | n | n .u l n' u» o n u I I' 'HI v , | s n - o v .a a n n u -u u n y u v I n nl v I I N n- o. h» nu» |o~«o.| -v \ l i n m »o n n y n 0 I n u v n a n. n. c f. I I -I I 29 Förestringsförfarandet b) kan utföras under mycket milda betingelser, t.ex. genom reaktion mellan ett karboxylsyraderivat och OH- eller NHZ- uppbärande polymer.

Föreningarna med formeln VIr kan framställas genom acetylering av en förening med formeln Qå- q@' °“° med en förening med formeln HX-CHR -CI-KNHIU-CHZOH l Acetaliseringen kan utföras som för förfarande a).

Under uppbyggnaden och avspjälkningen av peptidalkoholen från hartset kan ytterligare reaktioner utföras, t.ex. avlägsning av skyddsgrupper, t.ex. S- skyddsgrupper, eller oxidation av cysteingrupper.

Sådana reaktioner kan utföras efter avspjälkning av peptidalkoholen i _ vätskefas.

Enligt syntesen enligt uppfinningen kan man enkelt framställa farma- kologiskt aktiva och andra peptider, som i C-änden innehåller 2 alkoholgrupper eller en alkohol- och en tiolgrupp.

I de följande exemplen är alla temperaturer angivna i Celsius-grader, och [oÛÉO-värdena är okorrigerade. Följande förkortningar används: AcOH = ättiksyra Boc tert.-butyloxikarbonyl But = tert.-butyl DCCI = dicyklohexylkarbodiimid DMF = dimetylformamid Fmoc = 9-fluorenylmetoxikarbonyl MeOH = metanol NEt3 = trietylamin Thr-ol = treoninol-grupp = CH B-CHOH-Cl-KCHZOPD-NH- TFA = trifluorättiksyra HOBT = N-hydroxibensotriazol hpGRF = humant pankreatiskt tillväxthormon-frisättande faktor HOSu = N-hydroxisuccinimid Alla peptider erhålls som poiyacetat-polyhydrat med en peptidhalt av 70 till 90%.

HPLC-analys visar att peptiderna innehåller mindre än 5% andra 'nano n-»ov l0 15 20 25 30 peptider.

Den i de följande exemplen angivna faktorn "F" visar peptidhalten i de erhållna produkterna (F = l motsvarar 10096 peptidhalt). Skillnaden upp till 10096 (U-F) x 100] består av ättiksyra och vatten.

Alla socker har a-konfiguration såvida inte annat anges. Deoxi = desoxi.

EXEMPEL 1: Na-ß-Deoxifruktosyl-DPhe-CyÉ-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cvs-Thr-ol-acetat I n on n. au I 1 ua 4%- (D) Phe-Cys-Phe- (D) Trp-Lys-'thz-Cys-Thz-ol AC! Bl! uO u 3 ml trifluorättiksyra (l0096-ig) sätts till #00 mg (Na-ß-deoxifruktosyU- D-Phe-Cšfs-Phe-DTrp-Lys(BOC)~Thr-C§s-Thr-ol och hålls vid rumstemperatur, tills allt utgångsmaterial löst sig (5 minuter). Efter tillsats av 20 ml diisopropyl- eter utfälls titelföreningen och avfiltreras sedan samt tvättas med diisopropyl- eter. Titelföreningen renas genom kromatografi på silikagel (elueringsmedel: CHCl3/MeOl-l/HOAc/l-l2O 7/ 3/0,5/ 0,5) och isoleras som ett vitt lyofilisat. (00%): -31,3° (c = 0,52 1 HoAc 9596); F= o,sz Utgångsprodukten kan framställas på följande sätt: a> fi-_D_Pne_-9'v_s-_f>ne_-9T_fa-Lsaßeçant-sisflreu 2,25 g di-tert.butyl-perkarbonat, löst i 30 ml DMF, sätts långsamt droppvis vid rumstemperatur till en lösning av 10 g H-DPhe-C 'ÜT-Cys-Thr-ol-acetat i 100 ml DMF. Efter två timmar vid rumstemperatur avdrivs lösningsmedlet under vakuum, och 200 ml diisopropyleter sätts till återstoden. Den fällning som bildas avfilteras, tvättas med diisopropyleter och torkas. Råprodukten renas genom kromatografi över silikagel (elueringsmedel: CHzClzlMeOl-I 9/ l) och isoleras sedan som ett vitt amorft pulver. (a]â°= 29,s° (c = 1,221 DMF) b) äf-êzDšë*iiÉERPEIQQEQäQYÉBEäQTIIrkYÄPQQETDEÉÉ-:TDEQ 2 g D(+)-glukos och 0,5 g av slutprodukten i steg a) löses i 20 ml MeOH/HOAc 9/1 (vol.vol.) och hålls vid 60-70°C i tre timmar. Efter koncent- rering genom indunstning upptas produkten i en liten mängd metanol, och titelföreningen fälls med diisopropyleter. Den renas genom kromatografi över - n . , ,. fu u; I n n nya g o a s .o v s c s .o f u o nu I n u o 1 u s ua n n u f I ~ » | n» I» n: so. vunna: n I c 1 . x. .u n n . 0 n v o l ; nu nu n ,. n n | n 31 silikagel (elueringsmedel: Cl-lzClzlMeOl-l 9/1). Man får ett amorft pulver. (ufgfå = 12,o° (c = 1,041 DMF) Följande föreningar (alla som acetat) framställdes analogt med Exempel 1 (i dessa föreningar betecknar SMS polypeptidgruppen 5 -DPhe-Clys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cyls-Thr-ol).

EXEMPEL 2: N”- [ q-cnukosyu1-u)-<1eøx1fru1 IO-ILH utgående från D(+)-maltos istället för D-glukos. 10 (Mg) = -7,9° (c = 0,71 iAcoH 95%), F: 0,91 EXEMPEL 32 Na-( a-Glukosylfl-lü-a-gJukosyKl-lÛ-B-deoxifruktosyl ) -SMS 'Iz H |- 1 HO-II-.H HO--fi-l H :I ' ""'° H H oH g 'ß H H H øH H H H o - . H0 o GH GHz-sms “ï"5 H oH H 0" ° H utgående från maltotrios istället för D-glukos. 15 (nä) = +11,3° (c = 0,71 1 95%-1g Acom; r== 0,73 EXEMPEL 11: Na-Fruktofuranuronsyra-SMS utgående från D-glukuronsyra istället för D-glukos. 20 (Mg) = -z9,u° (c = 0,311 1 esss-ig AcøH);1== 0,23 >n.uu 518 630 32 -..>- 4 - f >< .- QoU' *- EXEMPEL s: wa-deox1sorbosyl-sms H a o ou 'ån ou "° cut. sms H H utgående från D(+)-galaktos istället för D-glukos-.

(Mg) = -3o,1+° (c = 0,50 195%-1g Acoz-U; F: 0,35 Exempel. s: N°-(o-ß-D-G1u1wsy141-u)-<1eøx1fru1 “_0001 1141» - n _"° “ I ä' u u on wo * o” ca: sus ,. ... l_1 utgående från D(+)-ce1lobios. (fflâo = -2s,1° (c = 0,117 1 9s%-1g AcoH);1== 0,21 EXEMPEL 7: N°-L-(q-Deøxifrukføsyl-sms li on (Hi- SHS H0!! utgående från L(-)-g1ukos istället för D(+)-glukos. (uJÉO = -zo° (c = o,4s19s%-1g AcoH);1== 0,91 EXEMPEL 8: N “- (o-ß-D-G1uk0sy1-(1-e)-deox1fru1<:osy1J-sms n uo-l -u gfÛÛ I OH 'åfl H vi mm f 'iv HI I | H nun n 0 II :nu I u I! I . 0 i Ib t I I n. I uu t . - o »in I I nu nu o: e-z Ja: :xviøuï I u 0 | l *I s: n i r I I I 0 0 0 r f. s s» l cc u 33 h utgående från gentíobios istället för D-glukos. (eJÉO = z3,5° (e = 0,46 1 esæ-ig Aeom; F; 0,76 EXEMPI-:L 9: N°'- ( o- ß-D-calekresyu»ln-deexifrukfesyl )-sMs n u av ou 0 “ ou mik”- sus u KG --!l 5 utgående från D(+)-laktos istället för D-glukos.

(Mg) = -29,3° (e = 0,55 1 em-ig AeoH);1== 0,83 EXEMPEL 10: N a - [O-u-GalaktosyM l -Q-deoxifruktosyl )-SMS _ u: ÜO-l-H no 0 'l ÛÜ H H “ 0 N .ou 10 H ID o ' " W I? l l 9 Cflz-(DNïhe-Cys-Phe-(ONrp-Lys-Thn-Cys-Thr-ol.

H0 ll utgående från melíbios istället för D-glukcs. (e]â° = +s,u° (e = 0,5 i esæ-ig Aeon-n; F: 0,76 EXEMPEL 11: fN-(l-Deoxi-D-fruktosyl)-Tyr3]-SMS ON 15 CI-Q-(OHihe-Cys-Tyr-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol utgående från Tyr3-sMs :ställer för sMs. [edâo = -32,2° (e = 0,91 eses-ig AeoH);1== 0,87 »upon w-nv | - I . « o . . . - .q A513 650 34 EXEMPEL 122 fN-(oz-D-GlukopyranosyH 1 -4)-1-deoxifruktosyl)-Tyr3 J-SMS NO 0 ° 004 I' I nu m» en,-(o)nn.-cy=-Tyr-(0)T=n-Lv=-Th=-CY='““"°1 OH å utgående från D(+)-maltos istället för D-glukos och TyrB-SMS istället för SMS. [aJÉO = -4,7° (c = 1,o195%-1g Aeon-D; F = 0,81 EXEMPEL 13: HOCH uoa ao H ca 2 I I 2 - (O) Pho-Cys-Pho-(D)Trp-Lys-Thr-Cyo-Thf-øl utgående från D-glukoheptos istället för D-glukos. (00%) = -1z,9° (c = 1,0 1 ssæ-ig AcoH);1== 0,91 EXEMPEL 14: I ß I HQ CHZ' R -(D)Phe-Cys - Phe-(Dïfrp-Lys -Thr-Cys -Thr- °| utgående från D(+)-glukos och SMS, som inte har någon skyddsgrupp på E-NHZ- gruppen i lysin.

(QJÉO = -42,4° (c = 0,37 i 95%-ig AcOI-D; F: 0,83 EXEMPEL 15: Ho 0 ou f' I R z Ho CH - R -(D)Phe-CyS-Phe-(DWrp-Lys °T|1I"CyS 'TÜP °| Ho 2 Ho utgående från glukoheptos och SMS, som inte har någon skyddsgrupp på :É-NHZ- gruppen i lysin. . . - | »- sis 630 ss (120- 93°( -o41'95%' A om-F-osu aD_-, c_,1 -igc ,., EXEMPEL 16: Fruktosyl-6-fosfat-SMS 9 rio-r -oc 2 OH on ° H0 f ' -ft . . 032- (o) Pn--cyz-Pna-(olrm-LvfThf-Cv* f ° oz 5 utgående från D-glukos-G-fosfat istället för D-glukos.

(QJÉO = -19,5° (c = 1,0 1 ases-ig Acom; F: o,s9 EXEMPEL 17: o OH \l CH l I 2- (Dl Phe-Cys-Phc-(Ol Trp-Lys -Thr-Cys-'fhr-øl OH OH utgående från D-ribos istället för D-glukos. lo (ag) = -31,s° (c = 1,o195%-1g Aeon) EXEMPEL 182 N a -Deoxifruktosyl-(D)Phe-Cys [ COC(CH 31 ll-Phe-(D)-Trp-Lys-Thr-Cys- l COC(CH32_3 l-Thr-ol a> Qsošizflflsasllfl12>2nesivs-fneæn'@;u§<§q@fnf;<ä§-:flf;°l 15 0,58 g av föreningen i Exempel l i 10 ml DMF blandas med 0,08 ml NEtB och sedan med 0,12 ml (BOC)2O. Blandningen omrörs i ca 15 timmar vid ~snnn :neon rumstemperatur, koncentreras under vakuum och agiteras med eter. Den utfällda produkten avfiltreras. Återstoden löses i en liten mängd MeOH, varefter produkten utíälls genom tillsats av H20. Produkten filtreras, tvättas med en 20 liten mängd H20, torkas och man får titelíöreningen. (u]2° = +14,5° (c = 0,71 DMF).

D b) E É-Ps°_>11;<9>_-líhsïCya-Eflsilåll aP;Li/äIäQCl-_T*1f;CJ§-Ih_f-_°L 0,51 g av slutföreningen i steg a) i en blandning av l0 ml dioxan och 2 ml NEt3/AcOH-buífert, pH 8,6, under argon blandas med totalt 0,4 g ditioerytritol. 25 Blandningen omrörs i ca 15 timmar vid rumstemperatur och koncentreras under sis eso 36 vakuum. Den utfällda produkten avcentrifugeras. Återstoden tvättas med en liten mängd H20 och vakuumtorkas sedan. Man får titelföreningen.

(QJÉO = +3,s° (e = o,s1DM1=). c) Na-Deoxifruktosyl-(D)Phe'-Cys [COC(CH3)3 ]-Phe-(D)Trp-Lys-(BOC)- 0,38 g av slutföreningen i steg b) löses under argon i 25 ml N-metylpyrro- lidon, blandas därefter vid 00 med 0,3 ml N-metylmorfolin och 0,31 ml pivaloyl- klorid och omrörs i ca 16 timmar vid 00. Produkten agiteras med eterldiiso- propyleter. Den utfällda produkten avcentrifugeras. Återstoden löses med en 10 liten mängd DMF, och produkten utfälls genom tillsats av MeOl-l och H20.

Produkten centrifugeras. Återstoden vakuumtorkas och används vidare utan ytterligare rening. <1) N°'-pesx1fru1 3 3 cys (coc(cH3)3 )-rhr-o1 15 _ Årsrsmdsn 1 steg s) löses v14 o° 1 5 m1 tFA/Hzo (9=1) seh omrörs 1 15 minuter. Produkten fälls ut genom tillsats av en blandning av eter/ 1096 5n I-lCl/eter. Produkten filtreras, tvättas med eter och torkas. Återstoden renas genom kromatografi på silikagel i en blandning av CHCIBIMeOI-I/ACOH/HZO.

Fraktioner som innehåller den önskade produkten slås samman, koncentreras 20 under vakuum under tillsats av H20 och lyofiliseras därefter. Man får titel- , föreningen. '="5 (QJÉO = -15,3° (c = 1,0 1 ssæ-ig Asom; F: 0,88 EXEMPEL 19: 2- ((mPhe-clfs-Phe-(Drrrp-Lys-Thr-ds-Thf-si J-z-dsoxi-D-glukss a BG... ._8 I! E 25 on s O! ao I 1 a (o)vns-cys-vns-(nxm-I-Yß-'rhr-CYI-*rhrfll- 2 g D(-)-fruktos och l g H-(D)Phe-Cšfs-Phe-(D)Trp-Lys(BOC)-Thr-C§s- Thr-ol (framställd som beskrivs i Exempel la) löses i 100 ml MeOH/HOAc 9/1 och hålls vid 65°C i 16 timmar. Efter koncentrering genom indunstning löses produkten i en liten mängd metanol, och râprodukten fälls ut med diiso- 518 630 : . 37 propyleter. Den sålunda erhållna råprodukten används vid skyddsgruppsavklyv- ningen (BOC-klyvning) utan att renas. l g av den erhållna råprodukten blandas med 20 ml trifluorättiksyra (l0096-ig) och hålls vid rumstemperatur, tills hela utgângsmaterialet löst sig (5 5 minuter). Genom tillsats av 200 ml diisopropyleter utfälls titelföreningen och avfiltreras därefter samt tvättas med diisopropyleter. Titelíöreningen renas genom kromatografi på silíkagel (elueringsmedel: CHCIBIMeOH/HOAC/HZO 7/ 3/0,5/ 0,5) och isoleras som ett vitt lyofilisat. (a)à° = -s,7° (c = o,31HoAc 9596); F: 0,73 10 Som andra produkt kan följande 1:1-blandning av isomerer med omvänd konfiguration vid CZ i kolhydratdeien erhållas: HO O \-oa___§ - H0 ( )Phe-C s-Phe-(Dfirp-Lys-Thr-C s-Thr-ol HO HO HO O H O (D) he-Cys-Phe-(mTrpfLys-Thr-Cys-Thr-ol 15 EXEMPEL 2G! 2- [Tyr3 -SMS ]-2-Deoxi-D-glukos HO »soon H "Q O (0)Phu-Cys-Ty:-(0)Trp-Lys-Th:-Cys-Th:-al Titelföreningen framställs analogt med Exempel 19 utgående från Tyr3- SMS istället för SMS. 20 (QJÉO = -2,9° (c = 1,o19s%-1g Acom; F: 0,95 EXEMPEL 21: Glukuronsyraamid av H-DPhe-Cšs-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cš/s-Thr-ol ° I É-(o) Pna-cys-Pne- ( o) 'rzp-Lys-rnz-cås-rnz-ol. -vaon vuunn 20 25 š1s eso 38 170 mg av glukuronsyraamiden av H-DPhe-Cvs-Phe-DTrp-Lys(BOC)-Thr- Üs-rnf-oi behandlas med 3 m1 rrifiunrärriksyra (iooes-ig), uns man får en fullständig lösning (5 minuter). Titelföreningen utfälls sedan som trifluoracetat genom tillsats av 20 ml diisopropyleter, och efter filtrering, torkning och efterföljande kromatografi på silikagel (elueringsmedel: CHCIBIMeOH/HOACI- H20 7/3/0,5/0,5) isoleras titelföreningen i ren form som ett vitt lyofilisat (acetat). [nJÉO = -z9,2° (c = 0,42 i HoAc 9596); F: 0,25 Utgångsprodukten kan framställas på följande sätt: En lösning av 135 mg DCCI i 2 ml DMF sätts till en till -30°C kyld lösning i DMF av 450 mg H-DPhe-Cvs-Phe-DTrp-Lys(BOC)-Thr-C§Is-Thr-ol, ll7 mg glukuronsyra och 135 mg HOBT. Efter 148 timmar, med samtidig tining till rumstemperatur, avfiltreras den resulterande dicyklohexylkarbamiden, och titel- föreningen utfälls genom tillsats av 20 ml diisopropyleter. Efter filtrering, torkning och kromatografi över silikagel (elueringsmedel: Cl-lzClzlMeOH 9/1) isoleras titelföreningen i ren form. ' (nJÉO = +1s,7° (c = o,so1DMF) EXEMPEL 22: Kininsyraamid av l-l-DPhe-Cyrfs-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cvs-Thr-ol R N n OH F l 9" ç'(Û)Pl'\Q-Cy$-phl-(Û)TID-Lyg-Thg-Cyg-Thç-q), il I Q Titelföreningen erhölls analogt med Exempel 21, utgående från L(-)- kininsyra. (00%) = -so° (c = o,u1+ 1 9596-13 Acom; F: o,97 EXEMPEL 23: Sialinsyraamid av H-DPhe-Cš/s-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cvs-Thr-ol OH H0 Ho 0" l 0 gflflflhe-Cg-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol ÅcwN H OH -svur sis san 39 Titelföreningen erhölls analogt med Exempel 21, utgående från sialin- syra.

(QJÉO = -so,s° (c = o,e19s%-1g AcoH);1== 0,95 EXEMPEL 24: 5 Na-(O- B-D-Glukosyloxiacetyl)-DPhe-Cvs-Phe-Dtrp-Lys-Thr-Cvs-Thr-ol i' kr n H ocu 1:/ OI I 2 I 1 u u MPI-ic-Cys-Phe-(O)Trp-Lys-fhr-Cys-ïhr-ol. y (ll 250 mg (tetra-O-acetyl-O-B-D-glukosyl)-oxiacetyl-DPhe-Cvs-Phe-DTrp- s-Thr-ol löses i 10 ml metanol och justeras till ett pH av 10 med nâgra droppar lN NaOCH3-lösning i metanol. Efter reaktion i 15 minuter 15, H*), och 10 jonbytaren avfiltreras. Filtratet koncentreras, och återstoden behandlas i 5 neutraliseras lösningen med en jonbytare (t.ex. Amberlys minuter med 3 ml trifluorättiksyra. Titelföreningen utfälls som trifluoracetat genom tillsats av 20 ml diisopropyleter och isoleras i ren form som ett vitt lyofilisat efter filtrering, torkning och kromatografi pâ silikagel (elueringsmedel: cHc13/MeoH/HoAc/H2o 7/3/0,5/o,5). 15 (QJÉO = -39,z° (c = o,eo 1 HoAc 95%);1== 0,91 Utgângsprodukten kan framställas på följande sätt: a) IafmQ-aßs21kQ-ßalkslußesxlßykdßxëebsfëxlssie: 2,5 g molekylsikt i! Å, pulver, sätts till en lösning av 830 mg glykolsyra- bensylester i 50 ml Cl-lzClz, och efter tillsats av 2,8 g silvertrifluormetan- 20 sulfonat tillsätts droppvis en lösning av 4,1 g acetobromglukos i 50 ml CHZCIZ.

Efter 15 minuter stoppas reaktionen med 4 ml pyridin, de fasta beståndsdelarna avfiltreras, och filtratet utskakas med l096-ig Nal-lSOq-lösning. Titelföreningen isoleras i ren form efter kromatografi över silikagel (elueringsmedel: CH2Cl2/- MeoH 99/1). 25 (nä) = -2z,a° (c = 1,7 i cHc13) b) Is?ßfiaßswæ-ßaltsllßeßzlfilvkdfze 800 mg tetra-O-acetyl-O-ß-D-glukosyl-glykolsyra-bensylester löses i #0 ml etanol/vatten 1/1 (vol./vol.) och blandas med 400 g palladium/aktivt kol 10%.

Hydrering på 'PARR-apparat" vid 50 PSI ger titelföreningen, som isoleras i 5 1 8 6 3 0 * 40 kristallin form efter filtrering och koncentrering under vakuum.

(QJÉO = -3s,s° (c = 1,03 1 MeoH) <=> 1:1É-lTsßa-Saasf:fl:Ckfitlà-slylæëyl-axiasstxlkêEhe- sisfrs-Q:fßa-zslßpslïhlaßiezhg-la 5 Till en lösning av 81 mg tetra-O-acetyl-O-B-D-glukosyl-glykolsyz-a, 225 mg l-l-DPhe-Cçfs-Phe-DTrp-Lys(BOC)-Thr-C§s-Thr-ol och 45 mg HOBT i 2 ml DMF, kyld till -30°C, sätts 45 mg DCCI, löst i l ml DMF. Efter 48 timmar och efter tining till rumstemperatur avfiltreras den resulterande dicyklohexyl- karbamiden, och titelföreningen utfälls frân filtratet genom tillsats av 20 ml 10 diisopropyleter.

Följande föreningar framställdes också analogt med Exempel 24 (i dessa betecknar SMS gruppen -DPhe-Cšfs-PhefDTrp-Lys-Thr-Cšfs-Thr-ol).

EXEMPEL 25: N°”-(o-ß-D-calakrosyl-oxiacery11-5Ms I nO-L-H 9 i. I 15 m. l-Q QCHLC- (D )Phe-Cy:-Phn-( 0 ) Trp-Lys-Thz-Cys-Thr-ol m H N H 44 gg ((11%) = -37,s° (c = 1 i esæ-ig Acom; F: 0,95 Exempel. 26: N°'-(o-ß-ceuobiosyl-oxiaceryn-sms R l| N--fl Ü--Ü o ___ 1 Ü u H M 0 OCHZC -(0Mihq-Cåg-Phc-(O)Trp-Lys-Thr-Cys- I :ll ll OI I' THE-OI.

H0 I R O “ H Oil n OI 20 [alåo = -32,s° (c = 1 i 9596-13 Acom; F: 0,91 lfluuø I »mot x n n. u.. u u n nu . - . .z f v | o ; o . a .u I n ' , ., p u . n v u . Kv v v I »n .m v. .u .-. nun.. u - . f a. n. . o . I V I ' n n u . nu nu I v. I I ~ ' 41 EXEMPEL 27: N a -(O- ß-(D)-Glukosyl-oxiisobutyryD-SMS R no--n en* '_ _ I H fO Oflš--CÅMPI-ae-Cys-Phl-(O)Trp-Lys-Thz-Cys-Thf-ql, Oil u QS 90 H n ON (nä) = -32,9° (c = 1 i 95%-1g Acom; F: 0,93 ExEMPEL zs: Na-(o-a-(D)-G1uk0sy1-u-(Lmxnsovaleryn-SMs “ -»=\f“= BO--H c" o a '-0 ' " F I °'fi 'C -Üflflhe-Cyg-Phc-(O)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol 90 H n ou (00%) = -a4,3° (c = 1 1 ssæ-ig Acox-n; F: 1,00 EXEMPEL 29: f N-Acetylmuramyl-(D)Phe1)-SMS Ho--H -o H OH OHH Ho H NHAc | I H -c-c-(oNßhe-cys-Pne-(o)T:p-Ly=-Th=-cy=-Th=-°1 3 “nu es (CLJÉO = 45,40 (C = 0,13 i 9596-ig ACOH); F: 0,9 H EXEMPEL 30: B-D-Glukosyl-tiokarbamoyl-SMS no f 1 ° :Lä-tor Pen-cv;-Pm-(ol'r«ø-Lv=°T'°f°Cv=°'""°°' OH I-O 518 630 §ïï*§Éï';°-._š = 42 620 mg E-Fmoc-SMS i 50 ml CHBCN/HZO 3:1 behandlas med 0,145 ml trietylamin. 272 mg 2,3ß,6-tetra-O-acetyl-B-D-glukosyl-isotiocyanat tillsätts, och blandningen hålls vid rumstemperatur i 1 timme. Blandningen indunstas i vakuum, och återstoden upptas i en liten mängd metanol samt behandlas med 5 diisopropyleter, varpå produkten faller ut i praktiskt taget ren form.

För avspjälkning av Fmoc-gruppen och acylgruppen behandlas produkten i 50 ml absolut metanol med en katalytisk kvalitet av IN NaOCl-IB i metanol.

Efter 30 minuter har reaktionen avslutats (enligt TLC), och blandningen neutraliseras med 196-ig ättiksyra samt indunstas i vakuum. Återstoden upptas i 10 vatten och extraheras med etylacetat. Vattenfasen lyofiliseras. Återstoden renas över silikagel och avmineraliseras över t.ex. Duolite. Man får titelföreningen som ett lyofilisat. (aJÉO = -us,5° (<1 = 1, esæ-ig Acom; F= 1 Utgångsmaterialet E-Fmoc-SMS kan framställas på följande sätt: 15 5 g SMS-acetat och 5 g NaI-ICO3 i 100 ml DMF/HZO 3:1 behandlas med 1,6 g Fmoc-HOSu. Efter l timme vid rumstemperatur späds blandningen med #00 ml H O och extraheras med 250 ml etylacetat/metanol 95:5. Den organiska fasen 2 torkas med Na2SO4 och koncentreras. Efter kolonnkromatografi över silikagel får man utgångsmaterialet som en amorf substans. -- 20 (QJÉO = za,3° (c =1,131DMF) Följande produkter kan erhållas analogt med det i Exempel 30 beskrivna sättet.

EXEMPEL 31: ' i "- cellobiosylziøkarbamyl-SMs 7": 25 Utgående från okta-acetyl-cellobiosyl-isotiocyanat » . . ' NO s ' - '; ° H n I I N-C-(OI PIn-Cys-Phc-(O)Trp-Lyrïhv-Cyvffififl i l I o HO » p: l OH (nä) = -1+,3°(c = 1 1AcoH);1== 0,87 EXEMPEL 32: B-D-Glukosylkarbamoyl-SMS 30 Utgående från 2,3,4,6-tetra-0-acetyl-B-D-glukosylisocyanat a ~ønn o 10 a coon musa 15 20 , t. u. n. a n n n.. n : .H. ': ' ' '° ' ' ' ' 'nu n o c ' " '°' .Å .vu: :no-u- I' nu n: 1: v '_ ' . _ , . , . 43 H0 u 9 I ' 0 34:49) 95.3”. pM-(nlïug-Lya-Thc-Cya-'lluv-ol 000 H0 Gl (dä) = 49,9 (c = 1 1 9596-11; Acow; F= 0,21 EXEMPEL 33: Cellobiosylkarbamoyl-SMS Utgående från okta-acetyl-cellobiosyl-isocyanat ((1120 - -37,9° (c = 1 i 95%-ig AcOH); F: D _ H0 N 9 f I tu -a *Wu-c-:ol vs--cys-nn.-tortvø-l-vß°f""°v" ' no 0 O o" 0" ou H0 ou ( 20 O . . a] - -37,9 (c = 1 i 95%-ig Acom; F: 0,85 D _ EXEMPEL 34: l-Deoxi-D-sorbityl-SMS 0" OH F l H°/\,/\/\/ (0) Phu-Cya-Phu-lblfrp-Lyrïhf-Cys-ïht-ol OH ou 0,5 mg av titelföreningen i Exempel 1 i 50 ml metanol behandlas först med NaBHLF stiger över 7. Total användning av NaBHI* är ca 10 ekvivalenter. och därefter S96-ig ättiksyra under sådana betingelser att pH inte Sedan fullständig reaktion ägt rum (4-5 timmar) behandlar man bland- ningen med ättiksyra för att förstöra överskott av NaBHu. Blandningen koncentreras under vakuum. Återstoden avmineraliseras med t.ex. Duolite och renas över silikagel. Huvudföreningen vid sidan av l-desoxi-D-mannityl-SMS är titelföreningen, som framställs som lyofilisat. (nä) = -17,s° (c = 1 1 sßes-ig Acom; F: 0,82 EXEMPEL 35: oz-D-GlukosyKl-làdeoxisorbityl-SMS Analogt med det i Exempel 30 beskrivna sättet framställs följande förening utgående från titelföreningen i Exempel 2 sis ezo 44 OH i I CH:- (DI Phu-Cya-Pho-(Dlfrp-Lys°ThPCy8°Tfif°°| "oil [aJÉO = +1,6° (c = 11AcoH);1==o,9 EXEMPEL 36: lJ-Dideoxi-sorbityl-SMS 0" F l 5 “o /¶\/\/ (O) Pho-Cys-Pho-(OlTrp-LyrThr-Cyt -Thf-Oi OH ou 0,55 g Boc-SMS i 30 ml dioxan/HZO 3:7 behandlas med 50 mg NaBl-IBCN. 250 mg 2-deoxi-D-glukos tillsätts. Blandningens pH justeras till 7 med 0,1 ml HCI och man upphettar till IOOOC i 6 timmar. Blandningen kyls, fryses och lyofiliseras. Återstoden upptas i etylacetat (50 ml) och skakas med vatten. Den 10 organiska fasen torkas och indunstas i vakuum. Boa-gruppen avspjälkas på konventionellt sätt med TFA. Produkten renas över silikagel och avmineraliseras t.ex. över Duolite, vilket ger titelíöreningen.

(QJÉO = zs,5° (c = 1 1 eses-ig HoAc» F 0,23 På analogt sätt kan föreningar i de föregående Exemplen 34 (utgående 15 från glukos) och 35 (utgående från maltos) framställas.

EXEMPEL 37: N a-Isokaproyl-desU-IÛ- fAlazNê -U-deoxifruktosyß-Lysl 1A 8 ]-lax-kalcitonin C113» /Cfls l C32 7 R n 18 | _ llïllíCfl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lya-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-fbr-TYC- Pm-Ai-g-tnf-Am-rhi--ciy-sei--ciy-rnr-Pm-NHZ - 01,000" msn: 10 15 20 25 30 35 sis eso 45 10,3 g N°”-1so| D(+)-glukos löses i en blandning av 94 ml DMF och 6 ml ättiksyra. Efter 2 timmar vid 50°C fälls produkten ut fullständigt genom tillsats av eter, filtreras därefter genom sugning, tvättas med eter samt vakuumtorkas. Rening utförs genom upplösning av ca 5-10 g av produkten i vatten, tillsats av lösningen till en omvänd-fas-kolonn 4 x 25 cm, C-IS på silikagel, och kromatografering med en gradient av vatten och 0-8096 av en lösningsmedelsblandning innehållande 38 delar vatten, 60 delar acetonitril och 2 delar 8596-ig fosforsyra. De fraktioner som innehåller den rena produkten slås samman, filtreras över en kolonn av ca 100 ml av en svagt basisk jonbytare i acetatform och tvättas med vatten.

Filtratet lysofiliseras, och man får titelföreningen som polyacetat, polyhydrat. («)å° = -3a,s° (c = o,731cH3cooH 9s%);1== 0,93 FAB-masspektroskopi 31407 (MH+) Den som utgångsprodukt använda föreningen Na-isokaproyl-Ser-Thr-Ala- Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr- Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NHZ kan framställas på följande sätt: a) Na-Isokaproyl-Ser(But)-Thr(But)-Ala-Val-Leu-OCH2-fenyl-(p)OCH2- s<>_--_di_vi_flxlää=ffn>_ 1 g p-hydroximetyl-fenoximetyl-co(polystyren-196-diviny1bensen) får stå och svälla i dimetylformamid/metylenklorid 1:4 (vol./vol.), avfiltreras genom sugning och blandas med en lösning av 0,74 g Fmoc-leucin och 0,19 g l- hydroxibensotriazol i 5 ml av den ovannämnda lösningsmedelsblandningen. 0,l+3 g dicyklohexylkarbodiimid och 85 mg lß-dimetylaminopyridin, vardera i 5 ml av samma lösningsmedelsblandning, tillsätts under omrörning. Blandningen omrörs i 16 timmar vid 200, avfiltreras genom sugning och tvättas med lösningsmedels- blandningen och sedan med dimetylformamid. Man får Fmoc-Leu-OCHZ-fenyl- (p)-ocH2 Nu-Fmoc-gruppen avspjälkas frân Fmoc-Leu-OCH2-fenyl-(p)OCH2-co- -co-(polystyren-l96-divinylbensen). (polystyren-196-divinylbensen) (1,56 g motsvarande 0,7 mmol) genom behandling med piperidin (2096 vol./vol.) i DMF i 10 minuter. Detta tvättas väl med DMF, och därefter tillsätts 0,71 g Fmoc-Vai-OH, 0,28 g 1-hydroxibensotriazol och 0,32 ml diisopropylkarbodiimid, vardera löst i 5 ml DMF. Efter 45 minuter filtreras blandningen genom sugning, och peptidhartset tvättas väl med DMF. Avspjälk- ningen av Na-Fmoc-gruppen upprepas, liksom kopplingen med den i sekvens följande aminosyran, i den angivna ordningen: Fmoc-Ala-OH (0,65 g), Fmoc- Thr(But)-OH (0,83 g) och Fmoc-Ser(But)-OH (0,80 g). I den senare reaktionscykeln (avspjälkning av Fmoc-skyddsgruppen, acylering med skyddad aminosyra) ersätts aminosyraderivatet med isokapronsyra (0,l+l g), mängden 1-hydroxibensotriazol »1116 10 15 20 25 30 . n ~ - n . n. v.. o v 6 o U uu- u oo nu. u I f ° :_'_._., , , n, ... u. .u .-: C . . O ' ' ^ " " ' ' 6 | .s n 6 | . f u .- - 6. 46 ökas till 0,53 g och mängden diisopropylkarbodiimid till 0,54 g, och koppling utförs i l5 timmar. Det skyddade peptidhartset tvättas väl med DMF och metylenklorid, vakuumtorkas vid 40°C i 15 timmar, och det skyddade peptid- hartset erhålls som ett färglöst pulver. b) klf-lsekfiafevl-êqihcêlë-l/fiyel-sirfàä Na-Isokaproyl-Ser(But)-Thr(BuÜ-Ala-Val-Leu-OCH2-fenyl-(p)OCH2-co- (polystyren-l96-divinylbensen) (1,0 g) omrörs i en blandning av trifluorättiksyra (5 ml) och metylenklorid (5 ml). Produkten filtreras, tvättas med samma blandning (5 ml), därefter med metylenklorid, koncentreras höggradigt under vakuum och utfälls totalt genom tillsats av eter. Fällningen tvättas väl med eter, torkas under vakuum över fast kaliumhydroxid, och titelföreningen erhålls som ett färglöst, amorft pulver.

C) k* _°f-lS9*@af9v_1-§faf-_Tbt/ïlë-l/alès1r911èxSlB99;Ls1a:âe:-§bfl~r <_0_*?>2tl-L°_U;H_if:1=y:<§<>_°>_-E=y:Glflihï-Ixfšïa-ê fs-IbL-ëæ-Ihf; Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NHZ Till en lösning av Na-isokaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-OH (0,l65 g) i DMF (7 ml) sätts H-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OBut)-Leu-His-Lys(Boc)-Leu-Gln- Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NHz-hydroklorid (O,59 g), 3ß-dihydro-B-hydroxi-li-oxo-1,2,3-bensotriazin (0,0l7 g), dicyklohexylkarbodiimid (0,065 g) och tillräckligt med N-etyl-N,N-diisopropylamin för att ett prov av reaktionsblandningen på. fuktat pH-papper skall indikera en reaktion av ca pH 6.

Efter 16 timmar utfälls blandningen genom tillsats av eter, torkas, och man får titelföreningen. d> uï-isgiaafgyi-sqflteala-yæehswslzixeaeu-ëqeßiftslg-.L:Uffe Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 ____.___.__.___._..____._._.__._._______._.______.__..__._.___. 0,50 g av den delvis skyddade peptiden i steg c) löses i en blandning av trifluorättiksyra (5096 vol./vol.) och metylenklorid. Efter l timme tillsätts 50 ml eter som innehåller 0,6 mmol HCl. Blandningen filtreras, tvättas med eter och vakuumtorkas. Produkten renas genom "omvänd-fas"-kromatografi i en gradient av acetonitril i HBPOu (296). De sammanslagna fraktioner som innehåller den rena substansen filtreras över en basisk jonbytare i acetatform. Filtratet lyofiliseras, och man får titelföreningen som polyacetat, polyhydrat.

(QJÉO = -3z,2° (c = 0,3 1 Aeon 9s%);1== o,s7 »man s - g n I .n nu u n | . .s . n o u in n q _ o I' s l n I I I ' *°° ' ' :n :av n: .n s-n «un|n n u w . . f: s: u 0 f a I I: u s | . |. n n n fl I H 47 EXEMPEL 38: Na -Isokaproyl-des-( 1 4)- (Ala7, Ne-(a-D-glukosyHl-IIJ-deoxifruktosyß- Lysl LmJ-iax-kaicironin .tak /cuj - c å!! H R 2 7 lu. ia CHZ-CO-Sc r-Thr-Ala-Va l-l.eu-Gly-Lys-Leu-Sar-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln..

| R THf-Trf-Pn-Ai-q-m--Asn-rm-.ciy-su--ciy-rni--Pzámuz . czäcoou Motsvarande di-Ng-maltulosyl-derivat framställs analogt med Exempel 37 med användning av D(+)-maltos-monohydrat istället för D(+)-glukos. Reak- tionstiden vid 50°C förlängs till 15 timmar. Isolering och rening är identiskt lika, och man får titelföreningen som polyacetat, polyhydrat; FAB-masspektroskopi: io 373o,9 (Mif). (aJZO = -15,z° (c = o,1e19s%-1g Acom; F: 0,97 D Analogt med Exempel 37 framställs följande föreningar: EXEMPEL 39: Na -Isokaproyl- (Nä -(l-deoxiíruktosyl)-Lys7 ]-lax-kalcitonin-(5-32)amid 10 1 5 CHZ-CO-Ser-Thr-Lys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lya-Leu-Gln- 32 ïhr-ïyr-Pto-Arq-Thr-Asn-ïhr-Gly-Sor-Gly-Thr-Pro-Mlz . 3 0130001 (QJÉO = -uø,o° (c = o,271AcoH 9596); F: 0,31; EXEMPEL ll-O: 8 U-N , Lysl s-N &-tris-( l -deoxifruk tosyD-lax-kalcitonin Na,Lys 1 v nu u PCI 1 I ål fl'l 5 I Il ' | ; I go , n n o I» c n ' " "' 'V2 '. ' ikh-å 2.' :'~'.".°2 . --- n n n « n n n .a I - H I 48 N .

R : u 0 "1- f ||0 I | iRlf R-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val -Leu-Gly-Lya-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-flis-Lys-Leu- ' 32 Gln-Thr-ïyr-Pro-Arg-Thr-Am-Thr-Gly-Ser-GIy-Thr-Poo-Miz (CJZDO = -5,3° (c = 0,38 1 AcoH 9596); F: 0,75 EXEMPEL 41: Na-Isokaproy1-des(1-4)- [N841-deoxifruktosyU-Lys7' 1 LIS ]-lax-kalcitonin- (5-32)-amid ca, ca, “c( ' n E" 'I cl | I, C"240-5".ïhr-Lys-Val-Leu-Gly-Lys-Lcu-Seššßln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln- Thr-Tyr- Pro-Arg-ïhr-Asn-ïhr-Gly-Scr-Gly-Thr-Pro-Nilz 3 NI 10 R = K no á IW C| - no ' 20 o . . _ _ (UD = 47,4 (c = 0,155 1 esæ-lg AcoH), F _ 0,34 EXEMPEL 42: a N” -Kincyl- (A1a7)-lax-kaucironin-ø-azyamid u 5 7 ' CO-Snr-ïhr-Ala-Val-Leu-cLy-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Lcu-Nta-Lya-Lw-Glfl- "° :z 15 n.f-ryr-vt-.Mfg-mf-Am-rhl-.cxy-su--cxy-rnf-Pm-uuz - 3 059m' Titelföreningen framställdes analogt med Exempel 21.

(QJÉO = -35,7° (c = o,371AcoH 95%);1== 0,38 EXEMPEL 4-32 N a-Kinoyl- ( A1a7) -lax-kalcitonin-(lß-32)-amid sis san 49 d 0 hg OH 4 7 u CU-Leu-Ser-fhr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln- . 32 T""TY"'P=°-^rq-rni--Am-rhi--ciy-sai-.ciyanu--Pi-a uu . J ca cow 2 3 Titelföreningen framställdes analogt med Exempel 21. (aJÉO = -39,3° (c = o,z919s%-1g Acom; 1== 0,39 5 De för Exemplen 42 och #3 erforderliga utgângspeptiderna (Alan-lax- ka1cnon1n-(5-32)-amid och (A1a7)-iax-ka1c11:on1n-(u-32)-am1d kan framställas analogt med utgângmaterialet i Exempel 37.

EXEMPEL IW: (N-Deoxi-f ruktosyl-Cysl J-oxytocin ". . 0 an . n I OC i I 10 I 0 CHZ-Cya-Tyc-Ilc-Gln-Asn-Cys-Prfl-LIU-Gl-Y-Wz OI Ü 0,5 g D(+)-glukos och 0,5 g oxytocin löses i 50 ml MeOH/HOAc 9/l och hålls vid 65°C i 3 timmar. Lösningen koncentreras sedan genom indunstning, kromatograferas över silikagel och befrias från salt över Duolite (HzO/etanoll- HOAc-gradient). Man får ett vitt lyofilisat. 15 (nä) = -23° (c = 0,32 1 esæ-ig HoAd; F; 0,95 EXEMPEL 45: BO Ac-(D)-Phe(li-Cl)-(D)Phe(lß-CD-(Dflrp-Ser-Tyr-(D)Lys(Na- C! Arg-Pro-(Dflåla-NHZ 60 mg Ac-(D)Phe(#-C1)-(D)Phe(4-Cl)-(D)Trp-Ser-Tyr-(Dlys-Leu-Arg- 20 Pro-(D)Ala-NH2 och 72 mg D(+)glukos löses i en blandning av 10 ml MeOH och l ml AcOH och omrörs i ca 20 timmar vid 60°C. Produkten fälls ut med eter och avcentrifugeras. Återstoden löses i ca l00 ml H20, och pH justeras till 8 med utspädd NaOH. Produkten adsorberas på en kolonn av Duolite ES 861 och elueras med en gradient av H20 -> dioxan-HzO-AcOl-I (60:L|-0:3). Fraktioner som 25 innehåller den önskade produkten koncentreras under vakuum, varefter de ' 510 630 50 lyofiliseras. Man får titelföreningen. (0120 = -z5° (c = 0,5 i ssse-ig Acom; F: 0,33 D EXEMPEL 46: N aAllN am, N ¿B29-tris( 1-deoxifruktosyD-gris-insulin 5 En suspension av 1 g (0,l7 mmol) grisinsulin och 0,47 g (2,6 mmol) glukos i 10 ml dimetylformamid/ättiksyra 9:1 omrörs i 1 timme vid 60°C. Lösningsmed- let avlägsnas vid 30°C i högvakuum. Återstoden löses i 300 ml H20, justeras till pH 7 och blandningen får passera genom en liten avmineraliseringskolonn (Duolite ES 861, 2,5 x 15 cm). Glukosen elueras med vatten och peptiden med isopropa- 10 nol/vatten/etylacetat 59:39:2. Lösningsmedlet avlägsnas, och blandningen lyofili- seras. Återstoden upptas i 300 ml vatten och renas genom kromatografi med omvänd fas. (2 x 25 cm kolonn, RP 18, 10 nm, buffert 57 mmol NaClOa, 8,4 mmol fosforsyra, pH 3 med liN NaOH, gradient 0-6596 A-B. 15 Buffert A buffert pH B/acetonitril 9:1 Buffert B buffert pH 3/acetonitril 0:6).

De fraktioner som innehåller titelföreningen uppsamlas, slås samman, 20 mmol trietylamin, koncentreras, späds med 300 ml vatten och får passera genom en avmineralise- ringskolonn såsom beskrivits ovan. Salter elueras med vatten. Peptiden elueras 20 med isopropanol/vatten/etylacetat 59z39z2. Lämpliga fraktioner slås samman och koncentreras, vilket ger titelföreningen. - (aJÉO = 5s,3° (c = 0,51 AcoH);1= = 0,28 -w-š EXEMPEL 07: I i ' 'E N a,Lys I z-Na ,l.ys21-N¿-tris-(l-deoxifruktosyD-(D) [Alaz ]-hpGRF-( l-29)-NH2 1 2 ®12 25 ®ïy r-O-Ala-Asp-Ala-l 1e-Pha-ïhr-Aan-Sor.ïy,_._¿r94_ls-Vol -Lou-Gly-G tl-“Lou-Sqp- Ala-Arg-Láa-Leu-Lcu-Gln-Asp-Ilc-lht-Scr-Aåimz . Cußcgq-g ®= ' Pâ analogt sätt med Exempel 37 framställer man titelföreningen utgående från (D)(A1a2]hpGR1=. 30 [QJÉO = -5,e° (c = 0,2 i 9596-11; AcoH);1== 0,82 . . . . .- sfs san 51 EXEMPEL 48: N a ,N8-bis(1-deoxiíruktosyULys-vasopressin Q OH R I ÜÜÜ OH R R-Cys-Tyr-Phc-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-Nflz m] En suspension av 118 mg (0,1 mmol) Lyss-vasopressin och 360 mg (2 mmol) glukos i 5 ml metanol/etylacetat 9:1 omrörs vid 650 i 2 till 4 timmar.

Lösningsmedlet avlägsnas under vakuum. Återstoden upptas i 30 ml vatten, och lösningen lyofiliseras. För att avlägsna överskottet glukos adsorberas peptiden (lösning i 40 ml vatten vid pH 7,3) på en Duolite-kolonn (1,5 x 10 cm). Glukosen elueras med vatten och peptiden med en blandning av isopropyl/vatten/etylacetat 59:39:2. Blandningen renas pâ en silikagelkolonn (elueringsmedel kloroform/meta- nol/etylacetat/ vatten 7:4: 1: 1).

De fraktioner som innehåller titelföreningen koncentreras och lyofili- seras, vilket ger titelföreningen. (ajâo = -sz° (c = 0,51 esee-ig HoAc);1== 0,84 EXEMPEL #9: I ü 00! u v40 I u n c' Ac-(D)Phe acetat Titelföreningen framställs analogt med Exempel 45 utgående från Ac- (D)Phe(pCl)-(D)Phe(pCl)-(D)Trp-Ser-I..ys-(D)Phe-Leu-Arg-Pro(D)Ala-NHz-acetat och D(+)glukos. (aJÉO = -3s° (c = 0,51 ases-ig AcoH);1== 0,86 EXEMPEL 50: I O! u üOI o. n (DWNÜICU-(OlfiwdpßlJ-(D)Trp-SorJyr-(NFho-Lw-Arg-Prø- (mAu-mz- acem ' OI 513 63 Û Ål' :rf -É : 52 Titelföreningen framställs analogt med Exempel 45 utgående från H- (D)Phe(pCl)-(D)Phe(pCi)-(D)Trp-Ser-Tyr-(D)Phe-Leu-Arg-Pro-(D)Ala-NHz-acetat och D(+)glukos. (aJÉÛ = -3z° (c = o,51 eses-ig AcoH);1== 0,94 5 EXEMPEL 51: ®-(0)Phe(pC1)-(0)Pho(pC1Fflfiïrp-Sor-Tyr-(Olæ-Lou-Ai-gæm-(n)gg._mz 200 mg H-(D)Phe(pCl)-(D)Phe(pCl)-(D)Trp-Ser-Tyr-(D)Lys-Leu-Arg-Pro- (D)Ala-NH2 och 520 mg D(+)glukos i DMF/AcOI-I 15:l omrörs vid 60°C i 3 10 timmar. Blandningen koncentreras i vakuum, fälls med eter, filtreras och torkas. Återstoden renas på följande sätt: 1) Adsorption på Duolite ES 861 och eluering med en blandning av dioxan- HzO-AcOl-l. 2) Kolonnkromatografi på silikagel med användning av CHCIB/ACOH/HZO 15 som elueringsmedel. 3) Preparativ HPLC ("omvänd fas"-kromatografi) på en oktadecyl-silikagel- kolonn. Eluering med en acetonitrilgradient i 2%-ig H3POq.

Fraktioner som innehåller titelföreningen slås samman, filtreras genom en kolonn innehållande en svagt basisk jonbytare i acetatform, koncentreras och 20 lyofiliseras, vilket ger titelföreningen. (uJÉO = -22,e° (c = 0,51 sses-ig Acom; F: 0,63 Syntesen enligt uppfinningen kan utföras på följande sätt: EXEMPEL S1 F ramställning av oktreotid (=SMS) 25 l) Framställning av acetalförankring (N-CF3CO-treoninolacetal av 2-_f.<>_ffm'_1f_'~=-=1°¿<1ëf_fi1__ 105 g (1,0 mmol) L-treoninol sätts till 200 ml metanol, som omrörs med en kvävgasström. Man får en klar lösning. En lösning av 200 ml trifluor- ättiksyrametylester i 250 ml metanol sätts till blandningen vid 00. Blandningen 30 hålls vid en temperatur av ca l0°C genom kylning med ett isbad.

Efter 1,5 timmar kan ingen mer fri treoninol påvisas i blandningen. 10 15 20 25 30 35 sis 650 53 Koncentrering vid 40°C ger en vit kristallin återstod. Återstoden löses i 200 ml etylacetat vid 70°C och fälls genom tillsats av hexan. Blandningen kyls till OOC, tvättas med hexan och torkas vid rums- temperatur. Man får N-trifluoracetyltreoninol. 50,3 g (0,25 mol) av den resulterande produkten löses i 1,25 liter tetra- hydrofuran, och 75 ml trimetylklorsilan tillsätts droppvis. Omedelbart därefter tillsätts en blandning av 70 ml trietylamin och 250 ml tetrahydrofuran. Man får en vit suspension som omrörs i 4 timmar. Blandningen filtreras, och filtratet indunstas vid 40°C till en olja.

Oljan löses i 1,5 liter metylenklorid och behandlas med portioner av 90,4 g p-formylfenoxiättiksyra vid rumstemperatur. Portioner om 9 ml trifluor- metan-sulfonsyratrimetylsilylester tillsätts. Blandningen omrörs i 24 timmar vid rumstemperatur, filtreras sedan och återstoden tvättas väl med metylenklorid.

Filtratet koncentreras vid 40°C till en orangeröd hartsartad produkt.

Denna produkt kromatograferas över silikagel. Eluering sker med etylacetat. Vid koncentrering av de relevanta fraktionerna fâr man titelföreningen med en renhet av 97% (HPLC). 2) yePètssfsá evflsfisßxdšëfls ekïêpspliëw- 17,2 g aminometylerad polystyren (märke Dow, 0,7 viktprocent N motsvarande 0,5 mmol aminometylgrupper per g harts) suspenderas i 80 ml metylenklorid/DMF 4:1. I tur och ordning tillsätts 4,17 g av slutprodukten i steg 1, l,6g HOBT och 4,0g DCCI. Sedan blandningen omrörts i 2 timmar vid rumstemperatur är Kaiser-test negativt. Blandningen filtreras och tvättas.

Det tvättade hartset suspenderas i 100 ml tetrahydrofuran och metanol 3:1 och behandlas med portioner av 10,4 g natriumborhydrid. Blandningen omrörs i 6 timmar vid rumstemperatur, filtreras och hartset tvättas. Hartset suspen- deras i metylenklorid/DMF 4:1. 5,5 g Fmoc-Cys(S-t-Bu)OH, 1,74g HOBT och 3,6g DCCI tillsätts. Fmoc-skyddsgruppen avspjälkas med piperidin (2 x 20 minuters kontakttid).

På analogt sätt kopplas i successiva cykler följande N-Fmoc-skyddade aminosyror med användning av HOBT/DCCI-ThrOl-l; Lys(BOC)-OH; D-TrpOH, Phe-OH, Cys(S-t-Bu)OH och D-Phe-OH, vilket ger det Fmoc-skyddade okta- peptidhartset. Slutlig laddning 0,26 mmol/g. 3) Qåkifliisftæfi evsviälkßiiia Det resulterande hartset suspenderas i 100 ml trifluoretanol/metylen- klorid 1:1 och behandlas med 50 ml tributylfosfin. Blandningen omrörs i 70 timmar vid rumstemperatur. Blandningen filtreras, tvättas och behandlas med 100 ml 1:1-blandning av tetrahydrofuran och 1N aminoacetatlösning. 1,1 ml 10 15 20 25 30 35 's1à eso 54 30%-ig vattenlösning av väteperoxid tillsätts. Blandningen omrörs i 24 timmar vid rumstemperatur. Hartset tvättas. Blandningen behandlas med 20 ml trifluor- ättiksyra, 80 ml metylenklorid, 10 ml vatten och 2 ml tioanisol. Blandningen omrörs i 2 timmar, varefter den filtreras och tvättas med trifluorättiksyra och metylenklorid. 200 ml dietyleter sätts till filtratet. Den resulterande fällningen avfiltreras. Återstoden löses i vattenhaltig buffert och avmineraliseras, t.ex. med användning av Duolite. Lösningen frystorkas som acetat, vilket ger titelföreningen som acetatet.

Alla de ovan angivna exemplen, t.ex. föreningarna i Exemplen l och 2, kan framställas på analogt sätt.

EXEMPEL S2 Framställning av N a-[<1-glukosyl(l-IIJ-deoxifruktosyl) ]-SMS (se Exempel 2) 393 g av den till hartset bundna oktapeptiden framställs enligt det ovan angivna Exemplet Sl. Cysteinskyddsgrupperna avlägsnas reduktivt. Peptid- bindningen till hartset oxideras till den cykliska oktapeptiden medelst väte- peroxid i en blandning av tetrahydrofuran/vatten.

Efter tvättning i tetrahydrofuran och därefter DMF skakas peptidhartset i 3600 ml av en blandning av DMF/ACOH (8:1). Suspensionen behandlas med 526 g D(+)maltos-monohydrat. Blandningen värms till 600 och omrörs i 18 timmar vid denna temperatur.

Blandningen kyls, och peptidhartset avfiltreras och tvättas i tur och ordning med DMF och metanol. Därefter tvättas det med metylenklorid.

Peptiden spjälkas sedan under 1 timme från hartset med en blandning av 2900 ml metylenklorid och 716 ml trifluorättiksyra med spâr av vatten.

Filtratet omrörs därefter och behandlas med portioner av 597 g natrium- karbonat, omrörs i 30 minuter och filtreras. Återstoden tvättas med metylen- klorid och metanol.

Filtratet koncentreras till torrhet.

Det avmineraliseras med användning av en ofunktionaliserad polystyren- kolonn som Duolite eller omvänd-fas-HPLC-material såsom silikagel behandlat med silikon och uppbärande lângkedjiga fettalkoholgrupper (t.ex. Labomatic, Schweiz, märket HB-SIL-låš-ZO-IOO). Man får den rena titelföreningen.

Föreningarna enligt uppfinningen uppvisar farmakologisk aktivitet och är därför indicerade för användning som läkemedel för terapi.

Aktiviteten för föreningarna enligt uppfinningen kan observeras vid farmaceutiska och biofarmaceutiska standardtester. Föreningarna är i allmänhet minst lika kraftiga som den omodifierade peptiden (dvs. motsvarande sockerfria peptid) vid administrering genom injektion eller oralt. I allmänhet absorberas de 55 bättre och är lättlösligare i vatten samt har längre verkningsvaraktighet.

Föreningarna enligt uppfinningen är därför indicerade för användning vid samma indikationer som för de omodifierade peptiderna.

Föreningarna enligt uppfinningen kan jämföras med de omodifierade 5 peptiderna vid biotillgänglighetsstandardtester.

Föreningarna enligt uppfinningen kan t.ex. påvisas i blodplasma under en längre period efter administrering än de omodifierade peptiderna, såsom visas vid biotillgänglighetsstandardförsök.

Föreningarna enligt uppfinningen och den omodifierade peptiden kan 10 administreras till exempelvis hundar i en enkeldos som är tillräcklig för att ge en terapeutisk effekt genom oral eller intravenös administrering.

Använda doser är sådana som tillåter peptiden eller en metabolit därav att påvisas i blodet. Påvisande kan ske på konventionellt sätt, t.ex. genom radioimmunoassay. 15 Vid det ovannämnda testet har det exempelvis bestämts att föreningen enligt Exempel 2 vid oral administrering gav en tio gånger högre blod- koncentration än oktreotid.

Den absoluta biotillgängligheten för oralt och intravenöst administrerad förening enligt Exempel 2, mätt på basis av ytan under kurvan, AUC (area under 20 the curve), är fem gånger högre än för oktreotid. Elimineringshalveringstiden vid intravenös administrering är ca 2,3 timmar jämfört med ca 0,5 timme för ° É ' oktreotid.

Dessutom elimineras föreningarna enligt uppfinningen fördelaktigt i 32,5 större utsträckning genom njurarna. Detta kan observeras vid standardtester. r., . 25 Hanråttor (225-375 g) som fått fasta administreras oralt med vatten (50 I ml/kg). Efter 30 minuter anestetiseras djuren med t.ex. Inactin (100 mg/kg i.p.).

Gallgången och urinblåsan kanyleras. Bägge V. jugularis friläggs. I en ven administreras en infusion av glukos 5% med etanol 1% (5 ml/h) för stimulering av diures. Den andra venen används för uttagning av blodprov (0,5 ml) varje timme i -' 30 under 4 timmar.

Föreningen enligt uppfinningen och den omodifierade peptiden administ- reras s.c. i en dos från ca 10 till ca 1000 mikrogram/kg. Koncentrationen av föreningen bestäms på konventionellt sätt, t.ex. med RIA.

Vid det ovan angivna testet har exempelvis följande resultat erhållits 35 med föreningen enligt Exempel 2 och oktreotid i en dos av 10 mikrogram/kg: Procent eliminerat genom Galla Urin Förening enligt Exempel 2 1,6 36 Oktreotid 22 19 , | | ~ | o » u I I < I v! 518 630 56 Medan oktreotid elimineras i både gallan och urinen, elimineras före- ningen enligt Exempel 2 övervägande i urinen.

Förbättrad absorption vid oral administrering kan påvisas för före- ningarna enligt uppfinningen på följande sätt: 5 Föreningen enligt uppfinningen och den omodifierade analogen administ- reras oralt till OFA-râttor (t.ex. l0 mg/kg). Efter bestämda tidsperioder, t.ex. 15, 30 och 60 minuter, uppsamlas blodprov. Dessa analyseras med avseende på sin läkemedelshalt, t.ex. med RIA.

Det har exempelvis bestämts vid detta test att föreningen enligt l0 Exempel 44 i en dos av l0 mg/kg uppvisar 50 till 10096 högre absorption än den omodifierade peptiden, oxytocin. Resultaten är som följer: Tabell: Råttplasmanivåer efter oral administrering.

Resultat givna i ng/ml 15 min. 30 min. 60 min. 15 oxytocin 7,53 3,60 2,55 förening enligt Exempel 4!! 11,79 6,98 3,98 De farmakologiska aktiviteterna för föreningarna enligt uppfinningen kan undersökas vid farmakologiska standardtester, t.ex. efter injektion, och om så önskas jämföras med dem för de omodifierade peptiderna, t.ex. uttryckta som 20 styrka och verkningsvaraktighet. i Exempelvis kan man utföra farmakologiska tester för att undersöka effekterna av föreningarna enligt uppfinningen på hormoner i djur. Således kan de föreningar som hämmar sekretionen av hormoner testas genom mätning av .;..§ sänkningen av hormonets blodnivåer. 25 Föreningar enligt uppfinningen som hämmar sekretion av GH (tillväxt- hormon), speciellt föreningarna med formeln VIII, och mer speciellt föreningar med formeln VIIIa till f, och reducerar GH-koncentrationerna i blodet, kan testas ån; på följande sätt: Rhesus-apor (minst 5 apor), som fått fasta, i primatstolar får föreningen 30 enligt uppfinningen i en bananbit som vehikel. Föreningarna administreras i en dos från ca 0,1 mg/kg till ca IO mg/kg p.o.

Blod tas från V. saphena via en kateter. GH-koncentrationen i blodet mäts med RIA (radioimmunoassay).

Vid detta test med rhesus-apor har det exempelvis bestämts att före- 35 ningen enligt Exempel 2 i en dos av O,I mg/kg sänkte GH-sekretionen med minst 5096 under längre än 10 timmar jämfört med en sänkningseffekt med 5 timmars varaktighet med den oförändrade peptiden, oktreotid. menu- l0 15 20 25 30 35 - - | . nu v u. ... . , . s u u.. . . . » f s v v .u . u - l IQ I I I I I I 0 F' Ü Ü Ü . n n: », .u un; »nr-va u n i . . t. n» o ~ . u v I I I I I n II IC I :I Ü Ü .I u 57 Ett ytterligare test är som följer: Hanrâttor halshuggs och blod uppsamlas i l timme efter administrering av den GH-sekretionshämmande föreningen i olika doser med logaritmiska intervall. GH-nivân i serumet bestäms med hjälp av RIA. Vid detta test är dessa föreningar enligt uppfinningen aktiva i doser från ca 0,02 till ca 30 mikrogram/kg s.c.

Vid detta test har det exempelvis bestämts att föreningarna i Exemplen 1, 2, 2l och 2G har ett IDSO av 0,0l+5, 0,190, 0,3 resp. 0,2 mikrogram/kg s.c. jämfört med ID 50 för naturligt somatostatin vid samma test på 93 mikrogram/kg s.c. (ID 50 anger den mängd förening som krävs för att sänka GH-halten med 5096 jämfört med den för obehandlade kontrolldjur).

Till skillnad från naturligt somatostatin är de GI-I-sekretionshämmande föreningarna enligt uppfinningen ytterst aktiva vid detta test under en lång tidsperiod (t.ex. 6 timmar).

Den GH-reducerande aktiviteten för dessa föreningar observeras även efter oral tillförsel till hanrâttor med östradiolimplantat. Vid detta test är det relativt små variationer i GH-nivån. Testet utförs på följande sätt: En slinga (längd 50 mm, 2) 3 mm), av silastik med 50 mg östradiol implanteras under eteranestesi under rygghuden hos hanrâttor, som har en vikt av ca 300 g. Vid olika tidpunkter (1 till 6 månader senare) används dessa djur upprepade gånger för tester. Testsubstansen administreras antingen s.c. eller oralt.

Direkt före liksom vid olika tidpunkter efter administrering av substan- sen uttas ca 0,8 ml blod från retroorbitalplexus. Det centrifugeras, och GH-nivân i serumet bestäms med RIA.

Föreningarna enligt uppfinningen är efter oral administrering aktivare än motsvarande omodifierade peptider, till och med efter flera timmar. ID 50 för var och en av föreningarna enligt Exemplen l och 2 är efter 2 timmar ca 17 till 40 gånger lägre än för den omodifierade peptiden, oktreotid. Ytterligare resultat är som följer: Förening enligt exempel ID 50 p.o. mikrogram/kg 21 500 24 25 Oktreotid 11.100 Dessa föreningar enligt uppfinningen är därför indicerade för indika- tioner, där en hämning av GH-sekretion är önskvärd. Indikationer innefattar diabetes mellitus, förebyggande och behandling av angiopati och proliferativ retinopati samt akromegali. , f 518 630 :zzï-.IÉ 58 De GH-sekretionshämmande föreningarna enligt uppfinningen hämmar även pankreassekretion.

Denna hämning kan påvisas vid tester på djur.

Den metod som beskrivs i Scand. J. Gastroint. _6_, 423 (1975) av SJ. 5 Konturek et al kan användas.

De GI-l-sekretionshämmande föreningarna enligt uppfinningen hämmar även magsyrasekretion och ökar pH-värdet på magsafterna till högre pH-enheter.

Aktiviteten för dessa föreningar observeras vid t.ex. följande test: GH-sekretionshämmande föreningar enligt uppfinningen administreras till l0 råttor, som fått fasta, med fistel implanterad i deras magsäck i doser från ca 0,05 mg/kg till ca 5 mg/kg genom magsond. Efter l timme öppnas fisteln.

Magsaften uppsamlas i perioder om 30 minuter. De uppsamlade volymerna registreras, och syrakoncentrationen bestäms.

Vid det ovannämnda testet ökade föreningen i Exempel 2 pH till 6-8 i 3,5 15 timmar. Oktreotid ökade pH-enheterna till 6-7 i endast 2 timmar. Föreningen i Exempel 2 är minst 60 gånger aktivare än cimetidin i detta testsystem.

De Gl-I-sekretionshämmande föreningarna enligt uppfinningen, speciellt föreningarna med formeln VIII, är därför indicerade för användning vid behandling av gastrointestinala rubbningar, t.ex. vid behandling av magsår, 20 gastrointestinal blödning, akut pankreatit och gastro-entero-pankreatiska tumö- rer (t.ex. vipom, insulinom, glukagonom, etc.).

De GH-sekretionshämmande föreningarna enligt uppfinningen hämmar även proliferationen och/eller keratiniseringen av epidermala celler och är därför indicerade för användning vid behandling av dermatologiska sjukdomar 25 som är associerade med patologisk proliferation och/eller keratinisering av epidermala celler, speciellt vid behandling av psoriasis.

Vidare är dessa föreningar indicerade för användning vid behandling av degenerativ senil demens, även senil demens av Alzheimer-typ (SDAT), eller vid behandling av clusterhuvudvärk (upprepad huvudvärk). 30 För alla dessa indikationer är en indicerad dagsdos från ca 2 mikrogram till 20 milligram av de GH-sekretionshämmande föreningarna enligt uppfinningen.

Om så önskas kan föreningarna administreras i deldoser 2 till li gånger per dag i enhetsdosform, eller om så önskas i form med fördröjd frisättning. Sådana enhetsdoser kan innehålla från ca 0,5 mikrogram till 10 mg. 35 Sockerderivaten av kalcitonin och av kalcitoninanaloger eller -derivat enligt uppfinningen, mer speciellt derivaten med formeln X, reducerar kalcium- plasmanivån. De är dessutom funktionella antagonister till parathormon och åstadkommer en positiv kalciumbalans i benen. Den hypokalcemiska aktiviteten för de nya föreningarna kan mätas på känt sätt, t.ex. enligt metoden enligt M. ».»-~ n unna c 10 15 20 25 30 35 518 630 59 Azria et al, rapporterad vid 1984 års kalcitoninsymposium, 24 oktober, Milano, och publicerad som "Short Communication" i "Current Clinical Practice Series" nr. 42, Excerpta Medica, 1986, sid. 1014. Vid denna metod används en Ca2+- jonselektiv elektrod, så att halten kalciumjoner i blodet hos unga kaniner eller hundar kontinuerligt kan mätas. Föreningarna administreras i.v. i en dos från ca 0,1 till ca 10 mikrogram/kg, t.ex. överensstämmande med ca l internationell enhet per kg. Mätningarna utförs under 5 timmar, och ytan under kurvan (AUC) beräknas.

Föreningarna kan även testas vid andra tester, t.ex. vid det hypokal- cemiska standardtestet enligt M. Kumar et al, J. Endocrinology (1965), 33, sid. 469, på råttor i olika doser som ger en hypokalcemisk aktivitet av 300 till 6000 internationella enheter per mg för de hypokalcemiska föreningarna enligt uppfinningen.

Det har exempelvis bestämts att var och en av föreningarna i Exemplen 37 och 38 har en verkningsvaraktighet som är mycket längre än med den omodifierade peptiden vid administrering i.v. till hundar (5 ug/kg). Vid detta test observerade man efter 3 timmar en reduktion i kalciumnivån i blodet på 15 till 18% för föreningarna C och D; efter 6 timmar kunde kalciumreduktion inte längre påvisas för den omodifierade peptiden, medan efter föreningarna i Exemplen 37 och 38 reduktionen i kalciumnivån fortfarande var lika uttalad som efter 3 timmar.

De hypokalcemiska föreningarna enligt uppfinningen är sålunda indice- rade för alla tillstånd, vid vilka en reduktion av plasmakalciumnivån eller en effekt på benmetabolismen önskas, t.ex. hyperkalcemi, som resultat av en brist i endogent tyrokalcitonin genom en förlust av sköldkörtelvävnad eller hyperfunk- tion hos bisköldkörteln. De är även indicerade för alla bentillstånd som är baserade på ökad benskörhet eller vid vilka en kalciumfixering i benet önskas, t.ex. osteoporos av olika slag (t.ex. postklimakterisk, posttraumatisk, orsakad av kortikosteroidterapi eller genom inaktivitet, maligna sjukdomar etc.), frakturer, osteomalaci, rakit och renalt inducerad osteodystrofi, smärta, t.ex. smärta i benen i samband med osteoporos, neurodystropa sjukdomar, Pagets sjukdom och vid kombinerad terapi med kalciumfosfat.

För dessa ovannämnda kalciumrelaterade indikationer är en indicerad dagsdos från ca 5 till ca 1500 internationella enheter. Dessa kan administreras som en enkeldos en gång per dag eller om så önskas en gång varannan eller var tredje dag.

Föreningar enligt uppfinningen, som är sockerderivat av LHRH eller analoger därtill, hämmar luteiniseringshormonsekretion, t.ex. som visas genom en hämning av ägglossning hos djur. . . - . - . . . ~ - - ~ vv i .

' I” .. . -- . ' »-.§., -. ~ t-ø- u: v :".: ':.:::'1"--- 7 -d - v: . nu nunt- II-I 60 Detta test utförs enligt M. Marko och E. Fliickiger, Experentia 30, 11714- 1176 (1974): Vuxna honråttor av Ivanovas Wistar-stammen (Sprague Dawley, lva:SDIV, 200-250 g) hålls under standardbetingelser: 11+ h ljus (från 04.00 till l8.00); 24°C; 5 55-6096 relativ fuktighet; foder och vatten ad libitum.

Djur med regelbundna fyradagarscykler injiceras proöstrusdagen 13.00 med föreningen, subkutant eller på oral väg. Nästa dag 9.00 avlivas djuren, och ägg räknas i båda äggledarna med hjälp av ett dissektionsmikroskop. Endast när inte några ägg återfinns anses ägglossningen vara hämmad. Antalet ägg per 10 ägglossande råtta i varje behandlingsgrupp bestäms också.

I allmänhet är dessa föreningar enligt uppfinningen verksamma i ett intervall från ca 0,0005 till ca 10 mg/kg. Exempelvis är föreningen enligt Exempel 45 aktiv vid 0,01 mg/kg s.c. Föreningens hämmande verkan på luteini- seringshormonsekretion kan även testas in vitro: 15 Hypofyscellkulturer bereds enligt Vales metod (W. Vale och G. Grant: Methods in Enzymology 37, 82-93 (1975)) såsom beskrivits tidigare (M. Marko och D. Römer: Life Sciences, 33, 233-2140 (1983)). Primärkulturer hålls i 4 dagar i en ínkubator vid 37°C. Därefter tvättas cellerna och inkuberas i 3 timmar i 1 ml medium innehållande LHRH eller testföreningen. Vid slutet av inkubationen 20 avlägsnas supernatanten och analyseras med avseende på LH genom specifik radioimmunoassay. _ Vid detta test befinns testföreningarna i allmänhet vara verksamma i ett 12 fiu ca 1o'7 inducerad LH-sekretion på ett dosberoende sätt. intervall från ca 10' M koncentration, varvid de hämmar Ll-IRH- 25 För alla LHRl-l-indikationer är en indicerad dagsdos från ca 2 mikrogram :¿..: A till 20 mg av föreningarna enligt uppfinningen. Om så önskas kan föreningarna administreras i deldoser 2 till i: gånger per dag i enhetsdosform, eller om så önskas i form med fördröjd frisättning. Sådana enhetsdoser kan innehålla från ca 0,5 mikrogram till 10 mg. 30 Föreningarna enligt uppfinningen kan administreras på godtycklig kon- ventionell väg, exempelvis enteralt, t.ex. oralt, t.ex. i form av dricklösningar, tabletter eller kapslar, nasalt, t.ex. i form av vätske- eller pulversprayer och salvor, eller parenteralt, t.ex. i form av injicerbara lösningar eller suspensioner.

Lämplig dosering av föreningarna enligt uppfinningen för någon särskild 35 administreringsväg, t.ex. nasalt eller oralt, kan fastställas med biotillgänglig- hetsstandardförsök med användning av samma substans injicerad i.v., i.m. eller s.c. I allmänhet är för oral administrering dagsdoserna ca 10 till ca 100 gånger högre än för injektion i.m. eller s.c. o e oøuø o 10 15 20 25 518 630 61 För föreningen enligt Exempel 2 är en indicerad dos från 3 till 10 mg tre gånger per dag, t.ex. p.o. för diabetes, sår eller akromegali.

Föreningarna enligt uppfinningen kan administreras i godtycklig farma- ceutiskt godtagbar form, t.ex. i fri form, dvs. fri basform eller, när föreningen är en syra, i fri syraform, eller i farmaceutiskt godtagbar saltform. Saltformen kan exempelvis vara en syraadditionssaltform eller, när föreningen är en syra, i farmaceutiskt godtagbar katjonisk saltform. Föreningarna kan även administreras i komplexform. Föreningarna kan dessutom eller alternativt föreligga i form av ett solvat, t.ex. ett hydrat.

Föreningarna enligt uppfinningen uppvisar samma storleksordning på aktiviteten i var och en av dessa former.

Föreliggande uppfinning avser även läkemedelskompositioner för en förening enligt uppfinningen i farmaceutiskt godtagbar form i förening med minst en farmaceutisk bärare eller minst ett farmaceutiskt spädningsmedel. Sådana kompositioner kan framställas på konventionellt sätt.

En drickampull eller injicerbar lösning kan per milliliter exempelvis innehålla 0,5 mg av föreningen i Exempel 2 i acetatform, ll,l+5 mg citronsyra, 6,32 mg NaOH, 4,5 mg NaCl.

Föreliggande uppfinning avser även en förening enligt uppfinningen för användning vid någon ovan angiven indikation, innefattande sänkning av GH- sekretion, diabetes mellitus, reducering av gastriska sekretioner och akromegali för de somatostatin-liknande föreningarna enligt uppfinningen. I Föreliggande uppfinning avser även användning av en förening enligt uppfinningen vid framställning av ett läkemedel lämpligt för användning vid behandling av någon ovan angiven indikation, innefattande sänkning av GH- sekretion, diabetes mellitus, reducering av gastriska sekretioner och akromegali för de somatostatin-liknande föreningarna enligt uppfinningen.

Claims (4)

>yano “sm ezo =;Ir=¿i::'=r 62 PATENTKRAV

1. Förfarande for framställning av en peptidalkohol som i den C-terminala änden av peptidkedjan uppbär två alkoholgrupper eller en alkoholgrupp och en tiolgrupp, 5 kännetecknat av att peptidalkoholen framställs genom sur hydrolys av en acetal av peptidalkoholen och ett harts innehållande formylfenylrester.

2. Förfarande enligt patentkravet 1 för framställning av en peptidalkohol med formeln /CHR l-XH Y-CO-NH-CH \cH2oH där 10 Y är resten av en peptidalkohol, RI är väte eller metyl och X är O eler S, kännetecknat av att ett harts med formeln Ir n | 1. H1 :-cu\ ®z lca-w-co-v °"°“2 I r som uppbär peptidalkoholen, där 15 ® är resten av ett olösligt syntetharts och Z är en direkt bindning eller en rest som förenar hartset med den acetalise- rade formylfenylgruppen, varvid den acetaliserade CHO-gruppen är belägen i m- eller p-ställning till gruppen Z och ett antal acetaliserade formylfenylgrupper är kopplade till en 20 molekyl av hartspolylneren, hydrolyseras under sura betingelser.

3. Föreningar med formeln Ir R 'L /X-Cfl Ü \ ca-uu-co-v ®lz men; Ir Ivan: 1 n>lnq 5 10 15 20 25 . ~ ~ Q - a v I - a nu s n. nu - . . - i . . I . . . . .. . - n n .. n u . 4 - - . . - n 1 i ~ y-g III än 115 IDG Iitlfllb h I . . . =. i: n u . ~ u - v :_ i . Y U n ~ u ß - .. . 63 är resten av ett olösligt syntetharts, Z är en direkt bindning eller en rest som förenar hartset med den acetalise- rade formylfenylgruppen, X är O eller S, RI är väte eller metyl och Y är resten av en peptidalkohol som kan uppbära skyddsgrupper, varvid den acetaliserade CHO-gruppen är belägen i m- eller p-ställning till gruppen Z och ett antal (acetaliserade) formylfenylgrupper är bundna till en molekyl av hartspolymeren, eller med formeln Vr n gl /xfl Vr \ - G2 *cl/canon A 2 där är resten av ett olösligt syntetharts, Z är en direkt bindning eller en rest som förenar hartset med den acetalise- rade formylfenylgruppen, X är O eller S, RI är väte eller metyl och A är en skyddsgrupp för amínofunktionen, och acetalgruppen är belägen i m- eller p-ställning till resten Z, och hartset uppbär ett antal acetaliserade formylfenylgrupper, eller med formeln VIr a / 1 X-Cll . G8/ ca-uu-A v I r 92' (sig \ o-cuz/ där X är O eller S, RI är H eller CH3, A är en skyddsgrupp för aminofunktionen, E är en rest som förenar gruppen Q'2 med den acetaliserade formylfenyl- SIUPPGII, är en reaktiv grupp som kan reagera med en annan reaktiv grupp som är . o o u un o n a a - o I I' 'S18 630 64 bunden till ett syntetharts och q är O eller 1, varvid acetalgruppen är belägen i m- eller p-ställning till Q'2-(E)q-gruppen, ® -v är resten av ett olösligt syntetharts och _ eller med formeln 5 där Z, varvid formylgruppen är belägen i m- eller p-ställníng till gruppen Z' och hartset är en rest som förenar harset med formylfenylgruppen, uppbär ett antal formylfenylgmpper, 10 eller föreningen med formeln H C H Å Hooc-cn2-o@- H H) z Fastfassyntes enligt krav 1 eller 2 för framställning av oktreotid. 3 Fl-NH-CCJ-CF-'a

4. oc: