NL8702345A - Peptidederivaten en werkwijze voor het bereiden en toepassen van deze derivaten. - Google Patents

Description

\ - Peptidederivaten en werkwijzen voor het bereiden en toepassen van deze derivaten -

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op peptiden, werkwijzen voor hun bereiding, farmaceutische preparaten die ze bevatten en hun toepassing als geneesmiddelen.

De onderhavige uitvinding verschaft een 5 derivaat van een suiker en een biologisch aktief peptide met een langdurige werkingsduur vergeleken met het niet met suiker gemodificeerde peptide, dat tenminste één suikerrest bevat die aan een aminogroep van tenminste één van de aminozuureenheden is gehecht door een andere koppeling dan een direkte N-glycosidische binding en bovendien, indien het een condensatieprodukt van een carboxylgroep bevattend suikerbestanddeel en een peptide met minder dan 8 aminozuureenheden is ,door een andere koppeling dan een direkte aminokoppe1ing.

Hierna worden deze verbindingen aangeduid 1** als verbindingen volgens de uitvinding.

Met een niet door suiker gemodificeerd peptide wordt de peptidestruetuur bedoeld die geen suikerrest of -resten bevat. Hierna wordt dit aangeduid als het niet-gemodifi-ceerde peptide.

20 Bovendien werd gevonden dat de verbindingen volgens de uitvinding bijzonder interessante en verrassende farmacologische eigenschappen bezitten, in het bijzonder een langere werkingsduur, zoals bijvoorbeeld hierna is beschreven.

Er werd nu gevonden dat het opnemen van 25 suikerresten , zelfs gebonden op een andere wijze dan normale glycosylering, bijvoorbeeld van Asp of Ser, deze eigenschappen verleent.

* fi Het verdient aanbeveling deze suikerresten bij aminogroepen aan aminozuren verwijderd van de aktieve plaats 50 van het peptide in te voeren.

De hierin gebruikte uitdrukking "peptiden" omvat peptiden (bijvoorbeeld di-, tri-peptiden), oligopeptiden, polypeptiden en eiwitten. Bij voorkeur heeft het peptide meer dan 7 aminozuureenheden. Geschikt bevat het peptide 8-32 aminozuureenhe- 8702345 i 5 - 2 - den.

De hierin gebruikte uitdrukking " biologisch aktieve peptiden" omvat in het bijzonder verbindingen met een farmacologische of therepeutische werking, bijvoorbeeld verbindingen 5 met een hormonale, enzymatische of immunomodulerende werking of die een dergelijke werking stimuleren of remmen. Deze biologisch aktieve peptiden omvatten in de natuur voorkomende peptiden afgescheiden uit de natuur of verkregen bij de fermentatie van cellen, bijvoorbeeld geproduceerd door genetic engineering of 10 synthese , evenals hun derivaten en analoga.

Met derivaten en analoga worden in het bijzonder natuurlijke peptiden aangeduid, waarin één of een aantal aminozuureenheden is weggelaten en/of is vervangen door één of een aantal andere aminozuurgroep(en) en/of waarin één of een aantal 15 functionele groepen is vervangen door één of een aantal andere functionele groepen en/of waarin één of een aantal groepen is vervangen door één of een aantal andere isosterische groepen. In het algemeen omvat de uitdrukking alle gemodificeerde derivaten van biologisch aktieve peptiden , die een kwalitatief overeenkomstig 20 effekt als het niet-gemodificeerde peptide vertonen.

De gebruikte suikers kunnen bijvoorbeeld elk bekend oligosaccharide, in het bijzonder een mono-, di- of triose of een derivaat daarvan, bijvoorbeeld eveneens een amino-en/of carbonzuur en/of gereduceerd en/of veresterd derivaat daarvan 25 zijn.

De suiker kan bijvoorbeeld zijn gekoppeld aan een N-terminale aminogroep en/of aan tenminste één aminogroep van het peptide die in de zijketen ervan aanwezig is.

De suiker kan via één van zijn functione:-30 le groepen , hetzij rechtstreeks, hetzij niet rechtstreeks, via een brugvormend gedeelte, bijvoorbeeld een alkyleencarbonylgroep, aan het peptide zijn gebonden.

Deze koppeling kan op een gebruikelijke wijze worden uitgevoerd, in het bijzonder op een hierna te beschrij- 35 ven wijze.

Een groep verbindingen volgens de uitvinding kan worden bereid via een Amadori of Heyns herschikking.

8702345 £ * - 3 -

De uitvinding verschaft eveneens orale farmaceutische preparaten die een verbinding volgens de uitvinding, in het bijzonder die met tenminste 8 aminozuren, bevatten.

De onderhavige uitvinding verschaft ·* in het bijzonder de volgende suikerderivaten van biologisch aktieve peptiden met a) formule I, waarin de groep met formule Ia de desoxyrest van een ketose voorstelt, waarbij de rest via de CH^-groep aan de NH-groep van een biologisch aktief peptide ^0 is gebonden en P de rest van een biologisch aktief peptide met formule NH^-P voorstelt , waarin de NH-groep aan het N-terminale uiteinde of in een zijketen van een peptide P is geplaatst, b) met formule II , waarin de groep met formule Ila de desoxyrest van een aldose is, waarbij de groep ^ via de vrije binding met de NH-groep van een biologisch aktief peptide is gebonden, en P de rest van een biologisch aktief peptide met formule N^-P voorstelt, waarin de NH-groep aan het N-terminale uiteinde of in een zijketen van het peptide ;P is ge-20 plaatst, c) met formule III, waarin

Gj de rest van een uronzuur of van een polyhydroxymono- of di-carbonzuur voorstelt, R een waterstofatoom of een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen weergeeft en 2^ P de rest van een biologisch aktief peptide met formule N^-P is, die tenminste 8 aminozuureenheden bevat, waarin NR^ aan het N-terminale uiteinde of in een zijketen van het peptide P is geplaatst, d) met formules IVa, IVb , IVc of IVd, 50 waarin P de rest van een biologisch aktief peptide met formule ^N- P voorstelt, de groepen samengevat onder formule IV suikerresten ® zijn en Q, Q*, QM en Q,,r groepen zijn die de peptiderest aan de suikerrest koppelen, waarin de NH-groep gebonden aan P bij het N-terminale uiteinde of in een zijketen van het peptide 55 aanwezig is of e) met formule Va of Vb , waarin Y = H^ of H,0H, 8702345 L Λ - 4 - c = 2, 3 of 4, en P de rest van een biologisch aktief peptide met formule I^N-P voorstelt, waarin de NH-groep gebonden aan P bij het N-terminale uiteinde of in een zijketen vdn het 5 peptide P is geplaatst en elk van de vrije hydroxylgroepen in het polyolgedeelte van de verbindingen met formule V desgewenst op een glycosylische wijze met een reducerend mono-, di- of oligosaccharide of aminosuiker is gebonden, alsmede·de zuuradditiezouten en complexen van deze polypeptidederivaten, onder de voorwaarden 10 dat a) in de hiervoor genoemde verbindingen met formule I , P een andere betekenis heeft dan een groep van een gastrine-peptide met een koolstofterminale groep eindigende in -Asp-Phe-NH2, 15 b) indien in de verbindingen met de formule IVb de groep met formule IV’ de rest van een muranylsuiker is en Q een alkyleengroep voorstelt, P niet als het tweede aminozuur van het stikstofterminale uiteinde een aminozuureenheid bevattende twee carboxylfuncties heeft of indien Q' een fenylring bevattende 20 tweewaardige groep is, P-Nï^ de rest van een natuurlijk insuline is.

Een gastrine is een peptide dat de afscheiding van maagzuur vergroot. Geschikt is het tweede aminozuur van het stikstofterminale uiteinde van P geen aminozuur. met twee carboxylfuncties.

25 Alle hiervoor genoemde suikeresten (G^“G^) kunnen mono-, di- of oligosacchariden zijn. Deze suikers kunnen heptosen, hexosen en/of pentosen, die als pyranosen of furanosen kunnen voorkomen, zijn.

In alle hiervoor genoemde formules I-V 50 slechts één suikergedeelte per peptiderest weergegeven.

De uitvinding omvat echter eveneens suikerderivaten met meer dan β één vrije aminogroepen aan de peptiderest , bij voorkeur 2 of 3 suikerresten per peptiderest.

De uitvinding verschaft bovendien alle 55 biologisch aktieve peptiden die meer dan één gebonden suikerrest bevatten en hiervoor zijn gedefinieerd.

De suikerpolypeptiden bevatten bij voorkeur 8702345

t A

- 5 - 1-3 monosaccharideresten, die samen tot een disaccharide of tri-saccharide kunnen zijn gebonden.

In alle hiervoor genoemde verbindingen betekent de lijn dat de binding op de of ti-plaats -kan zijn.

5 In formule I is de groep met formule Ia bij voorkeur a) een rest met formule Vla, waarin één van de groepen Ga en Gb een waterstof-10 atoom voorstelt en de andere de hydroxylgroep is, één van de groepen Gc en Gd een waterstofatoom weergeeft en de andere een-OH of O-glycosylgroep weergeeft, waarbij de glycosylgroep een derivaat kan zijn van een reducerend mono-, di- of oligosaccharide, 15 één van de groepen Ge en Gf een waterstofatoom voorstelt en de andere de hydroxylgroep is, bijvoorbeeld waarbij de groepen Ga - Gf zodanig worden gekozen , dat de rest met formule Vla overeenkomt met een groep die verkregen kan worden met behulp van een Amadori herschikking van een 20 natuurlijk of synthetisch verkrijgbaar mono-, di- of oligosaccharide.

De volgende resten kunnen als voorbeelden van de suikerresten met formule Vla worden genoemd:

Deoxyfructosyl, deoxytagatosyl, deoxy-sorbosyl,K -glucosyl(1,4)-deoxyfructosyl,^-glucosyl(1-4)-0( -25 glucosyl(1-4)-deoxyfructosyl.

b) een rest met formule VIb, waarin één van de groepen Ga en Gb een waterstofatoom voorstelt en de andere de hydroxylgroep weergeeft, één van de groepen Gc en Gd een waterstof-30 atoom weergeeft en de andere de hydroxylgroep of O-glycosylgroep is, waarbij de glycosylgroep afgeleid kan worden van een reducerend - g mono-, di- of oligosaccharide, één van de groepen Ge en Gf een waterstofatoom voorstelt en de andere een waterstofatoom, C00H, C^OH, 35 CH2-0-P(0)-(0H)2 of CH20-glycosyl is, waarin de glycosylgroep afge leid kan worden van een reducerend mono-, di- of oligosaccharide, 8702345 i 4 - 6 - bijvoorbeeld waarin de groepen Ga-Gf zodanig worden gekozen dat de groep met formule VIb overeenkomt met een groep die verkregen kan worden met behulp van een Amadori herschikking van een in de natuur voorkomend of synthetisch verkrijgbaar mono-'j di- of oligosaccharide.

Resten met formule VIb kunnen bijvoorbeeld worden verkregen met behulp van een Amadori herschikking van sacchariden, zoals gentiobiose, melibiose, ribose , xylose of van uronzuren, zoals glucuronzuur of galacturonzuur.

10

In formule II is de groep met formule Ha bij voorkeur a) een rest met formule Vila, waarin één van de groepen Ga of Gb een waterstofatoom voorstelt en de andere een vrije binding is, één van de groepen Gc of Gd een waterstofatoom weergeeft en de andere de hydroxylgroep is, één van de groepen Ge of Gf een waterstofatoom voorstelt en de andere de hydroxylgroep of O-glycosylgroep is, waarin de glycosylgroep een derivaat kan zijn van een reducerend 20 mono-,di- of oligosaccharide , één van de groepen Gg en Gh een waterstofatoom voorstelt en de andere de CI^OH groep of Cl^O-glycosylgroep is, waarbij de glycosylgroep een derivaat kan zijn van een reducerend mono-, di- of oligosaccharide, bijvoorbeeld waarin de groepen 25

Ga - Gh zodanig worden gekozen , dat de groep met formule Vila overeenkomt met een groep die verkregen kan worden onder toepassing van een Heyns herschikking van een in de natuur voorkomend of synthetisch verkrijgbaar mono-, di- of oligoketose, b) een rest met formule VII b, waarin 30 een van de groepen Ga en Gb een waterstofatoom voorstelt en de andere een vrije binding is , één van de groepen Gc en Gd een waterstof- - t atoom weergeeft en de andere de hydroxylgroep is, één van de groepen Ge en Gf een waterstof-35 atoom voorstelt en de andere de CI^OH of Cl^-O-glycosylgroep is, waarin de glycosylgroep een derivaat kan zijn van een reducerend mono-, di- of oligosaccharide, bijvoorbeeld waarin de groepen Ga-Gf zodanig worden gekozen dat de groep met formule Vllb overeenkomt met 8702345

* J

- 7 - een groep die verkregen kan worden met behulp van een Heyns herschikking van een in de natuur voorkomend of synthetisch verkrijgbaar mono- , di- of oligoketose.

De resten met formules Vila of Vllb 5 kunnen bijvoorbeeld worden verkregen door middel van de Heyns herschikking van een suiker zoals D-fructose, lactulose , L-sorbose, D-tagatose of D-ribulose.

. Γη formule III bevat het polyhydroxymono-of -dicarbonzuur bijvoorbeeld tenminste drie hydroxylgroepen en 10 kan eveneens andere substituenten, zoals amino- of acetylamino-groepen , bevatten.

Voorbeelden van dergelijke polyhydroxy-carbonzuren zijn: de ''onzurenW afgeleid van suikers, zoals glucon-zuur , of "aarzuren" , zoals glucaarzuur en verder chininezuur, acetyl-15 muraanzuur, acetylneuraminezuur óf D-glucosaminezuur.

Voorbeelden van uronzuren zijn glucuronzuur en galacturonzuur.

In de verbindingen met formule IV hebben en G^'' de hiervoor voor G1 of G2 gegeven definities.

20 De groep Q of Q* verbindt een NH^ groep van het peptide met een-N^ of H0-groq>van de suikerrest en is bijvoorbeeld de rest van een dicarbonzuur of bij voorkeur een —C,H0—CO-groep, waarin b = 0-6. De groep kan vertakt zijn. Q' geeft bijvoorbeeld een NH-CO-C^-C^-CO groep of in het bijzonder 25 ' ' een .CO-groep , waarin b bijvoorbeeld 1-6 is , aan. Q is bij voorbeeld een -C^-CO-groep. Q is in het bijzonder -CO- of -CS-.

-NH-Q"- en -NH-Q'T ’ geeft groepen aan die een N^-groep van het peptide verbinden met de suikerrest, in het bijzonder groepen van w-aminocarbonzuren. Ze kunnen bijvoorbeeld een -NH-C^-H^^-CO-groep ^ voorstellen.

In het geval van een verbinding met formule V verdienen die met formule Va aanbeveling, in het bijzonder waarin n = 3.

Al de hiervoor genoemde resten P zijn 35 resten van biologisch aktieve peptiden. Onder dergelijke*peptiden vallen alle in de natuur voorkomende en synthetische peptiden 8702345 5 Λ - 8 - (eveneens derivaten en analoga daarvan(zie het begin van deze beschrijving)) met hormonale , enzymatische of immunomodulerende werking .Deze aktiviteit kan zowel stimulerend als remmend zijn.

De volgende verbindingen kunnen als voorbeelden van dergelijke 5 peptiden worden genoemd: somatostatine, calcitonine, oxytocine, vasopressine, insuline, LH, LHRH , groeihormoon, gastrine, verbinding P, eathepsine, encefalinen , alsmede alle derivaten en analoga van deze peptiden, die een overeenkomstige werking met de peptiden of een antagonissrenie werking bezitten.

10 De verbindingen volgens de uitvinding bevat ten bij voorkeur tenminste 8 aminozuureenheden, bijvoorbeeld 8-32, in het bijzonder 8-20, vooral 8-10 aminozuren.

De peptiden die de voorkeur hebben zijn die met formules I en II.

15 In de hiervoor vermelde en hierna volgende formules is , terwille van de eenvoud , de suikerrest gewoonlijk alleen weergegeven door de pyranosestructuur. Natuurlijk vallen de furanose_en openketenstructuren eveneens onder de uitvinding, mits ze relevante suikers zijn.

20 Onder de ondernavige uitvinding vallen eveneens werkwijzen voor het bereiden van de verbindingen met de hiervoor gegeven formules. Ze kunnen worden bereid volgens methoden die in het algemeen bekend zijn voor de synthese van verbindingen van dit type. De verbindingen volgens de uitvinding kunnen bijvoor-25 beeld op de volgende wijze worden bereid: a) tenminste één beschermende groep, die in een suiker gederivatiseerd peptide aanwezig is, wordt verwijderd, of b) twee peptideeenheden, waarvan elk 30 tenminste één aminozuur of een aminoalkohol in een beschermde „ g of onbeschermde vorm bevat en één peptideeenheid de suikergroep bevat^worden via een amidebinding met elkaar verbonden, waarbij de peptidebinding zodanig is dat de gewenste aminozuurvolgorde wordt verkregen en stap a) van de werkwijze daarna desgewenst wordt uit-35 gevoerd, of 6702345 - 9 - c) tenminste één suikerrest in een beschermde of niet-beschermde peptide wordt ingevoerd en stap a) van de werkwijze daarna desgewenst wordt uitgevoerd,of-; d) een functionele groep van een al 5 of niet beschermd suiker-gederivatiseerd peptide wordt omgezet in een andere functionele groep of wordt verwijderd, zodat een al of niet beschermd geglycosyleerd peptide wordt verkregen en in het laatste geval stap a) van de werkwijze wordt uitgevoerd, of 10 e) een suiker.derivatiseerd peptide, waarin de mercaptogroepen van Cysgroepen in vrije vorm voorkomen, wordt geoxydeerd ter verkrijging van een peptide waarin 2 Cys -groepen door een S-S-brug met elkaar zijn verbonden.

Zoals reeds in het begin van deze beschrij-15 ving is vermeld omvat de hierin gebruikte uitdrukking "suiker" eveneens suikerderivaten, zoals aminosuikers , geoxydeerde en gereduceerde suikers of veresterde suikers.

De hiervoor beschreven reakties kunnen op een gebruikelijke wijze, analoog aan de werkwijzen beschreven 20 in de volgende voorbeelden, worden uitgevoerd, in het bijzonder kunnen de werkwijzen a) en b) volgens de hierna beschreven synthese van de uitvinding worden bereid. Desgewenst kunnen bij deze reakties beschermende groepen, die geschikt zijn om bij peptiden of suikers te worden toegepast, worden aangewend als functionele 25 groepen die niet aan de reaktie deelnemen. Onder de uitdrukking "beschermende groep " valt een polymeerhars met functionele groepen.

De verbindingen met formule I kunnen worden verkregen door reaktie van een beschermd peptide met een 30 vrije aminogroep in een weinig zuur medium met een reducerend mono-, di- of oligosaccharide of een overeenkomstig uronzuur of * ester daarvan (Amadori-herschikking) en vervolgens verwijdering van de beschermende groepen.

Deze reaktie kan op een wijze die 35 gebruikelijk is voor de Amadori-herschikking worden uitgevoerd.--

Het toegevoegde zuur kan bijvoorbeeld ijsazijn zijn. Bij een reak- 8702345 J > - 10 - tie met uronzuur, kan van het gebruik van een extra zuur worden afgezien. Het verdient aanbeveling een overmaat koolhydraat toe te passen, bijvoorbeeld 10 equivalenten voor 1 equivalent peptideverbinding. De reaktie kan in een polair oplosmiddel, 5 zoals methanol, worden uitgevoerd, bij voorkeur bij temperaturen van ongeveer 60 tot 70°C.

De verbindingen met formule II kunnen worden verkregen door reaktie van een beschermd peptide met een vrije aminogroep in een weinig zuur medium met een ketose (her-10 schikking volgens Heyns). De reaktie kan onder dezelfde omstandigheden als toegepast als bij de Amadori-herschikking ( zie hiervoor) worden uitgevoerd.

De verbindingen met formule ΙΓΙ kunnen worden verkregen door reaktie van een beschermd peptide met 15 een vrije aminogroep met een zuur met formule Gj-C00H of een reaktief derivaat van een dergelijk zuur en daarna de beschermende groep(en) te verwijderen. Dit kan een gebruikelijke amideringsreaktie zijn , die op een bekende wijze wordt uitgevoerd. Zuurhalogeniden kunnen in het bijzonder als reaktieve derivaten 20 van carbonzurenworden toegepast. De amiden kunnen bijvoorbeeld eveneens worden verkregen met de vrije zuren in aanwezigheid van hydroxybenzotriazool en dicyclohexylcarbodiimide.

De verbindingen met de formules IVa , IVb, IVc en IVd kunnen worden verkregen door: 25 λ a) reaktie van het peptide allereerst met het bruggedeelte en vervolgens reaktie van het produkt met de suiker , of b) reaktie van de suiker allereerst met het bruggedeelte en daarna reaktie van het geglycolyseerde 30 bruggedeelte met het peptide.

Deze reakties kunnen op een gebruike- • £ lijke wijze worden uitgevoerd. In het algemeen zijn de amide- , ester- of etherverbindingen volgens de uitvinding de hoofdprodukten.

De verbindingen volgens de uitvinding kunnen op een gebruikelijke 35 wijze worden gezuiverd.

Verbindingen met IVa waarin Q -CO- of -CS- voorstélt kunnen bijvoorbeeld worden verkregen door koppeling t : 2 3 4 5: -* jr - n - van het overeenkomstige glycosylisocyanaat of glycosylisothiocyanaat met formule

G. N = C = L

'i / 5 waarin L = 0 of S en een hiervoor gedefinieerde betekenis heeft en waarin de in aanwezige vrije hydroxylgroep beschermd is, bijvoorbeeld door acylering , aan een peptide P-N^ in beschermde vorm en daarna de beschermende groepen af te splitsen.

^ Deze reaktie kan op een gebruikelijke wijze voor het bereiden van ureumderivaten worden uitgevoerd.

Verbindingen met formule IVc en IVd kunnen worden verkregen met behulp van bijvoorbeeld een Amadorï-of Heyns_ herschikking, bijvoorbeeld zoals hiervoor beschreven voor ^ de bereiding van verbindingen met formules I en II.

Een verbinding met formule Va of Vb kan bijvoorbeeld worden verkregen door a*) reductieve aminering van een aldose, desoxyaldose of ketose met het peptide P-NH„-, of 20 1 b’) reductie van de hemi-acetaalgroep in een verbinding met formule I of II , waarbij desgewenst elk reaktie- bestanddeel tijdelijk beschermd kan zijn.

De reductieve aminering en reductie kunnen op een gebruikelijke wijze worden uitgevoerd. De reductieve 25 . ..

ammenng kan bijvoorbeeld geschieden met NaBH^CN. De aanbevolen pH is 7. De reductie van de hemi-acetaalgroep kan worden uitgevoerd met boriumhydriden, bijvoorbeeld met natriumboriumhydride.

De aanbevolen pH bedraagt ongeveer 6.

Voor zover het bereiden van de uitgangs- 30 ....

materialen met m het bijzonder hierin is beschreven, is dit bekend of ze kunnen op een gebruikelijke wijze worden verkregen, ® bijvoorbeeld onder toepassing van methoden die bekend zijn uit de literatuur of hierin voor analoge verbindingen zijn beschreven, of volgens de synthese van de uitvinding^die hierna is beschreven.

35 .

Een aanbevolen klasse verbindingen volgens i de uitvinding omvat desuikerderivaten van somatostatine , bijvoorbeeld met 4-9 aminozuren. Onder de uitdrukking "somatostatine" vallen o/02345 J ·# - 12 - de analoga of derivaten ervan. In het bijzonder aanbeveling verdienende suikerderivaten van verbindingennet formule VIII, waarin A een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen of een alkanoylgroep met 1-4 koolstofatomen voorstelt, >~N-CH(Z.j)-C0 weergeeft 1) een (L)- of (D)-fenylalaninegroep, die desgewenst gesubstitueerd is door halogeen, NC^, NH2 , OH , alkyl met 1-3 koolstofatomen en/of alkoxy met 1-3 koolstofatomen, of 2) de rest van een natuurlijk lypofiel -aminozuur of van een overeenkomstig (D)-aminozuur , dat verschilt van dat vermeld onder 1) , waarin ^ in > N-CH(Z^)-C0- de groep van een aminozuurgroep gedefinieerd onder 1) en 2) voorstelt, A' een waterstofatoom of een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen weergeeft, en Y2> onafhankelijk van elkaar, 20 1) een waterstofatoom, R !a 2) een -C0-C-(CH~) -H groep is, K m waarin m een geheel getal van 1-4 is, 25 de methyl- of ethylgroep voorstelt en " een waterstofatoom, de methyl- of ethylgroep weergeeft, of

CH

30 3) -CO-ClQ* , z n waarin n een geheel getal van 1-5 is, of * 4) -CO-NHR .

c 9 35 waarin R^ een alkylgroep met 1-6 koolstofatomen en een rechte pf vertakte keten is, of 5) -C0-NH-CH-C00R ,

Rd 8702345 \ t - 13 - waarin R, ώ rest van een in de natuur voorkomend ^-aminozuur is α (waaronder waterstof) dat aan het &(-koolstofatoom aanwezig is, en Re een alkylgroep met 1-5 koolstofatomen voorstelt, 5

6) -CO-(NH)p - C l.(CH

\kl 9 q waarin R^ en R£ ^onafhankelijk van elkaar, een waterstofatoom, de methyl- of ethylgroep voorstelt,

Rg en Rg, onafhankelijk van elkaar, een waterstof-, fluor-, chloor- of broomatoom, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen of alkoxygroep met 1-3 koolstofatomen weergeeft, p - 0 of 1, q = 0 of 1 en r = 0, 1 of 2 , of waarin Y^ en tezamen een binding vormen, B = Phe of Phe die in de fenylgroep 20 is gesubstitueerd door fluor, chloor, broom, N02, NH^, OH, alkyl met 1-3 koolstofatomen of alkoxy met 1-3 koolstofatomen, C is L- of D-Trp , waarvan de benzeenring desgewenst gesubstitueerd is door fluor, chloor, broom, N02, NH^, OH , alkyl met 1-3 koolstofatomen of alkoxy met 1-3 koolstofatomen, 25 D is Lys , waarin de (X-ammogroep door methyl gesubstitueerd kan zijn, E is Thr, Ser, Val, χ F is C00R1, CH20R2, CO-NR^ of -CO-N 1 3° . £ R^ een waterstofatoom of een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen voorstelt, R2 een waterstofatoom of de rest van een 35 fysiologisch aanvaardbare, fysiologisch hydrolyseerbare ester weergeeft,

Rg een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen, een fenylgroep of een fenylalkylgroep met 8702345 1 * - 14 - 7-10 koolwaterstofatomen voorstelt, doch indien R^ een -CH(R^)-X^ groep is, slechts een waterstofatoom of de methylgroep voorstelt, een waterstofatoom,een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen of een groep met formule IX voorstelt, 5 R^ de rest van een in de natuur voorkomend aminozuur (waaronder waterstof) is, die aan het K-koolstofatoom is gehecht, of een HO-CI^-CH^- of HCK-CI^)^ groep weergeeft, waarin de groep met formule IX de L- of D-configuratie kan hebben, D X is COOR., CH„0Ro of 10 -«Λ , 1 R^ een waterstofatoom of een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen weergeeft en 15 een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen, een fenylgroep of een fenylalkylgroep met 7-10 koolstofatomen voorstelt, waarbij de groepen B, D en E in de L-vorm voorkomen en de groepen op de plaatsen 2 en 7, evenals de groepen Y^4) en Y^h) 20 onafhankelijk van elkaar in de D- of L-vorm voorkomen, alsmede de zouten en complexen van deze verbindingen.

Dergelijke verbindingen zijn beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.395.403 .

In de polypeptidederivaten met de hiervoor 25 gegeven formule VIII verdienen de volgende definities of combinaties daarvan aanbeveling:

Indien >N-CH(Z^)-C0- definitie 1) heeft, is deze groep bij voorkeur een (L)- of (D)-fenylalanine of een (L)-of (D)-tyrosinegroep (waarin Z benzyl of p-OH weergeeft), in het 30 bijzonder de (D)-fenylalaninegroep.

Indien >N-CH(Z^)-C0- definitie 2) heeft, verdienen de groepen waarin Z^ een alkylgroep met 3, bij voorkeur 4, of meer koolstofatomen, bijvoorbeeld tot 7 koolstofatomen , voorstelt, aanbeveling.

35 Het verdient het meest aanbeveling dat de >N-CH(Z^)-C0-groep een onder 1) gedefinieerde groep is.

8702345 * i - 15 - en Y2 hebben bij voorkeur de definities welke hiervoor onder 1, 2 of 4 zijn gegeven. In. het bijzonder vormen ze tezamen een binding.

B geeft bij voorkeur Phe of Tyr weer.

5 G stelt bij voorkeur -(D)-Trp voor.

D is bij voorkeur Lys.

E is bij voorkeur Thr.

Het verdient aanbeveling dat F

/*3 · Λ 10 -CO-N^ , in het bijzonder CO-ïr J voorstelt, waarin de -CH(R^)-X^ groep bij voorkeur de L-configuratie heeft.

R^ is bij voorkeur een waterstofatoom, 15 R5 geeft CH2.0H, CH-OH, i-butyl, ch3 CHgC^OH of (Q^g-OH, in het bijzonder C^OH of CH-OH, in het “3 20 bijzonder CH-OH weer,

CK3 R

3 /\ X. stelt bij voorkeur -CO-N voor of

1 \ R

*7 25 is CH2OR2, in het bijzonder CH2OR2, R2 is bij voorkeur een waterstofatoom en R2 , als groep van een ester, stelt 30 bij voorkeur HCO, alkylcarbonyl met 2-12 koolstofatomen, fenyl-alkylcarbonyl met 8-12 koolstofatomen of benzoyl voor.

^ De groepen op de 2- en 7-plaats hebben bij voorkeur de L-configuratie.

Bijzonder aanbevolen suikersomatostatine-35 derivaten zijn die welke een suikergroep aan de stikstofterminale aminogroep bezitten, bijvoorbeeld verbindingen met formule Villa,

VlIIb, VIIIc, VlIId ,VIIIe, waarin Q= CO of CS en VlIIf.

Bijzonder aanbevolen zijn de verbindingen 87 0 2 3 4 5 1 * - 16 - met formules Villa, VUIb, VUIe en VUIf.

Een groep verbindingen omvat die met formule VlIIpa , waarin -: A de desoxygroep van een ketose of een 5 overeenkomstig uronzuur is, welke groep via een Cl^-groep met de NH-groep is verbonden , waarbij de desoxygroep verkregen kan worden door een Amadori-reaktie van een aldose of een overeenkomstig uronzuur met de vrije aminogroep van het somatostatine, en Z.j, A', Y^, B,C,D,E,Ï2 de hiervoor met 10 betrekking tot formule VIII gegeven betekenissen hebben.

Een andere groep verbindingen omvat de verbindingen met formule A Z A' CH -S-Y Y0-S-CH„ II ! I 2 1 2 l 2 G-CO-N-CH-CO-N-CH-CO-B-C-D-E-NH-CH-F , 15 1 2 3 4 5 6 7 waarin G een acylgroep van een uronzuup, een polyhydroxycyclohexaancarbonzuur, N-acetylmuraminezuur of N-acetyl- 20 neuraminezuur voorstelt, A een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen of een alkanoylgroep met 1-4 koolstofatomen weergeeft en Z, A', Y^ B, C, D, E, Y2 en F de hiervoor gedefinieerde betekenissen hebben.

25

Geschikt is G glucuronzuur , galacturon- zuur of chininezuur.

Een andere groep verbindingen omvat die met formule VIIIpc, waarin Q een waterstofatoom of de 30 glycosylgroep van een mono-, di- of oligosaccharide voorstelt, n een geheel getal van 1-6 is , A een waterstofatoom,een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen of een alkanoylgroep met 1-4 koolstofatomen voorstelt en 35 Z, A’, Y^, B, C, D, E, Y2 en F de hiervoor gedefinieerde betekenissen hebben.

Een andere aanbevolen groep verbindingen 8702345

> X

- 17 - volgens de uitvinding omvat de suikerderivaten van calcitoninen.

De uitdrukking "calcitonine" omvat calcitoninen die in de natuur voorkomen ( geextraheerd uit natuurlijke bronnen, celcultures enz. of synthetisch bereid) en derivaten 5 en analoga daarvan.

Onder de in de natuur voorkomende calcitoninen die kunnen worden toegepast vallen, die van mensen , zalm , aal, kippen, vee, schapen, ratten, of varkens , in het bijzonder die van mensen, zalm , kippen en aal.

10 Onder derivaten en analoga van deze calcitoninen vallen in het bijzonder in de natuur voorkomende calcitoninestructuren, waarin één of een aantal aminozuurgroepen vervangen zijn door één of een aantal andere aminozuurgroepen en/of de S-S-brug vervangen is door een alkyleenbrug en/of waarin één 15 of een aantal aminozuurgroepen zijn weggelaten.

Vooral aanbevolen worden de suikerderivaten van calcitoninen met formule X, waarin R een waterstofatoom of de R"C0-groep voorstelt, 20 R"C0 de acylgroep van een carbonzuur is,

Yj de groep geplaatst aan het ®C-koolstof-atoom van een -aminozuur is, Y2 de groep geplaatst aan het ^.-koolstof-atoom van een ^-aminozuur, -C^-S-S-C^-CH-COOH, 25 m2 -CH2-S-S-CH2-CH2“COOH, -(CH2)g-C00H of -C^-S-Y is, Y^ een alkylgroep met 1-4 koolstofatomen, benzylgroep, die desgewenst door methyl of methöxy is gesubstitueerd, 30 of de CH^CONH-CH^ groep voorstelt, o een geheel getal van 1-4 is, - £ Thr of D-THR weergeeft, s een geheel getal van 3-5 is,

Aq de aminoacylgroep van een neutraal, 35 , 8 lipofiel L-**-aminozuur is,

Ag de aminoacylgroep van een neutraal, 8702345 s x - 18 - lipofiel L- of D-Q(,-aminozuur voorstelt, en Z1 een polypeptidegroep is, die op de plaatsen 10-31 van een in de natuur voorkomend calcitonine aanwezig is, of een derivaat of analogon ervan, dat een hypocalcèmische 5 werking heeft, waarin de 1-4 Yj groepen in formule X , onafhankelijk van elkaar , al of niet gelijk kunnen zijn, met uitzondering van de aminoacylgroep Ac, alle aminozuurgroepen in formule X de

O

L- of D-configuratie kunnen bezitten, alsmede de zouten en complexen van deze verbindingen.

10 Dergelijke verbindingen zijn bijvoorbeeld beschreven in het Britse octrooischrift 2.184.729 A.

ΖΛ in formule X stelt een peptidegroep voor die op de 10-31 plaats en inverschillende bekende calcitoninen, bijvoorbeeld humaan-, zalm-, aal-, kip-, vee-; schaap-j rat-of 15 varkenscalcitonine,aanwezig kan zijn, evenals in derivaten en analoga van deze calcitoninen, met een overeenkomstige werking.

Onder derivaten en analoga van deze calcitoninen worden in het bijzonder natuurlijke calcitoninen verstaan,vaarin één of een aantal aminozuurgroepen vervangen zijn door één of een aantal 20 andere aminozuurgroepen, of waarin de S-S-brug vervangen is door een alkyleenbrug of waarin één of een aantal aminozuurgroepen zijn weggelaten. Deze peptidegroepen bevatten normaliter 22 aminozuren, doch ze kunnen eveneens een overeenkomstige kleinere hoeveelheid aminozuurgroepen bevatten door één of een aantal 25 aminozuurresten ( des-aminoacylderivaten) weg te laten.

stelt bij voorkeur voor: a) Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln- Asp- Phe- Asn- Lys- Phe- His- Thr-Phe- Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala b) Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr c) Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr ^ 35 Verbindingen met formule X, waarin Z^ de onder b) of c) gegeven definitie heeft, bij voorkeur die waarin Z,| definitie c) heeft , verdienen vooral aanbeveling.

δ / ü 2 3 4 5 * ï - 19 - R"CO is bij voorkeur de acylrest van een alifatisch , cycloalifatisch , aromatisch of heterocyclisch carbon-zuur .

R" stelt bij voorkeur 1 5 a') een verzadigde of onverzadigde, al of niet vertakte^alkylgroep met 1—17 koolstofatomen, in het bijzonder een verzadigde alkylgroep met 3-9 koolstofatomen, b') een cycloalkylgroep met 5-7 koolstofatomen of cycloalkylalkylgroep, waarin de cycloalkylgroep 5-7 koolstofatomen en de alkylgroep 1 of 2 koolstofatomen bevat, c') adamantyl-, adamantylmethyl- of adamantylethylgroep , of d') fenyl-, benzyl- of fenethylgroep voor.

In de hiervoor genoemde definities van ^ R1' kunnen de alkyl-, cycloalkyl- of fenylgroepen gesubstitueerd zijn door gebruikelijke substit.uenten, bijvoorbeeld door halogeen, nitro, hydroxyl, alkoxy, enz.

De R"C0 - rest kan bijvoorbeeld de «r deaaminorest van een in de natuur voorkomend Dl-aminozuur zijn.

20 Voor R'r verdienen de definities a'), b') en c') aanbeveling.

Yj en als groepen die aan het ^-koolstof atoom van een &(-aminozuur aanwezig zijn, zijn in het bijzonder de groepen die gebonden zijn aan het o(,-koolstofatoom van een in de natuur voorkomend -aminozuur, doch groepen van andere 0(,-25 · aminozuren kunnen eveneens m overweging worden genomen, bijvoorbeeld van 3-cyclohexylalanine of van een %-aminoisoboterzuur.

Indien o in formule X is 4 , a) is de N-terminale aminoacylgroep (overeenkomende met de tweede aminozuurgroep in de volgorde van de in de natuur voorkomende calcitoninen) bij voorkeur Ser, Gly of Ala, ^ b) is de tweede aminoacylgroep (over eenkomende met de derde aminozuurgroep in de volgorde van de in de natuur voorkomende calcitoninen) bij voorkeur Asn of Ser, c) is de derde aminoacylgroep ( overeen-35 komende met de vierde aminozuurgroep in de volgorde van de in de natuur voorkomende calcitoninen) bij voorkeur Leu, Asn, Ser,

Phe, D-Leu of de groep van cyclohexylalanine, 8702345 * > - 20 - d) is de vierde aminoacylgroep (overeenkomende met de vijfde aminozuurgroep incle volgorde van de in de natuur voorkomende calcitoninen) bij voorkeur Ser-of Ala.

Indien o in formule X is 3, hebben 5 het stikstofterminale , de tweede en de derde aminozuurgroepen dezelfde voorkeursdefinities als hiervoor voor het geval dat o = 4 onder b) zijn gegeven.

Indien o in formule Xis2, hebben het stikstofterminale en de tweede aminozuurresten dezelfde, 10 aanbevolen definities als hiervoor voor het geval dat o = 4 onder c) en d) is vermeld.

Indien o in formule X b 1, zijn het stikstofterminale en de tweede aminozuurgroep bij voorkeur Ser, of Ala.

A, stelt bij voorkeur Thr voor.

® y i 15 i2 -NH-CH-CO geeft bij voorkeur Cys, een cysteinederivaat, zoals hiervoor voor is gegeven of een neutraal lipofilisch ££-aminoacylgroep, in het bijzonder Ala of een andere neutrale lipoliele oC-aminoacylgroep, in het bijzonder 20 Ala weer, j ’

Ag stelt bij voorkeur de aminoacylgroep van een neutraal lipofilisch C(-aminozuur, in het bijzonder Val of Gly voor en Α^ is eveneens bij voorkeur de aminoacyl-25 groep van een neutraal lipofilisch <<-aminozuur, in het bijzonder Leu of Phe.

In de verbindingen met formule X is o bij voorkeur 2 , waarin R een waterstofatoom of een RMC0 groep voorstelt, of in het bijzonder is o = 1 en R een R"CQ groep.

30 Alle aminozuurgroepen bezitten bij voorkeur de L-configuratie.

® De geglycosyleerde calcitoninen(waaronder derivaten en analoga) zijn in het bijzonder die welke geglycosyleerd zijn aan de stikstofterminale aminogroep of aan één of een aantal 35 aminogroep(en) in één of een aantal zijketen(s) , bijvoorbeeld verbindingen met de formules Xla, Xlb, XIc, Xld, Xle, of Xlf.

8702345 * - 21 -

Calc geeft derest van een natuurlijk calcitonine of van een derivaat of een analogon van een dergelijk calcitonine, die via een aminogroep aan het stikstofterminale uiteinde of in een zijketen met de suikergroep is gebonden, aan.

5 get calcitoninederivaat met formule X

kan worden bereid volgens methoden die in het algemeen bekend zijn voor de synthese van dit type polypeptiden. De polypeptiden met de hiervoor gegeven formule kunnen bijvoorbeeld als volgt worden bereid: 10 a) tenminste één beschermende groep, die aanwezig is in een beschermd polypeptide met de in formule X gegeven volgorde ,wordt verwijderd, of b)twee peptideeenheden, waarvan elk tenminste één aminozuur of derivaat daarvan bevat, zoals beschreven 15 voor formule X in een beschermde of niet-beschermde vorm, worden met elkaar verbonden via een amidebinding, waarin de peptidebinding op een dusdanige wijze zal worden bereid dat de aminozuurvolgorde die in formule X aanwezig is wordt verkregen en stap a) van de werkwijze wordt daarna desgewenst uitgevoerd, of 20 c) een verbinding met formule X , waarin R een waterstofatoom voorstelt, in een beschermde of niet-beschermde vorm , wordt in reaktie gebracht met een zuur met formule R"C00H of met een reaktief derivaat van een dergelijk zuur en stap a) van de werkwijze wordt desgewenst uitgevoerd, of 25 d) teneinde een verbinding met formule X te verkrijgen, waarin CH^-S-S-CH^-CH-COOH of nh2 CH2-S-S-CH2-CH2-COOH voorstelt , 30 hetzij een verbinding met formule XIX, in een beschermde of niet-beschermde vorm te laten reageren met

een verbinding met formule XIII, waarin R.n een groep voorstelt - £ 1U

die de vorming van een S-S-brug met het S-atoom van de andere CH2SH groep in het peptide met formule XII vergemakkelijkt , 33 Rjj.een waterstofatoom of een aminogroep beschermende groep weergeeft, 8702345 4 Μ - 22 - R^2 een hydroxylgroep of een beschermende groep voor de carboxylgroep is, en V een waterstofatoom of een NH-groep voorstelt, hetzij een verbinding met formule XIV, in een beschermde of niet-beschermde vorm, waarin R^q een hiervoor gedefinieerde betekenis heeft, te laten reageren met een verbinding met formule XV en daarna stap a) van de werkwijze desgewenst uit te voeren.

10

Indien de bereiding van de uitgangsmaterialen niet in het bijzonder is beschreven, zijn deze verbindingen bekend of kunnen volgens gebruikelijke methoden worden bereid en gezuiverd. De eindprodukten met formule X kunnen eveneens op een gebruikelijke wijze worden gezuiverd, zodat ze minder dan 5% polypeptide bijprodukten bevatten. De als uitgangsmaterialen voor de werkwijzen a) en b) toegepaste peptiden kunnen eveneens op een bekende wijze via een in een oplossing of in de vaste fase uitgevoerde werkwijze worden bereid.

2Q De bereiding van peptideeenheden die een -CH2-S-S-CH2-CH2-COOH of CHj-S-S-CH-CHg (NH2)-COOH groep als de Y2 groep bevatten, kan analoog aan de hiervoor beschreven werkwijze d) geschieden.

Volgens deze werkwijze d), past men ^ verbindingen met formule XIII of XIV toe, waarin R^q de bekende groepen weergeeft die met mercaptanen onder vorming van een S-S-binding reageren. R^q is in het bijzonder no2 S-alkyl, -S-C00alkyl, S -/Cfr of S-SO^.

30 In deze groepen is de alkylgroep in het bijzonder een lage alkylgroep met 1-4 kooltofatomen. Het invoeren vah deze groepen in verbindingen met vrije SH-groepen kan analoog aan methoden die bekend zijn uit de zwavelchemie worden uitgevoerd.

Een andere aanbevolen groep verbindingen 35 omvat een groep van LH RH antagonisten.

Bij voorkeur vallen onder cfe verbindingen suikerderivaten van verbindingen met formule XVI, waarin R^ een waterstofatoom of een acylgroep met 1-7 koolstofatomen voorstelt, 8702345 ' τ - 23 - A.J = D-Phe, die desgewenst gesubstitueerd is in de fenylring door fluor, chloor, broom , NI^, CH^ of OCH^, in het bijzonder op de 4-plaats, $-D~naftylalanine > D-Trp, die desgewenst is gesubstitueerd op de 5- of 6-plaats door fluor, chloor* broom, 5 NH£ of OCH3 en/of op de t-plaats isgesubstitueerd door fórmyl of acetyl, proline, 3,4-dehydroproline of D-pyroglutamine, = D-Phe, desgewenst gesubstitueerd door fluor, chloor, broom, NI^» CH^ of CH^O in de fenylring , D-°C-methylfenylalanine, waarvan de 4-plaats desgewenst gesubstitueerd is door chloor of "^HD-naftylalanine.

CJj = D-Trp, waarvan de 5- of 6-plaats desgewenst gesubtitueerd is door fluor, chloor, broom , NH^ en/of OCH^ en/of de 1-plaats door HCO of CH^CO, i^-D-naftylalanine, 3-D-pyridylalanine, D-Tyr, of Phe desgewenst gesubstitueerd door fluor, chloor, broom, NI^» CH^ of CH^O,

Ser, = Tyr, of fenylalanine, desgewenst gesubstitueerd in de fenylring door chloor, broom, NH^, CH^ of ch3o.

2^ F = D-Phe , waarvan de fenylring desge wenst gesubstitueerd is door fluor, chloor, broom, NI^, CH^ of CH^O, D-Trp, waarvan de 5- of 6-plaats desgewenst gesubstitueerd is door fluor, chloor, broom, NH^ of CH^O en/of de 1-plaats door formyl of acetyl, 25 D-Tyr, |b-D-naftylalanine, D-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Val, D-Ser (OtBu), D-Arg, desgewenst gedialkyleerd door alkyl met 1-6 koolstofatomen of cycloalkyl met 5 of 6 koolstofatomen, D-homoarginine, desgewenst gedialkyleerd 5® met alkyl met 1-6 koolstofatomen of cycloalkyl met 5 of 6 koolstofatomen, D-Lys, * D-His (Bzl) of D-Orn, beide desgewenst gedialkyleerd door alkyl met 1-6 koolstofatomen of cycloalkyl met 35 5 of 6 koolstofatomen, D-Phe (P-NH2) of ^-p-aminocyclohexylanaline, 870 2 3 4 5

Ir ** - 24 - G.| = Leu, Nle, Nva, N-^-methylleucine, Trp, Phe, Met of Tyr, H.| = Arg, Lys of Orn, desgewenst gesubstitueerd door alkyl met 1-6 koolstofatomen of cycloalkyl met 5 of 6 koolstofatomen , I^ = Pro, hydroxyproline of 3,4-dehydro- proline, en K1 = D-Ala.

Desgewenst kunnen en worden vervangen door de andere. D en K. kunnen desgewenst Cys zijn , die met een 10 1 , 1 S-S-brug zijn verbonden.

Desgewenst is één van de substituenten D^ en K| Asp of Glu en is de andere Orn , diaminopropionzuur of diaminoboterzuur waarbij rest D^ en door een amidebrug zijn verbonden.

15

Aanbevolen betekenissen zijn: = acetyl of formyl A^ = D-Phe, D-Phe, (p-Cl), jb-D-naf tylalanine, 3,4-dehydroproline, B ^ = D-Phe, desgewenst op de hiervoor beschreven wijze gesubstitueerd, 20 Cï = D“Trp» desgewenst op de hiervoor beschreven wijze gesubstitueerd, D1 = Ser (i) Ei = Tyr of Phe,desgewenst op de hiervoor beschreven wijze ge substitueerd , en indien 25 F,j = D-Phe of Lys of (ii) E.j = D-Phe of Lys indien = Tyr of Phe, desgewenst gesubstitueerd zoals gedefinieerd hiervoor, 2q G,| = Leu H1 = Arg ® I^ = Pro K. = D-Ala

1 I

In de hiervoor genoemde LHRH antagonisten 35 is de suikerrest bij voorkeur gehecht aan de stikstofterminale amino-groep of aan een vrije aminogroep in een zijketen.

De suikerderivaten hebben bij voorkeur de 8702345 < ï - 25 - volgende structuren, waarin I^N-LHRN antagonist een groep van een LHRH antagonist met formule XVI voorstelt: formule XVIa, XVIb, XVIc, XVId, XVIe en XVIf.

In de hiervoor gedefinieerde formules XVIa-XVIf is terwillevm ώ eenvoud shdts één suiker gedeelte aangegeven dat gebonden is aan een aminogroep. Desgewenst kunnen echter meer dan één suikergedeelte aanwezig zijn. Bij voorkeur zijn twee van dergelijke suikerdelen aanwezig.

De uitgangsmaterialen voor de LHRH

10 .....

antagonisten zijn bijvoorbeeld beschreven in EPA 81887 en 201260 A.

Andere aanbevolen polypeptiden zijn: a) oxytocine en vasopressine, evenals de . 8 8 derivaten ervan, bijvoorbeeld Lys -vasopressine en Orn -vasopressine, b) insuline, c) GuRF en de derivaten ervan.

De uitgangsmaterialen en verbindingen volgens de uitvinding kunnen door synthese inch vloeistoffase of in de vaste fase worden bereid. De verbindingen volgens de uitvinding 20 kunnen geschikt verkregen worden door synthese m de vaste fase.

Men heeft nu een bijzonder geschikte werkwijze voor het bereiden van peptidealkoholen gevonden, die aan het koolstofterminale uiteinde van de peptideketen twee alkohol- groepen of één alkoholgroep en een thiolgroep bevatten. De 25 werkwijze is in het bijzonder geschikt voor het bereiden van peptidealkoholen die een koolstofterminale threoninol-, serinol-of cysteinolgroep bevatten.

Voorbeelden van geschikte verbindingen zijn bijvoorbeeld enkele van de hierin beschreven somatostatineverbin- 30 .4· dingen.

Peptidesynthese in de vaste fase is een * £ bijzonder snelle en gunstige methode voor het bereiden van peptiden gebleken en is daardoor een algemeen gebruikelijke methode geworden.

Zoals bekend wordt eerst een aminozuur 35 via zijn carboxylgroep gebonden , onder vorming van een ester- of amidegroep , aan een hydroxylgroep of aminogroep van een onoplosbare , synthetische hars; daarna worden de verdere aminozuren hieraan 8702345 i * - 26 - in de gewenste volgorde toegevoegd en tenslotte wordt het volledige polypeptide van de dragerhars afgescheiden.

Deze synthese verloopt zonder moeilijkheden voor normale polypeptiden met koolstofterminale aminozuren. Polypeptidealkoholen die echter aan het koolstofuiteinde een aminoalkohol in plaats van een aminozuur bevatten, vormen echter niet gemakkelijk een binding met dragerharsen die 0H~ of NH^-groepen bevatten en/of worden niet zo gemakkelijk weer afgescheiden indien de synthese is beëindigd.

10

Het volgende was reeds vroeger voorgesteld als mogelijke vastefasewerkwijzen voor het bereiden van peptide-alkoholen: a) de gebruikelijke bereiding van het overeenkomstige polypeptide dat aan het koolstofuiteinde een 15 aminozuur ( als de ester van een hars die hydroxylgroepen bevat) bevat en vervolgens afsplitsing door reductie, onder toepassing van boriumhydriden, waarbij de carboxylgroep gelijktijdig wordt omgezet in een alkoholfunctie (Amerikaanse octrooischriften 4.254.023/4).

20 , b) Toevoeging van de terminale aminoalkohol als ether aan een hydroxymethylhars, onder toepassing van carbonyldiimidazool en tenslotte, na synthese van het peptide, afscheiding onder toepassing van HC1/TFA of HBr/TFA (Kun-Hwa Hsieh en G.R. Marshall, ACS National Meeting, New Orleans, 21-25. 3.1977). 25

Deze methoden vereisen echter beide drastische afscheidings- of splitsingsomstandigheden.

Men heeft nu gevonden dat het afscheiden van het peptide van de hars , onder gelijktijdige vorming van het koolstofterminale peptidealkohol, onder milde omstandig-30 , heden wordt uitgevoerd mdien de koolstoftermmale aminoalkohol via een acetaalbinding met de hars is gebonden.

* C Volgens de uitvinding wordt de peptide alkohol waarin aan het koolstofterminale uiteinde van de peptide-keten twee alkoholgroepen of één alkoholgroep en een thiolgroep aanwezig is, verkregen door zure hydrolyse van een acetaal van de peptidealkohol en een polymeerhars die formylfenylgroepen bevat.

Dit wordt aangeduid als de synthese volgens de uitvinding. De reaktie 670234» * Tl - 27 - kan schematisch volgens reaktievergelijking A worden aangegeven, waarin (p) de rest van een onoplosbare', synthetische hars voorstelt, 5 Z een direkte binding of een groep die de hars met de (geacetaliseerde) formylfenylgroep verbindt,weergeeft, X = 0 of S, R.j een waterstofatoom of de methylgroep voorstelt en 10 Y de rest van een peptidealkohol is die beschermende groepen kan bevatten, waarin de desgewenst geacetaliseer-de CHO-groep op de m- of p-plaats ten opzichte van de Z-groep aanwezig is. Terwille van de eenvoud is in de formules I en II van het hiervoor genoemde schema slechts één substitutiegroep aan de hars aangegeven; het zal echter duidelijk zijn dat een aantal van dergelijke groepen aan een molecuul van het harspolymeer kunnen zijn gebonden. Het afscheiden van de peptidealkohol van de hars door hydrolyse van de acetaalgroep vindt , zoals hiervoor reeds werd vermeld, onder zure omstandigheden plaats, bijvoorbeeld met verdund trifluorazijnzuur. De hydrolyse kan bij kamertemperatuur worden uitgevoerd.

Indien Z in formule I een direkte binding is, zijn de fenylgroepen die acetaalgroepen bevatten rechtstreeks aan het polymeermolecuul gebonden en behoren tot het polymeer.

Voorbeelden van dergelijke verbindingen met formule I zijn de acetalen van een geformyleerde polystyreenhars (in formule I , (P) is dan een polyethyleenketen).

Indien Z een groep voorstelt, dan bevat deze een groep die het resultaat is van een reaktie van een reaktie- 30 ve groep, die rechtstreeks of indirekt gebonden is aan het polymeer, ^ met een andere reaktieve groep, die rechtstreeks of indirekt gebonden is aan de (geacetaliseerde) formylfenylgroep. De Z-groep kan bijvoorbeeld door formule Illr worden weergegeven, waarin Q. de rest van een reaktieve groep die 35 1 aan het polymeer is gebonden , voorstelt, de rest van een reaktieve groep is die aan de (geacetaliseerde) formylfenylgroep is gebonden , - -1 34 h A * - 28 - D een groep weergeeft die de -groep met het polymeer verbindt, E een groep weergeeft die dè Q2“groep met de (geacetaliseerde) formylfenylgroep verbindt, en ^ p en q, onafhankelijk van elkaar , 0 of 1 zijn.

De Qi “Q2 groeP i-s bij voorkeur een ester- of amidegroep, in het bijzonder een carbonamidegroep. is bij voorkeur NH en Q2 geeft bij voorkeur CO aan.

^ D en E zijn, onafhankelijk van elkaar, bijvoorbeeld alkyleen- of alkyleenoxygroepen met 1-5 koolstofatomen.

Voorbeelden van dergelijke verbindingen met formule Ir waarin Z

een groep met formule Illr is , zijn verbindingen waarin ®-D-Q.J

de rest van een geaminomethyleerde polystyreenhars is en de 15 groep met formule R, I1 /X"CH\ n F /rsV' CEL CH-NH-CO-Y een groep met vE"\y/ νο-οη^ 20 formule IVr is, waarin R een waterstofatoom of de methylgroep en m 0 of 1 voorstellen, waarbij de acetaal- 25 £ groep weer m- of p-geplaatst is.

In dit geval is Z dus een groep met formule -CH -NH-CO-CH-(O) - en (P) is polystyreen

I m R

2Q De groep met formule IVr is bij voorkeur de

^R

X-CH 1

V

* -C0-CH2-0-/oV-CH ch-nh-co-y N 0-CH2 35 In plaats van het geaminomethyleerde poly styreen kunnen eveneens andere polymeren worden toegepast, in het bijzonder die met vrije NH2~groepen , bijvoorbeeld polyacrylamiden 8702345 < ? - 29 - die aminoethylgroepen bevatten.

Zoals hiervoor reeds werd vermeld is de geacetaliseerde formylfenylgroep bij voorkeur via een ainidebinding met het polymeer gebonden. Dit verzekert dat de binding van de geacetaliseerde formylfenylgroep aan de hars tijdens de synthese van het polypeptide en gedurende de scheiding stabiel blijft en dat, zoals gewenst, splitsing of scheiding bij de acetaalbinding plaatsvindt, zodat enerzijds de peptidealkohol wordt gevormd en anderzijds de formylfenylgroep aan de hars aanwezig blijft.

Desgewenst kan de peptidealkohol verder van de hars worden verplaatst door zogenaamde "spacers" tussen de reaktieve groepen van het polymeer ( in het bijzonder aminogroepen) en de reaktieve groepen van het geacetaliseerde formylfenylderivaat (in het bijzonder carboxylgroepen ) op te nemen. Voor bepaalde reakties aan de polypeptidealkohol, kan dit geschikt geschieden voor de afscheiding ( bijv. oxydatie van cysteine-groepen). In dat geval bevat de groep D of E in formule Ilr bovendien de spacer en is of de reaktieve groep van de spacer.

De toegepaste spacer kan bijvoorbeeld een ^-aminocarbonzuur, zoals B-aminocapronzuur, zijn.

In een specifiek geval , bij toepassing van geaminomethyleerd polystyreen, een groep met formule IVr en £-aminocapronzuur als de spacer, is Z een groep met formule 25 -CH„-NH-C0-(CHo)t-NH-C0-CH-(0) - .

2 2 5 | m

R

De verbindingen met formule Ir kunnen worden bereid volgens methoden die gebruikelijk zijn in de in vaste fase uitgevoerde technologie, uitgaande van een verbinding met ory e formule Vr, waarin A een beschermende groep van de aminofunctie is en de acetaalgroep zich op de m- of p-plaats ten opzichte van * groep Z bevindt. Voor dit doel wordt allereerst de beschermende groep A afgesplitst en daarna laat men de vrije aminogroep reageren met het volgende N-beschermde aminozuur enz. , totdat alle 35 aminozuren aan de hars in een volgorde overeenkomende met de gewenste peptidealkohol zijn gehecht.

8702345 « ► - 30 -

De voor de toegepaste aminozuren of voor de aminoalkohol gekozen aminobeschermende groepen moeten groepen zijn die onder niet-zure omstandigheden worden gesplitst, aangezien onder zure omstandigheden hydrolyse van de acetaalgroep plaatsvindt.

5 De CF^CO- of de FMOC-groep (9-fluorenylmethyloxycarbonyl)groep kan bijvoorbeeld als een dergelijke aminogroep beschermende groep worden toegepast. Deze beschermende groepen worden op een wijze die gebruikelijk is in de peptidechemie in een basisch milieu afgesplitst.

10 Alleen de beschermende groep van het laatst toegediende aminozuur mag labiel voor een zuur zijn en wordt dan gelijktijdig van de hars afgesplitst, onder vorming van de peptidealkohol.

Bij voorkeur is de Boc-groep aanwezig.

15 Als basen worden bij voorkeur kaliumhydroxyde, piperidine of NaBH^ toegepast.

De opbouw van de peptideketen kan op een gebruikelijke wijze geschieden uitgaande van een peptidegedeelte met vrije aminogroepen en een aminozuur met vrije of geaktiveerde 20 carboxylgroepen.

De reaktie kan worden uitgevoerd onder toevoeging van bijvoorbeeld hydroxybenzotriazool of dicyclohexyl-carbodiimide.

Verbindingen met formule Vr kunnen bij- 25 voorbeeld worden bereid door a) reaktie van een hars met een aldehyde-groep met formule IIr, waarin de CHO-groep zich op de m- of p-plaats ten opzichte van de Z-substituent bevindt, met een N-beschermde aminoalkohol met formule 30 hx-chr1-ch(nha)-ch2oh , . g desgewenst in een geaktiveerde vorm, of b) reaktie van een hars met formule €>- (D) - q|

35 P

met een verbinding met formule VIr, waarin de acetaalgroep zich op de m- of p-plaats ten opzichte van de Qj - (E)^- groep bevindt en 8702345 * f - 31 - waarin Qj en twee reaktieve groepen zijn, welke samen reageren onder vorming van een - C^-brug.

De acetalisering van werkwijze a) kan geschieden in aanwezigheid van een zuur als katalysator. Onder 5 geschikte zuren vallen p-tolueensulfonzuur en p-trifluormethyl- sulfonzuur. Des-gewenst kan een trimethylsilylgroep als beschermende groep voor een vrije alkohol worden toegepast.

De veresteringswerkwijze b) kan onder zeer milde omstandigheden worden uitgevoerd, bijvoorbeeld 10 door reaktie van een carbonzuurderivaat met een OH- of NH2~groep bevattende polymeer.

De verbindingen met formule VIr kunnen worden verkregen door acetylering van een verbinding met formule 15 Qi - -(e)- CH0 met een verbinding met formule hx-chr1-ch(nha)-ch2oh .

Het acetyleren kan op de wijze als 20 beschreven voor werkwijze a) worden uitgevoerd.

Gedurende het opbouwen en het afsplitsen van de peptidealkohol van de hars, kunnen nog meer reakties worden uitgevoerd, bijvoorbeeld verwijdering van beschermende groepen, bijvoorbeeld S-beschermende groepen, of oxydatie van cysteine-groepen.

Dergelijke reakties kunnen na het afsplitsen van de peptidealkohol in de vloeistoffase worden uitgevoerd.

Volgens de synthesewerkwijze van de uitvinding kunnen farmacologisch aktieve en andere peptiden die aan 30 het koolstofuiteinde twee alkoholgroepen of een alkohol- en ® thiolgroep bevatten, op eenvoudige wijze worden bereid.

In de volgende voorbeelden zijn alle tempe-*"20 raturen uitgedrukt in °C en zijn de waarden niet-gecorrigeerd.

De volgende afkortingen worden toegepast: 35 8702345 - 32 ·· * ¥

AcOH = azijnzuur

Boe = tert.butyloxycarbonyl

Bu1" = tert. butyl DCCI = dicyclohexylcarbodiimide 5 DMF = dimethylformamide

Fmoc = 9-fluorenylmethoxycarbonyl

MeOH - methanol NEt^ - triethylamine

Thr-ol = threoninOlgroep = CH3-CHOH-CH(CH2OH)-NH- 10 TFA = trifluorazijnzuur HOBT = N-hydroxybenzotriazool hpGRF = humaan pancreatisch groeihormoon vrijmakende factor HOSu = N-hydroxy-succinimide <15 Alle peptiden worden verkregen als polyacetaten-polyhydraten met een peptidegehalte van 70-90%.

Uit HPLC analyses blijkt dat de peptiden minder dan 5% andere peptiden bevatten.

De in de volgende voorbeelden vermelde 2o factor "F" geeft het peptidegehalte in de verkregen produkten aan (F-1 komt overeen met een peptidegehalte van 100%). Het verschil tot 100% /,(1 —F) x 100/ wordt gevormd door azijnzuur en water.

Alle suikers hebben de ^-configuratie, 25 tenzij anders vermeld.

Voorbeeld 1; _ _ ΐΛ- fi-despxyfructosyl-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys- I?2El£Z2lï!}El2ll22ë]:22L.5ÏÊ!i_£2S2IilÊ XVII e 30 Men voegde 3 ml trifluorazijnzuur ( 100 %) toe aan 400 mg /N^ - ft-deoxyfructosyl/-D-Phe-Cys-Phe-DTrp-Lys(B0C)-Thr-Cys-Thr-ol en hield dit mengsel op kamertemperatuur, totdat al het uitgangsmateriaal was opgelost ( 5 min.).

Na toevoeging van 20 ml diisopropylether sloeg de in de titel ge-35 noemde verbinding neer , welke verbinding men daarna affiltreerde en uitwaste met diisopropylether. De in de titel genoemde verbinding 8702345 '* Jl - 33 - werd gezuiverd door chromatograferen over silicagel (elutie- raiddel: een mengsel van chloroform, methanol , azijnzuur en water , 7:3:0,5:0,5) en werd als een wit lyofilisaat afgescheiden.

2Ω : -31,3° (c = 0,52 in HOAc 95%) 5 F: 0,88

Het uitgangsmateriaal kan als volgt worden bereid: a) H-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys(BOC)-Thr-Cys-Thr- to 21

Men druppelde bij kamertemperatuur 2,25 g di-tert.butyl-percarbonaat , opgelost in 30 ml dimethylformamide,

langzaam toe aan een oplossing van 10 g H-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-“I

Cys-Thr-ol-acetaat in 100 ml dimethylformamide. Nadat men 15 het reaktiemengsel 2 uren op kamertemperatuur had gehouden verwijderde men het oplosmiddel onder verminderde druk en voegde aan het residu 200 ml diisopropylether toe. Het gevormde neerslag werd afgefiltreerd, gewassen met diisopropylether en gedroogd.

Het ruwe produkt werd chromatografisch over silicagel ( elutie- 20 middel: een mengsel van en methanol, 9:1) gezuiverd en werd vervolgens als een wit, amorf poeder afgescheiden.

2Ω

Oxs" : 29,8° (c= 1,28 in DMF) b) - ft-desoxyfructosyl-DPhe-Cys-Phe-25 DTrp-Lys(BOC)-Thr-Cys-Thr-o1%

Men loste 2 g D-(+)-glucose en 0,5 g van het eindprodukt van stap a) op in 20 ml van een mengsel van methanol en azijnzuur ( 9:1, vol./vol.), en hield dit mengsel 3 uren op een temperatuur tussen 60 en 70°C. Na concentreren door verdampen 30 .

nam men het produkt op m een weinig methanol en sloeg de inde titel genoemde verbinding neer met diisopropylether. De - £ verbinding werd chromatografisch gezuiverd over silicagel ( elutie- middel: een mengsel van en methanol, 9:1).

Men verkreeg een amorf poeder.

35 20 £ct7D - 12,0° (c= 1,04 DMF).

De volgende verbindingen (alle in de vórm 8702345 A * - 34 - van acetaten ) werden analoog aan voorbeeld 1 verkregen( in deze verbindingen geeft SMS de polypeptidegroep -DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-cys-Thr-ol) weer.

5

Voorbeeld 2:

N^-/~0C-glucosyl(1y4)-deoxyfructosyl7~SMS

met_formule_XVIII

Uitgaande van D(+)-maltose in plaats van 10 D-glucose.

20 [AlD = -7,9° (c= 0,71 in AcOH 95%) F : 0,91 .

Voorbeeld 3: N^-Z^-glucosylCl-^-^-glucosylO-O-ffi" i ζ deoxyfructosyl|-SMS met formule XIX .

Verkregen uitgaande van maltotriose in plaats van D-glucose 20 /*7d = + 11,3° (c= 0,71 in 95% AcOH), F : 0,78 20

Voorbeeld 4: Oü N__zfluctofuranuronzuur-SMS_met_formule_XX .

Verkregen uitgaande van D-glucuronzuur in plaats van D-glucoser 25 Γ*ΐΙ° = '29,4° (c= 0,34 in 95 % AcOH), F : 0,88.

Voorbeeld 5; N^deoxysorbosyl-SMS met formule XXI ,

Verkregen uitgaande van D(+)-galactose 30 m plaats van D-glucose - 20 /0(.L· = -30,4° (c= 0,50 in 95% AcOH), F: 0,85.

• £ D

Voorbeeld 6; N^-^Ö- i^~D-glucosyl-(1-4)-deoxyfructosyl/-Verkregen uitgaande van D(+)-cellobiose „ 20 f*ÜO = -28,1° (c=0,47 in 95% AcOH), F:0,81.

8702345 ? f - 35 -Voorbeeld 7: lf^-L(-)-deoxyfructosyl-SMS met formule XXIII. Verkregen uitgaande van L(-)-glucose in plaats van D(+)-glucose .

5 1^1° = -20° (c= 0,46 in 95% AcOH), F: 0,91.

Voorbeeld 8; N**- ZÓ- -D-glucosyl- (1 -6 ) -deoxyfructosyl7- SMS met formule XXIV_ ^ Verkregen uitgaande van gentiobiose in plaats van D-glucose · on f'XT" = 23,5° (c= 0,46 in 95% AcOH), F: 0,76.

Voorbeeld 9: ^ N^-ZÓ- |^-D-galactosyl-(1-4)-deoxyfructosyl/- SMS met_formule XXV_

Verkregen uitgaande van P(+)-lactose in plaats van D-glucose.

/oi7p°= -29,3° (c- 0,55 in 95% AcOH), F: 0,83.

20

Voorbeeld 10:

Zn— (0—ft. -galactosyl-(1-6)-deoxyfructosyl)- (D)Phe1J-SMS met formule XXVI „

Verkregen uitgaande van melibiose in 25 plaats van D-glucose.

20 J0C7d “ +8,4° (c= 0,5 in 95% AcOH) , F: 0,76 „

Voorbeeld 11: __ /Ji-(1-deoxy-D-fructosyl)-Tyr-7-SMS met for- 30 mule XXVII .

3 • £ Verkregen uitgaande van Tyr -SMS m plaats van SMS.

20 -32,2° (c= 0,9 in 95% AcOH), F:0,87.

35

Voorbeeld 12: /N~C -D-glucopyranosy1-(1-4)-1-deoxy-__ fructosyl), Tyr^J-SMS met formule XXVIII ^ 8702345 * k - 36 -

Verkregen uitgaande van D(+)-maltose 3 in plaats van D-glucose en Tyr -SMS m plaats van SMS.

£*jl° = , F : 0,81 5 Voorbeeld 13;

De verbinding met formule XXIX *

Deze verbinding werd verkregen uitgaande van D-glucoheptose in plaats van D-glucose.

20 ΓΜ7η = "12,9° (c=1,0 in 95% AcOH) , F= 0,91.

10 D

Voorbeeld 14:

De verbinding met formuleXXX .

Deze verbinding werd verkregen uitgaande 15 van D(+)-glucose en SMS, dat geen beschermende groep aan de L-NH2 groep van lysine bevat .

C<X7¾0 = -42,4° (c= 0,37 in 95% AcOH), F = 0,83 .

Voorbeeld 15: 20 De verbinding met formule XXXI .

Deze verbinding werd verkregen uitgaande van glucoheptose en SMS, dat geen beschermende groep aan de t-NH^- groep van lysine bevat.

_ 20 ί°ϋΌ - -9,3° (c= 0,41 in 95% AcOH), F= 0,84.

25

Voorbeeld 16;

Fructosyl-6-fosfaat-SMS met formule XXXII.

Deze verbinding werd verkregen uit D- glucose-6-fosfaat in plaats van D-glucose 30 - 20 /0(7d = -19,5° (c= 1,0 in 95% AcOH), F= 0,89 .

® Voorbeeld 17: D£_YÊEbinding_met_formule_XXXIIIi._ 35 Deze verbinding werd verkregen uitgaande van D-ribose in plaats van D-glucose.

C°<]i0 -31,8” (c= 1,0 in 95Z AcOH).

8702345 ϊ τ - 37 -

Voorbeeld 18; -deoxyfructosyl-(D)Phe-Cys^COC(CH^)

Phe-(D)-Trg-Lys-Thr-Cys /COC(CH^) ^7-Thr-ol, 5 a) deoxyfructosyl-(D)Phe-éys-Phe-(D)Trp-

Lys (BOCj-Thr-Cys-Thr^-ol .

Men mengde 0,58 g van de verbinding van voorbeeld t in 10 ml dimethylforrnamide met 0,08 ml triethylamine en daarna met 0,12 ml (B0C)_0. Vervolgens roerde men het mengsel 10 1 ongeveer 15 uren bij kamertemperatuur, concentreerde onder verminderde druk en roerde met ether. Het neergeslagen produkt werd afgefiltreerd.

Het residu werd opgelost in weinig methanol, waarna het produkt door toevoegen van water werd neergeslagen. Het produkt werd afgefiltreerd, met een weinig water gewassen, gedroogd en aldus werd de in de titel genoemde verbinding verkregen.

/"*_7d2°= +44,5° (C = 0,7 in BMF).

b)-deoxyfructosyl-(D)-Phe,-Cys-Phe-(D)Trp-Lys(BOC)-Thr-Cys-Thr-ole 20 Men mengde 0,51 g van het eindprodukt van stap a) in een mengsel van 10 ml dioxan en 2 ml triethylamine- azijnzuurbuffer , pH 8,6 , inken argonatmosfeer met in totaal 0,4 g dithioerythritol. Daarna roerde men het mengsel ongeveer 15 uren bij kamertemperatuur en concentreerde onder verminderde druk.

25 Het neergeslagen produktwerd afgefiltreerd. Het residu werd gewassen met een weinig water en daarna onder verminderde druk gedroogd. Aldus verkreeg men de in de titel genoemde verbinding.

20

Ck7O = + 3,8° (c= 0,8 in DMF).

30 c) N ^ -deoxyf ructosyl- (D) Phe '-CysfcOC (CH^)^-

Phe- (D ) Trp-Ly s(BOC) -Thr-Cys £C0C ( CH3 ) ^/-Thr-o 1.

Men loste in een argonatmosfeer 0,38 g van het eindprodukt van stap b) op in 25 ml N-methylpyrrolidon, mengde daarna bij 0°C met 0,3 ml N-methylmorfoline en 0,31 ml pivaloyl-35 chloride en roerde nog ongeveer 16 uren bij 0°C. Het produkt werd geroerd met een mengsel van ether en diisopropylether. Het neergeslagen produkt werd afgecentrifugeerd. Het residu werd opgelost met een 8702345 * - 38 - weinig dimethylformamide en het produkt werd door toevoegen van methanol en water neergeslagen. Vervolgens werd het produkt gecentrifugeerd. Het residu werd onder verminderde druk gedroogd en verder , zonder verdere zuivering, toegepast.

5 d) N~*-deoxyfructosyl-(D)Phe-Cys/COC(CH^)

Phe- (D)Trp-Lys-Thr-Cys/CQC (CH^^-Thr-ol.

Het residu van stap c) werd bij 0°C opgelost in 5 ml van een mengsel van TFA en water (9:1) en werd ^ 15 min geroerd. Het produkt werd neergeslagen door een mengsel van ether-10% 5n HCL-ether toe te voegen. Het produkt werd afgefilteerd, gewassen met ether en gedroogd. Het redisu werd gezuiverd door chromatograferen over silicagel in een mengsel van chloroform, methanol, azijnzuur en water. De fracties die het gewenste produkt bevatten 15 werden samengevoegd, onder verminderde druk geconcentreerd onder toevoegen van water en daarna gelyofiliseerd. Aldus verkreeg men de in de titel genoemde verbinding.

= "15,3° (c= 1,0 in 95% AcOH) , F: 0,88.

20 Voorbeeld 19: 2-/~(D) Phe-Cy s-Phe- (D) Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-2ΐ2ΐ2ΐ^22£Σΐ3ΐ£ΐ22222 -

Men loste 2 g D(-)-fructose en 1 g H-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys(B0C)-Thr-C\?s-Thr-ol (bereid op de wijze 25 als beschreven in voorbeeld 1a) op in 100 ml van een mengsel van methanol en azijnzuur ( 9:1) en hield dit mengsel 16 uren op 65°C. Na concentreren door indampen loste men het produkt op in een weinig methanol en sloeg het ruwe produkt neer metéiiso- / ^ própylether. Het aldus verkregen ruwe produkt werd zonder verder te zuiveren toegepast ter afscheiding van de beschermende groep (B0C . g afsplitsing).

Men mengde 1 g van het aldus verkregen ruwe produkt met 20 ml trifluorazijnzuur ( 100%) en hield dit mengsel op kamertemperatuur totdat het gehele uitgangsmateriaal was opgelost ( 5 min.). Door toevoegen van 200 ml diisopropylether sloeg de in de titel genoemde verbinding neer,, waarna deze werd 8702345 3 * - 39 - afgefiltreerd en met diisopropylether werd gewassen. De in de titel genoemde verbinding werd gezuiverd door chromatograferen over silicagel ( elutiemiddel: CHCl3/Me0H/H0Ac/H20 7:3:0,5:0,5) en werd als een wit lyofilisaat geïsoleerd.

Of) 5 " "6»7° (c= 0,3 in H0Ac 95%) . F: 0,73 -

Er kan een tweede produkt, het volgende 1:1 mengsel van isomeren met formule XXXV met dè iiwerse configuratie aan C0 van het koolhydraatgedeelte worden verkregen.

10 Voorbeeld 20: 3 2-ftTyr -SMs7~2-deoxy-D-glucose met formule

XXXVI

Analoog aan voorbeeld 19 uitgaande van 3

Tyr SMS m plaats van SMS werd de in de titel genoemde verbinding ^ verkregen.

[c(]f - (c- ), F-0,95.

Voorbeeld 21: glucuronzuuramide van H-DPhe-Cys-Phe-DTrp- 20 -1

Lys-Thr-Cys-Thr-ol met formule XXXVII ·

Men behandelde 170 mg van het glucuronzuuramide van H-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys(BOC)-Thr-Cys-Thr-ol met 3 ml 100% trifluorazijnzuur totdat een volledige oplossing werd verkregen ( 5 min). Daarna werd de in de titel genoemde verbinding als trifluor-25 acetaat neergeslagen door toevoeging van 20 ml diisopropylether en na filtreren , drogen.en vervolgens chromatograferen over silicagel (elutiemiddel: een mengsel van chloroform, methanol, azijnzuur en water, 7:3:0,5:0,5) , werd de in de titel genoemde verbinding in zuivere vorm als een wit lyofilisaat (acetaat) afgescheiden, on 20 C\T" - -29,2 (c= 0,48 in HOAc 95%) F: 0,85 .

Het uitgangsproduct kan als volgt worden verkregen:

Men voegde een oplossing van 135 mg DCCI in 2 ml dimethylformamide toe aan een oplossing, afgekoeld tot -30°C, van 450 mg H-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys(BOC)-Thr-Cys-Thr-ol, 25 117 mg glucuronzuur en 135 mg HOST in dimethylformamide. Na 48 uren, onder gelijktijdig oplopen van de temperatuur tot kamertemperatuur, filtreerde men het verkregen dicyclohexylureurn af en sloeg de in de 8702345 ί » - 40 - titel genoemde verbinding neer door toevoegen van 20 ml diiso-propylether. Na filtreren, drogen en chromatograferen over silicagel (elutiemiddel een mengsel van en methanol , 9:1.) , werd de in de titel genoemde verbinding in zuivere vorm afgescheiden.

5 /¾¾° + 16,7° (c= 0,50 in DMF).

Voorbeeld 22: het_chininezuuratnide_vari_H—DPhe—

Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol met formule XXXVIII

10 De in de titel genoemde verbinding werd analoog aan voorbeeld 21 verkregen, uitgaande van L(-)-chininezuur.

- -20 /0(./ = -50° (c= 0,44 in 95% AcOH), F: 0,97.

Voorbeeld 23: 15 het_sialinezuuramide_van_H-DPhe-_

Cys-Phe-DTrp-Lyg-Thr-Cys-Thr^oljmet formule XXXIX .

De in de titel genoemde verbinding werd analoog aan voorbeeld 21, uitgaande van sialinezuur , verkregen.

- 20 /0^7 -60,8° (c= 0,6 in 95% AcOH), F: 0,95.

20

Voorbeeld 24: tft-(0- ^-D-glucosyl-oxyacetyl)-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol met formule XL «

Men loste 250 mg (tetra-O-acetyl-O-i^-D-25 glucosyl)-oxyacetyl-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-(BOC)-Thr-Cys-Thr-ol op in 10 ml methanol en stelde de pH ervan met enkele druppels van een 1N natriummethanolaatoplossing in methanol in op 10. Na 15 min reageren neutraliseerde men de oplossing met een ionenuitwisselaar (bijvoorbeeld AMBERLYST 15, H ) en filtreerde de ionenuitwisselaar 30 af. Het filtraat werd geconcentreerd en het residu werd 5 min behandeld met 3 ml trifluorazijnzuur. De in de titel genoemde verbin-® ding werd als trifluoracetaat neergeslagen door toevoeging van 20 ml diisopropylether en werd na filtreren in zuivere vorm als een wit lyofilisaat afgescheiden , gedroogd en gechromatografeerd 35 over silicagel( elutiemiddel: chloroform, methanol, azijnzuur en water, 7:3:0,5:0,5) .

8702345

* V

- 41 - -20

Cjj£ = -39,2° (c= 0,60 in HOAc 95%) F: 0,911

Het uitgangsmateriaal kan als volgt worden bereid: ' 5 a) De benzylester van tetra-O-acetyl-0- ft-D-glugosyl-glycolzuur.

Men voegde 2,5 g moleculaire zeef poeder van 4 A toe aan een oplossing van 830 mg van de benzylester van glycolzuur in 50 ml en druppelde na toevoegen van 2,8 g zilvertrifluormethaan.sulfonaat een oplossing van 4,1 g acetobroomglucose in 50 ml CH^Cl^ toe. Na 15 min. beëindigde men de reaktie met 4 ml pyridine, filtreerde de vaste bestanddelen af en schudde het filtraat uit met een 10%-ige natriumwaterstof-15 sulfaatoplossing. De in de titel genoemde verbinding werd in zuivere vorm na chromatograferen over silicagel ( elutiemiddel: een mengsel van CH„C19 en methanol, 99:1) afgescheiden. ffXl" = -22,4° (c= 1,7 in CHC13).

20 N ft b) Tetra-Q-acetyl-Q-/7 -D-glucosyl-__ glycolzuur„

Men loste 800 mg van de benzylester van tetra-O-acetyl-O-^-D-glucosyl-glycolzuur op in 40 ml van een ^ mengsel van gelijke volumedelen ethanol en water en mengde dit mengsel met 400 g 10%-ige palladium op aktieve houtskool. Door hydrogeneren in een "PARR-inrichting" bij 50 psi verkreeg men de in de titel genoemde verbinding, die men na filtreren en concentreren onder verminderde druk in kristallijne vorm afscheidde.

2Π 3Q fOC?^ = -35,5° (c= 1,03 in MeOH).

c) N^-(tetra-O-acetyl-O-ft-D-glucosyl-oxyacetyl)—DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys(BOC)-Thr-Cys-Thr-ol.

Men voegde aan een oplossing van 81 mg 35 tetra-0-acetyl-0- 1^-D-glucosyl-glycolzuur, 225 mg H-DPhe-Cys-Phe — ........ ........

DTrp-Lys(BOC)-Thr-Cys-Thr-ol en 45 mg Η0ΒΤ in 2 ml dimethylformamide, afgekoeld tot -30°C, 45 mg DCCI , opgelost in 1 ml dimethylformamide, toe. Na 48 uren en oplopen van de temperatuur tot kamertemperatuur 8702345 1 > - 42 - filtreerde men het verkregen dicyclohexylureum af en sloeg de in de titel genoemde verbinding uit het filtraat neer door toevoegen van 20 ml diisopropylether.

Eveneens werden de volgende verbindingen ^ analoog aan voorbeeld 24 bereid ( in deze voorbeelden stelt SMS

de -DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol groep voor).

Voorbeeld 25: -(0- ft-D-galactosyl-oxyacetylj-SMS met ^ ^ formule XLI.

20 = -37,5° (c= 1 in 95% AcOH) F: 0,95 Voorbeeld 26: -(0-p -cellobiosy1-oxyacety1)-SMS met ^ formule_XLII ^ “ 20 £0Ü^ = -32,5° (c= 1 in 95% AcOH) F: 0,91

Voorbeeld 27:

N^-(0-?i -(D)-glucosyl-oxyisobutyryl)-SMS

20 meü_formule_XLIXI „ ————— A7d = -32,9° (c= 1 in 95% AcOH) F:0,93. Voorbeeld 28: 25 (D)_-glucosy l-^-_(L)_-oxy isovalerylj- SMS met formule XLIV , -20 = -44,3° (c= 1 in 95% AcOH) F:1,00. Voorbeeld 29: 30 /jj-acetylmuramyl-(D)Phe J-SMS met for- mule_XLV .

- £ 20 = "15>4° (c= °’13 in 95% Ac0H> F:0,9. Voorbeeld 30: 35 jb-p-Glucosyl-thiocarbamoyl-SMS met for

mule XLVI

Men behandelde 620 mg E-Fmoc-SMS in 50 ml 8702345 * Λ - 43 - van een mengsel van CH^CN en water ( 3:1) met 0,45 ml triethyl- amine . Daarna voegde men 272 mg 2,3,4,6-tetra-O-acetyl- P-D- glucosyl-isothiocyanaat toe en hield de temperatuur van het mengsel 1 uur op kamertemperatuur. Het mengsel werd onder verminderde 5 druk ingedampt en het residu werd opgenomen in een weinig methanol en behandeld met diisopropylether, waarna het produkt in een vrij-wel zuivere vorm neersloeg.

Ter afsplitsing van de Fmoc groep en de acylgroep werd het produkt in 50 ml absolute methanol behandeld 10 met een katalytische hoeveelheid van een 1N oplossing van natrium- methanolaat in methanol. Na 30 min. was de reaktie voltooid (volgens dunnelaagchromatografie), het mengsel werd geneutraliseerd met 1%-ige azijnzuur en onder verminderde druk ingedampt. Het residu werd opgenomen in water en geextraheerd met ethylacetaat. De 15 waterfase werd gelyofiliseerd. Het residu werd gezuiverd over silicagel en gedemineraliseerd over bijvoorbeeld Duolite. De in de titel genoemde verbinding werd verkregen als een lyofilisaat.

.-20 [0(ίΏ" = -48,5° (c= 1,95% AcOH) F= 1

Het uitgangsmateriaal £-Fmoc-MS kan als 20 volgt worden verkregen:

Men behandelde 5 g SMS-acetaat en 5 g natriumwaterstofcarbonaat in 100 ml van een mengsel van dimethyl-formamide en water (3:1) met 1,6 g Fmoc-HOSu. Nadat men het reaktiemengsel een uur op kamertemperatuur had gehouden verdunde 25 men het mengsel met 400 ml water en extraheerde met 250 ml van een mengsel van ethylacetaat en methanol ( 95:5). De organische fase werd met natriumsulfaat gedroogd en geconcentreerd. Na kolomchromato-grafie over silicagel verkreeg men het uitgangsmateriaal als een amorf materiaal.

30 r· 20 C«JO - 24,3° (c= 1,13 DMF)

De volgende produkten kunnen op een analoge * wijze als beschreven in voorbeeld 30 worden verkregen.

35 Voorbeeld 31:

Cellobiosylthiocarbamyl-SMS

Uitgaande van octa-acetyl-cellobiosyl-- _ 20 isothiocyanaat . Formule XLVII, :-4,3°(c= 1 in AcOH), F=0,87.

8702345 1 ' - 44 -

Voorbeeld 32: D—Glucos^lcarbamoYl—SMS ,

Uitgaande van2,3,4,6-tetra-0-hcetyl- β-D- glucosyl-isocyanaat.

20 5 Formule XLVIII,&7D :-39,9 (c=1 in 95%

AcOH) F- 0,81.

Voorbeeld 33:

Cellobiosylcarbamoyl-SMS_ 10

Uitgaande van octa-acetyl-cellobiosyl- isocyanaat.

Formule XLI- -37,9° (c=1 in 95% AcOH ) F= 0,85.

^ Voorbeeld 34: il?225ïl5l£2Eki2Yil§MS jnet_formule_L *

Mm behandelde 0,5 mg van de in de titel genoemde verbinding van voorbeeld 1 in 50 ml methanol eerst met 2Q natriumboriumhydride en daarna met 5%-ige azijnzuur onder dusdanige omstandigheden, dat de pH niet hoger werd dan 7. De totaal gebruikte hoeveelheid natriumboriumhydride was ongeveer 10 equivalenten.

Nadat een volledige reaktie had plaats- 22 gehad ( 4-5 uren) behandelde men het mengsel met azijnzuur teneinde de overmaat natriumboriumhydride te ontleden. Het mengsel werd onder verminderde druk geconcentreerd. Het residu werd gedeminera- liseerd met bijvoorbeeld Duolite en over silicagel gezuiverd.

De hoofdverbinding naast 1-desoxy-D-mannityl-SMS is de in de oQ titel genoemde verbinding, die als lyofilisaat werd verkregen.

-20 s _17»6 ° (c- 1 in 95% AcOH F= 0,82.

• £

Voorbeeld 35: H-D-glucosyl(1-4)deoxysorbityl-SMS , 35 Op analoge wijze als beschreven in voorbeeld 34 werd uitgaande van de in de titel genoemde verbinding van voorbeeld 2 de volgende verbinding met formule LI verkregen.

8702345 -45 -

< I

20 ÜOÜ^ = + t,6° (c- 1 in AcOH) , F= 0,9.

Voorbeeld 36: -: 1,2-dideoxy-sorbity1-SMS niet formule LIT , 5 Men behandelde 0,55 g Boc-SMS in 30 ml van een mengsëL van dioxan en water ( 3:7) met 50 mg NaBH^CN.

Daarna voegde men 250 mg 2-deoxy-D-glucose toe·. De pH van het mengsel werd met 0,1 ml zoutzuur ingesteld op 7, waarna het mengsel 6 uren werd verhit op 100°C. Daarna werd het mengsel afgekoeld, IQ bevroren en gelyofiliseerd. Het residu werd opgenomen in ethyl- acetaat ( 50 ml)en geschud met water. De organische fase werd gedroogd en onder verminderde druk ingedampt. De Boc-groep werd op een gebruikelijke wijze met TFA afgesplitst. Het produkt werd gezuiverd over silicagel en gedemineraliseerd met bijvoorbeeld 15 Duolite waardoor de in de titel genoemde verbinding werd verkregen.

20 ίΛ 7d = 25,5° (c= 1 95% HOAc) F- 0,83.

Op analoge wijze kunnen verbindingen van de voorgaande voorbeelden 34 (uitgaande van glucose) en 35 (uitgaande van maltose) worden bereid.

20

Voorbeeld 371 υί _ri aocSEESY l~de s (1^-4) - Al a^AN £- (1 -de oxy- ] I ί g ———— — - fructosyl)-Lys *_ Jzalmcalcitonine met formule LIII4 25 Men loste 10,3 g N^-isocaproyl-des(1-4)- /Ala^7zalmcalcitonine,polyacetaat en 1,8 g D(+)-glucose op in een mengsel van 94 ml dimethylformamide en 6 ml azijnzuur. Nadat men het reaktiemengsel 2 uren op 50°C had gehouden sloeg men het produkt volledig neer door toevoegen van ether, zoog daarna af, 30 waste met ether en droogde onder verminderde druk . Het zuiveren geschiedde door ongeveer 5-10 g van het produkt op te lossen in * water, de oplossing toe te voegen aan een kolom met omgekeerde fase 4 x 25 cm, 018 met silicagel en te chromatograferen met een gradient van water en 0-80% van een mengsel van oplosmiddelen dat 38 delen 35 water, 60 delen acetonitril en 2 delen 85%-ige fosforzuur bevat.

De frakties die het zuivere produkt bevatten werden samengevoegd, gefiltreerd over een kolom van ongeveer 100 ml van een zwak basische 8/0234$ - 46 - I * ionenuitwisselaar in acetaatvorm en gewassen met water. Het filtraat werd gelyofiliseerd en de in de titel genoemde verbinding werd als het polyacetaat.polyhydraat verkregen.

[0( 7p° = -34,8° (c= 0,73 in CH^OOH 95% ) 'F: 0,93. * 5 FAB massaspectroscopie 3407 (MH+).

Het als uitgangsmateriaal toegepaste -isocaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-N^ kan op de volgende wijze worden bereid: a) N^^isocagro^l-Ser (Bu^)-Thr (Bu^)-Ala-Val—Leu—0CH.2~fen2l^E).0CH2~co—_Cgol2St^reen—i%—divin^lbenzeen) .

Hen liet 1 g p-hydroxymethyl-fenoxymethyl- co(polystyreen-1%-divinylbenzeen) opzwellen in een mengsel van di-15 methylformamide en methyleenchloride ( 1:4,vol./vol.) , zoog af en mengde met een oplossing van 0,74 g Fmoc-leucine en 0,19 g 1-hydroxy-benzotriazool in 5 ml van het hiervoor genoemde mengsel van oplosmiddelen. Daarna voegde men onder roeren 0,43 g dicyclohexyl-carbodiimide en 85 mg 4-dimethylaminopyridine , elk in 5 ml van 20 hetzelfde oplosmiddelmengsel., toe. Het mengsel werd 16 uren geroerd bij 20°C, afgezogen en gewassen met het oplosmiddelmengsel en daarna met dimethylformamide . Men verkreeg Fmoc-Leu-OCH^-fenyl-(p)-OC^-co(polystyreen-1%-divinylbenzeen).

De N -Fmoc groep werd van het Fmoc-Leu- 25 OC^-feny 1-(pJOC^-co (po lystyreen-1 %-diviny lbenzeen) (1,56 g overeenkomende met 0,7 m.mol) afgesplitst door 10 min te behandelen met piperidine in dimethylformamide ( 20% , vol./vol.). Men waste goed uit met dimethylformamide en voegde daarna 0,71 g Fmoc-Val-OH, 0,28 g 1-hydroxybenzotriazool en 0,32 ml diisopropylcarbodiimide, 30 ...

elk opgelost m 5 ml dimethylformamide , toe. Na 45 min. werd het mengsel afgezogen en de peptidehars goed gewassen met dimethylformamide. Het afsplitsen van de I^-Fmoc groep werd herhaald, evenals de koppeling met het aminozuur dat in de reeks volgt, in de gegeven volgorde:

^ Fmoc-Ala-OH (0,65 g) , Fmoc-Thr(But)-0H

(0,83 g) en Fmoc-Ser(Bu )-0H (0,80 g ). In de laatste reaktiekring-loop (afsplitsing van de Fmoc beschermende groep, acylering met een 8702345 * τ - 47 - beschermd aminozuur) werd het aminozuurderivaat vervangen door isocapronzuur ( 0,41 g), de hoeveelheid 1-hydroxybenzotriazool verhoogd tot 0,53 g en die van diisopropylcarbodiimide tot 0.54 g en het koppelen geschiedde gedurende 15 uren. De beschermende 5 peptidehars werd goed gewassen met dimethylformamide en methyleen- chloride, 15 uren onder verminderde druk bij 40°C gedroogd en de beschermde peptidehars werd als een kleurloos poeder verkregen.

b) N -isocaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-OH , 10 Men roerde 1,0 g fK-isocaproyl-Ser(Bu )-

Thr (Bu^-Ala-Val-Leu-OCï^-fenyl- (pJOC^-co (polystyreen-1 %-divinyl-benzeen) in een mengsel van 5 ml trifluorazijnzuur en 5 ml methyleen-chloride. Het produkt werd afgefiltreerd, gewassen met 5 ml van hetzelfde mengsel en daarna met methyleenchloride, in sterke 15 mate onder verminderde druk geconcentreerd en door toevoegen van ether geheel neergeslagen. Het neerslag werd goed uitgewassen met ether, gedroogd onder verminderde druk boven vast kaliumhydroxyde en de in de titel genoemde verbinding werd als een kleurloos , amorf poeder verkregen.

20 y .

c) N-isocaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-LysCBocj-Leu-Ser-Gln-GluCOBu^j-Leu-His-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-HH^ (

Men voegde aan een oplossing van 0,165 g 25 N -isocaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-OH in 7 ml dimethylformamide 0,59 g H-Gly-Lys(Boci-Leu-Ser-Gln-GluCOBu^-Leu-His-Lys(Boc)-Leu-

Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2.hydrochloride, 0,017 g 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine, 0,065 g dicyclohexylcarbodiimide en voldoende N-ethyl-N,N-diisopropylamine 30 toe on ineen monster van het reaktiemengsel op bevochtigd pH papier een reaktie bij een pH van ongeveer 6 aan te tonen. Na 16 uren werd * het mengsel door toevoegen van ether neergeslagen, gedroogd en verkreeg men de in de titel genoemde verbinding.

35 . sv d) N_-isocaproyl-Ser-Thr-Ala-yal-Leu-Gly-^

Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr- 8702345 I \ - 48 -

Men loste 0,50 g van het gedeeltelijk beschermde peptide van stap c) op in een mengsel van trifluorazijn- zuur ( 50%, vol. /vol.) en methyleenchloride. Na 1 uur.; voegde men 50 ml ether die 0,6 m.mol waterstofchloride bevatte toe. Het 5 mengsel werd gefiltreerd, gewassen met ether en onder verminderde druk gedroogd. Het produkt werd gezuiverd door "omgekeerde fase" chromatografie in een gradient van acetonitril in fosforzuur (2%).

De gecombineerde fracties die het zuivere materiaal bevatten werden gefiltreerd over een basische ionenuitwisselaar in acetaatvorm.

10 Het filtraat werd gelyofiliseerd en de in de titel genoemde verbinding werd verkregen als het polyacetaat.polyhydraat.

- -20 1<KJD = -32,2° (c= 0,3 in AcOH 95% ) F = 0,87.

Voorbeeld 38: 15 N^isocaproyl-des-^l-^-ZAla^, N-(o(.-D- 11 18 —~ glucosyl(1-4)-deoxyfructosyl)-Lys * Jzalmcalcitonine met formule_

LIV

Het overeenkomstige di-N^ -maltulosylderi-vaat werd analoog aan voorbeeld 37 verkregen onder toepassing 20 van D(+)-maltose.monohydraat m plaats van D(+)-glucose. De reaktie- tijd bij 50°C werd verlengd tot 15 uren. Het afscheiden en zuiveren geschiedde op overeenkomstige wijze en de in de titel genoemde

verbinding werd verkregen als het polyacetaat.polyhydraat, FAB

massaspectroscopie: 3730,9 (MH+), 25 20 [χ]Ώ = -15,2° (c= 0,16 in 95% AcOH) F= 0,97

Analoog aan voorbeeld 37 werden de volgende verbindingen bereid:

Voorbeeld 39:

Lys^7-zalmcalcitonine (5-32)amide met formule LV _ - £ ------------------------------------------- ✓ 20 ιοί= -40,0° (c= 0,27 in AcOH 95%) F- 0,84.

35 8702345 * » - 49.-

Voorbeeld 40:

Lys^ ^-N^Lys^N^ -tris-f 1-deoxyfructosyl)-zalmcalcitonine met formule LVI e 20 /0C7d = -5,3° (c= 0,38 in AcOH 95%), F= 0,75

Voorbeeld 41: Οι .

N -isocaproyl-des(1-4)_-/N-(1-deoxyfructosyl)- 7 1 ί -j g ——— — — —

Lys *__* Jzalmcalcitonine-(5-32)amide met formule LVII .

- F = 0,84

Voorbeeld 42: fl^-chinoyl-ZAla 7zalmcalcitonine-(5-32)- amide met formule LVIII .

De in de titel genoemde verbinding werd analoog aan voorbeeld 21 bereid.

- -20 40Ud = -35,7° (c= 0,37 in AcOH 95%) F: 0,88 .

Voorbeeld 43: ^-chinoyl-ZAla^7zalmcalcitonine-(4-32)- amide met formule LIX .

De in de titel genoemde verbinding werd analoog aan voorbeeld 21 bereid.

" 20 #7 = -39,3° (c= 0,29 in 95% AcOH) F: 0,89 ,

De peptide uitgangsmaterialen fklaj-zalmcalcitonine-(5-32)-amide en /Ala _7-zalmcalcitonine-(4-32)-amide die nodig zijn voor het bereiden van de voorbeelden 42 en 43 kunnen analoog aan het uitgangsmateriaal van voorbeeld 37 worden * verkregen.

Voorbeeld 44: /H-deoxy-fructogyl-Cys j/-oxytocine met formule LX .

Men loste 0,5 g D(+)-glucose en 0,5 g oxy- 8702345 1 * - 50 - tocine op in 50 ml van een mengsel Aan methanol en azijnzuur (9:1) en hield het mengsel 3 uren op 65°C. Daarna concentreerde men de oplossing door verdampen, chromatografeerde over silicagel en bevrijdde het mengsel van zouten over Duolite (water- ^ ethanol-azijnzuurgradient). Men verkreeg een wit lyofilisaat.

~ -20 L0Uo = -23° (c= 0,32 in 95% HOAc) F: 0,95

Voorbeeld 45:

Ac- (D)-Phe (4-CD- (D)Phe (4-Cl·)- (D)Trp-Ser-10 IZIliS 1ϊ;Σ Ξ jne t _f o rmul e .

Men loste 60 g Ac-(D)Phe(4-Cl)-(D)Phe(4-Cl)- (D)Trp-Ser-Tyr-(D)-Lys-Leu-Arg-Pro-(D)Ala-NH2 en 72 mg D(+)glucose

op m een mengselvan 10 ml methanol en 1 ml azijnzuur en roerde I

ongeveer 20 uren bij 80°C. Het produkt werd met ether neergeslagen en afgecentrifugeercLHetresidu werd opgelost in ongeveer 100 ml water en de pH werd met een verdunde natriumhydroxydeoplossing ingesteld op 8. Het produkt werd geadsorbeerd aan een kolom Duolite ES 861 en geelueerd met een gradient van water —► dioxan-water-azijnzuur ^ (60:40:3). De fracties die hetgpwenste produkt bevatten werden onder verminderde druk geconcentreerd en daarna gelyofiliseerd. Men verkreeg de in de titel genoemde verbinding.

- 20 £0(7 = -25° (c= 0,5 in 95% AcOH) F: 0,83.

Voorbeeld 46: 25 N^29_fcr£g Q,je0XyfyuCt.QSyl)-__ varkensinsuline .

Men roerde een suspensie van 1 g (0,17 m.mol) en 0,47 g(2,6 m.mol) glucose in 10 ml dimethylformamide-30 azijnzuur ( 9:1)1 uur op 60°C. Daarna verwijderde men het oplosmiddel onder hoog-vacuum bij 30°C. Het residu werd opgelost in 300 ml water, de pH werd ingesteld op 7 en het mengsel werd geleid door een kleine ontmineraliserende kolom (Duolite ES 861 2,5x15 cm).

De glucose werd geelueerd met water en het peptide door een mengsel 35 van isopropanol , water en ethylacetaat ( 59:39:2) .

Het oplosmiddel werd verwijderd en het mengsel werd gelyofiliseerd. Het residu werd opgenomen in 300 ml 8702345 * t - 51 - water en gezuiverd door in omgekeerde fase uitgevoerde chromatografie.

( 2 x 25 cm kolom, RP 18, 10 nm, Buffer 57m,mol NaC10^, 20 m.mol triethylamine, 8,4 m.mol fosforzuur, pH 3 met. 4N NaOH, gradient 0-65% A-B.

5

Buffer A Buffer pH 3/acetonitril 9:1

Buffer B Buffer pH 3/acetonitril 4:6 »

De frakties die de in de titel genoemde 10 verbinding bevatten werden verzameld, gecombineerd, geconcentreerd, verdund met 300 ml water en geleid door een ontmineraliserende kolom, zoals hiervoor beschreven. De zouten werden geelueerd met water. Het peptide werd geelueerd met een mengsel van isopropanol- water en ethylacetaat ( 59:39:2). De geschikte frakties werden 15 gecombineerd en geconcentreerd, waardoor de in de titel genoemde verbinding werd verkregen.

- -20

IqCJjj = 56,3° (c= 0,5 AcOH) F= 0,88.

Voorbeeld 47: 20 n\ Lys^ 2-N, Ly s2 ^-N-tris-(1-deoxyfructosy1)- (P/Ala J-phGRF-(1-29)-NH^ met formule LXII .

Op analoge wijze als beschreven in voorbeeld 2 37 werd uitgaande van (DA1a JhpGRF - de in de titel genoemde verbinding verkregen.

25 /θ'/20 = “5,6° (c= 0,2 in 95% AcOH) F= 0,82.

Voorbeeld 48: lfi,N^-bis(1-deoxyfr^ctosyl)L·ys-vasopressine met formule LXIII w

Men roerde een suspensie van 118 mg (0,1 8 m.mol) Lys -vasopressine en 360 mg (2 m.mol) glucose in 5 ml van een mengsel van methanol en ethylacetaat (9:1 ) 2 tot 4 uren bij 65°C. Daarna verwijderde men het oplosmiddel onder verminderde druk.

Het residu werd opgenomen in 30 ml water en de oplossing werd ge-35 lyofiliseerd. Ter verwijdering van de overmaat glucose werd het peptide (oplossing in 40 ml water met pH 7,3) geadsorbeerd aan een 8702345 t * - 52 -

Duolite-kolom ( 1,5 x 10 cm). De glucose werd geelueerd met water en het peptide met een mengsel van isopropylalkohol, water en ethylacetaat ( 59:39:2) . Het mengsel werd gezuiverd"over een silicagelkolom ( elutiemengsel: een mengsel van chloroform, 5 methanol ,ethylacetaat en water, 7:4:1:1).

De frakties die de in de titel genoemde verbinding bevatten werden geconcentreerd en gelyofiliseerd, waardoor de in de titel genoemde verbinding werd verkregen.

- 20 /Pt7n = -52° (c= 0,5 in 95% HOAC) F= 0,84.

10 '

Voorbeeld 49:

De verbinding met formule LXIV

De in de titel genoemde verbinding werd .J5 op analoge wijze als beschreven in voorbeeld 45 bereid uitgaande van Ac-(D)Phe(pCl)-(D)Phe(pCl)-(D)-Trp-Ser-Lys-(D)Phe-Leu-Arg-Pro(D)Ala-NH2, acetaat en D(+)glucose .

2o /<Χ]*υ = -36° (c* 0,5 in 95% AcOH) F= 0,86.

20 Voorbeeld 50:

De_verbinding met formule LXV

De in de titel genoemde verbinding werd op analoge wijze als beschreven in voorbeeld 45 bereid uitgaande van H-(D)Phe(pCl)-(D)Phe(pCl)-(D)-Trp-Ser-Tyr-(D)Phe-Leu-Arg-Pro-(D) 25

Ala-N^, acetaat en D(+)glucose.

20

IpC] = -32° (c- 0,5 in 95% AcOH) F= 0,94.

Voorbeeld 51:

30 De verbinding met formule LXVI

Men roerde 200 mg H-(D)Phe(pCl)-(D)Phe(pCl)-(D)Trp-Ser-Tyr-(D)Lys-Leu-Arg-Pro-(D)Ala- en 520 mg D(+)glucose in een mengsel van dimethylformamide en azijnzuur ( 15:1) 3 uren bij 60°C. Daarna concentreerde men het mengsel onder verminderde 35 druk, sloeg met ether neer, filtreerde en droogde. Het residu werd als volgt gezuiverd: 8/02345 * i - 53 - 1) Adsorptie aan Duolite ES 861 en elutie met een mengsel van dioxan - 1^0 - AcOH.

2) Kolomchromatografie over silicagel onder toepassing van een mengsel van chloroform, azijnzuur en water 5 als elutiemiddel.

3) Preparatieve HPLC ("omgekeerde fase") chromatografie over een octadecyl-silicagelkolom. Elutie met een acetonitrilgradient in 2% H^PO^.

De frakties die de in de titel genoemde ^ verbinding bevatten werden gecombineerd, gefiltreerd door een kolom die een zwak basische ionenuitwisselaar in acetaatvorm bevatte, geconcentreerd en gelyofiliseerd , waardoor de in de titel genoemde verbinding werd verkregen.

-2Π [9(L· - -22,6° (c= 0,5 in 95% AcOH) F= 0,63.

15

De synthese volgens de uitvinding kan als volgt worden uitgevoerd:

Voorbeeld S1 20

Bereiding van octreotide ( = SMS) , 1) Bereiding van acetaal anker (N-CF^CO-threoninolacetaal van p-formylfenoxy-azijnzuur).

25 Men voegde 105 g ( 1,0 m.mol) L-tbreoninol toe aan 200 ml methanol, die met een stikstofstroom werd geroerd.

Aldus verkreeg men een heldere oplossing.Men voegde bij 0°C een oplossing van 200 ml van de methylester van trifluorazijnzuur in 250 ml methanolkoe. Daarna hield men het mengsel onder koelen met 30 een ijsbad op een temperatuur van ongeveer 10°C.

- £ Na 1 uur en 30 min kon geen vrij threoninol meer in het mengsel worden aangetoond. Door concentreren bij 40°C verkreeg men een wit, kristallijn residu.

Het residu werd bij 70°C opgelost in 35 200 ml ethylacetaat en door toevoegen van hexaan neergeslagen.

Het mengsel werd tot 0°C afgekoeld, gewassen met hexaan en bij kamer 8702345 4 » - 54 - temperatuur gedroogd» Aldus verkreeg men N-trifluoracetylthreoninol.

Men loste 50,3 g (0,25 mol) van het verkregen produkt op in 1,25 1 tetrahydrofuran en druppelde hieraan 75 ml trimethylchloorsilaan toe. Onmiddellijk daarna 5 voegde men een mengsel mn 70 ml triethylamine en 250 ml tetra- hydrofuran toe. Aldus verkreeg men een witte suspensie, die 4 uren werd geroerd. Het mengsel werd gefiltreerd en het filtraat werd bij 40°C ingedampt, waardoor een olie werd verkregen.

De olie werd opgelost in 1,5 1 methyleen-10 chloride en bij kamertemperatuur behandeld met porties van 90,4 g p-formylfenoxyazijnzuur. Hieraan voegde men porties van 9 ml van de trimethylsilylester van trifluormethaansulfonzuur toe.

Het mengsel werd 24 uren bij kamertemperatuur geroerd, daarna gefiltreerd en het residu werd goed uitgewassen met methyleenchlori-15 de.

Het filtraat werd geconcentreerd bij 40°C, waarbij een oranjerood, harsachtig produkt werd verkregen.

Dit produktirerd gechromatografeerd over silicagel. Het elueren geschiedde met ethylacetaat. Bij concentreren van de van belang 20 zijnde frakties werd de in de titel genoemde verbinding met een zuiverheid van 97% (HPLC) verkregen.

2) Opbouw van het beschermde octapeptide .

25 Men suspendeerde 17,2 g geaminomethyleerd polystyreen (merk Dow 0,7 gew.% van N overeenkomende met 0,5 m.mol aminomethylgroepen per gram hars) in 80 ml van een mengsel van methyleenchloride en dimethylformamide (4:1). Daarna voegde men achtereenvolgens 4,17 g van het eindprodukt van stap 1, 50 1,6 g HOBT en 4,0 g DCCI toe. Nadat men het mengsel 2 uren bij . g kamertemperatuur had geroerd was de proef volgens Kaiser negatief.

Het mengsel werd gefiltreerd en gewassen.

De gewassen hars werd gesuspendeerd in 100 ml tetrahydrofuran en methanol ( 3:1) en behandeld met porties 55 van 10,4 g natriumboriumhydride. Het mengsel werd 6 uren geroerd bij kamertemperatuur, gefiltreerd en de hars werd gewassen.

8702345

' I

- 55 -

De hars werd gesuspendeerd in een mengsel \an methyleenchloride en dimethylformamide ( 4:1) en men voegde 5,5 g Fmoc-Cys (S-t-Bu)OH, 1,74 g HOBT en 3,6 g DCCI toe. De Fmoc beschermende groep werd met piperidine (2x20 min. contacttijd) afgesplitst.

Op overeenkomstige wijze werden in achtereenvolgende cycli de volgende N-Fmoc beschermde aminozuren gekoppeld onder toepassing van HOBT/DCCI-ThrOH;Lys (BOC)-OH; D-TrpOH, Phe-QH, Cys(S-tBu)OH en D-Phe-OH, ter verkrijging van de Fmoc beschermde octapeptidehars. De uiteindelijke grootte bedroeg 0,26 m.mol/g.

3) Oxydatie en afsplitsing.

De verkregen hars werd gesuspendeerd in ^ 100 ml van een mengsel van gelijke delen trifluormethyl en methanol en behandeld met 50 ml tributylfosfine. Dit mengsel werd 70 uren geroerd bij kamertemperatuur. Het mengsel werd gefiltreerd, gewassen en behandeld met 100 ml van een 1:1 mengsel van tetrahydro-furan en een 1N-aminoacetaatoplossing. Daarna voegde men 20 1,1 ml van een 30%-ige waterige waterstofperoxydeoplossmg toe.

Het mengsel werd 24 uren geroerd bij kamertemperatuur. De hars werd gewassen. Het mengsel werd behandeld met 20 ml trifluor- azijnzuur, 80 ml methyleenchloride , 10 ml water en 2 ml thio- anisool. Het mengsel werd 2 uren geroerd, daarna gefiltreerd en 25 ...

gewassen met tnfluorazijnzuur en methyleenchloride . Aan het filtraat voegde men 200 ml diethylether toe. Het verkregen neerslag werd afgefiltreerd. Het residu werd opgelost in een waterige buffer en gedemineraliseerd, bijvoorbeeld onder toepassing van Duolite.

De oplossing werd als acetaat gevriesdroogd, waardoor de in de 30 · titel genoemde verbinding als acetaat werd verkregen.

* Al de hiervoor gegeven voorbeelden , bij voorbeeld de verbindingen van de voorbeelden 1 en 2 , kunnen op overeenkomstige wijze worden bereid.

^ Voorbeeld S2

Bereiding van “filucosyl (1-4)-__ deoxy-fructosylJ-SMS (zie voorbeeld 2) e - 0 2 3 4 5 * ί - 56 -

Men bereidde 393 g van het octapeptide gebonden aan de hars op de wijze als beschreven in het hiervoor gegeven voorbeeld S1. De cysteine beschermende groepen werden reductief verwijderd. De peptidebinding aan de hars werd met wa-5 terstofperoxyde m een mengsel van tetrahydrofuran en water geoxydeerd tot het cyclische octapeptide.

Na wassen in tetrahydrofuran en daarna dimethylformamide werd de peptidehars geschud in 3600 ml van een mengsel van dimethylformamide en azijnzuur (8:1). De suspensie ^ werd behandeld met 526 g D(+) maltose.monohydraat. Het mengsel werd verwarmd tot 60°C en 18 uren bij deze temperatuur geroerd.

Het mengsel werd afgekoeld en de peptidehars werd afgefiltreerd en achtereenvolgens gewassen met dimethylformamide en methanol. Daarna werd het gewassen met methyleen-15 chloride. Het peptide werd vervolgens gedurende 1 uur van de hars afgesplitst met een mengsel van 2900 ml methyleenchloride en 716 ml trifluorazijnzuur met een spoor water.

Vervolgens werd het filtraat geroerd en behandeld met porties van 597 g natriumcarbonaat, 30 min. geroerd 20 en gefiltreerd. Het residu werd gewassen met methyleenchloride en methanol.

Het filtraat werd drooggedampt.

Het werd ontmineraliseerd onder toepassing van een niet-gefunctionaliseerde polystyreenkolom zoals Duolite, 25 ...

of omgekeerde fase HPLC materiaal, zoals silicagel behandeld met silicon en bevattende hogere alkoholgroepen met een lange keten (bijvoorbeeld Labormatic, Zwitserland, merk HB-SIL-18-20-100).

De zuivere , in de titel genoemde verbinding werd verkregen.

De verbindingen volgens de uitvinding 30 ....

vertonen farmacologische werking en zijn daardoor geïndiceerd - £ voor toepassing als farmaceutica voor therapeutische toepassing.

De werkino van de verbindingen volgens de uitvinding kan worden aangetoond met standaard farmaceutische en biofarmaceutische proeven. De werking van de verbindingen is 35 . . , m het algemeen minstens even krachtig als van het met-gemodificeer- de peptide (d.w.z. het overeenkomstige peptide dat geen suiker bevat), bij toediening via injekties. als oraal. Ze worden in het 8702345 ér i -57- algemeen beter geabsorbeerd , zijn beter oplosbaar ii water en bezitten een langere werkingsduur.

De verbindingen volgens de uitvinding zijn daardoor geïndiceerd voor toepassing bij dezelfde indicaties 5 als voor de niet-gemodificeerde peptiden.

De verbindingen volgens de uitvinding kunnen met standaardbiobeschikbaarheidsproeven worden vergeleken met de niet-gemodificeerde peptiden.

De verbindingen volgens de uitvinding 10 kunnen bijvoorbeeld gedurende een langere tijdsperiode na het toedienen in het bloedplasma worden aangetoond dan de niet-gemodificeerde peptiden, zoals uit standaard biobeschikbaarheids-proeven blijkt.

De verbindingen volgens de uitvinding 15 en de niet-gemodificeerde peptiden kunnen ineen enkele dosis die voldoende is voor het verkrijgen van een therapeutisch effekt bij orale of intraveneuze toediening aan bijvoorbeeld honden worden toegediend.

Men past doses toe die het mogelijk maken 20 het peptide of een metaboliet daarvan in het bloed aan te tonen.

De detectie kan op een gebruikelijke wijze geschieden, bijvoorbeeld volgens radioimmunoassay.

Bij de hiervoor beschreven proef no.

1 is bijvoorbeeld vastgesteld dat de verbinding van voorbeeld 2 bij 25 orale toediening een 10 maal hogere bloedconcentratie ten opzichte van octreotide geeft.

De absolute biobeschikbaarheid van de oraal en intraveneus toegediende verbinding van voorbeeld 2, gmeten op basis van het AUC (oppervlak onder de kromme) is 5 maal 30 hoger dan dat van octreotide . De eliminatiehalfwaardetijd bij .

^ intraveneuze toediening is ongeveer 23 uren t.o.v. ongeveer 30 min.

voor octreotide.

Bovendien is het gunstig dat de verbindingen volgens de uitvinding in grotere mate via de nieren worden 35 afgescheiden. Dit kan met standaardproeven worden aangetoond.

Aan mannetjesratten (225-375 g) die hadden gevast werd oraal 50 ml/kg water toegediend. Na 30 min werden de u 2 3 4 5 i ‘ - 58 - dieren geanesthetiseerd met bijvoorbeeld Inactine ( 100 mg/kg i.p.). De galleiding en blaas werden voorzien van een .·canule.

Beide Vena jugularis werden blootgelegd. Aan één ader-werd een infusie van 5% glucose met 1% ethanol toegediend ( 5 ml/uur) , ^ ter stimulering van diurese. De andere ader werd benut om bloedmonsters (0,5 ml) te nemen, elk uur en gedurende 4 uren.

De verbinding volgens de uitvinding en het niet-gemodificeerde peptide werden subcutaan in een dosis van. ongeveer 10 tot ongeveer 1000 pg/kg toegediend. De concentratie 10 van de verbinding werd op een gebruikelijke wijze bepaald, bijvoorbeeld met RIA, radioimmunoassay.

Bij de hiervoor beschreven proef heeft dit bijvoorbeeld met de verbinding van voorbeeld 2 en octreotide in een dosis van 10 jig/kg tot de volgende resultaten geleid: 15

Percentage dat verwijderd is via de gal urine

Verbinding van voorbeeld 2 1,6 36

Octreotide 22 19 20

Terwijl octreotide zowel via de gal als de urine wordt afgevoerd, wordt de verbinding van voorbeeld 2 overwegend via de urine afgevoerd.

Een verbeterde absorptie bij orale toe-25 diening kan voor de verbindingen volgens de uitvinding als volgt worden aangetoond:

De verbinding volgens de uitvinding en het niet-gemodificeerde analogon daarvan werden oraal aan 0FA ratten toegediend (bijv. 10 mg/kg) .

30 Na bepaalde tijdsperioden, bijvoorbeeld 15, 30 en 60 min., werden bloedmonsters verzameld. Deze werden geanalyseerd op hun • C hormoon (oxytocine) gehalte met behulp van RIA.

Er werd bijvoorbeeld met proef no.3 vastgesteld dat de verbinding van voorbeeld 44 in een dosis van 30 10 mg/kg een 50-100%’s hogere absorptie vertoont dan het niet- gemodificeerde peptide oxytocine. De verkregen resultaten zijn : 8702345 * . i - 59 -

Tabel: Ratten plasmaspiegel na orale toediening

De resultaten zijn vermeld in ng/ml j5jnin. 30 min. 60 min ^ oxytocine 7,53 3,60 2,55 de verbinding van voorbeeld 44 11,79 6,98 3,98

De farmacologische aktiviteiten van de ^ verbindingen volgens de uitvinding kunnen volgens standaard farmacologische proeven worden bepaald , na bijvoorbeeld injekteren en desgewenst worden vergeleken met die van de niet-gemodificeerde peptiden, bijvoorbeeld wat betreft de werking en de langere duur van de werking.

^ Zo kunnen bijvoorbeeld farmacologische proeven worden uitgevoerd ter bepaling van de werkingen van de verbindingen volgens de uitvinding op hormonen bij dieren. Zo kunnen de verbindingen die de afscheiding van hormonen remmen worden onderzocht door de verlaging van de bloedspiegels van het hormoon 20 te meten.

De verbindingen volgens de uitvinding die de GH (groeihormoon) secretie remmen, in het bijzonder de verbindingen met formule VIII, meer in het bijzonder de verbindingen met formule VIIIa-f, en de GH-concentraties in 25 het bloed verlagen, kunnen als volgt worden onderzocht:

Rhesus-apen (tenminste 5 ) die hadden gevast, in primaatstoelen, ontvingen de verbinding volgens de uitvinding in een stuk banaan als drager. De verbindingen werden in een dosis van ongeveer 0,1 mg/kg tot ongeveer 10 mg/kg p.o. toegediend.

Via een katheter werd bloed aan de Vena saphena onttrokken . De GH-concentratie in het bloed werd met RIA (radioimmunoassay ) bepaald.

Bij deze proef met rhesus-apen werd

OC

J bijvoorbeeld gevonden dat de verbinding van voorbeeld 2 m een ó / υ l 3 4 5 I 1 - 60 - dosis van 0,1 mg/kg de GH-secretie met tenminste 50% gedurende een langere tijdsperiode dan 10 uren verlaagde, vergeleken met een 5 uur durende verlaging verkregen met het niet-veranderde peptid^óctreotide.

5 Men sneed van mannetjesratten de koppen af en voerde op verschillende tijdstippen (bijv. na 1, 6 en 18 uren) het bloed af, na toediening van de verbinding volgens de uitvinding in verscheidene, logarithmisch wisselende , doses. De GH-spiegel in het serum werd bepaald met behulp van RIA. Bij deze 10 proef zijn de verbindingen volgens de uitvinding werkzaam in doses van ongeveer 0,02 tot ongeveer 30 pg/kg s.c.

Volgens deze proef no. 5 werd bijvoorbeeld gevonden dat de verbindingen volgens de voorbeelden 1,2,21 en 24 een ID^ van 0,045, 0,190; 0,3 en 0,2 pg/kg s.c., respectie-15 velijk vergeleken met de ID^q voor natuurlijk stomatostatine bij dezelfde proef van 93 pg/kg s.c. hebben ( de ID^q geeft de hoeveelheid verbinding aan die nodig is om het GH-gehalte met 50% te verlagen vergeleken met die van niet-behandelde controledieren).

In tegenstelling met natuurlijk somato- ·.

20 stine zijn de verbindingen volgens de uitvinding bij deze proef na een langdurige tijdsperiode (bijv. 6 uren) nog in sterke mate aktief.

De GH-verlagende werking van de verbindingen werd eveneens waargenomen na orale toediening aan mannetjesratten 25 met geïmplanteerd oestradiol. Bij deze proef treden betrekkelijk geringe variaties van de GH-spiegel op. De proef werd als volgt uitgevoerd:

Een loop (lengte 50 mm 0 3 mm) van silastine met 50 mg oestradiol werd onder etheranesthesie geim-30 planteerd onder de dorsale huid van mannetjesratten, die een gewicht van ongeveer 300 g hebben. Op verschillende tijdstippen ( 1 tot S 6 maanden later) werd herhaaldelijk van deze dieren gebruik gemaakt voor proeven. De te onderzoeken verbinding werd hetzij subcutaan, hetzij oraal toegediend, waarbij in het laatste geval aan de 35 dieren gedurende ongeveer 16 uren voor de proef geen voedsel was toegediend.

b / u 2 3 4 5 < ί - 61 -

Direkt ervoor,evenals op verschillende tijdstippen na het toedienen van de verbinding^werd ongeveer 0,8 ml bloed onttrokken door prikken van de retro-orbitale plexus.

Het werd gecentrifugeerd en de GH-spiegel van het serum werd 5 met RIA bepaald. De waarden daarvan werden eveneens berekend.

De verbindingen volgens de uitvinding zijn bij orale toediening aktiever dan de overeenkomstige niet-gemodificeerde peptiden, zelfs na een aantal uren. De ID^q voor elk van de verbindingen van de voorbeelden 1 en 2 is 10 na 2 uren ongeveer 17 tot40maal2ager dan die van het niet-gemodi-ficeerde peptideoctreotide. De verdere resultaten zijn :

Verbinding A van voorbeeld ID^ P'0, micr°gram/kg 21 500 15 24 25 octreotide. 1400 »

De verbindingen volgens de uitvinding zijn daardoor geïndiceerd voor toepassing bij de behandeling waarbij een remming van de GH-afscheiding wenselijk is. Onder de hoofdindicaties vallen diabetes mellitus, het verhinderen en behandelen van angiopathie en woekerende retinopathie, evenals acromegalie.

De verbindingen volgens de uitvinding ^ remmen eveneens de afscheiding van de pancreas.

Deze remming kan met behulp van proeven op dieren worden vastgesteld.

De methode beschreven in Scand.J.

Gastroint. 6^, 423 (1975) door S.J.Konturek en med. kan worden toe-30 gepast.

De verbindingen remmen eveneens de afscheiding van maagzuur.

De remmende werking van de verbindingen volgens de uitvinding op de GH-afscheiding verhoogt eveneens de pH van het maagsap.

8702345

i V

- 62 -

De werking van de verbindingen werd bijvoorbeeld met de volgende proef vastgesteld:

Aan de maag van ratten die hadden gevast met slangen geïmplanteerd in hun maag werden de verbindingen 5 volgens de uitvinding toegediend. De verbindingen volgens de uitvinding werden verstrekt in een dosis van ongeveer 0,5 mg/kg tot ongeveer 5 mg/kg . Na 1 uur werden de slangen geopend. Het maagsap werd in perioden van 30 min. verzameld. De verzamelde volumes werden geregistreerd en de zuurconcentratie werd vastgesteld. *0 De pH^waarde van het maagsap steeg.

Bij de hiervoor beschreven proef verhoogde de verbinding A gedurende3,5urendepHtot 6-8. Octreotide verhoogde de pH gedurende slechts 2 uren tot 6-7. Verbinding A is tenminste 60 malen aktiever dan cimetidine.

De verbindingen volgens de uitvinding , in het bijzonder de verbindingen met formule VIII, zijn daardoor geïndiceerd voor toepassing bij de behandeling van maag-darmstoor-nissen, bijvoorbeeld de behandeling van maagzweren, maag-darmbloe-dingen , acute pancreatitis en tumoren die maag-darmhormoner. afschei-20 den (bijvoorbeeld vipoma'^ insulinoma's , glucagonoiua's enz.)

De verbindingen volgens de uitvinding remmen eveneens de vermeerdering en/of keratinisatie van epidermale cellen en zijn daardoor geïndiceerd voor toepassing bij de behandeling van dermatologische ziekten, die verbonden zijn met de patholo-25 gische vermeerdering en/of keratonisering van epidermale cellen, in het bijzonder de behandeling van psoriasis.

Bovendien zijn deze verbindingen geïndiceerd voor toepassing bij de behandeling van degeneratieve seniele dementie, dus het Alzheimer-type (SDAT) van seniele dementie 50 of voer de behandeling van clusterhoofdpijnen (herhaalde hoofd-. g pijnen).

Voor al deze indicaties ligt een geïndiceerde dagelijkse dosis tussen ongeveer 2 pg en 20 jig van de verbindingen volgens de uitvinding. Desgewenst kunnen de ver-35 bindingen in gescheiden doses 2 tot 4 malen daags in een eenheids-doseringsvorm of desgewenst in een vorm waarin het aktieve materiaal 6/Ü2345 £' i - 63 - langzaam wordt vrijgemaakt, worden toegediend. Dergelijke eenheidsdoseringen kunnen ongeveer 0,5 jig tot 10 mg bevatten.

De verbindingen volgens de uitvinding, in het bijzonder suikerderivaten van calcitonine en van calcitonine - 5 derivaten, meer in het bijzonder de derivaten met formule X, verlagen de calciumplasmaspiegel. Bovendien zijn het functionele antagonisten van het parathormon en bewerken een positieve calciumbalans in het beendergestel. De hypocalcemische werking van de nieuwe verbindingen kan op een bekende wijze worden 10 bepaald, bijvoorbeeld volgens de methode van M.Azria en med., beschreven in het Calcitonine 1984 Symposium, 24e oktober, Milaan en gepubliceerd als "Short Communication" in "Current Clinical

Practice Series" No. 42 , Excerpta Medica 1986, blz. 104.

.. 2+

Bij deze methode wordt een Ca -ion selectieve elektrode gebruikt, 15 zodat het gehalte aan calciumionen in het bloed van jonge konijnen of honden continu kaaworden gemeten. De verbindingen werden i.v. in doses van ongeveer 0,1 tot ongeveer 10 pg/kg, bijvoorbeeld in overeenstemming met ongeveer 1 internationale eenheid per kg, toegediend. De metingen werden uitgestrekt over 5 uren en het 20 AUC (oppervlak onder de kromme) werd berekend.

De verbindingen kunnen eveneens met behulp van andere proeven worden onderzocht, bijvoorbeeld met de hypocalcemische standaardproef van M. Kumar en med., J,

Endocrinology (1965), 33, blz. 469, op ratten, in verschillende 25 doseringen, die een hypocalcemische werking van 300 tot 600 internationale eenheden per mg voor de verbindingen volgens de uitvinding geven.

Zo werd bijvoorbeeld bepaald, dat elk van de verbindingen van de voorbeelden 37 en 38 een werkingsduur 30 hebben die veel langer is dan die van het niet-gemodificeerde peptide^zalmcalcitonine^ indien dit i.v. werd toegediend aan honden (5 pg/kg).Bij deze proef werd na 3 uren een verlaging van de calciumspiegel in het bloed van 15 tot 18% waargenomen voor de verbindingen C en D; na 6 uren kon voor zalmcalcitonine niet 35 langer een calciumverlaging worden waargenomen, terwijl voor de t / Ü 2 3 4 5 i. ► - 64 - verbindingen van de voorbeelden 37 en 38 de verlaging van de calciumspiegel nog na 3 uren op hetzelfde niveau waa.

De verbindingen volgens de uityinding zijn dus geïndiceerd voor alle aandoeningen waarbij een verlaging 5 van de plasmacalciumspiegel of een beïnvloeding van het metabolisme van het beendergestel wenselijk is, bijvoorbeeld hypercalcemie, als resultaat van een deficiëntie in het endogene thyrocalcitonine door een verlies van schildklierweefsel of hyperfunctie van de parathyroide. Ze zijn dus eveneens geïndiceerd voor alle aandoe-10 ningpn \an het beendergestel die gebaseerd zijn op een toegenomen stoornis of waarbij een calciumfixatie in het beendergestel wenselijk is, bijvoorbeeld verschillende soorten osteoporose (bijv. postclimacterische, posttraumatische, veroorzaakt door corticosteroide therapie of inactiviteit, maligne ziekten enz.,), fracturen, 15 osteomalacie, rachitis en door de nieren geïnduceerde osteodystrofie, pijn , bijv. in het beendergestel in verband met osteoporeose, neurodystropische ziekten, Paget's ziekte en in gecombineerde therapie met calciumfosfaat.

Voor deze hiervoor genoemde met calcium 20 verband houdende indicaties ligt een geïndiceerde dagelijkse dosis tussen ongeveer 5 en ongeveer 1500 internationale eenheden. Deze kunnen als enkelvoudige dosis 1 maal daags of desgewenst elke 2 tot 3 dagen worden toegediend.

De verbindingen volgens-de uitvinding , 25 bij voorkeur die welke suikerderivaten van LHRH of analoga daarvan zijn, remmen de remming van het luteiniserend hormoon, bijvoorbeeld als geïndiceerd door een remming van de ovulatie bij dieren.

De proef werd uitgevoerd volgens M.Marko en E.Flückiger, Experientia 30, 1174-1176 (1974): 30 Volwassen vrouwtjesratten van de , ^ Ivanovas Wistar stam (Sprague Dawley, IvarSDIV, 200-250 g) werden onder standaardomstandigheden: 14 uur licht ( van 04.00 tot 18.00 uur), 24°C, relatieve vochtigheid 55-60 en vrij voedsel en water , gehouden.

35 Dieren met regelmatige cycli van 4 dagen werden geinjekteerd inde proestrus om 13.00 uur met de verbinding, subcutaan of via de orale weg. De volgende dag om 9.00 uur (a.m.) : Ü 2 3 4 5 * i - 65 - werden de ratten opgeofferd en de eicellen bij beide eileiders geteld met behulp van dissectiemicroscopie. Alleen wanneer geen eicellen werden aangetroffen werd de ovulatie als geremd beschouwd. Het gemiddelde aantal eicellen per ovulerende rat in elke behandelings-^ groep werd berekend . Uit de verhouding van de ratten die in elke behandelde groep ovuleerden werd de doeltreffende dosis van de onderzochte verbindingen vastgesteld.

In het algemeen zijn de verbindingen volgens de uitvinding doeltreffend in een trajekt van ongeveer 0,0005 tot ^ ongeveer 10 mg/kg . Zo is bijvoorbeeld de verbinding van voorbeeld 45 aktief in een dosis van 0,01 mg/kg .

De remmende werking op de afscheiding van het luteiniserend hormoon van de verbindingen werd eveneens volgens een ander model in vitro onderzocht: *5 Men bereidde celcultures van de hypofyse volgens de enzymdispersiemethode van Vale (W.Vale en G.Grant:

Methods in Enzymology 37, 82-93 (1975)), zoals reeds eerder beschreven is door M.Marko en D.Romer: Life Sciences, 33, 233-240 (1983) .

De primaire cultures werden 4 dagen in een incubator op 37°C gehouden.

20 Daarna werden de cellen gewassen en 3 uren geincubeerd in 1 ml MEM (Gibco 100 x) dat LHRH en de te onderzoeken verbinding bevatte.

Aan het einde van de incubatie werd het medium gecentrifugeerd en bij -20°C opgeslagen, totdat het op LH met specifieke radioimmunoassay werd onderzocht op ratten LH.

25 Aan het einde van de incubatie werd het medium gecentrifugeerd en bij -20°C opgeslagen,totdat het op LH volgens specifieke radioimmunoassay werd onderzocht op ratten LH.

Volgens deze proef bleken de onderzochte verbindingen in het algemeen doeltreffend te zijn in een concentratie-50 trajekt van ongeveer 10 tot ongeveer 10 M, waarbij de door LHRH geïnduceerde LH-afscheiding op een dosisafhankelijke wijze . ^ wordt geremd.

Voor alle LHRH indicaties ligt een geïndiceerde dagelijkse dosis tussen ongeveer 2 pg en 20 mg van de verbin-55 dingen volgens de uitvinding. Desgewenst kunnen de verbindingen in gescheiden doses 2 tot 4 malen daags in een eenheidsdoseringsvorm of desgewenst in een vorm waarbij het aktieve materiaal langzaam 8702345 i ► - 66 - wordt afgegeven , worden toegediendi Dergelijke eenheidsdoseringen kannen ongeveer 0,5 pg tot 20 mg bevatten.

Voor bijvoorbeeld de verbinding van voorbeeld 2 ligt een geïndiceerde dosis tussen ongeveer· 3 en 10 mg 3 maal daags, bijvoorbeeld p.o. voor diabetes of zweren.

De verbindingen volgens de uitvinding kunnen volgens elke gebruikelijke weg worden toegediend, bijvoorbeeld enteraal , zoals oraal, bijvoorbeeld in de vorm van drinkbare oplossingen, tabletten of capsules, nasaal, bijvoorbeeld in de vorm van vloeibare of poedervormige sprays en zalven , of parenteraal, bijvoorbeeld in de vorm van injekteerbare oplossingen of suspensies.

De geschikte dosering van de verbindingen volgens de uitvinding voor elke speciale toedieningsweg, bij-^ voorbeeld via de neus of oraal, kan door standaard biobeschikbaar- heidsproeven onder toepassing van hetzelfde, geinjekteerde materiaal, i.v, , i.m. of s.c. , worden vastgesteld. In het algemeen zijn bij orale toediening de dagelijkse doses ongeveer 10 tot ongeveer 100 malen hoger dan die beschikbaar voor injektie i.m. of s.c.

20 . . . .

De verbindingen volgens de uitvinding kunnen in elke farmaceutisch aanvaardbare vorm worden toegediend, bijvoorbeeld in vrije vorm,zoals in de vorm van een vrije base, of, indien de verbinding een zuur is, in de vrije zuurvorm, of in een farmaceutisch aanvaardbare zoutvorm.De zoutvorm kan bijvoorbeeld 25 . . .. . . . .

een zuuradditiezoutvorm zijn, of, mdien de verbinding een zuur is, in een farmaceutisch aanvaardbare kationogene zoutvorm.

De verbindingen kunnen eveneens in complexvorm worden toegediend. Bovendien of alternatief kunnen de verbindingen de vorm van een solvaat, bijvoorbeeld een hydraat, hebben.

30 . ...

Deze verbindingen volgens de uitvinding vertonen een overeenkomstige mate van werking in elk van de - g hiervoor genoemde vormen.

De onderhavige uitvinding verschaft eveneens farmaceutische preparaten van een verbinding volgens de 35 uitivinding m een farmaceutisch aanvaardbare vorm, desgewenst tezamen met tenminste één farmaceutische drager of verdunningsmiddel. Dergelijke preparaten kunnen op een gebruikelijke wijze worden bereid b / ü 2 3 4 5

> I

- 67 - of vervaardigd.

Een drinkbare ampul of injekteerbare oplossing kan per ml bijvoorbeeld 0,5 mg van de verbinding volgens voorbeeld 2 in acetaatvorm, 11,45 mg citroenzuur-, 6,32 mg 5 natriumhydroxyde en 4,5 mg natriumchloride bevatten.

De onderhavige uitvinding verschaft eveneens een werkwijze volgens de uitvinding voor toepassing bij elk van de hiervoor genoemde indicaties, waaronder verlaging van de GH-afscheiding, diabetes mellitus en vermindering van de af-10 scheiding in de maag.

De onderhavige uitvinding verschaft eveneens het gebruik van een verbinding volgens de uitvinding ter bereiding of vervaardiging van een geneesmiddel dat geschikt is om bij de behandeling van elk van de hiervoor genoemde indicaties 15 te worden toegepast.

- € 8/02345

Claims (16)

1. Een suikerderivaat van een biologisch aktief peptide, welk derivaat een langdurige werking vergeleken met het niet door suiker gemodificeerde peptide uitoefent en tenminste aan één van de aminozuureenheden een suikerrest bevat die via een andere koppeling dai een :* direkte N-glycosidische binding aan een aminogroep daarvan is gehecht en bovendien, indien het een condensatieprodukt van een carboxylgroep bevattende suiker en een peptide met minder dan 8 aminozuureenheden betreft, door een andere koppeling dan een direkte amidebinding.

1. Werkwijze voor het bereiden van een derivaat van een suiker en een biologisch aktief peptide met een langduriger werkingsduur ten opzichte van het niet door suiker gemodificeerde peptide , waarbij het peptide tenminste één suiker- 5 rest bevat dat aan een aminogroep van één van de aminozuureenheden is gebonden door een andere koppeling dan een direkte N-glycosidische binding en bovendien , indien het een condensatieprodukt van een carboxylgroep bevattend suikerbestanddeel en een peptide met minder dan 8 aminozuureenheden is, via een andere koppeling dan een direkte amidekoppeling, met het kenmerk, dat a) tenminste één beschermende groep, die in een met suiker gederivatiseerd peptide aanwezig is, wordt verwijderd, of b) twee peptideeenheden, waarvan elk tenminste één aminozuur of een aminoalkohol in een al of niet beschermde vorm bevat en één peptideeenheid de suikerrest bevat, via een amidebinding met elkaarwaaSei verbonden, waarbij de peptide-binding zodanig is dat de gewenste aminozuurvolgorde wordt verkregen 25 en daarna desgewenst stap a) van de werkwijze wordt uitgevoerd, of c) tenminste één desgewenst beschermde suikerrest in een al of niet beschermd peptide wordt ingevoerd en daarna desgewenst stap a) van de werkwijze wordt uitgevoerd, 50 d) een functionele groepvan een al of niet beschermd, met suiker gederivatiseerd peptide wordt omgezet in een andere functionele groep of wordt verwijderd, zodat een al of niet beschermd geglycosyleerd peptide wordt verkregen en in het laatste geval stap a) van de werkwijze wordt uitgevoerd, of e) een met suiker gederivatiseerd peptide, *55 waarin de mercaptogroepen van de Cys-groepen in vrije vorm bestaan, wordt geoxydeerd tot een peptide waarin twee Cys-groepen door een S-S-brug met elkaar zijn verbonden.

2. R la -C0-C-(CH9) -H , waarin I 2 m 30 h £ m een geheel getal van 1-4 is, R de methyl- of ethylgroep voorstelt, en R^ een waterstofatoom, een methyl- of 35 ethylgroep weergeeft, of 3) ^ CH2 -CO-GH J , waarin (CH2)n . 8 7 0 2:4b • ' 3 > -ΙΦΙ- η een geheel getal van 1-5 is, of 4) -CO-NHR,, waarin R^ een alkylgroep met rechte of vertakte keten en 1-6 koolstof atomen voorstelt:, of 5) -CO-NH-CH-COOR , waarin I e Rd R^ de rest van een natuurlijk oC-aminozuur ( waaronder waterstof) , die aan het QC-koolstofatoom is geplaatst, en R^ een alkylgroep met 1-5 koolstofatomen voorstellen, 6. een groep met formule LXVII , waarin Ra' en y , onafhankelijk van elkaar, een waterstofatoom, de methyl- of ethylgroep voorstellen, Rg en Rg, onafhankelijk van elkaar, een waterstof-, fluor-, chloor- of broomatoom, een alkylgroep met 1-3 koolstof atomen of een alkoxygroep met 1-3 koolstofatomen weergeven, p = 0 of 1, q = 0 of 1 en r = 0, 1 of 2, voorstellen of waarin Y,j en tezamen een binding aangeven, B een Phe-groep of een Phe-groep waarvan de fenylring gesubstitueerd is door F, Cl, Br, NO^, NE^, OH, alkyl met 1-3 koolstofatomen of alkoxy met 1-3 koolstofatomen voorstelt, C = L- of D-Trp, die desgewenst in de benzeenring gesubstitueerd is door F, Cl, Br, Ν02» NH2, OH, alkyl met 1-3 koolstofatomen of alkoxy met 1-3 koolstofatomen, D = Lys, waarin de -aminogroep door methyl gesubstitueerd kan zijn, E Thr, Ser , Val voorstelt, . e F = C00R.J, CH20R2, C0-NR3R4, of -CO-N^J Xt R^ een waterstofatoom of een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen voorstelt, R^ een waterstofatoom of de rest van een . 870 2 $*»3 -103.- t ,. 5 fysiologisch aanvaardbare , fysiologisch hydrolyseerbare ester weergeeft, een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen, een fenylgroep of een fenylalkylgroep met 7-10 * _ koolstofatomen voorstelt, doch indien = -CH(R^)-X^ , slechts een waterstofatoom of de methylgroep is , R^ een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen of een groep met formule IX voorstelt, R^ de rest van een natuurlijk amino- ^ zuur ( waaronder waterstof) voorstelt, die aan het -koolstofatoom is geplaatst, of een H0-CH2-CH2- of HOC-CH^)^ groep, waarin de groep met formule IX de L- of D-configuratie heeft, ^^.R^ X1 is COOR^, CH20R2 of CON , ^Ε7 15 waarin R^ een waterstofatoom of een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen voorstelt en R^ een waterstofatoom , een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen, een fenylgroep of een fenylalkylgroep met 7—10 20 koolstofatomen weergeeft, waarin de resten B, D en E m de L-vorm voorkomen en de resten op de plaatsen 2 en 7, evenals de resten Y^4) en Y24) , onafhankelijk van elkaar, in de D- of L-vormen voorkomen, alsmede de zouten en complexen van deze verbindingen.

2. Een suikerderivaat van biologisch aktie- ^ ve peptiden a) met formule I, waarin de rest met formule Ia de desoxyrest van een ketose is, welke rest via de C^-groep met de NH-groep van een biologisch aktief peptide is verbonden , en P de rest van een biologisch aktief peptide ^ met formule N^-? is, waarin de NH-groep aan het stikstofterminale uiteinde of in een zijketen van het peptide aanwezig is, b) met formule II, waarin de groep met formule Ha de desoxyrest van een aldose is, waarbij de groep via de vrije binding met de NH-groep van een biologisch aktief peptide is verbonden, en 20 . P de rest van een biologisch aktief peptide M193-10-7-85 .8702345 - 2 - * * 1 IT met formule ίΠ^-Ρ voorstelt, waarin de NH^-groep aan het stikstof-terminale uiteinde of in een zijketen van het peptide P aanwezig is, c) met formule III, waarin G^-CO de rest van een uronzuur of van 5 een polyhydroxymono- of di-carbonzuur voorstelt, Ry een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen of een alkanoylgroep met 1-4 koolstofatomen weergeeft en P de rest van een biologisch aktief 10 peptide dat tenminste 8 aminozuureenheden met formule N^-P bevat, is, waarin NR. aan het stikstofterminale uiteinde of in een zijketen van het peptide aanwezig is , d) met formule IVa, IVb, IVc of IVd, waarin 15. de rest van een biologisch aktief peptide met formule l^N-P voorstelt, de groepen samengevat onder formule IV suikerresten zijn, Ry een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen of een alkanoylgroep met 1-4 koolstofatomen voorstelt, en 20 Q, Q’, Q^enQ'" groepen zijn die de peptiderest met de suikerrest verbinden, e) met formule Va of Vb , waarin Y = H2 of H, OH, c = 2 , 3 of 4 en 25. de rest van een biologisch aktief peptide met formule ^N-P voorstelt, waarin de NH-groep gebonden aan P aan het stikstofterminale uiteinde of in een zijketen van het peptide aanwezig is en elk van de vrije hydroxylgroepen in het polyolgedeelte van de verbindingen met formule V desgewenst op een glycosylische wijze met een reduce-30 rend mono- , di- of oligosaccharide of aminosuiker is verbonden, alsmede de 2uuradditiezouten en complexen van deze polypeptidederivaten , onder . g de voorwaardai dat a) in de hiervoor genoemde verbindingen met formule I, P een andere betekenis heeft dan een groep van een gastrine-35 peptide met een koolstofterminale groep in -Asp-Phe-N^, . 870 2345 -190- 1 ' ï b) indien in de verbindingen met formule IVb Q' een fenylring bevattende , tweewaardige groep voorstelt of indien in de verbindingen met formule IVd Q’" deprest van een alifatisch dicarbonzuur is, P-NH9 geen natuurlijk insuline is en 5 c) indien in de verbindingen met formule III G^-CO de rest van een desgewenst ge N-acyleerd muramine- zuur is, de tweede aminozuurrest aan het stikstofterminale uiteinde van het peptide P-NHR^ geen rest van een aminodicarbonzuur is.

2. Werkwijze voor het bereiden van een verbinding a) met formule I, waarin de groep met 8702345 * f - 69 - formule Ia de desoxyrest van een ketose is , waarbij de rest via de C^-groep met de NH-groep van een biologisch aktief peptide is gebonden , P de rest van een biologisch aktief 5 peptide met formule N^-P is, waarin de NH-groep aan het stikstof- terminale uiteinde of in een zijketen van het peptide is geplaatst, b) met formule II, waarin de groep met formule Ha de deoxyrest van een aldose is ,waarbij de groep via de vrije binding met de NH-groep van een biologisch ak-10 tief peptide is gebonden, en P de rest van een biologisch aktief peptide met formule N^-P is, waarin de NH-groep aan het stikstof-terminale uiteinde of in een zijketen van het peptide P is geplaatst, 15 c) met formule III, waarin de rest van een uronzuur of van een polyhydroxymono- of -di-carbonzuur voorstelt, Ry een waterstofatoom of een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen weergeeft en 20 p de rest van een biologisch aktief peptide is dat tenminste 8 aminozuuteenheden met formule H^N-P bevat, waarin NR aan het stikstofterminale uiteinde of in een y zijketen van het peptide is geplaatst, d) met formule IVa, IVb, IVc of IVd, 25 waarin P de rest van een biologisch aktief peptide met formule ^N-P is G,, G!, G?! en G.’'' suikerresten voor- 4 4 4 4 stellen , en

30 Q, Q’, Q'' en Q’'* groepen zijn die de peptidereste met de suikerrest verbinden, waarbij de NH-groep - £ gebonden aan P aan het stikstofterminale uiteinde of in een zijketen van het peptide is geplaatst, e) met formule Va of Vb , waarin

35 Y = H2 of H, OH, c = 2, 3 of 4, en P de rest van een biologisch aktief £>/ 0 2 34 5 i ‘ - 70 - peptide met formule I^N-P is , waarin de NH-groep gebonden aan P aan het stikstofterminale uiteinde of in een zijketen van het peptide aanwezig i's en elk van de vrije hydroxylgroepen in het polyolgedeelte van de verbinding 5 met formule V desgewenst op glycosylachtige wijze met een reducerend mono-, di- of oligosaccharide of aminosuiker is verbonden, alsmede de zuuradditiezouten en complexen van deze polypeptide-derivaten, onder de voorwaarden dat 10 met het kenmerk, dat a) tenminste één beschermende groep, 15 die in een metsuiker gederivatiseerd peptide aanwezig is, wordt i verwijderd, of b) twee peptideeenheden, waarvan elk tenminste één aminozuur of een aminoalkohol in een al of niet beschermde vorm bevat en één peptideeenheid de suikergroep bevat, 20 met elkaar via een amidebinding worden gebonden, waarbij de peptidebinding zodanig is , dat de gewenste aminozuurvolgorde wordt verkregen en daarna desgewenst stap a) van de werkwijze wordt uitgevoerd, of c) tenminste één suikerrest in een al of 25 niet beschermd peptide wordt ingevoerd en daarna desgewenst stap a) van de werkwijze wordt uitgevoerd, d) een functionele groep van een al of niet beschermd, met een suiker gederivatiseerd peptide wordt omgezet ineen andere functionele groep of wordt verwijderd, zodat 30 een al of niet beschermd geglycosyleerd peptide wordt verkregen en in het laatste geval stap a) van de werkwijze wordt uitgevoerd, * of. e) of met suiker gederivatiseerd peptide , waarin de mercaptogroepen van Cys-groepen in vrije vorm aanwezig 35 zijn, wordt geoxydeerd tot een peptide waarin twee Cys-groepen door een S-S-brug met elkaar zijn verbonden en de verbinding in 8702345 f £ - 71 - vrije vorm, de vorm van een zuuradditiezout of een complex, wordt afgescheiden.

3 -CH2-S-S-CH2-CH2-COOH, -(CH2>s-C00H of -CH2~S-Y3 is, Yg een alkylgroep met 1-4 koolstofatomen, een benzylgroep die desgewenst gesubstitueerd is door methyl of methoxy of een CHgCONH-CI^-groep weergeeft, 10. een geheel getal van 1-4 is, Ag is Thr of D-Thr, s een geheel getal van 3-5 is, A_ de aminoacylgroep van een neutraal, O lypofiel L-Si-aminozuur voorstelt, Ap de aminoacylgroep van een neutraal, lypofiel , L- of D-^-aminozuur is, en een polypeptidegroep voorstelt, die op de plaatsen 10-31 van een natuurlijk calcitonine of een derivaat of analogon daarvan met hypocalcemische werking aanwezig is, waarin de 20 1-4 Yj’-groepen in formule X, onafhankelijk van elkaar, al of niet gelijk kunnen zijn, en , met uitzondering van de aminoacylgroep Ag, alle aminozuurgroepen in formule X de L- of D-configuratie kunnen hebben, alsmede de zouten en complexen van deze verbindingen.

3. Een suikerderivaat volgens conclusie 30 1 of 2 van een verbinding met formule VIII, waarin a) een waterstofatoom, een alkylgroep met 1—3 koolstofatomen of een alkanoylgroep met 1-4 koolstofatomen voorstelt, de > N-CH(Z,)-C0 groep 15 1 1. een (L)- of (D)-fenylalaninerest voorstelt, die desgewenst gesubstitueerd is door halogeen, NO2, N^, OH, alkyl met 1-3 koolstofatomen en/of alkoxy met 1-3 koolstofatomen, of 2. de rest van een natuurlijk lypofiel ^ -aminozuur of van een overeenkomstig (D)-aminozuur, dat verschilt van ^ die vermeld onder 1) , waarin Z.J in de >N-CH(Z^)-CO-groep de rest van een aminozuurresidu gedefinieerd onder 1) en 2) voorstelt, A' een waterstofatoom of een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen is 25 Y1 en Y2 , onafhankelijk van elkaar, 1. waterstof,

3. Werkwijze voor het bereiden van een peptidealkohol die aan het koolstof-terminale uiteinde van de 5 peptideketen twee alkoholgroepen of één alkoholgroep en een thiol- groep bevat, met het kenmerk, dat de peptidealkohol wordt verkregen door zure hydrolyse van een acetaal van de peptidealkohol en een hars die formylfenylgroepen bevat.

4. Een verbinding volgens conclusie 3, die 25 ___ N -£P(-glucosyl(l-4)-deoxyfructosyl7-(D)-Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol, is.

4. Werkwijze volgens conclusie 3 voor 10 het bereiden van een peptidealkohol met'formule ^^-CHR1 - XH Y - CO - NH - CH \ CH-OH 15 waarin Y de rest van een peptidealkohol voorstelt, R.| een waterstofatoom of de methylgroep 20 weergeeft, en X = 0 of S, met het kenmerk, dat een hars met formule Ir , die de peptidealkohol bevat, waarin © de rest van een onoplosbare , synthe- 25 tische hars is en Z de direkte binding of een groep die de hars met de geacetaliseerde formylfenylgroep verbindt, voorstelt, waarin de geacetaliseerde CHO-groep meta of para is geplaatst t.o.v. de Z-groep en een aantal geacetaliseerde formylfenylgroepen 50 met een molecuul van het harspolymeer zijn verbonden, onder zure om-standigheden wordt gehydrolyseerd.

5. Een suikerderivaat van een calcitonine met formule X, waarin 2Q R een waterstofatoom of een R"C0 groep • g voorstelt, R"C0 de acylgroep van een carbonzuur weergeeft, Y,|1 de groep is die aan het Q(-koolstof-atoom van een -aminozuur is gehecht, .8702543 ' * ^ ί -103- Y2’ de groep aan het tX-kool- stofatoom van een 0(-aminozuur , -CH~-S-S-CH„-CH-COOH, 2 2 | ’ nh2

5. Werkwijze volgens conclusie 4, waarin de Θ- ^-polystyreengroep is·

6. Een verbinding volgens conclusie 1 of 25 2, waarin het peptide een LHRH-antagonist is.

6. Werkwijze volgens conclusie 4, waarin Z een groep met formule -(D)^-Q ^-Q^-(E) ^- *-s » waarin C / u 2 3 4 5 J > - 72 - Q de rest van een reaktieve groep voorstelt die aan de hars is gebonden, Q2 de rest van een reaktieve groep weergeeft die aan de geacetaliseerde formyl-fenylgroep is gebonden, ·* D een rest voorstelt die de -groep met het polymeer verbindt, E een groep is die de (^“groep met de geacetaliseerde formylfenylgroep verbindt, en p en q , onafhankelijk van elkaar, 0 of 10. zijn.

7. Een derivaat volgens conclusie 1 , bereid volgens een Amadori of Heyns herschikking.

7. Werkwijze volgens één der conclusies 3- 7, waarin Z een -CH -NH-CO-CH-(O) -groep voorstelt, 2. m R 15 waarin R een waterstofatoom of de methylgroep voorstelt, m = 0 of 1 en 20 een polystyreengroep weergeeft.

8. Een derivaat volgens conclusie 1 of 2, waarin het peptide waarmee de suikerrest is verbonden een hormonale, 20 hormoonremmende, enzymatische , enzymremmende of immunomodulerende werking uitoefent. * 9. Werkwijze voor het bereiden van een suikerderivaat van een biologisch aktief peptide volgens één der conclusies 1-8, met het kenmerk, dat 25 a) tenminste één beschermende groep, die in een met suiker gederivatiseerd peptide aanwezig is , wordt verwijderd ,of .870234b i -104- b) twee peptideeenheden , waarvan elk tenminste één aminozuur of een aminoalkohol in een al of nrèt beschermde vorm bevat en één peptideeenheid de suikerrest bevat , met elkaar via een amidebinding worden verbonden, waarbij de peptidebinding 5_ zodanig is dat de gewenste aminozuurvolgorde wordt verkregen en daarna desgewenst stap a) van de werkwijze wordt uitgevoerd, of c) tenminste één desgewenst beschermde suikerrest in een al of niet beschermd peptide wordt ingevoerd en daarna desgewenst stap a) van de werkwijze wordt uitgevoerd, of 10 d) een functionele groep van een al of niet beschermd , met suiker gederivatiseerd,peptide wordt omgezet in een andere functionele groep of wordt verwijderd, zodat een al of niet beschermd geglycosyleerd peptide wordt verkregen en in het laatste geval stap a) van de werkwijze wordt uitgevoerd, of 15 e) een met suiker gederivatiseerd peptide, waarin de mercaptogroepen van de Cys-groepen in vrije vorm bestaan, wordt geoxydeerd tot een peptide waarin twee Cys-groepen door een S-S-brug met elkaar zijn verbonden.

8. Werkwijze volgens één derconclusies 4- 7, waarin X = 0 en R^ de methylgroep voorstelt.

9. Werkwijze voor het bereiden van een peptidealkohol in hoofdzaak zoals hiervoor is beschreven aan de 25 hand van één van de voorbeelden.

10. Een farmaceutisch preparaat dat een 20 verbinding volgens één der conclusies 1-8 in vrije vorm en/of in de vorm van een farmacologisch aanvaardbaar zout en/of complexvorm, desgewenst tezamen met een farmaceutische drager , bevat.

10. Werkwijze voor het bereiden van een suikerderivaat van conclusie 1 , in hoofdzaak zoals hiervoor is beschreven aan de hand van één van de voorbeelden.

11. Een verbinding volgens één der conclusies 1-8 in een farmaceutisch aanvaardbare vorm voor toepassing als 25 farmaceuticum.

11. Een verbinding verkregen volgens 30 een werkwijze van één van de conclusies 1-10. 12 .Esn derjb/aat van aan suiter en een biologisch aktief peptide met een langere werkingsduur vergeleken met het niet met suiker gemodificeerde peptide, waarbij het peptide tenminste één suikerrest bevat die aan een aminogroep van één van de 35 aminozuureenheden is gebonden met behulp van een andere koppeling dan een direkte N-glycosidische binding en bovendien , indien het een condensatieprodukt van een carboxylgroep bevattende suikercomponent w 0 2 3 4 5 K I - 73 - en een peptide met minder dan 8 aminozuureenheden betref t^ door een andere koppeling dan een direkte amidekoppeling.

12. Werkwijze voor het bereiden van een peptidealkohol die aan het koolstof-terminale uiteinde van de peptide-keten twee alkoholgroepen of één alkoholgroep en een thiolgroep bevat, met het kenmerk, dat de peptidealkohol wordt bereid door zure hydrolyse 30 van een acetaal van de peptidealkohol en een hars die formylfenylgroepen bevat.

13. Werkwijze volgens conclusie 12. voor het bereiden van een peptidealkohol met formule .8702543 35 -ίβ^ CHf^-XH Y-CO-NH-CH , ch2oh 5 waarin Y de rest van een peptidealkohol, een waterstofatoom of een methyl- groep , en X een zuurstof- of zwavelatoom voorstellen, met het kenmerk, dat een hars met formule Ir , die de peptidealkohol bevat, waarin (p) de rest van een onoplosbare, synthetische hars is en Z de direkte binding of een rest die de hars met de geacetaliseerde formylfenylgroep verbindt, is, waarin de geacetaliseerde CHO-groep meta of para ten opzichte van de Z-groep is geplaatst, en een aantal geacetaliseerde formylfenylgroepen zijn verbonden met een molecuul van de harspolymeer, onder zure omstandigheden wordt gehydrolyseerd.

13. Een derivaat volgens conclusie 12, waarin het peptide tenminste 8 aminozuureenheden bevat.

14. Verbindingen met formule Ir, waarin φ de rest van een onoplosbare , synthetische hars voorstelt, Z een direkte binding of een rest die 2^ de hars met de geacetaliseerde formylfenylgroep verbindt, weergeeft, X een zuurstof- of zwavelatoom is, Rj een waterstofatoom of de methylgroep voorstelt, en Y de rest van een peptidealkohol weer-2Q geeft, die beschermende groepen kan bevatten, waarin de geacetaliseerde CHO-groep meta of para ten opzichte van de Z-groep is geplaatst en een ^ aantal (geacetaliseerde) formylfenylgroepen met een molecuul van het harspolymeer zijn verbonden, of verbindingen met formule Vr, waarin 32. een beschermende groep van de amino- funktie voorstelt en de acetaalgroep meta of para ten opzichte van de Z-rest is geplaatst en de hars een aantal geacetaliseerde formylfenylgroe- . 870 2 34 3 4 * . 1 ί -iö£- pen bevat, of verbindingen met formule VIr, waarin E een rest voorstelt die de ' ëroeP met de geacetaliseerde formylfenylgroep verbindt, C^' een reaktieve groep weergeeft , die met een andere reaktieve groep kan reageren die met een synthetische hars is verbonden,en q = 0 of 1, waarbij de acetaalgroep meta of para t.o.v. de Q«'-(E) -groep aanwe- 10 . . - q Zlg is, of verbindingen met formule ^.CHO ®-z' 15 waarin Q) de rest van een onoplosbare , synthetische hars is en Z' eenrest weergeeft die de hars met de formylfenylgroep verbindt, waarbij de formylgroep meta of para t.o.v. de Z'-groep is geplaatst en de hars een aantal formylfenylgroepen bevat.

14. Een derivaat volgens conclusie 12 of 13, waarin het peptide ten hoogste 32 aminozuureenheden bevat.

15. Verbindingen als beschreven in de beschrijving en/of voorbeelden.

15 HCL’ïÊ--i) · formule Ac-(D)Phe(pCl9-(D)Phe(pCl)-(D)Trp-Ser-Lys(N^ )-(D)Phe-Leu-Arg-Pro-(D)Ala-NH2, ii) formule LXV, iii) formule 20 Φ (D)Phe(pCl)^- (D j)Phe (pCl)-(D)Trp- Ser-Tyr- (D ) Ly s-Leu-Ar g-Pr o- (D ) Al a-NI^ ® L· OCkl £VB1 B29 |>|ONr—^CHj_— 92.N , h , Nfc -tris-deoxyfructosyl- varkensinJiline.

93. N^jLys ^ ^-N£,Lys^-N^-tris-(1-deoxy- 25 -2- fructosyl)-/DAla_/ hpGRF-(1-29)-NH2· 94. if^-N^-bis(l-deoxyfructosyl) Lys- vasopressine.

95. Een verbinding volgens één der conclusies 12-94 als hydraat. 30 ....

96. Een verbinding volgens een der con- ®·” clusies 12-94 in een zuuradditiezoutvorm.

97. Een farmaceutisch preparaat dat één of een aantal verbindingen volgens één der conclusies 12-94 in vrije vorm , en/of in een farmaceutisch aanvaardbare zoutvorm 35 en/of complexvorm, desgewenst tezamen met een vloeibare of vaste drager, bevat. 8702345 » * τ - 85 -

98. Een preparaat volgens conclusie 97 dat geschikt is voor orale toediening.

99. Een preparaat volgens conclusie 97 dat geschikt is voor toediening via de neus. ^ 100. Een verbinding volgens één der conclusies 16-94 in een farmaceutisch aanvaardbare vorm voor toepassing als farmaceuticum.

101. Een verbinding volgens conclusie 100 voor toepassing bij diabetes, het behandelen van zweren of psoriasis.

102. Verbindingen met formule Ir, waarin <D de rest van een onoplosbare, synthetische hars is, ^ Z een direkte binding of een groep die de hars met de geacetaliseerde formylfenylgroep verbindt, voorstelt, X = O of S, R. een waterstofatoom of de methylgroep 20. voorstelt en Y de rest van een peptidealkohol is, die beschermende groepen kan bevatten, waarbij de geacetaliseerde CHO-groep meta of para ten opzichte van de Z-groep is geplaatst en een aantal (geacetaliseerde) formylfenylgroepen aan een molecuul 25 van het harspolymeer is gebonden.

103. Verbindingen met formule Vr, waarin ® de rest van een onoplosbare, synthetische hars is, Z de direkte binding of een groep die 30 de hars met de geacetaliseerde formylfenylgroep verbindt, voorstelt, ' * X = 0 of S, Rj een waterstofatoom of de methylgroep voorstelt en A een beschermende groep van de ammofunktie weergeeft en de acetaalgroep meta of para geplaatst is 6702345 f - 86 - ten opzichte van de Z-groep en de hars een aantal geacetali-seerde formylfenylgroepen bevat.

104. Verbindingen met formule VIr, waarin 5. een zuurstof- of zwavelatoom voorstelt, R,j een waterstofatoom of de methyl- groep weergeeft, A een beschermende groep van de amino- 10 funktie is, E een rest voorstelt die de groep met de geacetaliseerde formylfenylgroep verbindt, een reaktieve groep is die met een andere reaktieve groep die aan een synthetische hars is gebonden 15 kan reageren en q = 0 of 1, waarbij de acetaalgroep meta of para geplaatst is ten opzichte van de groep,

105. Verbindingen met formule LXXIII , 20 waarin (p) de rest van een onoplosbare , synthetische hars en Z' een groep die de hars met de formylfenylgroep verbindt, voorstellen, waarbij de formylgroep meta 25 0f para ten opzichte van de Z^-groep is geplaatst en de hars een aantal formylfenylgroepen bevat.

106. De verbinding met formule LXXIV

107. Werkwijze voor het synthetiseren van octreotide in de vaste fase.

108. Werkwijze voor het synthetiseren van een peptide met twee alkoholgroepen of één alkoholgroep en eenthiolgroep in de vaste fase.

109. Een peptide verkregen door synthese volgens conclusie 107 of 108.

110. Werkwijze als beschreven in de beschrij ving en/of voorbeelden. 8702345 \ l """ 111. Verbindingen en preparaten beschreven in de beschrijving en/of voorbeelden.

112. Gevormde farmaceutische preparaten. -o-o-o- f V OctrooibureauVriesendorp & Gaode anno 1833 - J(j~ ^ 2514 BB 's-Gravenhage Telefoon 070-61 47 21* —______ Dr. Kuyperstraat 6 ^ I ’s—Gravenhage,9 oktober 1987 •9 0KTI987 Wijzigingenblad behorende bij de Nederlandse O.A.No.8702345 SANDOZ AG te BAZEL, 1^"*^ . **^*1 Zwitserland. P" — " ƒ I 15 0KTI987 j vervangen door: "De uitvinding verschaft een suikerderivaat van een biologisch aktief peptide, welk derivaat een langdurige werking vergeleken met het niet met suiker gemodificeerde peptide heeft en tenminste aan een van de aminozuureenheden een suikerrest bevat die door een andere koppeling dan een direkte N-glycosidische binding aan een aminogroep daarvan is gebonden en bovendien, indien hd: een condensatieprodukt van een suiker die een carboxylgroep bevat en een peptide met minder dan 8 aminozuureenhe-den betreft, door een andere koppeling dan een direkte amidebinding". Blz. 1 regel 17 - "de peptidestructuur bedoeld die " vervangen door: "het structureel overeenkomstige peptide bedoeld dat" 15 blz. 1 regels 24-27 vervangen door: * £ "Er werd nu gevonden dat het opnemen van een suikerrest of van suikerresten, zelfs indien gebonden op een andere wijze dan normale glycosylering, bijvoorbeeld van Asn of Ser, deze eigenschappen verleent". 20 blz_;__j__regel_29 - "aan" vervangen door : "van" .8702345 -2- » Ml 93-10-7-85 biz. 2 tussen de regels 1 en 2 opnemen; * ft -i3- "De hierin gebruikte uitdrukking "aminozuureenheid" omvat eveneens een aminoalkoholeenheid , bijvoorbeeld een gereduceerd aminozuur". ** blzi_2_regel_22 - tussen "bekend" en "oligosaccharide" opnemen: "mono- of" : "eveneens" schrappen tO blz.2 tussen r.35 en 36 opnemen: "in een aanbevolen groep van de verbindingen volgens de uitvinding is de suikerrest door een andere koppeling dan een direkte N-glycosidische of direkte amidebinding aan een aminogroep van het peptide gebonden". 15 blz. 3 regel 3: "Aminozuren" vervangen door "Aminozuureenheden" blz. 3 regel 22: "G^" moet zijn: "G3CO" blz. 3 regel 24 vervangen door; 20 ", een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen of een alkanoylgroep met 1-4 koolstofatomen weergeeft en" blz. 3_regel 32 tussen "zijn" en "en" opnemen: 25 "Ry een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-5 koolstofatomen of een alkanoylgroep met 1-4 koolstofatomen" blz. 4 regels 15-20 vervangen door: - "b) indien in de verbindingen met formule IVb Q' een fenylring bevat-50 tende tweewaardige groep voorstelt of indien in de verbindingen met formule IV d Ql,,de rest van een alifatisch dicarbonzuur voorstelt, * C P-NH^ geen natuurlijk insuline is, c) ihdien in de verbindingen met formule III G3CO de rest van een desgewenst ge N-acyleerd muraminezuur 55 voorstelt, de tweede aminozuurrest aan het stikstofterminale uiteinde van het peptide P-NHRy geen rest van een aminodicarbonzuur zal zijn" .8702345 r 1 blz .__4_regel_25: "(G^-G^)" schrappen. - tussen "suikerderivaten" en "met" opnemen; 'f - "van peptiden" blz. 4 regel 32 vervangen door: "één vrije aminogroep aan de peptiderest, deze derivaten bevatten bijvoorbeeld 2 of 3" 10 blz. 5 regel 16 - opnemen tussen "is," en "bijvoor-": "een van de groepen Gg en G^ een waterstofatoom voorstelt en de andere een waterstofatoom of CH2OH is," ^ blz1_7_regels_ji6_en_i7 vervangen door: "Voorbeelden van uronzuren zijn glucuron- en galacturonzuren". 2Q "groeihormoon" vervangen door "GRF" blz. 9 regel 1: "suikerrest" vervangen door "desgewenst beschermde rest" 25 blz^_U)_regel_34: "etherverbindingen" vervangen door "acetaalverbindingen" blz.11, regel 7: "hydroxylgroep" vervangen door "hydroxylgroepen" blz. 11 regels 36 en 37: 2q "somatostatine" vervangen door "somatostatinepeptiden" blz. 12 regel 23: - £ "is" vervangen door "zijn," 35 blz. 17 regel 8 + blz. 18 regel 14: "vee" vervangen door "rund" ,870234b blz. 22 regel 21; t , 14- de tweede formule vervangen door : Ci^S-S-CE^-CH (NH2)~COOH blz. 23 regel 32 vervangen door: 5 "D-Hys, D-His (Bzl)" blz. 23 regel 33 vervangen door: "D-Lys of D-Om, beide desgewenst" 10 blz. 23 regel 36 vervangen door: "D-Phe (p-NH2) of" blz. 24 regel 18: 15 de komma tussen "D-Phe" en "(p-Cl)" vervalt blz. 24 tussen regel 21 en 22 opnemen: "De desgewenst uitgevoerde substitutie is bij voorkeur monosubstitutie" 20 blz. 24 regel 23: "en" schrappen blz. 24 regel 27: "E^" moet zijn "F^" 25 blz. 25 regel 1: H2N-LHRN" moet zijn "H^-LHRH" blz_;__25_rege 1_ 1_: "groep van een" schrappen 30 blz. 25 regel 9 vervangen door: "De uitgangsmaterialen en de synthese voor de niet gemodificeerde LHBH-" ‘ ® blz. 25 regel 17 vervangen door : "c) groeihormoonafgevende factor" 35 blz. 29 regel 11 vervangen door: "weg van de hars zijn geplaatst door zogenaamde "spacers" tussen de" .870234b t ί D1- blz. 30 de regels 10-13 vervangen door: ’’Alleen beschermende groepen in de zijketens en de amino beschermende groep van het laatst toegevoegde aminozuur mogen labiel voorhet zuur zijn en worden dan gelijktijdig van de hars afgesplitst onder terug-vorming van de peptidealkohol" blz. 30 regel 22: "of’ moet zijn "en" IQ blz. 35 regels 22 en 23 - de titel van voorbeeld 10 moet zijn: "N°^ -(0-°C-galactosyl-(1-6)-desoxyfructosyl-SMS" " aanvullen met: " ~4,7° (c=1,0 in 95%-ige azijnzuur)" 15 blzi_39_regel_26 aanvullen met: " -2,9° (c=1,0 in 95%-ige azijnzuur)" 20 blz_1_48_regel_1_5_+_blz^_49_regel_7 : "N" moet zijn "N& " blz.__49_regel_9 aanvullen met: "-37,4°(c=0,155 in 95%-ige azijnzuur)" 25 blz. 50 regels 9 en 10, de titel van voorbeeld 45 vervangen door: "Voorbeeld 45: Ac-(D)-Phe(4-C1)-(D)Phe(4-C1)-(D)Trp-Ser-Tyr-(D)Lys formule LXI" 30 blz. 51 regel 20(voorbeeld 47): * £ "N." (2x) moet zijn "N^ " ]?l£i_:i:Lrege 1_ 15: 35 "trifluormethyl en methanol" moet zijn "trifluorethanol en methyleenchloride" blz, 56 regel 27: "Labormatic" moet zijn "Labomatic" .870254¾ i?" blz. 57 regels 23/24; "no 1" schrappen blz. 57 regel 31: "23" moet zijn "2,3" ^ blz» 58 regel 32 vervangen door: "geneesmiddelgehalte met behulp van bijvoorbeeld RIA" blz. 58 regel 33: "met proef no. 3" vervangen door "bij deze proef" 10 blz. 59 regel 11: "na bijvoorbeeld" vervangen door "bijvoorbeeld na" blz. 5 regel 13: "de langere" schrappen blz. 60 regels 5-8 vervangen door: 15 ** Een andere proef is de volgende: Men sneed van mannetjesratten de koppen af en verzamelde 1 uur na het toedienen van de verbinding die de GH-secretie remt bloed in verschillende, logarithmisch bepaalde , doses". 20 blz. 60 regel 10: "de" vervangen door "deze" blz. 60 regel 12: "no.5" schrappen blz. 60 regels 19-22 vervangen door : ^ "in tegenstelling met natuurlijk somatostatine zijn de GH-secretie remmende verbindingen volgens de uitvinding bij deze proef gedurende een lange tijdsperiode (bijv. 6 uren) in sterke mate aktief" blz. 60 regel 23: "de" vervangen door "deze" 30 blz. 60 regel 34(vanaf "waarbij") , 35 en 36: schrappen - C - blz. 61 regel 3: "doorprikken van" vervangen door "uit" blz. 61 regel 5: de gehele zin schrappen 35 blz. 61 regel 7: "bij" vervangen door "na" - * .8702345 -3¾ - ί ‘ blz. 61 regel 12: "A" schrappen biz. 61 regels 19-2_1, de gehele zin vervangen door: "Deze verbindingen volgens de uitvinding zijn daardoor geïndiceerd 5 voor indicaties waarbij een remming van de GH-afscheiding wenselijk is" ^Ιζ^_6_1 .regels _21/22: "Onder de hoofdindicaties" vervangen door "Onder indicaties" 10 bl z ^__6_1__rege 1_23: "woekerende" vervangen door "sterk toenemende" vervangen door: ^ "De GH-secretie remmende verbindingen volgens de uitvinding" 31-35 vervangen door: "De GH-secretie remmende verbindingen volgens de uitvinding remmen 2Q eveneens de afscheiding van maagzuur en verhogen de pH van het maagsap" blz. 62 regel 1: "de" vervangen door "deze" blz. 62 regels 3-7 tot "Na" vervangen door: 2^ "Aan ratten die hadden gevast werden in doses van ongeveer 0,05 mg/kg tot ongeveer 5 mg/kg via een maagbuis GH-secretie remmende verbindingen volgens de uitvinding toegediend, waarbij in de maag van de ratten slangen waren geïmplanteerd" 30 blz. 62 regel 10: deze zin schrappen ‘ £ kl£i_§£_regel£M 2_erM 3: "A" vervangen door "van voorbeeld 2" blz. 62 regel 14: na "cimetidine" toevoegen "bij dit onderzoeksysteem" .8702345 tussen "De" en "verbindingen" opnemen "GH-secretie remmende" biz. 62 regel 15: ί * -3Γ- blz. 62 regel 19/20: 5 "tumoren die maag-darmhormonen afscheiden " vervangen door : "gastro-entero pancreatische tumoren" blz. 62^regel 21; 10 tussen "De" en "verbindingen" opnemen "GH-secretie remmende" blz. 62 regel 25: "keratonisering" vervangen door "keratinisering" 15 blz. 62 regel 33: " 20 pg" vervangen door "20 mg" 20 tussen "de" en "verbindingen" opnemen "GH secretie remmende" blz. 63 regels 3-5 vervangen door: "De suikerderivaten van calcitonine en van de met calcitonine analoge derivaten volgens de uitvinding, meer in het bijzonder de derivaten 25 met formule X," blz. 63 regel 26: tussen "de" en "verbindingen opneraen "hypocalcemische" 30 blz. 63 regel 31: ",zalmcalcitonine" schrappen - blz. 63 regel 34: . "zalmcalcitonine" vervangen door "het niet.gemodificeerde peptide" 35 blz. 64 regel 2 vervangen door: "calciumspiegel na 3 uren nog even duidelijk was" .8702345 biz.. 64_regel_3 tussen "De" en "verbindingen " opnemen: "hypocalcemische" P * - si- blzA64 regel 5: "beïnvloeding van" vervangen door "effect-:op" ^ blz. 64 regel 9: "parathyroïde" vervangen door "parathyroïdeklier" blz. 64 regel 11: "stoornis" vervangen door "broosheid van het beendergestel" 10 blz. 64 regel 14: tussen "of" en "inactiviteit" opnemen "door" blz. 64 regel_22: ^ tussen "desgewenst" en "elke" opnemen "eenmaal" " bij voorkeur die welke " schrappen klSi.ö4_rege1_28: "De" vervangen door "Deze" 20 blz. 64_regel_36: "in de proestrus" vervangen door: " op een dag in de proestrus" blz. 65 regel 5: tussen "werd" en "berekend" opnemen "eveneens" 25 blz. 65 regels 5-7 : deze zin schrappen blz_. j65 jregel_ 8: "de" vervangen door "deze" blz. 65 regel 11: na "mg/kg" opnemen "s.c." 30 * blz^JiSjregeIs_l2-t4, deze zin vervangen door: "De remmende werking op de afscheiding van het lute'iniserend hormoon van de verbinding kan eveneens ra vitro worden onderzocht" 35 blz. 65 regel 16: "enzymdispersiemethode" vervangen door "methode" .8702345 ’ J -τ biz. 65 regels 20-24 vervangen door: "Daarna werden de cellen gewassen en 3 uren geincubeerd in 1 ml medium dat LHRH of de te onderzoeken verbinding bevatte. Aan het einde van de incubatie werd de supernatant verwijderd en met ^ specifieke radio-immunoassay op LH onderzocht " blz. 65 regels__25-27: deze zin schrappen jq blz. 66 regel 2: "20 mg" moet zijn "10 mg" blz. 66 regel 19; "beschikbaar" schrappen blz. 66, tussen de regels 19 en 20 opnemen: 15 "Voor de verbinding van voorbeeld 2 ligt een geïndiceerde dosis tussen 3 en 10 mg 3 maal daags , bijv. p.o. voor diabetes, zweren en acromegalie" blz. 66 regel 30: "Deze" vervangen door "De" 20 blz. 67 regel 10 toevoegen na "maag," : "en acromegalie voor de op somatostatine gelijkende verbindingen volgens de uitvinding" 25 blz. 102 regel 7 toevoegen: ", waaronder verlaging van de GH-afscheiding , diabetes mellitus, vermindering van afscheiding in de maag en acromegalie voor de op somatostatine gelijkende verbindingen volgens de uitvinding". 3°. s -o-o-o- Z S 4 3 Schut/MM r* '* Octrooibureau Vriesendorp & Gaade anno 1833 _ 2514 BB ‘s-Gravenhage Telefoon 070-61 47 21* Dr. Kuyperstraat 6 *~ ' rnf “9 0KTI987 ' 's-Gravenhage, 9 oktober 1987 ' Conclusies behorende bij de Nederlandse O.A. No. 8702345 SANDOZ AG BAZEL, f"*- * I Zwitserland. 150ΚΤΙ987 I

15. Een derivaat volgens conclusie 12, 13 of 14, waarin het derivaat meer dan één suikerrest bevat.

16. Een suikerderivaat van biologisch 10 aktieve peptiden a) mettormule I, waarin de rest met / formule Ia de desoxyrest van een ketose is, waarbij de rest via de CH2~gtoep met de NH-groep van een biologisch aktief peptide is gebonden en 15 , ... P de rest van een biologisch aktief peptide met formule N^'P is, waarin de NH-groep aan het stikstof-terminale uiteinde of in een zijketen van het peptide aanwezig is, b) met formule II, waarin de rest met formule Ha het desoxyresidu van een aldose is, waarbij de groep 20 ...... . via de vrije binding met de NH-groep van een biologisch aktief peptide is gebonden en P de rest van een biologisch aktief peptide met formule N^-? is, waarin de NH^-groep aan het stikstof- terminale uiteinde of in een zijketen van het peptide P aanwezig 25 is, c) met formule III, waarin Gg de rest van een uronzuur of van een polyhydroxymono- of di-carbonzuur is, R een waterstofatoom of een alkylgroep 30 y met 1-3 koolstofatomen voorstelt en P de rest van een biologisch aktief * peptide is die tenminste 8 aminozuureenheden met formule OT^-P bevat, waarin NR^ aanwezig is in het stikstofterminale uiteinde of in een zijketen van het peptide,, 35 d) met formule IVa, IVb, IVc of IVd , waarin P de rest van een biologisch aktief peptide met formule -, ü 2 3 4 5 I 4 - 74 - l^N^-P weergeeft, G^, G^, G^ en G^'1 suikerresten zijn en Q, Q*> Q" en Q,M groepen weergeven die de peptiderest met het suikerresidu verbindt, waarin de NH-groep gebonden aan P aan het stikstofterminale uiteinde of in een zijketen van het peptide aan-wezig is, e) met formule Va of Vb, waarin Y = H2 of H, OH, c = 2 of 3 of 4, en 10 . P de rest van een biologisch aktief peptide met formule ^N-P voorstelt, waarin de NH-groep die aan P is gebonden^aan het stikstofterminale uiteinde of in een zijketen van het peptide aanwezig is en elk van de vrije hydroxylgroepen in het polyolgedeelte van de verbindingen met formule V desgewenst op 15 ... een glycosylachtige wijze is gebonden aan een reducerend mono-, di- of oligosaccharide of aminosuiker , alsmede de zuuradditiezouten en complexen van deze polypeptidederivaten, onder de voorwaarden dat a) in de hiervoor genoemde verbindingen 20 i met formulel, P een andere betekenis heeft dan een groep van een gastrinepeptide met een koolstofterminale groep in -Asp-Phe-NH^, b) indien in de verbindingen met formule IVb, / de rest is van een uronylsuiker en G4 25 Q een alkyleengroep voorstelt, P niet als tweede aminozuur van het stikstofterminale uiteinde een aminozuureenheid bevattende twee carboxylfuncties heeft , of indien Q' een fenylring bevattende, tweewaardige groep is, g P niet de rest van een natuurlijk insuline kan zijn, waarbij alle hiervoor genoemde suikerresten (G^-G^) mono-, di- of oligosacchariden kunnen zijn en deze suikers heptosen, hexosen en/of pentosen , die als pyranosen of furanosen kunnen bestaan^ kunnen bevatten. 8702345 < 4 - 75 -

17. Een verbinding volgens conclusie 16 die één suikerrest bevat.

18. Een verbinding volgens conclusie 16 die twee suikerresten bevat.

19. Een verbinding volgens conclusie 16 die drie suikerresten bevat.

20. Een verbinding volgens één der conclusies 16-19 die een verbinding met formule I is.

21. Een verbinding volgens één der con-10 clusies 12-19 , waarin een suikerrest formule Vla heeft, waarin één van de groepen Ga en Gb een waterstofatoom voorstelt en de andere een hydroxylgroep is, één van de groepen Gc en Gd een waterstofatoom voorstelt en de andere een hydroxylgroep of 0-glycosyl-15 groep weergeeft, waarin de glycosylgroep kan worden afgeleid van een reducerend mono-, di- of oligosaccharide , en één van de groepen Ge en Gf een waterstofatoom is en de andere de hydroxylgroep weergeeft.

22. Een verbinding volgens één der 20 conclusies 12-14, waarin een suikerrest wordt gekozen uit deoxy-fructosyl, deoxytagatosyl, deoxysorbosyl,0(-glucosyl-(1-4)-deoxyfructosy1,0^-glucosyl(1-4)-O^-glucosyl(1-4)-deoxy-fructosyl .

23. Een verbinding volgens conclusies 12-19 , waarin een suikerrest formule VIb heeft, waarin 25 één van de groepen Ga en Gb een water stofatoom en de andere de hydroxylgroep voorstelt, één van de groepen Gc en Gd een waterstofatoom voorstelt en de andere de hydroxylgroep of een 0-glycosylgroep weergeeft, waarin de glycosylgroep kan worden afgeleid 30 van een reducerend mono-, di- of oligosaccharide , één van de groepen Ge en Gf een waterstofatoom voorstelt en de andere een waterstofatoom, , C00H, C^OH, -CH2~0-P(0)-(0H)2“ of C^O-glycosyl is, waarin de glycosylgroep kan worden afgeleid van een reducerend mono-, di- of oligosaccharide.

24. Een verbinding volgens conclusie 23, waarin een suikerrest is gederivatiseerd door een 8702345 - 76 - Amadori-herschikking van gentiobiose, melibiose, ribose, xylose, glucuronzuur of galacturonzuur.

25. Werkwijze volgens één der conclusies 16-19, welke formule III heeft.

26. Een verbinding volgens één der conclusies 12-19, waarin de suikerrest formule Vila heeft, waarin één van de groepen Ga» of een waterstofatoom is en de andere een vrije binding voorstelt, één van de groepen Gc of G^ een water-10 stofatoom voorstelt en de andere de hydroxylgroep weergeeft, één van de groepen G£ of een waterstofatoom voorstelt en de andere een hydroxylgroep of 0-glycosyl-groep is, waarin de glycosylgroep kan worden afgeleid van een reducerend mono-, di- of oligosaccharide, 15 één van de groepen Gg en G^ een waterstofatoom voorstelt en de andere de CE^OH groep of CH^-O- glycosylgroep voorstelt, waarbij de glycosylgroep een derivaat kan zijn van een reducerend mono- , di- of oligosaccharide.

27. Een verbinding volgens één 20 der conclusies 12-19, waarin een suikerrestformule Vllb heeft, waarin één van de groepen Gfl en G^ een waterstofatoom voorstelt en de andere een vrijetinding is, ééivan de groepen Gc en G^ een water-25 stofatoom is en de andere de hydroxylgroep weergeeft, één van de groepen Gg en G^ een waterstofatoom weergeeft en de andere een CI^OH of C^-O-glycosyl groep is, waarin de glycosylgroep een derivaat kan zijn van een reducerend mono-, di- of oligosaccharide.

28. Een verbinding volgens conclusie 26 of 27, waarin de suikerrest met behulp van een Heyns reaktievan D-fructose, lactulose, L-sorbose, D-tagatose of D- • C ribulose is afgeleid.

29. Een verbinding met formule III 35 zoals gedefinieerd in één van de conclusies 16-19.

30. Een verbinding volgens één der conclusies 12-19, waarin een suikerrest is afgeleid van gluconzuur, 8702345 * * - 77 - glucarinezuur, chininezuur, acetylmuraanzuur, acetylneuramine-zuur , D-glucosaminezuur, glucaronzuur of galacturonzuur .

31. Een verbinding met formule IVa, zoals gedefinieerd in één van de conclusies 16-19.

32. Een verbinding met formule IVb, zoals gedefinieerd in één van de conclusies 16-19.

33. Een verbinding met formule IVc , zoals gedefinieerd in één van de conclusies 16-19.

34. Een verbinding met formule IVd , 10 zoals gedefinieerd in één van de conclusies 16-19.

35. Een verbinding volgens één der conclusies 31-34, waarin Q , Q’, QT ’ of Q’*' is -C,H„,-C0, D 2b waarin b een geheel getal van 1-6 is.

36. Een verbinding volgens conclusie 15 31, waarin Q=C0 of CS.

37. Een verbinding met formule Va zoals gedefinieerd in één van de conclusies 16-19.

38. Een verbinding met formule Vb, zoals gedefinieerd in één van de conclusies 16 - 19.

39. Een verbinding volgens conclusie 37 of 38, waarin c = 3.

40. Een verbinding volgens één der conclusies 12—39» waarin het peptide een derivaat van somatostatine is.

41. Een verbinding volgens conclusie 37, waarin het derivaat 4-9 aminozuren bevat.

42. Een suikerderivaat met formule VIII, waarin A een waterstofatoom, een alkylgroep 30 met 1-3 koolstofatomen of een alkanoylgroep met 1-4 koolstofatomen ^ voorstelt, >N-CH(Z^)-C0 weergeeft 1> een (l)- of (D)-fenylalaninegroep, die desgewenst gesubstitueerd is door halogeen,Ν0^> ΝΙ^,ΟΗ, 35 alkyl met 1-3 koolstofatomen en/of alkoxy met 1-3 koolstofatomen, of i. / u 2 3 4 5 i v - 78 - 2. de rest van een natuurlijk, lypofiel hl-aminozuur of van een overeenkomstig (D)-aminozuur, dat een ander is dan die vermeld onder 1) waarin in_>N-CH(Z^ )-C0 de rest van een aminozuurgroep gedefinieerd onder 1) en 2) voorstelt, A' een waterstofatoom of een alkyl-groep met 1-3 koolstofatomen weergeeft, Yj en Y2, onafhankelijk van elkaar, 1. waterstof, 10 2) R !a -CO-C-(CH„) -H I 2 m ’ *b 15 waarin m een geheel getal van 1-4 is , R de methyl- of ethylgroep weergeeft en een waterstofatoom , de methyl- of ethylgroep is of 20 3) ^ CH2 -CO-CH I , waarin n een geheel getal van 1-5 is , of 4) -CO-NHR , waarin R een c * c 25 alkylgroep met 1-6 koolstofatomen met een rechte of vertakte keten is, of 5) -C0-NH-CH-C00R , Rd 30 waarin R^ de rest van een natuurlijk X-aminozuur (waaronder water-* £ stof ) is , dat aan het X -koolstofatoom is gehecht en R£ een alkylgroep met 1-5 koolstofatomen is, 6. een groep met formule LXVII 35 8/02345 r - 79 - waarin R^ en R£ , onafhankelijk van' elkaar, een waterstofatoom , de methyl- of ethylgroep en Rg en Rg, onafhankelijk van elkaar, _ 5 een waterstof-, fluor-,chloor- of broomatoom of een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen of alkoxygroep met 1-3 koolstofatomen voorstellen, p = 0 of 1, q = 0 of 1 en 10 r =0,1 of 2, voorstellen of waarin Y.| en Y2 tezamen een binding aangeven, B een Phe-groep of Phe-groep waarvan de fenylgroep gesubstitueerd is door F, Cl, Br, NO^, ΝΙ^,ΟΗ, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen of een alkoxygroep met 15 1-3 koolstofatomen voorstelt, C = L- of D-Trp , waarvan de fenylring desgewenst gesubstitueerd is door F, Cl, Br, NOg, N^, OH, alkyl met 1-3 koolstofatomen of alkoxy met 1-3 koolstofatomen, D Lys voorstelt, waarin de K-aminogroep 20 gesubstitueerd kan zijn door methyl, E = Thr, Ser, Val, F = C00R,, CH0OR , CO-NR.R, of 1 2 2 3 4 -CO-N TX1 „ O R^ een waterstofatoom of een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen voorstelt, R^ een waterstofatoom of de rest van een fysiologisch aanvaardbare , fysiologisch hydrolyseerbare 2Q ester is, ® Rg een waterstofatoom , een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen, een fenylgroep of een fenylalkylgroep met 7-10 koolstofatomen weergeeft, doch indien R^ een -CH(Rg)-X^-groep is, slechts een waterstofatoom of de methylgroep weergeeft,

25 R^ een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen of een groep met formule IX is, 8702345 I » - 80 - de rest van een natuurlijk aminozuur (waaronder waterstof) is, dat aan het -koolstofatoonr is geplaatst, of een of HO(—CH^)^ groep voorstelt, waarin de groep met formule IX de L- of D-configuratie kan hebben, X = COOR , CH OR, of r 1 1 Δ / \ ** CON is ) Ry Rg een waterstofatoom of een alkyl-groep met 1-3 koolstofatomen voorstelt, Ry een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen , een fenylgroep of een fenylalkylgroep met 7-10 koolstofatomen weergeeft,waarin de groepen B, D en E in de L-vorm voorkomen en de groepen op de plaatsen 2 en 7, evenals de groepen Y^4) en onafhankelijk van elkaar, in de D- of L- vorm bestaan, evenals de zouten en complexen van deze verbindingen.

43. Een suikerderivaat volgens conclusie 42 met formule Villa , VUIb, VIIIc , VUId , VUIe, waarin Q=CO of CS of VUIf.

44. Een verbinding volgens conclusie 43, met het kenmerk, dat de groep met formule h(a)z A' ch„-s-y. y,-s-ch9 « 11 | . 2 1 2 , 2 -N-CO-CO-N-CH-CO-B-C-D-E-NH-CH-F (D)-Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol , aangeduid als SMS , is.

45. Een verbinding volgens conclusie 44, die ï£^--deoxy-fructosyl-SMS is. ‘ « 46. Een verbinding volgens conclusie 44, die N^£fc(-glucosyl(l-4)-deoxyfructosyl7-SMS is.

47. Een verbinding volgens conclusie 44, die -glucosyl(l-4)-0(,-glucosyl(1-4)- (^-deoxy-fructosyl-SMS is.

48. Een verbinding volgens conclusie 44, 8702345 - 81 - o( die N -f ruc tofuranuronzuur-SMS is.

49. Een verbinding volgens conclusie 44, die N^deoxysorbosyl-SMS is.

50. Een verbinding volgens conclusie 5 44, die l^-ZÖ-ί^-D-glucosyl-(1-4)-deoxyfructosyl7-SMS is.

51. Een verbinding volgens conclusie . X 44, die N -L(-)-deoxyfructosyl-SMS is.

52. Een verbinding volgens caiclusie ( Λ * 44, die N -(0-|^-D-glucosyl-(1-6)-deoxyfructosyl/-SMS is.

53. Een verbinding volgens conclusie 44, die N1-£θ- |^~D-glactosyl-(1-4)-deoxyfructosyl/-SMS is.

54. Een verbinding volgens conclusie 44, die -glactosyl-(1-6)-deoxyfructosyl)-(D)Phe^7_SMS is.

55. Een verbinding volgens concousie 44, — 2 15 die _/N-1-deoxy-D~fructosyl)-Tyr_/-SMS is.

56. Een verbinding volgens conclusie 44, die ]β-(ρ( -D-glucopyranosyl-(1-4)1-deoxy-fructosyl), Tyr^7-SMS is.

57. Een verbinding volgens conclusie 44, met formule LXVIII , formule LXIX of formule LXX.

58. Een verbinding volgens conclusie 44, die fructosyl-6-fosfaat-SMS is.

59. Een verbinding volgens conclusie 44 met formule LXXI.

60. Een verbinding volgens conclusie 25 44, die N^-deoxyfructosyl-(D)Phe-Cys/C0C(CH^i^Phe-(D)-Trp-Lys-Thr- Cys/C0C(CHg)^7-Thr-ol is.

61. Een verbinding volgens conclusie 44, die 2-/tD)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol/-2-deoxy-D-glucose is.

62. Een verbinding volgens conclusie 3 44, die 2-Zïyr -SMS7-2-deoxy-D-glucose is. ® 63. Glucuronzuuramide met formule l---1 H-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-o1 . 35 ^__ 64. Cbininezuuramide van H-DPhe-Cys-Phe DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol. 8702345 I i - 82 - 65.Sialinezuuramide van H-DPhe-Cys-Phe- DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol. 66.N^-(0-/^-D-glucosyl-oxyacetyl)-DPhe- I---\ Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-o1. - 67. Een verbinding volgens conclusie 44, die ϊΚ-(0- f’-D-galactosyl-oxyacetyD-SMS is.

68. Een verbinding volgens conclusie tX 'j 44, die N -(0 -j -cellobiosyloxyacetyl)-SMS is. 4 69. /N-acetylmuramyl-(D)Phe,7~SMS. 10 ” .

70. Een verbinding volgens conclusie 44, die | -D-glucosyl-thio-carbamoyl-SMS is,

71. Een verbinding volgens conclusie 44 , die cellobiosylthiocarbamoyl-SMS is.

72. Een verbinding volgens conclusie ^ 44, die P-D-glucosyl-carbamoyl-SMS is.

73. Een verbinding volgens conclusie 44, die cellobiosyl-carbamoyl-SMS is.

74. Een verbinding volgens conclusie 44, die 1-deoxy -D-sorbityl-SMS is. 20

75. Een verbinding volgens conclusie 44, die ö(-D-glucosyl(1-4)-deoxysorbityl-SMS is.

76. Een verbinding volgens conclusie 44, die 1,2—dideoxy-sorbityl- SMS is.

77. Een verbinding volgens één der con-25 clusies 12-19, waarin het peptide een calcitonine is.

78. Een verbinding volgens conclusie 77, waarin het calcitonine zalm-, aal- of humaan_.ca 1 citonine is.

79. Een verbinding volgens conclusie 77 of 78, met het kenmerk, dat het calcitonine zalmcalcitonine is. 30 . . _ 80. Een suikerderivaat van een calcitonine met formule X, waarin R een waterstofatoom of een R"C0 groep voorstelt, R"C0 de acylgroep van een carbonzuur 35 voorstelt, Yj de groep geplaatst aan het -koolstof- 8702345 < i « - 83 - atoom van een OC-aminozuur weergeeft, Y' de groep geplaatst aan het opkooi stof at oom van een ^—aminozuur, —CHj,—S—S-CH2“CH-OOOH, nh2 ' 5 -CH2-S“S-CH2-CH2-COOH, -(CH2)g-COOH of -CB^-S-Yg, weergeeft, Yg een alkylgroep met 1-4 kool-stofatomen, een benzylgroep die desgewenst gesubstitueerd is IQ door methyl of methoxy of een CH^CONH-CH^groep weergeeft, o een geheel getalvan 1-4 is, A, = Thr of D-THR, 6 s een geheel getal van 3-5 is, Ag de aminoacylgroep van een neutraal, •J5 lypofiel, L-D( ~amino zuur voor stelt, Α^ de aminoacylgroep van een neutraal, lypofiel, L- of D-öi,-aminozuur weergeeft en Z.j een polypeptidegroep voorstelt, die op de 10-31 plaats van een natuurlijk calcitonine aanwezig is, 2q of een derivaat of analogon daarvan met een hypocalcemische werking, waarin de 1-4 Yj groepen in formule X, onafhankelijk van elkaar, al of niet gelijk kunnen zijn en, met uitzondering van de aminoacylgroep Ag, alle aminozuurgroepen in formule X de L- of D-configuratie bezitten, alsmede de zouten en complexen van 25 deze verbindingen,

81. Een verbinding volgens conclusie 80, die li*-isocaproyl-des(1-4)-iAla7, N£-(1-deoxy -fructosyl)-Lys11 ’ 1i/ zalmcalcitonine is.

82. Een verbinding volgens conclusie 30 80, die N^-isocaproyl-des(1-4)-iAla7, N-^-D-glucosylO^)- deoxyfructosyl)-Lys ^^^/zalmcalcitonine is. - £ ^ 83. Een verbinding volgens conclusie 80, die N -isocaproyl-/N£~(1-deoxyfructosyl- Lys7)zalmcalcitonine-(5-32)amide is.

84. Een verbinding volgens conclusie • j j ζ 1 ft c 80, die N ,Lys -N ,Lys N^-tris-(l-deoxyfructosyl) -zalmcalcitonine is. 6/02345 f * - 84 - t

85. Een verbinding volgens conclusie 80, die lf*-isocaproyl-des(l-4)-^N-(l-deoxyfructosyl) -Lys^*^*^7 zalmcalcitonine-(5-32) amide is.

86. Een verbinding volgens conclusie 5 80, die N^-chinoyl-/Ala^/-zalmcalcitonine-(5-32)-amide is.

87. Een verbinding volgens conclusie ρζ η— 80, die N -chinoyl-/Ala_/-zalmcalcitonine- (4-32)-amide is. 88. /N-desoxy-fructosyl-Cys^7-oxytocine.

89. Een verbinding volgens 10 één der conclusies 12-19, waarin het peptide een LHRH antagonist is.

90. Ac-(D)Phe(4--C1)- (D)Phe(4-C1)- (D)Trp-Ser-Tyr-(D)Lys met formule LXI. H ra_n nn V/pj w\rn 91. Een verbinding gekozen uit

16. Gevormde farmaceutische preparaten, -o-o-o- * m f Schut/MM .8702345