JPS61264260A

JPS61264260A - アルデヒド化多孔性高分子材料によるタンパク質の除去方法

Info

Publication number: JPS61264260A
Application number: JP60105381A
Authority: JP
Inventors: Hiromi Kitano; 博巳北野; Norio Ise; 伊勢　典夫; Katsunori Nakamura; 勝則中村; Yohei Hirai; 洋平平井
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1985-05-17
Filing date: 1985-05-17
Publication date: 1986-11-22
Also published as: JPH052105B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明はタンパク質含有被処理溶液を、アルデヒド基を
有する多孔性高分子材料で処理することからなるタンパ
ク質の除去方法に関するものである。

更に詳しくは、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体で
ある比較的疎水性の高い多孔性樹脂に、フリーデル・ク
ラフト反応を用いてアルデヒド基を導入し、前記多孔性
樹脂のタンパク質結合能を大きく増加させ、ついでそれ
をタンパク質含有被処理溶液と接触せしめることにより
該含有タンパク質を多孔性高分子材料に結合させ、該タ
ンパク質含有被処理液からタンパク質を除去する方法に
関する。

（従来の技術及び発明が解決しようとする問題点）臨床
分析等においては、尿や血清などの被検液中に含まれて
いるタンパク質をあらかじめ除去しておかなければなら
ない場合が多い。このようなタンパク質の除去にはこれ
まで、トリクロロ酢酸やア七トンによる沈殿法、あるい
は透析法が用いられてきた。

しかしながらこれらの方法によると、前者では検査、研
究の対象となる物質の変性または変質の起ることが言返
められ、また、後者ではテーリングや試料の希薄化など
が起り、共に好ましいものではなかった。

本発明者等は、上記の如き従来のタンパク質除去方法の
欠点に鑑み、目的成分の変性や変質ならびに試料の希薄
化などの問題を起さないタンパク質除去方法について研
究を行った。

その結果、各種のポリフェノールとアルデヒドとの付加
縮合により得られる樹脂を用いることにより上記目的が
達成されることの知見を得、既に特許出願している。（
特許公開公報昭５８−９２８６１参照）ひるかえって、従来公知のこの種タンパク質の除去方法
についてみるに、大雑把に分けると、バッチ法とカラム
法が知られている。しかしてこの両方法に於いては、使
用する吸着剤の量ができうる限り少ない量であって、し
かも大量のタンパク質を結合できるものの使用が望まし
いことはいうまでもない。

か−る吸着材料としては、タンパク質に対する有効表面
積の大きな多孔性材料の出現が望まれていた。また、そ
の表面上にタンパク質を不可逆的に結合できる結合サイ
トをなるべく多数有することが、必要である。

ところで疎水性ポリマーの表面へのタンパク質の吸着は
、一部溶媒による洗浄に対して不可逆的であるが、この
種目的に対し必ずしも良好な結果を与えなかった。そこ
でより多量のタンパク質を不可逆的に結合させるために
は、その疎水性表面にタンパク質と結合可能である活性
な官能基を導入すればよいことが理解される。

本発明の目的は、このような観点から、中性付近の穏や
かな条件下でタンパク質と結合可能であるアルデヒド基
を、疎水性の高いスチレン−ジビニルベンゼン多孔性ポ
リマーに導入することにより、タンパク結合能の優れた
樹脂を得ることにあしかして、この種問題点を解決する
ための手段、さらに具体的にはポリマーにアルデヒド基
を導入する公知の手法としては、アクロレイン等のアル
デヒド基を含むモノマーの重合が考えられる。そこで本
発明者等はアクロレインのホモポリマーおよびアクロレ
インとスチレンのコポリマーを懸濁重合および溶液重合
により合成してみた。しかしながら、得られたものは、
その物理的強度や有効表面の小さいものが多く、それ故
高能率なタンパク結合樹脂材料ということのできないも
のであった。

次いで、本発明者等は各種疎水性樹脂、就中スチレン−
ジビニルベンゼン共重合体の多孔性樹脂を母体とし、そ
れにアルデヒド基を導入することを鋭意試み、本発明を
完成するに至った。

（本発明の詳細な説明）本発明において用いる多孔性母体は、スチレン−ジビニ
ルベンゼン共重合体からなるものである。

このような構造および組成を有する共重合体樹脂は、既
にＸΔＤ−２（孔径９０人、３００ｍ２／ｇ；ローム・
アンド・ハース社製）およびＨＰ−２０（孔径１０００
人、５５０ｍ’／ｇ；三菱化成■製）として容易に市場
より入手することが可能である。

たソ゛シ、本発明の実施においては市販品を一旦、温メ
タノール中で数回攪拌、洗浄を繰り返し、次いで真空乾
燥したものの使用が望ましい。

尚、本発明におけるアルデヒド基の導入は、グロス等の
フリ、−デル・クラフト反応法（ｌｌ、　［；ｒｏｓｓ
。

＾、Ｒｉｅｃｈｅ、　　ＧｌＭａｔｔｈｅｙ　　Ｃｈｅ
ｍ、　　Ｂｅｒ、、　　９６．３０８（１９６３））に
準じた。

以下本発明の方法を具体的に述べる。

まず原料の多孔性樹脂を塩化メチレン等の溶媒中に懸濁
し、充分脱気した後に塩化アルミニウムを加え溶解する
。次いで、室温下に於て、ジクロロメチルエーテルを滴
下し、約２０分〜１時間好ましくは約３０分〜４０分間
攪拌した後、希鉱酸水溶液例えば希塩酸水溶液（５％）
を滴下する。

続いて、約２〜５時間、好ましくは約３時間攪拌し、次
にデカンテーションにより上澄液を除去し、さらに水酸
化ナトリウム水溶液（ｐＨ９）で中和、洗浄を行なう。

更に、水、メタノール等で充分洗浄した後、真空乾燥し
、所望のアルデヒド化樹脂（アルデヒド基を有する多孔
性高分子材料）を得る。

前記に於て、ジクロロメチルメチルエーテルの童等の、
操作条件を変えることにより、各挿具なったアルデヒド
含量のアルデヒド化樹脂を得ることができる。

具体的には原料の多孔性樹脂１００ｇ当りジクロロメチ
ルメチルエーテルの使用割合は約１０〜８０ｍｆ２、好
ましくは約２０〜４０ｍＡの範囲にする。

また使用する溶媒としては、クロロホルム、トリクロル
エチレン、塩化メチレン等、塩素系溶媒の使用が望まし
い。就中、塩化メチレンの使用が好ましい。

該溶媒の使用量は、原料の多孔性樹脂１００ｇ当り約１
２００ｍβ〜１５００　ｍ　ｆｌ、好ましくは約１３０
０ｍｌである。

反応温度は２０〜２５℃（室温近辺）、すなわち比較的
低いということが本発明の特長の一つである。

フリーデル・クラフト反応の終点は、反応の結果生ずる
塩酸ガスの発生がなくなる点を一応の目安とす−る。通
常は約２０〜６０分、好ましくは約３０分反応を行なえ
ばよい。

本発明の方法に於ては、ひき続いて鉱酸との反応を行な
う。

鉱酸としては、塩酸、硫酸、硝酸等を用いることができ
る。たゾし、これらは希薄溶液（２％〜１０％）として
用いる。

その鉱酸処理の態様は特に限定されるものではないが、
例えば水冷下前記希薄溶液を滴下する方法が好適である
。

尚、滴下終了後もしばらく攪拌を続け、所望のアルデヒ
ド化樹脂をつる。

このようにして得られたアルデヒド化樹脂は、黄色〜黄
灰色のもので、かつ孔径５００〜４０００への細孔を多
数有するものである。

また、得られた樹脂中のアルデヒド含有の増加と共に、
タンパク質結合能の上昇する傾向のあることが認められ
た。

本発明に於て「アルデヒド含量」は、ピリジン中でのヒ
ドロキシアミン−塩酸塩との反応によりオキシムを生成
し、それを元素分析することにより算出した。また「ア
ルデヒドの置換率」は、樹脂中のベンゼン環１００個当
りに導入されたアルデヒド基の数（百分率表示）で示し
た。

本発明に於てアルデヒドの置換率が約１０％近辺をこえ
ると、逆にタンパク質結合能の低下する傾向が認められ
た。

したがって、アルデヒドの置換率の範囲は、５〜１５％
、特に約６％にすることが望ましい。

前述の如くにして得られたアルデヒド化樹脂は、次いで
粉砕機で粉砕後、必要により標準ふるいにかけ、粒径を
約３０〜２００μｍ１好ましくは約４４〜７４μｍにそ
ろえ、ひき続いて必要により溶媒、例えばメタノール中
で充分脱気しくアルデヒド化樹脂として）使用に供する
。

尚、粒子径は一般に小さい方が望ましいことは云うまで
もない。

本発明に於ては、これをカラムに充填し、次いで該充填
カラムにタンパク質含有被処理溶液を通す。

別の態様として、該タンパク質被処理溶液にアルデヒド
化樹脂粒子を加え（必要により攪拌して）該溶液と樹脂
粒子を十分に接触せしめてもよい。

尚、前記カラム充填剤用としては、圧損を小さくするこ
とが好ましい。例えば５０μｍ程度の粒径にしたり、該
カラムの太さを５ｍｍ〜８ｍｍにすることが好ましい。

前記接触処理により被処理溶液中のタンパク質は、アル
デヒド化樹脂と良好に結合する。

また、一旦多孔性アルデヒド化樹脂材料表面に結合され
たタンパク質は、ある種の溶剤、例えば０、ＩＭ　　Ｎ
ａＯＨ，０，ＩＭ　　ＨＣｊ２．６Ｍ尿素等による洗浄
でも全く流出せず、したがって非常に強固な結合をして
いることが確認された。したがって本発明の実施の結果
得られた多孔性高分子樹脂材料がタンパク質により飽和
されるまで、繰り返しあるいは連続的にタンパク質の除
去に使用することができる。それ故、例えば診断用バイ
オリアクター用除タンパクシステムにディスポーザブル
タイプのものとして有利に用いることができる。

以下実施例により、本発明を更に具体的に説明する。

実施例１温メタノールで洗浄した後、真空乾燥を行なうことによ
り得られたＨＰ−２０３０ｇを、無水塩化メチレン４０
０ｍｌに懸濁し、アスピレータ−を用いて十分脱気した
後、塩化アルミニウム（ＡＡＣ１３）４０ｇを添加し、
攪拌、溶解させた。

ついで、ジクロロメチルメチルエーテル２０ｍ１を滴下
し、３０分間、室温下で反応させた。ＨＣβガスの発生
がおさまった後、５％塩酸水溶液２００ｍ１ｌを滴下し
、３時間反応させた。上澄液をデカンテーションにより
除去しｐＨ９水酸化ナトリウム水溶液で中和、洗浄した
。さらに水、メタノールで十分洗浄した後、真空乾燥し
、目的のアルデヒド化ＨＰ−２０を碍た。

得られた樹脂中のアルデヒド含量は、約７％であった。

ジクロロメチルメチルエーテルあるいは塩化メチレンの
量を変えることにより、異なったアルデヒド含量の樹脂
が得られた。

ＸＡＤ−２についても同様の方法でアルデヒド化を行な
った。

実施例２ＨＰ　−２０および７　）’ｖ　７’　Ｉニー　）’化
Ｈ，Ｐ−２０を粉砕後ふるいにかけ、粒子径を４４〜７
４μｍにそろえた。次いで両者を、メタノール中で十分
脱気した後、溶媒を、水、ｐＨ５，５，１／３０　Ｍリ
ン酸緩衝液（２５℃）の順に変え、同緩衝液中に懸濁さ
せた夫々の樹脂（０，０２６ｇ−ｇｅｊ２　／　ｍ　ｊ
ｉ！　）を調製した。夫々の樹脂懸濁液５ｍｌを採取し
、種々の濃度の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液（２５
ｍ　Ｉ！同緩衝液を使用）に加え、温度を２５℃の恒温
に保ちながらゆるやかに攪拌を続けた。一定時間毎に、
懸濁液の一部（３ｍｊ２）を採取し、ミリポアフィルタ
−（Ｍｉｌｌｅｘ　ＧＳ外径０．２２μｍ）で、樹脂を
濾過した後、濾液中の遊離ＢＳＡ濃度をローリイ（ｔｏ
ｗｒｙ）法により定量し、夫々の樹脂への吸着量を算出
した。

吸着量の時間変化より、平衡吸着量に達するまでに、い
ずれの樹脂も２時間以上か一つだ。

第１図に３時間後のＢＳＡ吸着量をもとにした夫々の、
吸着等混線を示した。

実施例３ＨＰ−２０、ＸＡＤ−２の２種類の多孔性樹脂および、
それぞれをアルデヒド化した樹脂につぃて、それらの粒
子径を４４〜７４μｍにそろえた。

次いでそれ等をメタノール中で十分脱気した後、両端が
テフロンフィルター１０１０３Ｘ５のガラスカラム（０
，４５ｇ−ｇｅβ）に充填した。次いで溶媒を水、ｐＨ
５，５，１／３０　Ｍリン酸緩衝液の順に変え、十分平
衡化させた。カラムおよび溶媒は通常２５℃の恒温に保
ち、ＡＬＴＥＸＩＩＯＡポンプにより、ｌ　ｍ　ＩＩ　
／ｍｉｎ　の流速でカラムに溶媒の送液を行なった。カ
ラムにレオダインインジェクターを内蔵したオートサン
プルインジェクターを用いて、４分毎にＢＳＡ溶液（３
０ｍｇ／ｍりを５０μβずつ注入し、カラムからの流出
液中のタンパク質は、Ｕ■ディテクターおよび示差屈折
率計により追跡した。流出タンパク質の定量は、流出ピ
ークの面積を測定することにより行なった。　第２図に
は、それぞれの樹脂を充てんしたカラムにＢＳＡ溶液を
注入した場合の注入回数とＢＳＡ流出量の関係を示した
。

ＨＰ−２０とＸＡＤ−２を比較すると、同じ多孔性のス
チレン−ジビニルベンゼン共重合体でありながら、タン
パク結合能には大きな違いがみられた。これは孔径およ
び表面積の違い、すなわちＨＰ−２０の平均孔径が１０
００人とＢ　Ｓ　’Ａの孔内拡散に充分な大きさである
のに比べ、ＸＡＤ−２の孔径は９０八と小さく、ＢＳＡ
が孔内へほとんど拡散できないためであると考えられる
。

またこれらに、アルデヒド基を導入したものは、いずれ
の場合も流出曲線は右へ移動、すなわちタンパク結合能
の上昇が見られた。これは樹脂表面上に導入されたアル
デヒド基がタンパク質分子中のアミノ基とシ・ｌフ塩基
を形成するこよにより、タンパク質を強く結合するため
、見かけ上、樹脂上のタンパク結合サイト数が増加した
ためであると理解される。

このように溶媒の流れ続けている状態のカラムへＢＳＡ
などのタンパク溶液をパルス的に断続的に注入し、カラ
ム内に不可逆にタンパク質を結合させるシステムは種々
のフローインジェクション分析法における除タンパク用
前処理カラムとして有効である。

また、別の実験により、カラム法での吸着歯は、バッチ
法のものとそれ程差のないことが判明した。

実施例４実施例２と同様の方法（ｐＨ５，５，１／３０　Ｍリン
酸緩衝液（２５℃）；カラムサイズ１０１０３Ｘ５、流
速１　ｍ　１７ｍ１ｎ、　）に従い、種々のアルデヒド
含量のアルデヒド化ＨＰ−２０カラムにＢＳＡ溶液を注
入していった場合の、流れ始めおよび５０％流出した時
の注入回数を、実験に使用した樹脂中に含まれるアルデ
ヒド量に対してプロットした。

第３図に示す結果が得られた。

アルデヒド基の増加とともにＢＳＡ結合能は増加する。

しかしアルデヒド置換率が１０％をこえるとむしろ該結
合能は低下する傾向が見られた。

かくて、置換率は、この図より約６％前後のアルデヒド
置換率のものがタンパク結合樹脂としては好ましいこと
が分る。

実施例５アルデヒドの置換率６％のアルデヒド化Ｐ’Ｈ−２０カ
ラムに実施例２の方法に従い、種々の（下記）低分子化
合物を溶解したサンプルを注入し、その流出挙動を調べ
た；尿素（５＋ｎＭ＞、尿酸（６１）μＭ＞、Ｄ−グルコー
ス（５ｍＭ）およびＬ−リシン（３＋ｎＭ）は、いずれ
も１００％流出した。しかし疎水性の高いし−トリプト
ファン（３ｍＭ）およびＬ−７エニルアラニンは、はと
んどカラム内に結合した。

一方、アルデヒド置換率１０％のアルデヒド化ＨＰ−２
’０カラムの場合、Ｌ−）リプトファンおよびＬ−フェ
ニルアラニンは、Ｌ−リシンの流出位置に比べ３８およ
び６倍遅れた位置に、約７０％が流出した。

さらにアルデヒド化置換率が１０％近くになるとＢＳＡ
結合量は多少減少するが、疎水性の高い低分子化合物の
吸着を少なくすることが可能であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＨＰ−２０とアルデヒド化ＨＰ　−２０の吸
着等混線を示す。第２図は、ＨＰ−２０、ＸＡＤ−２ならびに両者をアル
デヒド化した樹脂について、注入回数とカラムからのＢ
ＳＡの流出量との関係を示す。第３図は、種々のアルデヒド化ＨＰ−２０カラムからの
ＢＳＡ流出に及ぼすアルデヒド基含量の影響を示す。第１図ＢＳＡの平佃テ５農度Ｃ”９／Ｔｎｉ）第２図ン王　　　入　　　回　　　数

Claims

【特許請求の範囲】

スチレン−ジビニルベンゼン共重合体の多孔樹脂とジク
ロロメチルメチルエーテルとのフリーデル・クラフト反
応を行ない、続いて鉱酸と反応させることにより得られ
るアルデヒド基を有する多孔性高分子材料を、タンパク
質含有被処理溶液と接触せしめることにより該溶液中の
タンパク質を該アルデヒド基を有する多孔性高分子材料
に結合させることからなるタンパク質含有被処理溶液か
らタンパク質を除去する方法。