PT85904B - Processo para a preparacao de derivados de peptidos - Google Patents

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA DO INVENTO para

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE DERIVADOS DE PEPTIDOS que apresenta

SANDOZ, S.A., suíça, industrial, com sede em Basileia, Suiça.

RESUMO

A invenção refere-se ao processo para a preparação de derivados de açúcar de péptidos 'biologicamente activos, caracterizado por compreender:

a) eliminar-se pelo menos um grupo de protecção dum péptido modificado por açúcar; ou

b) ligar-se, por ligação amida, duas unidades peptídicas, cada uma das quais contém pelo menos um aminoácido ou um ami noálcool e uma das quais contém um radical de açúcar; ou

c) num péptido, introduzir-se pelo menos um radical de açúcar; ou

1) eliminar-se ou transformar-se um grupo funcional de um péptido modificado por açúcar; ou

e) oxidar-se um péptido modificado por açúcar.

- 4íj

A presente invenção tem por objecto péptidos, a sua preparação, preparações farmacêuticas que contêm tais péptidos e a sua utilização como medicamentos.

A presente invenção oferece um derivado de um açúcar de um péptido biologicamente activo, derivado que possui uma duração de acção prolongada em comparação com um péptido sem modificação por açúcar e contém pelo menos sobre um dos radicais de aminoácido, um radical de açúcar ligado com o grupo amino do radical de aminoácido por uma ligação diferente de uma ligação N-glucosídica directa e, quando o derivado é um produto de condensação de açúcar que contém carboxi com um péptido tendo pelo menos 8 unidades de aminoácidos por uma ligação diferente de uma ligação amida directa.

Os citados compostos chamar-se-ão a seguir compostos da invenção.

Por ”péptido não modificado por glucido” entende-se um péptido de estrutura correspondente que não possui nenhum radical glucido. Tal péptido charmar-se-à a seguir péptido por modificar.

Verfiçámos agora que os compostos da invenção aprj sentam propriedades farmacológicas particularmente interessantes e surpreendentes, em especial exercem uma acção de duração prolongada, por exemplo como se descreve a seguir.

Verificou-se que a incorporação de um ou mais radicais de açúcar, ainda quando estão ligados de maneira diferente à glicosilação, por exemplo de Asn ou Ser, induz as citadas propriedades.

A introdução de tais radicais de açúcar efectua-se de preferência sobre grupos amino de aminoácidos afastados do sítio de actividade do péptido.

termo péptidos” como utilizado aqui, inclui os péptidos (por exemplo di-péptidos, tri-péptidos), os oligo-pé ptidos, os polipéptidos e as proteínas. 0 péptido tem, de preferência, mais de 7 unidades de aminoácido. Convenientemente, o péptido tem 8 a 32 unidades de aminoácido.

termo ”unidade aminoácido” tal como empregue aqui inclui, além disso, uma unidade amino-alcoólica, por exemplo um aminoácido reduzido.

A expressão péptidos biologicamente activos” usa-se aqui no sentido de abranger em particular os compostos con. actividade farmacológica ou terapêutica, por exemplo, os compostos tendo uma actividade hormonal, enzimática ou imuno-moduladora, ou então que estimulam ou inibem tal actividade. Estes péptidos biologicamente activos compreendem os péptidos naturais isolados da natureza ou obtidos por fermentação de células, por exemplo produzidos por engenharia genética, ou sintetizados assim como também os derivados e análogos de tais péptidos.

Por derivados e análogos devem entender-se em particular os péptidos naturais nos quais uma ou várias unidades de aminoácido foram omitidas e/ou substituídas por um ou vários outros radicais de aminoácidos e/ou nos quais um ou vários grupos funcionais foram substituídos por outro ou vários outros grupos funcionais e/ou nos quais um ou vários grupos foram substituídos outro ou vários outros grupos isoestéricos. A expressão compreende, em geral, todos os derivados moiificados de um péptido biologogicamente activo que apresentam um efeito qualitativamente similar ao efeito do péptido por modificar.

Os açúcares podem ser, por exemplo, quaisquer mono-sacáridos ou oligosacáridos conhecidos, em especial uma nonose, diose ou triose ou um derivado destas, por exemplo um aminoácido e/ou um ácido carboxílico e/ou um derivado dos mesmos reduzido e/ou esterifiçado.

açúcar pode estar unido, por exemplo, a um gru-

po amino-N-terminal e/ou pelo menos a um grupo amino do péptido presente na cadeia lateral do mesmo.

açúcar pode estar unido ao péptido quer directa quer . indirectamente por meio de um dos seus grupos funcionais ou por um membro de ponte, por exemplo um grupo alcileno-carbonilo.

A ligação pode efectuar-se de uma maneira convencional, em especial tal como se descreve a seguir.

Num grupo preferido dos compostos da invenção, o radical açúcar está ligado a um grupo amino do péptido por uma ligação diferente da ligação N-glicosídica directa ou uma ligação amida directa.

Um grupo dos compostos da invenção é preparado por meio de um reagrupamento de amadori ou de Heyns.

A invenção oferece, além disso, preparações farmacêuticas destinadas para administração por via oral que contêm um composto da invenção em especial compostos tendo pelo menos 8 unidades de aminoácido.

A presente invenção proporciona, em particular, os seguintes derivados de açúcar de péptidos biologicamente activos que têm a fórmula I

,--0 .OH λ V '---' ^-ΌΗ₂ΝΗ-Ρ em que (I)

significa o radical desoxidado de uma cetose, estando tal radical ligado ao grupo NH de um péptido 'biologicamente activo por meio do grupo CHg,

P significa o radioal de um péptido biologicamente activo da fórmula NHg-P, em que o grupo NH se encontra na extremidade N-terminal ou então numa cadeia lateral do péptido, de fórmula II em que

(II) significa o radical desoxidado de uma aldose, estando o radical ligado, através de uma ligação livre, ao grupo NH de um péptido biologicamente activo, e

P significa o radical de um péptido biologicamente activo de fórmula NHg-P, em que o grupo NH se encontra na extremidade do N-terminal ou então numa cadeia lateral do péptido P, de fórmula III

G.-CO-NR -Ρ (III) em que

Gy-CO significa o radical de um ácido urónico, ou de um ácido poli-hidroxi-monocarboxílico ou poli-hidroxi-dicarboxílico,

R significa hidrogénio ou alquilo com 1 a 3 átomos de «y carbono ou alcanoilo com 1 a 4 átomos de carbono,

P significa o radical de um péptido biologicamente activo que contém pelo menos 8 unidades de aminoácidos que tem a fórmula HgN-P em que NRy. se encontra na extremidade do Ν'-terminal ou então numa cadeia lateral do péptido P,

d) das fórmulas IVa, IVb, IVc ou IVd /

/

NH-Q-N— P (IVa)

(IVb)

^Ey

(IVc) (IVd) em que P significa o radical de um péptido biologicamente activo de fórmula HgN-P

OH significam radicais de açúcar,

R_y significa hidrogénio, alquilo com 1 a 3 átomos de carbono ou alcanoílo com 1 a 4 átomos de carbono, e

Q, Q*, Q e Q»” significam grupos que ligam o radical péptido ao radical de açúcar, em que o grupo NH ligado com P se encontra na extremidade do N-terminal ou então numa ca deia lateral do péptido, ou

e) de fórmula Va ou Vb

H0H₂C-(CHOH)_c-CY-CH₂-NH-P (Va)

H0H₂C-(CH0H)_c-(jJH-CH OH (Vb)

NHP em que Y significa H₂ ou H, OH c significa 2, 3 ou 4

P significa o radical de um péptido biologicamente activo de fórmula H₂N-P, em que o grupo NH unido ao radical P se encontra no N-terminal ou numa cadeia lateral do péptido, e qualquer dos grupos hidróxi livres do radical poliol dos compostos de fórmula V está eventualmente ligado glicosidicamente a um monossacárido, um dissacárido ou um oligossacárido redutor ou com um amino-açúear redutor, e dos seus sais de adição de ácidos e dos complexos de tais derivados de polipéptidos, com as condições de que

a) quando, nos compostos de fórmula I acima mencionados, P tem um significado diferente de um radical de um péptido de gastrina com um grupo C-terminal finalizando com -Asp-Phe-NHg,

b) quando, nos compostos de fórmula IVb, Q’ significa um ciclo de fenilo contendo radicais divalentes ou quando, nos compostos de fórmula IVd, Q”’ significa o radical de um ácido dicarboxílico alifático, então P-NHg não signifique uma insulina natural, e

c) quando, nos compostos de fórmula III, G^-CO significa o radical de um ácido murámico opcionalmente N-acilado, então o segundo radical aminoácido na extremidade do N-terminal do péptido P-NHR não deve significar o radical de v

um aminoácido dicarboxílico.

Uma gastrina é um péptido que aumenta a secreção do ácido gástrico.

Todos os radicais de açúcar acima mencionados (Gj a G^) podem ser monossacáridos, dissacáridos ou oligossacáridos. Tais açúcares podem conter heptosas, hexosas e/ou pentosas que podem existir sob a forma de piranosas ou de furanosas.

Em todas as fórmulas I a V acima indicadas mostra-se só um radical açúcar por radical péptido. A invenção abrange, contudo, também os derivados de açúcar de pêptidos tendo mais de um grupo amino sobre 0 radical péptido, contendo tais derivados, por exemplo, 2 ou 3 radicais de açúcar por radical péptido.

A invenção oferece, adicionalmente, todos os péptidos biologicamente activos que têm mais de um radical de açúcar ligados tal como descrito anteriormente.

Os péptidos modificados por açúcar contêm 1 a 3 radicais mono-sacárido, os quais podem estar ligados mútuamente, como um dissacárido ou trissacárido.

Em todos os compostos acima mencionados, a linha ^significa que a ligação pode estar na posição ou (3.

Na fórmula I,

representa de preferência

a) um radical de fórmula

(Via) na qual um dos radicais G_a e G^ significa hidrogénio e o outro OH, um dos radicais G_Q e significa hidrogénio e o outro significa OH ou O-glicosilo, em que o radical glicosilo é derivável de um monossacárido, dissacárido ou oligossacárido redutor, um dos radicais G_e e G^ significa hidrogénio e o outro é OH, um dos radicais G_g e G_h é hidrogénio e o outro é hidro

génio ou CHgOH, escolhendo-se, por exemplo, os radicais G_e a de tal modo que o radical de fórmula Via corresponda a um radical que se pode obter por meio de um reagrupamento de Amadori a partir de um monossacárido, dissa· cárido ou oligossacárido natural ou sinteticamente acessível.

Como exemplos de radicais de açúcar de fórmula

Via podem citar-se os radicais seguintes:

deoxifructosilo, deoxitagatosilo, deoxisorbosilo,q-glucosil-(l-4)-deoxifructosilo,o{ -glucosil(l-4)-«Y -glucosil(t-4)-deoxifructosilo.

b) um radical de fórmula

na qual um dos radicais G_& e G·^ significa hidrogénio e o outro significa OH, um dos radicais G_c e significa hidrogénio e o outro significa OH ou O~glicosilo, em que o radical glicosilo é derivável de um monossacárido, dissacárido ou oligossacárido redutor, um dos radicais βθ e significa hidrogénio e o outro significa hidrogénio, COOH, CH₂0H, CH₂-O-P(O)-(OH)₂ ou CH₂0-glicosilo, em que o radical glicosilo é derivável de um monossacarido, dissacárido ou oligossacárido redutor, em que os radicais G_a a se seleccionam de uma maneira tal que o radical de fórmula VIb corresponda a um radical que pode obter-se por meio de um reagrupamento de Amadori a partir de um monossacárido, dissacárido ou oligossacárido natural ou acessível sinteticamente.

Os radicais de fórmula VIb podem obter-se, por exemplo, por meio de um reagrupamento de Amadori a partir de sacáridos tais como a gentiobiosa, a melibiosa, a ribosa, a xilosa ou então a partir de ácidos urónicos tais como o ácido glucurónico ou o ácido galacturónico.

Na fórmula,

preferência

representa de

a) um radical de fórmula Vila

(Vila) na qual um dos radicais G_a ou G-& significa hidrogénio e o outro significa uma ligação livre, um dos radicais G_c ou significa hidrogénio e o outro significa OH, um dos radicais G_e ou G^ significa hidrogénio e o outro significa OH ou O-glicosilo, em que o radical glicosilo é derivável de um monossacárído, dissacárido ou oligossacárido redutor, um dos radicais G_g e G& significa hidrogénio e o outro significa CHgOH ou C^-O-glicosilo, em que o radical glicosilo é derivável de um monossacárído, dissacárido ou oligossacárido redutor, em que, por exemplo, os radicais G_& a G^ se seleccionam de um modo tal que o radical de fórmula Vila corresponda a um radical obtenível por meio de reagrupamento de Heyns a partir de uma monocetose, dicetose ou oligocetose natural ou acessível sinteticamente.

b) um radical de fórmula Vllb

(vrib) na qual um dos radicais G_a e G-^ significa hidrogénio e o outro significa uma ligação livre, um dos radicais G_c e G^ significa hidrogénio e o outro significa OH, um dos radicais G-θ e G^ significa hidrogénio e o outro significa CHgOH ou C^-O-glioosilo, em que o radical glicosilo é derivável a partir de um monossacárido, dissacárido ou oligossacárido redutor, em que, por exemplo, os radicais G_& a G_f se seleccionam de

maneira tal que o radical Vllb corresponda a um radical que é obtenível por meio de um reagrupamento de Heyns a partir de uma monocetose, dicetose, ou oligocetose natural ou acessível sinteticamente.

Os radicais de fórmula Vila ou Vllb podem obter-se, por exemplo, por meio de reagrupamento de Heyns a partir de açúcar tal como D-frutose, a lactulose, a Jj-sorbose, a D-tagatose ou a D-ribulose.

Na fórmula III, o ácido polihidroximonocarboxilico ou polihidroxidicarboxílico contém, por exemplo, 3 grupos hidroxi, como minimo, e também pode conter outros substituintes, por exemplo grupos de amino ou de acetilámino.

Gomo ácidos polihidroxicarboxílicos entram em consideração os seguintes:

os ácidos ónicos que derivam de açúcar, tal como o ácido glucónico, ou os ácidos áricos tais como o ácido glucárico, e, ulteriormente, o ácido quínico, o ácido acetilmurânico, o ácido acetilneuramínico ou o ácido D-glucosamínico.

Como exemplos de ácidos urónicos podem citar-se o ácido glucurónico e o ácido galacturónico.

Nos compostos da fórmula IV, G^, G'^, G^, e G’^ têm as significações indicadas anteriormente para ou radical Q ou Q’ une um grupo NHg do péptido com um grupo NHg ^{ou H0} úo radical de açúcar, e é, por exemplo, o radical de um ácido dicarboxílico ou, de preferência, um radical -C-^Hg-CO, em que b significa 0 a 6, Tal radical pode estar ramificado.

radical Q’ significa por exemplo

¹⁴ ou, em particular, um radical -C^H^-GO- (sendo o símbolo b, por exemplo, 1 a 6).

Q significa, por exemplo, um radical -CHg-CO-.

Q significa, em especial, -GO- ou -CS-,

-NH-Q”- e -ΝΤϊ-Q*” significam radicais que unem um grupo NH₂ de péptido com o radical de açúcar, em especial significam os radicais de ácidos w-aminocarboxilicos. Tais radicais podem significar, por exemplo, um radical -NH-G^Hg^-COQuanto a um composto de fórmula V, preferem-se os compostos que têm a fórmula Va, em especial os compostos em que n significa 3.

Todos os radicais P acima mencionados são radicais de péptidos biologicamente activos. Tais péptidos incluem todos os péptidos naturais e sintéticos (inclusive os derivados e análogos de tais péptidos) (veja-se o princípio da presente descrição) que possuem uma actividade hormonal, enzimática ou imunomoduladora. Tal actividade pode ser tanto estimulante como inibidora. Gomo exemplos de tais péptidos podem cisar-se os seguintes;

a somatostatina, a calcitonina, a oxitocina, a vosopresina, a insulina, a LH, a 1HRH, a GRF, a gastrina, a substância P, catepsina, encefalinas, assim como todos os derivados e análogos destes péptidos, com uma actividade similar à dos péptidos ou então que têm uma actividade antagonista.

Os compostos da invenção contêm de preferência 8 unidades de aminoácido, como mínimo, por exemplo de 8 a 32, em especial 8 a 20, com maior preferência 8 a 10 aminoácidos.

Os péptidos preferidos são os que têm a fórmula

I e II.

Nas fórmulas acima indicadas e naquelas mais adi. ante, por motivos de simplificação, representa-se usualmente o radical de açúcar unicamente pela estrutura da piranosa.

Desde logo estão incluídos, além disso, na presente invenção, a furanosa e as estruturas de cadeia aberta, na condição de que existam para os açúcares relevantes.

A presente invenção inclui os processos para a preparação dos compostos das fórmulas acima indicadas. Tais compostos podem produzir-se por métodos geralmente conhecidos para a síntese de compostos desta classe.

Os compostos da invenção podem produzir-se, por exemplo, tal como segue:

a) elimina-se pelo menos um grupo protector presente num péptido modificado por um glucido, ou

b) ligant-se, por meio de uma ligação amida, duas unidades peptídicas, cada uma das quais contém pelo menos um aminoácido ou um aminoálcool sob a forma protegida ou por proteger e uma unidade peptídica que contém um radical de açúcar, em que a ligação entre os péptidos tem que ser tal, que se obtenha a sequência de aminoácido desejada, e em seguida efectua-se eventualmente o processo da Etapa

a), ou

3) introduz-se pelo menos um radical de açúcar opcionalmente

I protegido num péptido protegido ou por proteger, e em seguida efectua-se opcionalmente o processo da Etapa a), ou ii) elimina-se ou então transforma-se um grupo funcional de um péptido modificado por um glucido, protegido ou por proteger, noutro grupo funcional, de modo que se obtenha um péptido glicosilado por proteger ou protegido, efectuando-se no último caso o processo da Etapa a), ou

e) oxida-se um péptido modificado por um glucido, no qual os

grupos mercapto dos radicais Cis existem sob a forma livre, a fim de produzir um péptido em que os dois radicais Cis estão ligados por uma ponte S-S.

Como mencionado no princípio da presente descrição, o termo açúcar” como utilizado aqui, abrange além disso os derivados de açúcar, tais como os amino-açúcares, os açúcares oxidados e reduzidos ou os açúcares esterifiçados.

As reacçóes acima mencionadas podem efectuar-se de maneira habitual, analogamente aos processos descritos nos Exemplos mais adiante, em particular o processo a) e b) e podem efectuar-se de acordo com a síntese da invenção que se descreve mais adiante. Se necessário, podem-se utilizar em tais reacções grupos protectores apropriados para se usar em péptidos ou açúcares para os grupos funcionais que não fazem parte da reacção. 0 termo ”grupo protector” inclui uma resina polímera tendo grupos funcionais.

Os compostos de fórmula I podem produzir-se por meio de reacção de um péptido protegido tendo um grupo amino livre num meio ligeiramente ácido com um monossacárido, dissacárido ou oligossacárido redutor ou com um ácido urónico correspondente ou com um éster de tal ácido urónico (reagrupamento de Amadori), depois do qual se eliminam os grupos protectores.

A reacção pode efectuar-se de uma maneira usual para o reagrupamento de Amadori. 0 ácido a adicionar pode ser, por exemplo, ácido acético glacial. Ao efectuar-se a reacção com ácido urónico, pode utilizar-se um ácido adicional. De preferência utiliza-se um excesso de carbohidrato, por exemplo dez equivalentes por um equivalente do composto péptido. Pode-se efectuar a reacção num dissolvente polar, tal como metanol, de preferência a temperaturas compreendidas entre aproximadamente 60° e 70°C.

Os compostos de fórmula II podem produzir-se por reacção de um péptido protegido tendo um grupo amino livre, num meio ligeiramente ácido, com uma cetose (reagrupamento de Heyns). Tal reacção pode levar-se a efeito nas mesmas condições que as indicadas anteriormente para o reagrupamento de Amadori.

Os compostos de fórmula III podem produzir-se por reacção de um péptido protegido tendo um grupo amino livre cori: um ácido de fórmula G^-COOH ou então com um derivado reactivo de tal ácido, e em seguida eliminam-s.e o grupo ou os grupos protetores. Pode tratar-se de uma reacção de amidaçao habitual, que pode efectuar-se de maneira conhecida. Como derivados reactivos de ácido carboxílicos podem utilizar-se, em particular, halogenetos de ácidos.

As amidas podem produzir-se, por exemplo, também com os ácidos livres em presença de hidroxibenzotriazol e diciclohexilcarbodiimida.

Os compostos das fórmulas IVa, IVb, IVc e IVd podem produzir-se

a) fazendo reagir primeiramente o péptido com o membro de ponte e em seguida fazendo reagir o produto com o açúcar, ou

b) fazendo reagir primeiramente o açúcar com o membro de ponte e em seguida fazendo reagir o membro de ponte glicolisado com o péptido.

Estas reacções podem levar-se a efeito de maneira usual. Geralmente os compostos de amida, de éster ou de acetal da invenção são os produtos principais. Os compostos da invenção podem purificar-se de acordo com métodos habituais.

Os compostos da fórmula IVa em que Q significa -CO- ou -CS-, podem produzir-se, por exemplo, por copulação do glicosilisocianato ou glicosilisotiocianato correspondente que tem a fórmula

na qual L significa 0 ou S e tem os significados acima definidos, e em que os grupos hidroxi livres presentes em G^ estão protegidos por exemplo por acilação, com um péptido P-NH^ ^so^ ^a forma protegida, e em seguida cindem-se os grupos protectores.

Pode-se efectuar esta reacção de uma maneira usual para a produção de derivados de ureia.

Os compostos de fórmula IVc e de fórmula IVd podem obter-se, por exemplo, por meio de um reagrupamento de Amadori du de Heyns, por exemplo tal como descrito anteriormente para a, produção dos compostos das fórmulas I e II.

Os compostos da fórmula Va ou Vb podem produzir-se, por exemplo, a’) por meio de aminação por redução de uma aldose, uma deoxi aldose ou uma cetose com 0 péptido P-NH₂-, ou b') por meio de redução do grupo hemi-acetal num nomposto de fórmula I ou II, se necessário, qualquer dos componentes da reacção pode estar protegido temporalmente.

A aminação redutiva e a redução podem realizar-se de maneira usual. A aminação redutiva pode efectuar-se, por exemplo com NaBH^CN. 0 pH preferido é 7. A redução do grupo

hemi-acetal pode levar-se a efeito com borihidretos, por exemplo com NaBH^. 0 pH preferido é de 6 aproximadamente.

Quanto à produção dos materiais de partida não está descrita particularmente, trata-se de compostos conhecidos ou que podem produzir-se de maneira usual, por exemplo, por métodos conhecidos na literatura ou descritos nesta memória para compostos análogos, ou por meio de síntese de acordo com a invenção como descrito mais adiante.

Uma classe preferida dos compostos da invenção compreende os derivados de açúcar dos péptidos somatostatina, por exemplo de 4 a 9 aminoácidos. 0 termo péptidos somatostatina inclui os seus análogos ou derivados dos mesmos. Especialmente preferidos são os derivados de açúcar do composto da fórmula VIII:

A -NH CH 1

CO - N CH₀-S-Y,

I ² -¹

CH-CO-B-C-D-BY₂-S-CH₂

NH - CH - F

4 5 6 7 (VIII) na qual

A significa hidrogénio, um grupo alquilo com 1 a 3 átomos de carbono ou um grupo alcanoilo com 1 a 4 átomos de carbono,

j)-CO significa

1) um radical (1)- ou (D)-fenilalanina, eventualmente substituído por halogéneo, por N0₂, por NH₂ ou por CH, um grupo alquilo com 1 a 3 átomos de carbono e/ou um grupo alcóxi com 1 a 3 átomos de carbono, ou

2) o radical de umOí-aminoácido lipófilo natural ou o radical de um (D)-aminoácido correspondente, diferente do in20 dicado sob 1), em ^N-CHÍZp-CO,

Zj_ representa o radical de um radical aminoácido do sob 1) e 2) mais acima, definiA’ ^Y1 significa hidrogénio ou alquilo com 1 a 3 átomos bono, de car^Y2 significam, independentemente um do outro,

1)

2) hidrogénio %

-C0-C-(CH₂)_m-H ^Rb

2'm

3)

4) em que m significa um número inteiro significa CH^ ou ch₃ ^Ra

Rk significa H, ou então

C₂H₅ e c₂h₅ ou

-CO-CH ch₂ (CH₂)_n em que n ou então significa um número inteiro de 1 a 4 de 1 a 5, em que R_c alquilo com 1 a 6 átoou então significa um radical mos de carbono de cadeia linear ou ramificada,

-CO-NH-CH-COOR„ t ^{e R}d

5) em que R_d significa o radical de um ©(-aminoácido (inclusive hidrogénio) que se encontra sobre o átomoo(-C, e

R_e significa um radical alquilo com 1 a 5 átomos de carbono,

6)

-CO-(NH)

em que R^ e R^ significam, independentemente um do outro, hidrogénio, CH^ ou CgHçj tro, hidrogénio, F, com 1 a 3 com 1 a 3 significam, independentemente um.· do ouiCl, Br, alquilo átomos de carbono ou alcoxi átomos de carbono, p significa 0 ou 1, q significa 0 ou 1 e r significa 0, 1 ou 2, ou então Y^ e Yg conjuntamento representam uma ligação

B representa Phe ou Phe substituído no radical fenilo por F, por Cl, por Br, .por NOg, por NHg, por OH, por alquilo com 1 a 3 átomos de carbono ou por alcoxi com 1 a 3 átomos de carbono,

C representa Ir- ou D-Trp se necessário substituído no ciclo benzénico por F, por Cl, por Br, por NOg, por NHg, por OH, por alquilo com 1 a 3 átomos de carbono ou por alcoxi com 1 a 3 átomos de carbono, i

D representa Lis, em que o grupo °í-amino pode estar substituído por metilo,

E representa Thr, Ser, Vai, representa OOOR^, CH₂OR_2> CO-NR^R^ ou -CO-NRj- significa hidrogénio ou alquilo com 1 a 3 átomos de carbono

R₂ significa hidrogénio ou o radical de um éster hidrolisável fisiologicamente e aceitável do ponto de vista fisiológico

Rg significa hidrogénio, alquilo com 1 a 3 átomos de carbono, fenilo ou fenilalquilo com 7 a 10 átomos de carbono, mas no caso de R^ representar -CHCR^J-X·^, R^ pode significar unicamente hidrogénio ou metilo,

R. representa hidrogénio, alquilo com 1 a 3 átomos de carbono ou

(ΙΣ)

representa o radical de um aminoácido natural (inclusive hidrogénio) que se encontra sobre o átomo cv-C ou representa um radical HO-CH₂-GH₂ ou H0(-CH₂)p em que o grupo IX pode ter a configuração 1 ou D,

Xj. representa COOR-p CH₂0R₂ ou CON

Rg representa hidrogénio ou alquilo com 1 a 3 átomos de carbono,

representa hidrogénio, alquilo com 1 a 3 átomos de carbono, fenilo ou fenilalquilo com 7 a 10 átomos de carbono, em que os radicais B, D e E podem encontrar-se sob a forma 1 e os radicais nas posições 2 e 7 assim como os radicais γ,4) e Y₂4) podem encontrar-se sob a forma D ou sob a forma L, e os sais de adição de ácidos e os complexos de tais derivados de polipéptidos.

Tais compostos estão descritos na Patente E.U.A. n2 4 395 403 cujos conteúdos inclusive os exemplos estão incorporados aqui como referência.

Nos derivados polipéptidos da fórmula VIII acima indicada, as definições ou combinações de tais definições preferidas são as seguintes.

Se ^N-CH(Z₁)-CO- tem a definição 1), tal radical é de preferência um radical (l·)- ou (D)-fenilalanina ou um radical (L)- ou (D)-tirosina (significando o símbolo Z benzilo ou p-OH), em especial o radical (D)fenilalanina.

Se^N-CH(Z₁)-CO~ tem a definição 2), preferem-se os radicais em que Z-^ significa alquilo contendo 3 átomos de carbono, de preferência 4 ou mais átomos de carbono, por exemplo até 7 átomos de carbono.

radical J^N-CH(Z^)-CO- particularmente preferido é um radical como definido na alínea 1).

Os símbolos Y^ e Y₂ têm de preferência os significados indicados mais acima sob 1, 2 ou 4. Em especial formam conjuntamente uma ligação.

B significa de preferência Phe ou Tyr

C significa de preferência -(D)-Trp

D significa de preferência Lis

I

E significa de preferência Tl}r /^R3 significa de preferência CO-N em especial p ^R4

^R3 em que o radical -CHÍR^J-X^ tem, de preferência, a configuração I, significa de preferência hidrogénio,

R₅ significa CH₂0H, CH-OH, i-butilo, CH₂CH₂OH ou ch₃ (ch₂)₃-oh, em especial CH_o0H ou CH-OH, em particular e t ^CH3

CH-OH ch₃ ^X1 ou ch₂or₂, r₂ em especial CHgORg significa de preferência hidrogénio,

R₂, como radical de um éster, significa de preferência HCO, alquilcarbonilo com 2 a 12 átomos de carbono, fenilalquilcarbonilo com 8 a 12 átomos de carbono ou benzoilo.

Os radicais nas posições 2 e 7 têm de preferência

I configuração

Derivados de açúcar da somatostatina especialmente preferidos são os que têm o radical açúcar sobre o grupo amino N-terminal, por exemplo os compostos que têm a fórmula

Ph cm Μ M o -o

I co i cm m

H iz;

Ph

I CM

Μ W o -o í co i

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H	K	H	W
H		H
H	1	H
t>	>	H ’
Χχ-ζ	n	x_z	Η o
	1		1 o co
	o		1 1
			CM
	1		Μ M 0-0
	FQ
	H ’		1 ** <
	Η O 1 o co		1
	1 1		o
	CM		o
	M W o -o		1
	1		<—I Jrj
			N -O
	< -ÍZ		I
	1		< -fe
	o		1
	o		—
			<y
	1		1
		o
	H M N -o <4 ~jÁ		?
	1		1 '
	O
	o		x »
	1 m		/
	O		O '

(ΡΙΙΙΛ)

Η Ζ_χ AOHg-S-Yj, Y₂-S-CH₂

NH-Q-N-CH-CO-N-CH-CO-B-C-B-E-NH-CH-E em que Q é CO ou CS (VlIIe)

Η Z, A’CH_O-S-Y₁ Y_O-S-CH_O

II¹ I I ^{2 1 2} I ²

HOCH₂- (CHOH) _c-CY-CH₂-N-CH-C0-N-CH-C0-B-C-D-E-NH-CH-E (VlIIf)

Especialmente preferidos são os compostos das fór mulas VlIIa, VlIIb, VlIIe e VlIIf.

Um grupo de compostos compreende os compostos de fórmula VlIIpa

Z η	A* 1	ÇH2-S-I1	y2-s-ch2
Ap - NH - CH -	CO - N -	CH - CO - B -	C -	D -	E	- NH-CH-E
1		2 3	4	5	6	7

(VlIIpa) na qual

A-P significa um radical desoxidado de uma cetose ou então um ácido urónico correspondente, estando o grupo ligado ao grupo NH por meio de um grupo CH₂, sendo o citado grupo desoxidado obtenível por meio de uma reacção de Amadori de uma aldose ou de um ácido urónico correspondente com o grupo amino livre da somatostatina, e

Zp A’, Yp B, C, D, E, Y₂ têm os significados definidos anteriormente em relação à fórmula VIII,

Outro grupo de compostos compreende os compostos da fórmula VlIIpb

AZ A’ CH₀-S-Y₁ Y_o-S-CH₉

II I I ^Χ d ,

G - CO - N - CH - CO - N - CH - CO - B-C-D-E - NH - CH - F

2 3 4 5 6 7 (VlIIpb) na qual

G significa um radical acilo de um ácido urónico, um ácido polihidroxiciclohexanocarboxílico, um ácido N-acetil-muramínico ou um ácido N-acetil-neuramínico,

A significa hidrogénio, um grupo alquilo com 1 a 3 átomos de carbono ou um grupo alcanoilo com 1 a 4 átomos de carbono,

Ζ, A’, Y^, B, G, D, E, Y₂ e F têm os significados definidos anteriormente.

símbolo G significa convenientemente ácido glucurónico, ácido galacturónico ou ácido quínico.

Outro grupo de compostos compreende os compostos da fórmula VIIIpo a z a»ch₂-s-y₁ y₂-s-ch₂

Q-0-C_nH_2n-CO-N-CH-CO-N-CH-CO-B-C-D-E-NH-CH-F

2 3 4 5 6 7 na qual

Q significa hidrogénio ou o grupo glicosilo de um monossacárido, dissacárido ou oligossacárido, n significa um número inteiro de 1 a 6,

A significa hidrogénio, um grupo alquilo com 1 a 3 átomos de carbono ou um grupo alcanoilo com 1 a 4 átomos de carbono,

Z, A’, Yp B, C, D, E, Y₂ e F têm os significados tais como definidos anteriormente.

Outra classe preferida dos compostos da invenção compreende os derivados de açúcar das calcitoninas.

termo calcitonina” abrange as calcitoninas naturais (extraídas a partir de fontes naturais, ou procedentes de culturas de células etc., ou produzidas sinteticamente) e os derivados e análogos de tais calcitoninas.

As calcitoninas naturais que podem utilizar-se incluem a calcitonina humana, do salmão, da enguia, do frango, do boi, da ovelha, da ratazana ou de porco, em especial a calcitonina humana, do salmão, do frango e da enguia.

Os derivados e análogos das citadas calcitoninas incluem em particular as estruturas calcitonínicas naturais, em que um ou mais radicais de aminoácido estão substituídos por um ou mais outros radicais de aminoácido e/ou a ponte S-S está substituída por uma ponte alquileno, e/ou em que um ou vários radicais de aminoácidos foram omitidos.

Particularmente preferidos são os derivados de açúcar das calcitoninas da fórmula X seguinte

Ϊ1 ?2

R-(NH-CH-CO)_o-Ag-NH-CH-CO-Ag“Ag-Z^-ProNH₂ (X) na qual

R representa H ou RCo

RCO representa o radical acilo de um ácido carboxílico, representa o radical de um &(-aminoácido que se encontra sobre o átomo °<-C, f? 29 t' í '

J>

Y₂ representa o radical de o(-aminoácido que se encontra sobre o átomo de<x-C, ou representa

-ch₂-s-s-ch₂-ch-cooh , -ch₂-s-s-ch₂-ch₂-COOH, k,

-(CH₂)_s-C°^0H ou -CHp-S-Υβ,

Y^ representa alquilo com 1 a 4 átomos de carbono; benzilo eventualmente substituído por metilo ou por metoxi ou representa CH^COONH-CHg-,

0	representa o número inteiro de 1 a 4
Ag	representa Thr ou D-Thr
s	representa um número inteiro de 3 a 5
Ag	representa o radical de aminoacilo de um I- «(-aminoáci-
	do lipófilo, neutral
A9	representa o radical aminoâcido de um L- ou D- «|-amino-
	ácido lipófilo, neutral, e
Z1	representa um radical polipéptido que se encontra nas

posições 10a 31 de uma calcitonina natural ou um derivado ou análogo do mesmo, que tem actividade hipocalcémica, em que os radical Y| 1 a 4 na fórmula X, independentemente uns dos outros, podem ser iguais ou diferentes; com a excepção do radical de aminoacilo Ag, todos os radicais de aminoácidos na fórmula X podem ter a configuração L ou D, e sais e complexos dos citados compostos.

Compostos tais estão descritos, por exemplo, na patente GB 2 184 729 A, cujos conteúdos se incorporam aqui por referência.

símbolo Z·^ na fórmula X significa um radical pépti do que pode ocupar as posições 10 até 31 em várias calcitoninas conhecidas, por exemplo na calcitonina humana, do salmão, •ί® da enguia, do frango, do boi, da ovelha, da ratazana ou a calcitoninã do porco, assim como também em derivados e análogos de tais calcitoninas, tendo actividade similar. Por derivados e análogos destas calcitoninas entendem-se, em especial, as calcitoninas naturais nas quais um ou mais radicais de aminoácidos estão substituídos por um ou mais outros radicais de aminoácidos, ou então a ponte S-S está substituída por uma ponte alquileno, ou então em que um ou mais radicais de aminoácidos foram omitidos. Estes radicais péptidos Z^ compreendem normalmente 22 aminoácidos, ainda que possam também conter uma quantidade correspondentemente inferior de radicais de aminoácidos por omissão de um ou de vários radicais de aminoácidos (derivados de des-aminoacilo).

representa de preferência

a) Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-lys-Phe-His-Thr-

Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala

b) Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-leu-Gln-

Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Vai-Gly-Ala-Gly-Thr

c) Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-GlnThr-Tyr-Pro-Arg Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr

Os compostos da fórmula X em que Z^ tem o significado indicado sob b) ou c) são particularmente preferidos, especialmente aqueles em que Z^ tem o significado indicado na alínea c).

R”CO significa de preferência o radical acilo de um ácido carboxílico alifático, cicloalifático, aromático ou heterocíclico,

R” rèpresenta de preferência a’) um grupo alquilo com 1 a 17 átomos de carbono, linear ou ramificado, saturado ou por saturar, em particular um grupo alquilo com 3 a 9 átomos de carbono b’) representa um grupo cicloalquilo com 5 a 7 átomos de carbono ou um grupo cicloalquilalquilo em que o grupo cicloalquilo contém 5 a 7 átomos de carbono e o grupo alquilo contém 1 ou 2 átomos de carbono, | c’) um grupo adamantilo, adamantilmetilo ou adamantietilo •ou d') um grupo fenilo, benzilo ou feniletilo.

Nos significados para o símbolo R” acima mencionados, os grupos alquilo, cicloalquilo ou fenilo podem estar substituídos por substituintes habituais, por exemplo por halogéneo, por N0₂, por OH, por alcoxi, etc.

radical R”CO pode ser, por exemplo, o radicalx•desamino de um -aminoácido natural. Para R” preferem-se em particular os significados a'), b’) e o).

Os símbolos Υ’^ e Y’₂ representando os radicais que se encontram sobre o átomo <^-0 de unw-aminoácido representam em particular os radicais unidos ao átomo <x-C de um o(-aminoácido natural, ainda que também entrem em consideração os radicais de outros <x-aminoácidos, tais como por exemplo os da 3-ciclohexilalanina ou do ácidoof-aminoisobutírico.

No caso que o símbolo o na fórmula X signifique 4, então

a) o radical de aminoacilo N-terminal (concorda com o segundo radical de aminoácido na sequência da calcitonina natural) representa de preferência Ser, G-ly ou

- Ala,

b) o segundo radical de aminoacilo (concorda com o terceiro radical de aminoácido na sequência da calcitoni32 na natural) representa de preferência Asn ou Ser,

c)

d) o terceiro radical de aminoacilo (concorda com o quarto radical de aminoácido na sequência da calcitonina natural) representa de preferência Leu, Asn, Ser, Phe, D-Leu ou o radical da ciclohexilalanina, o quarto radical de aminoacilo (concorda com o quinto radical de aminoácido na sequência da calcitonina natural) representa de preferência Ser ou Ala.

Quando o símbolo o na fórmula X representa 3, N-terminal, o segundo e o terceiro o mesmo significado como indicado que o = 4 na alínea b), respectiva-

d).

os radicais de aminoacilo radical de aminoacilo têm mais acima para o caso em mente c), respectivamente

Quando o na fórmula X representa 2, o radical de aminoacilo N-terminal e o segundo radical de aminoacilo tem de preferência os mesmos significados preferidos como indicados mais acima para o caso em que o = 4 na alínea c), respectivamente na alínea d).

Quando o na fórmula X representa 1, o radical de aminoácido N-terminal representa de preferência Ser ou Ala.

representa de preferência Cis, ou então um derivado da cisteina como indicado anteriormente para o símbolo ou então um radical tf-aminoacilo lipófilo neutral, em particular Ala ou um radical c(-aminoacilo lipófilo neutral, com maior preferência representa Ala, ^A8 representa de preferência o radical aminoacilo de

um α-aminoácido lipófilo neutral, em particular representa Vai ou Gli,

Αθ representa igualmente, de preferência, o radical aminoacilo de umcx-aminoácido lipófilo neutral, em particular representa Leu ou phe.

Nos compostos da fórmula X, o símbolo o representa de preferência 2, representando R, H ou R”CO; ou então o representa com maior preferência 1 e R representa R^ttCO. Todos os radicais aminoácidos têm de preferência a configuração L.

Como calcitoninas glicosiladas (incluindo os derivados e análogos) entram em consideração as calcitoninas glicosiladas quer sobre o grupo amino N-terminal quer sobre um ou vários grupos amino numa ou em várias cadeias laterais, preferindo-se, por exemplo, os compostos das fórmulas

(Xla)

NH-Cal

A

G^CO-N-Cal (Xlb)

Z-°\ A

G y—Ο-ς’-Ν-Cal (XID) (Xle) ou

H0H₂C- (CHOH) _c-CY-CH₂NH-Cal (Xlf) nas quais Cal representa o radical de uma calcitonina natural ou de um derivado ou análogo de tal calcitonina, radical que está unido ao radical de açúcar através de um grupo amino quei ao final N-terminal quer a uma cadeia lateral.

Os derivados de calcitoninas da fórmula X podem preparar-se de acordo com os métodos conhecidos, geralmente adoptados para a síntese desta classe de polipéptidos. Os polipéptidos de tal fórmula X podem produzir-se, por exemplo, tal como segue:

a) elimina-se pelo menos um grupo protector presente num polipéptido protegido na sequência indicada na fórmula X, ou

b) ligam-se duas unidades peptídicas, cada uma das quais contendo pelo menos um aminoácido ou um derivado deste, como descrito para a fórmula X, sob a forma protegida ou por proteger, por meio de uma ligação amida, devendo efectuar-se a ligação peptídica de uma maneira tal que se restabeleça a sequência aminoácido contida na fórmula Xe, se

for caso disso, efectua-se a seguir o processo da etapa a), ou

c) faz-se reagir um composto de fórmula X em que R representa hidrogénio, sob a forma protegida ou por proteger, com um ácido da fórmula R”COOH ou com um derivado reactivo de tal ácido e em seguida efectua-se eventualmente o processo da etapa a), ou

d) para a produção de compostos da fórmula X em que Y£ representa ch₂-s-s-ch₂-ch-gooh ou nh₂ ch₂-s-s-ch₂-ch₂-cooh, faz-se reagir um composto da fórmula XII

Y£ CH₂-SH

R-(NH-CH-CO) ^Ag-líH-CH-CO-Ag-Ag-Z^ProNHg (XII) sob a forma protegida ou por proteger, com um composto da fórmula XIII çh₂-s-Ri₀

Rll-V-CH-C0B.₁₂ (XIII) em que R_1Q representa um grupo susceptível de facilitar a formação de uma ponte S-S com o átomo S do grupo CH₂SH no péptido da fórmula XII, ^11 representa hidrogénio ou um grupo protector para o grupo amino,

Rj-₂ representa OH ou um grupo protector para o grupo carboxi e

V representa hidrogénio ou um grupo NH, ou então faz-se reagir um composto da fórmula XIV

Y| °%^SR10

R- (NH-CH-CO) ^Ag-NH-CH-CO-Ag-Ag-Zj-ProNHg (XIV) sob a forma protegida ou por proteger, em que R-^θ tem o significado acima definido, com um composto da fórmula XV

CH₂-SH

R1I-V-CH-COR3 (XV) e, se for caso disso, efectua-se seguidamente 0 processo de etapa a).

Quando a produção dos produtos de partida não está descrita especificamente, trata-se de compostos conhecidos ou de compostos que podem produzir-se e purificar-se de acordo com métodos usuais. Também os produtos finais da fórmula X pode purificar-se de uma maneira habitual, de modo que contenham menos de 5 % de produtos polipeptidos secundários. Os péptidos utilizados como produtos de partida para os processos

a) e b) podem produzir-se igualmente de uma maneira por si conhecida, em solução, ou então segundo 0 processo de Fase Sólida.

A produção das unidades peptídicas contendo como radical Yg ^um grupo

-CHg-S-S-GHg-CHg-COOH ou GHg-S-S-CHg-CHÍNHgJ-CCOH gfectua-se analogamente ao processo d) acima mencionado.

Em tal processo d), utilizam-se compostos que têm a fórmula XIII respectivamente XIV em que R_1Q representa radicais per si conhecidos que reagem com mercaptanos sob formação de uma ligação S-S. 0 símbolo representa em particular S-alquilo, -S-COOalquilo,

S

Nestes grupos, o grupo alquilo representa em particular um grupo alquilo inferior com 1 a 4 átomos de carbono. A introdução destes grupos nos compostos contendo grupos SH livres leva-se a efeito em analogia com os métodos conhecidos na química do enxofre.

Outra classe preferida de compostos compreende um grupo de LH RH antagonistas.

Os compostos incluem, de preferência, derivados de açúcar de compostos da fórmula XVI

(XVI na qual

Rj_ significa H ou um grupo acilo com 1 a 7 átomos de carbono, Aj significa D-Phe, que está eventualmente substituído no ciclo fenílico por F, por 01, por Br, por NHg, por ou por OCH^, especialmente na posição 4, ou representa(i-D-naftilalanina, D-Trp que está eventualmente substituído na posição 5 ou 6 por F, por 01, por Br, por NH₂ ou por OCH^ e/ou está substituída na posição 1 por formilo ou por acétilprolina, por 3,4-dehidroprolina ou por D-piroglutamina,

Bj significa D-Phe, eventualmente substituído por F, por 01, por Br, por NH₂, por ^3 ^ou P^or CH^O no ciclo fenílico,

D—0( -metil-fenilalanina que está eventualmente substituída na posição 4 por Cl, ou (3-D-naf t i lalanina significa D-Trp, eventualmente substituída na posição ou β por F, por Cl, por Br, por NK₂ e/ou por OCH^ e/ou na posição 1 por HCO ou por CH^CO, (3 -D-naf t i lalanina,

3-D-piridilalanina,

D-Tyr, ou

Phe, eventualmente substituído por F, por Cl, por Br, por NH₂, por CH^, ou por CH^O,

D^ significa Ser,

E^ significa Tir, ou fenilalanina eventualmente substituído no ciclo fenílico por Cl, por Br, por NH₂, por CH^ ou por CH₃O,

Fj- significa D-Phe, opcionalmente substituído no ciclo fenílico por F, por Cl, por Br, por NH₂, por CH₃ ou por CH₃O, D-Trp, opcionalmente substituído na posição 5 ou 6 por F, por Cl, por Br, por NH₂ ou por CH-^O e/ou na posição 1 por formilo ou por acetilo,

D Tir, ^-D-naftilalanina, D-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Val, D-Ser (OtBU), D-Arg, opcionalmente dialquilada com um grupo alquilo em ou cicloalquilo em C^__g,

D-humoarginina, opcionalmente dialquilada com alquilo em θΐ-β ^{ou em} θ5_6»

D-His, D-His(Bzl),

D-Lis ou D-Orn, ambos opcionalmente dialquilados com alquilo em C-μ,θ ou cicloalquilo em

D-Phe (p-NH₂) ou

tf-p-aminociclohexilalanina,

Gj_ significa Leu, Nle, Nva, Ν-tf-metil-leucina, Trp, Phe, Met ou Tir significa Arg, Lis ou Orn que está opcionalmente substituído por alquilo em Cq_g ou por cicloalquilo em C^g, ϊΐ, significa Pro, hidroxiprolina, ou 3,4-dehidroprolina, e significa D-Ala.

Se desejado, Ej e íj podem estar substituídos um pelo outro.

^e Kq P⁰^^em> ^se desejado, ser Cis ligado por uma ponte S-S.

Se desejado, um de ^e Kq significa Asp ou Glu, o outro significa Orn, ácido diaminopropiónico ou ácido diaminobutírico, e em que os radicais Dj_ e estão ligados por uma ponte amida.

Significados preferidos são os seguintes:

Rj. = acetilo ou formilo

Aq = D-Phe, D-Phe, (p-Cl), β-D-naftilalanina,

3,4-dehidroprolina,

Bj- = D-Phe, opcionalmente substituído como indicado mais acima,

C·^ = D-Trp, opcionalmente substituída como indicado mais acima, = Ser

Uma substituição opcional é de pref. a mono-substituição.

i) Eq = Tir ou Phe opcionalmente substituído como indicado mais acima, quando F^ significa D-Phe ou Lis ou

ii)	E1	= D-Phe ou lys quando F^ = Tir ou Phe opcionalmente substituído segundo indicado mais acima,
	G1	= leu
	Ηχ	= Arg
	Σ1	= Pro
	K1	= D-Ala.
		Nos antagonistas 1H RH acima mencionados, o radi-
cal	de açúcar está ligado, de preferência, com o grupo amino

N-terminal ou então com um grupo amino livre numa cadeia lateral.

Os derivados de açúcar têm de preferência as estruturas seguintes em que o antagonista HgN-lHRH significa um radical de um antagonista LHRH da fórmula XVI:

X ✓

K.

OH

CHgNH-LHRH-Antag.

(XVIa)

G^-CO-NH-LHRH-Antag.

(XVTb) (XVIc)

NH-Q-NH-IHRH-Antag.

(XVId)

♦

O-Q’-NH-LHRH-Antag.

HOGH₂C- (GHOH) _C-C-CH₂-NH-LHRH-Ant ag. Ϋ (XVIe) (XVIf)

Nas fórmulas XVIa a XVIf acima definidas, por razões de simplificação indica-se unicamente um radical de açúcar ligado a um grupo amino. Gontudo, se desejado podem estar presentes mais de um radical de açúcar. De preferência encontram-se presentes dois de tais radicais de açúcar.

Os materiais de partida e a síntese para os antagonistas LHRH por modificar, estão descritos, por exemplo, nas patentes europeias 81887 e 201260 A.

Outros polipéptidos preferidos são os seguintes:

a) oxitozina e vasopresina, assim como os seus derivados,

8 por exemplo Lis -vasopresina e Orn -vasopresina,

b) Insulina

c) factor de libertação da hormona de crescimento.

Os materiais de partida e os compostos da invenção podem preparar-se por meio de síntese de fase líquida ou síntese de fase sólida.

Os compostos da invenção podem preparar-se convenientemente por meio da síntese de fase sólida.

Encontrou-se um processo especialmente vantajoso para a preparação de álcoois peptídicos que contém sobre o C'-terminal da cadeia peptídica dos grupos de álcool ou então um grupo álcool e um grupo tiol. 0 processo é partieularmente apropriado para a preparação de álcoois peptídicos que contêm um radical treoninol, serinol ou cisteinol C terminal.

Os exemplos de compostos apropriados incluem alguns dos compostos somatostatina descritos nesta memória.

Verificou-se que a síntese de péptidos pela Fase Sólida é um processo especialmente rápido e favorável para a preparação de péptidos e, por conseguinte, chegou a ser um método geralmente convencional.

Como é sabido, liga-se, primeiramente, um aminoácido por meio do seu grupo carboxi a um grupo hidroxi ou a um grupo amino de uma resina sintética insolúvel, formando um grupo éster ou amida; em seguida adicionam-se os demais aminoácidos na sequência desejada e, finalmente, cinde-se o polipéptido completo a partir da resina veículo.

Esta síntese não cria problemas alguns para oa polipéptidos naturais tendo aminoácidos C-terminais. Contudo, os álcoois polipeptídicos que, sobre o átomo C-termínal contém um amino-álcool em vez de um aminoácido, não devem formar facilmente uma ligação com as resinas (utilizadas como veículo) que contêm grupos OH ou NHg e/ou não permitem, uma vez ter minada a síntese, um cisão fácil.

Verificou-se agora que a cisão do péptido a partir da resina, enquanto que forme simultaneamente o álcool peptídico C-terminal, efectua-se em condições suaves, se se ligar o amino-álcool C-terminal à resina por meio de uma ligação acetal.

De acordo oom a presente invenção, o álcool peptídico, contendo sobre o átomo C-terminal da cadeia peptídica dois grupos álcool ou um grupo álcool e um grupo tiol, é ,preparado por hidrólise ácida de um acetal do álcool peptídico e de uma resina polímera que contém grupos formilfenilo.

Prefere-se também este processo como a síntese da

A reacção pode ilustrar-se esquematicamente tal como segue:

invenção.

®-^z

(Ir) /--k^CHO CHRj-XH @-Z·/ Qj) +y-co-nh-ch-ch₂oh (Ilr)

P significa o radical de uma resina sintética insolúvel,

Z significa uma ligação directa ou um radical que une a resina ao grupo formilfenilo (acetalisado),

X significa 0 ou S,

Rj significa hidrogénio ou metilo, e

Y significa o radical de um álcool peptídico que pode conter grupos protectores, em que o grupo CHO se encontra na posição m ou p do radical Z.

Por razões de simplicidade, nas fórmulas I e II do esquema acima indicado, dá-se só um grupo de substituição; deverá entender-se, contudo, que tais numerosos grupos estão ligados a uma molécula da resina polímera.

A cisão do álcool peptídico a partir da resina por meio de hidrólise do grupo acetal efectua-se tal como men44

cionado anteriormente em condições ácidas, por exemplo com ácido trifluoracético diluído. A hidrólise pode efectuar~se à temperatura ambiente.

Se, na fórmula I , o símbolo Z significa uma ligação directa, ligam-se directamente os grupos acetal contendo os radicais fenilo ao radical polímero e pertencem ao polímero.

Como exemplos de tais compostos de fórmula I entram em consideração os acetais de uma resina de poliestireno formilada (aasim, na fórmula I o símbolo (P) significa uma cadeia de polietileno).

Quando Z significa um radical, tal radical contém um grupo obtido por reacção de um. grupo reactivo, que está directamente ou indirectamente ligado ao polímero, com outro grupo reactivo que está ligado directa ou indirectamente ao grupo formilfenilo (acetalizado). 0 radical Z pode representar-se, por exemplo pela fórmula Illr seguinte:

-(B)_p-.Q_rQ₂-(E)_q- (Illr) em que

Qj = o radical de um grupo reactivo ligado ao polímero

Q₂ = o radical de um grupo reactivo ligado ao grupo formilfenilo (acetalizado)

D = um radical que une o grupo Q_x ao polímero

E = um radical que une o grupo Q₂ ao grupo formilfenilo (acetalizado) p e q, independentemente um do outro, significam 0 ou 1.

grupo Qj_“Q₂ θ de preferência um grupo éster ou amida, em especial um grupo carbonamida. significa de pre-ferência NH e Q₂ significa de preferência GO.

D e E, independentemente um do outro, significam, por exemplo, radicais alcileno ou alquileno-oxi com 1 a 5 átomos de carbono. Como exemplos de tais compostos de fórmula Ir em que Z significa um radical Illr, são os compostos em que significa o radical de uma resina poliestireno aminometilada e o radical

significa um radical de fórmula IVr

-C-CH-(O)

Η !l

R

X-CH.

CH-NH-CO-Y o-ch₂ em que

R significa hidrogénio ou metilo e m significa 0 ou 1, em que o grupo acetal se encontra, novamente, na posição m ou

p.

Neste caso, o símbolo z significa

-CH₂-NH-C0-CH-(0)_m- e

R

significa poliestireno.

radical IVr significa de preferência

Em vez do poliestireno aminometilado, podem-se utilizar também outros polímeros, em especial uns que tenham grupos NH₂ livres, por exemplo poliacrilamidas contendo grupos aminoetilo.

Como mencionado anteriormente, o grupo formilfenilo acetalizado está ligado de preferência ao polímero por uma ligação amida. Isso assegura que a copulação do radical formilfenilo acetalizado à resina durante a síntese do polipéptido e durante a cisão permaneça estável, e que a cisão ocorra sobre a ligação acetal, como desejado, de modo que, por um lado, o álcool peptídico é gerado e, por outro lado, o radical formilfenilo permaneça sobre a resina.

Se necessário, o péptido de álcool pode estar ligado mais afastado da resina por meio da incorporação dos chamados spacers entre os grupos reactivos do polímero (em especial grupos amino) e os grupos reactivos do derivado formilfenilo acetalizado (em especial grupos carboxi. Para certas reacções sobre o álcool polipeptídico, tal processo efectua-se vantajosamente antes da cisão (por exemplo oxidação de radicais cisteína). Neste caso, o radical D ou E na fórmula II contém, adicionalmente, o spacer, e ou Q₂ significa o radical reactivo do spacer”.

spacer” utilizado pode ser, por exemplo, um ácido(jj-aminocarboxílico, tal como ácido í-aminocapróico.

Num caso específico, ao utilizar um poliestireno aminometilado, um radical de fórmula IVr e um ácido é-aminoca47

prónico como spacer”, o símbolo Z significa

-CH₂-NH-CO-(CH₂)₅-NH-CO-CH-(O)_mR

Os compostos de fórmula I podem preparar-se por métodos que são usuais na tecnologia de ”Fase Sólida”, partindo de um composto de fórmula Vr

em que A significa um grupo protector da função amino e o grupo acetal ocupa a posição m ou p em relação ao radical Z.

Para tal fim, cinde-se primeiramente o grupo protector A e em seguida faz-se reagir o grupo amino livre com o seguinte aminoácido N-protegido, etc..., até que todos os aminoácidos sejam adicionados à resina na sequência que corresponda.

Os grupos protectores dos grupos amino que se têm de escolher para os aminoácidos utilizados ou para o amino-álcool, devem ser grupos susceptíveis de ser cindidos em condições não ácidas, já que em condições ácidas ocorre a hidrólise do grupo acetal. Como grupos protectores dos grupos amino pode-se utilizar o grupo CF^OO- ou o grupo FM0C-(9-flourenilmetiloxicarbonilo). Tais grupos protectores cindem-se em seguida num meio básico de acordo com métodos habituais na química de péptidos.

Unicamente o grupo protector do último aminoácido adicionado pode ser lábil para com ácidos e pode ser cindido da resina simultaneamente com a regeneração do alcoolpeptídico.

Utiliza-se de preferência o grupo Boc.

Como bases utilizam-se de preferência KOH ou piridina ou NaBH^

A formação da cadeia peptídica pode efectuar-se de uma maneira habitual partindo de um radical peptídico tendo grupos amino livres e de um aminoácido com grupos carbóxi livres ou activados.

A reacção pode efectuar-se, por exemplo, com adição de hidroxibenzotriazol ou de diciclohexilcarbodiimida.

Os compostos da fórmula Vr podem preparar-se, por exemplo, tal como segue:

a) faz-se reagir uma resina que contém um grupo aldeído de fórmula II

CHO

em que o grupo CHO ocupa a posição m ou p em relação ao substituinte Z, com amino-álcool N-protegido que tem a fórmula

HX-CHR₁-CH(NHA)-CH₂0H opcionalmente sob a forma activada, ou

b) faz-se reagir uma resina tendo a fórmula @-(D)-Q{

Ρ com um composto de fórmula VI

(n_r) na qual o grupo acetal ocupa a posição m ou p em relação ao grupo - (E)_Q - e

Q| e QJ> significam dois grupos reactivos que reagem mutuamente para formar uma ponte

A acetalização do processo a) pode levar-se a efei to em presença de um ácido como catalisador. Como ácidos apropriados podem citar-se o ácido p-toluenossulfónico e o ácido p-trifluormetilsulfónico.

Se necessário, pode-se utilizar um grupo trimetilsililo como grupo protector para o álcool livre.

processo de esterificação b) pode realizar-se em condições muito suaves, por exemplo por reacção de um derivado do ácido carboxílico com um polímero que contém um grupo OH ou NH₂

Os compostos de fórmula Vir podem preparar-se por acetilação de um composto de fórmula

com um composto de fórmula hx-chr₁-ch(nha)-ch₂oh

A acetalização pode efectuar-se tal como indicado para o processo a).

Durante a formação do álcool peptídico e a cisão do álcool peptídico a partir da resina, podem-se efectuar outras reacções, por exemplo uma eliminação dos grupos protecto res, por exemplo os grupos protectores S, ou uma oxidação dos radicais cisteina.

Tais reacções podem levar-se a efeito depois da cisão do álcool peptídico na fase líquida.

Nos Exemplos seguintes, todas as temperaturas estão indicadas em graus Centígrados; os valores /õç.7^ estão por corrigir.

Abreviaturas utilizadas:

AcOH =	ácido acético
Boc	=	butil terc.-oxicarbonilo
Bu6	=	butilo terciário
DCCI	=	diciclohexilcarbodiimida
DMF	=	dimetilformamida
Fmoc	=	9-fluorenilmetoxicarbonílo
MeOH	=	metanol
NEt3	=	trietilamina
Thr-ol	=	radical Treoninol = CHyCHOH-CHCCHgOH) -NH-
TFA	=	ácido trifluoracético
HOBT		N-hidroxibenzotriazol

hpGRF = factor de libertação da hormona de crescimento pancreático humano

HOSu = N-hidroxi-succinimida.

Obtêm-se todos os péptidos sob a forma de poliacetato - polihidrato cem um conteúdo em péptido de 70 a 90 %.

Segundo a análise HP10, os polipeptidos contêm menos de 5 % de outros péptidos.

Nos Exemplos seguintes, o factor F” indicado dá o conteúdo em péptido nos produtos obtidos (F = 1 corresponde ao conteúdo em péptido de 100 %. A diferença até 100 % /Tl-P) x 1007 completa-a ácido acético e água.

Todos os açúcares têm a configuração a menos que se dêm outras indicações. Deoxi = Desoxi.

EXEMPLO 1: - P>-deoxifructosil-DPhe-Cys-Phe-DTrp-lys----------------------1 _____________________

adicionam-se 3 ml de ácido trifluoracético (100 %) a 400 mg de deoxifructosÍ17-D-Phe-Cys-Phe-DTrp-Lys(BOC)-Thr-0ys-Thr-ol

— e mantém-se a mistura à temperatura ambiente até que o material de partida esteja dissolvido (5 minutos). Adicionam-se em seguida 20 ml de éter diisopropílico, depois do que se pre cipita o composto do título, separa-se a seguir por filtração e lava-se com éter diisopropílico. Purifica-se o composto do título por cromatografia sobre gel de sílica (eluente: GHCl^/ /MeOH/HOAcHgO 7/3/0,5/0,5 e isola-se sob a forma de um liofilizado branco.

/θ(_7·ί;0 _: -31,3° (c = 0,52 em HOAc a 95 $) P : 0,88.

► ^F 0 produto de partida pode preparar-se tal como segue:

a) HzPP^Çj^Phe^DTr^L^BOCi^Th^Çj^Thr^ol

Adicionam-se lentamente, gota a gota, à temperatura ambiente, 2,25 g de dibutil terc.-percarbonato, dissolvido em 30 ml de DMP, a uma solução de 10 g de acetato de H-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol em 100 ml de ML Depois de duas horas à temperatura ambiente, elimina-se o dissolvente sob pressão reduzida, e ao resíduo adicionam-se 200 ml de étei diisopropílico. Separa-se por filtração o precipitado formado, | lava-se com éter diisopropílico e seca-se. Purifica-se o produto em bruto por cromatografia sobre gel de sílica (eluente: CH₂Cl₂/MeOH 9/1) e em seguida isola-se sob a forma de um pó amorfo, branco.

Z*,7p° : 29,8° (C = 1,28 em DMP) |-----------------------------------------------------------------------------------------------1

b) N-β-desoxifructosil-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys(BOC)-Thr-Cys-

-Thr-ol

Dissolvem-se 2 g de D-(+)-glucose e 0,5 g do pro53 duto final obtido por meio da etapa a) em 20 ml de MeOH/HOAc 9/1 (volume/volume), e mantém-se a solução a 60 - 70° durante três horas. Depois de concentração por evaporação, recolhe-se o produto numa pequena quantidade de metanol, e precipita-se o composto do título com éter diisopropílico. cromatografia sobre gel

Purifica-se por de sílica (eluente: CH₂Cl₂/Me0H 9/1).

Obtém-se um pó amorfo.

1,04 em DMF)

Procedendo analogamente ao descrito no Exemplo 1 prepararm-se os seguintes compostos (todos sob a forma de acetatos) nestes compostos, SMS representa o radical polipéptido.

-DPhe-Cys- Phe-DTrp- Lys-Thr- 0 ys-Thr- o 1)

EXEMPLO 2 N* -/c< -glucosil(l-4)-deoxifructosil)-SMS

partindo de D(+)-maltose em vez da D-glutose /Ev 7^0 _n = -7,9 (c = 0,71 em AcOH a 95 %) F: 0,91

EXEMPLO 3; -glucosil( 1-4)-01 -glucosil(l-4)- (3-deoxifructosil-SMS

P: 0,78 partindo de maltotriosa em vez da D-glucose

Z'«7²⁰

D = +11,3° (c = 0,71 em AcOH a 95 %).

EXEMPLO 4: Ácido N^-fructofuranurónico-SMS

F. 0,88

Partindo de ácido D-glucurónico em vez da D-glucose.

Ζ#_7ρ° = -29,4° (c = 0,34 em AcOH a 95 %).

EXEMPLO 5: N^-deoxisorbosilo-SMS

partindo de D(+)-galactose em vez da D-glucose.

7²⁰ = -30,4° (c = 0,50 em AcOH a 95 “ D

EXEMPLO 6; N^-/Õ-β-D-glu.cosil-(l-4)-deoxifruotosilo7-SMS

partindo de D(+)-celobiose.

D

28,1° (c = 0,47 em AcOH a 95 %).

I

EXEMPLO 7:

N^-L(-)-deoxifractosilo —SMS

F : 0,91 ►

partindo de

ZN7²⁰ ,

D

L(-)-glucose em vez de H(+)-glucose

-20° (c « 0,46 em AcOH a 95 %).

EXEMPLO 8:

N^-/Õ- p -D-glucosil-(1-6)-deoxifructosilo7-SMS

T‘ £

HO

H

F : 0,76 partindo de

Z~<7²⁰

D gentiobiose em vez de E-glucose

23,5° (c = 0,46 em AcOH a 95 %).

57.

EXEMPLO 9: ^-/Ο-β -D-galactosil-(l-4)-deoxifruotosilo7SMS

Ε : 0,83 partindo de D(+)-lactose em vez de B-glucose £o 7^2Q = -29,3° (c = 0,55 em AcOH a 95 %). ~ P

EXEMPLO 10: N^(0-O|-galactosil-(l-6)-deoxifructosil)-SIwS

CH₂-(P)Phe-Cys-Phe-(P)Trp-Lys-Thr-Oys

-Thr-ol partindo de melibiose em vez de P-glucose.

Z«_7²⁰ = +8,4° (c = 0,5 em AcOH a 95 %

D

F : 0,76

EXEMPLO 11: /N-(l-deoxi-D-fructosil)-Tyr³7-SMS

ΌΗ₂- (D) Phe-Cys-Tyr- (D) Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol

Partindo de Tir³-SMS em vez de SMS /”cz_7²⁰= -32,2^o (c = 0,9 em AcOH a 95 %) F : 0,87 D

EXEMPLO 12: -D-glucopiranosil-(l-4)-deoxifractosil),

Tir³7-SMS

OH —CH₂~ (D) Phe-cjrs-Tyr- (D) Trp-Lys-Thr-C^s-Thr-o1 partindo de D(+)-maltose em vez de D-glucose e de Tir -SMS em vez de SMS

= -4,7° (c = 1,0 em AcOH a 95

F = 0,81

EXEMPLO 13:

(D) Phe-Cys-Phe- (D) Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol partindo de D--glu.coh.ept o se em vez de D-glucose

ZXJ²⁰ = -12,9° (c = 1,0 em AcOH a 95 $) F = 0,91 D

EXEMPLO 14:

R I

R- (D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Tr-Oys-Thr-ol

partindo de D(+)-glucose e de SMS, que não tem nenhum grupo protector sobre o grupo ^-NH₂ de lisina /^_cx_7²⁰ = -42,4° (c = 0,37 em AcOH a 95 $) F = 0,83

EXEMPLO 15;

I ^R

R- (D)Phe-Cys- Phe-(D)Trp-Lys-Thr-0 ys-Thr-o1

partindo de glucoheptose e de SMS que não contém grupo protec· tor sobre o grupo de lisina £<* 7²⁰= -9,3° (c = 0,41 em AcOH a 95 %) F = 0,84 “ D

EXEMPLO 16: Fructosil - 6 - fosfato - SMS

partindo de D-glucose-6-fosfato em vez de D-glucose />y v20 ^L _Ό = -19,5 (c = 1,0 em AcOH a 95 %) F = 0,89

EXEMPLO 17:

Partindo de B-ribose em vez de D-glucose ₌ _3i_>8° (c = 1,0 em AcOH a 95 %).

EXEMPLO 18: N^-deoxifructosil-(B)Phe-Cys2ÕOC(CH₃)₃_7-Phe-(B)-Trp-Lys-Thr-Cys /COC(CH₃)₃_7-Thr-ol r--------------------------------------------1

a) deoxifructosil -(B)Phe-Cys-Phe-(B)Trp-Lys(BOC)-Thr-Cys___________________-____________________________

Misturam-·se 0,58 g do composto do Exemplo 1 em 10 ml de BMF primeiramente com 0,08 ml de NEt₃ e em seguida com 0,12 ml de (BOC)₂O. Agita-se a mistura durante 15 horas à temperatura ambiente, e em seguida concentra-se sob vácuo e agita-se com éter. Separa-se por filtração o produto que se precipitou. Dissolve-se o resíduo com uma pequena quantidade de MeOH, e em seguida precipita-se o produto pela adição de HgO. Filtra-se o produto, lava-se com uma pequena quantidade de Ií₂0 e seca-se, com o qual se obtém o composto do título. /“<7²⁰ = +14,5° (c = 0,7 em DMF)

b) N^-deoxifructosil-(D)-Phe ’-Cys-Dhe-(D)Trp-Lys(BOC)-ThrzÇys₌Thr₌ol____________________________________________

0,51 g do composto final da etapa a) numa mistura que consta de 10 ml de dioxano e de 2 ml de NEt^/tampão AcOH a um pH de 8,6, misturam-se, numa atmosfera de argão, com 0,4 g em total de ditioeritritol. Agita-se a mistura durante 15 horas aproximadamente à temperatura ambiente e em seguida concentra-se sob pressão reduzida. 0 produto precipitado submete-se a centrifugação. lava-se 0 resíduo con uma pequena quantidade de H₂0, e em seguida seca-se sob pressão reduzida. Obtém-se 0 composto do título.

/“<7 ²⁰ = +3,8° (c = 0,8 θω DMF)

D

0) B^c’-deozifrueto_Sil-(B)ae--CysZÕOO(CH₃)₃_7-rhe-(D)T^lys-(BOC)-Trp-Cys(COC(CH₃)₃ J7-Thr-ol

Dissolvem-se, sob argão, 0,38 g do composto final da Etapa b) em 25 ml de N-metilpirrolidona, em seguida misturam-se, a 0^o, com 0,3 ml de N-metilmorfolina e com 0,31 ml de cloreto de pivaloilo, e agitam-se a 0^o durante 16 horas aproximadamente. Agita-se o produto com éter/éter diisopropílico. 0 produto precipitado submete-se a centrifugação. Dissolve-se 0 resíduo com uma pequena quantidade de dimetilformamida e precipita-se 0 produto por adição de MeOH e de Κ,Ο. Submete-se 0 produto a centrifugação. 0 resíduo seca-se sob pressão reduzida e utiliza-se sem outra purificação.

d) -deoxif ructosil- (D) Phe-Cys/COC(CH₃) _3í_7~Fhe- (P) Trp-Lys-

-Thr-Cys/COC(CH₃) ₃__7-Thr-ol

Dissolvem-se, a 0^o, o resíduo da Etapa c) em 5 ml de TFA/H₂O (9 : 1) e agita-se durante 15 minutos, Precipita-se o produto por adição de uma mistura de éter / 10 % 5n HCJ/ /éter. Filtra-se o produto, lava-se com éter e seca-se. Purifica-se o resíduo por cromatografia sobre gel de sílica numa mistura de CHC1₃ / MeOH / AcOH / HgO. Combinam-se as fracções que contêm o produto desejado, concentram-se sob pressão reduzida com adição simultânea de H₂0 e em seguida liofilizam-se. Obtém-se o composto do título.

= -15,3° (c = 1,0 em AcOH a 95 $) F : 0,88

EXEMPLO 19: 2-/TD)Phe-Cis-Phe-(D)Trp-Lis-Thr-Cis-Thr-ol7-2-deoxi-D-glucose

Dissolvem-se, em 100 ml de MeOH/HOAc 9/1, 2 g de D(-)-frutose e 1 g de H-(D)Phe-Cys-Phe- (D)Trp-Lys(Boc)-lhi?-Cys-Thr-ol (produzido como descrito no Exemplo 1 a), e mantem-se a solução a 65° durante 16 horas. Depois da concentração por evaporação, dissolve-se o produto numa pequena quantidade de metanol, e o produto em bruto precipita-se com éter diisopropílico. 0 produto em bruto assim obtido utiliza-se, sem purificação, na cisão do grupo protector (cisão BOC).

Mistura-se 1 g do produto em bruto obtido com 20 ml de ácido trifluoracético (100%) e mantém-se a mistura à temperatura ambiente até uma dissolução completa do material de partida (5 minutos). Precipita-se o composto do título por meio de adição de 200 ml de éter diisopropílico e em seguida separa-se por filtração e lava-se com éter diisopropílico. Purifica-se o composto do título por cromatografia sobre gel de sílica (eluente: CHCl^/MeOH/HOAc/E^O 7/3/0,5/0,^ e isola-se sob a forma de um liofilisado branco.

/“ex n

L = -6,7 (c = 0,3 em HCAc a 95 %) F : 0,73

Pode-se obter um segundo produto, a mistura 1 : 1 de isómeros seguintes, tendo a configuração inversa sobre o C2 do radical carbohidrato:

he-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol

/°' OH (0^ 'Phe-Cys-Phe- (D)Trp-lys-Cys-Thr-01

EXEMPLO 20: 2-ZTir³-SMS7-2-deoxi-P-glucose

Em analogia ao Exemplo 19, partindo de Tir SMS em vez do SMS, prepara-se o composto do título.

Z^_7^° ₌ _2,9° (c = 1,0 em AcOH a 95 %) F = 0,95

EXEMPLO 21: Amida do ácido glucurónico de

H-DPhe- C ys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Õjs-Thr- o 1

,o

-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cy

Tratam-se, até dissolução completa (5 minutos), 170 mg de amida do ácido glucorónico de H-DPhe-cJs-Phe-DTrp-Lys(BOC)-Thr-C^s-Thr-ol com 3 ml de ácido trifluoracético (100%). Seguidamente precipita-se o composto do título sob a forma de trifluoracetato por adição de 20 ml de éter diisopro· pílico, e, depois da filtração, o secado e a subsequente cro-

7/3/0,5/0,5), isola-se o composto do título sob a forma pura como liofilisado branco (acetato).

D = -29,2° (c = 0,48 em HOAc a 95 /) F : 0,85 produto de partida pode preparar-se tal como segue:

Adiciona-se uma solução de 135 mg de DCCI em 2 ml de DMF a uma solução, arrefecida a -30°, em DMF, de 450 mg de H-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Dys-(BOC)-Thr-Cys-Thr-ol, de 117 mg de ácido glucurónioo e de 135 mg de HOBT. Ao fim de 48 horas, com degelo simultâneo à temperatura ambiente, separa-se por filtração a diciclohexilureia resultante e precipita-se o composto do título por adição de 20 ml de éter diisopropílico. Depois de filtrar e de secar, submete-se o composto a cromatografia sobre gel de sílica (eluente: CHgOlg/MeOH 9/1), e isola-se o composto do título sob a forma pura.

/^7²° = +16,7° (c = 0,50 em DMF) D

EXEMPIO 22: Amida do ácido quinico de Ií-DPhe·

Η H

H

H C- (D) Phe-C4s-Phe- (D) Trp-Lys-The-C^s-Thr-o 1

II composto do título foi obtido de uma maneira análoga à descrita no Exemplo 2), partindo de ácido L-(-)-quínico.

/c/_7²⁰ = -50° (c = 0,44 em AcOH a 95 % ) F : 0,97

D

EXEMPLO 23:

Amida do ácido siálico de H-DPheCys-Ph.e-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr- ol

Exemplo 21, composto do título foi obtido em analogia ao partindo de ácido siálico.

ΖΎ_7²⁰ = -60,8° (c = 0,6 em AcOH a 95 %) F : 0,95 D

EXEMPLO 24: N^Q-(0-P“D-glucosil~oxiaceteil)-DPlie·Cys-fhe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol

|-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol

250 mg de (tctra-O-acetil-O- í3-D-glucosil)-oxiace[ .............. ....................... ............| ' til-BPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-(BOC)-Thr-Cys-Thr-ol dissolvem-se em 10 ml de metanol e ajustam-se a um. pH de 10 com algumas gotas de uma solução IN de NaOCH^ em metanol. Depois de deixar reagir durante 15 minutos, neutraliza-se a solução com um intercambiador de iões (por exemplo AMBER1YST 15, H^T), e separa-se o intercambiador de iões por filtração. Concentra-se o filtrado e trata-se o resíduo durante 5 minutos com 3 ml de ácido trifluoracético. Precigita-se o composto do título sob a forma de acetato de trifluor por adição de 20 ml de éter diisopropílico, e depois de filtração, de secado e de cromatografia sobre gel de sílica (eluente; CHCl^/MeOH/HOAc/ /H₂0 7/3/0,5/0,5), isola-se o composto do título sob a forma de um liofilisado branco.

= -39,2° (c = 0,60 em AcOH a 95 %) F : 0,91 produto de partida pode preparar-se tal como segue:

a) íster benzílico do ácido tetra-O-acetil-O-^-D-glucosilglicólico_______________________________________________

Adicionam-se 2,5 g de um tamiz molecular 4 S, sob a forma de pó, a uma solução de 830 mg de éster benzílico

do ácido glicólico em 50 ml de CH₂C1₂, e, depois da adição de 2,8 g de trifluormetano-sulfonato de prata, adiciona-se, gota a gota, uma solução de 4,1 g de acetobromoglucosa em 50 ml de 0ΙΙ₂01₂· Ao fim de 15 minutos, para-se a reacção com 4 ml de piridina, separam-se por filtração os constituintes sólidos, e o filtrado sacode-se com uma solução a 10 $ de NaHSO^. Depois da cromatografia sobre gel de sílica (eluente: CHgClg/MeOH 99/1), isola-se o composto do título sob a forma pura.

= -22,4° (c = 1,7 em CHClj) b o__ t e t r a₌ 0₌ ac e t i 1-0^ θ θ 2 1i c o

Dissolvem-se 800 mg de éster benzílico do ácido tetra-O-acetil-O-p-D-glucosil-glicólico em 40 ml de etanol/água 1/1 (volume/volume), e misturam-se com 400 g de paládio/carvão activado a 10 $. A hidrogenação sobre PARR-APPARATUS” a 50 PSI produz o composto do título, o qual se isola, depois de filtração e concentração sob pressão reduzida, sob forma cristalina.

Z’<Y_7^° ₌ _35_}5° (c = 1,03 em MeOH) (V

c) N -(tetra-O-acetil-O-p-D-glucosil-oxiacetil)-DPhe^ΣθζΖ^θζΡϊίίζίΣθί^ΡΡίζϊ^Ζ^^Ζ^ίζθΙ______________

A uma solução que se constitui de 81 mg de ácido tetra-0-acetil-0-|3-D-glucosil-glicólico, de 225 mg de H-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Iys (BOC)-Thr-Cys-Thr- o 1 e 45 mg de HOBT em 2 ml de DMF, arrefecida a -30°C, adicionam-se 45 mg de DCCI, dissolvido em 1 ml de DMF. Ao fim de 48 horas e depois de degelar até uma temperatura ambiente, se-

,.. 3^, :¹ para-se por filtração a ureia diciclohexílica resultante e o composto do título precipita-se a partir do filtrado por meio de adição de 20 ml de éter diisopropílico.

Os seguintes compostos foram também produzidos de uma maneira anáologa à descrita no Exemplo 24 (nestes compostos, SMS significa o radical

-PPhe- Cys- Phe-PTrp-Lys-Thr- C J-s- Thr- o 1).

EXEMPLO 25: 1^-(0-/¾-P-galactosil-oxiacetilo)-SMS

EXEMPLO 26: íK-(0-/3-celobiosil-oxiacetilo)-SMS

OCH₂C-(D)Phe-C^s-Phe-(P)Trp-

OH

Lys—Thr-Cys-Thr-o1

= -32,5° (c = 1 em AcOH a 95 %)

F : 0,91

N^“(0-P-(D)-glucosil-oxiisol)utirilo)-SlLS

^3/° ._______________________

O-C-C-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol /cf_7²⁰ = -32,9° (c = 1 em AcOH a 95 7) F : 0,93 D

EXEMPLO 28: 5^-(0)-cr-(L)-glu.cosil-C(-(L)-oxiisovalerilo)-SMS

H.C k ³ \7 ³ | -------------------------------------------------------------------------------------------------1

- (D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol

H OH /cC?²⁰ = -44,3° (c = 1 em AcOH a 95 %) F : 1,00

EXEMPLO 29: /N-acetilmuramil- (D)Phe^J'___>7-SMS

/JxJ^2Q = -15,4° (c = 0,13 em AcOH a 95 %) F : 0,9

EXEMPLO 30: p-D-glucosil-tiocarbomoilo-SMS

Tratam-se 620 mg de E-Fmoc-SMS em 50 ml de CH^CN/ /HgO 3 : 1 com 0,45 ml de trietilamina. Seguidamente adicionam-se 272 mg de 2,3,4,6-tetra-O-acetil-p -E-glucosil-isotiocianato e mantém a mistura à temperatura ambiente durante 1 hora, evapora-se a mistura sob pressão reduzida e o resíduo recolhe-se numa pequena quantidade de metanol e trata-se com éter diisopropílico, depois do que o produto precipita sob forma praticamente pura.

Com o fim de cindir o grupo Fmoc e o grupo acilo, trata-se o produto em 50 ml de metanol absoluto com uma quantidade catalítica de IN NaOCH^ em metanol. Depois de um tempo de reacção de 30 minutos, a reacção está completada (por tlc). Neutraliza-se a mistura com ácido acético a 1 % e evapora-se sob pressão reduzida. Recolhe-se o resíduo em água e extrai-se com acetato de etilo. Diofiliza-se a fase aquosa. Purifica-se o resíduo sobre gel de sílica e desmineraliza-se, por exemplo, sobre Duolite. Obtém-se o composto do título sob a forma de liofilizado.

L~o(J^2Q = -48,5° (c = 1, em AcOH a 95 /) F = 1

D material de partida£-Fmoc-SMS pode produzir-se tal como segue:

Tratam-se 5 g de acetato de SMS e 5 g de NaHCO^ eir 100 ml de DMF/H^O 3 : 1 com 1,6 g de Fmoc-HOSu. Depois de uma hora à temperatura ambiente, dilui-se a mistura com 400 ml de H₂0 e extrai-se com 250 ml de acetato de etilo/metanol 95 : 5. Seca-se a fase orgânica com Na₂S0^ e concentra-se, Denois de cromatografia de coluna sobre gel de sílica, obtém-se o material de partida sob a forma de uma substância amorfa.

/-, ₇20 = 24,3 (c = 1,13 em DMF)

Os produtos seguintes podem obter-se procedendo de uma maneira análoga à descrita no Exemplo 30.

2<_7²⁰ = -4,3° (c = 1 em AcOH) F = 0,87

D

EXEMPLO 32: β -D-glucosilcarbamoilo-SMS

Partindo de 2,3,4,6“tetra-0-acetil-j3-D--glucosil-isocianato

7²⁰ = -39,9 (c = 1 em AcOH a 95 F = 0,81 ~ D

I

EXEMPLO 33: Celobiosilcarbamoilo-SMS

Partindo de octa-acetil-celobiosil-isooianato

r^j 7²⁰ = -37,9^o (c = 1 em AcOH a 95 %) F = 0,85 P

EXEMPLO 34: 1-deoxi-L-sorbitilo-SMS

	OH	PH	(P) Phe-Cys-Phe- (P) Trp-Lys-Thr-Cys-
HOX	OH	OH	-Thr-ol

Tratam-se 0,5 mg do composto do título do Exemplo em 50 ml de metanol primeiramente com NáBH^ e em seguida com ácido acético a 5 % em condições tais que o pH não ultrapasse 7. Utilizam-se em total aproximadamente 10 equivalentes de NaBH|.

Uma vez completada a reacção (4 a 5 horas), trata-se a mistura com ácido acético a fim de destruir o excesso de NaBH^. Concentra-se a mistura sob pressão reduzida. Desmineraliza-se o resíduo, por exemplo com Duolite e purifica-se sobre gel de sílica. 0 composto principal, à parte de 1-desoxi-D-manitil-SMS, é o composto do título o qual se produz sob a forma de um liofilizado.

Ζ~°Ζ7ρ° = -47,6° (c = 1 em AcOH a 95 %) P = 0,82

EXEMPLO 35: O(-D-glucosil(l-4)-deoxisorbitilo-SMS

Procedendo de maneira análoga à descrita no Exemplo 34 partindo do composto do título que figura no Exemplo 2, produz-se o composto seguinte:

= +1.6 ( c = 1 em AcOH)

E = 0,9

EXEMPLO 36: 1,2-dideoxi-sorbitilo-SMS

Tratam-se 0,55 g de Boc-SMS em 30 ml de dioxano/

/ ΕΕ,Ο 3 : 7 com 50 mg de NaBH^CN e em seguida adicionam-se 250 mg de 2-deoxi-D-glucose. Ajusta-se o pH da mistura a 7 com 0,1 ml de HC1 e aquece-se a mistura a 100°C durante o horas. Arrefece-se a mistura, congela-se e liofiliza-se. Recolhe-se o resíduo em acetato de etilo (50 ml) e sacode-se com água. Seca-se a fase orgânica e evapora-se sob pressão reduzi da. Cinde-se o grupo Boc com TFA procedendo de maneira usual. Purifica-se o produto sobre gel de sílica e desmineraliza-se, por exemplo sobre Duolite, para obter o composto do título.

= 25,5° (c = 1 em AcOH a 95 %) F = 0,83

Procedendo de maneira análoga, podem-se preparar os compostos dos Exemplos anteriores 34 (partindo de glucose) e 35 (partindo de maltose).

EXEMPLO 37: íH-isocaproil-des(l-4)--/Ãla7,N£~(l-deoxifru11 1R ctosil)-Lis ’ calcitonina de salmão

θ^Η2 7 R-q

CH_o-C0-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu2 ₁₈

-Le u-His-Lys-Le u-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arq-Thr-AsnR.CH₃C00H

-Thr-Gly-S er-Gly-Thr-Pro-NHg

HO — Dissolvem-se 10,3 g de poliacetato de N -isocaproil-des(l-4)-/Ãla Jcalcitonina de salmão e 1,8 g de D(+)-glucose numa mistura de 94 ml de DMF e de 6 ml de ácido acético. Depois de 2 horas a 50^0, precipita-se completamente o produto adicionando-lhe éter, separa-se por filtração com sucção, lava-se com éter e seca-se sob pressão reduzida. Efectua-se a purificação dissolvendo aproximadamente 5 - 10 g do produto em água, adicionando a solução a uma coluna de fase revertida 4 x 25 cm, C-18 sobre gel de sílica e cromatografando-o com um gradiente de água e um 0-S0 % de uma mistura de disI solvente que consta de 38 partes de água, de 60 partes de acetonitrilo e de 2 partes de ácido fosfórico a 85 %. Combinam-se as fracções contendo o produto puro, filtrando-se sobre uma coluna de aproximadamente 100 ml de um intercambiador de iões ligeiramente básico sob a forma de acetato e leva-se com água. Liofiliza-se o filtrado, obtendo-se o composto do título sob a forma do poliacetato, polihidrato. FAB espectroscopia de massa 3407 (MH⁺) = “34,8° (c = 0,73 em CH₃COOH a 95 %) F : 0,93 if*- isocaproil-Ser-Thr-Ala-Val-Ieu-Gly-Iys-leu-Ser-Gln-Glu

De u-His-Lys-De u-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly| Thr-Pro-NH₂ utilizado como produto de partida pode preparar-se tal como segue:

a) N^-isocaproil-Ser-(Bu^)-Thr-{Bu^)-Ala-Val-leu-OCH₃-fenil- (p) OCHy-CO- (poliestireno-l%-divinilbenzeno)

Deixa-se inchar 1 g de p-hidroximetil-fenoximetilco(poliestireno-l%-divinilbenzeno) em dimetilformamida/cloreto de metileno 1:4 (volume/volume), em seguida separa-se por filtração com sucção e mistura-se com uma solução de 0,74 g

de Fmoc-Leucina e 0,19 g de 1-hidroxibenzotriasol em 5 ml da mistura de dissolvente acima mencionada. Adicionam-se seguidamente, agitando, 0,43 g de diciclohexilcarbodiimida e 85 mg de 4-dimetilaminopiridina, cada um em 5 ml da mesma mistura de dissolventes. Agita-se a mistura durante 16 horas a 20°, separa-se por filtração com sucção e lava-se com a mistura de dissolventes, e em seguida com dimetilformamida.

Obtém-se assim o Fmoc-Ieu-OCHg-fenil-CpJ-OCHg-co(poliestireno-l%-divinilbenzeno).

A partir do Fmoc-LeuT0CH₂-fenil-(p)0CH₂-co(poliIestireno-l/-divinilbenzeno) (1,56 g correspondem a 0,7 mMole) cinde-se o grupo lÔ-Fmoc por meio de tratamento com piperidina (20 % volume/volume) em dimetilformamida durante 10 minutos. Lava-se o produto perfeitamente com DMF, e em seguida adicionam-se 0,71 g de Fmoc-Val-OH, 0,28 g de 1-hidroxibenzotriazol e 0,32 ml de diisopropilcarbodiimida, cada um dissolvido em 5 ml de dimetilformamida. Ao fim de 45 minutos, filtra-se a mistura com sucção, e a resina peptídica lava-se per feitamente com dimetilformamida. Repete-se tanto a cisão do grupo íf* -Fmoc como a copulação com o aminoácido seguindo a sequência na ordem indicada:

Fmoc-Ala-OH (0,65 g) Fmoc-Thr(Bu^)-OH (0,83 g) e FmocSer(Bu^)-OH (0,80 g). No ciclo de reacção ultimamente indicado (cisão do grupo protector Fmoc, acilação com o aminoácido protegido), substituí-se o derivado de aminoácido por ácido isocapróico (0,41 g), aumenta-se a quantidade do 1-hidroxibenzotriazol até 0,53 g e a quantidade da diisopropilcarbodiimida até 0,54 g, e efectua-se a copulação durante 15 horas Lava-se perfeitamente a resina peptídica protegida com dimetilformamida e cloreto de metileno, seca-se sob pressão reduzida a uma temperatura de 40⁵C durante 15 horas. Obtém-se a resina peptídica protegida sob a forma de um pó incolor.

b) - is o capr o il-Ser-Thr^ Ala^ Val-Le u-OH *tí *t

Agita-se IP -isocaproil-Ser(Bu )-Thr(Bu )-Ala-Val-Leu-OCH₂-fenil-(p)OCH₂-co(poliestireno-1%-divinilbenzeno) (1,0 g) numa mistura de ácido trifluoracético (5 ml) e cloreto de metileno (5 ml). Filtra-se o produto, lava-se com a mesma mistura (5 ml), e em seguida com cloreto de metileno, concentra-se perfeitamente sob pressão reduzida e precipita-se totalmente pela adição de éter. Lava-se perfeitamente o depósito com éter, seca-se sob pressão reduzida sobre hidróxido de potássio sólido, com o qual se obtém o composto do título sob a forma de um pó amorfo, incolor.

QJ

c) N -isocaproil-Ser-Thr-Ala-7al-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-SerG ln-GluÇOBu^) -Le u-His-Lys (Boc)-Le u-Gln-Thr-Tyr-Pro- ArgThr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂ o/

A uma solução de N -isocaproil-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-OH (0,165 g) em dimetilformamida (7 ml) adiciona-se cloridrato de H-Gli-Lis(Boc)-Leu-Ser-Gln-Glu(CBu'*^:)-Leu-Lis-Lis(Boc)-Leu-Gln-Thr-Tir-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gli-Ser-Gli-Thr-Pro-NH₂ (0,59 g),'3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-l,2,3-benzotriazina (0,017 g), diciclohexilcarbodiimida (0,065 g) e a quantidade suficiente de N-etil-N,iT-diisopropilamina para uma amostra da mistura da reacção sobre papel pH humedecido para indicar uma reacção de aproximadamente 6 pH. Ao fim de 16 horas, precipita-se a mistura por adição de éter, obtendo-se, depois de secado, o composto do título.

d) - i s o o apr o il-Ser-Thr-Ala-Val- Le u- Gly- Lys-L e u- S er- Gln-

Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂

Dissolvem-se 0,50 g do péptido parcialmente protegido da Etapa c) numa mistura de ácido trifluoracético (50 % volume/volume) e de cloreto de metileno. Depois de 1 hora, adicionam-se 50 ml de éter contendo 0,6 mMole de HC1. Filtra-se a mistura, lava-se com éter e seca-se sob pressão reduzida. Purifica-se o produto por meio de cromatografia de Fase inversa num gradiente de acetonitrilo em H^PO^ (2 %). As fracções contendo a substância pura combinam-se e filtram-se sobre um intercambiador de iões básico sob a forma de ace tato. Depois de liofilizado do filtrado, obtém-se o composto do título sob a forma de poliacetato, polihidrato.

Z» 7²⁰

D = -32,2° (c = 0,3 em AcOH a 95 %)

F = 0,87

EXEMPLO 38: N⁰'-isocaproil-des-(L-4)-/Ãla⁷,N^E-(^í-D-glucosil

18 (l-4)-deoxifructosil)-Lis ’ J calcitoniha de salmão

K 7 711

CH_O- C 0- S er- Thr- A la-V al- Le u-Gly- Lys-Le u- S er- Gln-Gl u^ά 18

Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arq-Thr-Asn-Gly-SerGly-Thr-Pro-NH₂ . CH^OOH

Procedendo de uma maneira análoga à descrita no Exemplo 37, utilizando monohidrato de D(+)-maltcse em vez de D(+)-glucose, obtém-se o derivado de di-N- Ε,-maltulosilo correspondente.

A reacção efectua-se a 50sC durante 15 horas.

isolamento e a purificação são iguais às ali indicadas.

Obtém-se o composto do título sob a forma de poli acetato, polihidrato,

FAB espectroscopia de massa: 3730.9 )MH⁺) /λ 7^0 _A

- _D = -15,2° (c = 0,16 em AcOH a 95 %) F = 0,97

Procedendo de maneira análoga à descrita no Exemplo 37, preparam-se os compostos seguintes:

Exemplo 39: (5-32)amida de N*³¹ -isocaproil-/N£-(l-deoxifructosil)-Lis'7-calcitonina de salmão

His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arq-Thr-Asn-Thr-Gly-SerGliThr-Pro-HH₂ . 3 CH₃C00H

ZÒ(Z²⁰ = “40,0° (c = 0,27 em AcOH a 95 %) F = 0,84 D

EXEMPLO 40: Eys¹¹-!^ ,Lys¹⁸xâ^-trM 1-deoxifructosil)calcitonina de salmão

!--------------------------------1 10 ?11

R-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-leu-Gly-Lys-Lea-Ser-Glii-Leii··· ?18

His-Lis-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₀ £ !

I

Zoé7p° = “5,3° (c = 0,38 em AcOH a 95 7) F = 0,75

EXEMPLO 41: (5-32)amida de -isocaproil-des(t4)-/Í>(1-deoxifructosil)-Lis'’ ’ _7 calcitonina de salmão ^R11

ZgL7^2O= -37,4° (c = 0,155 em AcOH a 95%) F = 0,84

D

EXEMPIO 42:

o — 7 (5-32)-amida de 2. -quinoil-/Ala27calcitonina de salmão

110

HO

-Le u-His-Le u-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-f hr-Asn-Th.r~Gly-Ser-Gly-Thr-P$5-NH₂ . 3 CH₃C00H composto do título foi preparado em analogia ao Exemplo 21.

= “35,7° (c = 0,37 em AcOH a 95 $) F : 0,88 > S5

EXEMPLO 43: (4-32)-amida de N⁰¹ -Guinoil-/Ãla27^caltitonina de salmão

HO

CO-Leu-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln·

Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-T^-Tyr-Pro-Ark-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂ . 3 CI^COOH

O composto do título foi preparado de maneira análoga à descrita no Exemplo 21.

7²⁰ ₌ -39,3 (c = 0,29 em AcOH a 95 /) F : 0,89

Os péptidos de partida /5-327-amida de /Ala_7-calcitonina de salmão e /4-327-amida de ,/ÃlaJy-calcitonina de salmão desejados para os Exemplos 42 e 43 podem preparar-se de maneira análoga à descrita para o material de partida do Exemplo 37.

EXEMPLO 44: /N-deoxi-fructosil-Cis¹7^,“O^xiíozina

Dissolvem-se 0,5 g de D(+)-glucose e 0,5 g de oxi· tozina em 50 ml de MeOH/HOAc 9/1 e mantém-se a solução a 65°C

durante 3 horas. Seguidamente concentra-se a solução por evaporação, cromatografa-se sohre gel de sílica e liberta-se de sal utilizando Duolite (HgO/etanol/gradiente de HOAC).

Obtém-se um liofilizado branco = -23° (c = 0,32 em HOAc a 95 %)

EXEMPLO 45: Ac-(P)-Phe(4-Cl)-(P)Phe(4-Cl)-(P)Trp-Ser-Tyr(P)Lys

mg de Ac-(P)Phe-(4-Cl)-(P)Phe-(4-Cl)-(P)Trp-Ser-Tyr-(P)Lys-Leu-Arg-Pro-(P)Ala-NII₂ e 72 mg de D(+)-glucose dissolvem-se numa mistura de 10 ml de MeOH e de 1 ml de AcOH e agita-se a mistura a 60⁹ durante 20 horas aproximadamente. Precipite u-se o produto com éter e submete-se a centrifugação. Dissolve-se o resíduo em aproximadamente 100 ml de H₂C e ajusta-se o pH a 8 com NaCH diluído. Adsorve-se o produto sobre uma coluna de Duolite PS 861 e elui-se com um gradiente de Ií₉0—> dioxano-H₂0-Ac0H (60:40:3). Concentra-se as fracções contendo o produto desejado sob pressão reduzida e em seguida liofiliza-se. Obtém-se o composto do título.

Zc/_7p° = -25° (c = 0,5 em AcOH a 95 %) F : 0,83

EXEMPLO 46: Π** ^A1,lf^^B1,N^^B^⁹-tris(l-deoxifractosil) insulina de porco

A.gita-se, durante 1 hora, a 60^0, uma suspensão de 1 g (0,17 mmole) e 0,47 g (2,6 mmole) de glucose em 10 ml de dimetilformamida/ácido acético 9 : 1. Elimina-se o dissolvente em alto vácuo a 30^sC. Dissolve-se o resíduo em 300 ml de H₂0, ajusta-se a um pH de 7, e passa-se a mistura através de uma pequena coluna desmineralizadora (Duolite ES 861 2,5 x 15 cm). Elui-se a glucose com água; o péptido elui-se com isopropanol/água/acetato de etilo 59:39:2.

Depois de eliminação do dissolvente, liofiliza-se a mistura. Recolhe-se o resíduo em 300 ml de água e purifica-se por meio de cromatografia com inversão de fase.

(coluna 2 x 25 cm, RP 18, 10 nm, tampão 57 mmole NaClO^, 20 mmole de trietilamina, 8,4 mmole de ácido fosfórico, pH 3 com NaOH 4N, gradiente 0-65 $ A-B.

Tampão A Tampão pH 3/acetonitrilo 9 : 1

Tampão B Tampão pH 3/acetonitrilo 4 : 6

Recolhem-se as fracções que contêm o composto do título, combinam-se, concentram-se, em seguida diluem-se com 300 ml de água e passam-se por uma coluna desmineralizadora como descrito anteriormente. Eluem-se os sais com água. Elui-se o péptido com isopropanol/água/acetato de etilo 59:39:2.

As fracções apropriadas combinam-se e concentram-se, com o que se obtém o composto do título.

ΖΎ-7ρ° = 56,3° (c = 0,5 AcOH)

P = 0,88

EXEMPLO

47: N* ,Lis¹²-NC. ,Lisⁱ'^-N^-tris-(l~deoxifructosil).

' (D/Ala7-hpGRF- (1-29) -1¾

2 0912

R-Ty]>P-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu29

Gly-C-ln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-nh₂ . ch₃cooh

Procedendo de maneira análoga à descrita no Exemplo 37 e partindo de (T;Ala²/hpCRF obtém o composto do título.

Ζ7χ_7|° = -5,6° (c = 0,2 em AoOH a 95 %) F = 0,82

EXEMPLO 48: -bis(l-deoxi.fructosil)Lis-vasopresina

36O mg (2 mmole) de glucose em 5 ml de metanol/acetato de eti lo 9 : 1. Elimina-se 0 dissolvente sob pressão reduzida. 0 resíduo recolhe-se em 30 ml de água e a solução liofiliza-se. Elimina-se em seguida 0 excesso de glucose e 0 péptido (solução em 40 ml de água a um pH de 7,3) adsorve-se sobre uma coluna de Duolite (1,5 x 10 cm). Elui-se a glucose com água e 0 precipitado elui-se com uma mistura de isopropilo/água/acetato de etilo 59:39:2. A purificação da mistura leva-se a efe to sobre uma coluna de gel de sílica (eluente: clorofórmio/ /metanol/acetato de etil/água 7:4:1:1).

Concentram-se as fracções contendo 0 composto do título e liofilizam-se para dar 0 composto do título.

/c/ 7²⁰ = -52° (c = 0,5 em HOAC a 95 0) F = 0,84

OH H |

Ac-(D)Phe(pCl)-(D)Phe(pCl)-(D)Trp-Ser-Lys(N^)-(D)Phe-Leu-Arg

-Pro-(D)Ala-NH₂, Acetato

Prepara-se 0 composto do título de uma maneira análoga à descrita no Exemplo 45 partindo de acetato de Ac-(D)-Phe(pCl)-(D)Phe(pCl)-(D)-Trp-Ser-Lis-(D)Phe-leu-Arg-Pro(D)Ala-NH₂, e de (D(+)glucose.

Z>_7p° = -36° (c = 0,5 em 95 / AcOH) F =

0,86

EXEMPLO 50:

OH H (D)Phe-(pCl)-(D)Phe(pCl)-(D)Trp-Ser-Tyr-(D)Phe-Leu-Arg-Pro- (D)Ala-NH₂, Acetato

Prepara-se o composto do título de maneira análoga à descrita no Exemplo 45 partindo de acetato de

Η-(D)Phe(pGl)-(D)Phe(pGl)-(B)-Trp-Ser-Tir-(D)Phe-Leu-Arg-Pro-(D)Ala-NH^ e de D(+)-glucose.

Z^_7p° = -32° (c = 0,5 em 95 < AcOH) F = 0,94

EXEMPLO 51:

,β- (D) Phe (pCl)- (D) Phe(pCl)-(D) Trp-Ser-Tyr- (D)Lys-Leu-Arg-Pro-(L)Ala-NH₂

Agitam-se durante 3 horas, a 60²C, 200 mg de H-(D)Phe(pCl) —(D)Phe(pCl)-(B)Trp-Ser-Tir-(D)Lis-Leu-Arg-Pro-(D)Ala-NH₂ e 520 mg de D(+)-glucose em BMF/AcOH 15 : 1. Concentra-se a mistura sob pressão reduzida, precipita-se com éter, filtra-se e seca-se.

resíduo purifica-se tal como segue:

1) por adsorçao sobre Duolite ES 861, elução com uma mistura de dioxano - HgO-AcOH.

2) por cromatografia de coluna sobre gel de sílica utilizando como eluente CHC^/AcOH/l^O.

3) cromatografia preparatória HPLC com inversão de fase, cro-· matografá-se sobre uma coluna de octadezilo. Como eluente utiliza-se um gradiente de acetonitrilo em H^PO^ a 2%.

Combinam-se as fracções que contêm o composto principal, filtra-se através de uma coluna 4ue contém um inI tercambiador de iões debilmente básico sob a forma de aceta| to, em seguida concentra-se e liofiliza-se para obter o composto do título.

-22,6e (_c = 0,5 em AcOH a 95%) P = 0,63.

A síntese de acordo com a invenção pode-se levar a efeito tal como segue:

EXEMPLO SI

Produção do octreotide (=SMS)

1) Produção da ligação acetal (N-CF^CO-Treoninol-acetal do ácido p-formilfenoxi-acético).

Adicionam-se 105 g (1,0 mmole) de L-Treoninol a

200 ml de metanol, efectuando-se a adição sob um Jacto de azoto, com agitação, com o qual se obtém uma solução límpida. Adiciona-se em seguida uma solução de 200 ml de éster metílico do ácido trifluracético em 250 ml de metanol a O⁹. Mantém-se a mistura à temperatura de uns 10⁹C por meio de arrefecimento com um banho de gelo.

Ao fim de 1 hora e meia, não pode já detectar-se nenhum Treoninol livre na mistura. A concentração a 40⁹C pro porciona um resíduo cristalino, branco.

— Dissolve-se o resíduo a 7020 em 200 ml de acetato de etilo e em seguida precipita-se por adição de 100 ml de hexano. Arrefece-se a mistura a 09C, filtra-se o produto, lava-se com hexano e seca-se à temperatura ambiente, com o qual se obtém o N-trifluoracetil-treoninol.

Dissolvem-se 50,3 g (0,25 mole) do produto acima obtido em 1,25 litros de tetrahidrofurano e adicionam-se, gota a gota, 75 ml de trimetil-clorosilano. Terminada a adição, adiciona-se imediatamente uma mistura de 70 ml de trietilamina e de 250 ml de tetrahidrofurano. Obtém-se uma suspensão i

¹ I branca a qual se agita durante 4 horas. Filtra-se a mistura e evapora-se o filtrado a 40⁹C, com o que se obtém um óleo.

Dissolve-se tal óleo em 1,5 litros de cloreto de metileno e trata-se, em porções, com 90,4 g de ácido p-formil-fenoxiacético, à temperatura ambiente. Seguidamente adicionam-se em porções 9 ml de éster trimetilsilílico do ácido trifluormetano-sulfónico. Agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 24 horas, em seguida filtra-se e o resíduo lava-se perfeitamente com cloreto de metileno.

Concentra-se o filtrado a 4020, coe o que se obtém um produto resinoso de cor vermelha alaranjada. Cromatografa-se o produto sobre gel de sílica, efectuando-se a elução cor: I acetato de etilo. Concentram-se as fracções principais depois do que se obtém o produto do título com um grau de pureza de 97 % (Cromatografia HPL).

i

2) Formação do octa-péptido protegido

Suspendem-se 17,2 g de poliestireno aminometilado (Marca Dow, 0,7 % em peso de N correspondendo a 0,5 mmole de grupos amino-metilo / g de resina) em 80 ml de cloreto de metileno/dimetilformamida 4 : 1. A seguir adicionam-se sucessivamente 4,17 g do produto final da Etapa 1, 1,6 g de ΙΐΟΒΤ ^— e 4,0 g de DCCI. Depois de se ter agitado a mistura durante

ί horas à temperatura ambiente, o teste de Eaiser resulta negativo. Filtra-se a mistura e lava-se.

Suspende-se a resina lavada em 100 ml de tetrahidrofurano e metanol 3 : 1 e trata-se, em porções, com 10,4 g de borohidrato de sódio. Agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 6 horas, filtra-se e lava-se a resina. Suspende-se a resina em cloreto de metileno/dimetilformamida 4 : 1. Adicionam-se 5,57 g de Fmoc-Cis (S-t-Bu)OH, 1,74 g de EOBT e 3,6 g de DCCI.

i Cinde-se o grupo protector Fmoc com piperidina (2 x 20 minutos tempo de contacto).

Procedendo de maneira análoga, copulam-se em ciclos sucessivos os seguintes aminoácidos N-Fmoc protegidos utilizando IIOBT/DCCI-TrOH; Lis (BOC)-OH; D-TrpOH, Phe-OIÍ, Cis(S-t-Bu)OH e D-Phe-OH, para obter a resina octapeptídica protegida por Fmoc.

Carga final: 0,26 mmole/g.

3) Oxidação e cisão

Suspende—se a resina resultante em 100 ml de trifluoretanol/cloreto de metileno 1 : 1 e trata-se com 50 ml de tributilfosfina. Agita-se a mistura durante 70 horas à temperatura ambiente. Filtra-se a mistura, lava-se e trata-se com 100 ml de uma mistura 1 : 1 de tetrahidrofurano e de uma solução 1N de acetato de amónio. Seguidamente adicionam-se 1,1 ml de peróxido de hidrogénio aquoso a 30 %. Agita-se a mistura durante 24 horas à temperatura ambiente. Lava-se a resina. Tra ta-se a mistura com 20 ml de ácido trifluoracético, com 80 ml de cloreto de metileno, com 10 ml de água e com 2 ml de tioanisol. Agita-se a mistura durante 2 horas, em seguida filtra-se e lava-se com ácido trifluoracético e com cloreto de metileno. Ao filtrado adicionam-se 200 ml de éter dietílico. 0 pre ΐ * r r ι í A '» ^f , 'r f / t < ,X .....

v r *' β

cipitado resultante separa-se por filtração. Dissolve-se o resíduo em tampão aquoso e desmineraliza-se, por exemplo utilizando Duolite. A solução, sob a forma do acetato, seca-se por congelação, obtendo-se o composto do título sob a forma de acetato.

Procedendo de uma maneira análoga, podem-se preparar todos os Exemplos acima indicados, por exemplo os compostos dos Exemplos 1 e 2.

EXEMPLO S2: Produção de N^c,í-/’^-glucosíl(lr4)-deoxifructosil)

-SMS (veja-se Exemplo 2)

De acordo com o Exemplo S2 acima indicado, preparam-se 393 g do octapéptido ligado à resina. Os grupos protectores da cisteina eliminam-se por redução. 0 péptido ligado à resina oxida-se em octapéptido cíclico por água oxigenada numa mistura de tetrahidrofurano/água.

Depois de ter lavado a resina peptídica em tetrahidrofurano e em seguida em dimetilformamida, sacode-se em 3600 ml de uma mistura de DMF/ACOH. (8:1). Trata-se a suspensão com 526 g de D(+)-maltose monohidrato. Aquece-se a mistura a 60^Q e agita-se durante 18 horas a 60^.

Arrefece-se a mistura e a resina peptídica separa-se por filtração, e em seguida lava-se sucessivamente com DMF e com metanol. Seguidamente lava-se com cloreto de metileno. A seguir cinde-se o péptido a partir da resina durante uma hora com uma mistura que consta de 2900 ml de cloreto de metileno e de 716 ml de ácido trifluoracético com um vestígio de água.

f , j. /W

Agita-se em seguida o filtrado e trata-se, em porções, com 597 g de carbonato de sódio, agita-se durante 30 minutos e filtra-se. Lava-se o resíduo com cloreto de metileno e com metanol.

Concentra-se o filtrado até à secura.

Desmineraliza-se utilizando uma coluna de poliestireno por funcionar semelhante à de Duolite, ou então um material HPLC de fase revertida, tal como gel de sílica tratado com silicio e que contém cadeias largas de grupo de álcoois gordos (por exemplo Labomatic, Suiza, Marca HB-SIL-18-20-100) Obtém-se o composto do título puro.

Os compostos da invenção apresentam interessantes propriedades farmacológicas, por conseguinte, podem utilizar-se na terapêutica como medicamentos.

A actividade dos compostos da invenção pode demonstrar-se nos ensaios biofarmacêuticos e farmacêuticos clás sicos. Os compostos são em geral pelo menos tão potentes como o péptido por modificar (quer dizer o péptido correspondente não glucosilado) depois da administração por injecção ou por via oral. Em geral, os compostos são melhor absorvidos, apresentam uma superior solubilidade em água e uma duração de acção mais ampla.

Os compostos da invenção- estão indicados, portanto, para serem utilizados para as mesmas indicações que as dos pêptidos não modificados.

Os compostos da invenção podem detectar-se por exemplo no plasma sanguíneo durante um período de tempo mais amplo depois da administração que os pêptidos não modificados, como o demonstram os ensaios de biodisponibilida.de clássicos.

Os compostos da invenção e o péptido não modificado podem administrar-se por via oral ou intravenosa por exen.

— pio a cães, numa só dose suficiente para obter o efeito terapêutico desejado.

As doses utilizadas são as que permitem detectar o péptido ou um dos seus metabolitos no sangue, k detecção pode efectuar-se de acordo com métodos habituais, por exemplo de acordo com o método de dosagem radioimunológica (RIA).

No ensaio mencionado anteriormente, verificou-se por exemplo que o composto do Exemplo 2, administrado por via oral, produz concentrações no sangue dez vezes superiores àque las obtidas com o octreotide.

A biodisponibilidade absoluta do composto do Exemplo 2 administrada por via oral ou intravenosa, determinada pelo AUC (área por debaixo da curva) é 5 vezes superior àque la da octreotide.

Além disso, os compostos da invenção apresentam a vantagem de ser eliminados em grande parte pelos lins. Isto pode mostrar-se pelos ensaios clássicos.

Mantêm-se em jejum ratazanas machos (com um peso de 225-375 g) e adm.inistra-se-lhes água por via oral (50 ml/ /kg). Anestesiam-se os animais ao fim de 30 minutos, com por exemplo, inactina (100 mg/kg) por via intraperitoneal). Colo) cam-se-lhes uma cânula no canal biliar e da visicula. Deixam-se a descoberto as duas veias jugulares. Numa delas, pratica-se uma perfusão a 5 % de glucose e de 1 / de etanol (5 ml/ /hora) a fim de estimular a diurese. A partir da outra veia efectua-se a tomada de sangue (C,5 ml em cada hora durante 4 horas.

Administra-se o composto da invenção e o péptido não modificado por via subcutânea numa dose compreendida entre aproximadamente 10 e aproximadamente 1000 microgramas/kg. Determina-se a concentração em composto de acordo com métodos habituais, por exemplo por RIA.

, / £· > naz < .i>

1’

No ensaio acima descrito, por exemplo, obtiveram-se os resultados com o composto do Exemplo 2 e a octreotide a 10 microgramas/kg:

Percentagem eliminada por via

	Biliar	Urinária
Composto do Exemplo 2	1,6	36
Octreotide	22	19

Enquanto a octreotide vem a ser eliminada pela via biliar e urninária, o composto do Exemplo 2 é essencialmente eliminado pela via urinária.

Pode-se mostrar uma absorção melhorada dos compostos da invenção por administração por via oral, da seguinte maneira:

Administra-se por via oral o composto da invenção e o péptido por modificar em ratazanas OEA (por exemplo 10 mg/kg). A diversos intervalos de tempo precisos, por exemplo 15, 30 e 60 minutos, tomam-se provas de sangue e analiza-se o seu conteúdo de substância activa, por exemplo por RIA.

Neste ensaio, verificou-se por exemplo que o composto do Exemplo 44, administrado numa dose de 10 mg/kg, apresenta uma absorção de 50 a 100 % superior àquela do péptido por modificar, a oxitocina. Os resultados são os seguintes:

Tabela: níveis de plasma na ratazana, depois da administração por via oral. Os resultados são dados em ng/ml

Oxitozina

Composto do Exemplo 44

15 minutos	30 minutos	60 minu-
		tos
7,53	3,60	2,55
11,79	6,98	3,98

As actividades farmacológicas dos compostos da invenção podem evidenciar-se nos ensaios farmacológicos usuais por exemplo depois de injecçao, e, se necessário, comparar-se com aquelas dos péptidos por modificar, por exemplo em termos de potência e de duração da acção.

Por exemplo, podem-se efectuar ensaios farmacológicos para verificar nos animais os efeitos dos compostos da invenção sobre as hormonas. Assim, os compostos que inibem a secreção das hormonas podem submeter-se a ensaios que permitam determinar a diminuição dos níveis sanguíneos da hormona.

Os compostos da invenção que inibem a secreção da hormona de crescimento (GH) em particular os compostos de fórmula VIII, e mais particularmente os compostos de fórmula VlIIa a f, e que reduzem as concentrações da hormona de crescimento (GH) no sangue, podem ser submetidos aos ensaios seguintes:

Simios rhesus (pelo menos 5 macacos) tidos em cadeiras recebem o composto da invenção em jejum man num pedaço de banana que serve de veículo. Administram-se os compostos numa dose compreendida entre aproximadamente 0,1 mg/kg e apro ximadamente 10 mg/kg por via oral. Tomam-se provas de sangue da Veia Saphena por um catéter. Mede-se por meio de RIA a con centração da hormona de crescimento no sangue.

Neste ensaio efectuado com simios rhesus, verificou-se que o composto do Exemplo 2, administrado numa dose de

0,1 mg/kg, provoca uma diminuição de 50 % aproximadamente da secreção da hormona de crescimento durante mais de 10 horas, enquanto que este efeito dura somente 5 horas com o péptido por modificar, a octreotide.

Noutro ensaio, decapitam-se ratazanas, machos, e tira-se-lhes sangue 1 hora depois da administração de maneira logarítmica do composto inibindo a secreção da hormona de crescimento. Determinara-se os níveis da hormona de crescimento no sangue por RIA. Neste ensaio, os compostos da invenção são activos em doses compreendidas entre aproximadamente 0,02 e aproximadamente 30 microgramas/kg por via subcutânea. Verificou-se, por exemplo, que os compostos dos Exemplos 1, 2, 21 e 24, administrados por via subcutânea, têm respectivamente uma DI₅₀ de 0,045, 0,190, 0,3 e 0,2 microgramas/kg, sendo a EI^q da somatostatina natural administrada por via subcutânea no mesmo ensaio de 93 microgramas/kg (a ΒΙ^θ indica a quan tidade de composto requerida para baixar de 50 / o conteúdo da hormona de crescimento em comparação com a dos animais de controle por tratar).

Contrariamente à somatostatina natural, os compostos inibidores da secreção da hormona de crescimento da invenção são altamente activos nestes ensaios durante um longo período de tempo (por exemplo o horas).

A actividade inibidora destes compostos foi demonstrada igualmente depois da administração por via oral a ratazanas, machos, tendo implantos de oestradiol. Neste ensaio, observam-se variações relativamente mínimas dos níveis da hormona de crescimento. 0 ensaio foi efectuado da seguinte maneira:

Em ratazanas, machos, com um peso de aproximadamente 300 g, implanta-se-lhes por debaixo da pele dorsal um tubo (longitude = 50 mm, diâmetro = 3 mm) de silastic com 50 mg de oestradiol, sob anestesia com éter. Re-utilizam-se estes

100

animais várias vezes (1 a 6 vezes mais tarde) nos ensaios. A administração da substância a ensaiar efectua-se por via subcutânea ou por via oral.

Directamente antes, assim como a diversos intervalos de tempo depois da administração da substância, toma-se aproximadamente 0,8 ml.de sangue do plexus retro-orbital, cen trifuga-se e determina-se o nível da hormona de crescimento no soro por RIA.

Os compostos da invenção são mais activos depois de administração por via oral que os péptidos correspondentes não modificados, ainda depois de várias horas. A ΡΙ^θ de cada composto dos Exemplos 1 e 2, ao fim de 2 horas, aproximadamente 17 a 40 vezes mais débil que aquela do péptido por modificar, a octreotide. Outros resultados são os seguintes:

Composto do Exemplo ΕΙ^θ F^{or via oral} micrograma/kg

21500

2425

Octreotide1400

Os compostos da invenção estão indicados, portanto, para serem utilizados no tratamento em casos em quese exija uma inibição da secreção da hormona de crescimento. As indicações compreendem o diabetes mellitus, a prevenção e o tratamento da angiopatia e da ratinopatia proliferativa, assim como da acromegalia.

A acção inibidora dos compostos da invenção sobre a secreção da hormona de crescimento, inibe igualmente a secreção pancreática. Esta inibição pode evidenciar-se nos ensaios efectuados com animais. 0 método descrito em Scand. J. Gastroint. 6, 423 (1975) por S. -J. Konturek y col. pode utilizar-se.

101

Os compostos da invenção que inibem a secreção da hormona de crescimento inibem igualmente a secreção gástrica e aumentam o pH do suco gástrico de várias unidades.

Esta actividade dos compostos da invenção pode demonstrar-se, por exemplo, no ensaio seguinte:

Administram-se os compostos da invenção que inibem a secreção da hormona de crescimento, numa dose compreendida entre aproximadamente 0,05 mg/kg e aproximadamente 5 mg/ /kg, em ratazanas em jejum às quais se lhes havia praticado uma fístula no estômago. Ao fim de uma hora, abre-se a fístula e tiram-se provas de suco gástrico cada 30 minutos. Registam-se os volumes recolhidos e determina-se a concentração de ácido.

Neste ensaio, o composto do Exemplo 2 provoca um aumento de pH de 6 a 8 durante 3 horas e meia. A octreotide provocou um aumento dos valores do pH de 6 a 7 durante só 2 horas. Neste ensaio mostra que o composto do Exemplo 2 é pela menos 60 vezes mais activo que a cimetidina.

Os compostos da invenção que inibem a secreção da hormona de crescimento, em particular os compostos de fórmula VIII, podem utilizar-se, por conseguinte, em terapêutica no tratamento de transtornas gastro-intestinais, por exemplo nas úlceras gástricas, nas hemorragias gastro-intestinais, na pancreatite aguda e nos tumores gastro-entero-pancreáticos (por exemplo as vipomas, insulinomas, glucagonomas, etc).

Os compostos da invenção que inibem a secreção da hormona de crescimento inibem igualmente a profileração e/ou a queratinização das células epidérmicas, e estão, portanto, indicados no tratamento de enfermidades dermatológicas associadas com uma proliferação patológica e/ou com uma queratinização das células epidérmicas, especialmente no tratamento da psoriase.

— Além disso, estes compostos podem utilizar-se igualmente em terapêutica no tratamento da demência senil degenerativa, igualmente da demência senil do tipc Alzheimer (DSTA), ou no tratamento de algias vasculares da cara (cefalias repetitivas).

Para todas estas indicações, os compostos da invenção que inibem a secreção da hormona do crescimento admi.nistram-se vantajosamente em dose compreendidas entre 2 microgramas e 20 miligramas. Se necessário, os compostos podem administrar-se em doses fraccionadas. 2 a 4 vezes ao dia, sob a forma de dose unitária, ou então sob a forma de libertação retardada. As doses unitárias podem compreender entre 0,5 micrograma e 10 mg de substância activa.

Os derivados glucosilados da calcitonina e dos seus derivados e análogos de acordo com a invenção, mais particularmente os derivados de fórmula Z, reduzem os níveis dc cálcio no plasma sanguíneo. Além disso, agem como antagonistas funcionais da para hormona para dar um balanço de cálcio positivo a favor dos ossos. A actividade hipocalcémica dos novos compostos pode determinar-se de acordo com os métodos habituais, por exemplo pelo método de M. Azria y col., exposto em 2-4 Outubro de 1984 or ocasião do Simpósio sobre a cal·t citonina que teve lugar em Milão e publicado sob a forma de comunicação breve em Ourrente Clinicai Pratice Series 42, Excerpta Medica 198o, página 104. leste método, utiliza-se um eléctrodo selectivo para o ião de cálcio, a fim de determinar a seguir o conteúdo de iões de cálcio no sangue de jovens coelhos e cães. Administram-se os compostos por via intra-venosa numa dosagem compreendida entre aproximadamente 0,1 e aproximadamente 10 microgramas/kg, por exemplo correspondendo a aproximadamente 1 unidade internacional por Kg. Zfectua-se as medições durante 5 horas e calculam-se os AUC área por baixo da curva.

Os compostos podem ensaiar-se também noutros ensaios por exemplo o ensaio descrito por E. Eumar y col., em J. Endocrinology (1965), 33, página 469, e praticados em ratazanas às quais se administram doses diferentes provocando uma hipocalcémica, seja de 300 a 6000 UI. por mg para os compostos da invenção exercendo uma actividade hipocalcémica.

Verificou-se, por exemplo, que os compostos dos Exemplos 37 e 38 administrados por via intravenosa em cães (5^Jg/kg), têm uma duração de acção muito mais ampla que o péptido por modificar. Neste ensaio, observa-se depois de 3 horas uma baixa do nível de cálcio no sangue compreendido entre 15 e 18 % para os compostos 37 e 38, depois de 6 horas, não pode detectar-se já nenhuma baixa de cálcio no sangue para o péptido não modificado, enquanto que com os compostos dos Exemplos 37 e 38, a redução do nível de cálcio continuou a ser mesmo ao fim de 3 horas.

Os compostos hipocalcémicos da invenção podem utilizar-se, por conseguinte, em terapêutica no tratamento de todos os estad.os em que se necessite uma redução do nível de cálcio no plasma sanguíneo ou um efeito sobre o metabolismo ósseo, por exemplo no tratamento da hipercalcémica resultando de uma deficiência em tirocalcitonina endógena devida a uma perda da função da secreção das células C da tiróide ou a uma hiperfunção da glândula paratiróide. Os compostos podem utilizar-se igualmente no tratamente de todas as afecções dos ossos associadas a uma friabilidade óssea aumentada ou naquelas em que se exija uma fixação do cálcio nos ossos, por exemplo no tratamento da osteoporose de origem diversa por exemplo pós-climatérica, pós-traumática, consecutiva a uma corticoterapia ou a uma imobilidade, de origem maligna, etc.), de fracturas, da osteomalacia, da osteodistrofia renal e provocada pelo raquetismo, de dores, por exemplo de dores dos ossos associadas a uma osteoporose,de transtornos neuro-distroficos,

104 da enfermidade de Paget e para a terapia combinada com o cálcio ou os fosfatos.

Para as indicações acima indicadas associadas ao cálcio, a dose diária apropriada está compreendida entre aproximadamente 5 e aproximadamente 1500 U.I., administrada diariamente numa só dose ou, se necessário, cada dois ou três dias.

Os compostos da invenção, cue são os derivados glucosilados da 1HRH ou. dos seus análogos, inibem a secreção da hormona luteinizante, por exemplo como indicado pela inibição da ovulação nos animais. Este ensaio efectua-se de acordo com o método descrito por I'. llarko y E. Fldckiger, em Experiência 30, páginas 1174-1176 (1974)'?

Em geral, estes compostos da invenção são activados numa dose compreendida entre aproximadamente 0,0005 e apro ximadamente 10 mg/kg. Por exemplo, o composto do exemplo 45 administrado por via subcutânea é activo numa dose de 0,01 mg/kg. 0 efeito inibidor dos compostos sobre a secreção da hormona luteinizante pode determinar-se igualmente in vitro. Preparam-se cultivos de células da hipófise de acordo com o método descrito por Vale (7/. Vale e G. Grant, Enzymology 37, .páginas 82-93; 1975) e por M. Marko e D. Rõmer em Pife Sciences, 33, p. 233-240 (19S3). I’antêm-se células primárias duran te 4 dias num incubador a 37²C. Lavam-se em seguida as células e incubam-se durante 3 horas em 1 ml de um meio que contem a LURE ou o composto a ensaiar. Ao fim da incubação, recuperação o sobrenadante e determina-se a actividade da hormona luteinizante por meio do método de dosagem radio-imunológico (RIA).

Neste ensaio, os compostos da invenção são acti12 vos em geral numa concentração de aproximadamente 10 a apro-7 ximadamente 10 M, e inibem a secreção da hormona luteinizante induzida pela LEREI em função do dose.

J

Para todas as indicações da IZRJJ, a dose diária apropriada está compreendida entre 2 microgramas e 20 mg de substância activ-a. Se necessário, podem-se administrar os compostos em doses fraccionadas, 2 a 4 vezes ao dia, sob a forma de doses unitárias ou, se necessário, sob a forma de libertação retardada, lais doses unitárias compreendem entre aproximadamente 0,5 microgramas e 10 mg de substância activa.

Podem-se administrar os compostos da invenção de acordo com os métodos habituais, por exemplo por via enteral, por via oral, por exemplo sob a forma de soluções bebíveis, de comprimidos ou de cápsulas, por via nasal, por exemplo sob a forma de sprás líquidos ou de pós para pulverização ou de cremes, ou por via parenteral, por exemplo sob a forma de soluções ou de suspensões injectáveis.

Para o composto do Exemplo 2, uma dose apropriada está compreendida entre 3 e 10 mg administrada 3 vezes ao dia, por exemplo por via oral ho tratamento de diabetes melitus, de úlceras e da acromegalia.

Os compostos da invenção podem administrar sob qualquer forma farmaceuticamente aceitável, por exemplo sob a forma livre, quer dizer de base livre, ou, quando o composto é um ácido sob a forma de ácido livre, ou sob a forma de um sal farmaceuticamente aceitável. 0 sal pode ser um sal de adição de ácido ou, quando o composto é um ácido, um sal catiónico. Pode-se administrar o compostos igualmente sob a forma de complexo. Cs compostos podem apresentar-se sob a forma de um solvato, por exemplo de um hidrato.

A presente invenção tem igualmente por objecto as composições farmacêuticas que compreendem um composto da invenção sob uma forma farmaceuticamente aceitável, em associação com pelo menos um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Tais composições podem preparar-se de acordo com os métodos habituais.

Uma ampola bebível ou uma solução injectável pode conter por ml, por exemplo 0,5 mg do composto do ^xemplo 2 sob a forma de acetato, 11,45 mg de ácido cítrico, 6,32 mg de NaOK, 4,5 mg de EaCl.

A presente invenção tem igualmente por objecto um composto da invenção apropriado para qualquer das utilizações anteriormente indicadas, inclusive a diminuição da secreção da hormona de crescimento, 0 diabetes melitus, a redução das secreções gástricas e a acromegalia para os derivados glucosilados de péptidos do tipo somatostatina.

A presente invenção relaciona-se igualmente com a utilização de um composto da invenção para a preparação de um medicamente apropriado para a utilização no tratamento das indicações mencionadas mais acima, incluindo a diminuição da secreção da hormona de crescimento, 0 diabetes melitus, a redução das secreções gástricas e a acromegalia para os derivados glucosilados de péptidos do tipo somatostatina.

Claims (9)

1. RSIVINDIÇASÕES lã. - Processo para a preparação de um derivado de açúcar de um péptido biologioamente activo, que possui uma duração de acção prolongada em comparação com um péptido sem modificação por açúcar e contém, pelo menos num dos radicais de aminoácidos, um radical de açúcar ligado ao grupo amino do radical de aminoácido por uma ligação diferente de urna ligação M-glusosídica directa e, quando o derivado é o produto de condensação de um açúcar que contém um grupo carboxi com um péptido tendo pelo menos 3 unidades de aminoácidos, por uma ligação diferente de uma ligação amida directa, caracterizado pelo facto de

   a) se eliminar pelo menos um grupo de protecção que está presente num péptido modificado por açúcar, ou

   b) se ligarem mutuamente, por meio de uma ligação amida, duas unidades peptídicas, cada urna das quais contém pelo menos um aminoácido ou um aminoálcool sob a forma protegida ou por proteger e uma das unidades peptídicas contém um radical de açúcar, em que a ligação peptídica, se efectua de uma maneira tal que se obtenha a sequência de aminoácidos desejada, depois do que se efectua opcionalmente o processo da etapa a), ou

   c) se introduzir pelo menos um radical de açúcar, opcionalmente protegido, num péptido protegido ou por proteger e, em seguida se efectuar opcicnalments a etapa a), ou

   d) se eliminar ou então se transformar um grupo funcional de um péptido modificado por açúcar noutro grupo funcional, de modo a obter-se um. pétptido glicosilado por proteger ou protegido e, neste último caso, se efectuar o processo da etapa a), ou

   e) se oxidar um péptido modificado por açúcar em que os grupos mercapto dos radicais Cis existem sob a forma livre, para se preparar um péptido em que dois radicais Cis estão ligados por uma pente S -S.
2. 2§. - Processo para a preparação de um composto

   108

   a) de fórmula significa o radical desozidado de una cetose, estando tal radical ligado ao grupo EH de urn péptido biologicamente acti vo por meio do grupo CIí₂,

   P significa o radical de um péptido biologicamente activo da fórmula em que o grupo NA se encontra na extremidade do N-terminal ou então numa cadeia lateral do péptido

   b) de fórnula II (II) em que significa c radical desoxidado de uma aldose, estando o radi- cal, ligado, através de uma ligação livre, ao grupo 2ΤΠ de um péptido biologicamente activo, e significa o radical de um péptido biologicamente activo de fórmula em que o grupo ΝΠ se encontra na extremidade do Ν’-terminal ou então numa cadeia lateral do péptido P,

   c) de fórmula III

   G.-CO-NH-P (III)
3. 3 j em que

   G-₇CC significa o radical de um ácido urónico, ou de um ácido poli-hidroxi-carboxílico ou poli-hidroxi-dicarbcxílico,

   R significa hidrogénio ou alcuilo com 1 a 3 átomos de carbono ou alcanoilo com 1 a
4. 4 átomos de carbono,

   P significa o radical de um péptido biologicamente activo que contém pelo menos 8 unidades de aminoácidos e que tem a fórmula II₀N-P em que NR se encontra na extriniidade do 2T-terminal ou então numa cadeia lateral do péptido,

   d) de fórmula ITa, IVb, IVc ou IVd (IVa) (1Tb)

   Λ ..

   (IVc) em que P significa o radical de te activo de fórmula U^N-P um péptido biologicamen-

   --o.

   significam radicais de açúcar,

   R significa hidrogénio, alquile com 1 a 3 átomos de carboJ no ou alcaloilo com 1 a 4 átomos de carbono, e

   Q, Q’» Q” e Q’ significam grupos que ligam o radical péptido ao radical de açúcar, em que o grupo 2TK ligado com P se encontra na extremidade do N-terminal ou então numa cadeia lateral do péptido,

   e) de fórmula Va ou 7b

   111 _Η0Ξ?0-(CHOH) _c-CY-CíI₂-NH-P (Va)

   H0H₂C-(Cn0H)_c-CH-CH_?0H (7b)

   ΕΉΡ em que χ significa H₉ ou H, OH c significa 2, 3 ou 4

   P significa o radical de um péptido biologicamente activo de fórmula H₂'.-P, em que o grupo NH unido ao radical P se encontra no lã-terminal ou numa cadeia lateral do péptido, e qualquer dos grupos hidroxi livres do radical poliol do composto de fórmula V está eventualmente ligado glicosidicamente a um monossacárido, um dissacárido ou um oligossacárico redutor ou com um amino-açúcar redutor, e dos sais de adição de ácidos e dos complexos de tais derivados de polilpéptidos, com as condições de que

   a) quando, nos compostos de fórmula I acima mencionados, P tem um significado diferente de um radical de um péptido de gastrina com um grupo C-terminal finalizando com -Asp-Pen-7H₂,

   b) quando, nos compostos de fórmula IVb, Q’ significa um ciclo de fenilo contendo radicais divalentes ou quando, nos compostos de fórmula I7d, Q' significa o radical de um ácido dicarboxilico alifático, então P-NH₉ não significa uma insulina natural, e

   c) quando, nos compostos de fórmula III, Gy-CC significa o radical de um ácido murámico opcionalmente N-acilado, então o segundo radical aminoácido na extremidade do H-ter112

   V' t minai do péptido P-NHR não deve significar o radical de um aminoácido dicarboxilico, caracterizado pelo facto de

   a) se eliminar pelo menos um grupo protector presente num péptido modificado por açúcar, ou

   b) se ligarem mutuamente, por meio de uma ligação amida, duas unidades peptídicas, cada uma das quais contém pelo menos um aminoácido ou aminoálcocl sob a forma protegida ou por proteger e uma das unidades peptídicas contém o radical açúcar, em que a ligação peptídica se efectua de maneira tal que se obtenha a sequência de aminoácidos desejada, depois do que se efectua. opcionalmente o processo da etapa a), ou

   c) se introduzir pelo menos um radical de açúcar opcionalmente protegido num péptido protegido ou por proteger e, em seguida se efectuar opcionalmente o processo da etapa a), ou

   d) se eliminar ou então se transformar um grupo funcional de um péptido modificado por açúcar, protegido ou por proteger, noutrc grupo funcional, de modo a obter-se um péptido gliccsilado protegido ou por proteger, e, neste último caso, se efectuar o processo da etapa a) ou

   e) se oxidar um. péptido modificado por açúcar, em que os grupos mercapto dos radicais Cis existem sob a forma livre para se preparar um péptido em que os dois radicais Cis estão unidos por uma ponto S-S, e se isolar o composto sob a forma livre, sob a forma de sal de ácido ou sob a forma de complexo.

   pe3^g. - Processo para a preparação de um álcool ptídico que contém no C-terminal da cadeia peptídica dois gru pos álcool ou então um grupo álcool e um grupo tiol, caracterizado pelo facto de se obter o péptido álcool por meio de hidrólise ácida de um acetal do péptido álcool e de uma resina contendo radicais formilfenilo.

   - Processo de acordo com a reivindicação 3 para a preparação de um péptido álcool de fórmula na qual

   Y significa um radical de um péptido álcool,

   R-^ significa hidrogénio ou metilo, e

   Χ significa 0 ou S, caracterizado pelo facto de se hidrolisar em condições ácidas uma resina que tem a fórmula Ir que contém o péptido álcool, em que ζρ) significa o radical de uma resina sintética insolúvel e

   Z significa uma ligação directa ou um radical que liga a re

   114 sina ao grupo formilfenilo acetalizado, encontrando-se o grupo CHO acetalizado na posição m ou p do radical Z e estando um número de grupos formilfenilo acetalizados ligados a uma molécula da resina polimérica.
5. 5-. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de significar um radical de poliestireno.
6. 6&. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de o símbolo Z significar um grupo de fórmula

   --(D) ρ“°Γ*2“^<Γ em que significa o radical de um grupo reactivo ligado à resina,

   Q₂ significa o radical de um grupo reactivo ligado ao grupo formilfenilo acetalizado,

   D significa um radical que une o grupo ao polímero,

   E significa um. radical que une o grupo Q₂ ^a0 o^rtlP⁰ fonmilfenilo acetalizado, p e q significam, independentemente um do outro, 0 ou 1.
7. 7^&. - Processo de acordo com qualquer das reivin- dicações 3 a 6, caracterizado pelo facto de

   Z significar o grupo

   -CII₂-NH-C0-CH-(0)_mR em que R significa H ou m significa 0 ou 1 e ^^significa um radical de poliestireno.

   83. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 7, caracterizado pelo facto de Σ significar 0 e Rj significar CH^.
8. 9^?. - Método para o tratamento de seres humanos que sofrem de perturbações patológicas provocadas pelo excesso de secreção da hormona do crescimento, corno diabetes melli tus, angiopatia e retinopatia proliferativa, acromegalia, e ainda de úlceras gástricas, pancreatite aguda, tumores gastro -entero-pancreáticos, da proliferação e/ou nueratinização patológicas das células epidérmicas ou de demência senil degenerativa, de demência senil do tipo de llzheimer e de algias vasculares da face, caracterizado pelo facto de se administrar aos pacientes que precisam desse tratamento uma dose diária de pelo menos um dos compostos de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, de preferência compreendida entre cerca de 2 microgramas e cerca de 20 miligramas de substância activa, por via entérica oral, nasal ou parentérica, 2 a 4 vezes por dia ou sob a forma de composição de libertação retardada.

   1C3. - Método para o tratamento de seres humanos em cujos organismos é necessário conseguir uma redução do nível de cálcio no plasma sanguíneo ou a alteração do metabolismo do cálcio ósseo de maneira a aumentar a sua fixação, nomeadamente, para o tratamento de osteoporose, perturbações neurodistróficas ou da doença de Paget, caracterizado pelo facto de se administrar aos pacientes que precisam esse tratamento uma dose diária de pelo menos um dos compostos de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, de preferência compreendida entre cerca de 5 e cerca de 1500 U.I. administrada uma vez por dia ou, caso necessário de dois em dois ou três em três dias.
9. 11'. - Método para o tratamento de seres humanos em cujos organismos se pretende obter a inibição da secreção da hormona luteiiizante para evitar a ovulação, caracterizado pelo facto de se administrar uma dose diária dum composto de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, de preferência compreendida entre cerca de 2 microgramas e 10 miligramas de substância activa por via entérica, oral, nasal ou parentérica, se necessário em doses fraccionadas 2 a 4 vezes por dia ou sob a forma de libertação retardada.