KR100360975B1 - 위장운동자극활성을가지는폴리펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하기 일반식에 의해 표현되는 위장 운동 자극 활성을 가지는 폴리펩티드.
여기서:
A는 친유성 지방족 또는 지환식 아미노산의 L-입체이성질체이고; B는 L-프롤린 또는 L-알라닌이고; D는 친유성 지방족 또 지환식 아미노산의 L-입체이성질체이고, E는 방향족, 친유성 지방족, 또는 지환식 아미노산의 L-입체이성질체이고; F는 방향족 또는 헤테로방향족 아미노산의 L-입체이성질체이고; G는 글리신 또는 D-알라닌이고; H 는 L-글루타민산 또는 L-글루타민이고; I는 L-글루타민, L-글루타민산, 또는 L-알라닌이고,
J는 I와 기 -NH- 사이의 직결합이거나,
Z, Z-Leu, Z-Leu-Gln, Z-Leu-Gln-Glu, Z-Leu-Gln-Glu-Lys, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys, 및 Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly로 구성되는 군으로부터 선택되고, 이때 Z은 아르기닌, D-아르기닌, D-호모아르기닌, D-리신, D-오르니틴, D-2,4-디아미노부티르산, D-글루타민, D-아스파라긴, 및 D-알라닌으로구성되는 군으로부터 선택되고: R1은 저급-알킬 또는 알릴이고: R2는 수소, 저급-알킬, 프로파르길, 및 알릴로 구성되는 군으로부터 선택되고: R3는 수소, 저급-알킬 및 알릴로 구성되는 군으로부터 선택되고; R4는 저급-알킬, 시클로알킬, 치환된 및 비치환된 아릴 및 헤테로아릴로 구성되는 군으로부터 선택되고, 이때, 아릴치환체는 할로겐, 히드록시, 및 저급-알콕시로 구성되는 군으로부터 선택되고; R5는 -CH2CONH2, 아미노알킬기, 및 구아니디노알킬기로 구성되는 군으로부터 선택되고: R6은 -COOH 또는 -CONH2이며; m은 0 또는 1이고, 단:
(a) m이 0, R2및 R3가 수소이고, J가 직결합일 때,기는 D-배치를 가지고;
(b) J가 Z-Leu 또는 Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly 일 때만 R5는 -CH2CONH2이고;
(c) m=0, R2및 R3가 수소이고, J가 Z, Z-Leu, Z-Leu-Gln, Z-Leu-Gln-Glu, Z-Leu-Gln-Glu-Lys, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn, Z-Lleu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys, 및 Z-Lleu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly 일때, Z은 D 배치를 가지며:
(d) 폴리펩티드는 모틸린과 다른 것이다.

Description

위장 운동 자극 활성을 가지는 폴리펩티드
본 발명은 당뇨병 경증 위아토니, 마비성 장폐색증, 및 수술후 장폐색증 같은 위장운동 활성의 감소된 기초 수준을 특징으로 하는 상태의 치료에 유용한 향상된 신진대사의 안정도 및 강력한 위장 운동성 자극 활성을 가지는 신규한 폴리펩티드에 관한 것이다.
모틸린 (motilin)은 위 동(洞), 십이지장, 및 결장을 자극하는 위장 선형 폴리펩티드 호르몬이다. 비록 그의 효과가 완전히 공지되지 않더라도, 모틸린은 위 운동성을 증가시키고 펩신 배출을 자극하는 역할을 하고, 내소화성 근전성 복합체를 조절하는데 또한 중요할 수 있다. 인간의 모틸린은 아직 정제되지 않았으나, 그의 면역 특성은 그것이 돼지 모틸린과 매우 유사하다는 것을 강하게 제안한다. 돼지 모틸린은 22 아미노산 잔기를 함유하고, 하기 식에 의해 표현될 수 있다.
돼지의 모틸린은 위치 1-5의 소수성 영역, 위치 11-22 의 친수성 영역, 및위치 6-10 의 연결 영역을 가진다. 돼지의 모틸린은 또한 1차 서열의 잔기 9-20의 α-나선형 2차 구조를 가진다 [ Khan 일행, Biochemistry 29, 5743-5751 (1990)].
건강한 인간 피검자에 대한 모틸린의 투여는 장 통과 시간을 가속화시키고, 위 공백을 향상시킨다. 시험관내에서, 모틸린은 인간 및 토끼 십이지장 평활근 스트립 및 단리된 위장 평활근 세포의 접촉을 자극한다. 게다가, 모틸린 및 그의 유도체 몇몇은, 위장도내 특이 수용체의 자극이 호르몬의 생리학적 효과에 책임이 있다는 것을 제안하면서 인간 및 토끼 등 조직상의 결합 자리에 대한 방사선표지된 모틸린과 경쟁한다. 모틸린의 주입은 당뇨병 경증 위아토니를 가진 환자에 있어서 고체 및 액체의 공백을 자극하는 것으로 보고되어왔다 [Peeters 일행, Gastroenterololgy 100, A480 (1991)]. 게다가, 모틸린은 위장 도의 암에 의해 발생되는 마비성 장폐색증을 가진 환자를 치료하는데 사용되어 왔다 [Meyer 일행, Med. Klin. 86, 515-517 (1991)].
모틸린을 사용한 주요 문제점은 인간에 있어서 4.5 분인 그의 비교적 짧은 반감기(t ½) 이다 [Christofides 일행, Gastroenterology 76, 903-907 (1979)]. 이 짧은 반감기는 치료학적 효과를 유발하기 위해 연속 주입에 의해 호르몬을 투여하는 것을 필요하게 한다.
N-터미날 아미노산 서열 및 모틸린의 중간 부분의 특정 잔기는 수축 활성을 위해 필수적이다 [Macielag 일행, Peptides 13, 565-569 (1992); Pesters 일행, Peptides 13, 1103-1107 (1992); Poitras 일행, Biochem, Biophys. Res. Commum. 183, 36-40 (1992)]. 보다 짧은 C-말단을 가지고 위치 12로 부터 결합된 3-5 염기아미노산을 함유하고, 위치 1-11 에서의 여러가지 아미노산 치환체를 가지는 모틸린-형 폴리펩티드는 모틸린의 활성이하의 활성을 가지는 것으로 보고되었다. 모틸린-형 폴리펩티드중 어느것도 신진대사 안정도를 증가시키는 것으로 보고되지는 않았다 [일본 특허 제 2-311, 495].
따라서, 강력한 위장 운동 자극 활성 및 향상된 신진대사 안정도를 가지는 모틸린-형 폴리펩티드는 위장 운동 활성의 감소된 기초 수준의 치료에 유용할 것이다.
본 발명은 광학적으로 활성인 이성질체 형태 및 그의 제약학적으로 허용가능한 산부가염을 포함하는 하기 일반식에 의해 표현되는 위장 운동 자극 활성을 가지는 폴리펩티드에 관한 것이다 :
여기서;
A 는 친유성 지방족 또는 지환식 아미노산의 L-입체이성질체이고;
B 는 L-프롤린 또는 L-알라닌이고;
D 는 친유성 지방족 또는 지환식 아미노산의 L-입체이성질체이고:
E 는 방향족, 친유성 지방족, 또는 지환식 아미노산의 L-입체이성질체이고;
F 는 방향족 또는 헤테로방향족 아미노산의 L-입체이성질체이고;
G 는 글리신 또는 D-알라닌이고;
H 는 L-글루타민산 또는 L-글루타민이고;
I 는 L-글루타민, L-글루타민산, 또는 L-알라닌 이고;
J 는 I 와 기 -NH- 사이의 직결합이거나, Z, Z-Leu, Z-Leu-Gln, Z-Leu-Gln-Glu, Z-Leu-Gln-Glu-Lys, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys, 및 Z-Leu-Gln-Glu-Lys-GIu-Arg-Asn-Lys-Gly 로 구성되는 군으로 부터 선택되고, 이때 Z 은 아르기닐, D-아르기닌, D-호모아르기닌, D-리신, D-오르니틴, D-2,4-디아미노부티르산, D-글루타민, D-아스파라긴, 및 D-알라닌으로 구성되는 군으로 부터 선택되고;
R1은 저급-알킬 또는 알릴이고:
R2는 수소, 저급-알킬, 프로파르길, 및 알릴로 구성되는 군으로부터 선택되고;
R3는 수소, 저급-알킬 및 알릴로 구성되는 군으로부터 선택되고;
R4는 저급-알킬, 시클로알킬, 치환된 및 비치환된 아릴 및 헤테로아릴로 구성되는 군으로부터 선택되고, 이때, 아릴기는 할로겐, 히드록시, 및 저급-알콕시로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있고;
R5는 -CH2CONH2, 1-3 탄소원자를 함유하는 아미노알킬기, 및 2 또는 3 탄소원자를 함유하는 구아니디노알킬기로 구성되는 군으로부터 선택되고;
R8은 -COOH 또는 -CONH2이며;
m 은 0 또는 1 이고, 부호 * 는 D 또는 L 배치로 존재할 수 있는 비대칭 탄소원자를 나타내고, 각 저급-알킬기는 1-4 탄소원자를 함유하는데, 단 :
(a) m 이 0, R2및 R3가 수소이고, J 가 직결합일때, -NH-CH(CH2R5)R8기는 D-배치를 가지고;
(b) J 가 Z-Leu 또는 Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly: 일때만 R5는 -CH2CONH2이고;
(c) m = 0, R2및 R3가 수소이고, J 가 Z, Z-Leu, Z-Leu-Gln, Z-Leu-Gln-Glu, Z-Leu-Gln-Glu-Lys, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys, 및 Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly 일때, Z 는 D 배치를 가지며;
(d) 폴리펩티드는 모틸린과 다른 것이다.
본 발명의 신규한 폴리펩티드는 모틸린 수용체에 대해 높은 친화도를 기지고 결합하고, 위장 조작에 대한 모틸린의 연동 효과와 흡사하다. 신규한 폴리펩티드는 또한, 그들이 적절한 기관 조직 균등질에 있어서, 생감성(生減成)에 대한 증가된 안정도를 나타내기 때문에 생체내에서 보다 효과적인 프로키네틱 (prokinetic) 약제이다. 모틸린-형 폴리펩티드는 보다 큰 화학적 안정도를 위해 위치 13 에서 메티오닌대신에 로이신 잔기를, 보다 큰 효능 및 안정도를 위해 위치 12 에서 L-아르기닌 대신에 D-아르기닌 잔기를, 및 생감성에 대한 증가된 안정도를 위해 위치 1 에서 알킬화 페닐알라닌 잔기를 함유한다. 그러므로, 본 발명의 폴리펩티드는 당뇨병 경증 위아토니, 마비성 장폐색증, 및 수술후 장폐색증 같은 위장 운동 활성의 감소된 기초 수준을 특징으로 하는 상태의 치료에 유용하다.
본 발명은 강력한 위장 운동 자극 활성을 가지는 신규한 폴리펩티드 뿐만 아니라, 포유동물, 바람직하게 인간에 있어서 위장 운동 활성의 감소된 기초 수준의 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 광학적으로 활성인 이성질체 형태 및 그의 제약학적으로 허용가능한 산 부가염을 포함하는 하기 식(1)에 의해 표현되는 폴리펩티드의, 상태를 경감시키기에 치료학적으로 효과적인 양을 포유동물에 투여하는 것으로 구성된다 :
식 (1) 에서, m은 0-1 의 정수이고, 부호 *는 D 또는 L 배치로 존재할 수 있는 비대칭 탄소 원자를 나타내고, 각 저급-알킬기는 1-4탄소 원자를 함유하는데, 단, (a) m이 0이고, R2및 R3가 수소이고, J 가 직결합일때,기는 D-배치를 가지고: (b) J 가 Z-Leu 또는 Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly 일때만 R5가 -CH2CONH2이고:
(c) m = 0, R2및 R3가 수소이고, J 가 Z, Z-Leu, Z-Leu-Gln, Z-Leu-Gln-Glu, Z-Leu-Gln-Glu-Lys, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys, 및 Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly 일때, Z는 D 배치를 가지며: (d) 폴리펩티드는 모틸린과 다른 것이다. 기 A-J 및 R1-R6은 하기에 서술되는 바와 같이 정의된다.
식(1) 에 의해 정의되는 본 발명의 신규한 화합물은 길이로 12-22 아미노산일 수 있는 폴리펩티드이고, 바람직하게 길이로 12, 14, 16, 18, 20, 또는 22 아미노산이다. 신규한 폴리펩티드의 구성 아미노산의 입체화학은 본 발명의 주요한 특징이다. L 또는 D일 수 있는 위치 1 (아미노-말단 아미노산, (R1)m(R2)(R3)N-*CH(CH2R4) CO-), 글리신 또는 D-알라닌일 수 있는 위치 8 (기 G), L 또는 D일 수 있는 위치 12, 및 L 또는 D 일 수 있는 C-말단 아미노산 위치, -NH-*CH (CH2R5)R6을 제외하고 달리 지시되지 않는 한, 각 아미노산의 절대적 입체화학은 L이다.
이 명세서를 통해 즉 사용되는 하기 약자는 하기 서술되는 바와같이 정의된다:
위치 1, 아미노-말단 아미노산,
위치 1 에서 폴리펩티드의 아미노-말단 부분에서의 아미노산, (R1)m(R2)(R3) N-*CH(CH2R4)CO -, 은 L 또는 D 배치를 가질 수 있다. R1은 저급-알킬 또는 알릴이고: R2는 수소, 저급-알킬, 프로파르길, 및 알릴로 구성되는 군으로 부터 선택될 수 있고; R3는 수소, 저급-알킬, 및 알릴로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 여기서 사용되는 바와 같이, 용어 "저급-알킬"은 1-4 탄소원자를 함유하는 직- 및 분지-쇄 탄화수소 라디칼에 관한 것이다. R1, R2및 R3에 대한 적합한 저급-알킬기의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 및 sec-부틸, 바람직하게 메틸이다.
정수 m 은 0 또는 1, 바람직하게 0 이다.
m 이 0 일때, 아미노 잔기는 R2, 및 R3가 수소인 1차 아민일 수 있다. 아미노 잔기는 또한 각각 1-4개의 탄소 원자를 가지는 저급-알킬기, 및 바람직하게 메틸 또는 에틸에 의해 1, 2 또는 3 치환된 2차 아민, 3차 아민, 또는 4차 암모늄 염 (m 은 1)일 수 있다. 아미노 잔기는 또한 한 프로파르길 기에 의해 치환되어, 예컨대 N-프로파르길, N-메틸-N-프로파르길, N,N-디메틸-N-프로파르길 치환된 아미노 잔기, 또는 3 이하의 알릴기를 제공할 수 있다. 바람직하게, 아미노-말단 아미노산은 N-치환되고, 바람직한 치환체는 1-3개의 메틸기이다.
R4는 저급-알킬, 시클로알킬, 치환 및 비치환 아릴, 및 헤테로아릴로 구성되는 군으로부터 선택되고, 이때, 아릴기는 할로겐, 히드록시 및 저급-알콕시로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체를 함유할 수 있다. 바람직한 치환 및 비치환 아릴기는 페닐, p-플루오로페닐, p-클로로페닐, p-브로모페닐, p-요오도페닐, p-히드록시페닐, p-메톡시페닐, 1-나프틸, 및 2-나프틸이다. 바람직한 헤테로아릴기는 3-인돌릴, 2-티에닐, 및 3-피리딜이다. 바람직한 시클로알킬기는 시클로펜틸, 시클로헥실, 및 시클로헵틸이다. 바람직하게, R4는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, 시클로헥실, 페닐, p-플루오로페닐, p-클로로페닐, p-브로보페닐, p-요오도페닐, p-히드록시페닐, p-메톡시페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 3-인돌릴, 2-티에닐, 및 3-피리딜로 구성되는 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게, R4는 페닐 및 시클로헥실로 구성되는 군으로 부터 선택된다. (R1)m(R2)(R3) N-*CH(CH2R4)CO - 가 유도될 수 있는 아미노산 잔기의 예는 페닐알라닌, p-플루오로페닐알라닌, p-클로로페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-요오도페닐알라닌, 티로신, p-메톡시페닐알라닌, 1-나프틸알라닌, 2-나프틸알라닌, 트립토판, β-2-티에닐알라닌, β-3-피리딜알라닌, α-아미노부티르산, 노르발린, 노르로이신, 로이신, 및 시클로헥실 알라닌이다. 높은 수준의 위장 연동 활성을 가지는 화합물에 대해, 바람직한 아미노-말단 아미노산은 L-페닐알라닌, D-페닐알라닌, L-시클로헥실알라닌, 및 D-시클로헥실알라닌이다.
위치 2, 기 A
폴리펩티드의 위치 2에서의 기 A 는 친유성 지방족 또는 지환식 아미노산의 L-입체이성질체인 아미노산이다. L-친유성 지방족 및 지환식 아미노산의 예는 L-발린, L-이소로이신, L-로이신, L-노르발린, L-노르로이신, 및 L-시클로헥실알라닌이다. 바람직한 기 A 아미노산은 L-발린, L-로이신, 및 L-이소로이신이다.
위치 3, 기 B
폴리펩티드의 위치 3에서의 기 B 는 L-프롤린 또는 L-알라닌인 아미노산이다. 높은 수준의 모틸린 수용체 아고니스트 활성을 가지는 화합물에 대해, 바람직한 기 B 아미노산은 L-프롤린이다.
위치 4, 기 D
폴리펩티드의 위치 4에서의 기 D 는 친유성 지방족 또는 지환식 아미노산의 L-입체 이성질체인 아미노산이다. L-친유성 지방족 및 지환식 아미노산의 예는 L-이소로이신, L-발린, L-로이신, L-노르발린, L-노르로이신, 및 L-시클로헥실알라닌이다. 바람직한 기 D 아미노산은 L-이소로이신, L-로이신, 및 L-시클로헥실알라닌이다.
위치 5, 기 E
폴리펩티드의 위치 5에서의 기 E 는 방향족, 친유성 지방족 또는 지환식 아미노산의 L-입체이성질체인 아미노산이다. L-방향족, 친유성 지방족, 및 지환식 아미노산의 예는 페닐알라닌, p-플루오로페닐알라닌, p-클로로페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-요오도페닐일라닌, 티로신, p-메톡시페닐알라닌, 1-나프틸알라딘, 2-나프틸알라닌, 로이신, 및 시클로헥실알라닌으로 부터 유도된 잔기이다. 바람직한 기 E 아미노산은 L-페닐알라닌 및 L-시클로헥실알라닌이다.
위치 6, L-트레오닌
폴리펩티드의 위치 6에서의 아미노산은 L-트레오닌이다.
위치 7, 기 F
폴리펩티드의 위치 7 에서의 기 F 는 방향족 또는 헤테로방향족 아미노산의 L-입체 이성질체인 아미노산이다. 방향족 및 헤테로방향족 아미노산의 예는 티로신, 패닐알라닌, p-메톡시페닐알라닌, 히스티딘, 티립토판, β-2-티에닐알라닌, 및 β-3-피리딜알라닌이다. 바람직한 기 F 아미노산은 L-티로신, L-히스티딘, 및 L- 페닐알라닌이다.
위치 8, 기 G
폴리펩티드의 위치 8 에서의 기 G 는 글리신 또는 D-알라닌, 및 바람직하게 글리신인 아미노산이다.
위치 9, 기 H
폴리펩티드의 위치 9 에서의 기 H 는 L-글리타민산 또는 L-글루타민, 바람직하게 L-글루타민산인 아미노산이다.
위치 10, L-로이신
폴리펩티드의 위치 10 에서의 아미노산은 L-로이신 이다.
위치 11, 기 I
폴리펩티드의 위치 11에서의 기 I 은 L-글루타민, L-글루타민산, 또는 L-알라닌인 아미노산이다. 바람직한 기 I 아미노산은 L-글루타민 및 L-알라닌이다.
기 J
기 J 는 기 I 과 -NH- 기 사이의 직 결합일 수 있거나; Z, Z-Leu, Z-Leu-Gln, Z-Leu-Gln-Glu, Z-Leu-Gln-Glu-Lys, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys, 및 Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly 로 구성되는 군으로 부터, 및 바람직하게 Z-Leu, Z-Leu-Gln-Glu, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn, 및 Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 기 Z은 아르키닌, D-아르기닌, D-호모아르기닌, D-리신, D-오르니틴, D-2,4-디아미노부티르산, D-글루타민, D-아스파라긴, 및 D-알라닌으로 구성되는 군으로부터 선택되고, 바람직하게 아르기닌, D-아르기닌, D-글루타민, 및 D-알라닌으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산이다.
위치 12
폴리펩티드내 기 J 가 기 I 및 -NH- 기 사이에 직결합일때, 폴리펩티드는 도데카펩티드이고, 위치 12 에서의 아미노산은 폴리펩티드의 C-말단 부분, -NH-*CH(CH2R5)-R6이다. 기 J 가 직결합이고, 폴리펩티드의 위치 1 에서의 기 R2및 R3가 수소일 때, 위치 12 에서의 아미노산은 D 배치를 가진다. 기 R5는 1-3 탄소원자를 함유하는 아미노알킬기, 또는 2 또는 3 탄소 원자를 함유하는 구아니디노알킬기이고, 바람직하게, 2 또는 3 탄소 원자를 함유하는 구아니디노알킬기로 구성되는 군으로부터 선택된다. 바람직한 아미노일킬 기는 아미노메틸, 2-아미노에틸, 및 3-아미노-n-프로필이다. 바람직한 구아니디노일킬 기는 N-2-구아니디노에틸 및 N-3-구아니디노-n-프로필이다. 기 R 은 -COOH 또는 -CONH2, 바람직하게 -CONH2이다. 바람직하게, 이 실시양태에서 폴리펩티드의 C-말단 부분에서의 아미노산, -NH-*CH(CH2R5)-R6은 아르기닌, D-아르기닌, 리신, D-리신, D-오르니틴, D-2,4-디아미노부티르산, 및 D-호모아르기닌으로 구성되는 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게 아르기닌, D-아르기닌, 및 리신으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
폴리펩티드에서 기 J 가 기 I 및 -NH-기 사이에 직결합이 아닐때, 위치 12 에서의 아미노산은 기 Z 이다. 상기 서술된 바와 같이, 기 Z은 아르기닌, D-아르기닌, D-호모아르기닌, D-리신, D-오르니틴, D-2,4-디아미노부티르산, D-글루타민, D-아스파라긴, 및 D-알라닌으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산이다. 바람직하게, 기 Z 은 아르기닌, D-아르기닌, D-글루타민, 및 D-알라닌으로 구성되는 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게 기 Z 은 D-아르기닌이다. 폴리펩티드의 위치 1 에서 기 R2및 R3가 수소일 때, 기 Z의 아미노산은 D 배치를 가진다.
위치 13
본 발명에서 폴리펩티드가 트리데카펩티드일 때, 위치 13 에서의 아미노산은폴리펩티드의 C-말단 부분, -NH-*CH(CH2R5)-R6이고, L 또는 D 배치를 가질 수 있고, 리신, 오르니틴, 2,4-디아미노부티르산, 아르기닌, 및 호모아르기닌, 바람직하게 L-리신 또는 D-리신으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드가 트리데카펩티드보다 클 때, 위치 13 에서의 아미노산은 L-로이신이다.
위치 14
본 발명에서 폴리펩티드가 테트라테카팹티드일 때, 위치 14 에서 아미노산은 폴리펩티드의 C-말단 부분, -NH-*CH(CH2R5)-R6이고, L 또는 D 배치를 가질 수 있고, 글루타민, 리신, 오르니틴, 2,4-디아미노부티르산, 아르기닌, 및 호모아르기닌으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게 L-리신, D-리신, L-글루타민, 및 D-글루타민으로구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 폴리펩티드가 테트라데카펩티드보다 클때, 폴리펩티드의 위치 14 에서의 아미노산은 L-글루타민이다.
위치 15
본 발명에서 폴리펩티드가 펜타데카펩티드일 때, 위치 15 에서의 아미노산은 폴리펩티드의 C-말단 부분, -NH-*CH(CH2R5)-R6이고, L 또는 D 배치를 가질 수 있고, 리신, 오르니틴, 2,4-디아미노부티르산, 아르기닌, 및 호모아르기닌, 바람직하게 L-리신 또는 D-리신으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드가 펜타데카펩디드보다 클때, 위치 15 에서의 아미노산은 L-글루타민산이다.
위치 16
본 발명에서 폴리펩티드가 헥사데카펩티드일 때, 위치 16 에서와 아미노산은 폴리펩티드의 C-말단 부분, -NH-*CH(CH2R5)-R6이고, L 또는 D 배치를 가질 수 있고, 리신, 오르니틴, 2,4-디아미노부티르산, 아르기닌, 및 호모아르기닌, 바람직하게 L-리신 또는 D-리신으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드가 헥사데카펩티드보다 클때, 폴리펩티드의 위치 16 에서의 아미노산은 L-리신이다.
위치 17
본 발명에서의 폴리펩티드가 헵타테카펩티드일 때, 위치 17 에서의 아미노산은 폴리펩티드의 C-말단 부분, -NH-*CH(CH2R5)-R6이고, L 또는 D 배치를 가질 수 있고, 리신, 오르니틴, 2,4-디아미노부티르산, 아르기닌, 및 호모아르기닌, 바람직하게 L-리신 또는 D-리신으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티트가 헵타데카펩티드보다 클때, 위치 17 에서의 아미노산은 L-글루탐산이다.
위치 18
본 발명에서 폴리펩티드가 옥타데카펩티드일 때, 위치 18 에서의 아미노산은폴리펩티드의 C-말단 부분, -NH-*CH(CH2R5)-R6이고, L 또는 D 배치를 가질 수 있고, 리신, 오르니틴, 2,4-디아미노부티르산, 아르기닌, 및 호모아르기닌으로 구성되는 군으로 부터 선택될 수 있고, 바람직하게 L-리신 또는 D-리신, L-아르기닌 및 D-아르기닌으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 폴리펩티드가 옥타테카펩티드보다 클때, 폴리펩티드의 위치 18 에서의 아미노산은 L-아크기닌이다.
위치 19
본 발명에서 폴리펩티드가 노나데카펩티드일 때, 위치 19 에서의 아미노산은 폴리펩티드의 C-말단 부분, -NH-*CH(CH2R5)-R6이고, L 또는 D 배치를 가질 수 있고, 리긴, 오르니틴, 2,4-디아미노부티르산, 아르기닌, 및 호모아르기닌, 바람직하게 L-리신 또는 D-리신으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티트가 노나데카펩티드보다 클때, 위치 19에서의 아미노산은 L-아스파라긴이다.
위치 20
본 발명에서 폴리펩티드가 20 아미노산으로 구성될 때, 위치 20 에서의 아미노산은 폴리펩티드의 C-말단 부분, -NH-*CH(CH2R5)-R6이고, L 또는 D 배치를 가질 수 있고, 리신, 오르니틴, 2,4-디아미노부티르산, 아르기닌, 및 호모아르기닌, 바람직하게 L-리신 또는 D-리신으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드가 20 아미노산보다 클때, 폴리펩티드의 위치 20 에서의 아미노산은 L-리신이다.
위치 21
본 발명에서 폴리펩티드카 21 아미노산으로 구성될 때, 위치 21 에서의 아미노산은 폴리펩티드의 C-말단 부분, -NH-*CH(CH2R5)-R6이고, L 또는 D 배치를 자질 수 있고, 리신, 오르니틴, 2,4-디아미노부티르산, 아르기닌, 및 호모아르기닌, 바람직하게 L-리신 또는 D-리신으로 구성되는 군으로부턴 선택될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드가 21 아미노산보다 클때, 위치 21 에서의 아미노산은 글리신이다.
위치 22
본 발명의 특정 폴리펩티드의 위치 22 에서의 아미노산이 폴리펩티드의 C-말단 두분, -NH-*CH(CH2R5)-R6이고, L 또는 D 배치를 가질 수 있고, 글루타민, 리신, 오르니틴, 2,4-디아미노부티르산, 아르기닌, 및 호모아르기닌으로 구성되는 군으로 부터 선택될 수 있고, 바람직하게 L-리신 또는 D-리신, L-글루타민 및 D-글루타민으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
C-말단 아미노산, -NH-*CH(CH2R5)-R6
본 발명의 폴리펩티트의 C-말단 위치, -NH-*CH(CH2R5)-R6에서 존재하는 잔기는 R6이 -COOH 또는 -CONH2, 바람직하게 -CONH2인 C-말단 카르복실산 유도체 R6로의 아미노산이다. R5는 상기 정의된 바와 같다.
여기서 사용되는 바와 같이, 용어 "시클로알킬"은 5-7 탄소원자를 함유하는 시클릭탄화수소 라디칼을 의미한다. 적합한 시클릭-탄화수소 라디칼의 예는 시클로펜틸, 시클로헥실, 및 시클로헵틸이다. 여기서 사용된 바와 같이 용어 "할로겐"은 염소가 바람직한 모두 네개의 할로겐을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 반명의 화합물은 하기로 구성되는 군 및 그들의제약학적으로 허용가능한 부가염으로 부터 선택된다:
각 경우에서, 아미노산은 달리 명시되지 않는한 L-배치를 가진다. 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 하기로 구성되는 군 및 그들의 제약학적으로 허용가능한 부가염으로 부터 선택된다 :
가장 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 하기로 구성되는 군 및 그들의 제약학적으로 허용가능한 부가염으로 부터 선택된다:
본 발명의 화합물은 그 분야에서 공지된 여러가지 방법에 의해, 예컨대 고체상 펩티드 합성 또는 고전적 용액상 합성에 의해서 제조될 수 있다. 고체상 방법에서, 펩티드사슬은 수지 지지체, 전형적으로 폴리스티렌 기재, 폴리하이프 (polyhipe) 기재, 또는 폴리아크릴아미드/Kieselguhr 복합체 수지를 사용하여 연속적으로 구성된다. 성장하는 펩티드 사슬은 적합한 산-불안정한 분자 링커, 예컨대히드록시메틸페닐아세트아미도메틸(DAM), 4-메틸벤즈히드릴아미노 (MBHA), 또는 히드록시메틸페녹시아세톡시 (HMPA) 부분에 의해 수지 지지체에 매어 놓는다. 그리고나서, 펩티드 사슬은 폴루오르화수소, 트리플루오로아세트산 (TFA), 트리플루오로메탄설폰산 (TFMSA)등을 사용하는 에시돌리시스를 통해, 링커 및 이어서 수지 지지체로 부터 절단될 수 있다.
본 발명의 위장 운동 자극 폴리펩티드를 고체상 또는 용액상 방법에 의해 제조하든지, 기본적 합성 접근법은 하나의 적합하게 보호된 아미노산 또는 펩티드 단편의 아미노기와 또다른 적합하게 보호된 아미노산 또는 팹티드 단편의 카르복실 부분의 반응을 통해 새로운 아미드 결합을 형성하는 아미노산 하부단위의 커플링을 포함한다. 커플린 반응에 효과적이기 위해, 카르복실 부분은 활성화되어야 한다. 표준 커플링제, 예컨대 DCC, DIC, EDCC, BOP, HBTU, 또는 PyBrOP 의 사용을 통해 활성화가 성취된다. PyBrOP 의 경우에서를 제외하고, 등몰량의 HOBt 는 활성화된 아미노산 성분의 라세미화를 억제시키기 위해 첨가될 수 있다. NMM, DIEA 또는 TEA 같은 염기는, 활성화를 위해 상응하는 아미노산의 카르복실레이트 염을 사용하는 것이 필요한 경우에 사용될 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 펩티드는 성분 아미노산의 활성 에스테르를 커플링함으로써 합성될 수 있다. 상기 활성 에스테르는, 예컨대 펜타클로로페닐 에스테르, 펜타플루오로 페닐 에스테르, p-니트로페닐 에스테르등을 포함한다.
본 발명의 펩티드의 제조중에, 아미노산 성분의 다른 반응 관능가는 적당한 보호기로 차단되어야 한다. 일반적으로, α-아미노 보호기의 정체는 어떤 유형의측쇄 보호기가 사용되어야 하는가를 가리킨다. 예컨대, α-아미노기가 그의 Boc 유도체로서 보호되는 경우에, 측쇄 보호는 일반적으로 벤질 알콜의 에스테르, 에테르, 또는 우레탄 유도체로 성취된다. 시클로헥산올의 에스테르 및 에테르 유도체는 또한 어느정도 성공적으로 사용되었다. 반대로, α-아미노기가 그의 Fmoc 유도체로서 보호될때, 측쇄 관능가는 일반적으로 t-부탄올의 에스테르, 에테르, 또는 우레탄 유도체로서 보호된다. 물론, 보호기의 대안적인 배합물은, 특별히 본 발명의 펩티드가 용액 상 방법론에 의해 합성될 때 사용될 수 있다.
Fmoc α-아미노 보호기의 제거가 염기, 전형적으로 피페리딘으로 쉽게 성취될 수 있다. 측쇄 보호기는 또한 펩티드의 C-말단 및 수지 링커 사이의 결합을 절단하는, 적당한 카르보늄 이온 스케빈저의 존재하에 TFA 로 처리함으로써 제거될 수 있다. Boc 보호기는 일반적으로 묽은 TFA로 처리함으로써 제거된다. 그러나, TFA 절단 후에, α-아미노기는 그의 TFA 염으로서 제공된다. 다음 아미노산 유도체에 대해 반응성인 성장하는 펩티드쇄의 α-아미노기를 제조하기위해, 수지-결합 펩티드는 TEA 또는 DIEA 같은 염기로 중성화 된다. 그리고나서, 적합한 스캐빈저를 함유하는 불화수소산 또는 TFMSA 같은 강산은 아미노산 측쇄를 탈보호하고, 수지 지지체로부터 펩티드를 절단하는데 사용된다.
본 발명에 따라, 아미노-말단 부분, (R1)m(R2)(R3)N- 을 함유하는 펩티드의 제조 방법이 제공된다. m=0; R2가 수소 또는 저급-알킬이고: R3가 저급 알킬일때, 방법은 임의로 적당한 링커를 통해 불용성 지지체에 결합된 적합하게 보호된 펩티드의 N-말단 아미노기 (NH2- (AA)n-)를 적당한 알데히드 또는 케톤 및 알칼리 금속 히드라이드 환원제와 반응시키는 것으로 구성된다. 알데히드 또는 케톤은, 예컨대 포름알데히드, 아세트알데히드, 또는 아세톤일 수 있다. 알칼리금속 히드라이드는, 예컨대 나트륨 시아노보로히드라이드 같은 알칼리금속 보로히드라이드일 수 있다. 방법은, 임의로 주위온도에서 아세트산 또는 1-히드록시에틸피페라진 에탄설폰산 (HEPES)와 함께, DMF 또는 NMP 같은 적합한 용매내에서 편리하게 수행된다. 본 방법은 공개가 참고로써 본원에 통합되는 미합중국 특허 제 4,421,744 호에서 보다 충분히 서술된다.
m=1 ; R1및 R3가 독립적으로 저급 알킬 또는 알릴이고; R2가 저급-알킬, 아릴 및 프로파르길로 구성되는 군으로 부터 선택될때, 방법은 R1이 상기 정의된 바와 같고, Hal이 할로겐 원자인 일반식 R3Hal 에 의해 표현되는 화합물과, 임의로 적당한 링커를 통해 불용성 지지체에 결합된, 적합하게 보호된 펩티드의 N-말단 이미노기 (NR2R3- (AA)n-)를 반응시키는 것으로 구성된다. 반응은 탄산나트륨 또는 탄산칼륨 같은 적합한 산-결합제의 존재하에, DMF 또는 NMP 같은 직합한 용매내에 수행된다. 방법은 공개가 참고문헌으로서 본원에 통합되는 Benolton-Chen, Proced.14 th. Europ. Pert. Symp.(1976). p149 에서 보다 충분히 서술된다.
유리 염기의 형태로 효과적인 본 발명의 화합물도 결정화의 안정도, 편리함, 증가된 용해도등의 목적을 위해 제약학적으로 허용가능한 산 부가염의 형태로 배합되고 투여될 수 있다. 이들 산 부가염은 적합한 무기 또는 유기산, 예컨대 염산, 황산, 설폰산, 주석산, 푸마르산, 취화수소산, 글리콜산, 시트르산, 말레인산, 인산, 숙신산, 아세트산, 니트르산, 벤조산, 아스코르빈산, p-톨루엔설폰산, 벤젠설폰산, 나프탈렌설폰산, 프로피온산 등으로부터 통상의 방법에 의해 생성된다. 바람직하게, 산 부가염은 염산, 아세트산, 또는 숙신산으로 부터 제조된 것들이다.
본 발명의 화합물은 제약학적 조성물을 제공하기 위해 제약학적으로 허용가능한 부형제와 결합될 수 있다. 유리 염기로서 표제 화합물에 적합한 부형제는 프로필렌 글리콜-알콜-물, 등장수, 주사용 무균수 (USP), 에멀포어 (emulpher)TM-알콜-물, 크레모포어(cremophor)-ELTM또는 당업자에게 공지된 다른 적합한 부형제를 포함한다.
표제 화합물의 산 부가염에 적합한 부형제는, 다른 가용화제, 예컨대 에탄올, 프로필렌 글리콜, 또는 당업자에게 공지된 다른 통상의 가용화제와 함께 또는 단독으로, 등장수, 주사용 무균수 (USP)를 포함한다. 바람직한 부형제는 본 발명의 화합물의 등장 수용액이다.
본 발명의 화합물은 바람직한 위장 운동 자극 활성을 제공하는데 효과적인 양으로 포유동물, 예컨대 동물 또는 인간에 투여될 수 있다. 화합물의 활성 및 바람직한 치료학적 효과의 정도가 또한 변하기 때문에, 사용된 화합물의 투여량은 또한 변할 것이다. 투여된 실제 투여량은 또한 환자의 체중 및 특정 환자의 개개 과감작 같은 일반적으로 인식된 요소에 의해 결정될 것이다. 이리하여, 특정 환자(인간)를 위한 단위 투여량은, 의사가 원하는 효과를 적정할 수 있는 체중의 kg 당 약 0.1 μg만큼 낮게 변할 수 있다. 적정을 위해 바람직한 최소 투여량은 1 μg/kg 체중이다.
본 발명의 화합물은 앞서 서슬된 부형제내, 무균 용액 또는 현탁액의 형태로, 인식된 비경구적 경로에 의해 투여될 수 있다. 이들 제제는 본 발명의 화합물의 적어도 약 0.1 중량% 를 함유해야 하나, 이 양은 본 발명의 화합물의 약 0.1중량% - 약 50중량% 에서 변할 수 있다. 본 발명의 화합물은 바람직하게 정맥내로 투여되고, 사용된 투여량은 일반적으로 70 kg 체중당 약 0.1 μg - 약 500 mg, 및 바람직하게 약 1 μg - 약 50 mg 의 범위내일 것이다. 이 투여량은 매일 1-4 번 투여될 수 있다.
무균 용액 또는 현탁액은 또한 하기 보조제를 포함할 수 있다: 무균 희석제, 예컨대 주사용 물, 식염 용액, 비휘발성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 또는 다른 합성 용매; 살균제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르빈산 또는 나트륨 메타비설파이트: 킬레이트화제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA); 완충액, 예컨대 아세테이트, 시트레이트, 또는 포스페이트: 및 강직성의 조절을 위한 약제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. 비경구적 제제는 엠푸울, 1회용 시린지, 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 투여 바이알내에 봉해질 수 있다.
이 출원을 통해, 여러가지 출판물이 참고되었다. 이 출판물내 공개는 그 분야의 기술을 보다 충분히 서슬하기위해 참고로써 본원내 퉁합된다.
본 발명은 본 발명의 화합물 및 조성물의 제조를 나타내나 제한하지 않는 목적으로 제공되는 하기 실시예에 의해 한층 더 설명된다.
실시예 1
[12-D-아르기닌, 13-로이신]모틸린-(1-14)-펩티드 (돼지)
비스-트리프루오로아세테이트 염
H-Phe-Val-Pro-Ile-Phe-Thr-Tyr-Gly-Glu-Leu-Gln-D-Arg-Leu-Gln-OH.
Milligen Model 9050 펩티드 합성기를 이용하는 고체상 연속 흐름 기술에 의해 Fmoc-L-Gln (Mbh) PepSyn KA 수지(0.097mequiv/g) 2.0g 상에 폴리펩티드를 합성했다. Thr이 ODhbt 에스테르로 결합되는 것을 제외하고, 모든 잔기는 HOBt 존재하에 Fmoc 아미노산의 Pfp에스테르로서 결합시킨다. 측쇄 보호는 하기와 같았다: D-Arg (Mtr), Glu (OtBu), Tyr (tBu), 및 Thr (tBu). Gln은 비보호된 채로 방치했다. DMF내 4배몰 초과량의 Fmoc 아미노산 OPfp/HOBt를 결합을 위해 사용했다. 결합 효율은 카이저 테스트(Kaiser test)에 의해 관찰했다. 결합 시간은 1-4시간 법위였다. 각 결한 사이글 후, Fmoc-α-아미노 보호기의 제거는 DMF내 20% 피페리딘으로 완료했다. 합성 이후, 수지-결합 펩티드를 DOM으로 세척하고 진공하에서 밤새 건조시켰다. 수지로부터 펩티드의 분해 및 블록킹제거는 5% 티오아니솔, 3% 에탄디티올, 및 2% 아니솔(총 20ml)를 함유한 무수 TFA와 함께 8시간동안 실온에서 진탕시켜 수행했다. 그리고나서 분해 용액을 차가운 에테르 250ml에 적가하고 침전된 펩티드를 여과에 의해 수집하여 표제 펩티드 320mg (85%)을 흰색 분말로서 얻었다. 펩티드는 직렬의 두개 C-18 컬럼(250 × 20mm, 15μ, Vydac)을 사용하여 WatersDelta-Prep 3000 상 HPLC에 의한 3회 실행으로 (대표 하중 = 107mg/실행) 정제시켰다. 용매 시스템은 220nm에서 UV 관축으로 20ml/분에서 60% 아세토니트릴/40% TFA (0.1%)에 대한 30분 구배를 갖는 0.1% TFA였다. 각 분획의 순도는 분석 HPLC (30분 구배, 100% TFA (0.1%) 대 100% 아세토니트릴, 1ml/분, 214nm: Rt - 17.37 분) 및 모세관 구역 전기영동에 의해 평가했다. 순수한 분획 (>95%)을 모으고 동결 건조시켜 표제 폴리펩티드 107mg (28%)을 솜모양의 흰색 분말로 얻었다.
AAA: Thr 0.87(1), Glx 3.02(3), Gly 1.04(1), Val 1.02(1), Iie 0.92(1), Leu 2.14(2), Tyr 1.00(1), Phe 1.93(2), Arg 0.93(1), FAB-MS: (M+H)*계산치 1712, 실측치 1712.
실시예 2
[1-N-메틸페닐알라닌, 3-알라닌, 11-알라닌, 12-D-아르기닌, 13-로이신, 14-D-리신]모틸린-(1-14)-펩티드 아미드 (돼지)
트리스-트리플루오로아세테이트 염
(N-Me)-Phe-Val-Ala-Ile-Phe-Thr-Tyr-Gly-Glu-Leu-Ala-D-Arg-Leu-D-Lys-NH2.
Milligen Model 9050 펩티드 합성기를 이용하는 고체상 연속 흐름 기술에 의해 PAL 수지(0.27mequiv/g) 0.85g 상에 폴리펩티드를 합성했다. 수지를 유리구슬(산세척, 150 ∼212 미크론) 3,4g과 혼합하고, 연속 흐름 컬럼내로 건조-팩킹시키고, 사용하기 앞서 1시간동안 DMF로 팽윤시켰다. Fmoc-MePhe-OH를 DMF내 0.6M NMM 존재하에 BOP 및 HOBt (1:1:1)로 예비 활성화시켜 결합시켰다. Fmoc-MePhe-OH를HOBt 존재하에 그의 ODhbt 에스테르로 결합시켰다. 모든 다른 잔기는 HOBt 존재하에 Fmoc 아미노산의 Pfp에스테르로서 결합시켰다.
측쇄 보호는 하기와 같았다: D-Arg (Mtr), Glu (OtBu), Tyr (tBu), Thr (tBu). D-Lys (Boc), Gln (Trt). DMF내 4배몰 초과량의 Fmoc 아미노 유도체를 결합을 위해 사용했다. 결합 효율은 카이저 테스트에 의해 관찰했다. 대표적인 결합 시간은 1-4시간 범위였다. 각 결합 사이클 후, Fmoc-α-아미노 보호기의 제거는 DMF내 20% 피페리딘으로 완료했다. 합성 이후, 수지-결합 펩티드를 DCM으로 세척하고 진공하에서 밤새 건조시겼다. 수지로부터 펩티드의 분해 및 블록킹제거는 5% 티오아니솔, 3% 에탄디티올, 및 2% 아니솔(총 20ml)를 함유한 무수 TFA와 함께 8시간동안 실온에서 진탕시켜 수행했다. 그리고나서 분해 용액을 차가운 에테르 250ml에 적가하고 침전된 펩티드를 여과에 의해 수집하여 표제 펩티드 210mg (91%)을 흰색 분말로서 얻었다. 펩티드는 직렬의 두개 C-18 컬럼(250 × 20mm, 15μ, Vydac)을 사용하여 Waters Delta-Prep 3000 상 HPLC애 의한 3회 실행으로 (대표 하중 = 70mg/실행) 정제시켰다. 용매 시스템은 220nm에서 UV 관축으로 20ml/분에서 60% 아세토니트릴/40% TFA (0.1%)에 대한 30분 구배를 갖는 0.1% TFA였다. 각 분획의 순도는 분석 HPLC (30분 구배, 100% TFA (0.1%) 대 100% 아세토니트릴, 1ml/분, 214nm; Rt = 17.66 분) 및 모세관 구역 전기영동에 의해 평가했다. 순수한 분획 (>95%)을 모으고 동결 건조시켜 표제 폴리펩티드 82mg (36%)를 솜모양의 횐색 분말로 얻었다.
실시예 3
[1-N,N-디메틸페닐알라닌, 13-로이신]모틸린-(1-14)-펩티드 아미드 (돼지) 비스-트리플루오로아세테이트 염
(Me2N)-Phe-Val-Pro-Ile-Phe-Thr-Tyr-Gly-Glu-Leu-Gln-Arg-Leu-Gln-NH2.
Milligen Model 9050 펩티드 합성기를 이용하는 고체상 연속 흐름 기술에 의해 0.2m몰 규모로 NovaSynPR 500 수지 상에 폴리펩티드를 합성했다. Thr이 ODhbt에스테르로 결합되는 것을 제외하고, 모든 잔기는 HOBt 존재하에 Fmoc 아미노산의 Pfp에스테르로서 결합시켰다. 측쇄 보호는 하기와 같았다: Arg (Mtr), Gln (Trt), Glu (OtBu), Tyr (tBu), 및 Thr (tBu). DMF내 4배몰 초과량의 Fmoc 아미노산 OPfp/HOBt를 결합을 위해 사용했다. 결합 효율은 카이저 테스트에 의해 관찰했다. 결합 시간은 1-4시간 범위였다. 각 결합 사이클 후, Fmoc-α-아미노 보호기의 제어는 DMF내 20% 피페리딘으로 완료했다. 합성 이후, 수지-결합 펩티드를 DCM으로 세척하고 진공하에서 밤새 건조시켰다. 완전히 결합된 펩티드를 함유한 수지를 200ml NMP가 담긴 플라스크로 옮겼다. 상기 현탁액에, 37% 수성 포름알테히드 (300eq) 5ml, 나트륨 시아노보로히드라이드(10eq) 126mg 및 빙초산 200㎕를 연이어 첨가했다. 혼합물을 7시간동안 교반시켰다. 수지를 여과시키고 DMF (5 × 50ml), DCM (5 × 50ml)로 세척하고 진공하에 건조시켰다. 수지로부터 펩티드의 분해 및 블록킹 제거는 5% 티오아니솔, 3% 에탄디티올, 및 2% 아니솔(총 20ml)를 함유한 무수 TFA와 함께 8시간동안 실온에서 진탕시켜 수행했다. 그리고나서 분해 용액을 차가운 에테르 250ml에 적가하고 침전된 펩티드를 여과에 의해 수집하여 표제 펩티드를 흰색 분말로서 얻었다. 펩티드는 직렬의 두개 C-18 컬럼(250 x 20mm, 15μ, Vydac)을 사용하여 Waters Delta-Prep 3000 상 HPLC에 의한 3회 실행으로 (대표 하중 = 70mg/실행) 정제시켰다. 용매 시스템은 220nm에서 UV 관측으로 20ml/분에서 60% 아세토니트릴/40% TFA (0.1%)에 대한 30분 구배를 갖는 0.1% TFA였다. 순수한 분획 (>95%)을 모으고 동결 건조시켜 표제 폴리펩티드 111mg을 솜모양의 횐색 분말로 얻었다.
실시예 4
[1-N,N,N-트리메틸페닐알라닌, 13-로이신]모틸린-(1-14)-펩티드 (돼지)
비스-트리플루오로아세테이트 염
(Me3N+)-Phe-Val-Pro-Ile-Phe-Thr-Tyr-Gly-Glu-Leu-Gln-Arg-Leu-Gln-OH.
Milligen Model 9050 팹티드 합성기를 이용하는 고체상 연속 흐름 기술에 의해 0.2m몰 규모로 FMOC-L-Gln (Mbh) PepSyn KA 수지 상엔 폴리펩티드를 합성했다. Thr이 ODhbt 에스테르로 결합되는 것을 제외하고, 모든 잔기는 HOBt 존재하에 Fmoc아미노산의 Pfp 에스테르로서 결합시켰다. 측쇄 보호는 하기와 같았다: Arg (Mtr), Gln (Trt), Glu (OtBu), Tyr (tBu), 및 Thr (tBu). DMF내 4배몰 초과량의 Fmoc 아미노산 OPfp/HOBt를 결합을 위해 사용했다. 결합 효율은 카이저 테스트에 의해 관찰했다.
결합 시간은 1-4시간 범위였다. 각 결합 사이클 후, Fmoc-α-아미노 보호기의 제거는 DMF내 20% 피페리딘으로 완료했다. 합성 이후, 수지-결합 펩티트를 DCM으로 세척하고 진공하에서 밤새 건조시켰다. 완전히 결합된 펩티드를 함유한 수지를 NMP 20ml가 담긴 플라스크로 옮겼다. 상기 현탁액에, 요오드화 메틸(400eq) 5ml를 첨가하고, 뒤이어 탄산칼륨(18eq) 500mg을 첨가했다. 혼합물을 12시간동안 교반시켰다.
수지를 여과하고 DMF (5 × 50ml), 물 (5 × 50ml), DMF (5 × 50ml)로 세척하고 진공하에 건조시켰다. 수지로부터 펩티드의 분해 및 블록킹제거는 5% 티오아니솔, 3% 에탄디티올, 및 2% 아니솔(총 20ml)를 함유한 무수 TFA와 함께 8시간동안 실온에서 진탕시켜 수행했다. 그리고나서 분해 용액을 차가운 에테르 250ml에 적가하고 침전된 펩티드를 여과에 의해 수집하여 표제 펩티드를 흰색 분말로서 얻었다. 펩티드는 직렬의 두개 C-18 컬럼(250 × 20mm, 15μ, Vydac)을 사용하여 Waters Delta-Prep 3000 상 HPLC에 의한 3회 실행으로 (대표 하중 - 70mg/실행) 정제시켰다. 용매 시스템은 220nm에서 UV 관측으로 20ml/분에서 60% 아세토니트릴/40% TFA(0.1%)에 대한 30분 구배를 갖는 0.1% TFA였다. 순수한 분획(>95%)을 모으고 동결건조시켜 표제 폴리펩티드 71mg을 솜모양의 흰색 분말로 얻었다.
실시예 5
2% 돼지 신장 균등질로 시험관내 안정성 검사
대부분의 작은 선형 폴리펩티드와 같이, 모틸린은 신장의 쇄자연세포에 의해 대사되는 것으로 여겨진다. 그러므로, 신장 균등질을 본 발명 펩티트의 상대적 생체내 생물안정성 평가를 위한 모델 시스템으로 선택했다. 조사할 모든 펩티드를 25℃에서 돼지 신장내 (알칸사스주 로저스시, Pel Freeze, Inc.)(2% 중량/부피, 최종 부피 = 4ml: 완충재 = HEPES pH 7.0) 항온처리했다. 초기 기질 농도 및 내부 표준(Fmoc-Gly) 농도는 모두 0.5mg/ml였다. 적합한 항온 처리 신간 및 샘플링 간격을 결정하기 위해, 2회의 실험을 각각의 폴리펩티드와 함께 수행했다. 첫번째 실행은 펩티든 안정성의 대략적 평가를 위해서였다. 모든 샘플링은 중복하여 수행했다. 샘플 부피는 180㎕ 였다.
샘플 세정은 100% TCA 20㎕를 (최종 부피 = 200㎕; 최종 TCA 농도 = 10%) 첨가하여 수행했다. 샘플의 평행을 확실히 하기 위해 5-10초동안 맴들이 시키고나서, 원심분리시켜 침전 단백질을 분리해냈다. 분석은 WISP 자동주입기, 5μ Vydac C-18 분석 컬럼, 및 214nm에 조정된 Waters 481 UV 관측기를 갖춘 Waters HPLC 시스템상에서 수행했다. 주입 부피는 80㎕였다. 초기 용매 조건은 1ml/분에서 63% 아세토니트릴/37% (0.1%) TFA에 대해 실행하는 35분 구배를 갖는 Milli-Q 물내 80% 아세토니트릴/20%(0.1%) TFA였다.
폴리펩티드 기질 및 대사산물 피크를 내부 표준에 대한 비율로 구하고 중복 실험 샘플 비율을 평균했다. 펩티드 기질에 대한 평균 비율을 백분율로 나타내고 시간에 대해 플롯팅했다. 데이타 처리를 위해 1차 반응으로 가정했다. 기질 소멸 속도는 Enzfiter program (Biosoft)을 사용하여 계산했다. 상대 반감기는 하기 관계식으로부터 결정했다.
t½ = 0.693/K
실시예 6
모틸린 수용기 결합 친화력의 결정
본 발명 펩티드의 모틸린 수용기 결합 친화력을 Bormans, Peeters 및 Vantrappen, Regul. Pept., 15, 143-153 (1986)의 일반적인 방법을 사용함으로써 결정했다. 토끼 동 평활근 막에 결합된 [125I - Tyr7, Nle13] 모틸린(돼지)를 치환하는 펩티드의 능력은 10-11-10-4M범위의 농도에서 각회 중복하여 2회 검사함으로써 결정했다. 라벨의 50%를 치환하는 농도(IC50)는 치환을 서술하는 방정식에 데이타를 대입하여 결정하고, 라벨링된 모틸린 및 라벨링안된 모틸린과 동등한 친화력으로 그리고 비-조합적으로 결합한 모틸린 수용기의 한 부류를 추정했다. 대입은 SAS-소프트웨어 팩키지(미합중국, 노오쓰캐롤라이나주, 캐리시 SAS Institute. Inc.,)의반복 최소자승법을 사용하여 수행했다. 많은 일련의 대조표준 실험으로부터 모틸린 자체의 분해상수를 0.75nM (pkd = 9.12)로 계산했으며, 상기 값을 모든 계산에 사용했다. 라벨의 50%를 치환하는 농도는 -log (pIC50)를 사용하여 나타낸다.
실시예 7
토끼 십이지장 평활근 스트립 조직 배쓰 분석
토끼 십이지장 체절의 수축 반응을 Depoortere 일동, J. Gastrointestinal Motility, 1, 150-159 (1989)의 방법에 따라 조직 배쓰내에서 등장으로 결정했다. 실험 계획은 하기로 구성되었다: 1시간의 평형 기간: 10-4M 아세틸콜린으로 공격한 후 뒤이어 세척하는 단계; 완료시 10-7M 모틸린을 첨가하여 화합물의 누적 사용량-반응 곡선 작성; 그리고 최종적으로 10-4M 아세틸콜린으로 공격. 만일 10-4M 아세틸콜린에 대한 최종 반응이 초기 반응과 5% 이상 다르다면, 결과를 제외시켰다. 화합물은 10-11- 10-4M 범위의 농도내에서 검사했다. 모틸린에 대한 최고 반응(Emax)의 50%에 해당하는 점은 모든 데이타 점들을 방정식 E = Emax(1 + EC50/[L])에 대입하여 결정했다. 약한 활성 화합물의 경우 10-7M 모틸린에 대한 반응 90%를 Emax로 사용했다. 반응의 50%를 산출하는 사용량은 -log (pEC50)을 사용하여 나타낸다.
실시예 8
개의 위장 도내 수축 활성
잡종 개를 성에 관계없이 나트륨 펜토바르비탈 65mg/kg 정맥주사로 마취시켰다. 복부에 중앙선 절개를 시술했다. 십이지장 체절을 찾아, 그 체절에 대한 말단 동맥을 확인하고, 적당한 크기의 가장 근접한 가능한 동맥의 지방 및 근막을 문질러 닦아내었다. 적합한 직경의 바늘을 일정 각도로 휘어 끝을 깨끗한 동맥내로 삽입했다. 바늘을 혈관 경련이 안정될 때까지 대략 30초동안 동맥내 위치에 유지하고나서, 카테테르 어셈블리를 동맥내로 삽입하여 000 실크 봉합사로 위치내에 묶는다. 가는 폴리에틸렌 카테테르(10 - 15cm)를 한 끝을 한점으로 자르고 다른 끝에는 바늘을 삽입했다. 바늘의 중심에 3-방 스톱콕크를 설치하고 카테테르 어셈블리를 글루코오즈 10mM을 함유한 헤파린화 크렙스 린저(Krebs Ringer) 중탄산염으로 채웠다. 크렙스 환약(공기 없음)을 동맥 카테테르에 주입하고 체절 내 표백의 분포를 표시했다. 만일 면적이 너무 넓다면, 측부 동맥은 면적에로의 순환이 보존되는 한 묶어버릴 수 있다. 그리고나서 바스형 스트레인 게이지를 장막에 붕합하고, 순환근 수축이 Beckman R611 디노그래프(dynograph) 상에 기록될 수 있도록 배치했다. 은 와이어 전지를 스트레인 게이지 양쪽상에 장막하조직으로 삽입하고 자극 단리 유닛을 통해 Grass S88 전기 자극기에 연결했다. 전기장 자극을 40V 0.5ms 및 5pps에서 적용하고 펜 기록기의 진폭은 수축 반응을 포함하도록 조정했다.
주입되는 모든 펩티드는 크랩스에 용해시키고 일련의 희석액을 제조하여 임의의 농도에 있어서 주입되는 부피가 1ml이도록 했다. 재료 크랩스를 제외한 모든 용액을 실험 당일 동안 얼음상에 유지하고 당일의 말엽에 제거했다. 사용량 - 반응곡선의 결정을 위해, 먼저 헤파린화 크렙스 대략 1ml의 환약을 부위에 주입하여 흥분 대조군을 얻었다. 펩티드 아고니스트(크렙스 1ml로 흥분시킨 부피 1ml내)를 진폭내 최고 반응이 얻어질 때까지 로그 증가분으로 주입했다. 그리고나서 주입 부위를 0.1% BSA를 함유한 크렙스로 흥분시켜 동맥선내 잔류한 임의의 펩티드를 치환했다. 모틸린 수용기에서 작용하는 펩티드의 경우, 최고 극대 사용량을 주입하지 않도륵 주의를 기울였으며, 이는 상기가 과내성을 유도하기 때문이다. 그러므로, 반응이 명백해감에 따라, 0.3 또는 0.5log 단위 증가분을 사용했다. 한 부위는 단지 ½ - 1시간에 1회 사용량-반응 결정을 위해 사용했다.
각 부위에서 영역 자극에 대한 검정 반응의 진폭을 측정하고 그 부위에 대해 100%로서 사용했다. 각 사용량의 아고니스트에 대한 반응의 진푹을 결정하고, 검정 반응의 %로서 계산하고 농도에 대해 플룻팅했다. 반응의 ED50은 검정 반응의 50%였던 반응을 생성하는데 요구되는 아고니스트의 양을 나타낸다. 상기는 반응의 효율및 효력 모드를 반영하고 실제로 상기를 명확히 구분하지 않는다.
* ED50은 나노몰로 나타낸다.
본 발명의 많은 구체예가 제시되었지만, 기본 구성이 변형되어 발명의 사상 및 범위를 벗어남 없이 본 발명을 이용하는 다른 구체예를 제공할 수 있다. 그러한 변형 및 개조는 모두 실시예의 방식으로 나타낸 특정 구체예 보다는 첨부된 청구 범위에 정의된 발명의 범위내 포함되도록 의도된다.

Claims (8)

  1. 광학적으로 활성인 이성질체 형태 및 그의 제약학적으로 허용가능한 산 부가염 포함하는 하기 일반식에 의해 표현되는 위장 운동 자극 활성을 가지는 폴리펩티드.
    A는 친유성 지방족 아미노산의 L-입체이성질체이고;
    B는 L-프롤린 또는 L-알라닌이고;
    D는 친유성 지방족 아미노산의 L-입체이성질체이고;
    E는 방향족, 친유성 지방족, 또는 지환식 아미노산의 L-입체이성질체이고;
    F는 방향족 또는 헤테로방향족 아미노산의 L-입체이성질체이고;
    G는 글리신 또는 D-알라닌이고;
    H는 L-글루타민산 또는 L-글루타민이고;
    I는 L-글루타민, L-글루타민산, 또는 L-알라닌이고,
    J는 I와 기 -NH- 사이의 직결합이거나, Z, Z-Leu, Z-Leu-Gln, Z-Leu-Gln-Glu, Z-Leu-Gln-Glu-Lys, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys, 및 Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly로 구성되는 군으로부터 선택되고, 이때 Z는 D-아르기닌, D-호모아르기닌, D-리신, D-오르니틴, D-2,4-디아미노부티르산, D-글루타민, D-아스파라긴, 및 D-알라닌으로 구성되는 군으로부터 선택되고;
    R1은 저급-알킬 또는 알릴이고;
    R2는 수소, 저급-알킬, 프로파르길 및 알릴로 구성되는 군으로부터 선택되고;
    R 3 는 수소, 저급-알킬 및 알릴로 구성되는 군으로부터 선택되고;
    R 4 는 시클로헥실, 페닐, p-플루오로페닐, p-클로로페닐, p-브로모페닐, p-요오도페닐, p-히드록시페닐, p-메톡시페닐, 1-나프틸, 및 2-나프틸로 구성되는 군으로부터 선택되며;
    R5는 1-3 개의 탄소 원자를 함유하는 아미노알킬기 및 2 또는 3 개의 탄소원자를 함유하는 구아니디노알킬기로 구성되는 군으로부터 선택되거나, 또는 J가 Z-Leu 또는 Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly인 때에는 -CH2CONH2이며;
    R6은 -COOH 또는 -CONH2이며;
    부호 *는 D 또는 L 배치로 존재할 수 있는 비대칭 탄소 원자를 나타내고, 각 저급-알킬기는 1-4 개의 탄소 원자를 함유하는 것이다.
  2. 제 1 항에 있어서, (R1)(R2)(R3)N-*CH(CH2R4)CO-가 L-페닐알라닌, D-페닐알라닌, L-시클로헥실알라닌, 및 D-시클로헥실알라닌으로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드.
  3. 제 1 항에 있어서, A가 L-발린, L-이소로이신, L-로이신, L-노르발린, 및 L-노르로이신으로 구성되는 군으로부티 선택되는 폴리펩티드.
  4. 제 1 항에 있어서, D가 L-이소로이신, L-발린, L-로이신, L-노르발린 및 L-노르로이신으로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드.
  5. 제 1 항에 있어서, E가 페닐알라닌, p-플루오로페닐알라닌, p-클로로페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-요오도페닐알라닌, 티로신, p-메톡시페닐알라닌, 1-나프틸알라닌, 2-나프틸알라닌, 로이신, 및 시클로헥실알라닌으로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드.
  6. 제 1 항에 있어서, F가 티로신, 페닐알라닌, p-메톡시페닐알라닌, 히스티딘, 트립토판, β-2-티에닐알라닌, 및 β-3-피리딜알라닌으로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드.
  7. 제 1 항에 있어서, J가 I와 기 -NH- 사이의 직결합이거나, Z-Leu, Z-Leu-Gln-Glu, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu, Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn, 및 Z-Leu-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly로 구성되는 군으로부터 선택되고, Z가 D-아르기닌 및 D-글루타민으로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드.
  8. 제 1 항에 있어서, -NH -*CH(CH2R5)R6기는 D-아르기닌, 리신, D-리신, 글루타민, D-글루타민, D-오르니틴, D-2,4-디아미노부티르산, 및 D-호모아르기닌으로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드.
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