JP2988857B2

JP2988857B2 - 免疫賦活剤

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Publication number: JP2988857B2
Application number: JP7191542A
Authority: JP
Inventors: 昭夫加藤
Original assignee: SHINKYO SANGYO KK
Current assignee: SHINKYO SANGYO KK
Priority date: 1995-07-27
Filing date: 1995-07-27
Publication date: 1999-12-13
Anticipated expiration: 2015-07-27
Also published as: JPH0940696A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、医薬、機能性食品
として、さらには獣医薬、餌飼料等として有用な免疫賦
活剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】免疫学の進歩により、ヒトおよび動物の
種々の疾患や感染症が免疫機能の低下または免疫機能の
不全が原因と考えられるようになり、近年、疾患や感染
症の予防、治療のために免疫機能を増強する試みが種々
なされている。かかる試みの１つにマクロファージを活
性化させる様々な物質を用いて免疫機能を増強すること
が検討されている。マクロファージは食細胞の１種で、
生体防御機構を基本から支える役目を果たしており、特
に、異物の生体への侵入に際して貧食作用により異物を
細胞に取り込み、消化して排除する働きをする。また、
マクロファージは、消化した異物のペプチドを細胞表面
に発現させてリンパ球に提示する機能を有している。さ
らに、マクロファージは、活性化することにより、癌細
胞に対する傷害性の獲得や、インターロイキン−１等の
各種サイトカイン類の放出によるリンパ球の活性化に関
与するなど、深く免疫系に関与していることが知られて
いる。したがって、マクロファージを活性化することに
より、免疫力の増強による生体防御作用の亢進、癌に対
する延命効果、様々な疾病の予防および治療等の可能性
が考えられる。

【０００３】マクロファージを活性化させる物質として
は、従来から、食細胞の活性化状態を引き起こす物質で
ある生物学的応答調節剤（biological response modi
fiers：ＢＲＭ）がある。細菌菌体やその成分、真菌由
来の多糖もマクロファージ活性化物質であり、臨床的に
も用いられている。食品由来の成分としては、β−１,
３−グルカン、ウロン酸、キチン等の糖類、レクチンな
どのタンパク質、リン脂質や過酸化脂質などの脂質など
が知られている（食品と生体防御、村上浩紀・上野川修
一編集、講談社サイエンティフィック、１２６〜１３７
頁）。微生物由来のリポ多糖（ＬＰＳ）、海藻由来の硫
酸化多糖がマクロファージを活性化することがも知られ
ている（化学と生物、Vol．３３，No．３，pp１４１〜
１４３，１９９５）。また、特開平２−６５７９０号に
はケフィア粒、特開平２−１７４７１８号にはイソマル
トオリゴ糖、特開平２−２３７９３４号には水溶性リグ
ニン、特開平３−１３５９１８号には核酸構成成分、特
開平３−２５１５３７号には卵白やその酵素処理物、特
開平３−２８４６２６号にはアマノリ属抽出物、特開平
４−２２９１８９号には大豆タンパク質、特開平５−２
０１８６４号にはリボフラビンをマクロファージ活性化
物質として用いる免疫機能の増強が開示されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、産業的
に未利用な可食性原料から有用物質を生産し、その利用
を図る検討の一環として、食品成分として消化吸収され
難い、動物や鳥類の卵由来のムチンや、卵の卵黄膜、カ
ラザの利用を検討する間に、これらを酵素処理すること
により得られる可溶性の物質、特に、硫酸化糖ペプチ
ド、とりわけ、硫酸化糖鎖部分に高いマクロファージ活
性化作用があり、それを用いることにより優れた作用を
有する免疫賦活剤が得られることを見いだし、本発明を
完成するに至った。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、硫酸化糖ペプ
チドまたはその硫酸化糖鎖部分を有効成分とする免疫賦
活剤を提供するものである。本発明においては、硫酸化
糖ペプチドまたはその硫酸化糖鎖部分は、通常、ムチン
の可溶性加水分解物、ことにプロテアーゼ分解物または
そのアルカリ加水分解物として用いられ、ムチンは動物
の粘膜組織、鳥類の卵、ことに、オボムチン（濃厚卵
白）から由来のものが使用される。また、硫酸化糖ペプ
チドまたはその硫酸化糖鎖部分は、卵のカラザまたは卵
黄膜の可溶性加水分解物としても用いられる。本発明の
有効成分は可食性の原料由来であり、安全であると共
に、ことに、Ｏ型糖鎖を多く持つ硫酸化糖ペプチドには
強いマクロファージ活性化能が見られ、マクロファージ
活性化能を有することが知られている他の食品由来成分
に比べ、著しく低濃度下でも活性を示し、優れた免疫賦
活剤となる。

【０００６】ムチンは、生体の分泌するムチン型糖蛋白
を構成成分とする粘性の高い透明な液体である。また、
卵のカラザや卵黄膜もムチン型糖蛋白を構成成分とす
る。ムチン型糖蛋白はアルカリに可溶であるが、水に難
解な糖蛋白で、本発明に従い、これをプロテアーゼ等で
処理して可溶化することによって、得られる硫酸化糖ペ
プチドに、マクロファージ活性化作用があり、それを免
疫賦活剤として利用できる。また、この処理物をさらに
アルカリ処理して得られる該ペプチドの硫酸化糖鎖部分
は、ことにマクロファージ活性化作用が高く、これも免
疫賦活剤として利用できる。ムチンや、卵のカラザ、卵
黄膜がムチン型糖蛋白を構成成分としていること、硫酸
化糖ペプチドを含んでいることは公知であるが、硫酸化
糖ペプチド、ことに、その硫酸化糖鎖部分にマクロファ
ージ活性化作用のあることは知られていない。また、上
記した特開平３−２５１５３７号には、生卵白、全卵
末、卵白末あるいは消化酵素で処理した画分や卵白を構
成する成分のマクロファージ活性化作用が開示されてい
るが、硫酸化糖ペプチドについては、何ら示唆されてい
ない。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明の免疫賦活剤の有効成分で
ある硫酸化糖ペプチドを得るのに用いるムチンの由来は
特に限定するものではなく、動物、例えば、ウシ、ウ
マ、ブタなどのの粘膜組織、例えば、胃、腸、顎下腺、
内臓器官など、あるいは鳥類、例えば、鶏、ウズラ、家
鴨、アヒル、七面鳥などの卵由来のムチンが使用され
る。卵は、全卵、卵白いずれでもよく、卵白中の濃厚卵
白にはオボムチンが多量に含まれているので、これを集
めて使用することも可能である。また、卵のカラザや卵
黄膜は、例えば、鶏卵の工業的処理に際して未利用成分
として分離されるが、これらはムチン型糖蛋白を構成成
分とするものであり、本発明における硫酸化糖ペプチド
の原料とすることができる。硫酸化糖ペプチドのマクロ
ファージ活性化作用はその硫酸基含量の多い方が作用が
強いので、硫酸基含量の多いカラザや卵黄膜由来の方が
ムチンよりも望ましい。

【０００８】本発明においては、ムチンやカラザ、卵黄
膜を加水分解処理して可溶化する。加水分解は、蛋白分
解酵素、プロテアーゼで処理することにより行うことが
できる。。用いるプロテアーゼは、植物起源（例、パパ
イン、ブロメライン）、動物起源（例、パンクレアチ
ン）、微生物（カビ、細菌、酵母等）起源（例、プロナ
ーゼ、サブチリシン）のいずれでもよい。これらプロテ
アーゼを単独で、または２種以上を使用することができ
る。酵素の使用条件は酵素の性質に適した条件が選択さ
れる。例えば、適当な緩衝液中で、酵素の至適pＨ、例
えば、プロナーゼの場合、pＨ８.０程度に保持し、基質
に対して０.５〜１.０％の酵素濃度で２０〜４０℃にて
２４〜４８時間インキュベートすることにより加水分解
する。また、蛋白分解酵素と同様な効果を与える、酸や
アルカリによる加水分解も有効である。例えば、塩酸、
硫酸のような酸、水酸化ナトリウムのようなアルカリを
０.１〜1.０Ｍの濃度で用い、２０〜５０℃にて、６〜
１２時間加水分解することにより、所望の加水分解分解
物が得られる。

【０００９】所望により、得られた加水分解物をさらに
アルカリ加水分解処理に付し、硫酸化糖ペプチドの糖鎖
部分を収集して、単独で、あるいは硫酸化糖ペプチドと
共に有効成分として用いてもよい。アルカリ処理も特に
限定するものではなく、糖鎖を遊離できる処理であれば
いずれでもよい。例えば、水酸化ナトリウム、水素化ホ
ウ素ナトリウムのアルカリで２０〜５０℃にて６〜１２
時間加水分解処理することにより、硫酸化糖鎖を遊離さ
せることができる。上記の加水分解物あるいは遊離した
硫酸化糖鎖部分は、透析、濾過、イオン交換樹脂による
処理等の公知の方法により分離、精製することができ
る。

【００１０】さらに、上記の加水分解物およびそのアル
カリ処理物を原料にして、化学的処理や酵素的処理を施
すことにより活性を向上させた誘導体とすることもでき
る。例えば、糖鎖にさらに硫酸基を導入したり、ムチン
型硫酸化糖ペプチドと、他の活性成分、例えば、多糖
類、コラーゲン等の高分子物質とを結合させることが挙
げられる。かかる誘導体も本発明の硫酸化糖ペプチドま
たはその糖鎖部分に包含されるものする。

【００１１】加水分解物、アルカリ処理物および／また
はこれらの誘導体はそのまま、または自体公知の方法で
各種の形態にして、免疫賦活用の医薬、健康食品、機能
性食品、獣医薬、餌飼料等として、さらにはそれ自体試
薬として利用できる。例えば、通常の製剤化方法により
経口用の錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤
として提供される。製剤化のために賦形剤、結合剤、崩
壊剤、滑沢剤、緩衝剤、矯味剤、安定剤等を必要に応じ
て添加することもできる。また、畜産、水産等の分野に
おける餌飼料に直接添加することも、単独あるいは他の
資材と混合して利用することもできる。本発明の有効成
分は、特に限定するものではないが、通常、成人１日当
たり硫酸基量として１mg〜１,０００mg、好ましくは１
０〜１００mgを経口摂取することにより、何らの副作用
もなく、所望の免疫賦活効果が発揮できる。

【００１２】

【実施例】つぎに実施例および試験例を挙げて本発明を
さらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるも
のではない。実施例１卵のムチン（オボムチン）、カラザおよび卵黄膜の乾燥
試料各１gを０.０５Ｍトリス塩酸緩衝液（pＨ８.０、
０.０２％アザイド入り）２０mlに溶解し、プロナーゼ
４mgを添加する。３０℃にて４８時間インキュベートし
た。８０〜１００℃で２０分間煮沸し、酵素を失活させ
てムチン、カラザおよび卵黄膜のプロテアーゼ分解物を
得た。得られたプロテアーゼ分解物は透析により低分子
物質を除去し、透析内液をゲル濾過して高分子画分を集
めて免疫賦活剤として用いた。実施例２実施例１と同様にして調製したオボムチン、カラザおよ
び卵黄膜の溶液をpＨ７.０に調整して、パパイン４mg、
０.０１Ｍシステイン、０.００２Ｍ−ＥＤＴＡを添加し
た。３０℃にて４８時間インキュベートした。実施例１
と同様に精製して免疫賦活剤として用いた。

【００１３】実施例３実施例１および２で得られたプロテアーゼ分解物をさら
にアルカリ処理した。ペプチドのセリンまたはスレオニ
ンにＯ−グルコシル結合した糖鎖は０.１Ｎ水酸化ナト
リウム、０.５Ｍ水素化ホウ素ナトリウム（ＮaＢＨ₄）
の存在下で切断した。このアルカリ処理を行った後、透
析しその外液をイオン交換樹脂によって精製した。硫酸
化糖ペプチドをアルカリで処理することによりペプチド
部分に結合している硫酸化糖鎖を遊離させた。確認され
た硫酸化糖鎖の遊離の１例は、反応式１：

【００１４】

【化１】

【００１５】で示され、該糖鎖はシアル酸、ガラクトー
ス、Ｎ−アセチルガラクトサミンよりなることが判明し
た。この糖鎖部分を免疫賦活剤として用いた。実施例１
〜３で得られた硫酸化糖ペプチドおよび硫酸化糖鎖の化
学成分の平均を表１に示す。

【００１６】

【表１】

【００１７】試験例１実施例１〜３で得られたペプチドおよび糖鎖部分、ブタ
胃ムチンから実施例１と同様にして得られたペプチドを
試料として、そのマクロファージ活性化能を以下のとお
り比較した。マクロファージ細胞は活性化されると増殖
を停止し、分化し、形態変化を生じ、活性酸素やインタ
ーロイキン−１（ＩＬ−１）の放出を促進するため、こ
れらを指標として活性化を調べた。培養マクロファージ
細胞（Ｊ７７４.１）に試料を加え、細胞の活性化によ
る形態変化と細胞の増殖、過酸化水素放出により活性化
の程度を検定した。（１）マクロファージに対する効果（細胞増殖、分化
の測定）マウス由来マクロファージ細胞（Ｊ７７４.１セルライ
ン）を、５％ＦＢＳ（牛胎児血清）を加えた培地（Ｈa
m's Ｆ１２ medium、ストレプトマイシン１００μg／
ml、ペニシリンＧ１００単位／ml、炭酸水素ナトリウ
ム１.１７６g／リットル）にて、試料（１００μg／m
l）を添加し、３７℃、５％炭酸ガスインキュベータに
て培養した。その後、２４時間毎に７日目まで細胞数と
形態変化を測定し、形態変化した細胞の割合を顕微鏡観
察から計算した。細胞数は以下のニュートラルレッド法
あるいは直接計測によって調べた。対照として、試料無
添加および試料の代わりＬＰＳ（１０μg／ml）を添加
して同様に試験した。

【００１８】（２）ニュートラルレッド法９６穴プレートに細胞（Ａ３７５Ｓ２：１０,０００個
／ml）、牛胎児血清（ＦＢＳ、最終１０％）、試料（Ｊ
７７４.１細胞上清）を加え、合計１００μlで３日間培
養した。ニュートラルレッド（０.０５％溶液）を５０
μlずつ添加し、４時間インキュベートした。プレート
中の溶液を捨て、ＰＢＳ（−）液で洗浄した。５０％エ
タノール溶液（０.０５Ｍのリン酸２ナトリウム含有）
を１００μlずつ加え、色素を抽出する。ＯＤ５４０の
測定にて生細胞を測定し、Ｊ７７４.１細胞中のインタ
ーロイキン−１を算出した。 (３) グルコース消費量測定グルコース消費量測定は過酸化水素アッセイ試験（食品
と生体防御、村上浩紀、上野川修一、前出）により以下
のように行った。３５mmシャーレにて、Ｊ７７４.１細
胞を、上記したように、試料、ＦＢＳを加えて４８時間
培養した。予め、温めたフェノールレッド液１mlを添加
し、３０分インキュベートした。上清に１Ｎ水酸化ナト
リウム１０μlを加え、ＯＤ６１０の吸光測定を行い、
過酸化水素量を算出した。

【００１９】(４) インターロイキン−１アッセイインターロイキン−１アッセイ用細胞(Ａ３７５Ｓ２セ
ルライン)とＭＥＭ培地を用いる方法(Ｂiochem．Ｂioph
ys．Ｒes．Ｃomm．１５４:１１８９−１１９６(1988))
により行った。上記と同様に、Ｊ７７４.１細胞に試料
を添加し、２４時間および４８時間培養し、その上清を
分取した。この上清を用いてインターロイキン−１アッ
セイ用細胞(最終１×１０,０００個／ml)を３日間培養
し、ニュートラルレッド法にて細胞数を測定した。結果
を表２および表３に示す。

【００２０】

【表２】

【００２１】

【表３】

【００２２】表２から明らかなごとく、ムチン、カラ
ザ、卵黄膜、ブタ胃ムチンのプロテアーゼ分解物中の硫
酸化糖ペプチドは高いマクロファージ活性化能を示す。
また、このマクロファージ活性化能はＮ−アセチルヘキ
ソサミン中の硫酸基が多いほど活性が高い(表１参照)。
さらに、表３に示すごとく、アルカリ処理により、ペプ
チドと糖鎖を分けマクロファージ活性化能を比較する
と、マクロファージ活性化能は硫酸化糖鎖に強く現れ、
糖鎖部分がこのマクロファージ活性化に必須であること
が判明した。

【００２３】

【発明の効果】以上のごとく、本発明によれば、可食性
の産業的に未利用の原料から得られる、優れたマクロフ
ァージ活性化作用を有する、医薬、食品、獣医薬、餌飼
料等として有用な免疫賦活剤が提供できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 35/24 Ａ６１Ｋ 35/24 35/54 35/54 38/00 Ｃ０７Ｋ 9/00 Ｃ０７Ｋ 9/00 14/465 14/465 Ａ６１Ｋ 37/02 37/18 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 14/435 A23K 1/16 304 A23L 1/30 A61K 35/24 A61K 35/54 A61K 38/00 C07K 9/00 C07K 14/465

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ムチンの可溶性加水分解物、および鳥類
の卵のカラザまたは卵黄膜の可溶性加水分解物からなる
群から選ばれる硫酸化糖ペプチドまたはその硫酸化糖鎖
部分を有効成分とする免疫賦活剤。
【請求項２】硫酸化糖ペプチドまたはその硫酸化糖鎖
部分が、ムチンの可溶性加水分解物である請求項１記載
の免疫賦活剤。
【請求項３】硫酸化糖ペプチドまたはその硫酸化糖鎖
部分が、ムチンのプロテアーゼ分解物またはそのアルカ
リ加水分解物である請求項２記載の免疫賦活剤。
【請求項４】ムチンが動物の粘膜組織由来のものであ
る請求項２記載の免疫賦活剤。
【請求項５】ムチンが鳥類の卵由来のものである請求
項２記載の免疫賦活剤。
【請求項６】ムチンがオボムチンである請求項５記載
の免疫賦活剤。
【請求項７】硫酸化糖ペプチドまたはその硫酸化糖鎖
部分が鳥類の卵のカラザまたは卵黄膜の可溶性加水分解
物である請求項１記載の免疫賦活剤。
【請求項８】硫酸化糖ペプチドまたはその硫酸化糖鎖
部分がカラザまたは卵黄膜のプロテアーゼ分解物または
そのアルカリ加水分解物である請求項７記載の免疫賦活
剤。