CN114868843B - 一种无菌幼鼠专用人工乳及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种无菌幼鼠专用人工乳及制备方法，以驴奶、蛋黄蛋白多肽、小鼠血清、水果浆液、维生素A、维生素D、维生素E、海藻、无菌水为原料制备无菌幼鼠专用人工乳，取消牛奶、氨基酸、维生素等单独添加的成分，添加驴奶、蛋黄蛋白多肽、水果浆液、海藻等物质，各物质之间相互作用，显著促进幼鼠发育、生长，能激发免疫蛋白的产生，消除不利幼鼠的物质，具有提高免疫力，增强蛋白质的作用，增加幼鼠的成活率、减少腹泻、胀气等问题。
Description
技术领域
本发明涉及动物人工饲养技术领域，尤其涉及一种无菌幼鼠专用人工乳及其制备方法。
背景技术
无菌鼠是指无细菌、病毒、真菌、原生动物和其他腐生或寄生相关生命形式的鼠(大鼠或小鼠)。这类鼠是在无菌条件下人工剖宫产获得的子代鼠，再放在无菌隔离系统内用人工喂乳或无菌“奶妈”鼠代乳饲育而成，其无菌性可通过需氧、厌氧粪便培养及粪便样品聚合酶链式反应。
无菌鼠由于其自身的特殊性，可用于制造人源化小鼠或被移植特定肠道菌群，在进行特定肠道菌群特性研究、肠道菌群作用机制研究。
无菌大鼠在培育过程中，由于肠道菌群的缺失，乳鼠在喂奶后往往出现消化不良，吸收障碍，腹泻、腹部胀气进而腹部发黑，相继死亡，这一过程是造成无菌大鼠培育失败的主要原因之一。配方奶中蛋白质为大分子颗粒，对于幼鼠的吸收很困难，在胃肠微生物缺失的环境下，更易出现各种消化问题。另外在肠道中，由于乳糖酶的缺少会产生乳糖不耐，进而产气。
已有的人工乳配方在饲养乳鼠时，常有消化不良，胀气现象发生，且成本高，不易于推广应用。
CN108713636A公开了一种无菌大小鼠人工乳及其制备方法，属于动物人工饲养用乳制品技术领域。所述无菌大小鼠人工乳，以100mL计，由如下原料制成：婴儿配方奶粉8-9g、磷酸氢二钠1.2-1.3g、磷酸二氢钾0.1-0.15g、维生素复合物2.5-3.5g、兔乳18-22mL、余量为双蒸水。本发明还公开了上述无菌大小鼠人工乳的制备方法。本发明的无菌大小鼠人工乳，原料组成简单，材料易得，适口性好，能满足无菌大小鼠幼仔的营养需求，动物体重增加明显，人工哺乳的成活率提高。但是小鼠存活率有待进一步提高。
发明内容
为实现上述目的，本发明提供了一种无菌幼鼠专用人工乳及其制备方法。
一种无菌幼鼠专用人工乳，包括以下原料，以100mL计：
所述水果浆液的制备方法，包括以下步骤：将水果进行清洗、去皮、去核，然后将经处理的水果加入水中进行榨汁，过100-200目筛取滤液，得到水果浆液；
所述水果与水的浴比为1g：(5-10)mL；
所述水果为桃子、李子、苹果中的一种或两种以上混合物。优选的，所述水果由桃子、李子、苹果按质量比(1-3)：(1-3)：(1-3)混合而成。
所述海藻为海藻粉末，海藻粉末的粒径为300-400目；
所述蛋黄蛋白多肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、将鸡蛋蛋黄加入混合溶剂中在室温下萃取1-4h，用冷冻离心机将固液分离，固体冷冻干燥，溶剂回收。将干燥后的固体磨碎，加入水搅拌均匀，冷冻离心机分离固液，取上清液，冷冻干燥，得到蛋黄蛋白；
S2、将蛋黄蛋白粉碎过80-100目筛，得到蛋黄蛋白粉末；将蛋黄蛋白粉末加入水中混合均匀并浸泡1h，再加入酶制剂，加热至40-50℃酶解1-5h，最后加热至100℃灭酶10-30min，冷却至室温后，过滤取上清液，浓缩、冷冻干燥，得到蛋黄蛋白多肽。
步骤S1中所述的混合溶剂由无水乙醇、正己烷按质量比(1-2)：(1-2)混合而成；
步骤S1中所述鸡蛋蛋黄与混合溶剂的浴比为1g：(10-30)mL；
步骤S1中所述干燥后的固体与水的浴比为1g：(10-30)mL；
步骤S2中所述蛋黄蛋白粉末、水的浴比为1g：(20-50)mL；
所述酶制剂为碱性蛋白酶、脂肪酶中的一种或两种以上混合物。
所述酶制剂的用量为蛋黄蛋白粉末质量的2-5％。
驴奶中含有90％的水分、1.5％脂肪、1.8％蛋白质、6.3％乳糖、灰分0.4％。驴奶属于乳清蛋白乳类，乳清蛋白中含有β-乳球蛋白、ɑ-乳白蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白、乳铁蛋白、糖聚肽等，这些高生物活性的优质蛋白质，是必需氨基酸的最佳来源，同时提供丰富的维生素、矿物质，同时含有高生物活性益生素，调节消化、补充能量等作用。驴奶中蛋白质氨基酸种类齐全，含有婴幼儿必须的组氨酸；驴奶中还含有人体必需脂肪酸、富硒等活性物质，硒为幼鼠发育、生长不可缺少的物质，能激发免疫蛋白的产生，消除不利幼鼠的物质，具有提高免疫力，增强蛋白质的作用。
海藻中含有丰富的食物纤维、多种维他命、微量元素、二十多种人体必需氨基酸。其中食物纤维能有效促进幼鼠消化、促进排泄，避免体内有害细菌的生长，具有整场作用；含有主要的维他命B12、维生素C、维生素E、生物素、烟碱酸，具有促进人体新陈代谢、疾病预防的作用微量元素主要以钠、钾、钙、铁含量居多；主要的必需氨基酸含有牛磺酸、甲硫氨酸、胱氨酸等物质，有效促进幼鼠生长、且提高免疫力。
现有技术中无菌幼鼠专用人工乳常添加蛋白质，但是蛋白质常含有乳糖，幼鼠由于小肠黏膜缺乏乳糖酶，导致母乳中的乳糖在小肠无法被消化吸收，未消化的乳糖进入结肠后，被细菌发酵产生乳酸和其他有机酸等短链脂肪酸、二氧化碳和氢气，导致肠胃胀气、腹痛甚至腹泻等乳糖不耐症的症状，对哺乳动物有很大的影响，阻碍着养殖业的发展。本发明中添加水果浆液，水果浆液采用的原料主要是桃、杏、苹果，桃、杏、苹果中存在些许的乳糖酶，补充幼鼠所需的乳糖酶，有效将肠道中未消化的乳糖进行降解，缓解乳糖不耐性引起的腹泻，进一步改善幼鼠肠胃胀气、腹泻等现状，为无菌幼鼠的培育在增加可能性。
同时添加易被吸收的小分子肽，增加幼鼠营养，促进幼鼠生长，同时改善幼鼠肠胃胀气等现象。蛋黄多肽与蛋白质相比更容易被消化吸收，鸡蛋黄中含有促进骨骼成长的成分，可以通过增加造骨细胞的数量，强化骨骼生长动力，摄取促进骨形成的钙、胶原等成分帮助幼鼠成长。
但是整个酶制剂分子中，活性中心只占其中很小的组成部分，因此本发明引入金属离子，金属离子增加酶活性，使其便于与底物结合，使酶促反应更加顺利进行，缩短酶解时间、增加产率。
进一步优选的，所述蛋黄蛋白多肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、将鸡蛋蛋黄加入混合溶剂中在室温下萃取1-4h，用冷冻离心机将固液分离，固体冷冻干燥，溶剂回收。将干燥后的固体磨碎，加入水搅拌均匀，冷冻离心机分离固液，取上清液，冷冻干燥，得到蛋黄蛋白；
S2、将蛋黄蛋白粉碎过80-100目筛，得到蛋黄蛋白粉末；将蛋黄蛋白粉末加入水中混合均匀并浸泡1h，再加入蛋壳膜固定化酶，加热至40-50℃酶解1-5h，最后加热至100℃灭酶10-30min，冷却至室温后，过滤取上清液，浓缩、冷冻干燥，得到蛋黄蛋白多肽。
所述蛋壳膜固定化酶的用量为蛋黄蛋白粉末质量的2-5％。
所述蛋壳膜固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将鸡蛋壳清洗干净后剥去蛋壳，得到蛋壳膜；将蛋壳膜加入0.2-0.5mol/L盐酸中浸泡20-40min，去除残留的钙杂质，最后取出蛋壳膜、清洗、干燥，得到预处理蛋壳膜；
(2)将预处理蛋壳膜加入0.5-2wt％戊二醛水溶液中，在20-25℃反应1-2h，反应后，将预处理蛋壳膜取出，用0.05mol/L、pH＝7的PBS溶液进行清洗，得到醛基化蛋壳膜，最后将醛基化蛋壳膜置于0.05mol/L、pH＝7的PBS溶液中储存备用；
(3)将醛基化蛋壳膜加入5-8mg/mL酶溶液中，20-25℃反应1-2h，反应结束后，采用0.05mol/L、pH＝7的PBS溶液进行清洗，得到酶处理蛋壳膜，最后将酶处理蛋壳膜置于0.05mol/L、pH＝7的PBS溶液中储存备用；
(4)将3-5g步骤(3)得到的酶处理蛋壳膜加入300-500mL甲苯中混合均匀，然后加入30-55g苯甲酚，在20-25℃反应1-2h，然后用鼓泡氩气浸泡20-30min去除溶解氧，最后在紫外光下照射1-4min，然后加入5-10mL金属制剂溶液，在紫外光下持续照射10-20min，反应结束后，分别采用甲苯、水、乙醇进行洗涤，最后低温干燥，得到蛋壳膜固定化酶。
所述步骤(1)中蛋壳膜、盐酸的浴比为1g：(10-30)mL；
所述步骤(2)中预处理蛋壳膜、1wt％戊二醛水溶液的浴比为(1-5)g：(100-200)mL；
所述步骤(3)中所述酶溶液为将酶制剂加入0.05mol/L、pH＝7的PBS溶液中混合均匀，得到5-8mg/mL酶溶液；
所述步骤(4)中所述金属制剂溶液为将15-20g金属制剂加入300-400mL二甲基亚砜中混合均匀得到金属制剂溶液；
所述金属制剂为锌离子、铅离子中的一种或两种以上混合物。优选的，所述金属制剂由锌离子、铅离子按质量比(1-3)：(1-3)混合而成。
所述锌离子为氯化锌；
所述铅离子为氯化铅。
所述步骤(4)中紫外光照射条件为250-380nm、27.9mWcm-2。
在上述基础上，本发明人以蛋壳膜为载体、以碱性蛋白酶、脂肪酶作为酶制剂，采用金属离子作为激活剂制备蛋壳膜固定化酶，并将蛋壳膜固定化酶应用于蛋黄蛋白多肽的制备过程中，有效促进蛋壳膜固定化酶与蛋黄蛋白粉末的结合，促进酶解反应，缩短酶解时间、增加蛋黄蛋白多肽的产率，小分子量的蛋黄蛋白多肽以被幼鼠肠道吸收，促进幼鼠生长，改善幼鼠吸收障碍造成的肠胃胀气、腹泻、腹部发黑等现象，进而增加小鼠的成活率。
该无菌幼鼠专用人工乳的制备方法，包括以下步骤：将驴奶、蛋黄蛋白多肽、水果浆液、维生素A、维生素D、维生素E采用50KGy60Co辐照进行处理1-5min；小鼠血清、无菌水通过110-125℃高压灭菌进行处理30-90min，并按前述原料组成成分的比例进行混匀，完成配制。
本发明的有益效果：
1、本发明公开了一种无菌幼鼠专用人工乳，以驴奶、蛋黄蛋白多肽、小鼠血清、水果浆液、维生素A、维生素D、维生素E、海藻、无菌水为原料制备无菌幼鼠专用人工乳，取消牛奶、氨基酸、维生素等单独添加的成分，添加驴奶、蛋黄蛋白多肽、水果浆液、海藻等物质，各物质之间相互作用，显著促进幼鼠发育、生长，能激发免疫蛋白的产生，消除不利幼鼠的物质，具有提高免疫力，增强蛋白质的作用，增加幼鼠的成活率、减少腹泻、胀气等问题。
2、本发明以蛋壳膜为载体、以碱性蛋白酶、脂肪酶作为酶制剂，采用金属离子作为激活剂制备蛋壳膜固定化酶，并将蛋壳膜固定化酶应用于蛋黄蛋白多肽的制备过程中，有效促进蛋壳膜固定化酶与蛋黄蛋白粉末的结合，促进酶解反应，缩短酶解时间、增加蛋黄蛋白多肽的产率，小分子量的蛋黄蛋白多肽以被幼鼠肠道吸收，促进幼鼠生长，改善幼鼠吸收障碍造成的肠胃胀气、腹泻、腹部发黑等现象，进而增加小鼠的成活率。
具体实施方式
各实施例中采用物质的来源：
驴奶来自于现场采集的新鲜驴奶。
小鼠血清，货号：SHSJ0061，购买自滁州市进优生物技术有限公司明光分公司。
碱性蛋白酶，产品编号：P824138，酶活力：200u/mg，购买自上海麦克林生化科技有限公司。
脂肪酶，产品编号：L812480，酶活力10万U/g，购买自上海麦克林生化科技有限公司。
实施例1
一种无菌幼鼠专用人工乳，包括以下原料，以100mL计：
所述水果浆液的制备方法，包括以下步骤：将水果进行清洗、去皮、去核，然后将经处理的水果加入水中进行榨汁，过200目筛取滤液，得到水果浆液；
所述水果与水的浴比为1g：5mL；
所述水果由桃子、李子、苹果按质量比1：1：1混合而成。
所述海藻为海藻粉末，海藻粉末的粒径为400目；
所述蛋黄蛋白多肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、将蛋黄加入混合溶剂中在室温下萃取4h，用冷冻离心机将固液分离，固体冷冻干燥，溶剂回收。将干燥后的固体磨碎，加入水搅拌一定时间，冷冻离心机分离固液，取上清液，冷冻干燥，得到蛋黄蛋白；
S2、将蛋黄蛋白粉碎过100目筛，得到蛋黄蛋白粉末；将蛋黄蛋白粉末加入水中混合均匀并浸泡1h，再加入酶制剂，加热至50℃酶解1h，最后加热至100℃灭酶20min，冷却至室温后，过滤取上清液，浓缩、冷冻干燥，得到蛋黄蛋白多肽。
步骤S1中所述的混合溶剂由无水乙醇、正己烷按质量比1：2混合而成；
步骤S1中所述蛋黄与混合溶剂的浴比为1g：15mL；
步骤S2中所述蛋黄蛋白粉末、水的浴比为1g：30mL；
所述酶制剂由碱性蛋白酶、脂肪酶按质量比1:2混合而成。
所述酶制剂的用量为蛋黄蛋白粉末质量的3％。
所述无菌幼鼠专用人工乳的制备方法，包括以下步骤：将驴奶、蛋黄蛋白多肽、水果浆液、维生素A、维生素D、维生素E、海藻采用50KGy 60Co辐照进行处理5min；小鼠血清、无菌水通过121℃高压灭菌进行处理60min，并按前述原料组成成分的比例进行混匀，完成配制。
实施例2
一种无菌幼鼠专用人工乳，包括以下原料，以100mL计：
所述水果浆液的制备方法，包括以下步骤：将水果进行清洗、去皮、去核，然后将经处理的水果加入水中进行榨汁，过200目筛取滤液，得到水果浆液；
所述水果与水的浴比为1g：5mL；
所述水果由桃子、李子、苹果按质量比1：1：1混合而成。
所述海藻为海藻粉末，海藻粉末的粒径为400目；
所述无菌幼鼠专用人工乳的制备方法，包括以下步骤：将驴奶、水果浆液、维生素A、维生素D、维生素E、海藻采用50KGy 60Co辐照进行处理5min；小鼠血清、无菌水通过121℃高压灭菌进行处理60min，并按前述原料组成成分的比例进行混匀，完成配制。
实施例3
一种无菌幼鼠专用人工乳，包括以下原料，以100mL计：
所述海藻为海藻粉末，海藻粉末的粒径为400目；
所述蛋黄蛋白多肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、将蛋黄加入混合溶剂中在室温下萃取4h，用冷冻离心机将固液分离，固体冷冻干燥，溶剂回收。将干燥后的固体磨碎，加入水搅拌均匀，冷冻离心机分离固液，取上清液，冷冻干燥，得到蛋黄蛋白；
S2、将蛋黄蛋白粉碎过100目筛，得到蛋黄蛋白粉末；将蛋黄蛋白粉末加入水中混合均匀并浸泡1h，再加入酶制剂，加热至50℃酶解1h，最后加热至100℃灭酶20min，冷却至室温后，过滤取上清液，浓缩、冷冻干燥，得到蛋黄蛋白多肽。
步骤S1中所述的混合溶剂由无水乙醇、正己烷按质量比1：2混合而成；
步骤S1中所述蛋黄与混合溶剂的浴比为1g：15mL；
步骤S1中所述干燥后的固体与水的浴比为1g：15mL；
步骤S2中所述蛋黄蛋白粉末、水的浴比为1g：30mL；
所述酶制剂由碱性蛋白酶、脂肪酶按质量比1:2混合而成。
所述酶制剂的用量为蛋黄蛋白粉末质量的3％。
所述无菌幼鼠专用人工乳的制备方法，包括以下步骤：将驴奶、蛋黄蛋白多肽、维生素A、维生素D、维生素E、海藻采用50KGy 60Co辐照进行处理5min；小鼠血清、无菌水通过121℃高压灭菌进行处理60min，并按前述原料组成成分的比例进行混匀，完成配制。
实施例4
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述蛋黄蛋白多肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、将鸡蛋蛋黄加入混合溶剂中在室温下萃取4h，用冷冻离心机将固液分离，固体冷冻干燥，溶剂回收。将干燥后的固体磨碎，加入水搅拌均匀，冷冻离心机分离固液，取上清液，冷冻干燥，得到蛋黄蛋白；
S2、将蛋黄蛋白粉碎过100目筛，得到蛋黄蛋白粉末；将蛋黄蛋白粉末加入水中混合均匀并浸泡1h，再加入蛋壳膜固定化酶，加热至50℃酶解1h，最后加热至100℃灭酶20min，冷却至室温后，过滤取上清液，浓缩、冷冻干燥，得到蛋黄蛋白多肽。
步骤S1中所述的混合溶剂由无水乙醇、正己烷按质量比1：2混合而成；
步骤S1中所述蛋黄与混合溶剂的浴比为1g：15mL；
步骤S1中所述干燥后的固体与水的浴比为1g：15mL；
步骤S2中所述蛋黄蛋白粉末、水的浴比为1g：30mL；
所述蛋壳膜固定化酶的用量为蛋黄蛋白粉末质量的3％。
所述蛋壳膜固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将鸡蛋壳清洗干净后剥去蛋壳，得到蛋壳膜；将蛋壳膜加入0.5mol/L盐酸中浸泡30min，去除残留的钙杂质，最后取出蛋壳膜、清洗、干燥，得到预处理蛋壳膜；
(2)将预处理蛋壳膜加入1wt％戊二醛水溶液中，在25℃反应2h，反应结束后，将预处理蛋壳膜取出，用0.05mol/L、pH＝7的PBS溶液进行清洗，得到醛基化蛋壳膜，最后将醛基化蛋壳膜置于0.05mol/L、pH＝7的PBS溶液中储存备用；
(3)将醛基化蛋壳膜加入8mg/mL酶溶液中，25℃反应2h，反应结束后，采用0.05mol/L、pH＝7的PBS溶液进行清洗，得到酶处理蛋壳膜，最后将酶处理蛋壳膜置于0.05mol/L、pH＝7的PBS溶液中储存备用；
(4)将5g步骤(3)得到的酶处理蛋壳膜加入500mL甲苯中混合均匀，然后加入55g苯甲酚，在25℃反应2h，然后用鼓泡氩气浸泡30min去除溶解氧，最后在紫外光下照射3min，然后加入10mL金属制剂溶液，在紫外光下持续照射12min，反应结束后，分别采用甲苯、水、无水乙醇进行洗涤，最后低温干燥，得到蛋壳膜固定化酶。
所述步骤(1)中蛋壳膜、盐酸的浴比为1g：15mL；
所述步骤(2)中预处理蛋壳膜、戊二醛水溶液的浴比为1g：40mL；
所述步骤(3)中所述酶溶液为将酶制剂加入0.05mol/L、pH＝7的PBS溶液中混合均匀，得到8mg/mL酶溶液；所述酶制剂由碱性蛋白酶、脂肪酶按质量比1:2混合而成。
所述步骤(4)中所述金属制剂溶液为将20g金属制剂加入400mL二甲基亚砜中混合均匀得到金属制剂溶液；
所述金属制剂由锌离子、铅离子按质量比2：1混合而成。
所述锌离子为氯化锌；所述铅离子为氯化铅。
所述步骤(4)中紫外光照射条件为365nm、27.9mWcm-2。
实施例5
与实施例4基本相同，区别仅仅在于：所述蛋黄蛋白多肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、将鸡蛋蛋黄加入混合溶剂中在室温下萃取4h，用冷冻离心机将固液分离，固体冷冻干燥，溶剂回收。将干燥后的固体磨碎，加入水搅拌均匀，冷冻离心机分离固液，取上清液，冷冻干燥，得到蛋黄蛋白；
S2、将蛋黄蛋白粉碎过100目筛，得到蛋黄蛋白粉末；将蛋黄蛋白粉末加入水中混合均匀并浸泡1h，再加入蛋壳膜固定化酶，加热至50℃酶解1h，最后加热至100℃灭酶20min，冷却至室温后，过滤取上清液，浓缩、冷冻干燥，得到蛋黄蛋白多肽。
步骤S1中所述的混合溶剂由无水乙醇、正己烷按质量比1：2混合而成；
步骤S1中所述蛋黄与混合溶剂的浴比为1g：15mL；
步骤S1中所述干燥后的固体与水的浴比为1g：15mL；
步骤S2中所述蛋黄蛋白粉末、水的浴比为1g：30mL；
所述蛋壳膜固定化酶的用量为蛋黄蛋白粉末质量的3％。
所述蛋壳膜固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将鸡蛋壳清洗干净后剥去蛋壳，得到蛋壳膜；将蛋壳膜加入0.5mol/L盐酸中浸泡30min，去除残留的钙杂质，最后取出蛋壳膜、清洗、干燥，得到预处理蛋壳膜；
(2)将预处理蛋壳膜加入1wt％戊二醛水溶液中，在25℃反应2h，反应后，将预处理蛋壳膜取出，用0.05mol/L、pH＝7的PBS溶液进行清洗，得到醛基化蛋壳膜，最后将醛基化蛋壳膜置于0.05mol/L、pH＝7的PBS溶液中储存备用；
(3)将醛基化蛋壳膜加入8mg/mL酶溶液中，25℃反应2h，反应后，采用0.05mol/L、pH＝7的PBS溶液进行清洗，最后低温干燥，得到蛋壳膜固定化酶，最后将酶处理蛋壳膜置于0.05mol/L、pH＝7的PBS溶液中储存备用；
所述步骤(1)中蛋壳膜、盐酸的浴比为1g：15mL；
所述步骤(2)中预处理蛋壳膜、1wt％戊二醛水溶液的浴比为1g：40mL；
所述步骤(3)中所述酶溶液为将酶制剂加入0.05mol/L、pH＝7的PBS溶液中混合均匀，得到8mg/mL酶溶液；所述酶制剂由碱性蛋白酶、脂肪酶按质量比1:2混合而成。
实施例6
与实施例4基本相同，其区别仅仅在于：所述金属制剂为锌离子；所述锌离子为氯化锌。
实施例7
与实施例4基本相同，其区别仅仅在于：所述金属制剂为铅离子；所述铅离子为氯化铅。
测试例1
喂养由SPF级KM孕鼠经剖腹产手术而得的210只无菌KM小鼠，随机分配为7组，对幼鼠分别进行饲喂各实施例制备的无菌幼鼠专用人工乳，总共饲养21天，其余饲养条件相同。记载21天后幼鼠的成活率，体重。
表1幼鼠的成活率、体重测试结果
| 成活率/％ | 体重/g | |
| 实施例1 | 40 | 9 |
| 实施例2 | 37 | 7 |
| 实施例3 | 23 | 5 |
| 实施例4 | 63 | 13 |
| 实施例5 | 46 | 10 |
| 实施例6 | 60 | 12 |
| 实施例7 | 53 | 12 |
由表1可知，实施例4的成活率、体重显著优于实施例1-3，其可能的原因是驴奶属于乳清蛋白乳类，乳清蛋白中含有β-乳球蛋白、ɑ-乳白蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白、乳铁蛋白、糖聚肽等，这些高生物活性的优质蛋白质，是必需氨基酸的最佳来源，同时提供丰富的维生素、矿物质，同时含有高生物活性益生素，调节消化、补充能量等作用。但是蛋白质常含有乳糖，幼鼠由于小肠黏膜缺乏乳糖酶，导致母乳中的乳糖在小肠无法被消化吸收，未消化的乳糖进入结肠后，被细菌发酵产生乳酸和其他有机酸等短链脂肪酸、二氧化碳和氢气，导致肠胃胀气、腹痛甚至腹泻等乳糖不耐症的症状，对哺乳动物有很大的影响，阻碍着养殖业的发展。本发明中添加水果浆液，水果浆液采用的原料主要是桃、杏、苹果，桃、杏、苹果中存在些许的乳糖酶，补充幼鼠所需的乳糖酶，有效将肠道中未消化的乳糖进行降解，缓解乳糖不耐性引起的腹泻，进一步改善幼鼠肠胃胀气、腹泻等现状，为无菌幼鼠的培育在增加可能性。海藻中含有丰富的食物纤维、多种维他命、微量元素、二十多种人体必需氨基酸。其中食物纤维能有效促进幼鼠消化、促进排泄，避免体内有害细菌的生长，具有整场作用；主要的必需氨基酸含有牛磺酸、甲硫氨酸、胱氨酸等物质，有效促进幼鼠生长、且提高免疫力。本发明以驴奶、蛋黄蛋白多肽、小鼠血清、水果浆液、维生素A、维生素D、维生素E、海藻、无菌水为原料制备无菌幼鼠专用人工乳，取消牛奶、氨基酸、维生素等单独添加的成分，添加驴奶、蛋黄蛋白多肽、水果浆液、海藻等物质，各物质之间相互作用，显著促进幼鼠发育、生长，能激发免疫蛋白的产生，消除不利幼鼠的物质，具有提高免疫力，增强蛋白质的作用，增加幼鼠的成活率、减少腹泻、胀气等问题。
测试例2
参照(《小麦蛋白低苦味肽的制备及其脱苦机理研究》，刘伯业，博士论文)中第2.3.7节的测试方法测试各个实施例中蛋黄蛋白多肽中多肽分子量分布。
表2蛋白多肽的测试结果
由表2可知，采用实施例4制备的蛋黄蛋白多肽中小于2000道尔顿的多肽分子量的比例占96.2，显著优于实施例1、实施例5，可能的原因是：本发明以蛋壳膜为载体、以碱性蛋白酶、脂肪酶作为酶制剂，采用金属离子作为激活剂制备蛋壳膜固定化酶，并将蛋壳膜固定化酶应用于蛋黄蛋白多肽的制备过程中，有效促进蛋壳膜固定化酶与蛋黄蛋白粉末的结合，促进酶解反应，缩短酶解时间、增加蛋黄蛋白多肽的产率，小分子量的蛋黄蛋白多肽以被幼鼠肠道吸收，促进幼鼠生长，改善幼鼠吸收障碍造成的肠胃胀气、腹泻、腹部发黑等现象，进而增加小鼠的成活率。
实施例4中制备的蛋黄蛋白多肽中小于2000道尔顿的多肽分子量的含量显著优于实施例6-7，归因于锌离子、铅离子协同作用，显著改善酶制剂的酶活力，促进酶促反应顺利进行，增加小分子肽的制备。
Claims (6)
1. 一种无菌幼鼠专用人工乳，其特征在于：包括以下原料，以100mL计：
驴奶50-65mL
蛋黄蛋白多肽0.1-1g
小鼠血清3-17mL
水果浆液1-5mL
维生素A45-60IU
维生素D5-8IU
维生素E0.1-0.3IU
海藻0.1-0.5g
无菌水余量；
所述蛋黄蛋白多肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、将蛋黄加入混合溶剂中在室温下萃取，用冷冻离心机将固液分离，固体冷冻干燥，溶剂回收；将干燥后的固体磨碎，加入水搅拌均匀，冷冻离心机分离固液，取上清液，冷冻干燥，得到蛋黄蛋白；
S2、将蛋黄蛋白粉碎过筛，得到蛋黄蛋白粉末；将蛋黄蛋白粉末加入水中混合均匀并浸泡，再加入蛋壳膜固定化酶，加热酶解，最后灭酶，冷却至室温后，过滤取上清液，浓缩、冷冻干燥，得到蛋黄蛋白多肽；
所述蛋壳膜固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
（1）将鸡蛋壳清洗干净后剥去蛋壳，得到蛋壳膜；将蛋壳膜加入盐酸中浸泡，去除残留的钙杂质，最后取出蛋壳膜、清洗、干燥，得到预处理蛋壳膜；
（2）将预处理蛋壳膜加入戊二醛水溶液中，在室温反应，反应后，将预处理蛋壳膜取出，用PBS溶液进行清洗，得到醛基化蛋壳膜，最后将醛基化蛋壳膜置于PBS溶液中储存备用；
（3）将醛基化蛋壳膜加入酶溶液中，加热反应，反应结束后，采用PBS溶液进行清洗，得到酶处理蛋壳膜，最后将酶处理蛋壳膜置于PBS溶液中储存备用；
（4）将步骤（3）得到的酶处理蛋壳膜加入甲苯中混合均匀，然后加入苯甲酚，在室温反应，然后用鼓泡氩气浸泡去除溶解氧，最后在紫外光下照射，然后加入金属制剂溶液，在紫外光下持续照射，反应结束后，分别采用甲苯、水、乙醇进行洗涤，最后低温干燥，得到蛋壳膜固定化酶；
所述金属制剂由锌离子、铅离子按质量比(1-3)：(1-3)混合而成。
2.如权利要求1所述的无菌幼鼠专用人工乳，其特征在于：所述水果浆液的制备方法，包括以下步骤：将水果进行清洗、去皮、去核，然后将经处理的水果加入水中进行榨汁，过筛取滤液，得到水果浆液；
所述水果为桃子、李子、苹果中的一种或两种以上混合物。
3.如权利要求1所述的无菌幼鼠专用人工乳，其特征在于：
步骤S1中所述的混合溶剂由无水乙醇、正己烷按质量比（1-2）：（1-2）混合而成；
步骤S1中所述蛋黄与混合溶剂的浴比为1g：（10-30）mL；
步骤S1中所述干燥后的固体与水的浴比为1g：（10-30）mL；
步骤S2所述蛋黄蛋白粉末、水的浴比为1g：（20-50）mL。
4.如权利要求1所述的无菌幼鼠专用人工乳，其特征在于：所述蛋壳膜固定化酶的用量为蛋黄蛋白粉末重量的2-5%。
5.如权利要求1所述的无菌幼鼠专用人工乳，其特征在于：所述步骤（1）中蛋壳膜、盐酸的浴比为1g：（10-30）mL；
所述步骤（2）中预处理蛋壳膜、1wt%戊二醛水溶液的浴比为（1-5）g：（100-200）mL；
所述步骤（3）中所述酶溶液为将酶制剂加入0.05mol/L、pH=7的PBS溶液中混合均匀，得到5-8mg/mL酶溶液；
所述酶制剂为碱性蛋白酶、脂肪酶中的一种或两种以上混合物；
所述步骤（4）中所述金属制剂溶液为将15-20g金属制剂加入300-400mL二甲基亚砜中混合均匀得到金属制剂溶液；
所述步骤（4）中紫外光照射条件为250-380nm、27.9mWcm-2。
6.如权利要求1-5任一项所述的无菌幼鼠专用人工乳的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将驴奶、蛋黄蛋白多肽、水果浆液、维生素A、维生素D、维生素E辐照处理，小鼠血清、无菌水通过灭菌处理，并按前述原料组成成分的比例进行混匀，完成配制。
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