BRPI0709667A2 - Composições de b-glicano,glicosamina e n-acetilglicosanina solúveis em água e métodos para a sua produção - Google Patents

Abstract

COMPOSIçõES DE <225>-GLICANO, GLICOSAMINA E N-ACETILGLICOSAMINA SOLúVEIS EM áGUA E MéTODOS PARA A SUA PRODUçAO. Composições de glicosamina, N-acetil glicosamina e <225>-glicano adequadas para o consumo ou uso humano ou animal são apresentadas. As composições de glicosamina, N-acetil glicosamina e <225>-glicano são derivadas de biomassa fúngica contendo quitina. Vários métodos de produção de composições de glicosamina, N-acetil glicosamina e <225>-gIicano são apresentados também.

Description

"COMPOSIÇÕES DE 0-GLICANO, GLICOSAMINA E N-ACETILGLICOSAMINASOLÚVEIS EM ÁGUA E MÉTODOS PARA A SUA PRODUÇÃO"

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTES RELACIONADOS

O presente pedido de patente PCT reivindica o benefício do pedido de patente dosEstados Unidos 11/394.981, depositado em 31 de março de 2006, que é uma continuação emparte do pedido de patente U.S. 10/685.125 pendente, depositado em 13 de outubro de 2003,que é uma continuação em parte do pedido de patente U.S. 10/326.549 pendente depositadoem 19 de dezembro de 2002, que é uma continuação do pedido de patente U.S. 09/785.695depositado em 16 de fevereiro de 2001, e reivindica prioridade do pedido de patente PCTPCT/US02/04468 depositado em 15 de fevereiro de 2002, cada um dos quais está aqui incorpo-rado pela referência. Pedido de patente dos Estados Unidos 11/394.981 é também uma conti-nuação em parte do pedido de patente pendente PCT/US03/34846 depositado em 31 de ou-tubro de 2003, que reivindica o benefício de pedido de patente provisório U.S. 60/423.119,depositado em 1 de novembro de 2002, e é uma continuação em parte de PCT/US02/25121,depositado em agosto de 2002, reivindica prioridade do pedido de patente U.S. 09/924.865,depositado em agosto de 2001, que é agora patente U.S. 6.693.188, cada um dos quais estátambém incorporado aqui pela referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a composições de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina e/ou B-glicano solúveis em água e a métodos de produzir os mesmos a partirde biomassa fúngica.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Glicosamina é um suplemento nutracêutico tem demonstrado fornecer alívio terapêu-tico significativo para artrite e dor nas juntas. Embora o mecanismo não seja totalmente conhe-cido, acredita-se que glicosamina funcione para ajudar na restauração da cartilagem para ali-viar. inflamação nas juntas, fornecendo assim benefício significativo aos usuários. N-acetilglicosamina é usada para várias aplicações tais como aditivos de alimentos e para uso emcomposições de produtos cosméticos e farmacêuticas.

Atualmente, glicosamina é basicamente derivada de fontes naturais de colheitas,tais como de marisco e outros organismos aquáticos. Quitina da concha ou exoesqueletodestes organismos é convertida em glicosamina e/ou N-acetilglicosamina usando várias técni-cas de produção. Estas fontes naturais são aceitáveis para produzir glicosamina e/ou N-acetilglicosamina para algumas aplicações, mas elas têm limitações. Estas limitações inclu-em o fato de que o marisco selvagem poderá ter variações significativas na sua composiçãoda concha em virtude de eles crescerem naturalmente sob circunstâncias não controladas.

O marisco pode variar em aspectos tais como seu tamanho e composição dependendo dascondições de crescimento, bem como suas espécies. Também, sem controle das condiçõesde crescimento, o marisco pôde ser exposto a contaminantes ambientais, incluindo metaispesados, que podem ficar retidos em glicosamina, N-acetilglicosamina ou outros produtosderivados ou produzidos do marisco. Mariscos colhidos são freqüentemente sazonais, eassim o suprimento e preço de marisco apresentam variações significativas com o tempo.

Uma preocupação adicional com glicosamina e/ou N-acetilglicosamina derivada demarisco é que porções significativas da população humana têm alergias a marisco e nãopodem usar produtos que contêm ingredientes derivados de marisco. Uma grande porcen-tagem de alergênicos de marisco são proteínas específicas. Alergênicos de marisco, taiscomo proteínas musculares (por exemplo, tropomiosina), são encontrados em glicosaminaderivada das fontes de marisco. Não é economicamente prático, nem mesmo possível as-segurar que produtos de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina derivados de fontes de ma-risco sejam completamente livres de tais traços de alergênicos de marisco. Assim, indiví-duos hiperalergênicos que devem evitar tais produtos de marisco não podem ingerir materi-ais derivados de marisco, tais como glicosamina e/ou N-acetilglicosamina.

Um problema adicional associado com fontes existentes de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina derivados de marisco é que alguns dos suprimentos de marisco são colhi-dos dos mares e oceanos do mundo. Colheita excessiva de marisco pode ter um maior im-pacto ambiental negativo. Assim, acredita-se que alguns consumidores prefeririam usar gli-cosamina que não é colhida a custa da vida marítima. Mesmo se o impacto ambiental de co-lheita de marisco não for negativo, continua a existir a preocupação de que o suprimento demarisco selvagem seja limitado em quantidade e inconsistente em qualidade de ano a ano.

Um outro problema associado com composições de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina derivadas de marisco é que tais composições não são "kosher." "Kosher" sig-nifica adequada ou própria, e é geralmente usada para descrever alimentos que são preparadosde acordo com leis dietárias judaicas especiais. Muitas pessoas que praticam Judaísmo ingeri-rão somente produtos kosher. Todos os alimentos marisco são não kosher e assim todos osprodutos derivados de marisco não são imediatamente considerados kosher. Para certas apli-cações medicinais, um produto de glicosamina de marisco pode receber dispensação especialde maneira tal que ele seja considerado kosher. Glicosamina derivada de marisco kosher espe-cialmente dispensado pode ser usada apenas para aplicações medicinais e quando puder ape-nas ser ingerida em forma de pílula ou comprimido. Conseqüentemente, são necessárias com-posições de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina "kosher totalmente certificada" ( isto é, produ-tos kosher não exigem dispensação ou restrição especial ao uso medicinal em forma de pílulaou comprimido). Similarmente, muitos vegetarianos rígidos exigem composições de glicosaminae/ou N-acetilglicosamina sem produto animal, de maneira que composições de glicosamina e/ouN-acetilglicosamina derivadas de marisco não satisfazem suas necessidades dietárias.

Portanto, existe uma necessidade de uma fonte de composições de glicosamina e/ouN-acetilglicosamina kosher, seguras, derivadas de produto não animal, de alta qualidade quepodem ser criadas economicamente e com mínimo impacto ambiental.

Além do mais, fontes fúngicas para produzir glicosamina e N-acetilglicosamina contêmB-glicanos e outros componentes. B-glicanos são polímeros de glicose contendo ligações glico-sídicas entre as unidades de glicose. B-glicanos são glicanos onde as ligações glicosídicas sãopredominantemente β ligações. Os B-glicanos nestas fontes compreendem /?-1,3-glicanos, bemcomo /M ,4 e β -1,6 ligações glicosídicas e ramificações compreendendo ligações βΛ ,3,6 glico-sídicas. Os tipos e número das ligações glicosídicas dependem de uma grande extensão na fontedos yff-glicanos. Por exemplo, não foi reportado que fontes de levedura de ^-glicanos incluem β-glicanos tendo as ligações βΛ ,4.

B-glicanos são naturalmente soluções insolúveis em água, ácidas ou básicas, ou emsolventes orgânicos. Inúmeros processos para o isolamento e purificação de ^-glicanos foramdesenvolvidos. Os métodos conhecidos, entretanto, usam álcali e ácidos quentes ou uma com-binação de ambos para solubilizar proteínas e outros componentes da biomassa, deixando os β-glicanos insolúveis. O ácido ou base pode em seguida ser removido dos /?-glicanos insolúveislavando com água. A alta capacidade de absorção de água dos /?-glicanos faz com que elesintumesçam significativamente, tornando esta etapa difícil e tediosa.

A digestibilidade ou aplicabilidade de ^-glicanos destas fontes é limitada por sua inso-lubilidade. Converter ^-glicanos em formas solúveis tem exigido usos de ácidos, bases, ou a-gentes oxidantes para quebrar os polímeros em polímeros menores para tomá-los solúveis.Estes mesmos agentes químicos podem ter efeitos adversos nas unidades de glicose, tal comooxidar o álcool em formas de aldeído ou ácido. Isto é desvantajoso não apenas em virtude deaplicações de /?-glicano preferirem /?-glicanos que não são quimicamente alterados, mas tambémem virtude de tais oxidações serem difíceis de controlar precisamente. Adicionalmente, trata-mentos químicos exigem etapas de purificação adicional para remover os ácidos, bases, ouagentes oxidantes. É desejável um processo exigindo um tratamento químico mínimo e mudan-ça na estrutura química mínima, ou nenhuma, para a estrutura /?-glicano.

Para manter a estrutura nativa dos /?-glicanos, tornando ainda os /?-glicanos solúveisem água, por exemplo, controlando o peso molecular, existe uma necessidade de um processobrando de fabricação em que /?-glicano não é degradado ou quimicamente alterado durante oprocesso, um rendimento suficiente de /?-glicano é obtido e componentes indesejáveis tais comoproteínas, lipídios, outros polissacarídeos bem como outros componentes indesejáveis na fontede /?-glicano são removidos das composições de /?-glicano.

No entanto, /?-glicanos estão recentemente em demanda de uma variedade de aplica-ções tais como imunoestimulantes para uso em alimentação animal, imunoestimulantes e/outratamentos de colesterol, e/ou as fontes de fibras ingeríveis para uso humano, como tratamentopara agricultura, e para uso nos produtos de tratamento de pele tais como hidratantes.O mecanismo do efeito de B-glicanos e V-1,3-D-glicanos, em particular, não é ainda to-talmente entendido, mas parece depender, em parte, da estrutura molecular específica, que éinfluenciada pelo peso molecular e pela solubilidade dos polímeros. Certos /?-glicanos devemser mais efetivos do que outros, com β-λ ,3-D-glicanos sendo especialmente efetivos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Composições de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina são reveladas, incluindo pro-dutos da composição de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina adequados para consumo hu-mano ou animal. As composições de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina reveladas são deri-vadas de biomassa fúngica contendo quitina. Materiais de partida adequados incluem fontesfúngicas microbianas, tais como fontes fúngicas derivadas de Aspergillus sp., Penicillium sp.,Mucor sp., e suas combinações. O uso de uma biomassa fúngica resulta em alta qualidadede composições de glicosamina que são geralmente uniformes com baixos níveis de impure-zas. As composições de glicosamina normalmente têm teor de cinza relativamente baixo, esão livres ou substancialmente livres de metal pesado contaminantes. Além disso, como umproduto de biomassa fúngica, as composições de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina nãoapresentam um risco para pessoas que têm alergias a marisco. Isto é, tropomiosina e outrasproteínas derivadas de músculo como essas não estão presentes em biomassa fúngica. Emvirtude de as composições reveladas de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina não serem deri-vadas de marisco (ou qualquer fonte animal), as composições reveladas são ambas kosher epodem ser consumidas por vegetarianos rígidos. Marisco e produtos derivados de marisco nãosão considerados kosher por nenhuma diretriz com relação a produtos kosher.

Modalidades particulares das composições reveladas de glicosamina compreendemglicosamina e nenhum alergênico de marisco. Outras modalidades das composições revela-das de glicosamina incluem glicosamina kosher. Outras modalidades das composições reve-ladas de glicosamina compreendem glicosamina e uma ausência de produtos derivados deanimal. Ainda outras modalidades das composições reveladas de glicosamina compreendemglicosamina e melanoidinas. Modalidades adicionais das composições reveladas de glicosa-mina compreendem glicosamina, melanoidinas e/ou ácido levulínico. Outras modalidades dascomposições reveladas de glicosamina têm capacidade de absorbância radical de oxigêniolipofílico (ORAC) valores de 30 pmol TE/g a 150 μητιοΙ TE/g ou de 35 μηποΙ TE/g a 100 μιτιοΙTE/g ou de 35 μηιοΙ TE/g a 50 μηιοΙ TE/g. Certas das composições de N-acetilglicosamina sãocomposições kosher de N-acetilglicosamina e são livres de alergênico de marisco (e o perigo ouincerteza de conter qualquer alergênico de marisco), e são livres de tais alergênicos semprecisar de nenhuma purificação das composições de maneira a remover suspeita deexistência de tais alergênicos nas composições.

São também vários métodos revelados para produzir composições de glicosa-mina por hidrólise ácida de biomassa fúngica. Os métodos para obter composições deglicosamina da biomassa microbiana incluem, por exemplo, reagir biomassa contendo 'quitina em uma solução acídica relativamente concentrada a uma temperatura relativa-mente elevada. São também revelados métodos para obter composições de glicosaminade biomassa fúngica, por exemplo, reagindo a biomassa contendo quitina em uma soluçãoacídica relativamente branda e em seguida em uma solução acídica relativamente con-centrada. Em uma modalidade alternativa, a biomassa contendo quitina microbiana rea-ge com uma solução básica antes ou depois do tratamento de hidrólise ácida. Ainda emuma outra modalidade, biomassa fúngica é tratada com uma solução acídica a uma tem-peratura e/ou pressão elevada para produzir composições de glicosamina.

São também revelados métodos para produzir tanto glicosamina quanto N-ace-tilglicosamina. Em algumas destas modalidades, mais que cerca de 80 % da quitina re-manescente na biomassa fúngica são convertidos em N-acetilglicosamina (NAG). Emmodalidades particulares a biomassa fúngica é pré-tratada com um pré-tratamento enzi-mático e/ou um pré-tratamento com ácido brando para quebrar parcialmente as paredescelulares da biomassa e para converter certos produtos indesejáveis em formas solúveis.

Os sólidos são separados e um tratamento enzimático é em seguida utilizado para con-verter a quitina em NAG. Em certas modalidades o produto resultante incluindo o produtode N-acetilglicosamina desejado também inclui produtos indesejáveis tal como glicose.

Conseqüentemente, em algumas modalidades, a mistura de N-acetilglicosamina e glico-se é tratada novamente com certas enzimas para converter a glicose em formas iônicasque são rapidamente removidas do N-acetilglicosamina na mistura. Em outras modalida-des, as enzimas para converter quitina em NAG e as enzimas para converter glicose emformas iônicas são aplicadas em uma etapa única.

Algumas modalidades do método revelado também incluem uma purificação a-dicional da composição de N-acetilglicosamina. Ainda em outros métodos revelados, a N-acetilglicosamina purificada é tratada para formar cristais de N-acetilglicosamina. Em ou-tros dos métodos revelados, a composição de N-acetilglicosamina purificada é desaceti-Iada para formar cloridrato de glicosamina.

Em modalidades alternativas, a biomassa é pré-tratada enzimaticamente e/oucom um pré-cozimento de ácido brando, a quitina é enzimaticamente convertida em N-acetilglicosamina e a composição resultante é em seguida desacetilada para formar gli-cosamina. Em outras modalidades, a biomassa é pré-tratada enzimaticamente e/ou comum tratamento com ácido brando, a quitina é convertida enzimaticamente em N-acetilglicosamina, a glicose é convertida enzimaticamente em formas iônicas, e o N-acetilglicosamina é desacetilada para formar glicosamina. Em outras modalidades a bi-omassa é pré-tratada enzimaticamente e/ou com um pré-tratamento com ácido brando, áquitina é convertida enzimaticamente em N-acetilglicosamina, e a glicose presente nacomposição de N-acetilglicosamina é enzimaticamente tratada por remoção, a composi-ção de N-acetilglicosamina é em seguida purificada e a composição de N-acetilglicosamina purificada é desacetilada para formar glicosamina.

São também reveladas composições B-glicano compreendendo B-glicanos solú-veis em água. Em certas modalidades da composição, as composições de B-glicanocompreendem B-glicano solúvel em água derivado de biomassa fúngica. Em algumasmodalidades as composições solúveis em água de B-glicano compreendem B-1,3-D-glicanos tendo um peso molecular médio de menos que cerca de 1.000,000. Certas mo-dalidades incluem composições solúveis em água de β-glicano compreendendo B-1,3-D-glicanos tendo uma faixa de peso molecular de cerca de 346 a cerca de 5.000,000. EmOutras modalidades, as composições B-glicano solúveis em água compreendem pelomenos cerca de 50 % em peso de B-1,3-D-glicanos. Em Outras modalidades, as compo-sições B-glicano solúveis em água compreendem pelo menos cerca de 70 % em peso β-1,3-D-glicanos. Em certas modalidades, as composições B-glicano solúveis em águacompreendem um razão de a a β de cerca dela cerca de 8. Em outras modalidades, ascomposições B-glicano solúveis em água compreendem uma razão de ligações a-glicosídicas a ligações B-glicosídicas de cerca de 1 a cerca de 20 a cerca de 1 a cerca de5. Em certas modalidades, as composições B-glicano solúveis em água compreendempelo menos cerca de 50 a 70 % em peso seco 1,3-B-D-glicanos e menos que cerca de 8% em peso seco 1,4-B-D-glicanos.

Em algumas modalidades, os B-glicanos nas composições B-glicano solúveis emágua têm solubilidades em solução aquosa de cerca de 20 % em peso a cerca de 60 %em peso ou de cerca de 30 % em peso a cerca de 50 % em peso ou de cerca de 40 %em peso a cerca de 50 % em peso.

São também revelados (1) métodos de produzir as composições de B-glicano supra-descritas, (2) métodos de isolar B-glicano, (3) métodos de isolar das fontes de biomassa fúngicade B-glicano formando B-glicanos fúngicos solúveis aquosos, (4) métodos de tratar alimentaçãoanimal, lavouras e/ou humanos com as composições de B-glicano reveladas. Modalidades par-ticulares dos métodos revelados produzem composições B-glicano incluem um processo defabricação brando em que pesos moleculares de B-glicano são controlados pelo processo, umrendimento suficiente de B-glicano obtido e componentes indesejáveis tais como proteínas,lipídios, outros polissacarídeos bem como outros componentes indesejáveis na fonte de β-glicano são removidos das composições de B-glicano

DESENHOS

A figura 1 é um diagrama de fluxo da tecnologia anterior que ilustra um processo paraproduzir glicosamina de marisco.

A figura 2 é um diagrama de fluxo de um dos métodos revelados para produzir moda-Iidades particulares das composições de glicosamina.

A figura 3 é um diagrama de fluxo de um outro dos métodos revelados para produzirmodalidades das composições de glicosamina.

A figura 4 é um gráfico mostrando a porcentagem de rendimento de glicosamina emuma modalidade da composição de glicosamina revelada produzida usando uma modalidadeda composição de métodos de glicosamina.

A figura 5 é um cromatograma líquido de uma modalidade das composições revela-das de glicosamina.

A figura 6 é um cromatograma líquido de uma modalidade das composições revela-das de glicosamina.

A figura 7 é uma série de espectros de STIR mostrando comparação de algumascomposições atualmente reveladas de glicosamina para materiais de glicosamina derivadosde marisco.

A figura 8 é um cromatograma de HPLC que compara componentes solúveis em á-gua de uma modalidade da composição revelada com glicosamina derivada de biomassa fún-gica indicando que nenhum ácido levulínico ou glicose foi detectado na glicosamina derivadade marisco.

A figura 9 é um diagrama de fluxo de alguns dos métodos revelados para produzirmodalidades das composições de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina.

A figura 10 é um gráfico que ilustra a porcentagem de N-acetilglicosamina obtidopor um tempo.

A figura 11 é um cromatograma de HPLC que ilustra N-acetilglicosamina separa-da dos outros componentes usando uma resina de troca catiônica.

A figura 12 é um diagrama de fluxo de alguns dos métodos revelados para produ-zir modalidades de composições B-glicano seco, purificado.

A figura 13 é um diagrama de fluxo de alguns dos métodos revelados para produ-zir modalidades de composições de B-glicano líquido ou sólido purificado ou não purifi-cado.

DESCRIÇÃO DETALHADA

São reveladas composições de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina e produtosda composição de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina, tais como suplementos alimen-tares, adequados for consumo humano ou animal. As composições de glicosamina e/ouN-acetilglicosamina são derivadas de quitina presente em vários tipos de biomassa fúngi-ca. Quitina é um polissacarídeo natural, com a estrutura de um polímero não ramificadode 2-acetoamido-2-deóxi-D-glicose (poli(N-acetil-D-glicosamina)). Quitina contém unida-des de N-acetilglicosamina e pode também conter até cerca de 50 % de unidades de de-sacetilada. A fórmula para quitina pode ser representada pela estrutura de repetição ge-<formula>formula see original document page 9</formula>

Quitina é tipicamente um sólido amorfo que é bastante insolúvel em água, ácidosdiluídos e álcalis. Embora quitina tenha várias aplicações comerciais, a utilidade comer-cial pode ser encontrada transformando a estrutura polimérica em componentes indivi-duais de 2-amino-2-deóxi-D-glicose, que é conhecido como glicosamina. Estruturalmen-te, glicosamina é glicose modificada com um grupo amina substituindo o grupo OH encon-trado no átomo de dois carbonos (C-2). A estrutura geral de glicosamina é:

Quitina pode também ser despolimerizada para formar o açúcar amino N-acetilglicosamina (NAG). Composições de N-acetilglicosamina tipicamente incluem ummonômero acetilglicosamina simples, mas também pode incluir pequenas quantidades deoligômeros que têm, por exemplo, duas ou três unidades de acetilglicosamina. N-acetilglicosamina pode ser usada para várias aplicações, tais como aditivos de alimentos,suplementos dietários, cosméticos, ou em composições farmacêuticas.

Da maneira supraestabelecida, composições de glicosamina reveladas aqui in-cluem glicosamina e N-acetilglucosamina derivada de biomassa fúngica contendo quitinae podem incluir igualmente outros componentes. Materiais de partida adequados paraproduzir as composições de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina incluem fontes fúngi-cas microbianas, tal como fontes fúngicas substancialmente uniformes derivadas de As-pergillus sp., Penicillium sp., Mucor sp. Absidia sp., Actinomucor sp., Actostelium sp., Agari-eus sp., AIIomyees sp., Amylomyees sp., Coprinus, sp., Cunninghamella sp., Didymiumsp., Fusarium sp., Gongronella sp., Lentinula sp., Mortierella sp., Mucoriopsis sp., Phy-eomyees sp., Rhizomueor sp., e Rhizopus sp., e suas combinações. Outras fontes de bi-omassa fúngica usadas podem incluir, sem limitação, Absidia ramosa, Gongronella butle-rii, Mortierella spinosa, Mueor racemosus, Rhizopus nigrieans, R. stolonifer, R. Oryzae, A.nidulans, Thielavia terrieola, Saccharomyees eerevisiae, Cheatomium lunasporium, e suascombinações. O uso de uma biomassa fúngica resulta em um produto de alta qualidadeque produz composições de glicosamina tendo baixos níveis de impurezas, tal como mi-nerais indesejáveis. As composições de glicosamina normalmente têm teor de cinza rela-tivamente baixo e, assim, nenhum metal pesados ou, no máximo, níveis de traço dos mesmos.Além disso, baixo teor de cinza fornece soluções relativamente claras feitas das composiçõesde glicosamina.

Além disso, em virtude de as composições de glicosamina serem produtos de bio-massa fúngica, as composições de glicosamina reveladas aqui não são submetidas a inclusãodos alergênicos de proteína encontrados em glicosamina produzida de marisco.

A. Glicosamina e composições N-Acetilglicosamina

As composições de glicosamina e N-acetilglicosamina podem ser derivadas de fontesde biomassa fúngica relativamente uniforme, de forma que as composições de glicosaminasão geralmente uniformes. "Biomassa fúngica uniforme" refere-se a biomassa fúngica com-preendendo substancialmente as mesmas espécies crescidas substancialmente no mesmomeio, crescidas em um ambiente relativamente controlado, ou outras condições tais que le-vam a uniformidade substancial na substância bioquímica constituída da biomassa. Depen-dendo da metodologia usada para purificar as composições de glicosamina tal como composi-ções de sal de glicosamina desejadas, a glicosamina resultante contendo composições podeser produzida com quantidades variadas de glicosamina, incluindo composições que excedem95 porcento de glicosamina, 98 porcento de glicosamina, e ainda 99,8 porcento de glicosamina.As composições de glicosamina podem conter ingredientes adicionais, tais como sais, mela-noidinas e ácidos, por exemplo, ácido levulínico (da maneira discutida a seguir). Algumas dascomposições de glicosamina incluem 0,01 a 10 % de glicose, 0,01 a 5 % de glicose, ou 0,01 a 2 % de glicose.

Similarmente, dependendo da metodologia usada para purificar as composições deN-acetilglicosamina, a N-acetilglicosamina resultante contendo composições pode ser produ-zida com quantidades variadas de N-acetilglicosamina, incluindo composições que excedem90 porcento de N-acetilglicosamina, 95 porcento de N-acetilglicosamina, e ainda 99,8 porcentode N-acetilglicosamina, em peso. Além disso, certas modalidades dos métodos (discutidoscom detalhes a seguir) revelados aqui para formar a N-acetilglicosamina converte pelo menoscerca de 80 % da quitina obtida da biomassa em N-acetilglicosamina, e os mesmos métodosrevelados convertem pelo menos cerca de 95 % da quitina obtida da biomassa emN-acetilglicosamina.

A menos que de outra forma indicada, todos os números que expressam quantidadesde ingredientes, propriedades tal como peso molecular, porcentagens, condições de reação eassim por diante usados na especificação e reivindicações devem ser entendidos comosendo modificados pelo termo "cerca de". Conseqüentemente, a menos que indicado docontrário, os parâmetros numéricos apresentados são aproximações que podem depen-der das propriedades exigidas desejadas.A glicosamina nas composições reveladas tem a fórmula geral representada aseguir:

<formula>formula see original document page 11</formula>

esta fórmula geral varia em modalidades diferentes das composições de glico-samina dependendo da presença de vários sais da glicosamina, incluindo citrato, aceta-to, fosfato, sulfato, cloreto, lactato, Gliconato, etc. A glicosamina nas composições deglicosamina, também pode ser substituída ou modificada sem divergir do escopo da in-venção. Assim, da maneira aqui usada, o termo glicosamina refere-se às várias formasde glicosamina, incluindo complexos de sal e glicosamina substituída. Similarmente, otermo composição de glicosamina refere-se a composições incluindo glicosamina emvárias formas como essas.

Modalidades das composições de glicosamina incluem componentes particula-res, além da glicosamina, tais como chitooligossacarídeos e produtos de despolimeriza-ção de glicano, reação e degradação, tais como glicose, melanoidinas e ácido levulínico.

Melanoidinas são polímeros irregulares relativamente complexos de alto pesomolecular, e estão presentes em modalidades particulares das composições de glicosa-mina. Por exemplo, modalidades particulares das composições reveladas de glicosaminaincluem de 0,001 a 15 % em peso melanoidinas ou de 0,001 a 1,0 % em peso de mela-noidinas ou de 0,01 a 0,1 % em peso de melanoidinas. Sem estar ligado a nenhuma teo-ria particular, melanoidinas são provavelmente formadas pela conversão de glicanos emglicose em hidroximetilurfural (HMF) para produzir as melanoidinas. (A reação pode pro-duzir outros produtos derivados de glicano e aminas das proteínas em uma fonte de bio-massa bem como lipídios em uma fonte como essa). Um processo químico como esse é co-nhecido como a Reação Maillard.

Ácido levulínico (também conhecido como ácido acetil-propiônico) está presente emmodalidades particulares das composições reveladas de glicosamina. Sem estar ligado anenhuma teoria particular, ácido levulínico é provavelmente formado quando glicanos na bio-massa fúngica são convertidos em glicose, isto é, convertidos em HMF para finalmente formarácido fórmico e levulínico. Ácido levulínico é um componente não perigoso, isto é, um acidu-Iante valioso usado em produtos tais como bebidas carbonatadas e sucos de frutas, geléia egelatinas. Assim, a adição de modalidades das composições de glicosamina a tais produtosfornece um acidulante benefício, bem como os benefícios fornecidos pela glicosamina nacomposição. Modalidades particulares das composições de glicosamina incluem de 0,0001 a1 % em peso de ácido levulínico, ou de 0,001 a 0,7 % em peso de ácido levulínico ou de 0,01a 0,4 % em peso de ácido levulínico.

Em virtude de as melanoidinas e ácido levulínico serem formados durante a produçãodas composições de glicosamina de acordo com os métodos revelados, não deve ser realiza-da nenhuma etapa adicional para incluir tais componentes nas composições. Melanoidinas eácido levulínico não foram esperados em composições de glicosamina derivadas de marisco,e análise de seis lotes de glicosamina derivada de marisco (obtidos de cinco fornecedoresdiferentes) não contêm nenhuma quantidade detectável de melanoidinas ou ácido levulínico.

Da maneira discutida, carboidratos complexos em biomassa fúngica, tais como glica-nos, são convertidos em melanoidinas no ambiente redutor do processo. Estes carboidratoscomplexos não estão presentes nas carapaças dos mariscos usadas em outros processos, eassim as melanoidinas não se formam. Comparação de espectros de FTIR (figura 7) de mate-riais insolúveis em água em certas modalidades das composições reveladas de glicosaminacom aqueles encontrados em um glicosamina típica derivada de marisco mostrou que mela-noidinas não estão presentes em composições de glicosamina derivadas de marisco. O es-pectro FTIR do material insolúvel da composição de glicosamina revelada tem diversas ban-das largas sem nenhuma estrutura fina, típica de materiais poliméricos. As bandas com núme-ros de onda entre 2.800 e 3.000 no espectro das presentes composições são típicas de gruposamida em melanoidinas. O material insolúvel do produto de glicosamina derivada de marisconão tem nenhuma indicação da presença de melanoidinas nos espectros FTIR.

Em virtude de as melanoidinas serem polímeros irregulares com menos carbono, al-gum grau de conjugação existe entre as ligações pi. Esta conjugação resulta na cor típica cas-tanho a marrom de melanoidinas. Tal coloração esteve claramente presente em modalidadesdas composições atualmente reveladas de glicosamina, mas esteve ausente nas amostras deglicosamina derivada de marisco, indicando novamente que composições de glicosamina de-rivadas de marisco não incluem melanoidinas.

Melanoidinas são reportadas para possuir caráter antioxidante e/ou captador de radi-cais livre. Ver, por exemplo, Gow-Chin Yen, et ai., Antioxidant Activity and Scavenging Effectson Active Oxigens of Xylose-Lysine Maillard Reaction Products, J. Sei. Food Agric., 67, 415-420(1995); K. Eichner, Antioxidant Effeets of Maillard Reaetion Intermediates, Prog. Fd. Nutr. Sci.,5, 441-451 (1981); Fumitaka Hayase, etal., Seavenging of Aetive Oxigen by Melanoidins, Agric.Biol. Chem, 53(12), 3383-3385 (1989); Dejian Huang, et al., High-ThroughputAssay of OxigenRadical Absorbance Capacity (ORAC) Using a Multichannel Handling System Coupled with aMicroplate Fluoreseenee Reader in 96-Well Format, J. Agric. Food Chem., 50, No. 16, 4437-4444 (2002), cada um dos quais está aqui incorporado pela referência. Certas modalidadesdas composições de glicosamina reveladas têm valores de capacidade de absorbância deradical de oxigênio lipofílico (valores lipo-ORAC) de 30 pmol TE/g (TROLOX equivalente porgrama) a 150 Mmol TE/g ou valores Iipo-ORAC de 35 μιηοΙ TE/g a 10O Mmol TE/g ou de 35Mmol TE/g a 50 Mmol TE/g. TROLOX é também conhecido como ácido 6-hidróxi-2,5,7,8-tetrametil-2-carboxílico.

Os valores Iipo-ORAC podem ser determinados, por exemplo, pelo uso de um ensaioORAC usando fluoresceína (FL) como uma sonda fluorescente da maneira discutida em DejianHuang1 et al., Development and Validation of Oxigen Radical Absorbance Capacity Assay forLipophilic Antioxidants Using Randomly Metilated β-Cyclodextrín as the Solubility Enhancer, J.Agric. Food Chem., 50, No. 7 (2002), isto está aqui incorporado pela referência. Randomly β-ciclodextrina metilada (RMCD) é usada como uma melhorador de solubilidade em água paraantioxidantes lipofílicos. Sete porcento de RMCD (p/v) em uma mistura acetona-água 50 % sãousados para solubilizar os antioxidantes lipofílicos em tampão de fosfato 75 mM (pH 7,4). Du-rante o uso de TROLOX como o padrão (1,0), σ-tocoferol, (+)-Y-tocoferol, (+)-ó-tocoferol, ace-tato de σ-tocoferol, tocotrienóis, 2,6-di-terc-butil-4-metilfenol, e y-orizanol têm valores ORAC de0,5 +/- 0,02, 0,74 +/- 0,03, 1,36 +/- 0,14, 0,00, 0,91 +/- 0,04, 0,16 +/- 0,01, e 3,00 +/- 0,26, res-pectivamente, durante o uso deste método.

Espera-se que ácido levulínico e glicose, presentes em certas modalidades das com-posições reveladas de glicosamina não estejam presentes em glicosamina derivada de maris-co. Cromatografia líquida de alto desempenho demonstra as diferenças entre modalidades dacomposição de glicosamina reveladas aqui e composições de glicosamina derivada de maris-co. Nem ácido levulínico nem glicose foram detectados em nenhum dos produtos de glicosa-mina derivados de marisco.

Especificamente, amostras das presentes composições e composições de glicosami-na derivada de marisco foram dissolvidas em ácido sulfúrico 0,01 N a uma concentração de 4% p/v. Amostras diluídas foram filtradas através de filtros de náilon de 0,2 mm em frascos frHPLC. Cromatogramas foram coletados usando uma coluna Metacarb H Plus (Varian, Inc.,Torrence, CA) usando ácido sulfúrico 0,01 N como o eluente a 0,4 mL/min. Picos foram identi-ficados por tempo de retenção contra padrões conhecidos. Como está aparente na figura 8,ácido levulínico e glicose foram presentes apenas nas composições atualmente reveladas deglicosamina e não nas composições derivadas de marisco.

Com referência a Tabela 1, modalidades das composições de glicosamina compre-endem glicosamina derivada de biomassa fúngica e podem também compreender um ou maisdos componentes listados na tabela 1, aqueles mostrados na tabela 2 e outros componentesda maneira aqui discutida. Concentrações de cada componente podem estar nas faixas mos-tradas ou podem ser variadas alterando qualquer de uma variedade de parâmetros de produção.Tabela 1

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Com referência a Tabela 2, são apresentadas duas modalidades específicas dascomposições de glicosamina. Os métodos utilizados para determinar os componentespresentes e concentrações dos mesmos são apresentados a seguir.

Tabela 2

<table>table see original document page 14</column></row><table>

* Porcentagens listadas são porcentagens em peso

Certas modalidades das composições de glicosamina têm teor de cinza relati-vãmente baixo. O teor de cinza pode ser menos que 5 porcento, menos que 2 porcento,ou menos que 1 porcento. Existem poucos se nenhuns componentes de metal pesadonas composições de glicosamina; as concentrações de componente de metal pesadonas composições reveladas de glicosamina são bem abaixo de 100 partes por milhão,mais tipicamente abaixo de 50 partes por milhão, ainda mais tipicamente abaixo de 20partes por milhão. Em certas modalidades os componentes de metal pesado estão pre-sentes em menos que 10 partes por milhão.O componente de glicosamina das composições de glicosamina pode ter umarotação específica positiva, tal como uma rotação específica de 69 a 74 graus positiva pa-ra o cloridrato de sal de glicosamina. As composições de glicosamina são normalmenterelativamente brancas quando purificadas em forma seca, mas incolores quando dissol-vidas em uma solução aquosa. Em um exemplo, uma solução de 20 porcento em pesode glicosamina tem uma cor American Public Health Association (APHA) de menos que50.

A N-acetilglicosamina nas composições reveladas tem a fórmula geral represen-tada a seguir:

<formula>formula see original document page 15</formula>

Esta fórmula geral varia em modalidades diferentes das composições de N-acetilglicosamina dependendo da presença de oligômeros de N-acetilglicosamina, tais comodímeros, trímeros, e assim por diante, até cerca de dez unidades de repetição. Também, a N-acetilglicosamina nas composições de N-acetilglicosamina pode ser substituída ou modificadasem divergir do escopo da invenção. Assim, da maneira aqui usada, o termo N-acetilglicosamina refere-se às várias formas de N-acetilglicosamina, incluindo oligômeros. Si-milarmente, o termo composição de N-acetilglicosamina refere-se a composições incluindo N-acetilglicosamina em várias formas como essa.

As composições de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina podem também ser combi-nadas com componentes adicionais para formar um suplemento alimentar para ingestão huma-na e/ou animal. Por exemplo, as composições de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina podemser combinadas adicionalmente com excipientes, Iigantes farmacêuticos comuns (por exemplo,sacarose, glicose, etil celulose, metil celulose, polivinil pirrolidona, polietileno glicol, lactose,fosfato de cálcio, crosprovidona, croscarmelose, e similares), ácidos orgânicos comuns (porexemplo, ácido cítrico, ácido málico, ácido tartárico, ácido lático e similares), e/ou carboidratos(por exemplo, amido, glicose, sacarose, e similares). Tais composições de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina podem também ser combinadas com açúcares, edulcorantes artificiais, coresnaturais e artificiais, flavorizantes naturais e artificiais, acidulantes, espessantes e similares, paraformar uma variedade de suplementos alimentares. Tais suplementos alimentares da compo-sição de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina são tipicamente feitos em bebidas, barras, con-centrados, misturas de bebida seca ou concentrada, pós, goma de mascar, confeitos, gomas,iogurtes, ataduras, pastilhas em forma de losangos de alimento e/ou suplemento e similares.Β. Materiais de Partida de Biomassa Fúngica

Materiais de partida adequados para produzir as composições reveladas de gli-cosamina incluem fontes de biomassa microbiana, tipicamente biomassa fúngica, tal co-mo fungos filamentosos tendo mais que 10 porcento de quitina por peso celular seco total,tal como fontes fúngicas derivadas de Aspergillus sp., Penicillium sp., Mucorsp., Absidia sp.,Actinomucor sp., Actostelium sp., Agarieus sp., Allomyees sp., Amylomyees sp., Coprínus, sp.,Cunninghamella sp., Didymium sp., Fusarium sp., Gongronella sp., Lentinula sp., Mortierellasp., Mucoriopsis sp., Phyeomyees sp., Rhizomueor sp., e Rhizopus sp., e suas combina-ções. Biomassas fúngicas adequadas incluem Aspergillus niger, Aspergillus terreus, As-pergillus oryzae, Mueor rouxii, Penieillium ehrysogenum, Penieillium notatum, Saeeharomy-ees eerevisiae; Saccharomyees uvarum; Absidia ramosa, Gongronella butlerii, Mueor raee-mosus, e em particular Candida guillermondi, Aspergillus niger, e Aspergillus terreus. A bi-omassa pode ser recuperada de uma reação de fermentação comercial, tal como a pro-dução comercial de ácidos orgânicos, incluindo ácido cítrico. Também, biomassa ade-quada para produção de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina pode ser gerada especifi-camente para este processo e não como um subproduto de outros processos. Da manei-ra aqui usada, o termo microbiana não inclui fitoplâncton e crustáceos ou moluscos.

Biomassas tendo níveis de quitina superiores a 5 porcento de peso de biomassaseca são adequadas para praticar os métodos revelados. Tal biomassa normalmentetem entre 5 e 25 porcento de quitina, e pode ter de 10 a 20 porcento de quitina, com ba-se no peso seco da biomassa. Também, a fim de preparar alimento ou composições degrau suplementar de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina as vezes é desejável que abiomassa microbiana cresça de uma maneira substancialmente controlada, com tempe-ratura e/ou níveis de nutrientes relativamente uniformes durante o crescimento da biomas-sa. Níveis de nutrientes podem ser controlados por qualquer maneira adequada, por e-xemplo, da maneira revelada nas patentes U.S. 2.739.923, 2.353.771 e 2.674.561, queestão incorporadas aqui pela referência.

As mesmas fontes de biomassa microbiana, tipicamente fontes de biomassa fún-gica, podem ser usadas para produzir as composições B-glicano aqui reveladas. Em cer-tas modalidades, a fonte yff-glicano é o produto "resíduo" separado dos líquidos nos mé-todos de glicosamina e/ou N-acetil de glicosamina aqui revelados. Da maneira aqui reve-lada (ver, por exemplo, figuras 2, 3, e 9 a 11) atualmente são revelados diversos proces-so para desenvolver composições de glicosamina, composições de N-acetilglicosamina,e composições /7-glicano todas de um fonte de partida única de biomassa fúngica. Proces-sos convencionais para produzir produtos da composição de glicosamina e/ou N-acetilglicosamina exigem a fonte de marisco indesejável, e qualquer das três composi-ções exige o uso de processos químicos indesejáveis e/ou produz quantidades relativa-mente grandes de resíduos químicos do processo, incluindo ácido forte e resíduos debase que podem ser caros para a devida disposição. Além disso, os processos existen-tes para produzir composições de glicosamina, composições de N-acetilglicosamina, oucomposições de B-glicano recuperou apenas aquelas composições individuais da fonte(isto é, produzem apenas os produtos glicosamina ou N-acetilglicosamina ou /ff-glicano,mas não produzem mais do que um produto). A múltipla abordagem do produto reveladaaqui resulta em uso mais eficiente de capital, baixos custos de fabricação, menos resí-duos químicos do processo e uso mais eficiente da matéria-prima (menos resíduo dosmateriais da fonte).

C. Métodos para Produzir Composições de Glicosamina de Biomassa Fúngica

São também revelados métodos para produzir composições de glicosamina defontes de biomassa fúngica, incluindo produzir tais composições por hidrólise ácida debiomassa fúngica. Hidrólise ácida quebra ligações de éter na biomassa e desacetila mo-léculas de quitina para gerar glicosamina livre. Hidrólise ácida pode quebrar a quitina emglicosamina, mas deixa a molécula de glicosamina substancialmente intacta. Dependen-do dos parâmetros da hidrólise ácida, as condições de hidrólise ácida quebram outroscomponentes (tais como glicanos, proteínas e lipídios) que existem na biomassa fúngica.

Em uma particularidade do método revelado para produzir composições de gli-cosamina de biomassa fúngica, hidrólise ácida é realizada tratando biomassa fúngica porum período de tempo relativamente longo, por exemplo, mais que 4 horas, em uma solu-ção ácida relativamente agressiva.

Com referência a figura 2, biomassa contendo quitina fúngica (a) pode primeiroreagir em uma solução acídica relativamente agressiva (c). Ácidos relativamente fortes(agressivos) podem ser usados para hidrolisar a biomassa fúngica, incluindo ácidos deconcentrações menos que 50 porcento. Ácidos de concentrações de 5 a 25 porcento de sãotambém adequados. Ácidos fortes adequados incluem ácido clorídrico, sulfúrico, fosfórico ecítrico em concentrações apropriadas.

Em modalidades particulares dos métodos revelados, composições particulares deglicosamina são formadas por um tratamento com ácido agressivo, reagindo de 5 a 20 porcen-to de ácido com 2 a 50 porcento de biomassa pré-tratada (com base no peso seco, embora abiomassa seja tipicamente processada com água presente) e de 35 a 93 porcento de água.Em certas implementações a mistura da reação compreende de 8 a 12 porcento de ácido clorí-drico, de 4 a 8 porcento de biomassa (com base no peso seco), e de 80 a 90 porcento de água.Ainda em uma outra modalidade, a solução ácida é de 17 a 20 porcento de solução de ácidoclorídrico.

A mistura do tratamento com ácido agressivo contendo a biomassa, ácido e água éaquecida e mantida a uma temperatura relativamente elevada. A mistura é normalmente aque-cida até uma temperaturaigual ou próxima de seu ponto de ebulição (tipicamente 90 0C a 106°C) e mantida sob condições de refluxo por 5 horas ou mais, mais tipicamente, mais que 8horas, e normalmente menos que 16 horas. A reação pode continuar até que se tenha umaquebra completa da quitina, mas não tanto a ponto de ser ineficiente ou decompor excessiva-mente as composições de glicosamina.

Embora a reação na solução ácida relativamente agressiva produza uma composiçãode glicosamina, etapas subseqüentes de purificação podem ser adotadas. Uma primeira etapade purificação pode incluir uma etapa de separação, tal como filtração, para remover impure-zas de particulado, resultando em uma solução substancialmente clara da composição de glico-samina, (d) na figura 2. A solução contém uma modalidade de composição de glicosaminabem como pequenas quantidades de glicose e outros componentes da composição. A compo-sição de glicosamina pode ser concentrada e alguns dos ácidos recuperados podem ser reci-clados e ré-utilizados.

A composição de glicosamina pode ser cristalizada, (e) na figura 2. Por exemplo, acomposição de glicosamina pode ser cristalizada adicionando etanol à solução concentradaou continuando a evaporação até o limite de solubilidade da composição de glicosamina.

A composição de glicosamina pode ser recuperada por um processo de separação,tais como filtração ou centrifugação, seguido por secagem. A composição de glicosamina secaé opcionalmente ainda mais tratada para remover açúcares residuais indesejáveis. Ummétodo de remover tais açúcares é dissolvendo a composição de glicosamina em água eadicionando etanol até precipitar novamente a composição de glicosamina enquanto a-çúcares indesejáveis permanecem na solução. Alternativamente, a solução pode sertratada por eletrodiálise, cromatografia, filtração da membrana, ou outros procedimentosadequados para aumentar ainda mais a concentração de glicosamina na composição deglicosamina. A composição de glicosamina pode opcionalmente ser descolorida e/oudesodorizada, por exemplo, tratando a composição com etanol, carbono, ou outros mate-rial ou método adequados.

Um método de hidrólise ácida agressiva como esse tipicamente tem um rendi-mento de composição de glicosamina de mais que 50 porcento do teor total de quitina damaterial de partida da biomassa fúngica.

Em uma modalidade alternativa do método apresentado anteriormente, a biomas-sa pode inicialmente ser tratada para remover algumas impurezas e/ou para aumentar aprodução da composição de glicosamina. Estes tratamentos podem incluir, por exemplo,aquecer a biomassa, adicionando enzimas digestivas, misturar com um ácido ou base,agitação mecânica, ruptura celular ultra-sônica, ou desidratação por compressão. Umtratamento opcional para remover proteínas, lipídios e ácido cítrico residual envolve pré-tratar a biomassa na presença de uma base, tal como hidróxido de sódio ((b) na figura2).

Em certas modalidades, uma concentração de menos que 10 porcento de hidró-xido de sódio é adicionada à biomassa fúngica. A solução básica é aquecida até umatemperatura relativamente elevada por um período de tempo suficiente para remover umaquantidade desejável do material contendo não quitina, tal como proteínas e lipídios. Es-te período de tempo pode ser menos que duas horas. Um exemplo específico deste mé-todo de pré-tratamento envolve aquecer a biomassa fúngica até 100 ° a 125 0C em umasolução de hidróxido de sódio de 1 a 8 porcento por 20 a 60 minutos. Alternativamente, aconcentração de hidróxido de sódio pode ser 1 a 4 porcento. Modalidades em que a bi-omassa é tratada com uma solução básica, proteína e glicanos são hidrolisadas na bio-massa. Estes subprodutos podem opcionalmente ser removidos, por exemplo, por filtra-ção. A remoção de tais proteínas e outros produtos resíduos pode ser seguida por trata-mento para remover proteínas solúveis, aminoácidos e outras impurezas.

Uma alternativa para tratar a biomassa com uma solução básica poderia incluir,por exemplo, tratar a biomassa fúngica em solução com enzimas de protease ou outrasenzimas adequadas para remover componentes indesejáveis tais como proteínas e lipí-dios. Ainda uma outra modalidade alternativa compreende tratar mecanicamente a bio-massa fúngica para quebrar fisicamente as paredes celulares de forma que proteínasindesejáveis e lipídios nas células possam ser removidos antes de extrair a quitina dasparedes celulares por si mesma. Ainda em uma outra modalidade alternativa, álcoois sãousados para remover componentes indesejáveis da biomassa fúngica antes da hidróliseácida.

Em uma outra modalidade do método para produzir composições de glicosaminade biomassa fúngica, o material de biomassa pode passar por um pré-tratamento comácido brando seguido por um tratamento com ácido agressivo.

Mais especificamente, com referência à biomassa contendo quitina (a) na figura3 pode primeiro sofrer um pré-tratamento com ácido brando (d). As condições de hidróli-se ácida (parâmetros compreendendo tempo, temperatura e concentração do ácido) u-sados são "brandas" em comparação com o tratamento com ácido agressivo subseqüen-te (f). A hidrólise ácida que ocorre nas condições relativamente brandas permite a remo-ção de constituintes indesejáveis da biomassa antes do tratamento com ácido agressivo(f). Um tratamento com ácido brando, portanto, pode ser usado para melhorar qualquerdos diversos aspectos de produção da composição de glicosamina de biomassa fúngica.

Um ácido brando pode ser usado para quebrar as paredes celulares da biomassa fúngi-ca de maneira tal que constituintes externos da biomassa, tal como proteínas, lipídios epolissacarídeos indesejáveis possam ser removidos antes de hidrolisar a quitina. A con-centração de ácido durante o tratamento com ácido brando pode ser ácido de 0,01 a 20% ou 0,1 a 15 %, ou de 0,5 a 5 % p/p, tal como HCI. O pré-tratamento com ácido brandopode também ser realizado usando ácidos orgânicos, tais como ácidos cítrico, oxálico,málico, maléico, itacônico, ou succínico. Estes ácidos orgânicos podem ser usados emconcentrações variando de 0,01 a 16 % em peso a temperaturas entre 110 0C a 200 °Cpor 10 minutos a 15 horas. Altas concentrações de ácido exigem maiores tempos de re-ação, temperaturas mais altas, ou ambos. Por exemplo, ácido cítrico 0,1 % pode ser u-sado a uma temperatura de cerca de 130 a 160 °C por duas a seis horas. Uma soluçãode ácido cítrico 15 % pode ser usada a temperaturas entre cerca de 110 e 130 °C por 15minutos até três horas. Altas concentrações de soluções de ácido forte ou o uso de áci-dos diferentes ou ácidos misturados podem ser usados para quebrar as paredes celula-res mais rapidamente, condições de reação devem ainda ser adaptadas para controlar a con-versão prematura indesejável da quitina em glicosamina. Similarmente, baixas concentraçõesde ácidos fortes, ácidos fracos ou ácidos misturados podem ser usadas (especialmente emtemperaturas relativamente mais altas, por períodos de tempo mais longos, ou em concentra-ções mais altas) de maneira tal que as paredes celulares sejam suficientemente quebradaspara permitir a remoção de uma porção substancial ou desejável dos constituintes externos dabiomassa, por exemplo, lipídios, proteínas e polissacarídeos indesejáveis.

Um tratamento com ácido brando (d) pode ser realizado reagindo os seguintes com-ponentes: de 0,05 a 20 porcento de ácido, e de 1 a 50 porcento de biomassa (com base no pe-so seco). Em certas implementações a mistura da reação do ácido brando compreende de 0,1a 12 porcento do ácido clorídrico, e de 3 a 25 porcento de biomassa (com base no peso seco).Ainda em uma outra modalidade as quantidades da solução compreendem de 0,5 a 5 porcentode ácido clorídrico e de 5 a 15 porcento de biomassa (com base no peso seco).

O tratamento com ácido brando pode ser realizado em uma temperatura de 60 °C a200 °C ou de 100 °C a 165 °C, ou em uma temperatura de 125 °C a 145 °C. Temperaturasmais altas podem ser usadas desde que ela não seja tão alta para converter uma quantidadesignificativa da quitina para formas solúveis. Similarmente, temperaturas mais baixas (tal como60 °C a 90 °C) podem ser usadas (especialmente com ácidos fortes relativamente concentra-dos, tal como HCI) desde que as paredes celulares sejam suficientemente quebradas paraliberar os produtos resíduos, por exemplo, lipídios, proteínas, e polissacarídeos indesejáveis,sem converter uma quantidade significativa de quitina para formas solúveis. Da maneira aquiusada "uma quantidade significativa de quitina para formas solúveis" com relação aos proces-sos descritos significa menos que uma quantidade que forneceria um baixo rendimento deglicosamina na composição final de glicosamina, menos que 10 % de quitina, ou menos que 5% de quitina, ou menos que 2 % de quitina.

Antes ou depois do tratamento com ácido brando, a biomassa fúngica (a) (ou os sóli-dos (e) retidos após a remoção do tratamento com ácido brando (d) dos produtos indesejá-veis) pode ser opcionalmente tratada com uma solução brandamente básica (b) da maneirasupradescrita e da maneira referenciada na figura 3. Embora as etapas do método sejam co-nhecidas e descritas em ordens específicas, deve-se entender que a ordem destas etapaspode ser variada sem fugir do método revelado.

Os sólidos (e) retidos após o tratamento com ácido brando (e opcionalmente o trata-mento de base branda (b)) são em seguida tratados com um ácido agressivo (f) da maneiradiscutida na modalidade anterior. Nesta modalidade, entretanto, uma grande porção das impu-rezas, basicamente glicanos, já foi removida da solução (entre etapas (d) e (e)). Conseqüen-temente, o tratamento com ácido agressivo (f) para converter quitina nos sólidos remanes-centes da biomassa fúngica em uma composição de glicosamina exige significativamente me-nos ácido. Por exemplo, com um tratamento com ácido agressivo em condições tal como HCI17 % e sólidos biomassa secos 10 % por 9 horas a 100 °C, o ácido clorídrico necessário naetapa do ácido agressivo poderia ser reduzido para 20 a 60 %.

Quando um pré-tratamento com ácido brando e processo de remoção do produto re-síduo são realizados antes de um tratamento com ácido agressivo, em virtude de ser necessáriousar menos ácido, a quantidade de solução de resíduo resultante final (entre etapas (h) e (i)) éum volume significativamente menor, comparado ao método omitindo o pré-tratamento comácido brando. O ácido necessário para tratar a biomassa é tipicamente caro; um menor volumede ácido é uma redução de custo significativa, especialmente durante a fabricação do produtoem uma escala comercial. O menor volume de solução acídica também permite um menoraparelho de separação para separar a composição de glicosamina da solução acídica. Emvirtude de o aparelho necessário para separar uma solução ácida concentrada como essa terque ser formado de materiais especiais (e caros) resistentes a atividades corrosivas de ácidosconcentrados, menor aparelho de separação economiza uma quantidade significativa em custosde fabricação de composições de glicosamina de biomassa fúngica, especialmente em umaescala comercial. Quando um pré-tratamento com ácido brando precede o tratamento comácido agressivo o volume menor de solução acídica faz com que menos resíduos da soluçãosejam tratados, uma vez que a composição de glicosamina é removida dela.

Composições de glicosamina são formadas durante o tratamento com ácido agressivo,seguido por um pré-tratamento com ácido brando da mesma maneira que as composições for-madas com tratamento com ácido agressivo sozinho.

Quando a quitina no sólido remanescente (e) é tratada com o ácido agressivo (f), gli-canos não removidos no processo de separação anterior são convertidos em composição be-néfica de componente de glicosaminas, tais como melanoidinas e ácido levulínico. Para alteraras concentrações de tais componentes da composição de glicosamina, pode-se permitir maisglicanos permanecerem no sólido remanescente (e).

Etapas do processo seguidas ao tratamento com ácido agressivo (f) são substancial-mente similares àquelas discutidas anteriormente.

Ainda em uma outra modalidade dos métodos para produzir composições de glicosa-mina de biomassa fúngica, maiores temperaturas e/ou pressões são utilizados com um trata-mento com ácido agressivo. Isto permite que a reação ocorra usando menos ácido ou em ummenor período de tempo do que o tratamento supramencionado do ácido agressivo. As faixasde temperatura para esta temperatura maior, tratamento com ácido agressivo são de 90 °C a160 0C1 por exemplo, de 105 °C a 160 C. A pressão aumentou naturalmente em função de rea-ções que ocorrem em um vaso selado.

Mais especificamente, biomassa fúngica é tratada na fase do tratamento com ácido a-gressivo com um ácido, tal como ácido de 4 a 20 % ou de 6 a 13 %. As baixas concentraçõesde ácido ainda convertem a quitina em solução em glicosamina em virtude de as condições dereação serem mudadas para aumentar os parâmetros de temperatura e/ou a pressão. Especifi-camente, a solução ácido/biomassa é colocada em um vaso selado de maneira tal que a reaçãopossa ocorrer em pressões ligeiramente acima da atmosférica até 10 atmosferas, ou ligeiramen-te acima da atmosférica até 4 atmosferas, tal como em 2 atmosferas. As pressões aumentadaspodem ser por causa da reação que ocorre a uma temperatura maior em um vaso selado ou areação pode ocorrer em um vaso em que a pressão é de outra aumentada.

A temperatura, se elevada, é preferivelmente de 90 0C a 160 °C, ou 100 0C a 140 °C,tal como 110 0C a 130 °C. A reação pode ocorrer em tais temperaturas elevadas nas pressõesapresentadas anteriormente ou for a de um vaso fechado em pressão atmosférica. Se a tempe-ratura da reação ocorre em um vaso fechado de 90 0C a 160 °C, as pressões serão geralmenteem pressão atmosférica a 5 atmosferas (65 psig). São obtidos bons resultados, por exemplo,com uma temperatura de reação de 120 0C e uma pressão de 1 atmosfera (ou 15 psig (0,1MPa)).

Outros métodos de aumentar a temperatura são disponíveis e incluídos nos métodospropostos, por exemplo, aumentando o ponto de ebulição pela adição de sais.

O restante dos métodos de maior temperatura e/ou pressão para produzir composiçõesde glicosamina de biomassa fúngica segue estas etapas esboçadas nos métodos supradescri-tos (tal como mostrado na figuras 2 ou 3). Exemplos específicos dos métodos de maior tempe-ratura e/ou pressão para produzir composições de glicosamina são apresentados a seguir.

D. Métodos para Produzir Composições de N-acetilglicosamina ou Composições deGlicosamina de Biomassa Fúngica

São também revelados métodos para produzir composições de N-acetilglicosamina(NAG) e/ou de glicosamina de biomassa fúngica em que são utilizadas uma etapa de pré-tratamento enzimático, uma etapa de separação e segunda etapa enzimática subseqüente.Além disso, são revelados métodos para produzir N-acetilglicosamina e/ou composições deglicosamina de biomassa fúngica em que uma etapa de pré-tratamento com ácido brando (ououtra etapa de pré-tratamento), uma etapa de separação, e etapa enzimática subseqüente paracxinverter quitina em N-cetilglicosamina são utilizados. Métodos são adicionalmente reveladosem que glicose presente na composição após converter quitina em N-acetilglicosamina é en-zimaticamente tratada para converter a glicose em formas iônicas removíveis. São tambémrevelados métodos em que as composições de N-acetilglicosamina são desacetiladas paraformar composições de glicosamina.

Biomassa fúngica tipicamente inclui uma porção significativa (pelo menos 15 % e atécerca de 50 % a cerca de 60 %) de glicanos intermisturados com a quitina. Além disso, emvirtude de os glicanos não serem solúveis em água, eles não são rapidamente removíveis dabiomassa fúngica. Em métodos da tecnologia anterior, tais como revelados na patente U.S.6.693.188, enzimas são utilizadas para degradar glicanos na biomassa ao mesmo tempo emque a quitina é degradada pelas enzimas para converter a quitina em NAG. Infelizmente, taismétodos fornecem uma quantidade desapontadora de quitina na biomassa sendo convertidaem NAG, em grande parte em virtude de os glicanos ainda estarem presentes na biomassaquando a quitina disponível é convertida em N-acetilglicosamina por tratamento enzimático.Tais glicanos interferem com a disponibilidade de quitina para interação com as enzimas, dei-xando uma grande porção da quitina intacta (isto é, uma grande porção da quitina não é con-vertida em NAG). Além da baixa conversão de porcentagem de quitina na biomassa fúngicaem NAG no método da patente 188, a taxa de conversão é também relativamente baixa (cercade 72 horas são necessárias para atingir a conversão máxima de quitina em NAG). Tabela 3apresenta a seguir dados de comparação para o tratamento de biomassa com uma etapa depré-tratamento antes de uma etapa de conversão com um método como esse em que ne-nhum pré-tratamento foi realizado antes da conversão da quitina em N-acetilglicosamina.

Tabela 3 apresenta uma comparação de altos rendimentos de NAG obtidos por di-gestão enzimática de quitina de biomassa fúngica pré-tratada, versus, baixos rendimentos etempo de reação longo em biomassa não tratada.

Tabela 3

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Os primeiros três tratamentos listados na tabela 3 foram realizados da maneira des-crita em patente U.S 6.693.188. O quarto e quinto tratamentos utilizados nos métodos atualmen-te revelados usando uma modalidade da biomassa pré-tratada com ácido brando (ácido cítrico0,1 %). Digestão enzimática no tratamento 4 usou uma combinação de quitinase e celulase,ao passo que, a digestão enzimática no tratamento 5 usou apenas quitinase. Tratamentos 4 e5 demonstraram conversão rápida de quitina em NAG1 comparado a tecnologia descrita naPatente 188. Além do mais, mais que 95 % da quitina foram digeridos em tratamentos 4 e 5,indicando maior disponibilidade de quitina para digestão enzimática por causa do pré-tratamento da biomassa. A capacidade de quitinase de ligar e rapidamente digerir quitina embiomassa pré-tratada é adicionalmente demonstrada na figura 10, que mostra a taxa relativa deformação de NAG durante as condições usadas no tratamento 4 da Tabela 3. Neste tratamen-to, acima de 80 % de digestão de quitina ocorreu por 7 horas.

Resultados superiores inesperados foram encontrados quando os métodos atualmen-te revelados foram utilizados de maneira tal que a biomassa fúngica foi tratada primeiro com umpré-tratamento da enzima de maneira tal que uma grande porção dos glicanos foram rapida-mente removíveis de maneira a não estar mais presentes para competir com a quitina paraexposição e conversão pelo tratamento da enzima. Mais especificamente, em certas modali-dades dos métodos revelados, a biomassa fúngica é primeiro submetida a uma etapa de pré-tratamento enzimático. A biomassa é pré-tratada não apenas para liberar para separação pelomenos uma porção de proteínas, lipídios, e polissacarídeos da biomassa, mas também de ma-neira tal, que uma porção significativa dos glicanos (cerca de 30 % dos glicanos presentes nabiomassa ou mais) são pré-tratados com enzimas de maneira a converter os glicanos em formasolúvel e assim removível.

Com referência à figura 9, a biomassa fúngica é submetida a uma etapa A de pré-tratamento. Etapa A de pré-tratamento quebra pelo menos uma porção dos glicanos na biomas-sa, mas não age para converter uma porção significativa da quitina para formas solúveis, talcomo em N-acetilglicosamina ou glicosamina. Da maneira aqui usada "uma quantidade signifi-cativa de quitina para formas solúveis" com relação aos processos descritos na figura 9 significamenos que uma quantidade que forneceria um baixo rendimento de glicosamina na composiçãofinal de glicosamina, por exemplo, menos que cerca de 30 % da quitina original, ou menos que10 % da quitina, ou menos que 5 % da quitina, são convertidos em formas solúveis. Os glicanosindesejáveis e outros componentes indesejáveis da biomassa são separados da quitina, porexemplo, por filtração.

Mais especificamente, a etapa A de pré-tratamento remove pelo menos alguns dos gli-canos, proteínas e/ou lipídios na fonte de biomassa fúngica convertendo-os em formas solúveis,que são em seguida separados da fração sólida, por exemplo, por filtração, da maneira descritaa seguir (em certas modalidades, cerca de 30 % dos polissacarídeos são convertidos em formassolúveis). Os sólidos remanescentes contêm uma concentração de quitina significativamentemaior, que na etapa de tratamento converte a quitina em NAG ou em glicosamina (descrita aseguir). Se uma etapa de pré-tratamento convertesse quitina em formas solúveis, tais como emglicosamina, NAG ou oligômeros de NAG, estas formas solúveis seriam removidas na etapa deseparação entre o pré-tratamento e tratamento e resulta em perdas de rendimento. Com a etapaA de pré-tratamento, tal como o pré-tratamento com ácido brando, por exemplo, um método detemperatura cítrica/alta, existe pouca ou nenhuma conversão de quitina em uma forma solúvel.Assim, o pré-tratamento com ácido brando (discutido a seguir) converte uma porção significativados glicanos, polissacarídeos, lipídios e proteínas em formas solúveis sem converter uma por-ção significativa da quitina em formas solúveis.

Na etapa A1 de pré-tratamento, a biomassa é misturada com enzimas de maneira aconverter uma porção significativa (pelo menos cerca de 20 %) dos glicanos presentes na bio-massa em forma(s) solúvel(s). As enzimas são tipicamente derivadas de micro organis-mo. As enzimas podem ser introduzidas na biomassa na presença do micro organismosdos quais elas são derivadas, que têm a vantagem de evitar uma etapa de separar asenzimas de seus organismos da fonte. Inclusão dos organismos da fonte pode ser vanta-josa em implementação onde o microorganismos continua a criar enzimas depois de tersido adicionado à biomassa fúngica.

Enzimas adequadas para a etapa de pré-tratamento (A1 na figura 9) incluem gli-canoses, laminarases, proteases ou celulases, tais como para quebrar parcialmente asparedes celulares de biomassa fúngica e para converter sólido glicanos bem como lipí-dios e/ou proteínas em formas solúveis sem converter uma porção significativa da quitinaem formas solúveis, tal como glicosamina ou N-acetilglicosamina. Os glicanos solúveis eoutros componentes solúveis indesejáveis da biomassa fúngica são em seguida removidosseparando os sólidos dos líquidos (usando meios convencionais tais como filtração, cen-trifugação, decantação, ou outros métodos de separação razoáveis).

Em modalidades alternativas outras etapas de pré-tratamento podem ser usadasem combinação ou como alternativas para a etapa A1 de pré-tratamento enzímático. Emcertas modalidades, a biomassa fúngica é pré-tratada com um pré-tratamento com ácidobrando, ver A2. Uma etapa de pré-tratamento com ácido brando como essa é descritaanteriormente em relação à composição de métodos de glicosamina.

Especificamente, em certas modalidades, o material de biomassa pode passarpor um pré-tratamento com ácido brando (A2, figura 9) seguido pelo tratamento da enzima(B, figura 9). Similar ao mostrado na figura 3 para formar uma composição de glicosami-na, nesta modalidade para produzir N-acetilglicosamina a biomassa contendo quitina (a)primeiro passa por um pré-tratamento com ácido brando (d). As condições de pré-tratamento com ácido (parâmetros compreendendo tempo, temperatura, tipo de ácido econcentração de ácido) usadas são "brandas" em comparação com o tratamento comácido agressivo (f) da maneira usada em alguns dos métodos de produção de glicosami-na. A hidrólise ácida que ocorre nas condições relativamente brandas permite a remoçãode constituintes indesejáveis da biomassa antes do pré-tratamento A1 da enzima ou otratamento da enzima B da maneira mostrada na figura 9.

Um ácido brando pode ser usado para quebrar as paredes celulares da biomas-sa fúngica de maneira tal que proteínas, lipídios e polissacarídeos indesejáveis possamser removidos antes para converter a quitina em N-acetilglicosamina através do tratamen-to da enzima (B, figura 9). A concentração de ácido durante o tratamento com ácidobrando pode ser ácido de 0,01 a 20 % ou 0,05 a 1 % p/p, tal como HCL ou um ou maisácidos orgânicos, tal como ácido cítrico. Faixas de porcentagem do ácido variam depen-dendo da temperatura e tempo do pré-tratamento. Concentrações mais altas de soluçõesde ácido forte, ou ácidos diferentes, ou ácidos misturados, podem ser usadas para que-brar as paredes celulares mais rapidamente, e as condições de reação ainda devem seradaptadas para controlar a conversão prematura indesejável da quitina em formas solú-veis. Similarmente, baixas concentrações de ácidos fortes, ácidos fracos ou ácidos mis-turados podem ser usadas (especialmente a temperaturas relativamente mais altas, porperíodos de tempo mais longos, ou a concentrações mais altas) de maneira tal que as pa-redes celulares sejam suficientemente quebradas para disponibilizar a remoção de umaporção substancial ou desejável dos constituintes externos da biomassa, por exemplo,lipídios, proteínas e polissacarídeos indesejáveis.

Um tratamento com ácido brando pode ser realizado reagindo os seguintescomponentes: de 0,01 a 16 % de ácido cítrico, e de 5 a 30 % de biomassa (com base nopeso seco). Em certas implementações a mistura da reação do ácido brando compreen-de de 0,01 a 3 % do ácido clorídrico, e de 3 a 25 % de biomassa (com base no peso se-co). Ainda em uma outra modalidade as quantidades da solução compreendem de 0,05 a5 porcento de ácido clorídrico e de 5 a 15 porcento de biomassa (com base no peso seco).

O tratamento com ácido brando pode ser realizado a uma temperatura de 60 0Ca 200 0C ou de 70 0C a 105 °C, ou a uma temperatura de 80 0C a 120 °C. Temperaturasmais altas (por exemplo, 100 a 200 0C com um ácido orgânico, tal como ácido cítrico) po-dem ser usadas desde que elas não sejam tão altas a ponto de converter uma quantida-de significativa da quitina em formas solúveis. Similarmente, temperaturas mais baixas(tal como 60 0C a 90 °C) podem ser usadas (especialmente com ácidos fortes relativa-mente concentrados) desde que as paredes celulares sejam suficientemente quebradaspara liberar os produtos resíduos, por exemplo, lipídios, proteínas, e polissacarídeosindesejáveis, sem converter uma quantidade significativa de quitina em formas solúveis.

Da maneira aqui usada "uma quantidade significativa de quitina para formas solúveis"significa menos que uma quantidade que forneceria um baixo rendimento de N-acetilglicosamina na composição final de N-acetilglicosamina, menos que 10 % da quiti-na, ou menos que 5 % da quitina, ou menos que 2 % da quitina.

Antes, depois ou em vez do pré-tratamento da enzima e/ou o pré-tratamento com ácidobrando, a biomassa fúngica (ou os sólidos retido depois do tratamento com ácido brando e re-moção dos produtos indesejáveis) pode opcionalmente ser tratada com uma solução brandamen-te básica (A3, figura 9) da maneira supradescrita e da maneira referenciada na figura 3 em rela-ção a composição de métodos de glicosamina. Embora etapas do método sejam conhecidas edescritas em ordens específicas, deve-se entender que a ordem destas etapas pode ser variadasem fugir dos métodos revelados.

Por exemplo, em certas modalidades, uma concentração de menos que 10 porcentode hidróxido de sódio é adicionada à biomassa fúngica ou aos sólidos separados depois do pré-tratamento usando enzimas e/ou ácido brando pré-cozido. A solução básica é aquecida a umatemperatura relativamente elevada por um período de tempo suficiente para remover uma quan-tidade desejável do material contendo não quitina, tal como proteínas e lipídios. Este período detempo pode ser menos que duas horas. Um exemplo específico deste método de pré-tratamento envolve aquecer a biomassa fúngica ou sólidos separados de 100 ° a 125 0C emuma solução de hidróxido de sódio de 1 a 8 porcento por 20 a 60 minutos. Alternativamente, aconcentração de hidróxido de sódio pode ser 1 a 4 porcento. Modalidades em que a biomassa étratada com uma solução básica, proteína e glicanos são hidrolisados na biomassa. Estes sub-produtos são removidos, por exemplo, por filtração. A remoção de tais proteínas e outros produ-tos resíduos pode ser seguida por tratamento para remover proteínas solúveis, aminoácidos, eoutras impurezas.

Ainda uma outra alternativa para tratar a biomassa com um pré-tratamento da enzimaou um pré-tratamento com ácido brando ou básico pode compreender pré-tratar mecanicamentee/ou ultra-sonicamente a biomassa fúngica para quebrar fisicamente as paredes celulares deforma que proteínas e lipídios indesejáveis nas células possam ser removidos antes de extrair aquitina das paredes celulares dela. Tal tratamento mecânico poderia ser seguido por qualquerdos outros pré-tratamentos revelados, A1-A3, figura 9.

Após o pré-tratamento da biomassa fúngica os sólidos são isolados usando qualquermétodo de separação adequado, tal como filtração, prensa de filtro, e/ou centrífuga de decanta-ção. O sólidos separados são em seguida submetidos ao tratamento de conversão de enzimapara converter a quitina em N-acetilglicosamina (B, figura 9). Novamente, as enzimas são tipi-camente derivadas de micro organismo. As enzimas podem ser introduzidas nos sólidos pré-tratados na presença do micro organismos dos quais elas são derivadas, que têm a vanta-gem de evitar uma etapa de separar as enzimas de seus organismos da fonte. Inclusãodos organismos da fonte pode ser vantajosa em implementação onde os microorganis-mos continuam a criar enzimas após terem sido adicionados aos sólidos pré-tratados.

Enzimas adequadas para a etapa de tratamento de conversão de enzima (B nafigura 9) incluem quitinases, glicanoses, celulases e outras enzimas que têm atividadeespecífica ou não específica que as permite hidrolisar formas poliméricas ou oligoméri-cas de quitina e/ou glicano, tal como laminarase, amilase, glicoamilase e outros. Combi-nações de enzimas podem ser usadas, tal como quitinase e celulase, da maneira de-monstrada na tabela 4. Em certas condições de reação, tal como variação do pH, com-posição do tampão, e temperatura, a inclusão de outras enzimas, além da quitinase, re-sulta em digestão mais rápida ou completa de quitina em NAG.

Tabela 4

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Glc = glicose

O tratamento de conversão de enzima pode ocorrer a uma temperatura de cercade 25 °C a cerca de 90 °C, ou de uma temperatura de cerca de 50 °C a cerca de 70 °C,ou preferivelmente a cerca de 50 0C a cerca de 55 °C. Conversão em temperaturas rela-tivamente altas como essas fornece supressão ou destruição de microcontaminação dacomposição resultante de N-acetilglicosamina com contaminantes tal como a maioria das bac-térias, fungos e leveduras.

O pH do tratamento de conversão de enzima (B, figura 9) pode ser cerca de 3,0 acerca de 9,0, ou de cerca de 4,5 a cerca de 8,0, ou de cerca de 5,0 a cerca de 7,5. Tampõesusados para praticar o tratamento de conversão de enzima incluem, quaisquer tampões ade-quados, tais como acetatos, fosfatos, e citratos. O tratamento de conversão de enzima forneceexcelente rendimento de N-acetilglicosamina em um período de tempo de cerca de 2 horas acerca de 24 horas, ou de cerca de 4 horas a cerca de 16 horas, ou por cerca de 5 horas acerca de 10 horas.

Usar o tratamento de conversão de enzima revelado fornece um alto rendimento dequitina na conversão de N-acetilglicosamina, certas modalidades convertem pelo menos cercade 90 % ou mais da quitina nos sólidos pré-tratados e em certas modalidades pelo menos cercade 95 % ou mais da quitina é convertida em NAG. (Ver TabeIa 4.)

Após o tratamento de conversão de enzima o filtrado líquido é isolado usando méto-dos de separação convencionais tal como centrifugação, filtração, etc. O filtrado é em seguidatratado para formar glicosamina em certas modalidades da invenção (E, figura 9). Esta moda-lidade particular para formar glicosamina é discutida mais detalhadamente a seguir. Se o fil-trado não tiver que ser tratado para formar glicosamina do NAG1 então esta etapa de isola-mento pode ser realizada depois do tratamento de glicose da enzima (C, figura 9).

O filtrado líquido obtido quando a quitina é convertida em N-acetilglicosamina tambémcontém uma quantidade significativa de glicose (de cerca de 10 % a cerca de 100 % da concen-tração de NAG - esta quantidade depende da extensão e efetividade da etapa de pré-tratamento da maneira ilustrada nos Exemplos a seguir) bem como enzimas, tampões e íonsresiduais da biomassa. Glicose pode ser separada da N-acetilglicosamina usando resinas cro-matográficas ou outros métodos similares, mas tais métodos de separação são tipicamentedifíceis e caros. O filtrado líquido contendo o N-acetilglicosamina e glicose (quer isolado damaneira discutida anteriormente ou não) em certas modalidades dos métodos revelados éassim tratado para um segundo tratamento da enzima para converter glicose em formas tôni-cas de glicose que são mais rapidamente separáveis da N-acetilglicosamina (C, figura 9). Aglicose é assim, preferivelmente enzimaticamente tratada para converter a glicose em formasiônicas (C, figura 9), tal como ácido glicônico usando glicose oxidase. As composições de NAGresultantes podem incluir algumas quantidades inferiores de glicose remanescente bem como osal de ácido glicônico ou outras espécies iônicas, que são em seguida separáveis das moléculasde N-acetilglicosamina neutras junto com as enzimas, tampões e outros sais que podem estarpresentes (ver Exemplos a seguir). Métodos de separação incluem resinas de troca iônica eeletrodiálise.

Enzimas adequadas para converter a glicose incluem, mas sem limitações, glicose oxi-dase, glicose-1-deidrogenase e hexoquinase.

O tratamento de conversão de enzima pode ocorrer a uma temperatura de cerca de40 0C a cerca de 60 cC, ou de uma temperatura de cerca de 45 0C a cerca de 55 0C, ou preferi-velmente a cerca de 50 0C a cerca de 55 °C. Conversão em temperaturas relativamente altascomo essas fornece supressão ou destruição de micro contaminação da composição resultantede N-acetilglicosamina com contaminantes tais como a maioria das bactérias, fungos e Ievedu-ras,-

O pH do tratamento de conversão de enzima pode ser cerca de 3,5 a cerca de 7,5, oude cerca de 4,5 a cerca de 7,0, ou de cerca de 5,0 a cerca de 6,0. Tampões usados para prati-car o tratamento de conversão de enzima incluem, quaisquer tampões adequados, tais comoacetatos, fosfatos e citratos. O tratamento de conversão de enzima fornece excelente conversãode glicose em um período de tempo de cerca de 1 hora a cerca de 24 horas, ou de cerca de 2horas a cerca de 16 horas, ou por cerca de 5 horas a cerca de 10 horas.

Usar o tratamento de conversão de enzima revelado fornece uma alta conversão deporcentagem de glicose em ácido glicônico. Certas modalidades convertem pelo menos cercade 90 % ou mais da glicose no filtrado líquido de tratamento B e em certas modalidades pelomenos cerca de 95 % ou mais da glicose é convertida em ácido glicônico. (Ver Tabela 15.)

Alternativamente, outros métodos podem ser usados para separar glicose da N-acetilglicosamina, tal como, o uso de resinas cromatográficas para separar N-acetilglicosaminade glicose, sais, tampões, e enzimas. Resinas típicas são baseadas nas afinidades com os gru-pos funcionais das moléculas. Resinas baseadas nos polissulfonas ou com grupos amino livressão adequados para a separação em vez do tratamento enzimático.

Em certas modalidades para produzir etapas BeC das composições de N-acetilglicosamina (figura 9) são conduzidas simultaneamente. Ou seja, em certas modalidadesos sólidos do pré-tratamento isolados são tratados com enzimas para converter quitina em N-acetilglicosamina e para converter glicose em formas iônicas. Tais modalidades incluem com-binações de enzimas incluindo quitinases ou quitinases mais enzimas auxiliares (tal como gli-canoses, celulases, laminarases, ou outros) que convertem quitina em N-acetilglicosamina,juntamente com glicose oxidase ou outras enzimas que convertem glicose em formas iônicastal como ácido glicônico. A execução simultânea das etapas BeC reduz o custo no processo.

O tratamento de conversão de enzima combinado descrita nas etapas BeC podeocorrer a uma temperatura de cerca de 40 °C a cerca de 60 °C, ou de uma temperatura decerca de 45 °C a cerca de 55 °C, ou preferivelmente a cerca de 50 °C a cerca de 55 °C. Con-versão a temperaturas relativamente altas como essas fornece supressão ou destruição demicro contaminação de a composição resultante de N-acetilglicosamina com contaminantestal como a maioria das bactérias, fungos e leveduras.

O pH do tratamento de conversão de enzima pode ser cerca de 3,5 a cerca de 7,5, oude cerca de 4,5 a cerca de 7,0, ou de cerca de 5,0 a cerca de 6,0. Tampões usados para pra-ticar o tratamento de conversão de enzima incluem, quaisquer tampões adequados, tais comoacetatos, fosfatos, e citratos. O tratamento de conversão de enzima fornece excelente conver-são de quitina em N-acetilglicosamina e excelente conversão de glicose em ácido glicônicoem um período de tempo de cerca de 1 hora a cerca de 24 horas, ou de cerca de 2 horas acerca de 16 horas, ou de cerca de 5 horas a cerca de 10 horas. (Ver Tabela 18)Usar o tratamento de conversão de enzima revelado fornece uma conversão simul-taneamente alta de porcentagem de glicose em ácido glicônico, e alta conversão de quitina emN-acetilglicosamina. (VerTabela 18)

Com referência à figura 9, em certas modalidades, após o tratamento de conversãode enzima de glicose (C, figura 9), o N-acetilglicosamina no caldo é convertido em glicosamina(E, figura 9), da maneira discutidas a seguir. Em modalidades onde umas composições de N-acetilglicosamina são desejadas, a N-acetilglicosamina é separada do caldo (o caldo contendoas formas iônicas de glicose e NAG) utilizando resinas de troca aniônicas, tais como PurolitePCR-822 (Purolite Co., Philadelphia1 PA) ou Diaion UBK530 (Mitshubishi Chemical Corp.,Tokyo, Japan), (Ver Exemplos a seguir), ou cromatografia de afinidade tais como resinas áci-do polissulfônico, etc. (D, figura 9), ou por filtração da membrana ou eletrodiálise. Para sepa-ração de resina de troca iônica, o pH do caldo é ajustado para uma faixa de cerca de 5 a cercade 9 usando, por exemplo, hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio. Tipicamente, as resi-nas são operadas em temperaturas ligeiramente elevadas, tal como 40 a 80 0C ou, mais prefe-rivelmente, 50 a 60 °C, para minimizar contaminação microbiológica. A N-acetilglicosaminaseparada é em seguida cristalizada e seca (F, figura 9) usando métodos convencionais talcomo cristalização evaporativa ou precipitação com solventes miscíveis em água tais comoetanol, isopropanol, ou acetona, seguido por uma etapa de secagem tais como secagem deluz, secagem em tambor duplo, ou secagem a vácuo. Alternativamente, a N-acetilglicosaminapode ser seca usando secagem por aspersão ou secagem em tambor duplo com ou sem umaetapa de evaporação/concentração preliminar. Tecnologia da membrana pode também serusada para remover pelo menos um pouco da água das composições de N-acetilglicosaminaantes de secagem, tal como a membrana de nanofiltração Koch SR3. Em virtude de as com-posições de N-acetilglicosamina aqui reveladas serem formadas utilizando conversão de en-zima de quitina, diferentes composições convencionalmente disponíveis de N-acetilglicosamina, as presentes composições não são apenas kosher (não sendo formadas demarisco) e são marisco sem alergênico, mas também são formados de uma fonte natural. Meiosconvencionais para produzir N-acetilglicosamina incluem processos de desacetilação e ré ace-tilação que exigem mudanças estruturais químicas das moléculas.

Em certas modalidades dos métodos revelados, a N-acetilglicosamina nos filtrados deetapas B e/ou C é convertida em glicosamina (E, figura 9). A N-acetilglicosamina é desacetila-da para formar glicosamina, por exemplo, por hidrólise ácida ou desacetilação enzimática. AN-acetilglicosamina é convertida em glicosamina adicionando cerca de 10 a 800 % de exces-so molar HCI com relação a N-acetilglicosamina presente no filtrado. Por exemplo, um filtradode N-acetilglicosamina 7 % em peso exigiria entre cerca de 11 e 80 g de HCI por quilogramade filtrado (cerca de 1 a 8 % em peso). Concentrações mais altas de ácido levam a maiorestaxas de hidrólise e geralmente exigem temperaturas de hidrólise mais baixas. Outros ácidosminerais, tais como ácido sulfúrico e fosfórico, podem ser usados, mas seu uso leva a etapas depurificação mais difíceis posteriormente no processo por causa da sua baixa volatilidade.

A mistura do filtrado de HCI é aquecida até uma temperatura de cerca de 80 acerca de 100 °C (por exemplo, cerca de 95 °C) por de cerca de 1 a cerca de 6 horas (porexemplo, 3 horas). A N-acetilglicosamina pode ser desacetilada em glicosamina tantosem conversão anterior de glicose quanto após o tratamento de conversão de enzima deglicose (C, figura 9). Se a N-acetilglicosamina é convertida em glicosamina (E, figura 9)sem conversão anterior de glicose (depois de B, figura 9) em seguida em certas modali-dades dos métodos revelados uma prensa de filtro pode ser usada na composição deglicosamina antes da solidificação da glicosamina (F, figura 9). A composição de glico-samina pode ser solidificada (F, figura 9) por métodos convencionais tais como cristali-zação evaporativa, cristalização com desidratação de membrana, evaporação ou desi-dratação de membrana seguida por precipitação usando solventes orgânicos tais comoetanol ou isopropanol, secagem, liofilização, etc.

A formação de glicosamina com o método supra-revelado permite a produção deglicosamina usando quantidades relativamente pequenas de ácidos a concentrações rela-tivamente baixas (por exemplo, HCI 3 %). Mais especificamente, a formação das compo-sições de glicosamina a partir das composições de N-acetilglicosamina da maneira des-crita utiliza pelo menos cerca de 50 % menos de HCI (ou outro ácido), comparado commétodos onde a glicosamina é formada diretamente da quitina. Menores quantidades deácido permitem menores custos por causa do menor corrosão de equipamento e da capa-cidade de usar certos equipamentos que de outra forma seriam degradados quando foremnecessárias maiores concentrações e quantidades de ácido. Além disso, os métodos deconversão de glicosamina via N-acetilglicosamina reduzem perigos de segurança na usi-na onde a glicosamina é formada, em parte por causa das baixas concentrações de áci-do e em virtude de a conversão em glicosamina ocorrer em ácidos a temperaturas maisbaixas, abaixo dos pontos de fusão dos ácidos usados e/ou pressões. As menores quan-tidades de ácido e baixas concentrações também reduzem a quantidade de resíduo quí-mico perigoso que deve ser disposto.

E. B-glicano Composições

Glicano pode referir-se a um polímero de glicose em general. Existem muitos ti-pos de glicanos, que são definidos adicionalmente pela união (ligações) entre as molécu-las de glicose no polímero. A ligação glicosídica pode ser tanto em uma forma a quanto β,uma vez que glicose existe como dois anômeros. Os glicanos β têm sido o foco de com-posições de fibra dietária, composições de redução do colesterol e outros usos no bene-fício da saúde, bem como imunoestimulantes para alimento animal, uso humano e parauso com lavouras. As fórmulas gerais variam nas diferentes modalidades de glicano β talcomo a porcentagem de B-1,3, /?-1,4, /?-1,6, B-1,3,6, e a razão de ligações glicosídicas a paraβ, bem como distribuições de comprimentos de cadeia e peso molecular.

Da maneira aqui usada, composição de /?-glicano ou /?-glicanos significam, pelo menosem parte, um grupo de polissacarídeos (açúcares) composto de monômeros /?-D-glicose Iiga-dos entre si por ligações glicosídicas incluindo ligações glicosídicas /?-1,3, /?-1,4 e /?-1,6 e podeincluir ramificações compreendendo glicosídicas ligações /?-1,3,6.

Também da maneira aqui usada, B-glicanos solúveis significa /?-glicanos solúveis emsistemas aquosos em pelo menos cerca de 20 porcento em peso. Solubilidade é definida comoa quantidade dos /?-glicanos nas composições que produzem soluções estáveis em sistemasaquosos, incluindo soluções neutras, ácidas ou básicas, sem sinais visíveis de sedimentação.Solubilidade é medida adicionando uma quantidade conhecida da composição de /?-glicano nosolvente em excesso da solubilidade, em seguida separando a porção solúvel dos sólidos nãodissolvidos e medindo os sólidos secos na solução resultante. A separação da porção não dis-solvida pode ser obtida por centrifugação ou simples sedimentação com o tempo por causa dagravidade. Alternativamente, pequenas quantidades da composição de /?-glicano são adiciona-das ao solvente até que a dissolução não mais ocorra em um período de tempo razoável, porexemplo, uma a duas horas. A soma das quantidades adicionadas que produz uma soluçãoestável representa a solubilidade da composição.

Da maneira aqui usada, uma solução estável não tem sedimentação visível, ou subs-tancialmente nenhuma sedimentação, onde sólidos são decantados no fundo, ou ficam por cimana solução. Significativamente ou substancialmente nenhuma sedimentação significa menosque cerca de 5 % de matéria insolúvel em uma composição não purificada, ou, para uma com-posição purificada, menos que cerca de 2 % de matéria insolúvel e preferivelmente menos quecerca de 1 % de matéria insolúvel na solução estável. Uma outra maneira na qual se determinase a solução é uma solução estável de maneira tal que a solução seja solúvel em água na formaaqui definida é quando um feixe de luz, tal como de um apontador laser usado para apresenta-ções, sai abundantemente de uma cubeta contendo uma solução amostra com o mesmo vetordo feixe de luz incidente, ou que chega. Se a maior parte ou toda a luz for dispersa em muitasdireções pela amostra, ela não é uma solução, mas uma suspensão - ou seja, ela não é solúvelem água na forma aqui definida.

Por exemplo, uma amostra da composição B-glicano purificada e precipitada foitestada adicionando-a a água a 5 %, 10 %, 15 %, e 20 % em peso. As soluções forammisturadas usando uma misturadora de vórtice, em seguida deixada descansar por duashoras. No final desse tempo, o sedimento, caso haja, foi muito pouco para observar aolho nu. Um feixe do apontador laser vermelho (VWR Scientifíc), transmitido através dasolução e que apareceu em um pedaço de papel branco detrás da amostra indicando quea luz não foi significativamente dispersa em muitas direções pela amostra.Da maneira aqui usada, B-glicano fúngico ou B-glicanos significa um grupo depolissacarídeos fúngicos (açúcares) composto predominantemente de monômeros β-Ώ-glicose ligados por ligações glicosídicas incluindo ligações glicosídicas B-1,3, /M ,4 e /M ,6e podem incluir ramificações compreendendo glicosídicas ligações /M ,3,6. fúngica 1-glicano ou B-glicano significa um grupo de polissacarídeos fúngicos (açúcares) compostopredominantemente de monômeros B-D-glicose ligados entre si por ligações glicosídicasincluindo ligações glicosídicas B 1 ,3, B-1,4 e B-1,6 e podem incluir ramificações compre-endendo glicosídicas ligações B-1,3,6 em que os B-glicanos são solúveis em sistemas a-quosos em pelo menos cerca de 20 peso porcento. Ter B-glicano de uma fonte fúngicaderivada é especialmente usado com a composição B-glicano quando usada com relaçãoao tratamento de lavouras. B-glicanos de fonte fúngica podem ser efetivos na proteçãode plantas de ataque fúngico, já que os B-1,3-glicanos de biomassa fúngica podem esti-mular uma resposta imune antifúngica.

Da maneira aqui usada, o termo hidrolisar significa clivar ligações em um polí-mero ou composto pela adição de água. Em que, da maneira aqui usada, água não éconsiderada um ácido.

As composições de B-glicano aqui reveladas podem ser na forma purificada oubruta, e podem ser sólidas ou líquidas, tais como xaropes. As composições de B-glicanoincluem B-glicanos solúveis em sistemas aquosos, e certas modalidades incluem β-glicanos solúveis em água. Os B-glicanos solúveis revelados são de biomassa fúngica eestão em um estado natural como produtos químicos (sem ser água) e não são usadosnos processos revelados, de maneira tal que a estrutura dos B-glicanos nas composi-ções reveladas têm mínima mudança geral na estrutura química ou nas formas dos gru-pos funcionais, tais como aquelas causadas por agentes oxidantes. Composições de β-glicanos solúveis são especialmente usadas para certas aplicações. Por exemplo, β-glicanos solúveis são facilmente transportados através do trato digestivo e são transportáveispara o sistema circulatório. Além disso, com uma composição de B-glicano solúvel purificada, émuito mais fácil assegurar que a dosagem de yff-glicano dada tem um parâmetro ativo mensu-rável para garantir segurança.

Em certas modalidades, os B-glicanos solúveis são coleções de polissacarídeos ten-do um peso molecular médio de cerca de 342 a cerca de 1.000.000. Em certas modalidades,mais que cerca de 80 % em peso dos B-glicanos solúveis têm um peso molecular médio decerca de 1.000 a cerca de 1.000.000. O peso molecular médio depende de condições de pro-cesso, tais como temperatura, tempo e acidez, da maneira discutida a seguir. Se purificadopor precipitação, o peso molecular médio pode também depender da razão de solventes or-gânicos para água e da temperatura. Um B-glicano de peso molecular relativamente alto teráuma menor solubilidade em um solvente, e assim uma menor razão de solvente água leva aum produto de maior peso molecular médio.

Cromatografia de Exclusão de Tamanho usando o sistema Dionex Summit Liquid C-hromatography (Dionex, Sunnyvale1 CA) com colunas TSK-GEL®,G4000PWXL, G3000PWXLe G2500PWXL 7,8 mm χ 30 cm (Tosoh Bioscience , Montgomeryville1 PA), em série foramempregadas para medição de peso molecular de B-glicanos solúveis a 30 °C. Água e Pullulan(Shodex, P-82, MW 5,650 - 710,500, American Polymer Standard, Mentor, OH), glicose, mal-tose, maltotriose e maltoexose (Sigma, St. Louis, MO) foram usados como eluente e padrãode calibração. A vazão foi 0,5 mL/minuto. Os dados foram processados usando o softwareCirrus® GPC (Polímero Laboratories, Amherst, MA).

Certas modalidades das composições de B-glicano solúveis reveladas atendem oscritérios seguintes (todos os valores são porcentagem em peso de produto seco):

Tabela 5

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Certas modalidades dos /?-glicanos solúveis fúngicos revelados atendem os crité-rios seguintes:

Tabela 6

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Proporção alβ 1/8 (89% de β) ou de cerca de 1/20 até cerca de 1/5

Outras modalidades c! as composições de B-glicano fúngicos solúveis reveatendem os critérios na tabela 7.

Tabela 7

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Certas modalidades das composições de B-glicano fúngico solúveis aqui revela-das foram comparadas com B-glicano não fúngico para confirmar o entendimento de queB-glicano fúngico contém uma grande porcentagem em peso de B-1,3-glicano. Especifi-camente, B-glicano fúngico solúvel da presente revelação formado usando métodos damaneira aqui revelada para isolar B-glicano de uma fonte de A. niger foi comparado comglicanos de cevada, com os resultados mostrados a seguir na tabela 8.

Tabela 8

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Certas composições de B-glicano são usadas como constituintes de fibras dietárias.Fibras dietárias não são digeridas antes de chegar ao cólon, isto é, a porção de polissacarí-deos não digerida no intestino delgado é considerada fibras dietárias. O digestibilidade é umamedida chave de fibras dietárias. Digestibilidade mede a fração dos glicanos que é quebradaem glicose antes de chegar ao cólon. Certas modalidades dos B-glicanos fúngicos incluemglicanos em que 79-87 % em peso dos glicanos não são digeríveis no intestino delgado, e sãoassim considerados fibras dietárias.

Para determinar a digestibilidade das composições de B-glicano, um ensaio de diges-tibilidade in vitro seguinte foi usado. O teste determina a fração de fibras digeríveis em umaamostra, expondo-se a amostra a pó intestinal de rato reconstituído. Este material contém todosos conteúdos do intestino do rato, incluindo as enzimas intestinais. Fibras indigeríveis são con-sideradas fibras dietárias. Primeiro, 2 mL de uma solução de B-glicano 2 % foram misturadoscom 0,1 g de pó intestinal de rato (Sigma, 11630, St. Louis, MO), 20 pL de NaN3 5 %, 0,5 mLde 20 mM de tampão de fosfato, pH 6,5, e 1,48 mL de água. A mistura da reação foi incubadaa 37 °C com leve agitação. Uma fração de 0,5 mL das amostras foi retirada no tempo 0 e 4horas com uma pipeta graduada descartável depois da mistura completa, e misturada com 1mL de HC11,0 N para interromper as atividades enzimáticas adicionais. A mistura da reação foifiltrada usando um filtro de seringa. O teor de glicose foi determinado por HPLC usando umacoluna H Plus Varian MetaCarb1 300 χ 7,8 mm (Varian, Walnut Creek, CA). A fase móvel foiH2SO4 0,01 Nea vazão foi 0,4 mL /min. Detector de índice refrativo foi usado como o detector.

A digestibilidade foi calculada da seguinte maneira:

Glc (%)Amostra = [CSpadrã0 X (PAamostra/PApacjrão) X 1,5 mL X D] X 100/CamostraOnde:

Glc (%)amostra = glicose % em peso na amostraCSpadrao = concentração do padrão em mg/mLPAamostra = área de pico da amostraPApadrão = área de pico do padrãoD = fator de diluição, 6

Camostra = concentração da amostra em mg/10 mLDigestibilidade = [GIc(0Zo)4hr - Glc (%)0hr]/(1 - Glc(%)0hr)

Tabela 9

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Fibras de levedura beta foram obtidas da Cargill Health & Food Technologies sior, W. FiberSoI 2H, Matsutani Chemical (Japão).

Pureza na forma aqui definida refere-se à porcentagem da composição de B-glicanosuscetível a despolimerização por enzimas específicas. Um teste de pureza serve a duasfunções, em que ele reporta a porcentagem da composição suscetível a enzimas usadas, eserve para ilustrar as diferenças entre composições de glicano.

Pureza de certas modalidades das composições B-glicano fúngico reveladas foi deter-minada usando um teste enzimático que determina a fração convertida a glicose por enzimasespecíficas. Este teste surgiu com base em que glicanos podem ser misturas complexas dediferentes biopolímeros, e assim o teste determina a "pureza" da estrutura de glicano particu-lar suscetível a enzimas específicas no estojo de teste.

Enzimas compreendendo Iichenase e B-glicosidase, obtidas da Megazyme Internati-onal Ireland Limited (Bray, Co. de Wicklow, Irlanda), são projetadas para medir a "pureza" deglicanos derivados de grãos, tal como aveias ou levedura. Essas enzimas são de origem alta-mente específica. Ou seja, glicanos originados de grãos exigem sistema de enzima originadode grãos e glicanos fúngicos exigem sistemas de enzima fúngica. Diferentes sistemas de en-zima exigem diferentes condições, tais como temperatura, pH, sistema tampão para ativida-des ideais. As enzimas de grãos não afetam significativamente os glicanos de biomassa fún-gica tal como A. niger. Se uma enzima, tal como Genencor B-glicanose 750 L disponível pelaGenencor, Rochester, NY, for utilizada, certas modalidades das composições de B-glicano fún-gico reveladas têm uma pureza de glicano de cerca de 60 % até 100 % em peso, dependendodas condições de teste, certas composições de glicano fúngico de biomassa têm uma purezade glicano 100 % em peso. A especificidade das enzimas exigida para quebrar o glicanos dife-rencia as estruturas de glicanos de várias fontes.

Tabela 10

Resultados de Pureza de Glicano Utilizando Diferentes Sistemas de Enzima

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1. Estojo de teste MegaZyme compreendendo enzimas lichenase e B-glicosidase, oprocedimento fornecido pelo fabricante foi rigorosamente seguido para testar a pureza de glica-no de um padrão de farinha de levedura (fornecido pelo fabricante, MegaZyme International,Irlanda) e glicanos isolados da biomassa fúngica. O produto final, porcentagem de glicose foideterminada por um método HPLC.

2. Sigma A. niger β-glicanose (disponível pela Sigma, #49101, St. Louis, MO) foi u-sado além da capacidade da enzima em condições ideais: tampão de acetato de sódio 50mM, pH 5,0, 37°C por 1 hora.

3. Genencor B-glicanose 750 L (102-03338-001, Genencor, Rochester, NY) foi usa-do além da capacidade da enzima a pH 4,0, a 60 °C por 17 horas.

4. Padrão de farinha de levedura foi fornecido pelo fabricante do estojo de teste (Me-gaZyme International, Ireland). O teor de B-glicano reportado é 4,19 % em peso.

5. Dois lotes de B-glicanos foram preparados internamente (ver Exemplo G3).

Não existe nenhum método universal para determinara pureza de todos os diferentestipos de glicanos. Portanto, a pureza do glicano depende do sistema de enzimas e de suacondição de reação usada para determinação. Assim, é revelado o método de teste específicousado para determinar a pureza das composições de glicano reveladas.

Modalidades das composições de B-glicano fúngico solúveis foram analisadas pelosníveis de pureza da seguinte maneira. Uma quantidade de 20 mg da composição de B-glicanofoi dissolvida em 25 mL de água. Um fração compreendendo 0,1 mL da amostra foi transferidapara um tubo de teste de 16 χ 100 mm tendo uma tampa rosqueada revestida com Teflon. Umafração de 1 mL da solução da enzima foi misturada com a amostra. A mistura foi em seguidaincubada a 60 °C em um banho de água por 17 horas. No final da incubação, 3,9 mL de águaforam adicionados. A mistura da reação foi filtrada e o teor de glicose foi medido usando umaHPLC Dionex consistindo em um forno de coluna Modelo LC25, bomba de gradiente GP50,detector eletroquímico ED40, autoamostrador AS40, e gerador de eluente EG40 com PAD (de-tector amperométrico pulsado).Para cada amostra, uma peça em bruto da amostra foi preparada adicionando 1 ml_ deágua em vez de 1 mL de solução de enzima.

A pureza da composição de B-glicano foi calculada da seguinte maneira:Pureza (%) = Cpadrão x [(PAamOStra — PApeia em bruto da amostra )/PApadrão] X 50 X 25 mL X(162/180)/Wamostra

F. Métodos para Produzir Composições de B-glicano Fúngico

São também revelados métodos para produzir composições de B-glicano solúveis apartir de biomassa fúngica. Com referência à figura 12, a biomassa fúngica é escolhida damaneira supradiscutida. Em certas modalidades, a biomassa é tipicamente composta de cercade 60-65 % em peso de glicano, 18-22 % de quitina e proteínas, lipídios, mananos e galacta-nos. O material de biomassa de partida pode ser A. niger que pode ter sido primeiramente usa-do para produzir ácido cítrico (assim, pode haver ácido cítrico residual no material departida) e podem em seguida ter sido usado para produzir glicosamina e/ou N-acetilglicosamina. Assim, as composições de glicano solúveis podem ser formadas comoum subproduto de qualquer ou todos estes outros métodos e produtos.

Água é adicionada à biomassa para obter cerca de 5-18% ou 8-14 % de misturade sólidos. (A biomassa pode conter certos ácidos, dependendo da fonte da biomassa,ou certos ácidos poderiam ser adicionados, tais como ácidos policarboxílico, por exem-plo, ácido cítrico, oxálico ácido, maléico ácido, itacônico ácido, ácido succínico ou mistu-ras destes). Em algumas modalidades, água é adicionada para obter entre cerca de 9-13% de sólidos na mistura. A mistura é em seguida posta em um tanque de pré-cozimentoe pode ser suavemente agitada (baixo cisalhamento), bem como aquecida acima do pon-to de ebulição da água, por exemplo, cerca de 110 °C, ou tal como de cerca de 110° acerca de 200 0C por 10 minutos a cerca de 15 horas, ou 1-8 horas ou por diversas horas,tal como de cerca de 4 a cerca de 6 horas. Esta etapa é realizada para solubilizar os β-glicanos - em outras palavras, os glicanos do material de partida na biomassa fúngicasão insolúveis antes deste tratamento e são solúveis a cerca de 20 a 70 % em peso de-pois desta etapa de tratamento. O tempo, temperatura e teor de ácido cítrico do materialde partida são parâmetros ligados. Assim, se houver um maior teor de ácido cítrico, en-tão o tempo e temperatura podem ser ambos reduzidos e o /?-glicano ainda solubilizado.

Em uma modalidade preferida, a mistura é aquecida e suavemente agitada por 4-6 ho-ras, quando o material de partida inclui cerca de 0,4 % de ácido cítrico.

A mistura é em seguida resfriada a menos que 80 °C. O produto é filtrado e, emmodalidades preferidas, ele é rinsado para aumentar a recuperação de glicanos solúveis ediminuir a carga de sacarídeo (para porções que serão usadas para formar produtos deglicosamina e/ou N-acetilglicosamina. A separação é alternativamente realizada usandooutros métodos de separação, tais como uma centrífuga de decantação, prensa de filtro,filtro a vácuo, ou filtro de tambor rotativo. A rinsagem é tipicamente uma rinsagem aquo-sa.

O filtrado é em seguida concentrado usando, por exemplo, filtração de membrana(aumenta os sólidos e permite seleção da faixa de peso molecular do produto). Outrosmétodos de concentração podem ser usados, tais como evaporação térmica a vácuo,secagem infravermelha, secagem em tambor, secagem por aspersão de cerca de 2-10 DSa cerca de 40-50 DS, onde DS é a porcentagem total de sólidos secos na solução.

O produto é em seguida precipitado usando etanol (ou qualquer solvente miscível emágua, tais como isopropanol, n-propanol, acetona ou acetonitrila). A razão de solvente para águapode variar de cerca de 1:2 a cerca de 6:1, dependendo do solvente usado e da faixa desejadade peso molecular da composição de B-glicano. A mistura é digerida naturalmente por 15 minu-tos a cerca de quatro horas para aumentar o tamanho de partícula médio do precipitado e redu-zir a inclusão de impurezas. Tipicamente existem impurezas presentes, tais como glicose, sais eoutras impurezas da biomassa, de maneira tal que concentração e precipitação deixa certas des-tas impurezas em solução, enquanto a composição de B-glicano desejada toma-se insolúvel.Em certas modalidades, a precipitação é desnecessária, se for utilizada filtração da membrana,como seria o caso para remover as impurezas. Assim, certas modalidades depois da evapora-ção do material com filtração da membrana, a etapa de precipitação do etanol pode ser evitadae o produto simplesmente seco. A filtração da membrana pode ser utilizada para selecionar fai-xas de peso molecular médio desejadas para os glicanos solúveis, selecionando-se membranasde tamanho de poro apropriado. Filtros de membrana são especificados em grande parte peloseu MWCO (corte de peso molecular). O uso de um filtro de membrana com um MWCO de2.000 removeria a maior parte dos sais, monossacarídeos e pequenos oligômeros com pesosmoleculares de menos que cerca de 2.000. Filtros de membrana com MWCO, por exemplo, de5.000, 20.000 ou 100.000 podem ser usados separadamente ou em série para fornecer compo-sições de B-glicano de faixas de peso molecular desejadas e com a maior parte das impurezasremovida.

O produto é opcionalmente filtrado e rinsado novamente da maneira discutida anteri-ormente. O filtrado indesejável tipicamente inclui etanol, água, glicose e outras impurezas taiscomo pequenos oligômeros, etc. que não se precipitaram quando o etanol foi adicionado (da ma-neira mostrada na figura 12).

O produto é em seguida seco por secagem com luz, secagem a vácuo, liofilização, se-cagem infravermelha, secagem em tambor duplo, secagem por aspersão e outros métodos desecagem conhecidos pelos versados na técnica. Preferivelmente, a umidade é reduzida paracerca de 20 porcento em peso ou menos.

Com referência à figura 13, o produto pode ser descobrido por métodos disponíveisaos versados na técnica, por exemplo, tratamentos de resina, pelo uso de carbono ativado, resi-nas de descolorimento, ou outros métodos conhecidos para branquear a composição de β-glicano. Produtos para cosméticos ou consumo humano podem preferir uma maior pureza, emenos cor. O produto descobrido é em seguida seco usando secagem em bandeja, secagemcom luz, liofilização, secagem a vácuo, secagem por aspersão, secagem em leito fluidizado,ou outros métodos conhecidos. A secagem é preferivelmente realizada a temperaturas inferio-res a cerca de 95 0C ou temperaturas tais que possam causar formação de cor, de maneira aevitar colorimento do produto descolorido. Da maneira mostrada na figura 13, opcionalmenteum xarope pode ser obtido não pela secagem do produto. O xarope é tipicamente de baixaviscosidade (por exemplo, 26 centipose). O xarope é uma solução aquosa de /?-glicano comde cerca de 10 a cerca de 50 % em de sólidos à temperatura ambiente.

G. Exemplos

A invenção será explicada com detalhes pelos exemplos ilustrativos seguintes não Ii-mitantes. A menos que de outra forma indicada, todas as quantidades são expressas em partesem peso.

Exemplo 1

A biomassa fúngica foi pré-tratada com uma solução de hidróxido de sódio aquoso(NaOH) 4 porcento em uma autoclave a 120 0C por 1 hora. Esta etapa removeu proteínas emexcesso e outros materiais indesejáveis. A biomassa foi em seguida totalmente lavada comágua deionizada até que seu pH fosse aproximadamente 7,0. Este material lavado foi mistu-rado com ácido clorídrico concentrado (HCI) e água para formar uma mistura de 10 a 15 por-cento de HCI e 5 a 6 porcento de biomassa, com base no peso seco da biomassa.

Esta mistura foi aquecida a refluxo. As amostras foram tomadas de tempo em tempo,e a reação analisada com uma cromatografia líquida de alta pressão disponível pela HPLC Dio-nex com a designação comercial "DX-500".

Os resultados são fornecidos na figura 4, que mostra um gráfico indicando a produ-ção de glicosamina, e mostra que a glicosamina foi progressivamente produzida a medida emque a reação correu durante 8 horas, mas que a quantidade de glicose diminuiu após 4 horas.Após 8 horas a glicosamina produziu um rendimento de 14 porcento. Um cromatograma doproduto é mostrado na figura 5.

Após a reação, a mistura foi filtrada, e o filtrado evaporado usando um evaporador derotação fabricado por RotaVap para aumentar a concentração de glicosamina da solução. Ovolume final foi reduzido para 10 a 20 mL. A esta solução foram adicionados 20 ml_ de etanole a solução turbilhonada para promover a precipitação de glicosamina e melhorar o rendimen-to. Estes precipitados de glicosamina foram obtidos por filtração e foram adicionalmente lava-dos com álcool até que a cor se tornasse branca. A figura 6 mostra um cromatograma do pro-duto, indicando mais que 97 porcento de glicosamina na composição de glicosamina.

Exemplo 2O exemplo 1 foi repetido, mas a biomassa pré-tratada foi mantida sob condições derefluxo por 13 horas. A composição de glicosamina resultante continha mais que 98 porcentode glicosamina.

A descrição detalhada e exemplos apresentados foram dados por questão de clarezade entendimento apenas. Nenhuma limitação desnecessária deve ser entendida a partir destadescrição ou exemplo. A invenção não está limitada aos detalhes exatos mostrados e descri-tos, mas variações serão incluídas na invenção definida pelas reivindicações.

Exemplo 3

Biomassa filtrada (3.900 g) de um processo de produção de ácido cítrico foi combi-nada com 100 mL de ácido clorídrico concentrado e 4,5 L de água. A solução resultante (HCI0,5 %, 7,8 % de sólidos de biomassa) foi mantida a 90 a 100 0C por 2 horas. A mistura da rea-ção (71,9 g) foi filtrada e lavada com 5 porções de água a 60 a 70 0C por uma lavagem totalde 400 mL. Os sólidos de biomassa lavados pesaram 31,5 g e continham 12,5 % de sólidosmediante secagem. Os sólidos de biomassa lavados portanto contiveram 3,9 g sólidos de 71,9g, ou 5,4 % de sólidos após tratamento com ácido brando da maneira supradescrita. Quandocomparado com os 7,8 % de sólidos iniciais antes do tratamento com ácido brando, foi calcula-da uma redução de 31 % em sólidos de biomassa.

Para estimar a quantidade do componente desejável da biomassa filtrada (quitina)sacrificada durante o tratamento com ácido brando, um tratamento com ácido agressivo foiconduzido usando tanto biomassa pré-tratada quanto não pré-tratada para produzir cloridrato deglicosamina da seguinte maneira:

Biomassa seca (pré-tratada ou não pré-tratada) (0,40 g) foi combinada com 3,60 g de22,5 % de ácido clorídrico em um tubo teste pequeno. As soluções resultantes (HCI 20 %, 10,0% de sólidos de biomassa) foram mantidas a 105 cC por 2,5 horas em um bloco aquecido. Aná-lise HPLC Dionex das duas amostras hidrolisadas de ácido permitiu que a porcentagem decloridrato de glicosamina em peso fosse determinada e comparada. Especificamente, a quan-tidade de glicosamina livre foi determinada usando cromatografia de troca iônica de alto de-sempenho com detecção amperométrica pulsada (HPAEC-PAD). O sistema consistiu em umgerador eluente EG40, bomba gradiente GP50, auto amostrador AS40, forno de coluna LC25,e detectar eletroquímico ED40, todos produzidos pela Dionex Corporation, Sunnyvale, Califór-nia, U.S.A. O método foi adaptado pela Dionex Corporation Technical Note 40, incorporadoaqui pela referência. Uma coluna Dionex CarboPac PA-20 foi usada em vez de uma colunaPA-10. O eluente foi 8 mM KOH a 0,5 mL/min. A coluna e detectar foram mantidos a 30 °C. Ovolume de injeção foi 10 pL. O padrão foi cloridrato de glicosamina a 10,8 mg/L. Amostrasforam diluídas com água deionizada, ASTM Tipo II, e filtradas através de filtros de frasco de0,2 μηι em um autoamostrador. Múltiplos padrões foram analisados antes e depois de cadaconjunto de amostra.A amostra de biomassa não pré-tratada continha 2,1 % de cloridrato deglicosamina.A quantidade teórica máxima de cloridrato de glicosamina atingível da biomassa pré-tratada é3,0 % (considere que todos 31 % de redução em sólidos de biomassa é não quitina). A amos-tra de biomassa pré-tratada foi medida a 2,7 % de cloridrato de glicosamina em peso. Assim,pré-tratamento com ácido brando resultou em um enriquecimento de quitina 29 % dos sólidosde biomassa, reduziu ainda o rendimento de cloridrato de glicosamina da biomassa original por 10%.

Exemplo 4

Biomassa filtrada (3.900 g) de um processo de produção de ácido cítrico foi combi-nada com 100 mL de ácido clorídrico concentrado e 4,5 L de água. A solução resultante (HCI0,5 %, 7,8 % de sólidos de biomassa) foi mantida a 90 a 100 0C por 20 horas. A mistura dareação (95,2 g) foi filtrada e lavada com 5 porções de água a 54 a 70 0C por uma lavagemtotal de 320 mL. Os sólidos de biomassa lavados pesaram 26,9 g e continham 16,0 % de sóli-dos mediante secagem. Os sólidos de biomassa lavados portanto continham 4,3 g de sólidosde 95,2 g, ou 4,5 % de sólidos após um tratamento com ácido brando da maneira supradescrita.Quando comparado com os 7,8 % de sólidos iniciais antes do tratamento com ácido brandopode-se calcular que uma redução de 42 % em sólidos de biomassa foi obtida.

Para estimar a quantidade do componente desejável da biomassa filtrada (quitina)sacrificada durante o tratamento com ácido brando, um tratamento com ácido agressivo foi con-duzido usando tanto biomassa pré-tratada quanto não pré-tratada para produzir cloridrato deglicosamina da seguinte maneira:

Biomassa seca (pré-tratada ou não pré-tratada) (0,40 g) foi combinada com 3,60 g de22,5 % de ácido clorídrico em um tubo teste pequeno. As soluções resultantes (HCI 20 %,10,0 % de sólidos de biomassa) foram mantidas a 105 0C por 2,5 horas em um bloco aqueci-do. Análise HPLC Dionex (realizada da maneira descrita no Exemplo 4) das duas amostrashidrolisadas de ácido permitiu que a porcentagem de cloridrato de glicosamina em peso fossedeterminada e comparada. A amostra de biomassa não pré-tratada continha 2,1 % de cloridra-to de glicosamina. A quantidade teórica máxima de cloridrato de glicosamina atingível da bio-massa pré-tratada é 3,6 % (considerando que todos os 42 % de redução em sólidos de bio-massa é não quitina). A amostra de biomassa pré-tratada foi medida a 3,0 % de cloridrato deglicosamina em peso. Assim, pré-tratamento com ácido brando resultou em um enriquecimentode quitina de 43 % dos sólidos de biomassa, reduziu ainda o rendimento de cloridrato de glico-samina da biomassa original por 17 %.

Exemplo 5

Biomassa filtrada (2.000 g) de um processo de produção de ácido cítrico foi combi-nada com 3.000 g de uma solução de ácido clorídrico de 7,5 %. A solução resultante (HCI 4,5%, 6,0 % de sólidos de biomassa) foi mantida a 90 a 100 cC por 2 horas. Uma porção (40,7 g)da mistura da reação foi transferida para um tubo centrífugo de 50 mL. A amostra foi centrifu-gada e o licor foi decantado. Os sólidos remanescentes foram subseqüentemente lavadoscinco vezes com porções de 25 a 30 mL de solução de NaOH (pH 13,1) em seguida lavadosquatro vezes com porções de 25 mL de solução de HCI (pH 1,3). Um ajuste final do pH atépróximo de neutro disponibilizou o isolamento de sólidos de biomassa lavados por decantação.

Os sólidos de biomassa pesaram 5,9 g e continham 14,2 % de sólidos mediante secagem. Ossólidos de biomassa lavados portanto continham 0,84 g sólidos de 40,7 g, ou 2,1 % de sólidosapós o tratamento com ácido brando da maneira supradescrita. Quando comparado com ossólidos iniciais de 6,0 % antes do tratamento com ácido brando uma redução de 65 % em sóli-dos de biomassa foi calculada.

Para estimar a quantidade do componente desejável da biomassa filtrada (quitina)sacrificada durante o tratamento com ácido brando, um tratamento com ácido agressivo foiconduzido usando tanto biomassa pré-tratada quanto não pré-tratada para produzir cloridrato deglicosamina da seguinte maneira:

Biomassa seca (pré-tratada ou não pré-tratada) (0,10 g) foi combinada com 1,90 g de20,3 % de ácido clorídrico em um tubo teste pequeno. As soluções resultantes (HCI 19,3 %,5,0 % de sólidos de biomassa) foram mantidas a 105 cC por 4 horas em um bloco aquecido.Análise HPLC Dionex (realizada da maneira supradescrita) das duas amostras hidrolisadas deácido permitiu que a porcentagem de cloridrato de glicosamina em peso fosse determinada ecomparada. A amostra de biomassa não pré-tratada continha 1,0 % de cloridrato de glicosa-mina. A quantidade teórica máxima de cloridrato de glicosamina atingível da biomassa pré-tratada é 2,9 % (considerando que todos os 65 % de redução em sólidos de biomassa não sãoquitina). A amostra de biomassa pré-tratada foi medida a 2,1 % de cloridrato de glicosamina empeso. Assim, pré-tratamento com ácido brando resultou em um enriquecimento de quitina de110 % dos sólidos de biomassa, reduziu ainda o rendimento de cloridrato de glicosamina dabiomassa original por 28 %.

Exemplo 6

Biomassa filtrada (3.000 g) de um processo de produção de ácido cítrico foi combi-nada com 3.000 g de 8,7 % de solução de hidróxido de sódio. A solução resultante (NaOH 4,4%, 8,1 % de sólidos de biomassa) foi mantida a 90 a 100 0C por 45 minutos. A mistura da rea-ção foi filtrada e lavada com água a 40 a 50 0C até que a porcentagem de NaOH remanescen-te nos sólidos de biomassa lavados fosse menos que 0,06 %. Os sólidos de biomassa lavadospesaram 1.479 g e continham 22,9 % de sólidos mediante secagem. Os sólidos de biomassalavados portanto continham 339 g sólidos de 6.000 g ou 5,7 % de sólidos após o tratamentode base branda da maneira supradescrita. Quando comparado com os iniciais sólidos de 8,1% antes do tratamento de base branda, uma redução de 30 % em sólidos de biomassa foi calculada.Os sólidos de biomassa lavados obtidos de tratamento de base branda foram subse-qüentemente submetidos a um tratamento com ácido brando. Os sólidos de biomassa lavados(1.310 g) foram combinados com 3.665 g de 5,5 % de solução de ácido clorídrico e 25 g deácido acético glacial. A solução resultante (HCI 4,0 %, 0,5 % de ácido acético, 6,0 % de sóli-dos de biomassa) foi mantida a 90 a 100 0C por 3,5 horas. Neste tempo uma porção, 944 g,da mistura da reação foi filtrada e lavada com 1.409 g de água em duas porções. Os sólidosde biomassa lavados pesaram 298 g e continham 12,5 % de sólidos mediante secagem. Ossólidos de biomassa lavados portanto continham 37,3 g de sólidos de 944 g, ou 4,0 % de sóli-dos após o tratamento com ácido brando. Quando comparado com os sólidos iniciais de 6,0 %do tratamento com ácido brando uma redução de 33 % em sólidos de biomassa foi calculada.Uma redução geral de 53 % em sólidos de biomassa resultou no efeito combinado de trata-mento de base branda seguido por tratamento com ácido brando.

Para estimar a quantidade do componente desejável da biomassa filtrada (quitina)sacrificada durante os tratamentos do ácido brando e base branda, um tratamento com ácidoagressivo foi conduzido usando tanto biomassa pré-tratada quanto não pré-tratada para produzircloridrato de glicosamina da seguinte maneira:

Biomassa seca (pré-tratada ou não pré-tratada) (0,10 g) foi combinada com 1,90 g de22,8 % de ácido clorídrico em um tubo teste pequeno. As soluções resultantes (HCI 21,6 %,5,1 % de sólidos de biomassa) foram mantidas a 105 0C por 4 horas em um bloco aquecido.Análise HPLC Dionex (realizada da maneira supradescrita) das três amostras hidrolisadas deácido permitiu que a porcentagem de cloridrato de glicosamina em peso fosse determinada ecomparada. A amostra de biomassa não pré-tratada continha 0,92 % de cloridrato de glicosa-mina. A quantidade teórica máxima de cloridrato de glicosamina atingível da base branda bi-omassa pré-tratada é 1,3 % (considerando que todos os 30 % de redução em sólidos de bio-massa é não quitina). A amostra de biomassa pré-tratada de base branda foi medida a 1,3 % decloridrato de glicosamina em peso. Assim, o pré-tratamento de base branda resultou em umenriquecimento de quitina de 41 % dos sólidos de biomassa sem uma redução no rendimentode cloridrato de glicosamina da biomassa original. A quantidade teórica máxima de cloridratode glicosamina atingível da biomassa pré-tratada de ácido brando é 2,0 % (considera-se que aredução geral de 54 % em sólidos de biomassa não é quitina). A amostra de biomassa pré-tratada de ácido brando foi medida a 1,5 % de cloridrato de glicosamina em peso. Assim, opré-tratamento com ácido brando depois do pré-tratamento de base branda resultou em umenriquecimento de quitina de 63 % dos sólidos de biomassa originais, reduziu ainda o rendi-mento de cloridrato de glicosamina da biomassa original por 25 %.

Exemplo 7

Uma amostra de biomassa de um processo de fermentação de ácido cítrico foi com-binada com HCI para formar uma lama de HC113 % e 10,5 % de sólidos de biomassa. A lamafoi colocada em um reator selado e levado para 113 0C por 10 horas. Amostras da composi-ção resultante foram tomadas em intervalos de uma hora e foram analisadas por glicosamina.Estes resultados foram em seguida convertidos em um rendimento com base na quantidadeteórica de quitina na biomassa.

Este procedimento foi repetido usando lamas de HCI 11 % e 9 %, com sólidos de bio-massa de 12 %. Os resultados são mostrados na tabela 11.

Tabela 11

<table>table see original document page 46</column></row><table>

Exemplo 8

Biomassa de fermentação de ácido cítrico (A. niger) foi misturada com ácido clorídri-co (JT Baker1S 37 percent Reagent Grade) e colocada em uma bomba de digestão de micro-ondas de pequena escala selado, disponível pela Alltech. Aa amostras preparadas foram co-locadas em um forno a vácuo de laboratório sem nenhum vácuo aplicado. O forno foi capazde manter uma temperatura de 160 °C. As amostras foram preparadas e tratadas nas condi-ções listadas na tabela 12 a seguir.

As amostras foram diluídas com água nanopura em uma faixa de concentração dentroda faixa padrão (< 10 mg/L de glicosamina) usando um sistema HPLC Dionex (realizando aanálise da maneira supradescrita). Especificamente, duas diluições foram realizadas, umadiluição de 1:50 seguida por uma diluição de 1:6. As amostras diluídas foram filtradas em umfiltro de 0,45 μm e analisadas por concentrações de glicose e glicosamina usando um sistemaHPLC Dionex.

Os resultados são tabulados na tabela 12 a seguir. Em virtude de cada experiência ter(na maioria) quatro pontos de amostra, os resultados mais altos de glicosamina para cadaexperiência foram registrados. Os resultados da amostra não foram corrigidos por nenhumaperda evaporativa na amostra durante a reação.

Tabela 12

<table>table see original document page 46</column></row><table><table>table see original document page 47</column></row><table>

*Porcentagem de rendimentos de glicosamina com base em 24 % de quitina teórica em biomassa seca

Os rendimentos de glicosamina não são ajustados para perdas evaporativas.Está mostrado que a perda evaporativa fornece uma indicação de uma fonte de erro noteste de bancada.

Os resultados destas modalidades das composições de glicosamina da maneira mos-trada nos Exemplos 8 e 9 indicam que usar os métodos de maior temperatura e ou pressão re-velados para produzir os mesmos, indica que quantidades ou concentrações significativamentemais baixas de ácido clorídrico são exigidas para produzir rendimentos significativos das com-posições de glicosamina.

Para todos os pontos de amostra selecionados para a Tabela 12 as concentrações deglicose foram próximas de zero.

Exemplo 9

Uma variedade de modalidades de suplementos alimentares incorporando as modali-dades particulares das composições de glicosamina é mostrada na tabela 13 a seguir (a mesmaabordagem básica poderia ser usada para as composições N-acetilglicosamina e/ou os glicanossolúveis revelados e estes podem ser adicionados sozinhos ou em adição de glicosamina). Ossuplementos alimentares nestes exemplos particulares são em forma de comprimido, cápsula,chicletes, líquido ou barra de alimento, mas poderia ser em qualquer forma física de suplementoalimentar adequado.

Tabela 13

<table>table see original document page 47</column></row><table><table>table see original document page 48</column></row><table>Exemplo 10

Uma modalidade do processo para produzir N-acetilglicosamina usando pré-tratamento com ácido brando e conversão enzimática em N-acetilglicosamina

Uma amostra de biomassa fúngica de 121,5 g contendo ácido cítrico e 78,5 g de á-gua foi misturada em um reator de pressão. A mistura, tendo 12,0 % de teor sólido e 0,6 % deácido cítrico, foi aquecida a 150 °C sobre agitação branda. Após 4 horas, a reação foi resfriadaa temperatura ambiente. A mistura da reação foi filtrada em um filtro de pano seguido por lava-gem com água. Uma porção de 63 % dos sólidos na biomassa foi removida na fração solúvel.A biomassa sólida residual e glicanos solúveis em filtrados foram submetidos a tratamentoadicional.

A biomassa sólida residual foi enzimaticamente tratada para converter a quitina em N-acetilglicosamina. Especificamente, 4,00 g de biomassa pré-cozida de ácido brando úmida(equivalente s 0,8 g peso seco) foram pesados em cada um dos quatro tubos de tampa ros-queada de 50 mL. Tampão de acetato de pH 4,5, pH 5,5, pH 6,5, ou pH 7,5 foi adicionadopara separar tubos para colocar o volume de cada 25,0 mL. O pH de cada tubo foi ajustado tomatch que do tampão de partida. Uma alíquota de 6 mL de cada suspensão de biomassa foidistribuída em 3 tubos de tampa rosqueada separados de 15 mL. Quitinase foi suspensa a t0,0030 g/mL em cada um dos 4 diferentes tampões de pH. Tratamentos tendo apenas quitinasereceberam 2 mL da suspensão de pH apropriado. Tratamentos em que quitinase foi combinadacom celulase recebeu 0,5 mL de suspensão de quitinase e celulase foi adicionada a 0,5 mL portratamento destas amostras recebendo apenas celulase, e a 0,375 mL àquelas amostras quetambém receberam quitinase. Celulase pode ser obtido de Genencor International (Rochester,NY) - GC880 Celulase orfrom Dyadic International, Inc. (Júpiter, FL) - Neutral Fungai Celula-se. Os tubos foram incubados a 0°C por 16 horas. Amostras foram analisada por NAG e teorde glicose por HPLC. Tratamentos marcados KC contêm celulase. Tratamentos marcados Chcontêm quitinase.

Tabela 14

<table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 50</column></row><table>

Estes resultados demonstram que o pH e fetivo da enzima é amplo, mas ao mesmo tempo, a atividade da enzima é uma função de pH. Conforme versados na tecnologia podementender estes exemplos, em certas condições de pH, a combinação de quitinase e celulasefornece concentrações NAG substancialmente mais altas, comparadas a qualquer das enzi-mas sozinhas. Com as modalidades da enzima misturada a concentração de quitinase na mis-tura poderia ser diminuída, retendo ainda altos níveis de degradação de quitina (isto é, gera-ção de NAG). Estas modalidades dos métodos revelados pra produzir NAG são muito usadasonde a enzima de quitinase é cara, e a combinação de enzima auxiliar mais quitinase de baixaconcentração fornece uma alternativa econômica mais favorável para quitinase sozinha. Pare-ce que celulase sozinha pôde gerar concentrações modestas de NAG. Isto sugere que tanto acelulase tem atividade quitinase não específica limitada, quanto o micro organismo usado paraproduzir a celulase também produziu algum nível de quitinase. Exemplos não Iimitantes deoutras enzimas que fornecem uma função auxiliar são glicanoses, laminarases, amilases, gli—coamilases e outros.

Uma amostra foi tratada para remover a glicose por tratamento de glicose oxidasepós-hidrólise. Esta modalidade utilizou uma suspensão de NAG/glicose gerada da biomassatratada do pré-tratamento com ácido brando usando tratamento da enzima quitinase e celula-se. Análise HPLC da amostra indicou concentrações de glicose de 8,7 g/L NAG e 6,3 g/L. Umaalíquota de 50 mL da solução de NAG-glicose foi ajustada ao pH 5,25 com EM H2SO4. Umaalíquota de 10 mL foi adicionada a cada um dos tubos de tampa rosqueada de 4, 15 mL. Tu-bos individuais foram dosados com 0,4 μί (dose A), 40 μί (dose B), e 200 pL (dose C) de gli-cose oxidase Genencor OxyGO 1500. Tubos foram colocados em um banho de água 50 °C.

Após 2, 4 e 8 horas, 1,0 mL de amostra foi removido e analisado por HPLC para glicose NAG,e teor de ácido glicônico usando detectores Rl e UV.

Tabela 15

<table>table see original document page 50</column></row><table>Tabela 16

<table>table see original document page 51</column></row><table>

Estes dados demonstram que glicose oxidase é capaz de converter acima de 95 %da glicose na solução de NAG/glicose em ácido glicônico. A depleção de glicose é acompa-nhada por um aumento na concentração de ácido glicônico. Perda de NAG pelo período dereação de 22 horas é aproximadamente 1 % tanto no controle quanto tratamentos de Dose C.

Portanto, nenhuma perda de NAG é atribuída à atividade de glicose oxidase.

Em seguida a N-acetilglicosamina é separada de sais e Gliconatos e outros compo-nentes usando resina de troca catiônica Purolite PCR-822. A separação foi monitorada porfrações de coleção eluindo da coluna, em seguida analisando as frações por HPLC.

Tabela 17. Glicose Oxidase tratada com caldo: Purga de N?da fase móvel; Resina Purolite

Com base somente em Gliconato e NAG Com base em Gliconato, Acetato, Citratoe NAG

<table>table see original document page 51</column></row><table><table>table see original document page 52</column></row><table>

A porção da Tabela 17 na esquerda ilustra o grau de separação de NAG de gli-conato. Se as frações 9 a 14 são coletadas e o resto das frações descartadas, 88,7 % dototal de NAG são recuperados com aproximadamente 95 % de pureza. Se o tampão deacetato é usado para controle do pH durante o processo enzimático, em seguida algu-mas impurezas de acetato são incorporadas no produto, da maneira mostrada no ladodireito da tabela, diminuindo a pureza de NAG para cerca de 90 % com cerca de 81 % derecuperação. As mesmas resinas ou similares são incapazes de separar NAG de glicose,uma vez que elas são ambas moléculas neutras.

Exemplo 11 - Modalidade do processo para Converter Simultaneamente Quitina em N-acetilglicosamina e Glicose em Gliconato

A biomassa foi tratada com o pré-tratamento com ácido brando descrito no Exemplo 10(Etapas A e A2 na figura 9). A biomassa pré-tratada foi em seguida enzimaticamente tratadapara produzir N-acetilglicosamina e gliconato. As reações foram realizadas suspendendo 1,0 gde biomassa pré-tratada (0,2 g peso seco) em 50 mM de tampão de acetato ou citrato em umvolume de tubos de tampa rosqueada 6,0 mL em 15 mL. A cada tubo foram adicionados 2,0 ml_de quitinase (0,0030 g/mL) dissolvidos em tampão similar aos tratamentos ao qual ele foi adicio-nado. Os tubos foram incubados a 50 °C por 22 horas. Tratamentos 1 a 3 foram realizados comquitinase sozinha por 22 horas, após o que glicose oxidase foi adicionada e os tubos foram in-cubados por mais 2 horas. Tratamentos 4 e 5 receberam simultaneamente tanto quitinase quan-to glicose oxidase (160 μL de Genencor OxyGO 1500). Amostras foram analisadas a 2, 4, 7, e22 horas para o sobrenadante para NAG1 glicose e ácido glicônico (GA) por HPLC.

Tabela 18

<table>table see original document page 52</column></row><table>Quitinase parece ter atividade ligeiramente maior em pH 6,0 de tampão citrato do quetampão de acetato. Ao contrário, glicose oxidase tem atividade ligeiramente mais alta em pH 6,0de tampão de acetato do que em tampão de citrato. Nos tratamentos 4 e 5 demonstrou-se quereações quitinase e glicose oxidase podem ocorrer simultaneamente. A quantidade de ácidoglicônico gerada depois de 22 horas simultaneamente nas reações foi a mesma obtida nos Tra-tamentos 1, 2, e 3 onde glicose oxidase foi adicionada independentemente após a reação dequitinase ter ocorrido. Portanto, tratamento de glicose oxidase pode correr separadamente ouem combinação com quitinase.

A solução resultante foi em seguida tratada similarmente com a separação de re-sina no Exemplo 10.

Exemplo 12 - Modalidade do Processo Revelado para Preparar Glicosamina deN-acetilglicosamina Produzidos Enzimaticamente

A N-acetilglicosamina do Exemplo 10 (Etapa B figura 9) foi tratada a 95 0C emHCI 3 % e 6 % pelos períodos de tempo indicados na tabela a seguir para produzir clori-drato de glicosamina. Os dados mostram que o HCI 6 % realizou ligeiramente melhor doque o HCI 3 % nestas condições. O nível do ácido maior pode ser usado tanto com tem-peraturas mais altas quanto em tempos de reação maiores. Nestas condições brandas,muito pouca glicose reagiu. Ácido acético é formado pela hidrólise.

Tabela 19

<formula>formula see original document page 53</formula>

Após quatro horas, cerca de 90 % do NAG foi convertido, enquanto 100 % foramconvertidos entre três e quatro horas. A glicose foi virtualmente não carregada no erroanalítico.

Exemplo 13 - Modalidade do Processo Revelado Usando um Pré-tratamento comácido Brando Seguido por Digestão de Ácido agressivo para produzir Glicosamina

Primeiro, a biomassa fúngica úmida 120,1 g contendo ácido cítrico e água 80,0 gforam misturados em um reator de pressão. A mistura foi 12,7 % de sólidos secos e 0,31% de ácido cítrico e foi aquecida a 150 °C sobre agitação branda. Após 4 horas, a rea-ção foi resfriada até a temperatura ambiente. A mistura da reação foi filtrada em um filtrode pano seguido por lavagem com água. Uma porção compreendendo 55,2 % de sólidoem biomassa foi removido.

Em seguida 9,77 g da biomassa pré-cozida úmida e 8,25 g de 37 % de HCI forammisturados em um reator de pressão. A mistura contendo 13,3 % de teor sólido e 16,9 % de HCIfoi aquecida a 100 0C com agitação. Após 8 horas, a reação foi resfriada a temperatura ambi-ente. A mistura da reação foi filtrada em um filtro de pano seguido por lavagem com água.Dados cromatográficos mostraram que o rendimento de glicosamina foi 38,8 % com base nabiomassa pré-cozida e o rendimento total de glicosamina foi 18,5 % com base no material departida original de biomassa.

Exemplo 14

Uma modalidade das composições B-glicano fúngicas solúveis reveladas foi produzi-da utilizando 101,7 g de biomassa fúngica úmida contendo ácido cítrico e 98,3 g de água mistu-rada em um reator de pressão. A mistura tendo 12,0 % de teor sólido e 0,144 % de ácido cítri-co foi aquecida a 150 0C sob agitação branda. Após 7 horas, a reação foi resfriada a temperatu-ra ambiente. A mistura da reação foi filtrada em um filtro de pano seguido por lavagem comágua. Mediante teste dos sólidos remanescentes depois desta etapa, determinou-se que 46,6% de sólidos no material de partida de biomassa foram hidrolisados. A distribuição do pesomolecular foi medida por SEC (cromatografia de exclusão de tamanho) usando um detector deíndice refrativo (RID). Um RID mede a massa de materiais comparáveis que escoam através dacélula detectara, tal como polissacarídeos. Uma saída de % de área indica a porcentagem damedida total de polissacarídeos eluindo em tempos com relação aos padrões de pullulan usa-dos para calibrar o instrumento. Aproximadamente 76 % da massa B-glicano têm pesos mole-culares entre 1.000 e 1.000,000. A quebra do peso molecular foi como a seguir:

Tabela 20

<table>table see original document page 54</column></row><table><table>table see original document page 55</column></row><table>

% de área = porcentagem de o B-glicano solúveis eluindo nas suas respectivasfaixas de peso molecular comparadas a padrões conhecidos.

Exemplo 15

Uma modalidade das composições de B-glicano fúngicas solúveis reveladas foi pro-duzida utilizando 75,6 g de biomassa fúngica contendo ácido cítrico e 74,9 g de água foi mistu-rada em um reator de pressão. A mistura tendo 11,9 % de teor sólido e 0,16 % de ácido cítricofoi aquecida a 150 0C sob agitação branda. Após 5 horas, a reação foi resfriada até a tempera-tura ambiente. A mistura da reação foi filtrada em um filtro de pano seguido por lavagem comágua. Mediante teste da solubilidade da composição B-glicano resultante, determinou-se que40,1 % de sólido no material de partida de biomassa foram hidrolisados. O peso molecular mé-dio dos B-glicanos solúveis foi 232.500.

Exemplo 16

O glicano fúngico 1 descrito no teste de pureza foi preparado aquecendo 32 kg de bi-omassa fúngica a 12 % em peso de sólidos por 5 horas a 136 °C. A concentração de ácidocítrico foi 0,22 % em peso. Glicano fúngico 1 teve um peso molecular médio cerca de 35.000.

O glicano fúngico 2 descrito no teste de pureza foi preparado aquecendo 170 Kg de bi-omassa fúngica a 12 % em peso de sólidos por quatro horas a 132 °C. A concentração deácido cítrico foi 0,6 % em peso. Glicano fúngico 2 teve um peso molecular médio cerca de450.000.

Embora os métodos e composições aqui revelados possam ser modificados, especi-ficidades destes foram mostradas a título de exemplo, e são descritas com detalhes. Entretan-to, deve-se entender que as modalidades específicas reveladas não devem ser interpretadascomo limitação da invenção reivindicada.

Claims (37)

1. Processo, CARACTERIZADO pelo fato de compreender o fornecimento de umafonte de biomassa fúngica contendo B-glicanos, a biomassa fúngica não compreendendolevedura; e tratamento da biomassa fúngica com água e não mais do que 5% de ácido, paraconverter no mínimo uma porção dos B-glicanos em B-glicanos solúveis em água e forman-do uma mistura incluindo B-glicanos solúveis em água e biomassa fúngica insolúvel em á-gua tratada.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato da bi-omassa fúngica ser convertida utilizando água, calor, e de cerca de 0.01% até cerca de 5%de ácido por peso da mistura.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato dos β-glicanos solúveis em água serem separados da mistura para formar uma composição a ba-se de B-glicano solúvel em água.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato decompreender também a purificação e/ou descolorização da composição a base de B-glicanosolúvel em água.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato decompreender também a separação dos B-glicanos solúveis em água e a formação de umseu xarope.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato dacomposição a base de B-glicano solúvel em água incluir B-glicanos solúveis em água possu-indo um peso molecular médio de menos do que cerca de 1,000,000.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato dacomposição a base de B-glicano solúvel em água compreender B-glicanos no mínimo cercade 20% do seu peso solúvel em água.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato da bi-omassa fúngica ser tratada utilizando água a uma temperatura de no mínimo cerca de 110°C.

9. Processo, CARACTERIZADO pelo fato de compreender o fornecimento de umafonte de biomassa fúngica contendo B-glicanos, e no mínimo cerca de 5% de quitina, proteí-nas e lipídios; tratamento da biomassa fúngica para hidrolizar no mínimo uma porção dos β-glicanos em B-glicanos solúveis em água, B-glicanos insolúveis em água, quitina, proteínas,e lipídios; e separação dos B-glicanos solúveis em água da mistura, onde os B-glicanos so-lúveis em água separados são no mínimo cerca de 20% do seu peso solúvel em água.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato dos β-glicanos solúveis em água separados possuírem um peso molecular médio de menos doque cerca de 1,000,000.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato da bi-omassa fúngica ser tratada utilizando água a uma temperatura de no mínimo cerca de-110°C.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato da bi-omassa fúngica ser hidrolizada utilizando água, calor, e menos do que cerca de 5% de ácidopor peso da mistura de ácido ou de base.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato dos β-glicanos solúveis em água separados serem no mínimo cerca de 30% do seu peso solúvelem água.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato dos β-glicanos solúveis em água incluírem glicanos possuindo ligações 1,3-, 1,4-, e 1,6-glicosídicas.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato decompreender também o tratamento da biomassa fúngica para hidrolizar no mínimo uma por-ção dos B-glicanos em B-glicanos solúveis em água e formar uma composição compreen-dendo glicanos solúveis em água possuindo ligações 1,4-glicosídicas.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato decompreender também o tratamento da biomassa fúngica para hidrolizar no mínimo uma por-ção dos B-glicanos em B-glicanos solúveis em água e formar uma composição compreen-dendo no mínimo cerca de 50% dos glicanos solúveis em água possuindo ligações 1,3-glicosídicas.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato decompreender também o tratamento da biomassa fúngica para hidrolizar no mínimo uma por-ção dos B-glicanos em B-glicanos solúveis em água e formar uma composição compreen-dendo no mínimo cerca de 70% dos glicanos solúveis em água possuindo ligações 1,3-glicosídicas.

18. Método, CARACTERIZADO pelo fato de compreender o fornecimento de umafonte de biomassa fúngica possuindo B-glicanos; a adição de água e não mais do que 5% deácido à biomassa fúngica para formar uma mistura de sólidos de cerca de 5% até cerca de-18%; aquecimento da mistura até no mínimo cerca do seu ponto de ebulição da mistura atésolubilização no mínimo de uma porção dos B-glicanos; e separação dos B-glicanos solúveisem água da mistura para formação de uma composição a base de B-glicano solúvel em á-gua.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato damistura ser aquecida até no mínimo cerca de 110°C.

20. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato da fon-te de biomassa fúngica incluir o ácido cítrico.

21. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato damistura restante após os B-glicanos solúveis em água serem separados dela ser tratadapara formar glicosamina.

22. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato damistura restante após os B-glicanos solúveis em água serem separados dela ser tratadapara formar N-acetilglicosamina.

23. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato dacomposição de B-glicanos solúveis em água ser no mínimo cerca de 20% do seu peso solú-vel em água.

24. Processo, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato dacomposição de B-glicano solúvel em água compreender glicanos possuindo ligações 1,3-,- 1,4-, e 1,6-glicosídicas.

25. Processo, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato dacomposição de /?-glicano solúvel em água compreender glicanos solúveis em água possuin-do no mínimo cerca de 50% de ligações 1,3-glicosídicas.

26. Processo, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato decompreender também o tratamento da biomassa fúngica para formar uma composição com-preendendo no mínimo cerca de 70% dos glicanos solúveis em água possuindo ligações- 1.3-glicosídicas.

27. Método, CARACTERIZADO pelo fato de compreender o fornecimento de umafonte de biomassa fúngica contendo B-glicanos, quitina, proteínas e lipídios; adição de águae não mais do que 5% de ácido à biomassa fúngica para formar uma mistura de sólidos decerca de 5% até cerca de 18%; tratamento da biomassa fúngica para hidrolizar no mínimouma porção dos B-glicanos em B-glicanos solúveis em água, B-glicanos insolúveis em água,quitina, proteínas, e lipídios; aquecimento da mistura até no mínimo cerca de 110°C parahidrolizar no mínimo uma porção dos B-glicanos; separação de um filtrado da mistura, o fil-trado compreendendo uma composição incluindo B-glicanos solúveis em água; concentra-ção da composição; e precipitação dos B-glicanos solúveis em água para purificar a compo-sição, onde a composição compreender glicanos solúveis em água possuindo ligações 1,3-,- 1.4-, e 1,6-glicosídicas.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato da fon-te de biomassa fúngica incluir o ácido cítrico.

29. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato damistura restante após os B-glicanos solúveis em água serem separados dela ser tratadapara formar glicosamina.

30. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato damistura restante após os B-glicanos solúveis em água serem separados dela ser tratadapara formar N-acetilglicosamina.

31. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de compreender j&-glicanos de bio-massa fúngica; glicanos solúveis em água possuindo ligações 1,3-, 1,4-, e 1,6-glicosídicas; eonde no mínimo cerca de 70% dos glicanos solúveis em água possuem ligações 1,3-glicosídicas.

32. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de compreender /?-glicanos de bio-massa fúngica; glicanos solúveis em água possuindo ligações 1,3-, 1,4-, e 1,6-glicosídicas; eonde os glicanos solúveis em água são no mínimo cerca de 10% do seu peso solúveis emágua.

33. Composição, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADA pelo fatodos glicanos solúveis em água serem no mínimo cerca de 20% do seu peso solúvel em água.

34. Composição, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADA pelo fatodos glicanos solúveis em água serem no mínimo cerca de 50% do seu peso solúvel em água.

35. Composição, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADA pelo fatodos B-glicanos da biomassa fúngica serem ^-glicanos de biomassa fúngica do microorga-nismo A. niger.

36. Composição, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADA pelo fatoda composição compreender também glicanos solúveis em água possuindo no mínimo cer-ca de 50% de ligações 1,3-glicosídicas.

37. Composição, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADA pelo fatoda composição compreender também glicanos solúveis em água possuindo no mínimo cer-ca de 1% de ligações 1,4-glicosídicas.