KR20050084071A - 당사슬 아스파라긴 유도체 및 그의 제조방법 - Google Patents

당사슬 아스파라긴 유도체 및 그의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20050084071A
KR20050084071A KR1020057009856A KR20057009856A KR20050084071A KR 20050084071 A KR20050084071 A KR 20050084071A KR 1020057009856 A KR1020057009856 A KR 1020057009856A KR 20057009856 A KR20057009856 A KR 20057009856A KR 20050084071 A KR20050084071 A KR 20050084071A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
compound
asparagine
oligosaccharide
oligosaccharide asparagine
group
Prior art date
Application number
KR1020057009856A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100876518B1 (ko
Inventor
야스히로 가지하라
가즈아키 가케히
가즈히로 후카에
Original Assignee
오츠카 가가쿠 가부시키가이샤
야스히로 가지하라
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 오츠카 가가쿠 가부시키가이샤, 야스히로 가지하라 filed Critical 오츠카 가가쿠 가부시키가이샤
Publication of KR20050084071A publication Critical patent/KR20050084071A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100876518B1 publication Critical patent/KR100876518B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
    • C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
    • C07H13/10—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals directly attached to heterocyclic rings
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/3272—Polymers obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B01J20/3274—Proteins, nucleic acids, polysaccharides, antibodies or antigens
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/328—Polymers on the carrier being further modified
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3823—Affinity chromatography of other types, e.g. avidin, streptavidin, biotin
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/54—Sorbents specially adapted for analytical or investigative chromatography

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

하기 화학식 1로 표시되는 11~3당을 갖는 당사슬 아스파라긴 유도체,
[화학식 1]
[화학식 중, R1 및 R2는 수소원자, 명세서 기재의 화학식 2~6으로 나타내어지는 기이고, 동일해도 상이해도 된다. Q는 비오틴기 또는 FITC기를 나타낸다.]
비오틴기 또는 FITC기로 아스파라긴의 아미노기 질소가 수식된 당사슬 아스파라긴의 비환원말단측 N-아세틸글루코사민에 적어도 1개 이상의 푸코오스를 포함하는 당사슬 아스파라긴 유도체, 비오틴화 당사슬 아스파라긴을 결합시킨 마이크로플레이트, 및 비오틴화 당사슬 아스파라긴을 결합시킨 어피니티 칼럼.

Description

당사슬 아스파라긴 유도체 및 그의 제조방법{Sugar-chain asparagine derivatives and processes for the preparation thereof}
본 발명은 비오틴화 당사슬 아스파라긴, 플루오레세인이소티오시아네이트(FITC)화 당사슬 아스파라긴, 그들의 제조방법 및 그의 용도에 관한 것이다.
최근, 핵산(DNA), 단백질에 이은 제3의 사슬형상 생명분자로서, 당사슬분자가 주목되어 오고 있다. 인간의 몸은 약 60조개의 세포로 되어 있는 하나의 대세포사회(huge cell society)로, 모든 세포 표면은 당사슬분자에 의해 덮혀 있다. 예를 들면, ABO식 혈액형은 세포 표면의 당사슬의 차이에 의해 결정되고 있다.
당사슬은 세포간의 인식이나 상호작용에 관련된 작용을 가져, 세포사회를 성립시키는 중요한 물질로 되어 있다. 세포사회의 교란은 암, 만성질환, 감염증, 노화 등으로 이어진다.
예를 들면, 세포가 암화(癌化)되면 당사슬의 구조변화가 일어나는 것이 알려져 있다. 또한, 콜레라균이나 인플루엔자 바이러스 등은 어느 특정한 당사슬을 인식하여 결합함으로써, 세포에 침입하여 감염되는 것이 알려져 있다.
당사슬은 단당(simple sugar)의 배열, 결합양식·부위, 사슬의 길이·분지양식, 전체의 고차구조 등의 다양성으로부터, 핵산이나 단백질의 구조와 비교하면 매우 복잡한 구조이다. 따라서, 그 구조에 유래하는 생물학적인 정보는 핵산이나 단백질에 비해 다종다양하다. 당사슬은 연구의 중요성을 인식하고 있으면서도, 그 구조의 복잡함이나 다양성에 의해 핵산이나 단백질에 비해 연구의 추진이 뒤져 있는 상황에 있다.
상술한 바와 같이 어떤 특정의 당사슬과 단백질이 인식하여 결합능을 갖고 있는지를 해명함으로써, 새로운 원리에 기초하는 의약품이나 식품의 개발 등을 초래하여, 병의 예방, 치료에 공헌하는 등, 폭 넓은 응용이 기대되고 있다.
따라서, 비오틴·아비딘의 결합 특이성을 이용하여, 비오틴화한 복수의 당사슬을 아비딘화한 마이크로플레이트(microplate) 위에서 반응시키는 것만으로 간단하게 당사슬 마이크로칩을 제조할 수 있다. 이것에 의해, 특정 당사슬과 결합능을 갖는 단백질을 해명할 수 있다.
또한, 어떤 특정 단백질을 분리 정제할 목적으로, 아비딘화한 어피니티 칼럼(affinity column)에 특정 비오틴화한 당사슬을 결합하여 고정화하고, 거기에 비오틴화한 당사슬과 특이적 결합능을 갖는 단백질을 포함하는 혼합물을 통과시킴으로써 목적으로 하는 단백질만을 단리할 수 있다.
또한 FITC화한 당사슬 아스파라긴은, 캐필러리 전기영동법(capillary electrophoresis) 등에 의해 미량이더라도 단리할 수 있다. 더욱이 그로부터 FITC를 박리하고 당사슬 아스파라긴 자신을 단리하는 것도 가능하다.
본 발명의 과제는, 아스파라긴의 아미노기 질소를 비오틴화 또는 FITC화한 당사슬 아스파라긴, 그의 제조방법 및 그의 용도를 제공하는 것에 있다.
발명의 개시
본 발명은, 하기의 발명에 관한 것이다.
1. 하기 화학식 1로 표시되는 11~3당(糖)을 갖는 당사슬 아스파라긴 유도체.
[화학식 중, R1 및 R2는 수소원자, 화학식 2~화학식 6으로 나타내어지는 기이고, 동일해도 상이해도 된다. Q는 비오틴기 또는 FITC기를 나타낸다.]
2. 비오틴기 또는 FITC기로 아스파라긴의 아미노기 질소가 수식된 당사슬 아스파라긴의 비환원말단측 N-아세틸글루코사민에 적어도 1개 이상의 푸코오스(fucose)를 포함하는 당사슬 아스파라긴 유도체.
3. 화학식 9로 표시되는 11~3당을 갖는 당사슬 아스파라긴을 비오틴화하는 것을 특징으로 하는 비오틴화 당사슬 아스파라긴의 제조방법.
[화학식 중, R1 및 R2는 상기와 동일하다.]
4. 화학식 9로 표시되는 11~3당을 갖는 당사슬 아스파라긴을 플루오레세인이소티오시아네이트(FITC)화하는 것을 특징으로 하는 FITC화 당사슬 아스파라긴의 제조방법.
5. 상기 비오틴화 당사슬 아스파라긴을 결합시킨 마이크로플레이트.
6. 상기 비오틴화 당사슬 아스파라긴을 결합시킨 어피니티 칼럼.
본 발명자는 앞서 일본국 특허출원 제2001-185685호(이하, 선출원이라고 한다)에 있어서, 여러 가지의 단리된 당사슬 아스파라긴 유도체를 종래에 비해 매우 용이하고 또한 대량으로 얻을 수 있는, 당사슬 아스파라긴 유도체, 당사슬 아스파라긴, 당사슬의 제조방법, 더 나아가서는 당잔기가 임의로 결실된 당사슬이 결합된 신규한 당사슬 아스파라긴 유도체, 당사슬 아스파라긴, 당사슬을 개발하였다.
이 선출원의 방법은 예를 들면
(1) (a) 1종류 또는 2종류 이상의 당사슬 아스파라긴을 포함하는 혼합물에 포함되는 상기 당사슬 아스파라긴에 지용성 보호기를 도입하여 당사슬 아스파라긴 유도체 혼합물을 얻는 공정,
및
(b) 상기 당사슬 아스파라긴 유도체 혼합물 또는 상기 당사슬 아스파라긴 유도체 혼합물에 포함되는 당사슬 아스파라긴 유도체를 가수분해하여 얻어지는 혼합물을 크로마토그래피에 제공하여 각 당사슬 아스파라긴 유도체를 분리하는 공정,
을 포함하는 당사슬 아스파라긴 유래의 당사슬 아스파라긴 유도체의 제조방법,
(2) (1)에 있어서, (b') 공정 (b)에서 분리된 당사슬 아스파라긴 유도체를 당 가수분해효소를 사용하여 가수분해하는 공정을 추가로 포함하는 당사슬 아스파라긴 유도체의 제조방법,
(3) (1) 또는 (2)에 있어서, 1종류 또는 2종류 이상의 당사슬 아스파라긴을 포함하는 혼합물이, 하기 화학식 A의 화합물 및/또는 상기 화합물에 있어서 1 이상의 당잔기가 결실된 화합물을 포함하는 것인 당사슬 아스파라긴 유도체의 제조방법,
(4) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 지용성 보호기가 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)기인 당사슬 아스파라긴 유도체의 제조방법,
(5) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 공정 (a)가 비환원말단에 시알산 잔기를 갖는 1종류 또는 2종류 이상의 당사슬 아스파라긴을 포함하는 혼합물에 포함되는 상기 당사슬 아스파라긴에 Fmoc기를 도입하고, 또한 시알산 잔기에 벤질기를 도입하여 당사슬 아스파라긴 유도체 혼합물을 얻는 공정인 당사슬 아스파라긴 유도체의 제조방법,
(6) (a) 1종류 또는 2종류 이상의 당사슬 아스파라긴을 포함하는 혼합물에 포함되는 상기 당사슬 아스파라긴에 지용성 보호기를 도입하여 당사슬 아스파라긴 유도체 혼합물을 얻는 공정,
(b) 상기 당사슬 아스파라긴 유도체 혼합물 또는 상기 당사슬 아스파라긴 유도체 혼합물에 포함되는 당사슬 아스파라긴 유도체를 가수분해하고, 얻어지는 혼합물을 크로마토그래피에 제공하여 각 당사슬 아스파라긴 유도체를 분리하는 공정, 및
(c) 공정 (b)에서 분리된 당사슬 아스파라긴 유도체의 보호기를 제거하여 당사슬 아스파라긴을 얻는 공정,
을 포함하는 당사슬 아스파라긴의 제조방법,
(7) (6)에 있어서, (b') 공정 (b)에서 분리된 당사슬 아스파라긴 유도체를 당 가수분해효소를 사용하여 가수분해하는 공정 및/또는
(c') 공정 (c)에서 얻어진 당사슬 아스파라긴을 당 가수분해효소를 사용하여 가수분해하는 공정,
을 추가로 포함하는 당사슬 아스파라긴의 제조방법,
(8) (6) 또는 (7)에 있어서, 1종류 또는 2종류 이상의 당사슬 아스파라긴을 포함하는 혼합물이, 하기 화학식 A의 화합물 및/또는 상기 화합물에 있어서 1 이상의 당잔기가 결실된 화합물을 포함하는 것인 당사슬 아스파라긴의 제조방법,
(9) (6) 내지 (8) 중 어느 하나에 있어서, 지용성 보호기가 Fmoc기인 당사슬 아스파라긴의 제조방법,
(10) (6) 내지 (8) 중 어느 하나에 있어서, 공정 (a)가 비환원말단에 시알산 잔기를 갖는 1종류 또는 2종류 이상의 당사슬 아스파라긴을 포함하는 혼합물에 포함되는 상기 당사슬 아스파라긴에 Fmoc기를 도입하고, 또한 시알산 잔기에 벤질기를 도입하여 당사슬 아스파라긴 유도체 혼합물을 얻는 공정인 당사슬 아스파라긴의 제조방법 등이다.
이들 당사슬 아스파라긴 유도체 및 당사슬 아스파라긴의 제조에 대한 상세한 내용은 상기 선출원에 기술되어 있기 때문에, 이것을 인용한다. 그러나 선출원의 내용에 대해서 약간 기술하자면, 선출원의 당사슬 아스파라긴 유도체의 제조방법은, 예를 들면 천연의 당단백질에 유래하는 당사슬 아스파라긴, 바람직하게는 아스파라긴 결합형 당사슬로부터 얻어지는 당사슬 아스파라긴의 혼합물에 포함되는 해당 당사슬 아스파라긴에 지용성 보호기를 도입(결합)하여 당사슬 아스파라긴 유도체의 혼합물을 얻은 후에, 해당 혼합물을 각 당사슬 아스파라긴 유도체로 분리하는 것을 하나의 큰 특징으로 한다. 또한, 본 명세서에 있어서 「당사슬 아스파라긴」이란 아스파라긴이 결합된 상태의 당사슬을 말한다. 또한, 「아스파라긴 결합형 당사슬」이란 단백질의 폴리펩티드 중의 아스파라긴(Asn)의 산아미노기에, 환원말단에 존재하는 N-아세틸글루코사민이 N-글리코시드 결합된 당사슬군으로서, Man(β1-4), GlcNac(β1-4)GlcNac를 모핵(mother nucleus)으로 하는 당사슬군을 말한다. 「당사슬 아스파라긴 유도체」란 아스파라긴 잔기에 지용성 보호기가 결합된 상태의 당사슬 아스파라긴을 말한다. 또한, 화합물의 구조식 중, 「AcHN」은 아세트아미도기를 나타낸다.
상기한 바와 같이, 천연의 당단백질에 유래하는 당사슬은 비환원말단의 당잔기가 랜덤으로 결실된 당사슬의 혼합물이다. 본 발명자 등은 의외로 천연의 당단백질에 유래하는 당사슬, 구체적으로는 당사슬 아스파라긴의 혼합물에 포함되는 해당 당사슬 아스파라긴에 지용성 보호기를 도입함으로써, 해당 보호기가 도입된 당사슬 아스파라긴 유도체의 혼합물을 공지의 크로마토그래피의 수법을 사용하여 용이하게 개개의 당사슬 아스파라긴 유도체로 분리할 수 있는 것을 발견하였다. 그것에 의해, 여러 구조를 갖는 당사슬 아스파라긴 유도체를 각각 대량으로 조제하는 것이 가능해졌다. 예를 들면, 종래 분리가 곤란했던 유사구조의 당사슬 아스파라긴 유도체끼리의 분리가 가능해져, 그들의 화합물을 각각, 용이하고 또한 대량으로 조제할 수 있다. 또한, 얻어진 당사슬 아스파라긴 유도체를 토대로, 예를 들면 당 가수분해효소를 순차 작용시켜 당잔기를 제거함으로써, 더욱 다양한 당사슬 아스파라긴 유도체를 합성하는 것도 가능하다.
이와 같이, 당사슬 아스파라긴에 지용성 보호기를 도입하여 유도체화함으로써 개개의 당사슬 아스파라긴 유도체의 분리가 가능해졌지만, 이것은 지용성 보호기를 도입함으로써 당사슬 아스파라긴 유도체의 전체 지용성이 높아져, 예를 들면 적합하게 사용되는 역상계 칼럼(reverse-phase column)과의 상호작용이 현격히 향상되어, 그 결과 보다 예민하게 당사슬 구조의 차를 반영하여 개개의 당사슬 아스파라긴 유도체가 분리되게 된 것에 의한 것으로 생각된다.
더욱이 선출원에 의하면, 얻어진 당사슬 아스파라긴 유도체의 보호기를 제거함으로써 여러 당사슬 아스파라긴을, 인공적으로 용이하고 또한 대량으로 얻을 수 있다.
상기 선출원에서 얻어지는 당사슬 아스파라긴 유도체, 당사슬 아스파라긴 및 당사슬은 모두 α2,6 결합체인 것이었다.
또한, 상기 선출원에서 얻어지는 당사슬 아스파라긴 유도체, 당사슬 아스파라긴 및 당사슬은 모두 푸코오스가 결합되어 있지 않은 당사슬 아스파라긴 유도체였다.
여기에서, α2,3 결합체와 α2,6 결합체의 상이에 대해 이하에 설명한다.
α2,3 결합체, α2,6 결합체란, 시알산과 갈락토오스의 결합양식을 나타내는 것이다. 전자는 시알산 2번 위치의 탄소와 갈락토오스 3번 위치의 탄소가 α결합하고 있는 것을 말하고, 후자는 시알산 2번 위치의 탄소와 갈락토오스 6번 위치의 탄소가 α결합하고 있는 것을 말한다. 이들은 갈락토오스와의 결합탄소의 차이이다.
본 발명의 방법에 있어서는 먼저, 출발 화합물인 지용성 보호기로 보호된 당사슬 아스파라긴(9당-Asn-Fmoc)을 시알산 전이효소를 사용하여 시알산 또는 시알산의 유도체를 전이시키고, 얻어진 지용성 보호기로 보호된 당사슬 아스파라긴을 크로마토그래피에 제공함으로써 분리하여, 지용성 보호기로 보호된 디시알로 당사슬 아스파라긴 유도체 및 2종류의 모노시알로 당사슬 아스파라긴 유도체가 얻어진다.
이어서, 얻어진 디시알로 당사슬 아스파라긴 유도체 및 2종류의 모노시알로 당사슬 아스파라긴 유도체를 당 가수분해함으로써, 시알산 또는 시알산 유도체를 갖는 9~7당사슬 아스파라긴 유도체가 얻어진다.
또한, 상기에서 얻어진 11~7당사슬 아스파라긴 유도체나 디시알로 당사슬 아스파라긴(α2,6-11당-Asn-Fomc)을 출발 원료로 하고 그것을 당 가수분해함으로써 얻어지는 10~6당사슬 아스파라긴 유도체에, 당전이효소에 의해 푸코오스를 전이함으로써 푸코오스를 포함하는 13~7당사슬 아스파라긴 유도체가 얻어진다.
해당 보호기로서는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 Fmoc기나 t-부틸옥시카르보닐(Boc)기, 벤질기, 알릴기, 알릴옥시카르보닐기, 아세틸기 등의 카보네이트계 또는 아미드계의 보호기 등을 사용할 수 있다. 얻어진 당사슬 아스파라긴 유도체를 바로 목적으로 하는 당펩티드의 합성에 사용할 수 있다고 하는 관점으로부터, 해당 보호기로서는 Fmoc기 또는 Boc기 등이 바람직하고, Fmoc기가 보다 바람직하다. Fmoc기는 시알산 등 비교적 산성조건에 불안정한 당이 당사슬에 존재하는 경우에 특히 유효하다. 또한, 보호기의 도입은 공지의 방법(예를 들면, Protecting groups in Organic chemistry, John Wiley & Sons INC., New York 1991, ISBN 0-471-62301-6 을 참조)에 따라 행하면 된다.
예를 들면, Fmoc기를 사용하는 경우, 당사슬 아스파라긴에 대해 아세톤을 적량 가한 후, 추가로 9-플루오레닐메틸-N-숙신이미딜 카보네이트와 탄산수소나트륨을 가하여 용해하고, 25℃에서 아스파라긴 잔기로의 Fmoc기의 결합반응을 행함으로써, 해당 당사슬 아스파라긴의 아스파라긴 잔기에 Fmoc기를 도입할 수 있다.
이상의 조작에 의해, 지용성 보호기가 도입된 당사슬 아스파라긴 유도체가 얻어진다.
시알산으로서는, 일반적으로 시판되고 있는 시알산 또는 화학합성한 것을 사용할 수 있다.
시알산의 유도체로서는, 일반적으로 시판되고 있는 시알산의 유도체 또는 화학합성한 것을 사용할 수 있다. 구체적으로는, 시알산 7번 위치, 8번 위치 또는 9번 위치의 탄소에 결합되어 있는 수산기를 수소원자 또는 할로겐원자로 치환한 것을 들 수 있다. 할로겐원자로서는, 플루오르, 염소, 브롬 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 플루오르가 좋다.
시알산 전이효소로서는, 일반적으로 시판되고 있는 것, 천연 유래의 것, 유전자 재조합에 의해 생산된 것을 사용할 수 있고, 전이시키는 시알산 또는 시알산의 유도체 종류에 따라 적절히 선택할 수 있다. 구체적으로는, α2,3 전이효소인 랫트 리콤비넌트(Rat Recombinant) 유래의 것, α2,6 전이효소인 랫트 간장(Rat Liver) 유래의 것을 들 수 있다. 또한 시알리다아제(sialydase)를 사용해서 pH 조정 등에 의해 평형을 이동시킴으로써 시알산 또는 시알산의 유도체를 전이시켜도 된다.
상기 당사슬 아스파라긴 유도체의 크로마토그래피에 의한 분리는, 적절히 공지의 크로마토그래피를 단독으로 또는 복수 조합시켜 사용함으로써 행할 수 있다.
예를 들면, 얻어진 당사슬 아스파라긴 유도체 혼합물을 겔여과 칼럼크로마토그래피(gel filtration column chromatography)로 정제 후, HPLC를 사용하여 정제한다. HPLC에 있어서 사용할 수 있는 칼럼으로서는 역상계 칼럼이 적합하고, 예를 들면 ODS, 페닐(Phenyl)계, 니트릴계나 음이온교환계 칼럼, 구체적으로는 예를 들면 파마시아사제 모노Q 칼럼, 이아트론사제 이아트로비즈 칼럼(Iatro-beads column) 등이 이용 가능하다. 분리조건 등은 적절히 공지의 조건을 참조하여 조정하면 된다. 이상의 조작에 의해, 당사슬 아스파라긴 유도체 혼합물로부터 목적으로 하는 각 당사슬 아스파라긴 유도체를 얻을 수 있다.
이어서, 상기에서 분리된 당사슬 아스파라긴 유도체를 가수분해함으로써, 목적으로 하는 당사슬 구조를 갖는 당사슬 아스파라긴 유도체를 효율적으로 얻을 수 있다. 예를 들면, 당사슬 아스파라긴 유도체를 분리하는 단계에 있어서는 혼합물에 포함되는 당사슬 아스파라긴 유도체의 종류를 제한하여 당사슬 아스파라긴 유도체를 대충 분리하고, 이어서 가수분해, 예를 들면, 당 가수분해효소를 사용하여 가수분해함으로써 목적으로 하는 당사슬 구조를 갖는 당사슬 아스파라긴 유도체를 효율적으로 얻을 수 있다. 또한, 가수분해는 상기와 동일하게 하여 행할 수 있다. 특히, 목적으로 하는 당사슬 구조를 갖는 당사슬 아스파라긴 유도체를 보다 효율적으로 얻는 관점으로부터, 당잔기의 절단양식이 명확한 당 가수분해효소를 사용하여 가수분해하는 것이 바람직하다.
예를 들면, 갈락토오스 잔기의 제거는, 가수분해되는 화합물을 완충액(예를 들면, 인산 완충용액, 초산 완충용액, 굳 완충용액(Good's buffer) 등)에 용해하고, 공지의 조건에 따라 갈락토오스 가수분해효소를 사용하여 갈락토오스 잔기의 절단반응을 행함으로써 이룰 수 있다. 또한, 가수분해되는 화합물은 각각 단리된 것이어도 혼합물이어도 된다. 이 반응에서 사용하는 갈락토오스 가수분해효소는 시판되고 있는 공지의 엑소형(exo-form) 효소를 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 동일한 활성을 갖는 것이라면, 새로 단리된 효소, 유전자 공학적으로 창제된 효소여도 된다. 이어서, 상기와 동일하게 하여, 반응 후에 얻어지는 반응액(당잔기가 절단된 당사슬 아스파라긴 유도체의 혼합물)을 크로마토그래피에 제공하여, 각 당사슬 아스파라긴 유도체를 얻으면 된다. 예를 들면, 분리는 HPLC(ODS 칼럼, 전개용매는 50 mM 초산암모늄수용액:아세토니트릴=82:18)로 행하는 것이 바람직하다.
N-아세틸글루코사민 잔기의 제거는, 가수분해되는 화합물을 완충액(예를 들면, 인산 완충용액, 초산 완충용액, 굳 완충용액 등)에 용해하고, 공지의 조건에 따라 N-아세틸글루코사민 가수분해효소를 사용하여 N-아세틸글루코사민 잔기의 절단반응을 행함으로써 이룰 수 있다. 또한, N-아세틸헥소사미니다아제(N-acetylhexosaminidase) 가수분해효소를 사용해도 된다. 또한, 가수분해되는 화합물은 각각 단리된 것이어도 혼합물이어도 된다. 이 반응에서 사용하는 각 효소는 시판되고 있는 엑소형 효소를 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 동일한 활성을 갖는 것이라면, 새로 단리된 효소, 유전자 공학적으로 창제된 효소여도 된다. 이어서, 상기와 동일하게 하고, 반응 후에 얻어지는 반응액(당잔기가 절단된 당사슬 아스파라긴 유도체의 혼합물)을 크로마토그래피에 제공하여, 각 당사슬 아스파라긴 유도체를 얻으면 된다. 예를 들면, 분리는 HPLC(ODS 칼럼, 전개용매는 50 mM 초산암모늄수용액:메탄올=65:35 또는 50 mM 초산암모늄수용액:아세토니트릴=82:18)로 행하는 것이 바람직하다.
만노오스 잔기의 제거는, 가수분해되는 화합물을 완충액(예를 들면, 인산 완충용액, 초산 완충용액, 굳 완충용액 등)에 용해하고, 공지의 조건에 따라 만노오스 가수분해효소를 사용하여 만노오스 잔기의 절단반응을 행함으로써 이룰 수 있다. 또한, 가수분해되는 화합물은 각각 단리된 것이어도 혼합물이어도 된다. 이 반응에서 사용하는 만노오스 가수분해효소는 시판되고 있는 엑소형 효소를 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 동일한 활성을 갖는 것이라면 새로 단리된 효소, 유전자 공학적으로 창제된 효소여도 된다. 이어서, 상기와 동일하게 하고, 반응 후에 얻어지는 반응액(당잔기가 절단된 당사슬 아스파라긴 유도체의 혼합물)을 크로마토그래피에 제공하여, 각 당사슬 아스파라긴 유도체를 얻으면 된다. 예를 들면, 분리는 HPLC(ODS 칼럼, 전개용매는 10~200 mM 정도의 초산암모늄 등의 완충용액과 아세토니트릴, 또는 에탄올, 또는 메탄올, 또는 부탄올, 또는 프로판올 등의 지용성이 있는 수용성 유기용제를 적절히 혼합해서 사용할 수 있다. 여기에 예시하는 경우, 전개용매로서는 50 mM 초산암모늄수용액:아세토니트릴=82:18이 적합하다)로 행하는 것이 바람직하다.
이와 같이 하여 얻어진 각 당사슬 아스파라긴 유도체를 얻은 후, 푸코오스를 전이시킴으로써 본 발명의 지용성 보호기로 아스파라긴의 아미노기 질소가 보호된 당사슬 아스파라긴의 비환원말단측 N-아세틸글루코사민에 적어도 1개 이상의 푸코오스를 포함하는 신규한 당사슬 아스파라긴 유도체를 제조할 수 있다.
푸코오스로서는, 일반적으로 시판되고 있는 푸코오스 또는 화학합성한 것을 사용할 수 있다.
푸코오스 전이효소로서는, 일반적으로 시판되고 있는 것, 천연 유래의 것, 유전자 재조합에 의해 생산된 것을 사용할 수 있고, 전이시키는 푸코오스의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있다. 구체적으로는, 당사슬 아스파라긴의 비환원말단측 N-아세틸글루코사민에 푸코오스를 전이시키는 효소인 푸코오실트랜스페라아제 V(Fucosyltransferase V)(Human, Recombinant, 혈장 유래, 혈청 유래, 유즙(乳汁) 유래, 간장(肝臟) 유래) 등을 들 수 있다. 또한, 푸코오스 가수분해효소를 사용하여 pH 조정 등에 의해 평형을 이동시킴으로써, 푸코오스를 전이시켜도 된다.
상기 당사슬 아스파라긴 유도체의 크로마토그래피에 의한 분리는, 적절히 공지의 크로마토그래피를 단독으로 또는 복수 조합시켜 사용함으로써 행할 수 있다.
예를 들면, 얻어진 당사슬 아스파라긴 유도체 혼합물을 겔여과 칼럼크로마토그래피로 정제 후, HPLC를 사용하여 정제한다. HPLC에 있어서 사용할 수 있는 칼럼으로서는 역상계 칼럼이 적합하고, 예를 들면 ODS, 페닐(Phenyl)계, 니트릴계나 음이온교환계 칼럼, 구체적으로는, 예를 들면 파마시아사제 모노Q 칼럼, 이아트론사제 이아트로비즈 칼럼 등이 이용 가능하다. 분리조건 등은 적절히 공지의 조건을 참조하여 조정하면 된다. 이상의 조작에 의해, 당사슬 아스파라긴 유도체 혼합물로부터 목적으로 하는 각 당사슬 아스파라긴 유도체를 얻을 수 있다.
이와 같이, 각 당사슬 아스파라긴 유도체를 얻은 후, 추가로 각종 당 가수분해효소 등을 사용하여 해당 유도체를 가수분해하고, 당사슬의 비환원말단의 당잔기를 제거함으로써, 예를 들면, 당사슬 말단의 분지구조가 불균일한 다양한 당사슬 아스파라긴 유도체를 각각 단일 화합물로서 얻을 수 있다. 또한, 여러가지 당 가수분해효소를 사용하여, 가수분해하는 순서나 그 종류를 변경함으로써, 보다 많은 종류의 당사슬 아스파라긴 유도체를 제조할 수 있다.
종래의 방법에 의하면, 극히 제한된 당사슬 구조를 갖는 당사슬 아스파라긴 유도체를 분석 스케일로 얻는 것에 조차 방대한 시간과 비용이 필요했지만, 본 발명에 의하면 특별한 장치나 시약을 필요로하지 않고, 관용의 겔여과 칼럼, HPLC 칼럼이나 적어도 3종류의 당 가수분해효소(예를 들면, 갈락토오스 가수분해효소, 만노오스 가수분해효소, N-아세틸글루코사민 가수분해효소) 등을 사용하여, 2주일 정도에 목적으로 하는 당사슬 구조를 갖는 당사슬 아스파라긴 유도체를 1 그램 정도 조제하는 것이 가능하다.
본 발명에서는, 상기 선출원에서 얻어진 각종 당사슬 아스파라긴, 상기 선출원에 기재가 없는 α2,3 결합체의 당사슬 아스파라긴, 및 (α2,3) (α2,6) 결합체의 당사슬 아스파라긴, 더 나아가서는 이들의 푸코오스 결합체의 당사슬 아스파라긴을 사용하여, 목적으로 하는 비오틴화 또는 FITC화한 당사슬 아스파라긴 유도체를 얻는 것이다.
본 발명은, 당사슬 아스파라긴의 아미노기 질소를 비오틴화 또는 FITC화한 당사슬 아스파라긴이다.
본 발명의 비오틴화 당사슬 아스파라긴으로서는, 예를 들면 하기 화학식으로 표시되는 화합물을 들 수 있다.
[화학식 중, R1 및 R2는 H, 또는 화학식 2~6으로 나타내어지는 기이고, 동일해도 상이해도 된다.]
본 발명의 FITC화 당사슬 아스파라긴으로서는, 예를 들면 하기 화학식으로 표시되는 화합물을 들 수 있다.
[화학식 중, R1 및 R2는 상기와 동일하다.]
또한, 본 발명은 당사슬 아스파라긴의 아미노기 질소를 비오틴화 또는 FITC화한 비오틴화 또는 FITC화 당사슬 아스파라긴의 제조방법이다.
본 발명의 비오틴화 또는 FITC화 당사슬 아스파라긴의 제조방법으로서는, 예를 들면 상기에 나타낸 여러 단리된 당사슬 아스파라긴의 아스파라긴의 아미노기 질소를 비오틴화 또는 FITC화함으로써 얻을 수 있다.
본 발명에서 사용되는 당사슬 아스파라긴으로서는, 예를 들면 화학식 7로 표시되는 화합물을 들 수 있다.
[화학식 7]
(화학식 중, R1 및 R2는 상기와 동일.)
구체적인 당사슬 아스파라긴으로서는, 선출원에 기재된 화합물을 들 수 있다. 즉, 선출원의 도 3~4에 나타내어진 α2,6 화합물을 동일하게 사용할 수 있고, 기호화한 이들 화합물을 본 발명의 표 1~3에 나타낸다.
또한 상기 당사슬 아스파라긴을 합성하기 위해 사용된 당사슬 아스파라긴 유도체로서도, 선출원에 기재된 α2,6 화합물을 들 수 있다. 즉, 선출원의 도 1~2에 나타내어진 화합물을 동일하게 사용할 수 있고, 기호화한 이들 화합물을 본 발명의 표 4~6에 나타낸다.
또한 상기 선출원에 기재된 당사슬 아스파라긴 이외에, α2,3 결합체의 당사슬 아스파라긴 및 (α2,3) (α2,6) 결합체의 당사슬 아스파라긴, 더 나아가서는 이들의 푸코오스 결합체의 당사슬 아스파라긴을 사용할 수 있다.
본 발명의 비오틴화로서는, 공지의 방법에 따라 행할 수 있다. 예를 들면, 당사슬 아스파라긴을 물에 용해하여 중탄산 나트륨을 가하고, 여기에 D-(+)-비오티닐숙신이미드를 용해시킨 디메틸포름아미드를 가하고, 실온에서 20분 반응시켜 겔여과 칼럼 등으로 정제해서 비오틴화 당사슬 아스파라긴을 얻을 수 있다.
본 발명의 비오틴화 당사슬 아스파라긴을 결합시킨 마이크로플레이트는, 시판의 아비딘화한 마이크로플레이트(예를 들면, 피어스사제)에 비오틴화한 당사슬 아스파라긴을 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 비오틴화 당사슬 아스파라긴을 결합시킨 어피니티 칼럼은, 시판의 아비딘화한 어피니티 칼럼에 비오틴화한 당사슬 아스파라긴을 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 FITC화로서는, 공지의 방법에 따라 행할 수 있다. 예를 들면, 당사슬 아스파라긴을 물에 용해하여 아세톤, 중탄산 나트륨을 가하고, 여기에 플루오레세인이소티오시아네이트를 가하고, 실온에서 2시간 반응시켜, 겔여과 칼럼 등으로 정제해서 FITC화 당사슬 아스파라긴을 얻을 수 있다.
본 발명에서 얻어진 FITC화 당사슬 아스파라긴은, 예를 들면 생체조직 중의 당사슬 수용체의 연구, 렉틴의 당결합 특이성의 연구에 유용하다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하에 실시예를 들어 설명하지만, 본 발명은 조금도 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. 또한 1H-NMR 데이터는 실시예 1~7 및 참고예 45에 대해서는 30℃에서 HOD를 4.8 ppm으로 하고, 참고예 1~44에 대해서는 30℃에서 내부표준으로서 아세톤의 메틸기 시그날을 2.225 ppm, HOD를 4.718 ppm으로 해서 측정하여 얻어진 값이다. 또한, Fmoc기가 제거된 화합물에 대해서는 측정 용매 중에 50 mM의 탄산수소 암모늄을 공존시켜서 측정하였다.
참고예 1 디시알로 당사슬 아스파라긴(화합물 24)의 합성
난(egg) 유래 조정제(粗精製) SGP(시알릴 글리코펩티드) 2.6 g을 트리스-염산·염화칼슘 완충용액(TRIZMA BASE 0.05 mol/l, 염화칼슘 0.01 mol/l, pH 7.5) 100 ㎖에 용해시켰다. 여기에 아지드화나트륨(sodium azide) 58 ㎎(772 μmol)과 액티나아제-E(Actinase-E)(가켄세이야쿠사제) 526 ㎎을 가하여 37℃에서 정치(靜置)하였다. 65시간 후, 다시 액티나아제-E를 263 ㎎ 가하고, 추가로 37℃에서 24시간 정치하였다. 이 용액을 동결건조한 후, 잔류물을 겔여과 칼럼크로마토그래피(Sephadex G-25, 2.5 Ø×1 m, 전개용매는 물, 유속은 1.0 ㎖/분)로 2회 정제하여, 화합물 24를 1.3 g(555 μmol) 얻었다.
얻어진 화합물 24의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 2 화합물 1, 2, 6 및 10의 합성
참고예 1에서 얻어진 화합물 24(609 ㎎, 261 μmol)를 물 20.7 ㎖에 용해시키고, 추가로 0.1 규정 염산 13.8 ㎖를 가하였다. 이 용액을 70℃에서 35분간 가열한 후 신속하게 빙냉(氷冷)하고, 포화 탄산수소나트륨수용액을 가하여 pH 7로 하였다. 이것을 동결건조한 후, 잔류물을 겔여과 칼럼크로마토그래피(Sephadex G-25, 2.5 Ø×1 m, 전개용매는 물, 유속은 1.0 ㎖/분)로 정제한 바, 화합물 24, 화합물 25 및 화합물 29, 화합물 33의 혼합물 534 ㎎을 얻었다. 이 4성분은 각각을 단리하지 않고 다음 공정으로 진행하였다.
또한, 얻어진 당사슬 혼합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
얻어진 당사슬의 혼합물 429 ㎎을 아세톤 16.3 ㎖와 물 11.2 ㎖에 용해시켰다. 여기에 9-플루오레닐메틸-N-숙신이미딜 카보네이트(155.7 ㎎, 461.7 μmol)와 탄산수소나트륨(80.4 ㎎, 957 μmol)을 가하고 실온에서 2시간 교반하였다. 이 용액을 이베포레이터(evaporator)에서 아세톤을 제거하고, 남은 용액을 겔여과 칼럼크로마토그래피(Sephadex G-25, 2.5 Ø×1 m, 전개용매는 물, 유속은 1.0 ㎖/분)로 정제한 바, 화합물 1, 화합물 2 및 6, 화합물 10의 혼합물 309 ㎎이 얻어졌다. 이 혼합물을 HPLC(ODS 칼럼, 전개용매는 50 mM 초산암모늄수용액:메탄올=65:35, 2.0 Ø×25 cm, 유속 3 ㎖/분)를 사용하여 정제한 바, 51분후에 화합물 1이, 67분후에 화합물 2 및 6의 혼합물이, 93분후에 화합물 10이 용출되었다. 각각을 별도로 취하여 동결건조를 행한 후, 겔여과 칼럼크로마토그래피(Sephadex G-25, 2.5 Ø×30 ㎝, 전개용매는 물, 유속은 1.0 ㎖/분)로 탈염(desalting)함으로써 목적의 화합물 2 및 6의 혼합물 150 ㎎을 얻었다.
또한, 얻어진 화합물 1의 물리적 데이터는 이하와 같다.
상기 당사슬의 구조를 기호화하면 다음과 같이 된다. 여기에서
NeuAc:시알산 Gal:D-갈락토오스 GlcNAc:N-아세틸글루코사민
Man:D-만노오스 Asn:아스파라긴
을 나타낸다.
또한, 얻어진 화합물 2 및 6의 혼합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
또한, 얻어진 화합물 10의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 3 화합물 3 및 7의 합성
참고예 2에서 얻어진 화합물 2 및 6의 혼합물(224 ㎎, 97 μmol)과 소혈청 알부민 24 ㎎을 HEPES 완충용액(50 mM, pH 6.0) 22 ㎖에 용해시키고, 추가로 디플로코커스 뉴모니아(Diplococcus pneumoniae) 유래 β-갈락토시다아제(1.35 U)를 가하였다. 이 용액을 37℃에서 15시간 정치한 후 동결건조를 행하였다. 잔류물을 HPLC(ODS 칼럼, 2.0 Ø×25 cm, 전개용매는 50 mM 초산암모늄수용액:아세토니트릴=85:15, 유속 3 ㎖/분)로 정제한 바, 129분후에 화합물 3이, 134분후에 화합물 7이 용출되었다. 각각을 별도로 취하여 동결건조를 행하였다. 계속해서 HPLC[ODS 칼럼 2.0 Ø×25 cm, 전개용매는 처음 15분간이 물, 16분후부터 30분후까지는 물:아세토니트릴(용량비)=10:0에서 85:15, 31분후부터 45분후까지는 물:아세토니트릴=85:15에서 80:20이 되도록 그라디언트(gradient)를 걸었다. 유속은 3.0 ㎖/분]를 사용하여 탈염처리를 행한 바, 목적으로 하는 화합물 3이 81 ㎎, 화합물 7이 75 ㎎ 얻어졌다.
또한, 얻어진 화합물 3의 물리적 데이터는 이하와 같다.
또한, 얻어진 화합물 7의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 4 화합물 4 및 8의 합성
참고예 3에서 얻어진 화합물 3 및 7의 혼합물(90 ㎎, 47.3 μmol)을 각각 분리하지 않고, 소혈청 알부민 8 ㎎과 함께 HEPES 완충용액(50 mM, pH 6.0) 8.1 ㎖에 용해시키고, 추가로 소의 신장(Bovine kidney) 유래 β-글루코사미니다아제(시그마알드리치사제, from Bovine kidney)를 2.88 U 가하였다. 이 용액을 37℃에서 18시간 정치한 후 동결건조하고, 잔류물을 HPLC(ODS 칼럼, 2.0 Ø×25 cm, 전개용매는 50 mM 초산암모늄수용액:메탄올=65:35, 유속 3 ㎖/분)로 정제한 바, 117분후에 화합물 4가, 127분후에 화합물 8이 용출되었다. 각각을 별도로 취하여 동결건조를 행하였다. 계속해서 HPLC(ODS 칼럼 2.0 Ø×25 cm, 전개용매는 처음 15분간이 물, 16분후부터 30분후까지는 물:아세토니트릴=10:0에서 85:15, 31분후부터 45분후까지는 물:아세토니트릴=85:15에서 80:20이 되도록 그라디언트를 걸었다. 유속은 3.0 ㎖/분)를 사용하여 탈염처리를 행한 바, 목적으로 하는 화합물 4가 40 ㎎, 화합물 8이 37 ㎎ 얻어졌다.
또한, 얻어진 화합물 4의 물리적 데이터는 이하와 같다.
또한, 얻어진 화합물 8의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 5 화합물 5의 합성
참고예 4에서 얻어진 화합물 4(30 ㎎, 473 μmol)와 소혈청 알부민 3 ㎎을 HEPES 완충용액(50 mM, pH 6.0) 6 ㎖에 용해시키고, 추가로 잭 빈스(Jack Beans) 유래 α-만노시다아제(α-mannosidase)를 10 U 가하였다. 이 용액을 37℃에서 21시간 정치한 후 동결건조하고, 계속해서 HPLC(ODS 칼럼, 2.0 Ø×25 cm, 전개용매는 처음 15분간이 물, 16분후부터 30분후까지는 물:아세토니트릴=10:0에서 85:15, 31분후부터 45분후까지는 물:아세토니트릴=85:15에서 80:20이 되도록 그라디언트를 걸었다. 유속은 3.0 ㎖/분)를 사용하여 정제하였더니, 목적으로 하는 화합물 5가 20 ㎎ 얻어졌다.
또한, 얻어진 화합물 5의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 6 화합물 9의 합성
참고예 4에서 얻어진 화합물 8(40 ㎎, 630 μmol)과 소혈청 알부민 5 g을 HEPES 완충용액(50 mM, pH 6.0) 7.8 ㎖에 용해시키고, 잭 빈스(Jack Beans) 유래 α-만노시다아제를 38 U 가하였다. 이 용액을 37℃에서 63시간 정치한 후 동결건조하고, 계속해서 HPLC(ODS 칼럼, 2.0 Ø×25 cm, 전개용매는 처음 15분간이 물, 16분후부터 30분후까지는 물:아세토니트릴=10:0에서 85:15, 31분후부터 45분후까지는 85:15에서 80:20이 되도록 그라디언트를 걸었다. 유속은 3.0 ㎖/분)를 사용하여 정제한 바, 목적으로 하는 화합물 9가 30 ㎎ 얻어졌다.
또한, 얻어진 화합물 9의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 7 Fmoc기의 탈보호(화합물 33의 합성)
참고예 2에서 얻어진 화합물 10(10.5 ㎎, 5.27 μmol)을 50% 모르폴린(morpholine)/N,N-디메틸포름아미드 용액 1.4 ㎖에 용해시키고, 실온·아르곤 분위기하에서 2시간 반응시켰다. 이 용액에 톨루엔 3 ㎖를 가하고, 35℃에서 이베포레이터(evaporator)에 제공하였다. 이 조작을 3회 반복하고, 반응용매를 제거하였다. 잔류물을 겔여과 칼럼크로마토그래피(Sephadex G-25, 2.5 Ø×30 ㎝, 전개용매는 물, 유속은 10 ㎖/분)로 정제하였더니, 목적으로 하는 화합물 33이 7 ㎎ 얻어졌다(수율은 76%). 또한, 얻어진 화합물의 구조는 참고예 2에서 얻어진 화합물 33과 1H-NMR 스펙트럼이 일치하였기에 확인되었다.
화합물 33의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 8 화합물 14의 합성
화합물 3(28 ㎎, 21.3 μmol)과 소혈청 알부민 1.0 ㎎을 HEPES 완충용액(50 mM, pH 5.0, 454 μL)에 용해시키고, 뉴라미니다아제(neuraminidase)(시그마알드리치사제, from Viblio Cholerae, 198 mU)를 가하였다. 이 용액을 37℃에서 20시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 반응용액을 HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5S-5 120A ODS No.2020178, 20×250 ㎜, 전개용매는 50 mM 초산암모늄수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 4 mL/분)로 정제하였다. 추가로 ODS 칼럼(코스모실(Cosmosil) 75C18-OPN, 15×100 ㎜, 처음에 H20를 50 mL 흘리고, 이어서 25% 아세토니트릴을 흘려 용출시켰다)으로 탈염한 바, 목적으로 하는 화합물 14(17 ㎎, 수율 70%)가 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 9 화합물 19의 합성
화합물 7(20 ㎎, 9.4 μmol)과 소혈청 알부민 1.6 ㎎을 HEPES 완충용액(50 mM, pH 5.0, 323 μL)에 용해시키고, 뉴라미니다아제(시그마알드리치사제, from Viblio Cholerae, 141 mU)를 가하였다. 이 용액을 37℃에서 18시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 계속해서 HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250 ㎜, 전개용매는 50 mM 초산암모늄수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 4 mL/분)로 정제하였다. 추가로 ODS 칼럼(코스모실 75C18-OPN, 15×100 ㎜, 처음에 H20를 50 mL 흘리고, 이어서 25% 아세토니트릴을 흘려 용출시켰다)으로 탈염한 바, 목적으로 하는 화합물 19(13 ㎎, 수율 76%)를 얻었다. 얻어진 화합물의 구조는 1H-NMR이 표준 화합물과 일치하였기에 확인되었다.
참고예 10 화합물 15의 합성
화합물 4(45 ㎎, 24 μmol)와 소혈청 알부민 1.7 ㎎을 HEPES 완충용액(50 mM, pH 5.0, 820 μL)에 용해시키고, 뉴라미니다아제(시그마알드리치사제, from Viblio Cholerae, 134 mU)를 가하였다. 이 용액을 37℃에서 14시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 계속해서, 반응용액을 HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250 ㎜, 전개용매는 50 mM 초산암모늄수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 4 mL/분)로 정제하였다. 추가로 ODS 칼럼(코스모실 75C18-OPN, 15×100 ㎜, 처음에 H20를 50 mL 흘리고, 이어서 25% 아세토니트릴을 흘려 용출시켰다)으로 탈염한 바, 목적으로 하는 화합물 15(28 ㎎, 수율 74%)이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 11 화합물 70의 합성
화합물 15(11 ㎎, 6.8 μmol)와 소혈청 알부민 1.5 ㎎을 HEPES 완충용액(50 mM, pH 5.0, 269 μL)에 용해시키고, β-갈락토시다아제(세이카가쿠고교사제, from Jack Beans, 11 μL, 275 mU)를 가하였다. 이 용액을 37℃에서 14시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 반응 용액을 HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250 ㎜, 전개용매는 50 mM 초산암모늄수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 4 mL/분)로 정제하였다. 추가로 ODS 칼럼(코스모실 75C18-OPN, 15×100 ㎜, 처음에 H2O를 50 mL 흘리고, 이어서 25% 아세토니트릴을 흘려 용출시켰다)으로 탈염한 바, 목적으로 하는 화합물 70(6.3 ㎎, 수율 64%)이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 12 화합물 20의 합성
화합물 8(47 ㎎, 25 μmol)과 소혈청 알부민 1.9 ㎎을 HEPES 완충용액(50 mM, pH 5.0, 840 μL)에 용해시키고, 뉴라미니다아제(시그마알드리치사제, from Viblio Cholerae, 369 mU)를 가하였다. 이 용액을 37℃에서 37시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 반응용액을 동결건조하고, 계속해서 HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250 ㎜, 전개용매는 50 mM 초산암모늄수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 4 mL/분)로 정제하였다. 추가로 ODS 칼럼(코스모실 75C18-OPN, 15×100 ㎜, 처음에 H20를 50 mL 흘리고, 이어서 25% 아세토니트릴을 흘려 용출시켰다)으로 탈염한 바, 목적으로 하는 화합물 20(26 ㎎, 수율 65%)을 얻었다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 13 화합물 71의 합성
화합물 20(12 ㎎, 74 μmol)과 소혈청 알부민 1.0 ㎎을 HEPES 완충용액(50 mM, pH 5.0, 330 μL)에 용해시키고, β-갈락토시다아제(세이카가쿠고교사제, from Jack Beans, 12 μL, 297 mU)를 가하였다. 이 용액을 37℃에서 46시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 반응용액은 HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250㎜, 전개용매는 50 mM 초산암모늄수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 4 mL/분)로 정제하였다. 추가로 ODS 칼럼(코스모실 75C18-OPN, 15×100㎜, 처음에 H2O를 50 mL 흘리고, 이어서 25% 아세토니트릴을 흘려 용출시켰다)으로 탈염한 바, 목적으로 하는 화합물 71(6.6 ㎎, 수율 61%)이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 14 화합물 16의 합성
화합물 5(32 ㎎, 18.4 μmol)와 소혈청 알부민 2.5 ㎎을 HEPES 완충용액(50 mM, pH 5.0, 713 μL)에 용해시키고, 뉴라미니다아제(시그마알드리치사제, from Viblio Cholerae, 134 mU)를 가하였다. 이 용액을 37℃에서 17시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 계속해서 반응용액을 HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250 ㎜, 전개용매는 50 mM 초산암모늄수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 4 mL/분)로 정제하였다. 추가로 ODS 칼럼(코스모실 75C18-OPN, 15×100 ㎜, 처음에 H20를 50 mL 흘리고, 이어서 25% 아세토니트릴을 흘려 용출시켰다)으로 탈염한 바, 목적으로 하는 화합물 16(13 ㎎, 수율 52%)이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 15 화합물 17의 합성
화합물 16(9 ㎎, 6.2 μmol)과 소혈청 알부민 1.6 ㎎을 HEPES 완충용액(50 mM, pH 5.0, 613 μL)에 용해시키고, β-갈락토시다아제(세이카가쿠고교사제, from Jack Beans, 186 mU)를 가하였다. 이 용액을 37℃에서 32시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 반응용액을 HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250㎜, 전개용매는 50 mM 초산암모늄수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 4 mL/분)로 정제하였다. 추가로 ODS 칼럼(코스모실 75C18-OPN, 15×100㎜, 처음에 H2O를 50 mL 흘리고, 이어서 25% 아세토니트릴을 흘려 용출시켰다)으로 탈염한 바, 목적으로 하는 화합물 17(5.4 ㎎, 수율 68%)이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 16 화합물 18의 합성
화합물 17(3.4 ㎎, 2.6 μmol)과 소혈청 알부민 1.1 ㎎을 HEPES 완충용액(50 mM, pH 5.0, 257 μL)에 용해시키고, N-아세틸-β-D-글루코사미니다아제(시그마알드리치 from Jack Beans, 144 mU)를 가하였다. 이 용액을 37℃에서 24시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 반응용액을 HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250㎜, 전개용매는 50 mM 초산암모늄수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 4 mL/분)로 정제하였다. 추가로 ODS 칼럼(코스모실 75C18-OPN, 15×100㎜, 처음에 H2O를 50 mL 흘리고, 이어서 25% 아세토니트릴을 흘려 용출시켰다)으로 탈염한 바, 목적으로 하는 화합물 18(2.1 ㎎, 수율 75%)이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 17 화합물 21의 합성
화합물 9(28 ㎎, 16 μmol)와 소혈청 알부민 1.7 ㎎을 HEPES 완충용액(50 mM, pH 5.0, 624 μL)에 용해시키고, 뉴라미니다아제(시그마알드리치사제, from Viblio Cholerae, 117 mU)를 가하였다. 이 용액을 37℃에서 17시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 계속해서 반응용액을 HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250 ㎜, 전개용매는 50 mM 초산암모늄수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 4 mL/분)로 정제하였다. 추가로 ODS 칼럼(코스모실 75C18-OPN, 15×100 ㎜, 처음에 H20를 50 mL 흘리고, 이어서 25% 아세토니트릴을 흘려 용출시켰다)으로 탈염한 바, 목적으로 하는 화합물 21(14.6 ㎎, 수율 68%)이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 18 화합물 22의 합성
화합물 21(10 ㎎, 6.9 μmol)과 소혈청 알부민 1.6 ㎎을 HEPES 완충용액(50 mM, pH 5.0, 672 μL)에 용해시키고, β-갈락토시다아제(세이카가쿠고교사제, from Jack Beans, 205 mU)를 가하였다. 이 용액을 37℃에서 20시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 반응용액을 HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250㎜, 전개용매는 50 mM 초산암모늄수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 4 mL/분)로 정제하였다. 추가로 ODS 칼럼(코스모실 75C18-OPN, 15×100㎜, 처음에 H2O를 50 mL 흘리고, 이어서 25% 아세토니트릴을 흘려 용출시켰다)으로 탈염한 바, 목적으로 하는 화합물 22(5.6 ㎎, 수율 64%)가 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 19 화합물 23의 합성
화합물 22(3.6 ㎎, 2.8 μmol)와 소혈청 알부민 1.2 ㎎을 HEPES 완충용액(50 mM, pH 5.0, 227 μL)에 용해시키고, N-아세틸-β-D-글루코사미니다아제(시그마알드리치 from Jack Beans, 195 mU)를 가하였다. 이 용액을 37℃에서 24시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 반응용액을 HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250㎜, 전개용매는 50 mM 초산암모늄수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 4 mL/분)로 정제하였다. 추가로 ODS 칼럼(코스모실 75C18-OPN, 15×100㎜, 처음에 H2O를 50 mL 흘리고, 이어서 25% 아세토니트릴을 흘려 용출시켰다)으로 탈염한 바, 목적으로 하는 화합물 23(2.3 ㎎, 수율 77%)이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 20 화합물 11의 합성
화합물 10(123 ㎎, 62 μmol)과 소혈청 알부민(1.1 ㎎)을 HEPES 완충용액(50 mM, pH 5.0, 2.5 μL)에 용해시키고, β-갈락토시다아제(세이카가쿠고교사제, from Jack Beans, 24 μL, 612 mU)를 가하였다. 이 용액을 37℃에서 61시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 반응용액을 동결건조하고, 이어서 HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250㎜, 전개용매는 50 mM 초산암모늄수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 3.5 mL/분)로 정제하였다. 추가로 ODS 칼럼(코스모실 75C18-OPN, 15×100㎜, 처음에 H2O를 50 mL 흘리고, 이어서 25% 아세토니트릴을 흘려 용출시켰다)으로 탈염한 바, 목적으로 하는 화합물 11(71 ㎎, 수율 70%)이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 21 화합물 12의 합성
화합물 11(50 ㎎, 30 μmol)과 소혈청 알부민 2.0 ㎎을 HEPES 완충용액(50 mM, pH 5.0, 920 μL)에 용해시키고, N-아세틸-β-D-글루코사미니다아제(시그마알드리치사제, from Jack Beans, 2.1 U)를 가하였다. 이 용액을 37℃에서 48시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 반응용액을 HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250㎜, 전개용매는 50 mM 초산암모늄수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 4 mL/분)로 정제하고 동결건조를 행하였다. 이 잔류물을 ODS 칼럼(코스모실 75C18-OPN, 15×100㎜, 처음에 H2O를 50 mL 흘리고, 이어서 25% 아세토니트릴을 흘려 용출시켰다)으로 탈염한 바, 목적으로 하는 화합물 12(25 ㎎, 수율 66%)가 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 22 화합물 13의 합성
화합물 12(10 ㎎, 11 μmol)와 소혈청 알부민 0.9 ㎎을 HEPES 완충용액(50 mM, pH 5.0, 440 μL)에 용해시키고, α-만노시다아제(시그마알드리치사제, from Jack Beans, 30 μL, 3.2 mU)를 가하였다. 이 용액을 37℃에서 21시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 이어서 HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250㎜, 전개용매는 50 mM 초산암모늄수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 4 mL/분)로 정제를 행하였다. 추가로 ODS 칼럼(코스모실 75C18-OPN, 15×100㎜, 처음에 H2O를 50 mL 흘리고, 이어서 25% 아세토니트릴을 흘려 용출시켰다)으로 탈염한 바, 목적으로 하는 화합물 13(3 ㎎, 수율 43%)을 얻었다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
(당사슬 아스파라긴 유도체의 Fmoc기의 탈보호)
모든 당사슬 아스파라긴 유도체에 있어서, 이하의 절차로 Fmoc기의 탈보호를 행하였다. 먼저, 당사슬 아스파라긴 Fmoc체 1 μmol 당 240 μL의 N,N-디메틸포름아미드, 160 μL의 모르폴린을 가하여, 실온·아르곤 분위기하에서 반응시켰다. TLC(전개용매로서 1 M 초산암모늄:이소프로판올=8:5를 사용하였다)로 반응종료를 확인한 후, 빙수로 냉각하였다. 여기에 디에틸에테르를 반응용액의 10배량 가하여 15분간 교반한 후, 석출된 침전물을 여과 분별하였다. 얻어진 잔사를 물에 용해시키고, 35℃에서 이베포레이트하였다. 추가로 톨루엔을 3 mL 가하여 이베포레이트한다고 하는 조작을 3회 반복하였다. 잔류물을 역상 칼럼크로마토그래피(코스모실 75C18-OPN, 15×100 ㎜, 전개용매는 물)에 의해 정제하였다.
참고예 23 화합물 33의 합성
화합물 10(10.5 ㎎, 5.3 μmol)을 상기 조작으로 7시간 반응시켰더니, 목적으로 하는 화합물 33(7 ㎎, 수율 76%)이 얻어졌다. 얻어진 화합물은 1H-NMR이 표준 화합물과 일치하였기에 확인되었다.
참고예 24 화합물 26의 합성
화합물 3(8.0 ㎎, 3.8 μmol)을 상기 조작으로 21시간 반응시켰더니, 목적으로 하는 화합물 26(6.3 ㎎, 수율 88%)이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 25 화합물 27의 합성
화합물 4(11.0 ㎎, 5.8 μmol)를 상기 조작으로 23시간 반응시켰더니, 목적으로 하는 화합물 27(8.5 ㎎, 수율 88%)이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 26 화합물 28의 합성
화합물 5(7.0 ㎎, 4.0 μmol)를 상기 조작으로 21시간 반응시켰더니, 목적으로 하는 화합물 28(5.3 ㎎, 수율 87%)이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 27 화합물 30의 합성
화합물 7(13.9 ㎎, 6.6 μmol)을 상기 조작으로 7시간 반응시켰더니, 목적으로 하는 화합물 30(8.0 ㎎, 수율 64%)을 얻었다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 28 화합물 31의 합성
화합물 8(8.0 ㎎, 4.2 μmol)을 상기 조작으로 12시간 반응시켰더니, 목적으로 하는 화합물 31(6.0 ㎎, 수율 86%)을 얻었다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 29 화합물 32의 합성
화합물 9(7.7 ㎎, 4.4 μmol)를 상기 조작으로 23시간 반응시켰더니, 목적으로 하는 화합물 32(5.2 ㎎, 수율 78%)가 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 30 화합물 37의 합성
화합물 14(9.1 ㎎, 5.0 μmol)를 상기 조작으로 13시간 반응시켰더니, 목적으로 하는 화합물 37(6.5 ㎎, 수율 77%)이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 31 화합물 42의 합성
화합물 19(9.8 ㎎, 5.4 μmol)를 상기 조작으로 13시간 반응시켰더니, 목적으로 하는 화합물 42(8.0 ㎎, 수율 88%)가 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 32 화합물 38의 합성
화합물 15(5.1 ㎎, 3.2 μmol)를 상기 조작으로 11시간 반응시켰더니, 목적으로 하는 화합물 38(4.0 ㎎, 수율 91%)이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 33 화합물 72의 합성
화합물 70(4.0 ㎎, 2.8 μmol)을 상기 조작으로 13시간 반응시켰더니, 목적으로 하는 화합물 72(2.9 ㎎, 수율 85%)가 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 34 화합물 43의 합성
화합물 20(5.4 ㎎, 3.3 μmol)을 상기 조작으로 11시간 반응시켰더니, 목적으로 하는 화합물 43(4.1 ㎎, 수율 87%)이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 35 화합물 73의 합성
화합물 71(4.0 ㎎, 2.8 μmol)을 상기 조작으로 13시간 반응시켰더니, 목적으로 하는 화합물 73(2.9 ㎎, 수율 85%)이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 36 화합물 39의 합성
화합물 16(2.2 ㎎, 1.5 μmol)을 상기 조작으로 7시간 반응시켰더니, 목적으로 하는 화합물 39(1.6 ㎎, 수율 84%)가 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 37 화합물 40의 합성
화합물 17(1.5 ㎎, 1.2 μmol)을 상기 조작으로 14시간 반응시켰더니, 목적으로 하는 화합물 40(1.1 ㎎, 수율 89%)이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 38 화합물 41의 합성
화합물 18(1.3 ㎎, 1.2 μmol)을 상기 조작으로 14시간 반응시켰더니, 목적으로 하는 화합물 41(0.8 ㎎, 수율 80%)이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 39 화합물 44의 합성
화합물 21(2.3 ㎎, 1.6 μmol)을 상기 조작으로 7시간 반응시켰더니, 목적으로 하는 화합물 44(1.6 ㎎, 수율 84%)가 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 40 화합물 45의 합성
화합물 22(1.6 ㎎, 1.3 μmol)를 상기 조작으로 14시간 반응시켰더니, 목적으로 하는 화합물 45(1.1 ㎎, 수율 85%)가 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 41 화합물 46의 합성
화합물 23(1.6 ㎎, 1.5 μmol)을 상기 조작으로 14시간 반응시켰더니, 목적으로 하는 화합물 46(1.1 ㎎, 6.4 μmol, 수율 85%)이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 42 화합물 34의 합성
화합물 11(12.4 ㎎, 7.5 μmol)을 상기 조작으로 11시간 반응시켰더니, 목적으로 하는 화합물 34(9.2 ㎎, 수율 86%)가 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 43 화합물 35의 합성
화합물 12(12.0 ㎎, 8.4 μmol)를 상기 조작으로 11시간 반응시켰더니, 목적으로 하는 화합물 35(7.0 ㎎, 수율 81%)가 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
참고예 44 화합물 36의 합성
화합물 13(8.4 μmol)을 상기 조작으로 11시간 반응시켰더니, 목적으로 하는 화합물 36이 얻어졌다.
참고예 45 화합물 76, 77의 합성 및 단리
화합물 2 및 화합물 6의 혼합물(5.0 ㎎, 2.2 μmol)을 220 μL의 물에 용해시키고, 22 mM의 탄산 세슘수용액을 100 μL 가하여 pH 7.0으로 하였다. 이 용액을 동결건조하였다. 건조 후의 고형물에 N,N-디메틸포름아미드를 430 μL 가하고, 추가로 6.6 μmol의 벤질브로마이드/N,N-디메틸포름아미드 용액을 20 μL 가하였다. 이 용액을 아르곤 분위기하에서 교반하였다. 48시간 후, TLC(전개용매는 1 M NH40Ac:이소프로판올=1:2를 사용하였다)로 원료의 소실을 확인한 후, 4.4 mL의 디에틸에테르를 가하여 화합물을 침전시켰다. 침전된 당사슬을 여과하여, 남은 당사슬을 물에 용해시켜 동결건조하였다. 동결건조 후의 잔류물을 분취(分取) HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250 ㎜, 전개용매는 50 mM 초산암모늄수용액:아세토니트릴=78:22, 유속 4.0 mL/분)로 정제한 바, 88분후에 화합물 77이, 91분후에 화합물 76이 용출되었다. 각각을 별도로 취하여 추가로 ODS 칼럼(코스모실 75C18-OPN, 15×100 ㎜, 처음에 H20를 50 mL 흘리고, 이어서 25% 아세토니트릴을 흘려 용출시켰다)으로 탈염한 바, 화합물 2의 벤질체가 1.6 ㎎, 화합물 6의 벤질체가 1.8 ㎎ 얻어졌다.
화합물 2의 벤질체(10당, 13.6 ㎎, 5.8 mmol)를 빙냉하에 NaOHaq.(pH=12) 1.4 ㎖에 용해시켰다. 반응을 HPLC로 모니터하면서 약 8시간 교반하였다. 반응의 진행이 종료된 시점에서, 반응액을 40 mM HCl로 pH=7.0으로 조정하였다. 중화 후의 액을, 멤브렌 필터(membrane filter)로 여과한 후, 농축, 이어서 HPLC(YMC- Pack ODS-AM, SH-343-5AM, 20×250 ㎜, AN/25 mM AcONH4 buffer=20/80, 7.0 ㎖/분., wave length;274 nm)로 분취·정제를 행하였다. 분취한 액을 농축 후, ODS 칼럼(코스모실 75C18-OPN, 나칼라이 테스크사제)으로 탈염처리를 행하고 농축, 동결건조를 행하였더니, 화합물 2의 순수 화합물(pure product)(6.2 ㎎, 47.4%)이 얻어졌다.
얻어진 화합물 2(4.0 ㎎, 1.76 mmol)에, DMSO 282 ㎖를 가하여 용해시켰다. 이 반응액에, 모르폴린 282 ㎖를 가하여 실온하에 교반을 행하였다. 반응을 TLC로 모니터하면서 약 1시간 반응을 행하였다. 원료가 소실된 것을 확인한 후, 반응액에 아세톤/디이소프로필에테르(IPE)=1/1의 용액 5 ㎖를 가한다. 이 슬러리를 멤브렌 필터로 여과를 행한 후, 잔사를 정제수로 용출시켰다. 수층을 농축 후, 겔 칼럼크로마토그래피(Sephadex G-25, H20)로 정제를 행하였다. 목적물이 포함되는 분획(fraction)을 모아 농축 후, 동결건조를 행하였더니, 목적으로 하는 모노시알로 당사슬 아스파라긴(화합물 76)(3.3 ㎎, 91.5% yield)이 얻어졌다. 화합물 76의 NMR 데이터를 이하에 나타낸다.
화합물 6의 벤질체(10당, 5.0 ㎎, 2.1 mmol)를 빙냉하에 NaOHaq.(pH=12) 2.0 ㎖에 용해시켰다. 반응을 HPLC로 모니터하면서 약 5시간 교반하였다. 반응의 진행이 종료된 시점에서 반응액을 40 mM HCl로 pH=7.0으로 조정하였다. 중화 후의 액을, 멤브렌 필터로 여과한 후, 농축, 이어서 HPLC(YMC- Pack ODS-AM, SH-343-5AM, 20×250 ㎜, AN/25 mM AcONH4 buffer=20/80, 7.0 ㎖/분., wave length;274 nm)로 분취·정제를 행하였다. 분취한 액을 농축 후, ODS 칼럼(코스모실 75C18-OPN, 나칼라이 테스크사제)으로 탈염처리를 행하고 농축, 동결건조를 행하였더니 화합물 6의 순수 화합물(2.5 ㎎, 52.0%)이 얻어졌다.
얻어진 화합물 6(1.5 ㎎, 0.67 mmol)에, DMSO 105 ㎖를 가하여 용해시켰다. 이 반응액에, 모르폴린 105 ㎖를 가하여 실온하에 교반을 행하였다. 반응을 TLC로 모니터하면서 약 1시간 반응을 행하였다. 원료가 소실된 것을 확인한 후, 반응액에 아세톤/디이소프로필에테르(IPE)=1/1의 용액 5 ㎖를 가하였다. 이 슬러리를 멤브렌 필터로 여과를 행한 후, 잔사를 정제수로 용출시켰다. 수층을 농축 후, 겔 칼럼크로마토그래피(Sephadex G-25, H20)로 정제를 행하였다. 목적물이 포함되는 분획을 모아 농축 후, 동결건조를 행하였더니, 목적으로 하는 모노시알로 당사슬 아스파라긴(화합물 77)(1.4 ㎎, 99% yield)이 얻어졌다.
화합물 77의 NMR 데이터를 이하에 나타낸다.
실시예 1
참고예 1에서 얻어진 화합물 24(6 ㎎, 2.58 mmol)를 물(300 mL)에 용해하고 중탄산 나트륨(2.1 ㎎, 24.9 mmol)을 가하였다. 여기에, D-(+)-비오티닐숙신이미드(4.2 ㎎, 12.3 mmol)를 용해시킨 디메틸포름아미드(300 mL)를 가하고, 실온에서 20분 반응시켰다. 원료 소실을 TLC(이소프로판올:1 M 초산암모늄수용액=3:2)로 확인 후, 이베포레이터를 사용하여 농축하였다. 잔사를 겔여과 칼럼(f20 ㎜×300 ㎜, Sephadex G-25, 물)으로 정제하여, 목적으로 하는 화합물(6.2 ㎎, 94%)을 얻었다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
실시예 2
참고예 45에서 얻어진 화합물 76을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 3
참고예 45에서 얻어진 화합물 77을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 4
참고예 7에서 얻어진 화합물 33을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 5
참고예 24에서 얻어진 화합물 26을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 6
참고예 25에서 얻어진 화합물 27을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 7
참고예 26에서 얻어진 화합물 28을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 8
참고예 27에서 얻어진 화합물 30을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 9
참고예 28에서 얻어진 화합물 31을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 10
참고예 29에서 얻어진 화합물 32를 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 11
참고예 30에서 얻어진 화합물 37을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 12
참고예 31에서 얻어진 화합물 42를 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 13
참고예 32에서 얻어진 화합물 38을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 14
참고예 33에서 얻어진 화합물 72를 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 15
참고예 34에서 얻어진 화합물 43을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 16
참고예 35에서 얻어진 화합물 73을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 17
참고예 36에서 얻어진 화합물 39를 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 18
참고예 37에서 얻어진 화합물 40을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 19
참고예 38에서 얻어진 화합물 41을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 20
참고예 39에서 얻어진 화합물 44를 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 21
참고예 40에서 얻어진 화합물 45를 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 22
참고예 41에서 얻어진 화합물 46을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 23
참고예 42에서 얻어진 화합물 34를 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 24
참고예 43에서 얻어진 화합물 35를 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 25
참고예 44에서 얻어진 화합물 36을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 26 Fmoc기로 아스파라긴의 아미노기 질소를 보호한 디시알로 α2,3 당사슬 아스파라긴(C1-1) 및 Fmoc기로 아스파라긴의 아미노기 질소를 보호한 2종류의 모노시알로 α2,3 당사슬 아스파라긴(C1-2 및 C1-3)의 합성
참고예 2에서 얻어진 Fmoc기로 아스파라긴의 아미노기 질소를 보호한 아시알로 당사슬 아스파라긴에 시알산 전이효소를 사용하여 CMP-시알산을 전이시켰다.
시알산 전이효소로서 α2,3 전이효소인 시판의 랫트 리콤비넌트 유래의 것을 사용하였다.
참고예 2에서 얻어진 아시알로 9당(20 ㎎, 10.1 μmol)을 50 mM 카코딜산(cacodylic acid) 완충액(pH=6.0, 5 ㎖)에 용해시킨 후, 소혈청 알부민(BSA, 5 ㎎)을 가한다. 여기에, CMP-시알산(26 ㎎, 40.4 μmol), 알칼리포스파타아제(Alkaline phosphatase)(5 ㎕, 125 unit)를 가하여 균일화한다. 마지막으로, α2,3-시알릴트랜스페라아제(α2,3-Sialyltransferase)(CALBIOCHEM사제, 100 ㎕)를 가하여 37℃에서 48시간 정치시킨다. HPLC로 반응을 모니터하면서 원료가 목적량까지 감소된 시점에서 반응을 종료시키고, 반응액을 멤브렌 필터로 여과한다. 여액을 농축하고 액량을 감소시킨 후, HPLC 분취 칼럼으로 정제한(YMC-Pack R&D ODS, D-ODS-5-A, 20×250 ㎜, AN/25 mM AcONH4 buffer=18/82, 7.5 ㎖/분., wave length;274 nm) 바, 25분후에 디시알로 11당 화합물(C1-1)이 각각 30분후, 34분후에 각 모노시알로 10당 화합물(C1-2) 및 (C1-3)이 용출되어졌다. 각각을 분취한 후, 탈염처리, 이어서 동결건조를 행하였더니, 각 화합물 1, 2, 3이 각각 0.7 ㎎(2.7%), 1.9 ㎎(8.3%), 3.5 ㎎(15.3%) 얻어졌다. 각 화합물의 NMR 데이터는 이하와 같다.
화합물(C1-1)
화합물(C1-2)
화합물(C1-3)
얻어진 (C-1)~(C-3)의 각 화합물을 참고예 7과 동일하게 처리하고 Fmoc기를 탈보호하여 당사슬 아스파라긴을 얻었다. 얻어진 당사슬 아스파라긴을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 27
실시예 26에서 얻어진 화합물(C1-2)(2 ㎎, 0.88 μmol)와 소혈청 알부민 1 ㎎을 HEPES 완충용액(50 mM, pH 5.0) 100 ㎕에 용해시키고, 추가로 β-갈락토시다아제(세이카가쿠고교사제, from Jack Beans, 5 μL, 100 mU)를 가하였다. 이 용액을 37℃에서 15시간 정치한 후, 멤브렌 필터로 여과를 행하였다. 여액을 HPLC(ODS 칼럼, 2.0 Ø×25 ㎝, 전개용매는 50 mM 초산암모늄수용액:아세토니트릴=82:18, 유속 7.5 ㎖/분)로 정제한 후, 용매를 농축, 이어서 동결건조를 행하였다. 잔류물을 물 200 ㎕에 용해시켜 ODS-칼럼크로마토그래피(코스모실 75C18-opn, 처음에 물로 세정을 행하고, 이어서 25% 아세토니트릴수용액으로 용출시킨다)를 사용하여 탈염처리를 행한 바, 목적으로 하는 화합물(C2)가 0.5 ㎍ 얻어졌다. NMR 데이터는 이하와 같다.
얻어진 (C2)의 화합물을 참고예 7과 동일하게 처리하고 Fmoc기를 탈보호하여 당사슬 아스파라긴을 얻었다. 얻어진 당사슬 아스파라긴을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 28
실시예 27에서 얻어진 화합물(C2)(1.8 ㎎, 0.86 μmol)를, 소혈청 알부민 1 ㎎과 함께 HEPES 완충용액(50 mM, pH 5.0) 90 ㎕에 용해시키고, 추가로 N-아세틸-β-글루코사미니다아제(시그마알드리치사제, from Jack Beans)를 4 ㎕(250 mU) 가하였다. 이 용액을 37℃에서 24시간 정치한 후, 멤브렌 필터로 여과를 행하였다. 여액을 HPLC(ODS 칼럼, 2.0 Ø×25 ㎝, 전개용매는 50 mM 초산암모늄수용액:아세토니트릴=82:18, 유속 7.5 ㎖/분)로 정제한 후, 용매를 농축, 이어서 동결건조를 행하였다. 잔류물을 물 200 ㎕에 용해시켜 ODS-칼럼크로마토그래피(코스모실 75C18-opn, 처음에 물로 세정을 행하고, 이어서 25% 아세토니트릴수용액으로 용출시킨다)를 사용하여 탈염처리를 행한 바, 목적으로 하는 화합물(C3)이 0.9 ㎍ 얻어졌다.
얻어진 (C3)의 화합물을 참고예 7과 동일하게 처리하고 Fmoc기를 탈보호하여 당사슬 아스파라긴을 얻었다. 얻어진 당사슬 아스파라긴을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 29
실시예 28에서 얻어진 화합물(C3)(0.8 ㎎, 0.42 μmol)과 소혈청 알부민 1 ㎎을 HEPES 완충용액(50 mM, pH 5.0) 50 ㎕에 용해시키고, α-만노시다아제(시그마알드리치사제, from Jack Beans)를 30 ㎕(2.9 U) 가하였다. 이 용액을 37℃에서 63시간 정치한 후, 멤브렌 필터로 여과를 행하였다. 여액을 HPLC(ODS 칼럼, 2.0 Ø×25 ㎝, 전개용매는 50 mM 초산암모늄수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 7.5 ㎖/분)로 정제한 후, 용매를 농축, 이어서 동결건조를 행하였다. 잔류물을 물 200 ㎕에 용해시켜 ODS-칼럼크로마토그래피(코스모실 75C18-opn, 처음에 물로 세정을 행하고, 이어서 25% 아세토니트릴수용액으로 용출시킨다)를 사용하여 탈염처리를 행한 바, 목적으로 하는 화합물(C4)가 0.6 ㎍ 얻어졌다.
얻어진 (C4)의 화합물을 참고예 7과 동일하게 처리하고 Fmoc기를 탈보호하여 당사슬 아스파라긴을 얻었다. 얻어진 당사슬 아스파라긴을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 30
실시예 26에서 얻어진 화합물(C1-3)(1 ㎎, 0.44 μmol)과 소혈청 알부민 1 ㎎을 HEPES 완충용액(50 mM, pH 5.0) 50 ㎕에 용해시키고, 추가로 β-갈락토시다아제(세이카가쿠고교사제, from Jack Beans, 5 μL, 100 mU)를 가하였다. 이 용액을 37℃에서 15시간 정치한 후, 멤브렌 필터로 여과를 행하였다. 여액을 HPLC(ODS 칼럼, 2.0 Ø×25 ㎝, 전개용매는 50 mM 초산암모늄수용액:아세토니트릴=82:18, 유속 7.5 ㎖/분)로 정제한 후, 용매를 농축, 이어서 동결건조를 행하였다. 잔류물을 물 200 ㎕에 용해시켜 ODS-칼럼크로마토그래피(코스모실 75C18-opn, 처음에 물로 세정을 행하고, 이어서 25% 아세토니트릴수용액으로 용출시킨다)를 사용하여 탈염처리를 행한 바, 목적으로 하는 화합물(C5)가 0.3 ㎍ 얻어졌다.
얻어진 (C5)의 화합물을 참고예 7과 동일하게 처리하고 Fmoc기를 탈보호하여 당사슬 아스파라긴을 얻었다. 얻어진 당사슬 아스파라긴을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 31
실시예 30에서 얻어진 화합물(C5)(1.0 ㎎, 0.48 μmol)를, 소혈청 알부민 1 ㎎과 함께 HEPES 완충용액(50 mM, pH 5.0) 50 ㎕에 용해시키고, 추가로 N-아세틸-β-글루코사미니다아제(시그마알드리치사제, from Jack Beans)를 4 ㎕(250 mU) 가하였다. 이 용액을 37℃에서 22시간 정치한 후, 멤브렌 필터로 여과를 행하였다. 여액을 HPLC(ODS 칼럼, 2.0 Ø×25 ㎝, 전개용매는 50 mM 초산암모늄수용액:아세토니트릴=82:18, 유속 7.5 ㎖/분)로 정제한 후, 용매를 농축, 이어서 동결건조를 행하였다. 잔류물을 물 200 ㎕에 용해시키고 ODS-칼럼크로마토그래피(코스모실 75C18-opn, 처음에 물로 세정을 행하고, 이어서 25% 아세토니트릴수용액으로 용출시킨다)를 사용하여 탈염처리를 행한 바, 목적으로 하는 화합물(C6)이 0.6 ㎍ 얻어졌다.
얻어진 (C6)의 화합물을 참고예 7과 동일하게 처리하고 Fmoc기를 탈보호하여 당사슬 아스파라긴을 얻었다. 얻어진 당사슬 아스파라긴을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 32
실시예 31에서 얻어진 화합물(C6)(1.0 ㎎, 0.53 μmol)과 소혈청 알부민 1 ㎎을 HEPES 완충용액(50 mM, pH 5.0) 50 ㎕에 용해시키고, α-만노시다아제(시그마알드리치사제, from Jack Beans)를 10 ㎕(0.9 U) 가하였다. 이 용액을 37℃에서 20시간 정치한 후, 멤브렌 필터로 여과를 행하였다. 여액을 HPLC(ODS 칼럼, 2.0 Ø×25 ㎝, 전개용매는 50 mM 초산암모늄수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 7.5 ㎖/분)로 정제한 후, 용매를 농축, 이어서 동결건조를 행하였다. 잔류물을 물 200 ㎕에 용해시켜 ODS-칼럼크로마토그래피(코스모실 75C18-opn, 처음에 물로 세정을 행하고, 이어서 25% 아세토니트릴수용액으로 용출시킨다)를 사용하여 탈염처리를 행한 바, 목적으로 하는 화합물(C7)이 0.5 ㎍ 얻어졌다.
얻어진 (C7)의 화합물을 참고예 7과 동일하게 처리하고 Fmoc기를 탈보호하여 당사슬 아스파라긴을 얻었다. 얻어진 당사슬 아스파라긴을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 33
Fmoc기로 아스파라긴의 아미노기 질소를 보호한 디시알로(α2,6)(α2,3) 당사슬 아스파라긴의 합성
참고예 45에서 얻어진 Fmoc기로 아스파라긴의 아미노기 질소를 보호한 모노 아시알로 당사슬 아스파라긴(화합물 2)에 시알산 전이효소를 사용하여 CMP-시알산을 전이시켰다.
시알산 전이효소로서 α2,3 전이효소인 시판의 랫트 리콤비넌트 유래의 것을 사용하였다.
참고예 45에서 얻어진 화합물 2(1.7 ㎎, 0.75 μmol)를 50 mM 카코딜산 완충액(pH=5.0, 85 ㎕)에 용해시킨 후, 소혈청 알부민(BSA, 1 ㎎)을 가한다. 여기에, CMP-시알산(4.8 ㎎, 7.5 μmol), 알칼리포스파타아제(Alkaline phosphatase)(1 ㎕, 75 unit)를 가하여 균일화한다. 마지막으로 α2,3-시알릴트랜스페라아제(α2,3-Sialyltransferase)(CALBIOCHEM사제, 75 ㎕, 34 mU)를 가하여 37℃에서 3.5시간 정치시킨다. HPLC로 반응을 모니터하면서 원료가 소실된 시점에서 반응을 종료시키고, 반응액을 멤브렌 필터로 여과한다. 여액을 농축하여 액량을 감소시킨 후, HPLC 분취 칼럼으로 정제한(YMC-Pack R&D ODS, D-ODS-5-A, 20×250 ㎜, AN/25 mM AcONH4 buffer=18/82, 7.5 ㎖/분., wave length;274 nm) 바, 25분후에 화합물(C7A)가 용출되어졌다. 분취한 후, 탈염처리, 이어서 동결건조를 행하였더니, 화합물(C7A)가 1.3 ㎎(67.8%) 얻어졌다. 화합물의 NMR 데이터는 이하와 같다.
얻어진 (C7A)의 화합물을 참고예 7과 동일하게 처리하고 Fmoc기를 탈보호하여 당사슬 아스파라긴을 얻었다. 얻어진 당사슬 아스파라긴을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 34
Fmoc기로 아스파라긴의 아미노기 질소를 보호한 디시알로(α2,3)(α2,6) 당사슬 아스파라긴의 합성
참고예 45에서 얻어진 Fmoc기로 아스파라긴의 아미노기 질소를 보호한 모노시알로 당사슬 아스파라긴(화합물 6)에 시알산 전이효소를 사용하여 CMP-시알산을 전이시켰다.
시알산 전이효소로서 α2,3 전이효소인 시판의 랫트 리콤비넌트 유래의 것을 사용하였다.
참고예 45에서 얻어진 화합물 6(1.2 ㎎, 0.53 μmol)을 50 mM 카코딜산 완충액(pH=5.0, 60 ㎕)에 용해시킨 후, 소혈청 알부민(BSA, 1 ㎎)을 가하였다. 여기에, CMP-시알산(3.4 ㎎, 5.3 μmol), 알칼리포스파타아제(Alkaline phosphatase)(1 ㎕, 75 unit)를 가하여 균일화한다. 마지막으로 α2,3-시알릴트랜스페라아제(α2,3-Sialyltransferase)(CALBIOCHEM사제, 52.9 ㎕, 24 mU)를 가하여 37℃에서 3시간 정치시킨다. HPLC로 반응을 모니터하면서 원료가 소실된 시점에서 반응을 종료시키고, 반응액을 멤브렌 필터로 여과한다. 여액을 농축하여 액량을 감소시킨 후, HPLC 분취 칼럼으로 정제한(YMC-Pack R&D ODS, D-ODS-5-A, 20×250 ㎜, AN/25 mM AcONH4 buffer=18/82, 7.5 ㎖/분., wave length;274 nm) 바, 23분후에 화합물(C7B)가 용출되어졌다. 분취한 후, 탈염처리, 이어서 동결건조를 행하였더니, 화합물(C7B)가 1.1 ㎎(81.2%) 얻어졌다. 화합물의 NMR 데이터는 이하와 같다.
얻어진 (C7B)의 화합물을 참고예 7과 동일하게 처리하고 Fmoc기를 탈보호하여 당사슬 아스파라긴을 얻었다. 얻어진 당사슬 아스파라긴을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다.
실시예 35~52
참고예 2, 8~10, 12, 14, 17, 45, 실시예 26~32에서 제조한 각 Fmoc-당사슬 아스파라긴 2 nmol을, 트리스 염산 완충액 약 10 ㎖에 용해시켰다. 이것에 GDP-푸코오스 200 nmol, 푸코오실트랜스페라아제 V(Fucosyltransferase V)(Human, Recombinant) 0.5 mU를 가하고 37℃에서 약 2시간 정치, 반응시켰다. 반응액을 초순수(ultrapure water) 20 ㎖로 희석한 후, 캐필러리 전기영동(fused silica capillary, 50 ㎜ i. d., 60 ㎝, buffer;100 mM Tris-borate, pH=8.3, 100 mM Heptane sulfonate, 인가전압 2.7 ㎸, 온도 25℃, 214 ㎜)으로 분리를 행하여 푸코오스를 포함하는 당사슬 아스파라긴 유도체를 얻었다. 얻어진 상기 당사슬 아스파라긴 유도체를 참고예 7과 동일하게 처리하고 Fmoc기를 탈보호하여 당사슬 아스파라긴을 얻었다. 얻어진 당사슬 아스파라긴을 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 비오틴화를 행하였다. 얻어진 비오틴화 당사슬 아스파라긴을 이하에 나타낸다.
실시예 35
실시예 36
실시예 37
실시예 38
실시예 39
실시예 40
실시예 41
실시예 42
실시예 43
실시예 44
실시예 45
실시예 46
실시예 47
실시예 48
실시예 49
실시예 50
실시예 51
실시예 52
실시예 53
디시알로 당사슬 아스파라긴(화합물 24)(11당, 1.4 ㎎, 0.60 mmol)을, 정제수 70 ㎖에 용해시켰다. 이것에 아세톤 70 ㎖, NaHCO3(0.76 ㎎, 9 mmol)을 가하여 실온하에서 교반한 후, 플루오레세인이소티오시아네이트(Fluorescein isothiocyanate)(FITC, 0.95 ㎎, 2.4 mmol, Aldrich사제)를 가하고 약 2시간 교반하였다. 2시간 후, TLC로 반응 종료를 확인한 후, 아세톤을 감압하에 증류 제거시키고, 남은 수용액을 겔 칼럼크로마토그래피(Sephadex G-25, H2O)로 정제하여 목적물이 포함되는 분획을 모았다. 모은 분획을 농축 후, HPLC(YMC- Pack ODS=AM, SH-343-5AM, 20×250 ㎜, AN/25 mM AcONH4 buffer=10/90, 7.5 ㎖/분., wave length;274 nm)로 분취한 후, 겔 칼럼크로마토그래피(Sephadex G-25, H2O)로 탈염처리를 행하였다. 목적물이 포함되는 분획을 모아 농축 후, 동결건조를 행하였더니 목적으로 하는 FITC화된 디시알로 당사슬 유도체(1.2 ㎎, 73.5% yield)가 얻어졌다.
실시예 54
화합물 24 대신에, 화합물 76을 사용하여 실시예 53과 동일하게 하여 FITC화를 행하였다.
실시예 55
화합물 24 대신에, 화합물 77을 사용하여 실시예 53과 동일하게 하여 FITC화를 행하였다.
실시예 56
화합물 24 대신에, 화합물 33을 사용하여 실시예 53과 동일하게 하여 FITC화를 행하였다.
얻어진 FITC화 당사슬 아스파라긴의 NMR 데이터를 이하에 나타낸다.
실시예 57
화합물 24 대신에, 화합물 26을 사용하여 실시예 53과 동일하게 하여 FITC화를 행하였다.
실시예 58
화합물 24 대신에, 화합물 27을 사용하여 실시예 53과 동일하게 하여 FITC화를 행하였다.
실시예 59
화합물 24 대신에, 화합물 28을 사용하여 실시예 53과 동일하게 하여 FITC화를 행하였다.
실시예 60
화합물 24 대신에, 화합물 30을 사용하여 실시예 53과 동일하게 하여 FITC화를 행하였다.
실시예 61
화합물 24 대신에, 화합물 31을 사용하여 실시예 53과 동일하게 하여 FITC화를 행하였다.
실시예 62
화합물 24 대신에, 화합물 32를 사용하여 실시예 53과 동일하게 하여 FITC화를 행하였다.
실시예 63
화합물 24 대신에, 화합물 37을 사용하여 실시예 53과 동일하게 하여 FITC화를 행하였다.
실시예 64
화합물 24 대신에, 화합물 42를 사용하여 실시예 53과 동일하게 하여 FITC화를 행하였다.
실시예 65
화합물 24 대신에, 화합물 38을 사용하여 실시예 53과 동일하게 하여 FITC화를 행하였다.
실시예 66
화합물 24 대신에, 화합물 72를 사용하여 실시예 53과 동일하게 하여 FITC화를 행하였다.
실시예 67
화합물 24 대신에, 화합물 43을 사용하여 실시예 53과 동일하게 하여 FITC화를 행하였다.
실시예 68
화합물 24 대신에, 화합물 73을 사용하여 실시예 53과 동일하게 하여 FITC화를 행하였다.
실시예 69
화합물 24 대신에, 화합물 39를 사용하여 실시예 53과 동일하게 하여 FITC화를 행하였다.
실시예 70
화합물 24 대신에, 화합물 40을 사용하여 실시예 53과 동일하게 하여 FITC화를 행하였다.
실시예 71
화합물 24 대신에, 화합물 41을 사용하여 실시예 53과 동일하게 하여 FITC화를 행하였다.
실시예 72
화합물 24 대신에, 화합물 44를 사용하여 실시예 53과 동일하게 하여 FITC화를 행하였다.
실시예 73
화합물 24 대신에, 화합물 45를 사용하여 실시예 53과 동일하게 하여 FITC화를 행하였다.
실시예 74
화합물 24 대신에, 화합물 46을 사용하여 실시예 53과 동일하게 하여 FITC화를 행하였다.
실시예 75
화합물 24 대신에, 화합물 34를 사용하여 실시예 53과 동일하게 하여 FITC화를 행하였다.
실시예 76
화합물 24 대신에, 화합물 35를 사용하여 실시예 53과 동일하게 하여 FITC화를 행하였다.
실시예 77
화합물 24 대신에, 화합물 36을 사용하여 실시예 53과 동일하게 하여 FITC화를 행하였다.
실시예 78
실시예 26에서 얻어진 (C-1)~(C-3)의 각 화합물을 참고예 7과 동일하게 처리하고 Fmoc기를 탈보호하여 당사슬 아스파라긴을 얻었다. 얻어진 당사슬 아스파라긴을 사용한 것 이외에는 실시예 53과 동일하게 FITC화를 행하였다.
실시예 79
실시예 27에서 얻어진 (C2)의 각 화합물을 참고예 7과 동일하게 처리하고 Fmoc기를 탈보호하여 당사슬 아스파라긴을 얻었다. 얻어진 당사슬 아스파라긴을 사용한 것 이외에는 실시예 53과 동일하게 FITC화를 행하였다.
실시예 80
실시예 28에서 얻어진 (C3)의 각 화합물을 참고예 7과 동일하게 처리하고 Fmoc기를 탈보호하여 당사슬 아스파라긴을 얻었다. 얻어진 당사슬 아스파라긴을 사용한 것 이외에는 실시예 53과 동일하게 FITC화를 행하였다.
실시예 81
실시예 29에서 얻어진 (C4)의 각 화합물을 참고예 7과 동일하게 처리하고 Fmoc기를 탈보호하여 당사슬 아스파라긴을 얻었다. 얻어진 당사슬 아스파라긴을 사용한 것 이외에는 실시예 53과 동일하게 FITC화를 행하였다.
실시예 82
실시예 30에서 얻어진 (C5)의 각 화합물을 참고예 7과 동일하게 처리하고 Fmoc기를 탈보호하여 당사슬 아스파라긴을 얻었다. 얻어진 당사슬 아스파라긴을 사용한 것 이외에는 실시예 53과 동일하게 FITC화를 행하였다.
실시예 83
실시예 31에서 얻어진 (C6)의 각 화합물을 참고예 7과 동일하게 처리하고 Fmoc기를 탈보호하여 당사슬 아스파라긴을 얻었다. 얻어진 당사슬 아스파라긴을 사용한 것 이외에는 실시예 53과 동일하게 FITC화를 행하였다.
실시예 84
실시예 32에서 얻어진 (C7)의 각 화합물을 참고예 7과 동일하게 처리하고 Fmoc기를 탈보호하여 당사슬 아스파라긴을 얻었다. 얻어진 당사슬 아스파라긴을 사용한 것 이외에는 실시예 53과 동일하게 FITC화를 행하였다.
실시예 85
실시예 33에서 얻어진 (C7A)의 각 화합물을 참고예 7과 동일하게 처리하고 Fmoc기를 탈보호하여 당사슬 아스파라긴을 얻었다. 얻어진 당사슬 아스파라긴을 사용한 것 이외에는 실시예 53과 동일하게 FITC화를 행하였다.
실시예 86
실시예 34에서 얻어진 (C7B)의 각 화합물을 참고예 7과 동일하게 처리하고 Fmoc기를 탈보호하여 당사슬 아스파라긴을 얻었다. 얻어진 당사슬 아스파라긴을 사용한 것 이외에는 실시예 53과 동일하게 FITC화를 행하였다.
실시예 87~104
실시예 35~52에서 얻어진 푸코오스를 포함하는 당사슬 아스파라긴 유도체를 사용하여 실시예 53과 동일하게 FITC화를 행하였다.
실시예 87
실시예 88
실시예 89
실시예 90
실시예 91
실시예 92
실시예 93
실시예 94
실시예 95
실시예 96
실시예 97
실시예 98
실시예 99
실시예 100
실시예 101
실시예 102
실시예 103
실시예 104
실시예 105 (마이크로플레이트의 제조)
96웰 BD 바이오코트 스트렙트아비딘(BioCoat Streptavidin)(BD 바이오사이언스사제:바이오어세이(bioassay)용, 결합능:5 ng/1웰)에, 실시예 1의 비오틴화 당사슬 아스파라긴 100 ㎍(비오틴 결합능 약 10배 상당량)을 증류수에 용해하여 1000 μl가 되도록 하였다. 이 조정용액을 1웰당 10 μl가 되도록 각 웰에 가하고, 증류수로 3회 세정하여 마이크로플레이트를 제조하였다. 각 비오틴화 당사슬 아스파라긴의 결합 수율은 95% 이상이었다. 고정화율의 확인은, 씻겨나간 비고정화 당사슬 잔량으로부터 산출하였다.
실시예 106 (어피니티 칼럼의 제조)
아비딘코트 비드(Avidin-caoted beads)(히타치소프트웨어 엔지니어링사제, xMAP LumAvidin Development Microspheres 1 ㎖) 10 ㎖와 실시예 1의 비오틴화 당사슬 아스파라긴 30 ㎎을 슬러리 상태에서 교반하고, 비드를 여과, 세정하였다. 세정은 비드 체적의 2배량의 증류수를 사용하여, 3회 여과지(filter paper) 위에서 세정하였다. 고정화의 확인은, 세정 회수된 비오틴화 당사슬 아스파라긴의 잔량에 의해 확인하였다. 이어서 상기 비오틴화 당사슬 아스파라긴 고정 비드 10 ㎖를 30 ㎖의 증류수에서 슬러리 상태 그대로 유리제의 오픈 크로마토 칼럼(Ø 20 ㎜, 길이 300 ㎜)으로 충전하여, 어피니티 칼럼을 제조하였다.
본 발명에 의하면, 아스파라긴의 아미노기 질소를 비오틴화 또는 FITC화한 당사슬 아스파라긴이 얻어진다.
더욱이 본 발명에 의하면, 비오틴·아비딘의 결합 특이성을 이용하여, 비오틴화한 복수의 당사슬을 아비딘화된 마이크로플레이트 위에서 반응시키는 것만으로 간단하게 당사슬 마이크로칩을 제조할 수 있다. 이것에 의해, 특정 당사슬과 결합능을 갖는 단백질을 해명할 수 있다.
또한, 어떤 특정 단백질을 분리 정제할 목적으로, 아비딘화한 어피니티 칼럼에 특정 비오틴화한 당사슬을 결합하여 고정화하고, 거기에 비오틴화한 당사슬과 특이적 결합능을 갖는 단백질을 포함하는 혼합물을 통과시킴으로써 목적으로 하는 단백질만을 단리할 수 있다.
더욱이 본 발명에서 얻어진 FITC화 당사슬 아스파라긴은, 예를 들면 생체조직 중의 당사슬 수용체의 연구, 렉틴의 당결합 특이성의 연구에 유용하다.

Claims (14)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 11~3당을 갖는 당사슬 아스파라긴 유도체.
    [화학식 1]
    [화학식 중, R1 및 R2는 수소원자, 화학식 2~6으로 나타내어지는 기이고, 동일해도 상이해도 된다. Q는 비오틴기 또는 FITC기를 나타낸다.]
    [화학식 2]
    [화학식 3]
    [화학식 4]
    [화학식 5]
    [화학식 6]
  2. 화학식 1에 있어서, R1 및 R2의 한쪽은 반드시 화학식 2 또는 화학식 3으로 나타내어지는 기인 11~7당을 갖는 (α2,3) 또는 (α2,6) 당사슬 아스파라긴 유도체.
  3. 화학식 1에 있어서, R1은 화학식 2로 나타내어지는 기이고, R2는 화학식 3으로 나타내어지는 기인 11당을 갖는 (α2,3) (α2,6) 당사슬 아스파라긴 유도체.
  4. 화학식 1에 있어서, R1은 화학식 3으로 나타내어지는 기이고, R2는 화학식 2로 나타내어지는 기인 11당을 갖는 (α2,3) (α2,6) 당사슬 아스파라긴 유도체.
  5. 비오틴기 또는 FITC기로 아스파라긴의 아미노기 질소가 수식된 당사슬 아스파라긴의 비환원말단측 N-아세틸글루코사민에 적어도 1개 이상의 푸코오스를 포함하는 당사슬 아스파라긴 유도체.
  6. 제5항에 있어서, 비오틴기 또는 FITC기로 아스파라긴의 아미노기 질소가 수식된 당사슬 아스파라긴이, 화학식 1로 표시되는 11~3당을 갖는 당사슬 아스파라긴 유도체인 푸코오스를 포함하는 당사슬 아스파라긴 유도체.
  7. 제5항에 있어서, 비오틴기 또는 FITC기로 아스파라긴의 아미노기 질소가 수식된 당사슬 아스파라긴이, 제3항의 11당을 갖는 (α2,3) (α2,6) 당사슬 아스파라긴 유도체인 푸코오스를 포함하는 당사슬 아스파라긴 유도체.
  8. 제5항에 있어서, 비오틴기 또는 FITC기로 아스파라긴의 아미노기 질소가 수식된 당사슬 아스파라긴이, 제4항의 11당을 갖는 (α2,3) (α2,6) 당사슬 아스파라긴 유도체인 푸코오스를 포함하는 당사슬 아스파라긴 유도체.
  9. 제5항에 있어서, 비오틴기 또는 FITC기로 아스파라긴의 아미노기 질소가 수식된 당사슬 아스파라긴이, 화학식 1에 있어서 R1 및 R2는 수소원자, 화학식 2로 나타내어지는 기, 또는 화학식 4~6으로 나타내어지는 기이고, R1 및 R2의 한쪽은 반드시 화학식 2 또는 화학식 4로 나타내어지는 기인, 11~6당을 갖는 α2,3 당사슬 아스파라긴 유도체인 푸코오스를 포함하는 당사슬 아스파라긴 유도체.
  10. 제5항에 있어서, 비오틴기 또는 FITC기로 아스파라긴의 아미노기 질소가 수식된 당사슬 아스파라긴이, 화학식 1에 있어서 R1 및 R2는 수소원자, 화학식 3으로 나타내어지는 기, 또는 화학식 4~6으로 나타내어지는 기이고, R1 및 R2의 한쪽은 반드시 화학식 3 또는 화학식 4로 나타내어지는 기인, 11~6당을 갖는 α2,6 당사슬 아스파라긴 유도체인 푸코오스를 포함하는 당사슬 아스파라긴 유도체.
  11. 화학식 7로 표시되는 11~3당을 갖는 당사슬 아스파라긴을 비오틴화하는 것을 특징으로 하는 비오틴화 당사슬 아스파라긴의 제조방법.
    [화학식 7]
    [화학식 중, R1 및 R2는 상기와 동일하다.]
  12. 화학식 7로 표시되는 11~3당을 갖는 당사슬 아스파라긴을 플루오레세인이소티오시아네이트(FITC)화하는 것을 특징으로 하는 FITC화 당사슬 아스파라긴의 제조방법.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비오틴화 당사슬 아스파라긴을 결합시킨 마이크로플레이트.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비오틴화 당사슬 아스파라긴을 결합시킨 어피니티 칼럼.
KR1020057009856A 2002-12-26 2003-12-25 당사슬 아스파라긴 유도체 및 그의 제조방법 KR100876518B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2002-00377819 2002-12-26
JP2002377819 2002-12-26
PCT/JP2003/016682 WO2004058789A1 (ja) 2002-12-26 2003-12-25 糖鎖アスパラギン誘導体およびその製造方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20050084071A true KR20050084071A (ko) 2005-08-26
KR100876518B1 KR100876518B1 (ko) 2008-12-31

Family

ID=32677407

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020057009856A KR100876518B1 (ko) 2002-12-26 2003-12-25 당사슬 아스파라긴 유도체 및 그의 제조방법

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20060166929A1 (ko)
EP (1) EP1577316A4 (ko)
JP (1) JP4495598B2 (ko)
KR (1) KR100876518B1 (ko)
CN (1) CN1723213A (ko)
AU (1) AU2003292792A1 (ko)
CA (1) CA2511205C (ko)
TW (1) TWI318984B (ko)
WO (1) WO2004058789A1 (ko)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI466897B (zh) * 2005-07-19 2015-01-01 Glytech Inc 癌細胞之檢測方法、糖鏈之構造解析方法，以及糖鏈衍生物
JP2007297429A (ja) * 2006-04-27 2007-11-15 Institute Of Physical & Chemical Research 糖鎖ライブラリの作製方法及びその利用
US20080053516A1 (en) * 2006-08-30 2008-03-06 Richard Allen Hayes Solar cell modules comprising poly(allyl amine) and poly (vinyl amine)-primed polyester films
GB0721935D0 (en) * 2007-11-08 2007-12-19 Glycom As New Carbohydrate derivatives
US8722616B2 (en) 2009-10-22 2014-05-13 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Anti-HIV peptides and methods of use thereof
US10358470B2 (en) 2011-10-01 2019-07-23 Glytech, Inc. Glycosylated polypeptide and pharmaceutical composition containing same
US10723764B2 (en) 2011-11-21 2020-07-28 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Anti-microbial peptides and methods of use thereof
WO2013078217A2 (en) 2011-11-21 2013-05-30 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Anti-microbial peptides and methods of use thereof
WO2014084110A1 (ja) 2012-11-30 2014-06-05 株式会社糖鎖工学研究所 糖鎖付加リンカー、糖鎖付加リンカーと生理活性物質とを含む化合物またはその塩、及びそれらの製造方法
WO2014177771A1 (en) * 2013-05-02 2014-11-06 Glykos Finland Oy Conjugates of a glycoprotein or a glycan with a toxic payload
WO2016001485A1 (en) 2014-06-30 2016-01-07 Glykos Finland Oy Saccharide derivative of a toxic payload and antibody conjugates thereof
TW201806625A (zh) 2016-03-30 2018-03-01 康瓦鐵克科技股份有限公司 經修飾之傷口敷料

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07224082A (ja) * 1994-02-14 1995-08-22 Rikagaku Kenkyusho アスパラギン結合型糖誘導体及びその製法
WO2003008431A1 (fr) * 2001-06-19 2003-01-30 Otsuka Chemical Co.,Ltd. Methode de production d'un derive d'asparagine de chaines des sucres

Also Published As

Publication number Publication date
TW200413408A (en) 2004-08-01
CN1723213A (zh) 2006-01-18
KR100876518B1 (ko) 2008-12-31
WO2004058789A9 (ja) 2005-11-17
US20060166929A1 (en) 2006-07-27
JP4495598B2 (ja) 2010-07-07
EP1577316A1 (en) 2005-09-21
EP1577316A4 (en) 2008-04-16
CA2511205C (en) 2009-07-14
JPWO2004058789A1 (ja) 2006-04-27
CA2511205A1 (en) 2004-07-15
WO2004058789A1 (ja) 2004-07-15
TWI318984B (en) 2010-01-01
AU2003292792A1 (en) 2004-07-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5345118B2 (ja) ３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体、該糖鎖アスパラギン、該糖鎖およびそれらの製造方法
KR100736510B1 (ko) 당사슬 아스파라긴 유도체, 당사슬 아스파라긴, 당사슬 및그들의 제조법
KR100775805B1 (ko) 당쇄 아스파라긴 유도체의 제조 방법
KR100876518B1 (ko) 당사슬 아스파라긴 유도체 및 그의 제조방법
EP1591532B1 (en) Process for producing sugar chain asparagine derivative
JP2006022191A (ja) ３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体、該糖鎖アスパラギン、該糖鎖およびそれらの製造方法
JPH10248590A (ja) グリコシルアスパラギン誘導体の製造法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20121011

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20131010

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20141110

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151109

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161024

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171127

Year of fee payment: 10

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181017

Year of fee payment: 11