CN1723213A - 糖链天冬酰胺衍生物及其制造方法 - Google Patents

糖链天冬酰胺衍生物及其制造方法 Download PDF

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Abstract

右式(1)表示的含有11～3糖的糖链天冬酰胺衍生物〔式中，R1和R2是氢原子、说明书所述式(2)～(6)表示的基团，可以相同，也可以不同。Q表示生物素基或FITC基。〕、在天冬酰胺的氨基氮被生物素基或FITC基修饰的糖链天冬酰胺的非还原末端侧的N－乙酰葡糖胺上至少含有一个以上岩藻糖的糖链天冬酰胺衍生物、使生物素化糖链天冬酰胺结合的微型板、以及使生物素化糖链天冬酰胺结合的亲和柱。

Description

糖链天冬酰胺衍生物及其制造方法
技术领域
本发明涉及生物素化糖链天冬酰胺、异硫氰酸荧光素(FITC)化糖链天冬酰胺、它们的制造方法及其用途。
背景技术
近年来，作为继核酸(DNA)、蛋白质之后的第三个链状生命分子，糖链分子引人注目。人体是由约60兆个细胞构成的一大细胞社会，所有的细胞表面都被糖链分子覆盖。例如，ABO式血型就是由细胞表面糖链的不同决定的。
糖链具有参与细胞间识别和相互作用的功能，成为构成细胞社会的要素。细胞社会的紊乱与癌、慢性疾病、感染病、老化等有关。
例如，已知细胞如果癌化，就会引起糖链的结构变化。另外也知道霍乱弧菌或流感病毒等通过识别、结合某一特定糖链，侵入、感染细胞。
糖链由于单糖的序列、结合样式以及部位、链长度以及分支样式、整体的高次结构等的多样性，所以与核酸或蛋白质的结构相比，是非常复杂的结构。因此，来自其结构的生物学信息与核酸和蛋白质相比，多种多样。现状是虽然人们认识到糖链研究的重要性，但由于其结构复杂和多样性，与核酸和蛋白质相比，研究进展缓慢。
象上述那样，通过阐明某一特定的糖链与蛋白质是否具有识别、结合能力，预期会带动依据新的原理的医药品和食品的开发等，对疾病的予防、治疗有贡献等广泛的应用。
因此，利用生物素·抗生物素蛋白的结合特异性，仅通过使生物素化的许多糖链在被抗生物素蛋白化的微型板上反应就可以简单地制造糖链微芯片(マイクロチツプ)。通过该微芯片可以阐明具有与特定糖链结合能力的蛋白质。
另外，以对某一特定的蛋白质进行分离纯化为目的，可以通过将特定的生物素化的糖链结合、固定于抗生物素蛋白化的亲和柱，使含有与生物素化的糖链具有特异结合能力的蛋白质的混合物通过上述柱子，可以只分离目的蛋白质。
此外，FITC化的糖链天冬酰胺通过毛细管电泳法等即使是微量也可以进行分离。另外也可以从FITC化糖链天冬酰胺将FITC除去，分离糖链天冬酰胺本身。
本发明的课题在于提供对天冬酰胺的氨基氮进行了生物素化或FITC化的糖链天冬酰胺、它的制造方法及其用途。
发明内容
本发明涉及到以下发明。
1.下述式(1)所示的含有11～3糖的糖链天冬酰胺衍生物。
[式中、R1和R2是氢原子、式(2)～(6)表示的基团，可以相同，也可以不同。Q表示生物素基或FITC基。]
Figure A20038010531700062
Figure A20038010531700072
Figure A20038010531700073
Figure A20038010531700074
2.糖链天冬酰胺衍生物，其中，在天冬酰胺的氨基氮被生物素基或FITC基改性的糖链天冬酰胺的非还原末端侧的N-乙酰葡糖胺上至少含有一个以上的岩藻糖。
3.生物素化糖链天冬酰胺的制造方法，其特征在于：对式(9)所示的含有11～3糖的糖链天冬酰胺进行生物素化。
Figure A20038010531700081
[式中，R1和R2如上所述。]
4.FITC化糖链天冬酰胺的制造方法，其特征在于：对式(9)所示的含有11～3糖的糖链天冬酰胺进行异硫氰酸荧光素(FITC)化。
5.使上述上述生物素化糖链天冬酰胺结合的微型板(マイクロプレ-ト)。
6.使上述生物素化糖链天冬酰胺结合的亲和柱。
本发明人在先前申请的特原2001-185685号(以下称为在先申请)中开发了与以往相比可以非常容易而且大量地获得各种分离的糖链天冬酰胺衍生物的糖链天冬酰胺衍生物、糖链天冬酰胺、糖链的制造方法，以及结合了任意缺失糖残基的糖链的新的糖链天冬酰胺衍生物、糖链天冬酰胺、糖链。
该先前申请的方法，涉及例如：
(1)包括以下工序的来自糖链天冬酰胺的糖链天冬酰胺衍生物的制造方法：
(a)将脂溶性保护基导入到在含有1种或2种以上糖链天冬酰胺的混合物中所含有的该糖链天冬酰胺中，获得糖链天冬酰胺衍生物混合物的工序，以及
(b)将该糖链天冬酰胺衍生物混合物或该糖链天冬酰胺衍生物混合物含有的糖链天冬酰胺衍生物水解，将得到的混合物供给色谱，对各糖链天冬酰胺衍生物进行分离的工序。
(2)上述(1)所述的糖链天冬酰胺衍生物的制造方法，其还包括(b’)用糖水解酶对工序(b)中分离的糖链天冬酰胺衍生物进行水解的工序。
(3)上述(1)或(2)所述的糖链天冬酰胺衍生物的制造方法，其中，含有1种或2种以上糖链天冬酰胺的混合物是含有下述式(A)的化合物和/或在该化合物中缺失1个以上糖残基的化合物的混合物。
(4)上述(1)～(3)任一项所述的糖链天冬酰胺衍生物的制造方法，其中，脂溶性保护基是芴甲氧羰(Fmoc)基。
(5)上述(1)～(3)任一项所述的糖链天冬酰胺衍生物的制造方法，其中，工序(a)是向含有在非还原末端带有唾液酸残基的1种或2种以上糖链天冬酰胺的混合物中所含的该糖链天冬酰胺导入Fmoc基，并且向唾液酸残基导入苄基从而得到糖链天冬酰胺衍生物混合物的工序。
(6)包括以下工序的糖链天冬酰胺的制造方法：
(a)将脂溶性保护基导入到含有1种或2种以上的糖链天冬酰胺的混合物所含的该糖链天冬酰胺中，获得糖链天冬酰胺衍生物混合物的工序，
(b)将该糖链天冬酰胺衍生物混合物或该糖链天冬酰胺衍生物混合物含有的糖链天冬酰胺衍生物水解后得到的混合物供给色谱，对各糖链天冬酰胺衍生物进行分离的工序，以及
(c)除去工序(b)中分离的糖链天冬酰胺衍生物的保护基，得到糖链天冬酰胺的工序。
(7)上述(6)所述的糖链天冬酰胺的制造方法，其还包括：
(b’)用糖水解酶对在工序(b)中分离的糖链天冬酰胺衍生物进行水解的工序，和/或
(c’)用糖水解酶对在工序(c)中得到的糖链天冬酰胺进行水解的工序。
(8)上述(6)或(7)所述的糖链天冬酰胺的制造方法，其中，含有1种或2种以上糖链天冬酰胺的混合物是含有下述式(A)的化合物和/或在该化合物中缺失1个以上糖残基的化合物的混合物。
(9)上述(6)～(8)任一项所述的糖链天冬酰胺的制造方法，其中，脂溶性保护基是Fmoc基。
(10)上述(6)～(8)任一项所述的糖链天冬酰胺的制造方法，其中，工序(a)是向含有在非还原末端带有唾液酸残基的1种或2种以上糖链天冬酰胺的混合物中所含的该糖链天冬酰胺中导入Fmoc基，并且向唾液酸残基导入苄基，得到糖链天冬酰胺衍生物混合物的工序。
有关这些糖链天冬酰胺衍生物以及糖链天冬酰胺的制造的详细描述由于在上述先前申请中已叙述，所以引用该申请。如果讲到若干先前申请的内容，先前申请的糖链天冬酰胺衍生物制造方法的一大特征是例如向从来自天然糖蛋白质的糖链天冬酰胺、优选是天冬酰胺结合型糖链得到的糖链天冬酰胺的混合物中含有的该糖链天冬酰胺中导入(结合)脂溶性保护基，得到糖链天冬酰胺衍生物的混合物，然后将该混合物分离为各糖链天冬酰胺衍生物。在本说明书中，所谓“糖链天冬酰胺”指的是结合了天冬酰胺状态的糖链。而所谓“天冬酰胺结合型糖链”指的是存在于还原末端的N-乙酰葡糖胺通过N-糖苷键与蛋白质多肽中天冬酰胺(Asn)的酸氨基连接的糖链组，以Man(β1-4)GlcNac(β1-4)GlcNac作为母核的糖链组。所谓“糖链天冬酰胺衍生物”指的是在天冬酰胺残基上结合了脂溶性保护基状态的糖链天冬酰胺。此外，在化合物的结构式中，「AcHN」表示乙酰胺基。
如上所述，来自天然糖蛋白质的糖链是随机缺失了非还原末端的糖残基的糖链混合物。本发明人意外地还发现了通过向来自天然糖蛋白质的糖链、具体来说是糖链天冬酰胺混合物中含有的该糖链天冬酰胺导入脂溶性保护基，利用众所周知的色谱法，可以容易地将导入了该保护基的糖链天冬酰胺衍生物的混合物分离为各个糖链天冬酰胺衍生物。通过这样操作可以分别大量制备具有各种结构的糖链天冬酰胺衍生物。例如，以往分离困难的类似结构的糖链天冬酰胺衍生物之间的分离变为可能，可以容易而且大量地分别制备这些化合物。另外，以得到的糖链天冬酰胺衍生物作为起始原料，例如通过使糖水解酶依次作用而除去糖残基，也可以进一步合成各种各样的糖链天冬酰胺衍生物。
因此，通过向糖链天冬酰胺中导入脂溶性保护基进行衍生化，各个糖链天冬酰胺衍生物的分离成为可能，认为这是由于通过导入脂溶性保护基，糖链天冬酰胺衍生物整体的脂溶性提高，例如，与适合使用的反相系柱的相互作用显著提高，其结果可更敏锐地反映糖链结构的差别，能够分离各个糖链天冬酰胺衍生物的缘故。
另外按照先前申请，通过除去得到的糖链天冬酰胺衍生物的保护基，可以人工地、容易而且大量地获得各种糖链天冬酰胺。
上述先前申请中得到的糖链天冬酰胺衍生物、糖链天冬酰胺以及糖链无论哪一个都是α2，6结合体。
此外，上述先前申请中得到的糖链天冬酰胺衍生物、糖链天冬酰胺以及糖链无论哪一个都是没有结合岩藻糖的糖链天冬酰胺衍生物。
以下就α2，3结合体和α2，6结合体的差异进行说明。
所谓α2，3结合体和α2，6结合体，是表示唾液酸与半乳糖之间的结合形式。前者指的是唾液酸的2位碳与半乳糖的3位碳进行α结合，后者指的是唾液酸的2位碳与半乳糖的6位碳进行α结合。两者的区别是与半乳糖结合的碳不同。
在本发明的方法中，首先，通过用唾液酸转移酶使唾液酸或唾液酸的衍生物转移到作为起始化合物的用脂溶性保护基保护的糖链天冬酰胺(9糖-Asn-Fmoc)上，将得到的用脂溶性保护基保护的糖链天冬酰胺供给色谱进行分离，可以得到用脂溶性保护基保护的双唾液酸基糖链天冬酰胺衍生物以及2种单唾液酸基糖链天冬酰胺衍生物。
然后，通过对得到的双唾液酸基糖链天冬酰胺衍生物和2种单唾液酸基糖链天冬酰胺衍生物进行糖水解，可以得到含有唾液酸或唾液酸衍生物的9～7糖链天冬酰胺衍生物。
另外，以上述得到的11～7糖链天冬酰胺衍生物或双唾液酸糖链天冬酰胺(α2，6-11糖-Asn-Fmoc)作为起始原料，通过进行糖水解可得到10～6糖链天冬酰胺衍生物，通过用糖转移酶向10～6糖链天冬酰胺衍生物转移岩藻糖，可以得到含有岩藻糖的13～7糖链天冬酰胺衍生物。
作为该保护基没有特别限定，可以使用例如Fmoc基、叔丁氧羰(Boc)基、苄基、烯丙基、烯丙氧羰基、乙酰基等碳酸酯系或酰胺系的保护基等。从将得到的糖链天冬酰胺衍生物直接用于所期望的糖肽的合成的观点出发，作为该保护基，优选Fmoc基或Boc基等，更优选Fmoc基。Fmoc基当糖链中存在在唾液酸等比较酸性的条件下不稳定的糖时特别有效。另外保护基的导入可以按照众所周知的方法(例如参照Protecting groups in Organic Chemistry，John Wiley &Sons INC.，New York 1991，ISBN 0-471-62301-6)进行。
例如，使用Fmoc基时，通过向糖链天冬酰胺中加适量丙酮后，再加入9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺碳酸酯和碳酸氢钠进行溶解，于25℃下进行Fmoc基向天冬酰胺残基的结合反应，可以向该糖链天冬酰胺的天冬酰胺残基导入Fmoc基。
通过以上操作可以获得导入了脂溶性保护基的糖链天冬酰胺衍生物。
作为唾液酸，可以使用一般市售的唾液酸或化学合成的唾液酸。
作为唾液酸的衍生物，可以使用一般市售的唾液酸的衍生物或化学合成的唾液酸衍生物。具体来说，可以列举与唾液酸的7位、8位或9位的碳结合的羟基用氢原子或卤素原子取代后的化合物。作为卤素原子，可以列举氟、氯、溴等，优选氟。
作为唾液酸转移酶，一般可以使用市售的、来自天然的、通过基因重组生产的唾液酸转移酶，可以根据要转移的唾液酸或唾液酸衍生物的种类适当选择。具体来说，，可以列举作为α2，3转移酶来自RatRecombinant的酶、作为α2，6转移酶来自Rat Liver的酶。另外使用唾液酸酶，通过pH调整等使平衡错开，也可以使唾液酸或唾液酸的衍生物转移。
上述糖链天冬酰胺衍生物的采用色谱的分离可以适当地通过单独或多个组合使用众所周知的色谱进行。
例如，将得到的糖链天冬酰胺衍生物混合物用凝胶过滤柱色谱纯化后，再用HPLC纯化。作为可以在HPLC中使用的柱子，反相系的柱合适，例如，可以使用ODS、Phenyl系、腈系、阴离子交换系柱，具体来说，可以利用例如Pharmacia公司生产的モノQ柱、Iatron公司生产的Iatro-beads column等。分离条件等可以参照众所周知的条件进行适当调整。通过以上操作可以由糖链天冬酰胺衍生物混合物得到所期望的各糖链天冬酰胺衍生物。
然后通过对上面分离得到的糖链天冬酰胺衍生物进行水解，可以高效地获得含有所期望的糖链结构的糖链天冬酰胺衍生物。例如在分离糖链天冬酰胺衍生物阶段，对混合物中含有的糖链天冬酰胺衍生物的种类进行限制，对糖链天冬酰胺衍生物进行粗略解离，然后进行水解，例如通过使用糖水解酶进行水解，可以高效地获得含有所期望的糖链结构的糖链天冬酰胺衍生物。水解可以如上述那样进行。从更高效地获得含有所期望的糖链结构的糖链天冬酰胺衍生物的观点出发，特别优选糖残基的切断方式使用明确的糖水解酶进行水解。
例如，半乳糖残基的去除可以通过将水解的化合物溶于缓冲液(例如磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、グツド缓冲液等)，根据众所周知的条件，使用半乳糖水解酶进行半乳糖残基的切除反应可以完成。被水解的化合物无论是分别分离的化合物，还是混合物都可以。在该反应中使用的半乳糖水解酶优选利用市售的众所周知的外切(エキソ)型的酶。此外，只要是具有同样活性的酶，无论是新分离的酶，还是基因工学上创造的酶都可以。然后与上述同样，将反应后得到的反应液(糖残基被切断的糖链天冬酰胺衍生物的混合物)供给色谱，可以获得各糖链天冬酰胺衍生物。例如，分离优选使用HPLC(ODS柱、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝82∶18)进行。
N-乙酰葡糖胺残基的去除通过将水解的化合物溶于缓冲液(例如磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、グツド缓冲液等)，根据众所周知的条件，使用N-乙酰葡糖胺水解酶进行N-乙酰葡糖胺残基的切除反应可以完成。也可以使用N-乙酰氨基己糖苷酶水解酶。被水解的化合物无论是分别分离的化合物，还是混合物都可以。在该反应中使用的各个酶优选利用市售的外切型的酶。此外，只要是具有同样活性的酶，无论是新分离的酶，还是基因工学上创造的酶都可以。然后与上述同样，将反应后得到的反应液(糖残基被切断的糖链天冬酰胺衍生物的混合物)供给色谱，可以获得各糖链天冬酰胺衍生物。例如，分离优选使用HPLC(ODS柱、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶甲醇＝65∶35，或50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝82∶18)进行。
甘露糖残基的去除通过将水解的化合物溶于缓冲液(例如磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、グツド缓冲液等)，根据众所周知的条件，使用甘露糖水解酶进行甘露糖残基的切除反应可以完成。被水解的化合物无论是分别分离的化合物，还是混合物都可以。在该反应中使用的甘露糖水解酶优选利用市售的外切型的酶。此外，只要是具有同样活性的酶，无论是新分离的酶，还是基因工学上创造的酶都可以。然后与上述同样，将反应后得到的反应液(糖残基被切断的糖链天冬酰胺衍生物的混合物)供给色谱，可以获得各糖链天冬酰胺衍生物。例如，分离优选使用HPLC(ODS柱、洗脱溶剂可将10～200mM左右的醋酸铵等的缓冲溶液与乙腈、或乙醇、或甲醇、或丁醇、或丙醇等具有脂溶性的水溶性有机溶剂适当混合后使用，作为洗脱溶剂，优选为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝82∶18)进行。
得到如上述那样操作得到的各糖链天冬酰胺衍生物后，通过使岩藻糖转移，可以制造天冬酰胺的氨基氮被本发明的脂溶性保护基团保护的糖链天冬酰胺的非还原末端侧的N-乙酰葡糖胺上至少含有一个以上岩藻糖的新的糖链天冬酰胺衍生物。
作为岩藻糖，可以使用一般市售的岩藻糖或化学合成的岩藻糖。
作为岩藻糖转移酶，可以使用一般市售的、来自天然的、或通过基因重组生产的岩藻糖转移酶，可以根据被转移的岩藻糖的种类适当选择。具体来说，可以列举作为使岩藻糖转移到糖链天冬酰胺的非还原末端侧的N-乙酰葡糖胺上的酶的Fucosyltransferase V(Human、Recombinant、来自血浆、来自血清、来自乳汁、来自肝脏)等。另外，使用岩藻糖水解酶，通过调整pH等错开平衡，也可以转移岩藻糖。
上述糖链天冬酰胺衍生物的采用色谱的分离可以适当地通过单独或多个组合使用众所周知的色谱进行。
例如，将得到的糖链天冬酰胺衍生物混合物用凝胶过滤柱色谱纯化后，再用HPLC纯化。作为可以在HPLC中使用的柱子，反相系的柱合适，例如，可以使用ODS、Phenyl系、腈系、阴离子交换系柱，具体来说，可以利用例如Pharmacia公司生产的モノQ柱、Iatron公司生产的Iatro-beads column等。分离条件等可以参照众所周知的条件进行适当调整。通过以上操作可以由糖链天冬酰胺衍生物混合物得到所期望的各糖链天冬酰胺衍生物。
通过上述操作得到各糖链天冬酰胺衍生物后，再通过使用各种糖水解酶等对该衍生物进行水解，除去糖链的非还原末端的糖残基，作为各个单一化合物可以得到糖链的末端的分支结构不均一的各种各样的糖链天冬酰胺衍生物。此外，通过使用各种糖水解酶，改变水解的顺序或其种类，可以制造更多种类的糖链天冬酰胺衍生物。
根据以往的方法，要获得分析级的具有极限的糖链结构的糖链天冬酰胺衍生物需要更庞大的时间和花费，但通过本发明不需要特别的装置和试剂，只是使用惯用的凝胶过滤柱、HPLC柱、至少3种糖水解酶(例如，半乳糖水解酶、甘露糖水解酶、N-乙酰葡糖胺水解酶)等，用2周时间左右就可以制造1克左右含有所期望的糖链结构的糖链天冬酰胺衍生物。
在本发明中使用上述先前申请得到的各种糖链天冬酰胺、上述先前申请没有叙述的α2，3结合体的糖链天冬酰胺、以及(α2，3)(α2，6)结合体的糖链天冬酰胺、以及这些的岩藻糖结合体的糖链天冬酰胺，可以得到目的生物素化或FITC化的糖链天冬酰胺衍生物。
本发明涉及对糖链天冬酰胺的氨基氮进行生物素化或FITC化的糖链天冬酰胺。
作为本发明的生物素化糖链天冬酰胺，例如，可列举下式表示的化合物。
Figure A20038010531700161
[式中、R1和R2是氢原子、或式(2)～(6)表示的基团，可以相同，也可以不同。]
作为本发明的FITC化糖链天冬酰胺，例如可以列举下式表示的化合物。
〔式中、R1和R2与上述相同。〕
另外，本发明涉及对糖链天冬酰胺的氨基氮进行生物素化或FITC化的生物素化或FITC化糖链天冬酰胺的制造方法。
作为本发明的生物素化或FITC化糖链天冬酰胺的制造方法，例如，可以通过对上述表示的各种分离的糖链天冬酰胺的天冬酰胺的氨基氮进行生物素化或FITC化而获得。
作为本发明中使用的糖链天冬酰胺，例如，可列举式(7)表示的化合物。
Figure A20038010531700171
(式中、R1和R2与上述同样。)
作为具体的糖链天冬酰胺，可列举先前申请所述的化合物。即，可以同样使用先前申请的第3～4图所示的α2，6化合物，标识的这些化合物表示在本发明的表1～3中。
另外，作为用于合成上述糖链天冬酰胺的糖链天冬酰胺衍生物，也可列举先前申请所述的α2，6化合物。即，可以同样使用先前申请的第1～2图所示的化合物，标识的这些化合物表示在本发明的表4～6中。
另外除了上述先前申请所述的糖链天冬酰胺以外，也可以使用α2，3结合体的糖链天冬酰胺、以及(α2，3)(α2，6)结合体的糖链天冬酰胺、还有这些的岩藻糖结合体的糖链天冬酰胺。
作为本发明的生物素化，可以根据众所周知的方法进行。例如、将糖链天冬酰胺溶于水，加碳酸氢钠，然后加入溶有D-(+)-生物素基琥珀酰亚胺的二甲基甲酰胺，于室温下反应20分，用凝胶过滤柱等进行纯化，可以得到生物素化糖链天冬酰胺。
本发明的使生物素化糖链天冬酰胺结合的微型板通过使生物素化的糖链天冬酰胺与市售的抗生物素蛋白化的微型板(例如、Pierce公司制)反应可以制造。
而本发明的使生物素化糖链天冬酰胺结合的亲和柱通过使生物素化的糖链天冬酰胺与市售的抗生物素蛋白化的亲和柱反应可以制造。
作为本发明的FITC化，可以按照众所周知的方法进行。例如，将糖链天冬酰胺溶于水，加丙酮、碳酸氢钠，然后再加异硫氰酸荧光素，于室温下反应2小时，用凝胶过滤柱等进行纯化，可以得到FITC化糖链天冬酰胺。
本发明中得到的FITC化糖链天冬酰胺对于例如活体组织中的糖类的受体的研究、植物凝集素的糖结合特异性的研究是有用的。
具体实施方式
以下举出实施例进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。1H-NMR的数据对于实施例1～7以及参考例45，是以30℃下HOD作为4.8ppm，对于参考例1～44是在30℃下作为内部标准，以丙酮的甲基信号作为2.225ppm、HOD作为4.718ppm进行测定得到的值。此外，有关除去Fmoc基的化合物，是在测定溶剂中使50mM的碳酸氢铵共存测定的。
参考例1  双唾液酸基糖链天冬酰胺(化合物24)的合成
使来自卵的粗纯化的SGP(唾液酸糖肽，sialylglycopeptide)2.6g溶解于100ml的Tris-HCl·氯化钙缓冲液(TRIZMA BASE0.05mol/l、氯化钙0.01mol/l、pH＝7.5)。然后向该溶液中加入叠氮化钠58mg(772μmol)和526mg肌动蛋白酶(アクチナ-ゼ)-E(科研制药公司生产)，于37℃下静置。65小时后，再加入263mg肌动蛋白酶-E，再于37℃下静置24小时。将该溶液冷冻干燥后，将残留物通过凝胶过滤柱色谱(Sephadex G-25、2.5φ×1m、洗脱溶剂为水，流速为1.0ml/min·)纯化2次，得到1.3g(555μmol)化合物24。
得到的化合物24的物理的数据如下。
1H-NMR(D2O，30℃)
5.15(1H，s，Man4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.95(1H，s，Man4’-H1)，4.82(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5，5’-H1)，4.53(2H，d，Gal6，6’-H1)，4.34(1H，d，Man3-H2)，4.27(1H，d，Man4’-H2)，4.19(1H，d，Man4-H2)，3.03(1H，dd，Asn-βCH)，3.00(1H，dd，Asn-βCH)，2.76(2H，dd，NeuAc7，7’-H3eq)，2.15(18H，s×6，-Ac)，1.79(2H，dd，NeuAc7，7’-H3ax)
Figure A20038010531700191
参考例2  化合物1、2、6和10的合成
使参考例1得到的化合物24(609mg，261μmol)溶解于20.7ml的水中，再加入0.1当量盐酸13.8ml。将该溶液于70℃下加热35分钟后，迅速进行冰冷，加入饱和碳酸氢钠水溶液，调到pH7。对该溶液进行冷冻干燥后，将残留物用凝胶过滤柱色谱(Sephadex G-25、2.5φ×1m、洗脱溶剂为水、流速为1.0ml/min·)进行纯化，得到化合物24、化合物25和29、化合物33的混合物534mg。这4种成分不分别进行分离直接进行下面的工序。
得到的糖链混合物的物理数据如下。
1H-NMR(D2O，30℃)
5.13(s，Man4-H1)，5.12(s，Man4-H1)，5.01(d，GlcNAc1-H1)，4.94(s，Man4’-H1)，4.93(s，Man4’-H1)，4.82(s，Man3-H1)，4.60(d，GlcNAc2-H1)，4.58(d，GlcNAc5，5’-H1)，4.47(dd，Gal6，6’-H1)，4.44(d，Gal6，6’-H1)，4.24(d，Man3-H2)，4.19(d，Man4’-H2)，4.11(d，Man4-H2)，2.97(bdd，Asn-βCH)，2.72(dd，NeuAc7-H3eq，NeuAc7-H3eq)，2.64(bdd，Asn-βCH)，2.15(s×5，-Ac)，1.79(dd，NeuAc7-H3ax，NeuAc7’-H3ax)
使得到的糖链的混合物429mg溶解于16.3ml丙酮和11.2ml水中。向该混合液中加入9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(155.7mg，461.7μmol)和碳酸氢钠(80.4mg，957μmol)，于室温下搅拌2小时。将该溶液供给蒸发器除去丙酮，将剩余溶液用凝胶过滤柱色谱(SephadexG-25、2.5φ×1m、洗脱溶剂为水、流速为1.0ml/min)进行纯化，得到化合物1、化合物2和6、化合物10的混合物309mg。将该混合物使用HPLC(ODS柱、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶甲醇＝65∶35、2.0φ×25cm、流速3ml/min)进行纯化，51分钟后化合物1洗脱下来，67分钟后化合物2和6的混合物被洗脱下来，93分钟后化合物10被洗脱下来。对各个级分分别收集，并进行冷冻干燥后，通过用凝胶过滤柱色谱(Sephadex G-25、2.5φ×30cm、洗脱溶剂为水、流速为1.0ml/min)进行脱盐，可以得到目的化合物2和6的混合物150mg。
得到的化合物1的物理的数据如下。
1H-NMR(D2O，30℃)
7.99(2H，d，Fmoc)，7.79(2H，d，Fmoc)，7.55(4H，m，Fmoc)，5.15(1H，s，Man4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.95(1H，s，Man4’-H1)，4.82(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5，5’-H1)，4.53(2H，d，Gal6，6’-H1)，4.34(1H，d，Man3-H2)，4.27(1H，d，Man4’-H2)，4.19(1H，d，Man4-H2)，3.03(1H，bdd，Asn-βCH)，3.00(1H，bdd，Asn-βCH)，2.76(2H，dd，NeuAc7，7’-H3eq)，2.15(18H，s×6，-Ac)，1.79(2H，dd，NeuAc7，7’-H3ax)；HRMS Calcd for C103H154N8NaO66[M+Na+]2581.8838，found，2581.8821
Figure A20038010531700201
上述糖链结构中的符号表示如下。其中
NeuAc：唾液酸    Gal：D-半乳糖    GlcNAc：N-乙酰葡糖胺    Man：D-甘露糖    Asn：天冬酰胺
此外，得到的化合物2和6的混合物的物理数据如下。
1H-NMR(D2O，30℃)
7.99(d，Fmoc)，7.79(d，Fmoc)，7.55(m，Fmoc)，5.14(s，Man4-H1)，5.12(s，Man4-H)，5.00(d，GlcNAc1-H1)，4.94(s，Man4’-H1)，4.93(s，Man4’-H1)，4.82(s，Man3-H1)，4.60(d，GlcNAc2-H1)，4.58(d，GlcNAc5，5’-H1)，4.46(dd，Gal6，6’-H1)，4.44(d，Gal6，6’-H1)，4.24(d，Man3-H2)，4.19(d，Man4’-H2)，4.11(d，Man4-H2)，2.97(bdd，Asn-βCH)，2.72(dd，NeuAc7-H3eq，NeuAc7-H3eq)，2.64(bdd，Asn-βCH)，2.15(s×5，-Ac)，1.79(dd，NeuAc7-H3ax，NeuAc7’-H3ax)
此外得到的化合物10的物理数据如下。
1H-NMR(D2O，30℃)
7.99(2H，d，Fmoc)，7.79(2H，d，Fmoc)，7.55(4H，m，Fmoc)，5.12(1H，s，Man4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.93(1H，s，Man4’-H1)，4.82(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5，5’-H1)，4.53(2H，d，Gal6，6’-H1)，4.34(1H，d，Man3-H2)，4.27(1H，d，Man4’-H2)，4.19(1H，d，Man4-H2)，3.03(1H，bdd，Asn-βCH)，3.00(1H，bdd，Asn-βCH)，2.15(12H，s×4，-Ac)；HRMS Calcd for C81H120N6NaO50[M+Na+]1999.6930，found，1999.6939
参考例3  化合物3和7的合成
将参考例2得到的化合物2和6的混合物(224mg、97μmol)和牛血清清蛋白24mg溶解于22ml的HEPES缓冲液(50mM，pH6.0)中，再加入来自Diplococcus pneumoniae的β-半乳糖苷酶(1.35U)。将该溶液于37℃下静置15小时后，进行冷冻干燥。将残留物通过HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝85∶15，流速为3ml/min)纯化，在129分钟后洗脱下化合物3，在134分钟后洗脱下化合物7。分别收集，进行冷冻干燥。然后通过HPLC[ODS柱、2.0φ×25cm、洗脱溶剂最初15分钟为水，16分钟后至30分钟后按照水∶乙腈(容量比)＝10∶0到85∶15，31分钟后至45分钟后按照水∶乙腈＝85∶15到80∶20进行梯度洗脱，流速为3ml/min]进行脱盐处理，得到81mg目的化合物3、75mg目的化合物7。
得到的化合物3的物理数据如下。
1H-NMR(D2O，30℃)
7.99(2H，d，Fmoc)，7.79(2H，d，Fmoc)，7.55(4H，m，Fmoc)，5.15(1H，S，Man4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.95(1H，s，Man4’-H1)，4.82(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5，5’-H1)，4.53(1H，d，Gal6’-H1)，4.34(1H，d，Man3-H2)，4.27(1H，d，Man4’-H2)，4.19(1H，d，Man4-H2)，2.97(1H，bdd，Asn-βCH)，2.76(1H，dd，NeuAc7’-H3eq)，2.61(1H，bdd，Asn-βCH)，2.15(15H，s×5，-Ac)，1.79(1H，dd，NeuAc7’-H3ax)；HRMS Calcd for C86H127N7NaO53[M+Na+]2128.7356，found，2128.7363
此外，得到的化合物7的物理数据如下。
1H-NMR(D2O，30℃)
7.99(2H，d，Fmoc)，7.79(2H，d，Fmoc)，7.55(4H，m，Fmoc)，5.15(1H，S，Man4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.95(1H，s，Man4’-H1)，4.82(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5，5’-H1)，4.53(1H，d，Gal6-H1)，4.34(1H，d，Man3-H2)，4.27(1H，d，Man4’-H2)，4.19(1H，d，Man4-H2)，2.97(1H，bdd，Asn-βCH)，2.76(1H，dd，NeuAc7-H3eq)，2.60(1H，bdd，Asn-βCH)，2.15(15H，s×5，-Ac)，1.79(1H，dd，NeuAc7-H3ax)；HRMS Calcd for C86H125N7Na3O53[M+Na+]2172.6995，found，2172.7084
参考例4  化合物4和8的合成
将参考例3得到的化合物3和7的混合物(90mg、47.3μmol)不进行分离，直接与牛血清清蛋白8mg溶解于8.1ml的HEPES缓冲液(50mM，pH6.0)中，再加入2.88U来自牛肾脏的β-葡糖胺酶(SigmaAldrich公司生产，来自牛肾脏)。将该溶液于37℃下静置18小时后，进行冷冻干燥，将残留物通过HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶甲醇＝65∶35，流速为3ml/min)纯化，在117分钟后洗脱下化合物4，在127分钟后洗脱下化合物8。分别收集，进行冷冻干燥。继续使用HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脱溶剂最初15分钟为水，16分钟后至30分钟后按照水∶乙腈＝10∶0到85∶15，31分钟后至45分钟后按照水∶乙腈＝85∶15到80∶20进行梯度洗脱，流速为3ml/min)进行脱盐处理，得到40mg目的化合物4，37mg目的化合物8。
得到的化合物4的物理数据如下。
1H-NMR(D2O，30℃)
8.01(2H，d，Fmoc)，7.80(2H，d，Fmoc)，7.56(4H，m，Fmoc)，5.22(1H，s，Man4-H1)，5.08(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.94(1H，s，Man4’-H1)，4.84(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(1H，d，GlcNAc5-H1)，4.55(1H，d，Gal6-H1)，4.33(1H，dd，Man3-H2)，4.20(1H，dd，Man4-H2)，4.15(1H，dd，Man4’-H2)，2.97(1H，bdd，Asn-βCH)，2.76(2H，dd，NeuAc7，7’-H3eq)，2.62(1H，bdd，Asn-βCH)，2.15(12H，s×4，-Ac)，1.79(2H，dd，NeuAc7，7’-H3ax)；HRMS Calcd for C78H114N6NaO48[M+Na+]1925.6562，found，1925.6539
此外得到的化合物8的物理数据如下。
1H-NMR(D2O，30℃)
7.99(2H，d，Fmoc)，7.79(2H，d，Fmoc)，7.55(4H，m，Fmoc)，5.15(1H，S，Man4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.95(1H，s，Man4’-H1)，4.82(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5，5’-H1)，4.53(2H，d，Gal6，6’-H1)，4.34(1H，d，Man3-H2)，4.27(1H，d，Man4’-H2)，2.97(1H，bdd，Asn-βCH2)，2.76(1H，dd，NeuAc7’-H3eq)，2.61(1H，bdd，Asn-βCH2)，2.15(12H，s×4，-Ac)，1.79(1H，dd，NeuAc7’-H3ax)；HRMS Calcd for C78H114N6NaO48[M+Na+]1925.6562，found，1925.6533
参考例5  化合物5的合成
将参考例4得到的化合物4(30mg、473μmol)和牛血清清蛋白3mg溶解于6ml的HEPES缓冲液(50mM，pH6.0)中，再加入10U的来自Jack Beans的α-甘露糖苷酶。将该溶液于37℃下静置21小时后，进行冷冻干燥，接着用HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脱溶剂最初15分钟为水，16分钟后至30分钟后按照水∶乙腈＝10∶0到85∶15，31分钟后至45分钟后按照水∶乙腈＝85∶15到80∶20进行梯度洗脱，流速为3ml/min)进行纯化，得到20mg的目的化合物5。
得到的化合物5的物理数据如下。
1H-NMR(D2O，30℃)
8.01(2H，d，Fmoc)，7.80(2H，d，Fmoc)，7.56(4H，m，Fmoc)，5.00(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.95(1H，s，Man4’-H1)，4.84(1H，s，Man3-H1)，4.67(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.56(1H，d，GlcNAc5-H1)，4.44(1H，d，Gal6-H1)，4.11(1H，dd，Man4’-H2)，4.07(1H，dd，Man3-H2)，2.97(1H，bdd，Asn-βCH)，2.76(1H，dd，NeuAc7’ -H3eq)，2.62(1H，bdd，Asn-βCH)，2.15(12H，s×4，-Ac)，1.79(2H，dd，NeuAc7’-H3ax)；HRMS Calcd for C72H104N6NaO43[M+Na+]1763.6034，found，1763.6074
参考例6  化合物9的合成
将参考例4得到的化合物8(40mg、630μmol)和牛血清清蛋白5g溶解于7.8ml的HEPES缓冲液(50mM，pH6.0)中，再加入38U的来自Jack Beans的α-甘露糖苷酶。将该溶液于37℃下静置63小时后，进行冷冻干燥，接着用HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脱溶剂最初15分钟为水，16分钟后至30分钟后按照水∶乙腈＝10∶0到85∶15，31分钟后至45分钟后为85∶15到80∶20，进行梯度洗脱，流速为3ml/min)进行纯化，得到30mg的目的化合物9。
得到的化合物9的物理数据如下。
1H-NMR(D2O，30℃)
8.01(2H，d，Fmoc)，7.80(2H，d，Fmoc)，7.56(4H，m，Fmoc)，5.23(1H，s，Man4-H1)，5.08(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.53(1H，d，Gal6-H1)，4.32(1H，dd，Man3-H2)，4.28(1H，dd，Man4-H2)，2.81(1H，bdd，Asn-βCH)，2.76(1H，dd，NeuAc7-H3eq)，2.59(1H，bdd，Asn-βCH)，2.13(12H，s×4，-Ac)，1.80(1H，dd，NeuAc7H3ax)；HRMS Calcd for C72H104N6NaO43[M+Na+]1763.6034，found，1763.6041
参考例7  Fmoc基的脱保护(化合物33的合成)
使参考例2得到的化合物10(10.5mg，5.27μmol)溶解于50％吗啉/N，N-二甲基甲酰胺溶液1.4ml中，于室温、氩气氛下反应2小时。向该溶液加入3ml甲苯，于35℃下用蒸发器进行蒸发。重复进行三次该操作，除去反应溶剂。将残留物通过凝胶过滤柱色谱(SephadexG-25、2.5φ×30cm、洗脱溶剂为水、流速为1.0ml/min·)进行纯化，得到7mg目的化合物33(收率为76％)。另外，得到的化合物的结构由从参考例2得到的化合物33与1H-NMR谱图一致进行确认。
化合物33的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ5.12(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.62(d，1H，J＝8.0Hz，GlcNAc2-H-1)，4.58(d，2H，J＝7.8Hz，GlcNAc5，5’-H-1)，4.47(d，2H，J＝7.9Hz，Gal6，6’-H-1)，4.24(bd，1H，Man3-H-2)，4.19(bdd，1H，J＝3.2Hz，1.4Hz，Man4’-H-2)，4.12(bdd，1H，J＝3.2Hz，1.4Hz，Man4-H-2)，2.93(dd，1H，J＝4.5Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.93(dd，1H，J＝6.8Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.08(s，3H，Ac)，2.05(s，6H，Ac×2)，2.01(s，3H，Ac)
参考例8  化合物14的合成
将化合物3(28mg、21.3μmol)和牛血清清蛋白1.0mg溶解于HEPES缓冲液(50mM，pH5.0，454μL)中，再加入神经氨酸苷酶(SigmaAldrich公司生产，来自Viblio Cholerae，198mU)。将该溶液于37℃下静置20小时后，通过HPLC分析，确认反应结束。将反应液通过HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速4.0mL/min)进行纯化。再通过ODS柱(Cosmoseal75C18-OPN、15×100mm、最初使50mL水流过，然后使25％乙腈流过进行洗脱)脱盐，得到目的化合物14(17mg、收率70％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ7.91(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.51(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.12(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.58(d，1H，J＝8.0Hz，GlcNAc2-H-1)，4.55(d，1H，J＝8.4Hz，GlcNAc5’ -H-1)，4.47(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6’-H-1)，4.34(t，1H，Fmoc)，4.24(bd，1H，J＝1.9Hz，Man3-H-2)，4.18(bdd，1H，J＝1.4Hz，3.3Hz，Man4-H-2)，4.11(bdd，1H，J＝1.4Hz，3.5Hz，Man4’-H-2)，2.72(bdd，1H，J＝3.0Hz，15.7Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝8.7Hz，15.7Hz，Asn-βCH)，2.06，2.05，2.04，1.89(each s，each 3H，Ac)；HRMS Calcd for C75H110N6NaO45[M+Na+]1837.6402，found 1837.6471
参考例9  化合物19的合成
将化合物7(20mg、9.4μmol)和牛血清清蛋白1.6mg溶解于HEPES缓冲液(50mM，pH5.0，323μL)中，再加入神经氨酸苷酶(SigmaAldrich公司生产，来自Viblio Cholerae，141mU)。将该溶液于37℃下静置18小时后，通过HPLC分析，确认反应结束。然后通过HPLC(YMC PackedColumn D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速4.0mL/min)进行纯化。再通过ODS柱(Cosmoseal75C18-opn、15×100mm、最初使50mL水流过，然后使25％乙腈流过进行洗脱)脱盐，得到目的化合物19(13mg、收率76％)。得到的化合物的结构由1H-NMR与标准品一致进行确认。
参考例10  化合物15的合成
将化合物4(45mg、24μmol)和牛血清清蛋白1.7mg溶解于HEPES缓冲液(50mM，pH5.0，820μL)中，再加入神经氨酸苷酶(SigmaAldrich公司生产，来自Viblio Cholerae，134mU)。将该溶液于37℃下静置14小时后，通过HPLC分析确认反应结束。接着将反应液通过HPLC(YMCPacked Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速4.0mL/min)进行纯化。再通过ODS柱(Cosmoseal75C18-opn、15×100mm、最初使50mL水流过，然后使25％乙腈流过进行洗脱)脱盐，得到目的化合物15(28mg、收率74％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ7.92(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.51(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.44(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.10(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.58(d，2H，GlcNAc2，5’-H-1)，4.47(d，1H，J＝8.0Hz，Gal6’-H-1)，4.35(t，1H，Fmoc)，4.24(bd，1H，J＝1.9Hz，Man3-H-2)，4.11(bs，1H，Man4’-H-2)，4.07(bs，1H，Man4-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝8.7Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.06，2.04，1.89(each s，each 3H，Ac)；HRMS Calcdfor C67H97N5NaO40[M+Na+ 1634.5608，found，1634.5564
参考例11  化合物70的合成
将得到的化合物15(11mg，6.8μmol)和牛血清清蛋白1.5mg溶解于HEPES缓冲液(50mM，pH5.0，269μL)中，再加入β-半乳糖苷酶(生化学工业公司生产、来自Jack Beans，11μL，275mU)。将该溶液于37℃下静置14小时后，通过HPLC分析确认反应结束，反应溶液通过HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODSNo.2020178、20×250mm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20、流速4mL/min)进行纯化。再通过ODS柱(コスモシ一ル75C18-opn、15×100mm、最初流过50mLH2O，然后流过25％乙腈，进行洗脱)进行脱盐，得到目的化合物70(6.3mg，收率64％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ7.91(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.70(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.50(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.10(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.55(d，2H，GlcNAc2，5’-H-1)，4.32(t，1H，Fmoc)，4.24(bs，1H，Man3-H-2)，4.10(bs，1H，Man4-H-2)，4.06(bs，1H，J＝1.3Hz，Man4’-H-2)，2.72(bd，1H，J＝14.0Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝9.5Hz，14.8Hz，Asn-βCH)，2.06，2.05，1.89(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C61H88N5O35[M+H+]1450.5，found，1450.4
参考例12  化合物20的合成
将化合物8(47mg、25μmol)和牛血清清蛋白1.9mg溶解于HEPES缓冲液(50mM，pH5.0，840μL)中，再加神经氨酸苷酶(SigmaAldrich公司生产，来自Viblio Cholerae，369mU)。将该溶液于37℃下静置37小时后，通过HPLC分析，确认反应结束。将该反应液冷冻干燥，然后通过HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODSNo.2020178、20×250mm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速4.0mL/min)进行纯化。再通过ODS柱(Cosmoseal75C18-opn、15×100mm、最初使50mL水流过，然后使25％乙腈流过进行洗脱)脱盐，得到目的化合物20(26mg、收率65％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ7.92(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.51(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.12(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.4Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.57(bd，2H，GlcNAc2，5’-H-1)，4.46(d，1H，J＝7.5Hz，Gal6’-H-1)，4.34(t，3H，Fmoc)，4.24(bs，1H，Man4’-H-2)，4.19(bs，1H，Man4-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝9.2Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.06，2.05，1.89(each s，each 3H，Ac)；HRMS Calcd for C67H97N5NaO40[M+Na+]1634.5608，found，1634.5644
参考例13  化合物71的合成
将化合物20(12mg，7.4μmol)和牛血清清蛋白1.0mg溶解于HEPES缓冲液(50mM，pH5.0，330μL)中，再加入β-半乳糖苷酶(生化学工业公司生产、来自Jack Beans，12μL，297mU)。将该溶液于37℃下静置46小时后，通过HPLC分析确认反应结束。反应溶液通过HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20、流速4mL/min)进行纯化。再通过ODS柱(コスモシ一ル75C18-opn、15×100mm、最初流过50mLH2O，然后流过25％乙腈，进行洗脱)进行脱盐，得到目的化合物71(6.6mg，收率61％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ7.90(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.70(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.49(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.42(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.11(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.4Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.55(d，2H，GlcNAc2，5-H-1)，4.31(b，1H，Fmoc)，4.24(bs，1H，Man3-H-2)，4.18(bs，1H，Man4-H-2)，3.97(dd，1H，J＝1.8Hz，3.3Hz，Man4’-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝8.0Hz，15.5Hz，Asn-ββCH)，2.06，2.05，1.88(each s，each3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C61H88N5O35[M+H+]1450.5，found，1450.3
参考例14  化合物16的合成
将化合物5(32mg、18.4μmol)和牛血清清蛋白2.5mg溶解于HEPES缓冲液(50mM，pH5.0，713μL)中，再加入神经氨酸苷酶(SigmaAldrich公司生产，来自Viblio Cholerae，134mU)。将该溶液于37℃下静置17小时后，通过HPLC分析确认反应结束。接着将反应液通过HPLC(YMCPacked Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速4.0mL/min)进行纯化。再通过ODS柱(Cosmoseal75C18-opn、15×100mm、最初使50mL水流过，然后使25％乙腈流过进行洗脱)脱盐，得到目的化合物16(13mg、收率52％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ7.92(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.51(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.44(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.00(d，1H，J＝9.9Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.75(s，1H，Man3-H-1)，4.58(d，2H，J＝7.5Hz，GlcNAc2，5’-H-1)，4.47(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6’-H-1)，4.34(t，1H，Fmoc)，4.10(bd，1H，Man3-H-2)，4.07(bs，1H，Man4’-H-2)，2.72(bdd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝9.2Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.07，2.05，1.89(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C61H88N5O35[M+H+]1450.5，found，1450.3
参考例15  化合物17的合成
使化合物16(9mg，6.2μmol)与牛血清清蛋白1.6mg溶解于HEPES缓冲液(50mM，pH5.0，613μL)，加入β-半乳糖苷酶(生化学工业公司生产、来自Jack Beans，186mU)。将该溶液于37℃静置32小时后，通过HPLC分析确认反应结束。将反应溶液用HPLC(YMC PackedColumn D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20、流速为4mL/min)进行纯化。再通过ODS柱(コスモシ一ル75C18-OPN、15×100mm、最初流过50mLH2O，然后流过25％乙腈，进行洗脱)进行脱盐，得到目的化合物17(5.4mg，收率68％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ7.89(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.68(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.49(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.42(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，4.99(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.55(d，1H，J＝8.1Hz，GlcNAc2，5’-H-1)，4.09，4.07(s，1H，Man4’-H-2，Man3-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.56(bdd，1H，J＝8.1Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.07，2.05，1.89(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd forC55H77N5NaO30[M+Na+]1310.5，found，1310.2
参考例16  化合物18的合成
使化合物17(3.4mg，2.6μmol)和牛血清清蛋白1.1mg溶解于HEPES缓冲液(50mM，pH5.0，257μL)，加入N-乙酰基-β-D-葡糖胺酶(SigmaAldrich  来自Jack Beans，144mU)。将该溶液于37℃下静置24小时后，通过HPLC分析确认反应结束。将反应溶液用HPLC(YMCPacked Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20、流速为4mL/min)进行纯化。再通过ODS柱(コスモシ一ル75C18-OPN、15×100mm。最初流过50mLH2O，然后流过25％乙腈，进行洗脱)进行脱盐，得到目的化合物18(2.1mg，收率75％)。得到的化合物的物理的数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ7.91(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.51(dd，2H，J＝7.5Hz，7.5Hz，Fmoc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，7.5Hz，Fmoc)，5.00(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(d，1H，J＝1.6Hz，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man 3-H-1)，4.58(d，1H，J＝7.8Hz，GlcNAc2-H-1)，4.34(t，1H，Fmoc)，4.07(d，1H，J＝2.7Hz，Man4’-H-2)，3.97(dd，1H，J＝1.6Hz，3.7Hz，Man3-H-2)，2.72(bdd，1H，J＝3.2Hz，15.1Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝8.9Hz，15.1Hz，Asn-βCH)，2.07，1.89(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C47H65N4O25[M+Na+]1085.4，found，1085.3
参考例17  化合物21的合成
将化合物9(28mg、16μmol)和牛血清清蛋白1.7mg溶解于HEPES缓冲液(50mM，pH5.0，624μL)中，再加入神经氨酸苷酶(SigmaAldrich公司生产，来自Viblio Cholerae，117mU)。将该溶液于37℃下静置17小时后，通过HPLC分析确认反应结束。然后将反应液通过HPLC(YMCPacked Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速4.0mL/min)进行纯化。再通过ODS柱(Cosmoseal75C18-OPN、15×100mm、最初使50mL水流过，然后使25％乙腈流过进行洗脱)脱盐，得到目的化合物21(14.6mg、收率68％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ7.92(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.50(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.12(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.57(d，2H，J＝7.2Hz，GlcNAc2-H-1)，4.46(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6-H-1)，4.34(t，1H，Fmoc)，4.22(bd，1H，J＝2.7Hz，Man3-H-2)，4.19(b，1H，Man4-H-2)，2.72(bdd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝9.8Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.05(s，6H，Ac×2)，1.89(s，3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C61H88N5O35[M+H+]1450.5，found，1450.3
参考例18  化合物22的合成
使化合物21(10mg，6.9μmol)与牛血清清蛋白1.6mg溶解于HEPES缓冲液(50mM，pH5.0，672μL)，加入β-半乳糖苷酶(生化学工业公司生产、来自Jack Beans，205mU)。将该溶液于37℃静置20小时后，通过HPLC分析确认反应结束。将反应溶液用HPLC(YMCPacked Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20、流速为4mL/min)进行纯化。再通过ODS柱(コスモシ-ル75C18-OPN、15×100mm、最初流过50mLH2O，然后流过25％乙腈，进行洗脱)进行脱盐，得到目的化合物22(5.6mg，收率64％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ7.87(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.67(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.48(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.41(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.12(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.55(d，2H，J＝8.6Hz，GlcNAc2，5-H-1)，4.26(t，1H，Fmoc)，4.22(d，1H，J＝2.2Hz，Man3-H-2)，4.18(bdd，1H，J＝1.3Hz，3.3Hz，Man4-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.54(bdd，1H，J＝9.5Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.05(s，6H，Ac×2)，1.88(s，3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C55H78N5O30[M+H+]1288.5，found，1288.3
参考例19  化合物23的合成
使化合物22(3.6mg，2.8μmol)和牛血清清蛋白1.2mg溶解于HEPES缓冲液(50mM，pH5.0，277μL)，加入N-乙酰基-β-D-葡糖胺酶(SigmaAldrich来自Jack Beans，195mU)。将该溶液于37℃下静置24小时后，通过HPLC分析确认反应结束。将反应溶液用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20、流速为4mL/min)进行纯化。再通过ODS柱(コスモシ一ル75C18-OPN、15×100mm、最初流过50mLH2O，然后流过25％乙腈，进行洗脱)进行脱盐，得到目的化合物23(2.3mg，收率77％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ7.91(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.70(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.50(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.11(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.57(d，1H，J＝6.5Hz，GlcNAc-H-1)，4.33(t，1H，Fmoc)，4.22(d，1H，J＝3.0Hz，Man3-H-2)，4.07(bdd，1H，J＝2.1Hz，Man4-H-2)，2.72(bdd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝8.9Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.05，1.89(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C47H65N4O25[M+H+]1085.4，found，1085.3
参考例20  化合物11的合成
使化合物10(123mg，62μmol)与牛血清清蛋白1.1mg溶解于HEPES缓冲液(50mM，pH5.0，2.5mL)，加入β-半乳糖苷酶(生化学工业公司生产、来自Jack Beans，24μL，612mU)。将该溶液于37℃静置61小时后，通过HPLC分析确认反应结束。将反应溶液进行冷冻干燥，接着用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120AODS No.2020178、20×250mm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20、流速为3.5mL/min)进行纯化。再通过ODS柱(コスモシ一ル75C18-OPN、15×100mm。最初流过50mLH2O，然后流过25％乙腈，进行洗脱)进行脱盐，得到目的化合物11(71mg，收率70％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ7.91(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.50(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.11(s，1H，Man4-H-1)，4.99(1H，d，J＝9.9Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.55(d，2H，J＝8.6Hz，GlcNAc2，5-H-1)，4.34(t，1H，Fmoc)，4.24(s，1H，Man3-H-2)，4.18(s，1H，Man4-H-2)，4.10(s，1H，Man4’-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.51(bdd，1H，J＝9.0Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.06(s，3H，Ac)，2.05(s，6H，Ac×2)，1.88(s，3H，Ac)；HRMS Calcd for C69H100N6NaO40[M+Na+]1675.5873，found，1675.5841
参考例21  化合物12的合成
使化合物11(50mg，30μmol)和牛血清清蛋白2.0mg溶解于HEPES缓冲液(50mM，pH5.0，920μL)，加入N-乙酰基-β-D-葡糖胺酶(SigmaAldrich，来自Jack Beans，2.1U)。将该溶液于37℃下静置48小时后，通过HPLC分析确认反应结束。将反应溶液用HPLC(YMCPacked Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20、流速为4mL/min)进行纯化，进行冷冻干燥。再通过ODS柱(コスモシ一ル75C18-OPN、15×100mm、最初流过50mLH2O，然后流过25％乙腈，进行洗脱)对该残留物进行脱盐，得到目的化合物12(25mg，收率66％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ7.91(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.70(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.50(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.10(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(bd，1H，J＝1.6Hz，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.58～4.52(b，1H，GlcNAc2-H-1)，4.33(t，1H，Fmoc)，4.24(bs，1H，Man3-H-2)，4.06(dd，1H，J＝1.6Hz，3.2Hz，Man4-H-2)，3.97(dd，1H，J＝1.6Hz，3.5Hz，Man4’-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.53(bdd，1H，J＝9.0Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.05，1.88(each s，each 3H，Ac)，
参考例22  化合物13的合成
使化合物12(10mg，11μmol)和牛血清清蛋白0.9mg溶解于HEPES缓冲液(50mM，pH5.0，440μL)，加入α-甘露糖苷酶(SigmaAldrich公司制造，来自Jack Beans，30μL，3.2U)。将该溶液于37℃下静置21小时后，通过HPLC分析确认反应结束。接着用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODSNo.2020178、20×250mm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20、流速为4mL/min)进行纯化。再通过ODS柱(コスモシ一ル75C18-OPN、15×100mm、最初流过50mLH2O，然后流过25％乙腈，进行洗脱)进行脱盐，得到目的化合物13(3mg，收率43％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ7.92(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.51(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，4.99(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.57(1H，GlcNAc2-H-1)，4.06(d，1H，J＝3.2Hz，Man3-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝8.3Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.05，1.89(each s，each 3H，Ac)，(糖链天冬酰胺衍生物的Fmoc基的脱保护)
在所有的糖链天冬酰胺衍生物中，都按照以下顺序进行Fmoc基的脱保护。首先，对于每1μmol糖链天冬酰胺Fmoc体加入240μl的N，N-二甲基甲酰胺、160μl的吗啉，于室温下在氩气氛下使其反应。通过TLC(洗脱溶剂使用1M醋酸铵∶异丙醇＝8∶5)确认反应结束后，于冰水中冷却。然后加入相当于反应溶液10倍量的二乙醚，搅拌15分钟后，对析出的沉淀物进行过滤。使得到的残渣溶解于水，于35℃下进行蒸发。反复进行3次再加3ml甲苯、蒸发的操作。将残留物通过反相柱色谱(Cosmoseal75C18-opn、15×100mm、洗脱溶剂为水)进行纯化。
参考例23  化合物33的合成
使化合物10(10.5mg，5.3μmol)按照上述操作反应7小时，得到目的化合物33(7mg，收率76％)。得到的化合物由于1H-NMR与标准品一致而确认。
参考例24  化合物26的合成
使化合物3(8.0mg，3.8μmol)按照上述操作反应21小时，得到目的化合物26(6.3mg，收率88％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ5.13(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.9Hz，GlcNAc1-H-1)，4.95(s，1H，Man4’-H-1)，4.78(s，1H，Man3-H-1)，4.62(2H，GlcNAc2，5’-H-1)，4.56(d，1H，J＝8.1Hz，GlcNAc5-H-1)，4.52(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6’-H-1)，4.25(bs，1H，Man3-H-2)，4.19(bs，1H，Man4’-H-2)，4.12(bs，1H，Man4-H-2)，2.94(dd，1H，J＝4.5Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.85(dd，1H，J＝6.8Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.68(dd，1H，J＝4.6Hz，12.4Hz，NeuAc7’-H-3eq)，2.08，2.07，2.06，2.04，2.02(each s，each 3H，Ac)，1.72(dd，1H，J＝12.1Hz，12.1Hz，NeuAc7’-H-3ax)；MS(Fab)，Calcdfor C71H118N7O51[M+H+]1884.7，found，1884.5
参考例25  化合物27的合成
使化合物4(11.0mg，5.8μmol)按照上述操作反应23小时，得到目的化合物27(8.5mg，收率88％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ5.11(s，1H，Man4-H-1)，5.08(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.95(s，1H，Man4’-H-1)，4.78(s，1H，Man3-H-1)，4.62(d，2H，GlcNAc2，5’-H-1)，4.45(d，1H，J＝7.6Hz，Gal6’-H-1)，4.26(bd，1H，Man3-H-2)，4.12(bd，1H，Man4’-H-2)，4.08(bdd，1H，J＝1.6Hz，3.3Hz，Man4-H-2)，2.94(dd，1H，J＝4.0Hz，17.2Hz，Asn-βCH)，2.85(dd，1H，J＝7.2Hz，17.2Hz，Asn-βCH)，2.68(dd，1H，J＝4.1Hz，12.1Hz，NeuAc7’-H-3eq)，2.09，2.07，2.04，2.02(each s，each 3H，Ac)，1.72(dd，1H，J＝12.1Hz，12.1Hz，NeuAc7’-H-3ax)，；MS(Fab)，Calcd for C63H104N6NaO46[M+Na+]1703.6，found，1703.1
参考例26  化合物28的合成
使化合物5(7.0mg，4.0μmol)按照上述操作反应21小时，得到目的化合物28(5.3mg，收率87％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ5.07(d，1H，J＝9.4Hz，GlcNAc1-H-1)，4.94(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.59(each d，each 1H，GlcNAc2，5’-H-1)，4.44(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6’-H-1)，4.10，4.07(each1H，Man4’，3-H-2)，2.93(dd，1H，J＝4.6Hz，17.5Hz，Asn-βCH)，2.85(dd，1H，J＝7.0Hz，17.5Hz，Asn-βCH)，2.67(dd，1H，J＝4.6Hz，12.2Hz，NeuAc7’-H-3eq)，2.08，2.06，2.02，2.01(each s，each 3H，Ac)，1.71(2H，dd，J＝12.2Hz，12.2Hz，NeuAc7’-H-3ax)；MS(Fab)，Calcd for C57H94N6NaO41[M+Na+]1541.5，found，1541.3
参考例27  化合物30的合成
使化合物7(13.9mg，6.6μmol)按照上述操作反应7小时，得到目的化合物30(8.0mg，收率64％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ5.13(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.9Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.60(each d，each 1H，J＝8.0Hz，GlcNAc2，5-H-1)，4.55(d，1H，J＝8.4Hz，GlcNAc5’-H-1)，4.44(d，1H，J＝8.0Hz，Gal6-H-1)，4.24(bd，1H，Man3-H-2)，4.19(bdd，1H，J＝1.3Hz，3.2Hz，Man4’-H-2)，4.10(bdd，1H，J＝1.4Hz，3.2Hz，Man4-H-2)，2.90(dd，1H，J＝4.5Hz，16.7Hz，Asn-βCH)，2.80(dd，1H，J＝7.5Hz，16.7Hz，Asn-βCH)，2.66(dd，1H，J＝4.6Hz，12.4Hz，NeuAc7-H-3eq)，2.07，2.06，2.05，2.02，2.01(each s，each 3H，Ac)，1.71(dd，1H，J＝12.4Hz，12.4Hz，NeuAc7-H-3ax)；MS(Fab)，Calcdfor C71H117N7NaO51[M+Na+]1906.7，found，1906.1
参考例28  化合物31的合成
使化合物8(8.0mg，4.2μmol)按照上述操作反应12小时，得到目的化合物31(6.0mg，收率86％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ5.12(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.59(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.43(d，1H，J＝8.0Hz，Gal6-H-1)，4.24(bd，1H，Man3-H-2)，4.18(bdd，1H，Man4’-H-2)，2.91(bd，1H，J＝17.0Hz，Asn-βCH)，2.81(dd，1H，J＝6.5Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.66(dd，1H，J＝4.6Hz，12.6Hz，NeuAc7-H-3eq)，2.06，2.06，2.02，2.00(each s，each 3H，Ac)，1.70(dd，1H，J＝12.6Hz，12.6Hz，NeuAc7-H-3ax)；MS(Fab)，Calcd forC63H104N6NaO46[M+Na+]1703.6，found，1703.0
参考例29  化合物32的合成
使化合物9(7.7mg，4.4μmol)按照上述操作反应23小时，得到目的化合物32(5.2mg，收率78％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ5.14(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.4Hz，GlcNAc1-H-1)，4.78(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4,60(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.44(d，1H，J＝8.0Hz，Gal6-H-1)，4.23(d，1H，J＝3.0Hz，Man3-H-2)，4.19(bdd，1H，J＝1.3Hz，2.9Hz，Man4-H-2)，2.92(dd，1H，J＝4.1Hz，17.2Hz，Asn-βCH)，2.83(dd，1H，J＝7.5Hz，12.7Hz，Asn-βCH)，2.67(dd，1H，J＝4.6Hz，12.7Hz，NeuAc7-H-3eq)，2.06(s，6H，Ac×2)，2.03，2.01(each s，each 3H，Ac)，1.71(dd，1H，J＝12.7Hz，12.7Hz，NeuAc7-H-3ax)；MS(Fab)，Calcdfor C57H94N6NaO41[M+Na+]1541.5，found，1541.2
参考例30  化合物37的合成
使化合物14(9.1mg，5.0μmol)按照上述操作反应13小时，得到目的化合物37(6.5mg，收率77％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ5.11(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.75(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.57，4.55(each d，each 1H，J＝7.5Hz，GlcNAc2，5，5’-H-1)，4.46(d，1H，J＝7.3Hz，Gal6’-H-1)，4.23(bs，1H，Man3-H-2)，4.18(bs，1H，Man4’-H-2)，4.10(bs，1H，Man4-H-2)，2.87(dd，1H，J＝4.8Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.76(dd，1H，J＝7.2Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.07(s，3H，Ac)，2.04(s，6H，Ac×2)，2.00(s，3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C60H100N6NaO43[M+Na+]1615.6，found，1615.0
参考例31  化合物42的合成
使化合物19(9.8mg，5.4μmol)按照上述操作反应13小时，得到目的化合物42(8.0mg，收率88％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ5.11(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.60，4.57，4.55(each d，each 1H，GlcNAc2，5，5’-H-1)，4.46(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6-H-1)，4.28(s，1H，Man3-H-2)，4.18(s，1H，Man4’-H-2)，4.10(s，1H，Man4-H-2)，2.88(dd，1H，J＝4.0Hz，16.6Hz，Asn-βCH)，2.77(dd，1H，J＝7.5Hz，16.6Hz，Asn-βCH)，2.07(s，3H，Ac)，2.04(s，6H，Ac×2)，2.00(s，3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C60H101N6O43[M+H+]1593.6，found，1593.8
参考例32  化合物38的合成
使化合物15(5.1mg，3.2μmol)按照上述操作反应11小时，得到目的化合物38(4.0mg，收率91％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ5.10(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.4Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.57(each d，each 1H，J＝7.8Hz，GlcNAc2，5’-H-1)，4.47(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6’-H-1)，4.24(d，1H，J＝2.3Hz，Man3-H-2)，4.10，4.06(each bd，each 1H，Man4’，4-H-2)，2.90(dd，1H，J＝4.2Hz，16.8Hz，Asn-βCH)，2.81(dd，1H，J＝7.3Hz，16.8Hz，Asn-βCH)，2.07，2.04，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcdfor C52H88N5O38[M+H+]1390.5，found，1390.1
参考例33  化合物72的合成
使化合物70(4.0mg，2.8μmol)按照上述操作反应13小时，得到目的化合物72(2.9mg，收率85％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ5.09(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.8Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.54(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.24(s，1H，Man3-H-2)，4.10，4.06(each bs，each 1H，Man4，4’-H-2)，2.87(dd，1H，J＝17.2Hz，Asn-βCH)，2.76(dd，1H，J＝6.5Hz，17.2Hz，Asn-βCH)，2.07，2.04，2.00(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C46H78N5O33[M+H+]1228.5，found，1228.3
参考例34  化合物43的合成
使化合物20(5.4mg，3.3μmol)按照上述操作反应11小时，得到目的化合物43(4.1mg，收率87％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ5.11(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.57(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.46(d，1H，Gal6-H-1)，4.24(s，1H，Man3-H-2)，4.18(bs，1H，Man4-H-2)，2.90(dd，1H，J＝4.0Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.80(dd，1H，J＝7.3Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.07，2.04，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C52H88N5O38[M+H+]1390.5，found，1390.2
参考例35  化合物73的合成
使化合物71(4.0mg，2.8μmol)按照上述操作反应13小时，得到目的化合物73(2.9mg，收率85％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ5.11(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.9Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.60，4.54(each d，each 1H，J＝7.9Hz，GlcNAc2，5-H-1)，4.24(s，1H，Man3-H-2)，4.18(dd，1H，J＝1.6Hz，1.6Hz，Man4-H-2)，3.96(1H，dd，J＝1.6Hz，1.6Hz，Man4-H-2)，2.88(dd，1H，J＝4.3Hz，16.8Hz，Asn-βCH)，2.77(dd，1H，J＝7.2Hz，16.8Hz，Asn-βCH)，2.06，2.04，2.00(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C46H78N5O33[M+H+]1228.5，found，1228.3
参考例36  化合物39的合成
使化合物16(2.2mg，1.5μmol)按照上述操作反应7小时，得到目的化合物39(1.6mg，收率84％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ5.07(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.75(s，1H，Man3-H-1)，4.62，4.58(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.09，4.08(each s，each 1H，Man3，4’-H-2)，2.91(dd，1H，J＝4.1Hz，16.9Hz，Asn-βCH)，2.81(dd，1H，J＝6.8Hz，16.9Hz，Asn-βCH)，2.08，2.04，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C46H77N5NaO33[M+Na+]1250.4，found，1250.3
参考例37  化合物40的合成
使化合物17(1.5mg，1.2μmol)按照上述操作反应14小时，得到目的化合物40(1.1mg，收率89％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ5.07(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.62，4.55(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.10，4.07(each s，each 1H，Man4’，3-H-2)，2.89(dd，1H，J＝3.7Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.79(dd，1H，J＝7.0Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.07，2.05，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C40H67N5NaO28[M+Na+]1088.4，found，1088.2
参考例38  化合物41的合成
使化合物18(1.3mg，1.2μmol)按照上述操作反应14小时，得到目的化合物41(0.8mg，收率80％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ5.07(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.62(d，1H，J＝7.8Hz，GlcNAc2-H-1)，4.08(d，1H，J＝2.9Hz，Man3-H-2)，2.92(dd，1H，J＝3.9Hz，17.3Hz，Asn-βCH)，2.83(dd，1H，J＝7.0Hz，17.3Hz，Ash-βCH)，2.07，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C32H55N4O27[M+H+]863.3，found 863.2
参考例39  化合物44的合成
使化合物21(2.3mg，1.6μmol)按照上述操作反应7小时，得到目的化合物44(1.6mg，收率84％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ5.11(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.8Hz，GlcNAc1-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.57(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.46(d，1H，J＝7.8Hz，Gal-H-1)，4.22，4.18(each bs，each 1H，Man3，4-H-2)，2.91(dd，1H，J＝4.1Hz，17.3Hz，Asn-βCH)，2.82(dd，1H，J＝7.0Hz，17.3Hz，Asn-βCH)，2.05，2.04，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcdfor C46H78N5O33[M+H+]1228.5，found，1228.3
参考例40  化合物45的合成
使化合物22(1.6mg，1.3μmol)按照上述操作反应14小时，得到目的化合物45(1.1mg，收率85％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ5.12(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.54(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.22(d，1H，J＝2.5Hz，Man3-H-2)，4.18(dd，1H，J＝1.4Hz，3.0Hz，Man4’-H-2)，2.89(dd，1H，J＝4.3Hz，16.9Hz，Asn-βCH)，2.78(dd，1H，J＝7.5Hz，16.9Hz，Asn-βCH)，2.06，2.05，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C40H67N5NaO28[M+Na+]1088.4，found，1088.3
参考例41  化合物46的合成
将化合物23(1.6mg，1.5μmol)按照上述操作反应14小时，得到目的化合物46(1.1mg，6.4μmol，收率85％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ5.10(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61(d，1H，J＝7.3Hz，GlcNAc2-H-1)，4.22(d，1H，J＝2.4Hz，Man3-H-2)，4.07(dd，1H，J＝1.6Hz，3.0Hz，Man4’-H-2)，2.90(dd，1H，J＝4.3Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.80(dd，1H，J＝7.0Hz，17.2Hz，Asn-βCH)，2.05，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C32H55N4O23[M+H+]863.3，found 863.3
参考例42  化合物34的合成
使化合物11(12.4mg，7.5μmol)按照上述操作反应11小时，得到目的化合物34(9.2mg，收率86％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ5.11(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝10.0Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61(d，1H，J＝6.8Hz，GlcNAc2-H-1)，4.55(d，2H，GlcNAc5，5’-H-1)，4.24(bs，1H，Man3-H-2)，4.18(bs，1H，Man4’-H-2)，4.10(bs，1H，Man4-H-2)，2.80(dd，1H，J＝3.8Hz，15.6Hz，Asn-βCH)，2.63(dd，1H，J＝8.2Hz，15.6Hz，Asn-βCH)，2.07(s，3H，Ac)，2.05(s，6H，Ac×2)，2.01(s，3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd forC54H90N6NaO38[M+Na+]1453.5，found，1453.2
参考例43  化合物35的合成
使化合物12(12.0mg，8.4μmol)按照上述操作反应11小时，得到目的化合物35(7.0mg，收率81％)。得到的化合物的物理数据如下。
1H-NMR(30℃)
δ5.10(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.78(s，1H，Man3-H-1)，4.61(d，1H，J＝8.0Hz，GlcNAc2-H-1)，4.25(bs，1H，Man3-H-2)，4.06(bs，1H，Man4’-H-2)，3.97(bs，1H，Man4-H-2)，2.79(dd，1H，J＝5.0Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.61(dd，1H，J＝7.3Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.07，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)，Calcd for C38H65N4O28[M+H+]1025.4，found，1025.2
参考例44  化合物36的合成
使化合物13(8.4μmol)按照上述操作反应11小时，得到目的化合物36。
参考例45  化合物76、77的合成及分离
使化合物2和化合物6的混合物(5.0mg，2.2μmol)溶解于220μL的水中，加入100μL的22mM碳酸铯水溶液，调到pH7.0。将该溶液进行冷冻干燥。向干燥后的固体物加入430μL的N，N-二甲基甲酰胺，再加入6.6μmo1的苄基溴/N，N-二甲基甲酰胺溶液20μL。将该溶液于氩气氛下搅拌。48小时后，通过TLC(洗脱溶剂使用1M醋酸铵∶异丙醇＝1∶2)确认原料消失后，加入4.4mL的二乙醚，使化合物沉淀。对沉淀的糖链进行过滤，使残留的糖链溶解于水，进行冷冻干燥。将冷冻干燥后的残留物通过分级HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5S-5 120A ODS No.2020178、20×250mm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝78∶22、流速4.0mL/min)纯化时，在88分钟后洗脱下化合物77，在91分钟后洗脱下化合物76。分别收集，再经ODS柱(コスモシ一ル75C18-opn、15×100mm、最初使50mL的H2O流过，然后使25％乙腈流过，进行洗脱)进行脱盐，得到化合物2的苄基体1.6mg、化合物6的苄基体1.8mg。
使化合物2的苄基体(10糖、13.6mg、5.8mmol)在冰冷条件下溶解于NaOHaq.(pH＝12)1.4ml。一边通过HPLC监测反应，一边搅拌约8小时。在反应进行到终点时，用40mMHCl将反应液调到pH＝7.0。将中和后的溶液用膜滤器过滤后，浓缩，然后通过HPLC(YMC-PackODS-AM，SH-343-5AM，20×250mm、AN/25mM醋酸铵缓冲液＝20/80，流速7.0mL/min.，波长：274nm)进行分级纯化。分级的溶液浓缩后，再通过ODS柱(Cosmoseal75C18-OPN、NACALAI TESQUE公司生产)进行脱盐处理，浓缩、冷冻干燥，得到化合物2的单一产品(6.2mg，47.4％)。
向得到的化合物2(4.0mg，1.76mmol)中加入DMSO282ml，使其溶解。然后向该反应液加入吗啉282ml，于室温下进行搅拌。一边通过TLC监测反应，一边进行约1小时反应。确认原料消失后、向反应液中加丙酮/二异丙基醚(IPE)＝1/1的溶液5ml。将该浆料用膜滤器进行过滤后，用纯化水洗脱残渣。将水层浓缩后，用凝胶柱色谱(Sephadex G-25，H2O)进行纯化。收集含有目的物的级分，浓缩后进行冷冻干燥，得到目的单唾液酸糖链天冬酰胺(化合物76)(3.3mg，收率91.5％)。
化合物76的NMR数据如下所示。
1H-NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)
δ5.22(s，1H，Man4-H1)，5.15(d，1H，J＝10.0，GlcNAc1-H1)，5.01(s，1H，Man4’-H-1)，4.85(s，1H)，4.65-4.75(m，3H)，4.54(dd，2H，Ja＝10.8，Jb＝7.6)，4.33(s，1H)，4.27(bd，1H，J＝2.4，Man4-H2)，4.19(bd，1H，J＝2.4)，2.95(dd，1H，Ja＝16.8，Jb＝4.4，Asn-βCH)，2.82(dd，1H，Ja＝16.8，Jb＝7.2，Asn-βCH)2.74(dd，1H，Ja＝12.4，Jb＝4.4，NeuAc7-H3eq)，2.16，2.15，2.13，2.11，2.09(eachs，15H，Acx5)，1.83(dd，1H，Ja＝12.4，Jb＝12.0，NeuAc7-H3ax).
使化合物6的苄基体(10糖、5.0mg、2.1mmol)在冰冷条件下溶解于NaOHaq.(pH＝12)2.0ml。一边通过HPLC监测反应，一边搅拌约5小时。在反应进行到终点时，用40mM HCl将反应液调到pH＝7.0。将中和后的溶液用膜滤器过滤后，浓缩，然后通过HPLC(YMC-PackODS-AM SH-343-5AM，20×250mm、AN/25mM醋酸铵缓冲液＝20/80，流速7.0mL/min.，波长：274nm)进行分级纯化。分级的溶液浓缩后，再通过ODS柱(Cosmoseal 75C18-OPN、NACALAI TESQUE公司生产)进行脱盐处理，浓缩、冷冻干燥，得到化合物6的单一产品(2.5mg，52.0％)。
向得到的化合物6(1.5mg，0.67mmol)中加DMSO105ml，使其溶解。然后向该反应液加吗啉105ml，于室温下进行搅拌。一边通过TLC监测反应，一边进行约1小时反应。确认原料消失后，向反应液中加丙酮/二异丙基醚(IPE)＝1/1的溶液5ml。将该浆料用膜滤器进行过滤后，用纯化水洗脱残渣。将水层浓缩后，用凝胶柱色谱(SephadexG-25，H2O)进行纯化。收集含有目的物的级分，浓缩后进行冷冻干燥，得到目的物单唾液酸糖链天冬酰胺(化合物77)(1.4mg，收率99％)。化合物77的NMR数据如下所示。
1H-NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)
δ5.20(s，1H，Man4-H1)，5.15(d，1H，J＝9.6，GlcNAc1-H1)，5.02(s，1H，Man4’-H-1)，4.85(s，1H)，4.63-4.73(m，3H)，4.53(dd，2H，Ja＝7.6，Jb＝7.2)，4.33(s，1H)，4.27(bd，1H，J＝2.4，Man4-H2)，4.19(d，1H，J＝2.0)，2.83(dd，1H，Ja＝16.0，Jb＝4.0，Asn-βCH)，2.75(dd，1H，Ja＝12.4，Jb＝4.8，NeuAc7-H3eq)2.62(dd，1H，Ja＝16.0 Jb＝8.0，Asn-βCH)，2.16，2.14，2.13，2.11，2.09(eachs，15H，Acx5)，1.79(dd，1H，Ja＝12.4，Jb＝11.6，NeuAc7-H3ax).
实施例1
将参考例1得到的化合物24(6mg，2.58mmol)溶于水(300mL)，加入碳酸氢钠(2.1mg，24.9mmol)。然后加入溶有D-(+)-生物素基琥珀酰亚胺(4.2mg，12.3mmol)的二甲基甲酰胺(300mL)，在室温下反应20分钟。用TLC(异丙醇∶1M 醋酸铵水溶液＝3∶2)确认原料消失后，用蒸发器进行浓缩。将残渣经凝胶过滤柱(f20mm×300mm，Sephadex G-25，水)纯化，得到目的化合物(6.2mg，94％)。得到的化合物的物理数据如下。
Figure A20038010531700481
1H-NMR(400mHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)
d5.22(s，1H，Man4-H1)，5.14(d，1H，GlcNAc1-H1)，5.03(s，1H，Man4’-H-1)，4.59(dd，1H)，4.86(s，1H，Man3-H1)，4.74-4.66(m，3H，，GlcNAc2，5，5’-H1)，4.53(d，2H，Gal6，6’-H1)，4.34(s，1H，Man3-H2)，4.28(bs，1H，Man4-H2)，4.19(bs，1H，Man4’-H2)，3.09(dd，2H，NeuAc7，7’-H3eq)，2.94-2.86(m，2H，biotin)，2.78-2.71(m，2H，biotin)，2.37(t，1H，biotin)，2.17，2.16，2.13，2.11(each s，Ac)，1.80(dd，2H，NeuAc7，7’-H3ax)，1.80-1.67(m，biotin)，1.52-1.47(m，biotin)，1.32(dd，biotin)
实施例2
除了使用参考例45得到的化合物76以外，其它与实施例1同样，进行生物素化。
Figure A20038010531700491
实施例3
除了使用参考例45得到的化合物77以外，其它与实施例1同样，进行生物素化。
Figure A20038010531700492
实施例4
除了使用参考例7得到的化合物33以外，其它与实施例1同样，进行生物素化。
Figure A20038010531700493
实施例5
除了使用参考例24得到的化合物26以外，其它与实施例1同样，进行生物素化。
Figure A20038010531700501
实施例6
除了使用参考例25得到的化合物27以外，其它与实施例1同样，进行生物素化。
实施例7
除了使用参考例26得到的化合物28以外，其它与实施例1同样，进行生物素化。
实施例8
除了使用参考例27得到的化合物30以外，其它与实施例1同样，进行生物素化。
实施例9
除了使用参考例28得到的化合物31以外，其它与实施例1同样，进行生物素化。
实施例10
除了使用参考例29得到的化合物32以外，其它与实施例1同样，进行生物素化。
实施例11
除了使用参考例30得到的化合物37以外，其它与实施例1同样，进行生物素化。
实施例12
除了使用参考例31得到的化合物42以外，其它与实施例1同样，进行生物素化。
实施例13
除了使用参考例32得到的化合物38以外，其它与实施例1同样，进行生物素化。
Figure A20038010531700522
实施例14
除了使用参考例33得到的化合物72以外，其它与实施例1同样，进行生物素化。
Figure A20038010531700523
实施例15
除了使用参考例34得到的化合物43以外，其它与实施例1同样，进行生物素化。
实施例16
除了使用参考例35得到的化合物73以外，其它与实施例1同样，进行生物素化。
Figure A20038010531700532
实施例17
除了使用参考例36得到的化合物39以外，其它与实施例1同样，进行生物素化。
实施例18
除了使用参考例37得到的化合物40以外，其它与实施例1同样，进行生物素化。
实施例19
除了使用参考例38得到的化合物41以外，其它与实施例1同样，进行生物素化。
实施例20
除了使用参考例39得到的化合物44以外，其它与实施例1同样，进行生物素化。
实施例21
除了使用参考例40得到的化合物45以外，其它与实施例1同样，进行生物素化。
实施例22
除了使用参考例41得到的化合物46以外，其它与实施例1同样，进行生物素化。
Figure A20038010531700552
实施例23
除了使用参考例42得到的化合物34以外，其它与实施例1同样，进行生物素化。
Figure A20038010531700553
实施例24
除了使用参考例43得到的化合物35以外，其它与实施例1同样，进行生物素化。
Figure A20038010531700561
实施例25
除了使用参考例44得到的化合物36以外，其它与实施例1同样，进行生物素化。
Figure A20038010531700562
实施例26  天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的双唾液酸基α2，3糖链天冬酰胺(C1-1)以及天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的2种单唾液酸基α2，3糖链天冬酰胺(C1-2和C1-3)的合成
使用唾液酸转移酶将CMP-唾液酸转移到参考例2得到的天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的去唾液酸基糖链天冬酰胺上。
作为唾液酸转移酶使用来自市售的Rat Recombinant的α2，3转移酶。
将参考例2得到的去唾液酸基9糖(20mg，10.1μmol)溶解于50mM二甲胂酸缓冲液(pH＝6.0，5ml)后，加入牛血清清蛋白(BSA，5mg)。然后向其加入CMP-唾液酸(26mg，40.4μmol)、碱性磷酸酶(5μl，125unit)，并进行均一化。最后加入α2，3-唾液酸转移酶(CALBIOCHEM公司生产，100μl)，于37℃下静置48小时。通过HPLC监测反应，在原料减少到目的量时刻，使反应终止，反应液用膜滤器进行过滤。将滤液浓缩，将溶液量减少后，通过HPLC分级柱(YMC-PackR&D ODS，D-ODS-5-A，20×250mm，AN/25mM醋酸铵缓冲液＝18/82，7.5mL/min.，波长：274nm)进行纯化，25分钟后，二唾液酸基11糖化合物(C1-1)被洗脱，30分钟后、34分钟后各单唾液酸基10糖化合物(C1-2)以及(C1-3)分别被洗脱下来。分别收集后，进行脱盐处理，然后进行冷冻干燥，可以得到各化合物1、2、3分别为0.7mg(2.7％)、1.9mg(8.3％)、3.5mg(15.3％)。各化合物的NMR数据如下。
化合物(C1-1)
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)
δ7.90(d，2H，Fmoc)，7.69(d，2H，Fmoc)，7.49(dd，2H，Fmoc)，7.42(dd，2H，Fmoc)，5.10(s，1H，Man4-H1)，4.97(d，1H，GlcNAc1-H1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.50-4.60(m，4H)，4.34(1H，Fmoc)，4.24(bs，1H，Man3-H2)，4.18(bs，1H，Man4-H2)，4.10(m，2H)，2.74(m，3H，Asn-βCH，NeuAc7，7’-H3eq)，2.40-2.60(m，1H，Asn-βCH)，2.05，2.03，2.02(eachs，Ac)，1.77(dd，2H，NeuAc7，7’-H3ax).
化合物(C1-2)
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)
δ7.90(d，2H，Fmoc)，7.69(d，2H，Fmoc)，7.49(dd，2H，Fmoc)，7.42(dd，2H，Fmoc)，5.10(s，1H，Man4-H1)，4.97(d，1H，GlcNAc1-H1)，4.90(s，1H，Man4’-H-1)，4.47-4.60(m)，4.43(d，1H)，4.32(1H，Fmoc)，4.22(bs，2H)，4.17(bs，1H，Man4-H2)，4.06-4.13(m，2H)，2.72(m，2H，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.50-2.60(m，1H，Asn-βCH)，2.05，2.03，2.01(each s，Ac)，1.77(dd，1H，NeuAc7-H3ax).
化合物(C1-3)
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)
δ7.90(d，2H，Fmoc)，7.69(d，2H，Fmoc)，7.49(dd，2H，Fmoc)，7.42(dd，2H，Fmoc)，5.10(s，1H，Man4-H1)，4.97(d，1H，GlcNAc1-H1)，4.90(s，1H，Man4’-H-1)，4.50-4.60(m)，4.45(d，1H)，4.33(1H，Fmoc)，4.22(m，2H)，4.17(bs，1H，Man4-H2)，4.09(m，2H)，2.74(m，2H，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.45-2.60(m，1H，Asn-βCH)，2.05，2.03，2.02，2.00(each s，Ac)，1.77(dd，1H，NeuAc7-H3ax)
Figure A20038010531700582
将得到的(C-1)～(C-3)各化合物与参考例7同样进行处理，对Fmoc基进行脱保护，得到糖链天冬酰胺。除了使用得到的糖链天冬酰胺以外，其它与实施例1同样进行生物素化。
Figure A20038010531700584
实施例27
将实施例26得到的化合物(C1-2)(2mg、0.88μmol)和牛血清清蛋白1mg溶解于100μl的HEPES缓冲液(50mM，pH5.0)中，再加入β-半乳糖苷酶(生化学工业公司生产，来自Jack Beans，5μl，100mU)。将该溶液于37℃下静置15小时后，用膜滤器进行过滤。将滤液通过HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝82∶18，流速为7.5ml/min)纯化后，对溶剂进行浓缩，然后进行冷冻干燥。将残留物溶解于200μl水中，使用ODS-柱色谱(コスモシ一ル75C18-opn、最初用水清洗，然后用25％乙腈水溶液进行洗脱)进行脱盐处理，得到目的化合物(C2)0.5μg。NMR数据如下。
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)
δ7.90(d，2H，Fmoc)，7.69(d，2H，Fmoc)，7.49(dd，2H，Fmoc)，7.42(dd，2H，Fmoc)，5.10(s，1H，Man4-H1)，4.98(d，1H，GlcNAc1-H1)，4.90(s，1H，Man4’-H-1)，4.50-4.60(m)，4.33(1H，Fmoc)，4.22(m，2H)，4.17(bs，1H，Man4-H2)，4.10(m，2H)，2.74(m，2H，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.45-2.60(m，1H，Asn-βCH)，2.05，2.03，2.01(each s，Ac)，1.78(dd，1H，NeuAc7-H3ax)
将得到的(C2)的化合物与参考例7同样进行处理，对Fmoc基进行脱保护，得到糖链天冬酰胺。除了使用得到的糖链天冬酰胺以外，其它与实施例1同样进行生物素化。
实施例28
将实施例27得到的化合物(C2)(1.8mg、0.86μmol)和牛血清清蛋白1mg一起溶解于90μl的HEPES缓冲液(50mM，pH5.0)中，再加入4μl(250mU)N-乙酰基-β-葡糖胺酶(SigmaAldrich公司生产，来自Jack Beans)。将该溶液于37℃下静置24小时后，用膜滤器进行过滤。将滤液通过HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝82∶18，流速为7.5ml/min)纯化后，对溶剂进行浓缩，然后进行冷冻干燥。将残留物溶解于200μl水中，通过ODS-柱色谱(コスモシ一ル75C18-opn、最初用水清洗，然后用25％乙腈水溶液进行洗脱)进行脱盐处理，得到目的化合物(C3)0.9μg。
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)
δ8.01(d，2H，J＝7.6，Fmoc)，7.80(d，2H，J＝7.6，Fmoc)，7.60(dd，2H，J＝7.6，Fmoc)，7.53(dd，2H，J＝7.6，Fmoc)，5.21(s，1H，Man4-H1)，5.09(d，1H，J＝8.8，GlcNAc1-H1)，5.00(s，1H，Man4’-H-1)，4.87(s，1H)，4.60-4.78(m，5H)，4.40-4.50(bm，2H)，4.34(s，1H)，4.28(bs，1H，Man4-H2)，4.20(dd，1H，Ja＝3.0，Jb＝9.9)，2.80-2.95(m，2H，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.65-2.75(m，1H，Asn-βCH)，2.16，2.14，2.12(eachs，Acx3)，1.98(s，3H，Ac)，1.89(dd，1H，Ja＝12.1，Jb＝11.9，NeuAc7-H3ax).
Figure A20038010531700601
将得到的(C3)的化合物与参考例7同样进行处理，对Fmoc基进行脱保护，得到糖链天冬酰胺。除了使用得到的糖链天冬酰胺以外，其它与实施例1同样进行生物素化。
实施例29
将实施例28得到的化合物(C3)(0.8mg、0.42μmol)和牛血清清蛋白1mg溶解于50μl的HEPES缓冲液(50mM，pH5.0)中，再加入α-甘露糖苷酶(SigmaAldrich公司生产，来自Jack Beans)30μl(2.9U)。将该溶液于37℃下静置63小时后，用膜滤器进行过滤。将滤液通过HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速为7.5ml/min)纯化后，对溶剂进行浓缩，然后进行冷冻干燥。将残留物溶解于200μl水中，使用ODS-柱色谱(コスモシ一ル75C18-opn、最初用水清洗，然后用25％乙腈水溶液进行洗脱)进行脱盐处理，得到目的化合物(C4)0.6μg。
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)
δ8.00(d，2H，J＝7.2，Fmoc)，7.79(d，2H，J＝7.2，Fmoc)，7.59(dd，2H，J＝7.2，Fmoc)，7.52(dd，2H，J＝7.2，Fmoc)，5.21(s，1H，Man4-H1)，5.09(d，1H，J＝10.0，GlcNAc1-H1)，4.60-4.75(m，)，4.40-4.50(m，2H)，4.32(bd，1H，J＝2.3)，4.28(bs，1H)，4.22(bdd，1H，Ja＝9.7，Jb＝2.8，Man4-H2)，2.80-2.95(m，2H，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.60-2.75(m，1H，Asn-βCH)，2.14，2.14，2.12(eachs，Acx3)，1.98(s，3H，Ac)，1.88(dd，1H，Ja＝12.1，Jb＝12.0，NeuAc7-H3ax).
将得到的(C4)的化合物与参考例7同样进行处理，对Fmoc基进行脱保护，得到糖链天冬酰胺。除了使用得到的糖链天冬酰胺以外，其它与实施例1同样进行生物素化。
实施例30
将实施例26得到的化合物(C1-3)(1mg、0.44μmol)和牛血清清蛋白1mg溶解于50μl的HEPES缓冲液(50mM，pH5.0)中，再加入β-半乳糖苷酶(生化学工业公司生产，来自Jack Beans，5μl，100mU)。将该溶液于37℃下静置15小时后，用膜滤器进行过滤。将滤液通过HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝82∶18，流速为7.5ml/min)纯化后，对溶剂进行浓缩，然后进行冷冻干燥。将残留物溶解于200μl水中，通过ODS-柱色谱(コスモシ一ル75C18-opn、最初用水清洗，然后用25％乙腈水溶液进行洗脱)进行脱盐处理，得到目的化合物(C5)0.3μg。
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)
δ8.01(d，2H，J＝7.2，Fmoc)，7.81(d，2H，J＝7.2，Fmoc)，7.60(dd，2H，J＝7.2，Fmoc)，7.53(dd，2H，J＝7.2，Fmoc)，5.21(s，1H，Man4-H1)，5.09(d，1H，J＝9.6，GlcNAc1-H1)，5.02(s，1H，Man4’-H-1)，4.55-4.70(m)，4.44(1H，Fmoc)，4.30-4.38(bm，2H)，4.28(bd，1H，Man4-H2)，4.17-4.25(m，2H)，2.78-2.95(m，2H，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.55-2.70(m，1H，Asn-βCH)，2.16，2.15，2.14，2.12(eachs，12H，Acx4)，1.98(s，3H，Ac)，1.89(dd，1H，Ja＝12.2，Jb＝12.0，NeuAc7-H3ax).
Figure A20038010531700621
将得到的(C5)的化合物与参考例7同样进行处理，对Fmoc基进行脱保护，得到糖链天冬酰胺。除了使用得到的糖链天冬酰胺以外，其它与实施例1同样进行生物素化。
Figure A20038010531700622
实施例31
将实施例30得到的化合物(C5)(1.0mg、0.48μmol)和牛血清清蛋白1mg一起溶解于50μl的HEPES缓冲液(50mM，pH5.0)中，再加入4μl(250mU)N-乙酰基-β-葡糖胺酶(SigmaAldrich公司生产，来自Jack Beans)。将该溶液于37℃下静置22小时后，用膜滤器进行过滤。将滤液通过HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝82∶18，流速为7.5ml/min)纯化后，对溶剂进行浓缩，然后进行冷冻干燥。将残留物溶解于200μl水中，通过ODS-柱色谱(コスモシ一ル75C18-opn、最初用水清洗，然后用25％乙腈水溶液进行洗脱)进行脱盐处理，得到目的化合物(C6)0.6μg。
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)
δ8.01(d，2H，J＝7.6，Fmoc)，7.80(d，2H，J＝7.6，Fmoc)，7.60(dd，2H，J＝7.6，Fmoc)，7.53(dd，2H，J＝7.6，Fmoc)，5.19(s，1H，Man4-H1)，5.09(d，1H，J＝9.2，GlcNAc1-H1)，5.02(s，1H，Man4’-H-1)，4.85(s，1H)4.58-4.75(m，5H)，4.38-4.48(m，2H，Fmoc)，4.40(bd，J＝2.4，1H)，4.18-4.25(m，2H)，4.15(m，1H)，2.80-2.95(m，2H，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.65-2.75(m，1H，Asn-βCH)，2.16，2.13，2.12(eachs，9H，Acx3)，1.98(s，3H，Ac)，1.89(dd，1H，Ja＝12.2，Jb＝12.0，NeuAc7-H3ax).
Figure A20038010531700631
将得到的(C6)的化合物与参考例7同样进行处理，对Fmoc基进行脱保护，得到糖链天冬酰胺。除了使用得到的糖链天冬酰胺以外，其它与实施例1同样进行生物素化。
Figure A20038010531700632
实施例32
将实施例31得到的化合物(C6)(1.0mg、0.53μmol)和牛血清清蛋白1mg溶解于50μl的HEPES缓冲液(50mM，pH5.0)中，再加入α-甘露糖苷酶(SigmaAldrich公司生产，来自Jack Beans)10μL(0.9U)。将该溶液于37℃下静置20小时后，用膜滤器进行过滤。将滤液通过HPLC(ODS柱、2.0φ×25cm、洗脱溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速为7.5ml/min)纯化后，对溶剂进行浓缩，然后进行冷冻干燥。将残留物溶解于200μl水中，通过ODS-柱色谱(コスモシ-ル75C18-opn、最初用水清洗，然后用25％乙腈水溶液进行洗脱)进行脱盐处理，得到目的化合物(C7)0.5μg。
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)
δ8.01(d，2H，J＝7.6，Fmoc)，7.81(d，2H，J＝7.6，Fmoc)，7.60(dd，2H，J＝7.2，Fmoc)，7.53(dd，2H，J＝7.6，Fmoc)，5.09(d，1H，J＝9.2，GlcNAc1-H1)，5.01(s，1H，Man4’-H-1)，4.84(s，1H)，4.55-4.70(m，5H)，4.44(t，1H，J＝6.0，Fmoc)，4.30-4.38(bs，1H)，4.15-4.25(m，2H)，4.17(s，1H)，2.80-2.95(m，2H，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.55-2.70(m，1H，Asn-βCH)，2.16，2.13，2.12(eachs，Acx3)，1.98(s，3H，Ac)1.89(dd，1H，Ja＝12.2，Jb＝12.3，NeuAc7-H3ax).
将得到的(C7)的化合物与参考例7同样进行处理，对Fmoc基进行脱保护，得到糖链天冬酰胺。除了使用得到的糖链天冬酰胺以外，其它与实施例1同样进行生物素化。
Figure A20038010531700642
实施例33
天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的双唾液酸基(α2，6)(α2，3)糖链天冬酰胺的合成
使用唾液酸转移酶将CMP-唾液酸转移到参考例45得到的天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的单唾液酸基糖链天冬酰胺(化合物2)上。
作为唾液酸转移酶使用市售的来自Rat Recombinant的α2，3转移酶。
将参考例45得到的化合物2(1.7mg，0.75μmol)溶解于50mM二甲胂酸缓冲液(pH＝5.0，85μl)后，加入牛血清清蛋白(BSA，1mg)。然后向其加入CMP-唾液酸(4.8mg，7.5μmol)、碱性磷酸酶(1μl，75unit)，并进行均一化。最后加入α2，3-唾液酸转移酶(CALBIOCHEM公司生产，75μl，34mU)，于37℃下静置3.5小时。通过HPLC监测反应，在原料消失的时刻，使反应终止，反应液用膜滤器进行过滤。将滤液浓缩，将溶液量减少后，通过HPLC分级柱(YMC-Pack R&D ODS，D-ODS-5-A，20×250mm、AN/25mM醋酸铵缓冲液＝18/82，7.5mL/min.，波长：274nm)进行纯化。25分钟后化合物(C7A)被洗脱下来。分别收集后，进行脱盐处理，然后进行冷冻干燥，可以得到化合物(C7A)1.3mg(67.8％)。化合物的NMR数据如下。
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)
δ8.00(d，2H，J＝7.2，Fmoc)，7.79(d，2H，J＝7.2，Fmoc)，7.60(dd，2H，J＝7.2，Fmoc)，7.52(dd，2H，J＝7.2，Fmoc)，5.21(s，1H，Man4-H1)，5.09(d，1H，J＝8.8，GlcNAc1-H1)，5.03(s，1H，Man4’-H-1)，4.86(s，1H)，4.58-4.72(m，5H)，4.54(d，1H，J＝8.0)，4.38-4.48(m，2H)4.34(bs，1H)，4.28(bs，1H)，4.15-4.25(m，2H)，2.80-2.86(dd，1H，Ja＝4.4，Jb＝12.4，NeuAc7-H3eq)，2.73-2.83(m，dd，3H，Ja＝4.4，Jb＝12.4，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.60-2.72(m，1H，Asn-βCH)，2.16，2.15，2.14，2.12(each s，Ac x5)，1.98(s，3H，Ac)，1.89(dd，1H，Ja＝12.4，Jb＝12.0，NeuAc7-H3ax)，1.81(dd，1H，Ja＝12.4，Jb＝12.0，NeuAc7-H3ax).
将得到的(C7A)的化合物与参考例7同样进行处理，对Fmoc基进行脱保护，得到糖链天冬酰胺。除了使用得到的糖链天冬酰胺以外，其它与实施例1同样进行生物素化。
实施例34
天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的双唾液酸基(α2，3)(α2，6)糖链天冬酰胺的合成
使用唾液酸转移酶将CMP-唾液酸转移到参考例45得到的天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的单唾液酸基糖链天冬酰胺(化合物6)上。
作为唾液酸转移酶使用市售的来自Rat Recombinant的α2，3转移酶。
将参考例45得到的化合物6(1.2mg，0.53μmol)溶解于50mM二甲胂酸缓冲液(pH＝5.0，60μl)后，加牛血清清蛋白(BSA，1mg)。然后加入CMP-唾液酸(3.4mg，5.3μmol)、碱性磷酸酶(1μl，75unit)，并进行均一化。最后加入α2，3-唾液酸转移酶(CALBIOCHEM公司生产，52.9μl，24mU)，于37℃下静置3小时。通过HPLC监测反应，在原料全部消耗的时刻，使反应终止，反应液用膜滤器进行过滤。将滤液浓缩，将溶液量减少后，通过HPLC分级柱(YMC-Pack R&D ODS，D-ODS-5-A，20×250mm、AN/25mM醋酸铵缓冲液＝18/82，7.5mL/min.，波长：274nm)进行纯化，23分钟后化合物(C7B)被洗脱下来。分别收集后，进行脱盐处理，然后进行冷冻干燥，可以得到各化合物(C7B)1.1mg(81.2％)。各化合物的NMR数据如下。
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)
δ8.00(d，2H，J＝7.6，Fmoc)，7.79(d，2H，J＝7.6，Fmoc)，7.59(dd，2H，J＝7.6，Fmoc)，7.51(dd，2H，J＝7.6，Fmoc)，5.21(s，1H，Man4-H1)，5.08(d，1H，J＝10.0，GlcNAc1-H1)，5.00(s，1H，Man4’-H-1)，4.84(s，1H)，4.60-4.72(m，5H)，4.52(d，1H，J＝7.6)，4.35-4.45(m，2H)，4.33(bs，1H)，4.27(bs，1H)，4.15-4.25(m，2H)，2.80-2.86(dd，1H，Ja＝4.8，Jb＝12.4，NeuAc7-H3eq)，2.73-2.83(bs，dd，3H，Ja＝4.8，Jb＝12.4，Asn-βCH，NeuAc7-H3eq)，2.60-2.72(m，1H，Asn-βCH)，2.15，2.12，2.10(each s，Ac x5)，1.97(s，3H，Ac)，1.88(dd，1H，Ja＝12.4，Jb＝12.4，NeuAc7-H3ax)，1.80(dd，1H，Ja＝12.4，Jb＝12.4，NeuAc7-H3ax).
Figure A20038010531700671
将得到的(C7B)的化合物与参考例7同样进行处理，对Fmoc基进行脱保护，得到糖链天冬酰胺。除了使用得到的糖链天冬酰胺以外，其它与实施例1同样进行生物素化。
Figure A20038010531700672
实施例35～52
使参考例2、8～10、12、14、17、45、实施例26～32中制造的各Fmoc-糖链天冬酰胺2nmol溶解于约10ml的Tris-HCl缓冲液。向该溶液中加入GDP-岩藻糖200nmol、岩藻糖基转移酶V(Human，Recombinant)0.5mU，于37℃下静置约2小时，使其反应。将反应液用超纯水20ml稀释后，通过毛细管电泳(fused silica capillary，50mm i.d.，60cm，buffer；100mM Tris-borate，pH＝8.3，100mM Heptanesulfonate，外加电压27kV，温度25℃，214mm)进行分离，得到含有岩藻糖的糖链天冬酰胺衍生物。将得到的上述糖链天冬酰胺衍生物与参考例7同样进行处理，对Fmoc基进行脱保护，得到糖链天冬酰胺。除了使用得到的糖链天冬酰胺以外，其它与实施例1同样进行生物素化。得到的生物素化糖链天冬酰胺如下所示。
实施例35
实施例36
实施例37
Figure A20038010531700692
实施例38
实施例39
Figure A20038010531700702
实施例40
Figure A20038010531700703
实施例41
Figure A20038010531700704
实施例42
实施例43
Figure A20038010531700706
实施例44
实施例45
Figure A20038010531700712
实施例46
实施例47
Figure A20038010531700722
实施例48
实施例49
实施例50
Figure A20038010531700731
实施例51
实施例52
实施例53
使双唾液酸糖链天冬酰胺(化合物24)(11糖、1.4mg、0.60mmol)溶解于70ml纯水中。然后向该溶液中加丙酮70ml、NaHCO3(0.76mg，9mmol)，于室温下搅拌后，加入异硫氰酸荧光素(FITC，0.95mg，2.4mmol，Aldrich公司生产)，搅拌约2小时。2小时后，用TLC确认反应结束后，在减压下经蒸馏除去丙酮，将剩余水溶液加到凝胶柱色谱(Sephadex G-25、H2O)进行纯化，收集含有目的物的级分。将收集的级分浓缩后，经HPLC(YMC-Pack ODS＝AM，SH-343-5AM，20×250mm，AN/25mM AcONH4 缓冲液＝10/90，7.5ml/min.，波长；274nm)分级后，通过用凝胶柱色谱(Sephadex G-25、H2O)进行脱盐处理。收集含有目的物的级分，浓缩后进行冷冻干燥，得到目的物FITC化的双唾液酸糖链衍生物(1.2mg，收率73.5％)。
1H NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)
δ7.86(d，1H，J＝2.0，FITC)，7.75(dd，1H，Ja＝8.0，Jb＝2.0，FITC)，7.46(d，1H，J＝8.0，FITC)，7.41(d，1H，J＝9.6，FITC)，6.71-6.83(bm，4H，FITC)，5.22(s，1H，Man4-H1)，5.10-5.20(bm，2H，GlcNAc1-H1)，5.03(s，1H，Man4’-H-1)，4.70-4.80(m，3H)，4.53(d，2H，J＝8.0)，4.33(s，1H，Man3-H-2)，4.27(bs，1H，Man4-H-2)，4.18(s，1H，Man4-H-2)，2.90-3.00(m，1H，Asn-βCH)，2.85-2.95(m，1H，Asn-βCH)，2.75(dd，2H，Ja＝12.0，Jb＝2.8，NeuAc7-H3ex)，2.15，2.14，2.12，2.09(eachs，18H，Acx6)，1.80(dd，2H，Ja＝12.0，Jb＝12.0，NeuAc7-H3ax).
实施例54
使用化合物76代替化合物24，与实施例53同样地进行FITC化。
实施例55
使用化合物77代替化合物24，与实施例53同样地进行FITC化。
Figure A20038010531700742
实施例56
使用化合物33代替化合物24，与实施例53同样地进行FITC化。
Figure A20038010531700743
得到的FITC化糖链天冬酰胺的NMR数据如下所示。
1H-NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)
δ7.88(d，1H，J＝2.0，FITC)，7.76(dd，1H，Ja＝8.0，Jb＝2.0，FITC)，7.46(d，1H，J＝8.0，FITC)，7.45(d，1H，J＝8.8，FITC)，6.85-6.93(m，4H，FITC)，5.21(s，1H，Man4-H1)，5.05-5.20(bd，2H，GlcNAc1-H1)，5.01(s，1H，Man4’-H-1)，4.67(d，3H，J＝7.6)，4.55(d，2H)，4.34(s，1H，Man3-H-2)，4.28(bs，1H，Man4-H-2)，4.20(s，1H，Man4-H-2)，3.00-3.10(bm，1H，Asn-βCH)，2.90-3.00(m，1H，Asn-βCH)，2.75(dd，2H，Ja＝12.0，Jb＝2.8，NeuAc7-H3ex)，2.14，2.13，2.12，2.08(eachs，12H，Acx4).
实施例57
使用化合物26代替化合物24，与实施例53同样地进行FITC化。
实施例58
使用化合物27代替化合物24，与实施例53同样地进行FITC化。
Figure A20038010531700752
实施例59
使用化合物28代替化合物24，与实施例53同样地进行FITC化。
实施例60
使用化合物30代替化合物24，与实施例53同样地进行FITC化。
实施例61
使用化合物31代替化合物24，与实施例53同样地进行FITC化。
Figure A20038010531700761
实施例62
使用化合物32代替化合物24，与实施例53同样地进行FITC化。
Figure A20038010531700762
实施例63
使用化合物37代替化合物24，与实施例53同样地进行FITC化。
实施例64
使用化合物42代替化合物24，与实施例53同样地进行FITC化。
Figure A20038010531700764
实施例65
使用化合物38代替化合物24，与实施例53同样地进行FITC化。
Figure A20038010531700765
实施例66
使用化合物72代替化合物24，与实施例53同样地进行FITC化。
实施例67
使用化合物43代替化合物24，与实施例53同样地进行FITC化。
Figure A20038010531700772
实施例68
使用化合物73代替化合物24，与实施例53同样地进行FITC化。
Figure A20038010531700773
实施例69
使用化合物39代替化合物24，与实施例53同样地进行FITC化。
Figure A20038010531700774
实施例70
使用化合物40代替化合物24，与实施例53同样地进行FITC化。
实施例71
使用化合物41代替化合物24，与实施例53同样地进行FITC化。
实施例72
使用化合物44代替化合物24，与实施例53同样地进行FITC化。
实施例73
使用化合物45代替化合物24，与实施例53同样地进行FITC化。
实施例74
使用化合物46代替化合物24，与实施例53同样地进行FITC化。
实施例75
使用化合物34代替化合物24，与实施例53同样地进行FITC化。
Figure A20038010531700784
实施例76
使用化合物35代替化合物24，与实施例53同样地进行FITC化。
Figure A20038010531700785
实施例77
使用化合物36代替化合物24，与实施例53同样地进行FITC化。
Manβ1→4GlcNAcβ1→4GlcNAc→Asn-FITC
实施例78
与参考例7同样地对实施例26得到的(C-1)～(C-3)的各化合物进行处理，对Fmoc基进行脱保护，得到糖链天冬酰胺。除了使用得到的糖链天冬酰胺以外，其它与实施例53同样地进行FITC化。
Figure A20038010531700791
Figure A20038010531700792
实施例79
与参考例7同样地对实施例27得到的(C2)的各化合物进行处理，对Fmoc基进行脱保护，得到糖链天冬酰胺。除了使用得到的糖链天冬酰胺以外，其它与实施例53同样地进行FITC化。
实施例80
与参考例7同样地对实施例28得到的(C3)的各化合物进行处理，对Fmoc基进行脱保护，得到糖链天冬酰胺。除了使用得到的糖链天冬酰胺以外，其它与实施例53同样地进行FITC化。
实施例81
与参考例7同样地对实施例29得到的(C4)的各化合物进行处理，对Fmoc基进行脱保护，得到糖链天冬酰胺。除了使用得到的糖链天冬酰胺以外，其它与实施例53同样地进行FITC化。
实施例82
与参考例7同样地对实施例30得到的(C5)的各化合物进行处理，对Fmoc基进行脱保护，得到糖链天冬酰胺。除了使用得到的糖链天冬酰胺以外，其它与实施例53同样地进行FITC化。
Figure A20038010531700802
实施例83
与参考例7同样地对实施例31得到的(C6)的各化合物进行处理，对Fmoc基进行脱保护，得到糖链天冬酰胺。除了使用得到的糖链天冬酰胺以外，其它与实施例53同样地进行FITC化。
实施例84
与参考例7同样地对实施例32得到的(C7)的各化合物进行处理，对Fmoc基进行脱保护，得到糖链天冬酰胺。除了使用得到的糖链天冬酰胺以外，其它与实施例53同样地进行FITC化。
Figure A20038010531700804
实施例85
与参考例7同样地对实施例33得到的(C7A)的各化合物进行处理，对Fmoc基进行脱保护，得到糖链天冬酰胺。除了使用得到的糖链天冬酰胺以外，其它与实施例53同样地进行FITC化。
实施例86
与参考例7同样地对实施例34得到的(C7B)的各化合物进行处理，对Fmoc基进行脱保护，得到糖链天冬酰胺。除了使用得到的糖链天冬酰胺以外，其它与实施例53同样地进行FITC化。
实施例87～104
使用实施例35～52得到的含有岩藻糖的糖链天冬酰胺衍生物，与实施例53同样地进行FITC化。
实施例87
Figure A20038010531700813
Figure A20038010531700821
实施例88
Figure A20038010531700822
实施例89
Figure A20038010531700831
实施例90
实施例91
Figure A20038010531700833
实施例92
Figure A20038010531700834
实施例93
实施例94
Figure A20038010531700841
实施例95
实施例96
实施例97
Figure A20038010531700851
实施例98
Figure A20038010531700852
实施例99
Figure A20038010531700861
实施例100
实施例101
实施例102
实施例103
实施例104
Figure A20038010531700866
实施例105(微型板的制造)
对于96孔BD生物包被链霉抗生物素蛋白(バイオコ-トストレプトアビジン)(BDBioscience公司生产：生物分析用、结合能：5ng/1孔)，将实施例1的生物素化糖链天冬酰胺100μg(相当生物素结合能的约10倍的量)溶于蒸馏水，调整到1000μl。将该调整溶液按照每孔10μl加到各个孔中，用蒸馏水洗3次，制造微型板。各生物素化糖链天冬酰胺的结合收率为95％以上。固定化率的确认由洗出的非固定化糖链残量算出。
实施例106(亲和柱的制造)
将抗生物素蛋白包被珠(アビジンコ-トビ-ズ)(HitachiSoftware Engineering公司生产、xMAP LumAvidin DevelopmentMicrospheres 1ml)10ml与实施例1的生物素化糖链天冬酰胺30mg于浆料状态下搅拌，过滤珠，清洗。清洗使用珠体积的2倍量的蒸馏水，在滤纸上进行3次清洗。固定化的确认由洗净回收的生物素化糖链天冬酰胺的残余量确认。然后将上述的生物素化糖链天冬酰胺固定珠10ml用30ml的蒸馏水直接以浆料状态充填到玻璃制的空心的色谱柱(φ20mm、长300mm)中，制造亲和柱。
                         表1
Figure A20038010531700871
Figure A20038010531700882
Figure A20038010531700886
                              表2
Figure A20038010531700894
Manβ1→4GlcNAcβ1→4GlcNAc→Asn
                            (36)
Figure A20038010531700895
Figure A20038010531700901
                          表3
Figure A20038010531700905
Figure A20038010531700911
Figure A20038010531700912
Figure A20038010531700914
Figure A20038010531700915
Figure A20038010531700916
                           表4
Figure A20038010531700922
Figure A20038010531700924
Figure A20038010531700931
                               表5
Figure A20038010531700932
Figure A20038010531700936
Manβ1→4GlcNAcβ1→4G1cNAc→Asn-Fmoc
                    (13)
                             表6
Figure A20038010531700944
Figure A20038010531700952
Figure A20038010531700953
Figure A20038010531700954
Figure A20038010531700955
Figure A20038010531700956
Figure A20038010531700961
根据本发明可以获得对天冬酰胺的氨基氮进行了生物素化或FITC化的糖链天冬酰胺。
另外根据本发明，利用生物素·抗生物素蛋白的结合特异性，只使生物素化的许多糖链在被抗生物素蛋白化的微型板上反应便可以简单地制造糖链微芯片。通过该微芯片可以阐明具有与特定糖链结合能力的蛋白质。
另外，以对某一特定的蛋白质进行分离纯化为目的，通过将特定的生物素化的糖链结合、固定于抗生物素蛋白化的亲和柱，使含有与生物素化的糖链具有特异结合能力的蛋白质的混合物通过上述柱子，可以只分离目的蛋白质。
另外，本发明中得到的FITC化糖链天冬酰胺在例如活体组织中的糖类受体的研究、植物凝集素的糖结合特异性的研究上有用。

Claims (14)

1.下式(1)表示的含有11～3糖的糖链天冬酰胺衍生物，
Figure A2003801053170002C1
式中，R1和R2是氢原子、式(2)～(6)表示的基团，可以相同，也可以不同，Q表示生物素基或FITC基。
Figure A2003801053170002C2
2.式(1)中R1与R2的一方必须是式(2)或式(3)表示的基团的含有11～7糖的(α2，3)或(α2，6)糖链天冬酰胺衍生物。
3.式(1)中R1是式(2)表示的基团，R2是式(3)表示的基团的含有11糖的(α2，3)(α2，6)糖链天冬酰胺衍生物。
4.式(1)的R1是式(3)表示的基团，R2是式(2)表示的基团的含有11糖的(α2，3)(α2，6)糖链天冬酰胺衍生物。
5.在天冬酰胺的氨基氮被生物素基或FITC基改性的糖链天冬酰胺的非还原末端侧的N-乙酰葡糖胺上至少含有一个以上岩藻糖的糖链天冬酰胺衍生物。
6.权利要求5所述的含有岩藻糖的糖链天冬酰胺衍生物，其中，天冬酰胺的氨基氮被生物素基或FITC基改性的糖链天冬酰胺是式(1)表示的含有11～3糖的糖链天冬酰胺衍生物。
7.权利要求5所述的含有岩藻塘的糖链天冬酰胺衍生物，其中，天冬酰胺的氨基氮被生物素基或FITC基改性的糖链天冬酰胺是权利要求3的含有11糖的(α2，3)(α2，6)糖链天冬酰胺衍生物。
8.权利要求5所述的含有岩藻塘的糖链天冬酰胺衍生物，其中，天冬酰胺的氨基氮被生物素基或FITC基改性的糖链天冬酰胺是权利要求4的含有11糖的(α2，3)(α2，6)糖链天冬酰胺衍生物。
9.权利要求5所述的含有岩藻塘的糖链天冬酰胺衍生物，其中，天冬酰胺的氨基氮被生物素基或FITC基改性的糖链天冬酰胺是式(1)中R1和R2是氢原子、式(2)表示的基团、或式(4)～(6)表示的基团，R1和R2中的一方必须是式(2)或式(4)表示的基团的含有11～6糖的α2，3糖链天冬酰胺衍生物。
10.权利要求5所述的含有岩藻塘的糖链天冬酰胺衍生物，其中，天冬酰胺的氨基氮被生物素基或FITC基改性的糖链天冬酰胺是式(1)中R1和R2是氢原子、式(3)表示的基团、或式(4)～(6)表示的基团，R1和R2中的一方必须是式(3)或式(4)表示的基团的含有11～6糖的α2，6糖链天冬酰胺衍生物。
11.生物素化糖链天冬酰胺的制造方法，其特征在于：对式(7)表示的含有11～3糖的糖链天冬酰胺进行生物素化，
Figure A2003801053170004C1
式中，R1和R2与上述相同。
12.FITC化糖链天冬酰胺的制造方法，其特征在于：对式(7)表示的含有11～3糖的糖链天冬酰胺进行异硫氰酸荧光素(FITC)化。
13.使权利要求1～10所述的生物素化糖链天冬酰胺结合的微型板。
14.使权利要求1～10所述的生物素化糖链天冬酰胺结合的亲和柱。
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