JPH07224082A

JPH07224082A - アスパラギン結合型糖誘導体及びその製法

Info

Publication number: JPH07224082A
Application number: JP6017443A
Authority: JP
Inventors: Ichiro Matsuo; 一郎松尾; Katsumi Ajisaka; 勝美鰺坂; Tomoya Ogawa; 智也小川
Original assignee: Meiji Milk Products Co Ltd; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research; Meiji Dairies Corp
Priority date: 1994-02-14
Filing date: 1994-02-14
Publication date: 1995-08-22

Abstract

(57)【要約】【構成】一般式（１）【化１】〔式中、Ｒ¹は水素原子又はα−アミノ基の保護基を示
し、Ｒ²は水素原子又はカルボキシル基の保護基を示
し、Ｒ^3a及びＲ^4aは同一又は異なって水素原子又は中性
条件下で脱離可能な基を示し、Ｘは保護されていてもよ
いアミノ基を示す〕で表わされるアスパラギン結合型糖
誘導体、その中間体及びそれらの製造法。【効果】この化合物（１）は、どのような構造のアス
パラギン結合型糖鎖の合成にも対応できるのみならず、
不溶性の樹脂上でペプチド鎖を伸長させていくペプチド
固相合成法に組み入れ、更に大きな糖ペプチドにするこ
とも容易である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は種々の糖ペプチド、糖蛋
白質及び複合型糖アスパラギン等の合成中間体として有
用なアスパラギン結合型糖誘導体、五糖グリコシルアジ
ド及びそれらの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】アスパラギン結合型糖鎖は、高マンノー
ス型、複合型及び混成型に分類されるが、これらは何れ
もＭａｎα１→６（Ｍａｎα１→３）Ｍａｎβ１→４Ｇ
ｌｃＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃで示される共通の五糖
母核構造を持っている。この五糖の還元末端のＮ−アセ
チルグルコサミン残基と、Ｌ−アスパラギンあるいはポ
リペプチド鎖上のアスパラギン残基とが、β−Ｎ−グリ
コシド結合したアスパラギン結合型糖誘導体は、蛋白性
医薬品原料の中間体として、あるいは糖蛋白質糖鎖の機
能改変材料として極めて有用である。

【０００３】しかしながら、これまでに化学合成された
アスパラギン結合型糖誘導体の糖鎖部分は、水酸基がア
セチル基で保護された単糖若しくは二、三糖〔Gunther,
W.and Kunz, H. (1990) Angew. Chem. Int. Ed. Engl.
29, 1050-1051〕であり、四糖以上については、羊の尿
由来の天然オリゴ糖（七糖）の報告〔Nakabayashi,S.,
Warren, C. D. and Jeanloz, R. W. (1988) Carbohydr.
Res. 174, 279-289〕が唯一である。

【０００４】通常アスパラギン結合型糖誘導体を化学合
成する場合、Ｎ−アセチルグルコサミン残基のＣ−１位
にアジド基を導入した後、これを還元してグリコシルア
ミンとし、次いでアスパラギン酸あるいはペプチド鎖上
のアスパラギン酸残基にカルボジイミドなどの縮合剤を
用いて、β−Ｎ−グリコシド結合させる。しかしなが
ら、アジド基を導入してグルコシルアジドに変換する方
法は、単糖以外では殆どなく一般性がない。

【０００５】また、糖の水酸基の保護基には、通常アセ
チル基やベンゾイル基などのアシル系の保護基が用いら
れているが、アシル系保護基の脱保護は塩基性条件下で
行う必要があり、糖鎖に結合したアミノ酸のラセミ化が
避けられないという問題があった。

【０００６】一方、糖の水酸基の保護基として中性条件
下で容易に脱離できるベンジル基を用いた五糖がポール
センらによって報告されている〔Paulsen,H.and Lebuh
n,R.(1984)Carbohydr.Res.130,85-101〕が、この五糖は
Ｎ−アセチルグルコサミン残基のＣ−１位がベンジル保
護されていることから直接アスパラギン酸を導入するこ
とができない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】このように従来、アス
パラギン結合型糖鎖の母核であるアスパラギン結合型五
糖は未だ合成されていない。従って、本発明の目的は種
々のアスパラギン結合型糖鎖合成の中間体として有用な
アスパラギン結合型五糖類及びその製造法を提供するこ
とにある。また、本発明は当該アスパラギン結合型五糖
類の合成中間体、更には種々の糖類の合成中間体として
有用な五糖グリコシルアジド及びその製造法を提供する
ことにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
糖鎖部分の合成方法及び得られた糖鎖とアスパラギン酸
あるいはペプチド上のアスパラギン残基との結合反応に
ついて種々検討した結果、糖鎖部分の水酸基の保護基の
選択、糖の１位へのアジド基の導入方法、アジド基の導
入された糖を受容体として非還元末端に糖を伸長する方
法、及び得られたグリコシルアジドを還元してグリコシ
ルアミンとした後、これを単離することなくアスパラギ
ン酸無水物又は活性エステルとβ−Ｎ−グリコシド結合
させる方法を開発した。これらの方法を利用することに
より、目的とする五糖グリコシルアジド及びアスパラギ
ン結合型糖誘導体が得られることを見出し、本発明を完
成するに至った。

【０００９】すなわち、本発明は次の一般式（１）

【００１０】

【化９】

【００１１】〔式中、Ｒ¹は水素原子又はα−アミノ基
の保護基を示し、Ｒ²は水素原子又はカルボキシル基の
保護基を示し、Ｒ^3a及びＲ^4aは同一又は異なって水素原
子又は中性条件下で脱離可能な水酸基の保護基を示し、
Ｘは保護されていてもよいアミノ基を示す〕で表わされ
るアスパラギン結合型糖誘導体及びその製造法に係るも
のである。

【００１２】また、本発明は次の一般式（２）

【００１３】

【化１０】

【００１４】〔式中、Ｒ³及びＲ⁴は同一又は異なって
水素原子、アシル基又は中性条件下で脱離可能な水酸基
の保護基を示し、Ｘは保護されていてもよいアミノ基を
示す〕で表わされる五糖グリコシルアジド及びその製造
法に係るものである。

【００１５】本発明において、α−アミノ基の保護基と
しては、通常ペプチド合成の際に利用されるα−アミノ
基の保護基であれば特に制限されないが、ウレタン型保
護基、アシル型保護基、アルキル型保護基、チオエーテ
ル型保護基、イミノ型保護基等が挙げられる。ここで、
ウレタン型保護基としてはベンジルオキシカルボニル、
置換ベンジルオキシカルボニル、フルオレニルメトキシ
カルボニル等のアラルキルオキシカルボニル基；ｔ−ブ
トキシカルボニルに代表されるアルキルオキシカルボニ
ル基；トリフェニルホスフィノエチルオキシカルボニ
ル、メチルスルフェニルエチルオキシカルボニル等の置
換アルキルオキシカルボニル基；アリルオキシカルボニ
ルに代表されるアルケニルオキシカルボニル基；フェノ
キシカルボニル等のアリールオキシカルボニル基等が挙
げられる。アシル型保護基としては、アセチル基等のア
ルカノイル基；ｏ−ニトロフェニルチオアセチル基等の
アリールチオアセチル基等が挙げられる。アルキル型保
護基としてはベンジル、ベンズヒドリル、トリフェニル
メチル基等のアラルキル基が挙げられる。チオエーテル
型保護基としては、トリフェニルメチルチオ、ジニトロ
フェニルチオ、トリクロロフェニルチオ等のアラルキル
チオ基又は置換フェニルチオ基が挙げられる。また、イ
ミノ型保護基としては、置換ベンジリデン基等が挙げら
れる。これらのα−アミノ基の保護基のうち、ウレタン
型保護基が特に好ましい。

【００１６】カルボキシル基の保護基としては、通常ペ
プチド合成の際に利用されるカルボキシル保護基であれ
ば特に制限されないが、メチル、エチル、ｔ−ブチル、
アリル等のアルキル又はアルケニル基；ベンジル、置換
ベンジル、２−トリフルオロメチル−６−クロモニルメ
チル、スルホベンジル、９−フルオレニルメチル等のア
ラルキル基；フェナシル、ｐ−メトキシフェナシル等の
アリルカルボニルメチル基；カルバモイルメチル、メチ
ルチオメチル、トリフェニルホスフィノエチル等の置換
アルキル基等が挙げられる。これらのカルボキシル保護
基のうちアラルキル基が特に好ましい。

【００１７】中性条件下で脱離可能な水酸基の保護基と
しては、エーテル系保護基、エステル系保護基が挙げら
れる。当該エーテル系保護基としては、ベンジル基、ｐ
−メトキシベンジル基、アリル基、有機シリル基、トリ
チル基等が挙げられる。エステル系保護基としてはアリ
ルオキシカルボニル基等が挙げられる。

【００１８】また、Ｘで示される基としては、前記α−
アミノ基の保護基で保護されたアミノ基と同じものがあ
げられるが、より好ましくは炭素数２〜６のアルカノイ
ルアミド、フタルイミド等が挙げられる。また、アシル
基としては、前記アシル型保護基と同じものが挙げられ
るが、炭素数２〜６のアルカノイル基が特に好ましい。

【００１９】本発明化合物（１）及び（２）は、例えば
次に示す反応式に従って製造される。

【００２０】

【化１１】

【００２１】

【化１２】

【００２２】

【化１３】

【００２３】

【化１４】

【００２４】

【化１５】

【００２５】〔式中、Ｒ^1aはα−アミノ基の保護基を示
し、Ｒ^2aはカルボキシル基の保護基を示し、Ｒ^3b及びＲ
^4bは同一又は異なってアシル基又は中性条件下で脱離可
能な基を示し、Ｘ′は保護アミノ基を示し、Ｙはハロゲ
ン原子を示し、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ ³、Ｒ⁴、Ｒ^3a、Ｒ^4a及
びＸは前記と同じ〕

【００２６】（１）式（６）で示されるトリクロロア
セトイミデート体又は式（７）で示されるグリコシルハ
ライドを、活性化剤ＢＦ₃・Ｅｔ₂Ｏ又はＣｐ₂ＨｆＣｌ₂
／ＡｇＣｌＯ₄の存在下、トリメチルシリルアジドで処
理し、次いでＲ^4bを脱保護して式（９）で示されるグル
コシルアジドを得；（２）このグリコシルアジド（糖受容体）に、式（１
５）で示される二糖性フルオリド（糖供与体）を、活性
化剤の存在下β−グリコシド結合させ、次いでＲ ^4bを脱
保護して、式（４）で示される三糖性グリコシルアジド
を得；（３）この三糖性グリコシルアジド（糖受容体）に、
式（５）で示される単糖類（糖供与体）を、活性化剤存
在下α−グリコシド結合させ、次いで所望により脱保
護、アシル化して、式（２）及び（２ａ）で示される五
糖性のグリコシルアジドを得；（４）この五糖性グリコシルアジド（２ａ）と式
（３）で示されるアスパラギン酸の無水物又は活性エス
テルとを接触水素化還元触媒の存在下に反応させ、所望
により脱保護することにより、一般式（１）で示される
アスパラギン結合型糖誘導体を得る。

【００２７】化合物（８）は、まず糖１位の水酸基以外
の水酸基及びアミノ基が保護されたグルコサミンを一般
的に用いられる糖供与体へと変換し、次いでこれらの糖
供与体をＢＦ₃・Ｅｔ₂Ｏ又はＣｐ₂ＨｆＣｌ₂／ＡｇＣｌ
Ｏ₄などの活性化剤の存在下トリメチルシリルアジド
（ＴＭＳＮ₃）と反応させることにより得られる。即
ち、保護グルコサミンにチオニルクロライド、チオニル
ブロマイド、三フッ化ジエチルアミノ硫黄（ＤＡＳＴ）
等のハロゲン化剤を反応させてグリコシルハライド（Ｃ
ｌ、Ｂｒ、Ｆ）（７）へ；又は１，８−ジアザビシクロ
［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）、水素化ナ
トリウム等の塩基の存在下、トリクロロアセトニトリル
を反応させてトリクロロアセトイミデート体（６）へ変
換する。糖１位へのアジド基の導入方法として、従来法
では、爆発性のあるＡｇＮ₃などを用いていたため、特
別の注意を要し、収率もよくなかった。それ故に、本発
明では従来法を用いず、化合物（６）又は（７）と、ト
リメチルシリルアジドとをカップリングする方法を採用
した。この方法により、糖１位にアジド基を持った化合
物（８）を合成することができた。即ち化合物（６）又
は（７）をできるだけ無水の有機溶媒に溶かし、要すれ
ば冷却し、１〜２０倍モル、好ましくは５〜１２倍モル
のＴＭＳＮ₃を加えた後、Ｃｐ₂ＨｆＣｌ₂／ＡｇＣｌ
Ｏ₄、あるいは、ＢＦ₃・Ｅｔ₂Ｏ等のルイス酸の活性化
剤を添加して反応を行う。３０分〜１２時間で反応を終
了し、常法により１Ｎ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウムで
洗浄して、乾燥後濃縮することにより化合物（８）を得
ることができる。

【００２８】化合物（９）は、化合物（８）のＲ^4bの保
護基を脱保護することにより得られる。例えばＲ^4bがア
シル基の場合、一般的な脱アシル化の条件でアシル基を
脱離して化合物（９）へと導くことができる。即ち、化
合物（８）をできるだけ無水のテトラヒドロフラン（Ｔ
ＨＦ）、ジオキサン、あるいはアルコール類に溶解し、
これに触媒量のナトリウムメチラート等のアルコキシ
ド、あるいはトリエチルアミン等のアミン化合物を加え
て反応を行う。反応温度は特に制限されないが、発熱す
る場合には冷却する。通常、０．５〜１２時間で脱アシ
ル化された化合物（９）が得られる。

【００２９】化合物（１２）は、グルコース糖受容体
（１０）とマンノース糖供与体（１１）とを、不溶性銀
触媒の存在下反応させることにより得られる。即ち、糖
受容体（１０）をできるだけ無水の有機溶媒、例えば塩
化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等の溶媒に溶解
し、これにＡｇ−シリカアルミナ、Ａｇ−シリケート等
の触媒、モレキュラーシーブス（ＭＳ）等の脱水剤を加
える。これにできるだけ無水の溶媒に溶かした糖供与体
（１１）を加えて反応を行う。反応温度は、糖供与体
（１１）の添加時は０〜−７８℃、好ましくは−２０〜
−４０℃とし、その後室温にて撹拌することにより、
０．５〜３６時間で反応が終了する。要すればカラムク
ロマトグラフィーを用いて精製することによりグルコー
ス糖受容体にマンノース糖供与体がβ−グリコシド結合
した二糖（１２）及びα−グリコシド結合した二糖（１
３）を得る。

【００３０】化合物（１２）は３〜１０当量の硝酸第二
セリウムアンモニウム（ＣＡＮ）と共にトルエン、アセ
トニトリル、水の混合溶媒中、４〜５０℃で０．５〜６
時間処理することにより、アノメリック位の保護基が脱
離された二糖（１４）へと導くことができる。トルエ
ン、アセトニトリル、水の混合溶媒の組成比は、通常
３：３：４が用いられるが、この組成比に限定されるも
のではない。

【００３１】化合物（１４）の還元末端の１位を活性化
して、糖供与体（１５）へと変換する反応は、通常の活
性化反応により行うことができる。即ち、（１４）にチ
オニルクロライド、チオニルブロマイド、ＤＡＳＴ等の
ハロゲン化剤を反応させてグリコシルハライド（Ｃｌ、
Ｂｒ、Ｆ）へ、又は、ＤＢＵ、水素化ナトリウム等の塩
基の存在下トリクロロアセトニトリルを反応させて、ト
リクロロアセトイミデートに変換する。まず化合物（１
４）を塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等の溶
剤に溶解し、これに氷冷下１〜１０倍モルのＤＡＳＴを
加えて反応を行う。５分〜２時間で反応が終了したら、
少量のメチルアルコールでＤＡＳＴを不活性化し、酢酸
エチルにより抽出して二糖性のグリコシルフルオリド
（１５）を得る。

【００３２】三糖〜五糖の合成は、糖の１位にアジド基
を導入したグリコシルアジド（９）を糖受容体として、
これに順次糖又は糖鎖を縮合させていくことにより行わ
れる。この方法は従来全く知られていなかったものであ
り、この方法を用いれば糖鎖部分を自由にデザインする
ことができる。即ち、グリコシルアジド（９）とＣｐ₂
ＨｆＣｌ₂、ＡｇＣｌＯ₄などの活性化触媒、およびＭＳ
等の脱水剤を、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭
素等の溶媒に加えて撹拌する。これに−１０〜−７８
℃、好ましくは−２０〜−４０℃において、等モル〜３
倍モルのグリコシルフルオリド（１５）を同溶媒に溶解
して添加する。その後室温において６〜３６時間撹拌し
た後、反応液をセライトを通して濾過する。常法により
後処理し、要すればカラムクロマトグラフィーにより精
製して三糖（４′）を得る。

【００３３】化合物（４′）の保護基Ｒ^4bがアリル基の
場合の脱離は、塩化パラジウム、ルテニウム錯体、イリ
ジウム錯体等の触媒を用いて行う。例えばイリジウム錯
体によるアリル基の脱離反応の場合、以下の通りであ
る。まず、ＴＨＦ、ジオキサンなどの溶媒に化合物
（４′）を溶解し、これに１／５〜１／２０重量部のイ
リジウム錯体を添加して撹拌する。水素ガス気流下、溶
液が無色になるまで撹拌した後、酢酸エチルを加えて濃
縮する。残渣をアセトン・水混合溶媒（９：１）に溶解
した後、ＨｇＣｌ₂／ＨｇＯ又はＨ₂Ｏ／Ｉ₂を加えて１
時間撹拌する。酢酸エチルにより抽出することによりア
リル基の脱離された三糖（４）が得られる。

【００３４】化合物（４）と（５）との縮合反応も、通
常のグリコシル化反応に従って行うことができる。即
ち、化合物（４）を塩化メチレン、クロロホルム、四塩
化炭素等の溶剤に溶解し、これにシルバートリフレート
（ＡｇＯＴｆ）などの触媒、及びＭＳなどの脱水剤を加
えて室温で３０分撹拌する。これを−２０〜−７８℃、
好ましくは−４０℃に冷却した後、同溶媒に溶解した２
〜１０倍モルのマンノース糖供与体（５）を滴下する。
反応温度を室温に戻し、１２〜３６時間撹拌する。要す
ればカラムクロマトグラフィーを行い精製することによ
り、還元末端の糖１位にアジド基が導入された五糖性化
合物（２）を得、所望により脱保護、アシル化等するこ
とにより化合物（２ａ）を得る。この五糖はアスパラギ
ン結合型糖鎖に共通の母核構造を有する。

【００３５】五糖（２）のアミノ基の保護基がフタロイ
ル基の場合は、常法によりアミン類又はヒドラジンによ
って脱離する。即ち、化合物（２）をＴＨＦ、ジオキサ
ン等の溶媒、あるいはｎ−ブタノール等のアルコールに
溶解した後、これにエチレンジアミンなどのアミン類、
あるいはメチルヒドラジン、ヒドラジン等のヒドラジン
類を加えて撹拌する。ＴＬＣで反応を追跡し、要すれば
アルゴンガス気流下、５０〜１００℃、あるいは溶媒の
沸点まで加熱する。反応終了後、メタノールに溶解した
無水酢酸を加えて２時間撹拌後、溶媒を留去した後カラ
ムクロマトグラフィーにより精製してアミノ基を有する
五糖性化合物（２）を得る。

【００３６】五糖性化合物（２ａ）とアスパラギン酸の
無水物又は活性エステルとの反応は化合物（２ａ）のア
ジド基を還元してアミノ基に変換して五糖性グルコサミ
ンを得る反応と、アスパラギン酸の無水物又は活性エス
テルとの縮合反応を同時に行う方法を採用した。即ち、
α−アミノ基及びα−カルボキシル基が保護されたアス
パラギン酸（３）を塩化メチレン、あるいはクロロホル
ム、四塩化炭素等の溶媒に溶解し、氷冷下ジシクロヘキ
シルカルボジイミド（ＤＣＣ）を加えて３０分撹拌すれ
ばアスパラギン酸無水物が得られる。またα−アミノ基
及びα−カルボキシル基が保護されたアスパラギン酸と
Ｎ−ヒドロキシマクシンイミドや１−ヒドロキシベンゾ
トリアゾールとを縮合剤の存在下に反応させれば、アス
パラギン酸活性エステルが得られる。ここで用いる縮合
剤としては、ＤＣＣの代わりに、Ｎ−エチル−Ｎ’−３
−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）
や、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）など
の、通常ペプチド合成に用いられているカルボジイミド
であれば何ら差し支えない。生じたＮ，Ｎ’−ジシクロ
ヘキシル尿素（ＤＣＵ）を濾過により取り除き、これに
ＭＳ等の脱水剤、リンドラー（Ｌｉｎｄｌａｒ）触媒及
び五糖性化合物（２ａ）を加えた後、溶媒を留去する。
残渣をメチルアルコールなどのアルコール類に溶解し、
水素ガスによりアジド基の還元を行い、同時に生じたア
ミノ基とアスパラギン酸βカルボキシル基との縮合反応
を行う。室温にて２〜２０時間撹拌後、濾過、濃縮、さ
らに要すればクロマトグラフィー処理を行うことにより
本発明の五糖性のアスパラギン結合型糖誘導体（１）を
得る。

【００３７】アスパラギン結合型糖誘導体（１）を温和
な酸処理、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で室温処
理しトルエン共沸した後、モルホリン処理し、次いでＰ
ｄ−Ｃ及び酢酸存在下で水素ガスを吹き込みつつ撹拌
し、全ての保護基が脱離されたアスパラギン結合型糖誘
導体を得ることができる。またＲ¹、Ｒ²、Ｒ^3a及びＲ
^4aがそれぞれ異なる基である場合には、脱離反応条件を
選択すれば、これらの基のうちで所望する基のみが脱離
した化合物を得ることができる。

【００３８】アスパラギン結合型糖誘導体（１）から高
マンノース型糖鎖を合成するには、非還元末端側のマン
ノースの水酸基に適当に保護されたマンノオリゴ糖を適
宜選択して結合すればよく、また、複合型糖鎖を合成す
るには、同じく保護されたラクトサミン誘導体を結合す
ればよい。ラクトサミン誘導体に適当に保護されたシア
ル酸あるいはフコースが結合していても、その場合の反
応には全く問題がない。また、本発明のアスパラギン型
糖誘導体（１）を用いて、固相法あるいは液相法によ
り、ペプチド鎖の伸長を容易に行うことができる。即
ち、カルボキシル基の保護基をはずした後、既知の方法
によりカルボキシル基を活性化し、それをペプチドのフ
リーのアミノ基と結合すれば、糖ペプチドが合成され
る。逆に、アミノ基の保護基をはずせば、その位置にカ
ルボキシル基を活性化したアミノ酸あるいはペプチドを
結合することもできる。この場合、カルボキシル基を固
定化してペプチド鎖伸長反応を行うこともできる。即
ち、固相法によるペプチド合成も可能である。従ってこ
の化合物を利用すれば、市販のペプチド合成機によるペ
プチド鎖伸長も可能である。

【００３９】以上に記述したように本発明のアスパラギ
ン結合型糖誘導体（１）は、どのような構造のアスパラ
ギン結合型糖鎖の合成にも対応できるのみならず、還元
末端側にペプチド鎖を伸長することも可能である。従っ
て本発明は、高マンノース型糖ペプチドあるいは複合型
糖ペプチドを合成するための万能の合成中間体として有
用である。

【００４０】本発明のアスパラギン結合型糖誘導体
（１）は、例えば下記の如き用途に使用し得る。（１）フリーの水酸基にマンノオリゴ糖を結合すること
により、高マンノース型糖アスパラギンを合成する。更
に例えば、これを抗癌剤と結合した蛋白質に結合するこ
とにより、高マンノース型糖鎖を有する新規な糖蛋白性
抗癌剤とすることができる。（２）フリーの水酸基にシアリルラクトサミンを結合し
て、複合型糖アスパラギンを合成する。更に例えば、こ
れを各種リンホカインに結合して、薬剤の血中滞留時間
を延長するのに用いることができる。

【００４１】また、五糖性アジド（２）を糖受容体とし
て、これに順次糖又は糖鎖を縮合させることにより従来
製造が困難だった高マンノース型糖鎖を容易に製造する
ことができる。

【００４２】

【実施例】以下に実施例を挙げ本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。

【００４３】実施例１

【００４４】

【化１６】

【００４５】ＭＳＡＷ３００を一晩真空乾燥した。これ
にＴＭＳＮ₃１ｇ（８．７mmol）、塩化メチレン３ml、
ＢＦ₃・Ｅｔ₂Ｏ１２mg（０．０８mmol）を加え、−７
８℃にて３０分間撹拌した。これにトリクロロアセトイ
ミデート体（６ａ）６００mg（０．８９mmol）／塩化メ
チレン溶液（３ml）を滴下した。１時間後、フィルター
濾過し、酢酸エチルにて抽出した。１ＮＨＣｌ、飽和
ＮａＣｌ水、飽和ＮａＨＣＯ₃水、飽和ＮａＣｌ水で各
々１回づつ洗浄後、有機層を無水硫酸マグネシウムにて
乾燥した。溶媒を減圧除去した後、残渣をシリカゲルカ
ラムにかけ、トルエン−酢酸エチル（８：１、ｖ／ｖ）
で溶出し、化合物（８ａ）を得た。

【００４６】収量 326mg 収率 65% Rf 0.44（トルエン−酢酸エチル＝3:1(v/v)）分子式 C₃₀H₂₈O₇N₄ 分子量化合物(2): 675.92 化合物(4): 556.57 〔α〕_D ²⁷=+50.26°(C=1.006、クロロホルム） FT-IR 2120.0cm^-1

【００４７】実施例２

【００４８】

【化１７】

【００４９】ＭＳ４Ａ、ＡｇＣｌＯ₄ ５１mg （０．２
４mmol）、Ｃｐ₂ＨｆＣｌ₂ ４６mg（０．１２mmol）を
真空乾燥した。これにＴＭＳＮ₃６２μｌ（０．４７mmo
l）、塩化メチレン２mlを加え、３０分間撹拌した。−
７８℃に冷却した後、グリコシルフルオリド（７ａ）５
０mg（０．０９４mmol）を加えた。３０分後、フィルタ
ー濾過し、酢酸エチルにて抽出した。飽和ＮａＣｌ水、
飽和ＮａＨＣＯ₃水、飽和ＮａＣｌ水で各々１回づつ洗
浄後、有機層を無水硫酸マグネシウムにて乾燥した。溶
媒を減圧除去し、残渣をシリカゲルカラムにかけ、トル
エン−酢酸エチル（８：１、ｖ／ｖ）で溶出し、化合物
（８ａ）を得た。

【００５０】収量 45mg 収率 86% Rf 0.44（トルエン−酢酸エチル=3:1(v/v)）

【００５１】実施例３

【００５２】

【化１８】

【００５３】化合物（８ａ）１７５ｍｇ（０．３１mmo
l）をＴＨＦ５mlに溶かし、氷冷下０．２ＮＮａＯ
Ｍｅ／ＭｅＯＨを１．５ml加えた。４５分後、アンバー
リスト１５Ｅ（約１００mg）にて中和した。アンバーリ
スト１５Ｅを濾別し、濾液を減圧濃縮した。シリカゲル
カラムにかけ、トルエン−酢酸エチル（５：１、ｖ／
ｖ）で溶出し、化合物（９ａ）を得た。

【００５４】収量 145mg 収率 90% Rf 0.31（トルエン−酢酸エチル=3:1(v/v)）分子式 C₂₈H₂₆O₆N₄ 分子量化合物(5): 514.54 〔α〕_D ²⁸ =+15.8゜(C=1、クロロホルム) FT-IR 2118.1cm^-1(N₃基)

【００５５】実施例４

【００５６】

【化１９】

【００５７】乾燥ＭＳ４Ａ、Ａｇシリカ−アルミナ
（１．５ｇ）、化合物（１０ａ）１２５mg（０．２１mm
ol）を５mlの塩化メチレンに溶かし、−２０℃にて撹拌
した。塩化メチレン５mlに溶かした化合物（１１ａ）５
５０mg（１．０９mmol）を加えた後、室温にて一晩撹拌
した（１２時間）。反応液をセライト濾過した後、酢酸
エチルにて抽出した。飽和ＮａＣｌ水、飽和ＮａＨＣＯ
₃水、飽和ＮａＣｌ水で各々１回づつ洗浄後、有機層を
無水硫酸マグネシウムにて乾燥した。溶媒を減圧除去
し、残渣をカラムクロマトにかけて精製して化合物（１
２ａ）及び化合物（１３ａ）を得た。

【００５８】元素分析化合物 (12a)β体化合物 (13a)α体 C H N C H N 計算値 71.96 6.23 1.38 71.96 6.23 1.38 実測値 71.62 6.27 1.33 71.05 6.31 1.25 分子式 C₆₁H₆₃O₁₃N 分子量化合物(13a): 1018.15

【００５９】実施例５

【００６０】

【化２０】

【００６１】化合物（１２ａ）７７ｍｇ（０．０７６mm
ol）をトルエン３mlに溶かし、これにアセトニトリル４
mlを加えた。ＣＡＮ１７１mgを加えた後、水３mlを加
え、室温で２時間撹拌した。酢酸エチルで希釈し、飽和
ＮａＣｌ水で２回洗浄後、飽和ＮａＨＣＯ₃水、飽和Ｎ
ａＣｌ水で各々１回づつ洗浄した。有機層を無水硫酸マ
グネシウムにて乾燥後、溶媒を減圧除去し、残渣をカラ
ムクロマトにかけ、トルエン−酢酸エチル（３：１、ｖ
／ｖ）で溶出して、化合物（１４ａ）を得た。

【００６２】収量 48mg 収率 70% Rf 0.19（トルエン−酢酸エチル=3:1(v/v)）分子式 C₅₄N₅₇O₁₂N 分子量化合物(14a): 912.02

【００６３】実施例６

【００６４】

【化２１】

【００６５】化合物（１４ａ）４８mg（０．０５３mmo
l）を塩化メチレン２mlに溶かし、氷冷下ＤＡＳＴ
０．０１３mlを加えた。１０分後メタノール０．１mlで
ＤＡＳＴをつぶし、酢酸エチルにて抽出した。飽和Ｎａ
Ｃｌ水、飽和ＮａＨＣＯ₃水、飽和ＮａＣｌ水で各々１
回づつ洗浄後、有機層を無水硫酸マグネシウムにて乾燥
した。溶媒を減圧除去した後、残渣をカラムクロマトに
かけ、トルエン−酢酸エチル（３：１、ｖ／ｖ）で溶出
して化合物（１５ａ）を得た。

【００６６】収量 48mg (0.653mmol) 収率 100% Rf 0.65（トルエン−酢酸エチル=3:1(v/v)）元素分析分子式 C₅₄H₅₆O₁₁NF 分子量化合物(15a): 914.02

【００６７】実施例７

【００６８】

【化２２】

【００６９】化合物（９ａ）２８mg（０．０５４mmol）
とＡｇＣｌＯ₄２９mg、Ｃｐ₂ＨｆＣｌ₂２７mg、ＭＳ
４Ａを２mlの塩化メチレンに溶かして撹拌した。−２０
℃に冷却し、化合物（１５ａ）４８mg（０．０５３mmo
l）を２mlの塩化メチレンに溶かした溶液を加えた。１
２時間後、反応液をセライト濾過し、濾液を酢酸エチル
で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ₃水、飽和ＮａＣｌ水で各々
１回づつ洗浄後、有機層を無水硫酸マグネシウムにて乾
燥した。溶媒を減圧除去した後、残渣をバイオビーズＳ
Ｘ−２にてゲル濾過して化合物（４′ａ）を得た。

【００７０】収量 59mg(0.042mmol) 収率 79%（ドナーから計算） Rf 0.57（トルエン−酢酸エチル=3:1(v/v)）分子式 C₈₄H₈₁O₁₉N₅ 分子量化合物(16a): 1408.54 〔α〕_D ²⁸ =+4.5゜(C=1、クロロホルム） FT-IR 2116.2cm^-1(N₃基)

【００７１】実施例８

【００７２】

【化２３】

【００７３】イリジウム触媒５mgをＴＨＦに加え撹拌
し、水素雰囲気下とした。反応液が無色になったので、
水素を除き、窒素置換した。１mlのＴＨＦに化合物
（４′ａ）を５１ｍｇ（０．０３６mmol）溶かし、イリ
ジウム錯体溶液に加えた。１時間後、酢酸エチルで希釈
し、減圧濃縮した。これをアセトン９mlに溶かし、水１
mlを加えた後、ＨｇＣｌ₂ ３５mg、ＨｇＯ０．７mg
を加えて撹拌した。１時間後、酢酸エチルで希釈し、飽
和ＮａＣｌ水、飽和ＮａＨＣＯ₃水、飽和ＮａＣｌ水で
洗浄後、シリカゲルカラムクロマトにかけてトルエン−
酢酸エチル（３：１（ｖ／ｖ））で溶出して精製し、化
合物（４ａ）を得た。

【００７４】収量 48mg(0.036mmol) 収率 100% Rf 0.1（トルエン−酢酸エチル=3:1(v/v)）分子式 C₇₆H₇₃O₁₇N₅ 分子量化合物(4a): 1328.41 〔α〕_D ²¹ =+21.8゜(C=0.38、クロロホルム)

【００７５】実施例９

【００７６】

【化２４】

【００７７】化合物（４ａ）１１２mg（０．０８４mmo
l）を１０mlの塩化メチレンに溶かし、ＭＳ４Ａ、Ａｇ
ＯＴｆ１５３mg（０．５９mmol）の中に加え、室温で
３０分間撹拌した。これを−４０℃に冷却した後、化合
物（５ａ）１７２mg（０．０３４mmol）の塩化メチレン
（２ml）溶液を滴下した。反応溶液を室温に戻し、１８
時間撹拌した。セライト濾過後、濾液を濃縮し、バイオ
ビーズＳＸ−１でゲル濾過をした。更にシリカゲルカラ
ム（溶離液、トルエン：酢酸エチル＝７：１）にて精製
し、化合物（２−１）を得た。

【００７８】収量 154mg(0.068mmol) 収率 80% Rf 0.56（トルエン−酢酸エチル=2:1(v/v)）分子式 C₁₃₄H₁₃₃O₂₉N₅ 分子量化合物(2-1): 2277.49 〔α〕_D ²⁶ =+17.05゜(C=0.44、クロロホルム)

【００７９】実施例１０

【００８０】

【化２５】

【００８１】化合物（２−１）２５mg（０．０１１mmo
l）をエチレンジアミン１５mlとｎ−ブタノール８mlに
溶かし、アルゴン雰囲気下、９０℃にて１６時間加熱し
た。溶媒を減圧除去した後、メタノールを加え、０℃に
冷却した。これに無水酢酸を加え、2時間撹拌した。溶
媒を減圧除去した後、ＰＴＬＣにて精製し化合物（２−
２）を得た（展開溶媒、クロロホルム：メタノール＝２
０：１）。

【００８２】収量 18mg(0.009mmol) 収率 80% Rf 0.48（クロロホルム：メタノール=20:1）分子式 C₁₁₈H₁₂₉O₂₅N₅ 分子量化合物(2-2): 2017.29 〔α〕_D ²⁷ =-8.9゜(C=1.007、クロロホルム)

【００８３】実施例１１

【００８４】

【化２６】

【００８５】α−アミノ基をＦｍｏｃ基で、α−カルボ
キシル基をｔ−Ｂｕ基でそれぞれ保護したアスパラギン
酸２０mgを塩化メチレン１mlに溶かし、氷冷下ＤＣＣ
５mgを加え、３０分間撹拌した。メンブランフィルター
にてＤＣＵｒｅａを濾別し、濾液を濃縮し、化合物（３
ａ）を得た。これにＭＳ３Ａとリンドラー触媒１３mgを
加え、更に化合物（２−２）１７mgを１mlのＣＨ₂Ｃｌ₂
に溶かした溶液を加えた。減圧下ＣＨ₂Ｃｌ₂を除きメタ
ノール５mlを加えた後、水素ガス雰囲気下とした。５時
間後フィルター濾過し、濾液を濃縮後セファデックスＬ
Ｈ−２０にてゲル濾過してアスパラギン結合型糖誘導体
（１ａ）を得た。

【００８６】収量 16mg 収率 79% Rf 0.72（クロロホルム:メタノール=10:1）分子式 C₁₄₁H₁₃₄O₃₀N₄ 分子量化合物(1a): 2384.72 〔α〕_D ²⁶ =+9.02 (C=0.82、クロロホルム)

【００８７】実施例１２

【００８８】

【化２７】

【００８９】化合物（１ａ）９mg（３×１０^-3mmol）
を、ＴＦＡ１mlに溶かし、室温で４０分間撹拌した。Ｔ
ＦＡを減圧除去し、トルエンで２回共沸した。モルホリ
ン１mlを加え、室温で１時間撹拌した後、モルホリンを
除去し、セファデックスＬＨ−２０（メタノール）でゲ
ル濾過後、水／酢酸＝１／４５mlに溶かし、Ｐｄ−Ｃ
触媒２０mgを加え、水素ガス雰囲気下、１９時間撹拌し
た。触媒をメンブレンフィルターで除き、濾液を濃縮
後、バイオゲルＰ−２でゲル濾過して化合物（１ｂ）を
得た。

【００９０】収量 3mg 収率 79% Rf 0.22（n-ブタノール：メタノール：水：酢酸=4:2:
2:1）分子式 C₃₈H₆₄O₂₈N₄ 分子量化合物(1b): 1024.906

【００９１】実施例１３

【００９２】

【化２８】

【００９３】化合物（１ａ）１８mg（０．００７５mmo
l）を塩化メチレン１ml、ＴＦＡ０．５mlに溶かし、室
温下撹拌した。１時間後、溶媒を減圧除去し、ＯＤＳカ
ラムを用いたＨＰＬＣ（溶離溶媒：０．１％ＴＦＡ／Ｃ
Ｈ₃ＣＮ０．１％／ＴＦＡ／Ｈ₂Ｏ）にて化合物（１
ｃ）を分取した。

【００９４】収量 15.6mg(0.0067mmol) 収率 89% Rf 0.33（クロロホルム：メタノール=10:1、0.1%酢
酸）分子式 C₁₃₇H₁₄₆O₃₀N₄ 分子量化合物(1c): 2328.62 〔α〕_D ²⁶ =+10.39゜(C=0.51/mg/ml、クロロホルム)

【００９５】実施例１４

【００９６】

【化２９】

【００９７】化合物（１ｃ）８mg（０．００３４mmol）
と化合物（１６）２．５mg（０．００６２mmol）を１ml
の塩化メチレンに溶かした。これにＨＯＢｔ１．８mg
（０．０１mmol）、ＥＤＣ２．４mg（０．０１mmol）を
加え、室温で３０分間撹拌した。反応液をそのままセフ
ァデックスＬＨ−２０によりゲル濾過して化合物（１
７）を得た。

【００９８】収量 9.2mg(0.032mmol) 収率 90% Rf 0.33（トルエン：エタノール=3:1）〔α〕_D ²⁷ =-3.75°(C=0.24、クロロホルム)

【００９９】実施例１５

【０１００】

【化３０】

【０１０１】化合物（１７）９mg（０．００３１mmol）
をモルホリン１mlに溶かし、室温で１時間撹拌した。減
圧下モルホリンを除去し、トルエンで２回共沸した。こ
れをメタノール／水（１０／１）に溶かし、ヘキサンを
加えた。ヘキサン層を除去し、メタノール／水層を濃縮
した。これをメタノールに溶かし、セファデックスＬＨ
−２０にてゲル濾過した。得られた脱Ｆｍｏｃ体（Ｒｆ
＝０．６３、トルエン／エタノール＝７／２）を酢酸／
水（４／１）１０mlに溶かし、Ｐｄ−Ｃ触媒２９mgを加
えた後、水素ガス雰囲気とした。１９時間後、Ｐｄ−Ｃ
触媒をセライトにて濾別し、濾液を濃縮後、バイオゲル
Ｐ−２にてゲル濾過しアスパラギン結合型糖ペプチド誘
導体（１８）を得た。この糖ペプチドは、ｈＣＧホルモ
ンのαサブユニットのアミノ酸配列に含まれるものであ
る（５２番目のアスパラギン残基）。

【０１０２】収量 2.2mg 収率 58% Rf 0.26（n-BuOH：メタノール：水：酢酸=5:2:2:1）

【０１０３】

【発明の効果】本発明のアスパラギン結合型糖誘導体
（１）は、どのような構造のアスパラギン結合型糖鎖の
合成にも対応できるのみならず、不溶性の樹脂上でペプ
チド鎖を伸長させていくペプチド固相合成法に組み入
れ、更に大きな糖ペプチドにすることも容易である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者小川智也埼玉県和光市広沢２番１号理化学研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式（１）【化１】〔式中、Ｒ¹は水素原子又はα−アミノ基の保護基を示
し、Ｒ²は水素原子又はカルボキシル基の保護基を示
し、Ｒ^3a及びＲ^4aは同一又は異なって水素原子又は中性
条件下で脱離可能な水酸基の保護基を示し、Ｘは保護さ
れていてもよいアミノ基を示す〕で表わされるアスパラ
ギン結合型糖誘導体。
【請求項２】一般式（２）【化２】〔式中、Ｒ³及びＲ⁴は同一又は異なって水素原子、ア
シル基又は中性条件下で脱離可能な水酸基の保護基を示
し、Ｘは保護されていてもよいアミノ基を示す〕で表わ
される五糖グリコシルアジド。
【請求項３】一般式（２ａ）【化３】〔式中、Ｒ^3a及びＲ^4aは同一又は異なって水素原子又は
中性条件下で脱離可能な水酸基の保護基を示し、Ｘは保
護されていてもよいアミノ基を示す〕で表わされる五糖
グリコシルアジドに、一般式（３）【化４】〔式中、Ｒ^1aはα−アミノ基の保護基を示し、Ｒ^2aはカ
ルボキシル基の保護基を示す〕で表わされるアスパラギ
ン酸の無水物又は活性エステルを接触水素化還元触媒の
存在下に反応させ、所望によりＲ^1a、Ｒ^2a、Ｒ^3a及びＲ
^4aの保護基を脱離せしめることを特徴とする一般式
（１）【化５】〔式中、Ｒ¹は水素原子又はα−アミノ基の保護基を示
し、Ｒ²は水素原子又はカルボキシル基の保護基を示
し、Ｒ^3a及びＲ^4aは同一又は異なって水素原子又は中性
条件下で脱離可能な水酸基の保護基を示し、Ｘは保護さ
れていてもよいアミノ基を示す〕で表わされるアスパラ
ギン結合型糖誘導体の製造法。
【請求項４】一般式（４）【化６】〔式中、Ｒ^3bは同一又は異なってアシル基又は中性条件
下で脱離可能な水酸基の保護基を示し、Ｘ¹は保護され
たアミノ基を示す〕で表わされる三糖グリコシルアジド
に、一般式（５）【化７】〔式中、Ｒ^3b及びＲ^4bは同一又は異なってアシル基又は
中性条件下で脱離可能な水酸基の保護基を示し、Ｙはハ
ロゲン原子を示す〕で表わされる単糖類を反応させ、所
望により保護基を脱離せしめることを特徴とする一般式
（２）【化８】〔式中、Ｒ³及びＲ⁴は同一又は異なって水素原子、ア
シル基又は中性条件下で脱離可能な水酸基の保護基を示
し、Ｘは保護されていてもよいアミノ基を示す〕で表わ
される五糖グリコシルアジドの製造法。