CN1081205A - N-乙酰氨基葡糖转移酶v蛋白及基因 - Google Patents

Abstract

本发明提供了基本纯化的UDP-N-乙酰葡萄 糖胺：α-6-D-甘露糖苷β-1，6-乙酰氨基葡糖转移 酶(GlcNAcT-V；Ec2.4.1.155)和与GlcNAcT-V特 异结合的抗体。本发明还提供了能移与编码 GlcNAcT-V的核酸顺序特异杂交的多聚核苷酸顺 序和寡核苷酸探针，编码Glc NAcT-V的cDNA克 隆和基因组克隆，以及编码Glc NAcT-V的核苷酸 顺序，特以大鼠的Glc NAcT-V编码顺序为例。

Description

本申请是1992年6月29日申请的U.S.SN.07/905，795的续展申请。

本发明的领域为蛋白质糖基化领域，具体涉及特定的酶，即N-乙酰氨基葡糖转移酶V，该酶参与三天线和四天线N-连接寡糖中β（1，6）分枝结构的形成。领域涉及纯化的具活性的酶，大鼠的该酶蛋白的氨基酸顺序，编码活性酶的基因及通过遗传工程表达编码活性酶的核苷酸顺序的细胞系。

UDP-N-乙酰葡萄糖胺;α-6-D-甘露糖苷β-1，6-乙酰氨基葡糖转移酶V（Glc  NAc  T-V，EC  2.4.1.155）是高尔基酶，负责三天线和四天线N-连接寡糖中β（1，6）分枝结构的合成。为方便起见，该酶在下文中简称Glc  NAc  T-V。已经在许多哺乳动物组织和细胞类型中发现Glc  NAc  T-V的活性。

在用肿瘤病毒、致癌物转化的，或者用某些致癌基因转染的哺乳动物细胞中，已观察到膜糖蛋白和糖脂类的改变的糖基化作用。在某些情况下，特定的取代基有量的增加，如唾液酸化作用（sialylation）。在另一些例子中，一些通常仅存以于胎儿组织中寡糖结构重现于肿瘤，如在腺癌中检测到某些路易斯组织-血液基团抗原。

寡糖的质的差别在某些转化细胞中也可观察到。用多瘤病毒或用Rous肉瘤病毒转化的BHK成纤维细胞，与相应的正常细胞相比，具有分枝程度更多的复合N-连接寡糖。在三天线和四天线N-连接的寡糖中发现的β-1，6分枝结构（-[Glc  NAc-β（1，6）Man-α（1，6）Man]-）的表达，在转化的细胞有所增加。这种增加与Glc  NAc  T-V的比活性的2-3倍的增加是互相关联的。用多瘤病毒，腺病毒，肿瘤基因DNA，以及用ras或fps/fes致癌基因转化鼠细胞，同样导致Glc  NAc  T-V活性的增加。相反，涉及N-连接糖基化的其他几种糖基转移酶在转化细胞中无变化。在转化细胞中，Glc  NAc  T-V比活性增加的机制还不清楚。

细胞表面结合的寡糖的β（1，6）分枝的增加，至少在某些情况下，与恶性肿瘤转移能力有关。β-1，6分枝增加后的水平超过了在正常组织中的水平，这一点在某些人乳房肿瘤组织中已观察到。

大鼠肾Glc  NAc  T-V的纯化技术已经公开。（Shoreibah  et  al.（1992）J.Biol.Chem.267：2920-2927）。

本发明的目的之一在于N-2酰氨基葡糖转移酶V以及编码具有该酶活性的蛋白质的DNA顺序。基本纯净和/或重组产生的Glc  NAc  T-V在体外很有用处，同时表达编码Glc  NAc  T-V顺序的重组宿主细胞在体外糖基化反应方面，是很有用处的。

在此提供了编码Glc  NAc  T-V的基因组的和cDNA的顺序，Glc  NAc  T-V酶的氨基酸顺序，和通过遗传工程表达编码活性Glc  NAc  T-V的顺序的重组宿主细胞。

本发明同时提供了对大鼠肾Glc  NAc  T-V特异的多克隆和单克隆抗体。这些抗体也可结合来自其他哺乳动物的Glc  NAc  T-V，并且在检测及分离中很有用。应该理解，从不同于大鼠肾脏的其他来源而得的Glc  NAc  T-V的分子量，动力学参数以及其一级氨基酸顺序，都可以不同于在此公开的有关大鼠肾脏的该酶的特征。

本发明的目的之二在于在原核与真核宿主细胞中通过重组DNA技术产生的Glc  NAc  T-V。本发明在此公开了大鼠Glc  NAc  T-V的完整的氨基酸顺序，以及编码大鼠Glc  NAc  T-V的完整的核苷酸顺序。在此公开了用重组DNA技术产生重组的有活性的Glc  NAc  T-V的示范方法。作为范例的氨基酸顺序，编码Glc  NAc  T-V的核苷酸顺序以及其中的其他顺序，正如已有技术中所知的那样，可以用于在大量物种中分离Glc  NAc  T-V编码顺序以及通过重组DNA技术产生大量有用的Glc  NAc  T-V。

本发明的目的之三在于编码Glc  NAc  T-V的cDNA克隆和编码Glc  NAc  T-V的基因组克隆。针对大鼠肾Glc  NAc  T-V的抗体或由此衍生的结合多肽的抗体，通过使用已有技术公知的分析和结合方法，（例如此处公开的Glc  NAc  T-V的氨基酸顺序的分析），可以因为抗体与其他Glc  NAc  T-V的交叉反应性而用于检测不同于大鼠肾来源的Glc  NAc  T-V;或者，这些抗体可用于筛选cDNA表达文库。类似地，本发明的简并寡核苷酸探针和/或编码顺序和/或扩增物顺序可用于筛选用哺乳动物的不同于大鼠肾脏来源的核酸构建的基因组或cDNA文库，它们还可用于制备扩增用的引物，从以大鼠肾脏或其他哺乳动物源制得的mRNA群体中扩增编码Glc  NAc  T-V的顺序。编码Glc  NAc  T-V的cDNA和/或基因组顺序在指导Glc  NAc  T-V的重组表达方面很有用。

本发明的目的之四在于编码大鼠Glc  NAc  T-V的核苷酸顺序，以及编码其他肾椎动物，最好在哺乳动物的Glc  NAc  T-V的核苷酸顺序。此外提供的编码大鼠Glc  NAc  T-V的核苷酸顺序编为顺序识别序号No.15（SEQ  IQ  NO：15），为从核苷酸299处开始的ATG翻译起始密码子到核苷酸2521处的翻译终止子。熟练的技术人员都了解，因为遗传密码的简并性，可以有一种以上的核苷酸顺序可以编码同样的氨基酸顺序。这些顺序，以及它们的编码功能相同的Glc  NAc  T-V的变换顺序都能用来在重组宿主细胞中表达Glc  NAc  T-V。来自其他肾椎动物，最好是哺乳动物的Glc  NAc  T-V的编码顺序在核苷酸顺序水平，与此公开的作为示范的大鼠Glc  NAc  T-V编码顺序会是高度同源的。与作为示范的大鼠Glc  NAc  T-V编码顺序具有不少于70%，较佳为不少于80%，更佳为不少于90%核苷酸同源性的且功能上相同的Glc  NAc  T-V编码顺序，能够通过使用众所周知DNA-DNA杂交技术和此处提供的作为示范的大鼠Glc  NAc  T-V编码顺序，而被从非大鼠细胞的mRNA源制备的cDNA文库中鉴别和分离出来的。编码Glc  NAc  T-V的基因组克隆，同样在考虑之中，该克隆含有天然的调控顺序。应该理解，在编码Glc  NAc  T-V的基因组克隆中的所有内含子顺序都不包括在与示范的全长的大鼠的编码顺序的顺序比较中。

本发明的目的之五在于含有编码具酶活性的Glc  NAc  T-V的第一核苷酸顺序以及与天然的Glc  NAc  T-V编码顺序无关的第二核苷酸顺序（在此命名为“外源核苷酸顺序”）的DNA分子。较佳地，第一核苷酸顺序编码具Glc  NAc  T-V活性的多肽序列，所述多肽的氨基酸顺序如图8中所示，其顺序识别编号为NO：16（SEQ.ID  NO：16）。

本发明的目的之五在于通过遗传工程改造的细胞，其含有带编码具酶活性的Glc  NAc  T-V的第一核苷酸顺序及与天然的Glc  NAc  T-V编码顺序无关的第二核苷酸顺序的DNA分子。哺乳动物的细胞是优选用于重组表达Glc  NAc  T-V编码顺序的。特别优选的是COS-7细胞和CHO（中国仓鼠卵巢）细胞。作为示范的大鼠的Glc  NAc  T-V的氨基酸顺序是特别优选的，较佳的是由图8中或顺序识别编号No：15中从核苷酸299到核苷酸2521的示范的核苷酸编码顺序所编码的。

图1为用溴化乙锭染色再现的琼脂糖胶电泳结果，显示Glc  NAc  T-V编码顺序的PCR扩增反应产物。泳道1含分子量标准（123级）;泳道2和7为以小鼠淋巴瘤细胞系BW5147总RNA  cDNA为模板的扩增反应的结果;泳道3和8为以小鼠淋巴瘤细胞系BW5147的聚腺苷酸RNA  cDNA为模板的扩增反应的结果;泳道4和9为以大鼠乳房瘤细胞系MAT  C1总RNA  cDNA为模板的扩增反应的结果;泳道5和10为以大鼠乳房瘤细胞系MAT  C1的聚腺苷酸RNA  cDNA为模板的扩增反应的结果;泳道6和11为无加入模板的扩增反应的结果。跑于泳道2-6的反应是用引物1（SEQ  ID  NO：5）和反引物2（antiprimer  2）（SEQ  ID  NO：8）作为PCR的引物而进行的。跑于泳道7-11的反应是用引物2（SEQ  ID  NO：7）和反引物1（SEQ  ID  NO：6）进行的。

图2显示用放射性标记的200扩增物（amplimer）（PCR产物）进行的Southern杂交的放射性自显影图。200扩增物是用大鼠乳房瘤细胞系MAT  C1聚腺苷酸RNA  cDNA为模板，以引物1（SEQ  ID  NO：5）和反引物2（SEQ  ID  NO：8）为引物制备向得的。图5A为BglⅡ消化的结果;图5B为NcoI/XhaI消化结果;图5C为NcoI消化结果;图5D为Bam  HI/BglⅡ消化结果。在每一板（panel）中，道1含经消化的MAT  C1基因组DNA而道2含经消化的大鼠肝脏基因组DNA。

图3为溴化乙锭染色再现的琼脂糖凝胶电脉结果，显示PCR扩增大鼠1-EJ文库cDNA顺序得到的产物。泳道2含分子量标准（分子量标记物Ⅱ，Boehringer  Mannheim，Indianapolis，IN）;泳道2含分子量标准（分子量标记Ⅶ  Boehringer  Mannheim）;泳道3含有一份用引物T7：473-30（SEQ  ID  NO：11）引物B：474-16用（SEQ  ID  NO：10）扩增大鼠1-EJ  cNA的PCR反应的产物。

图4为放射性自显影再现的结果，得自于用引物A：474-14（SEQ  ID  NO：9）为探针与从图3中的凝胶的反方向转移的DNA-Southern杂交。

图5为溴化乙锭染色再现的琼脂糖凝胶电泳结果，显示了在图4的放射性自显影图中可见的约为2.1kb的PCR产物经PCR扩增后得到的产物。泳道1含分子量标准（分子量标准物Ⅶ，Boehringer  Mannheim）;泳道2含有引物T7：476-30（SEQ  ID  NO：11）和引物485-26：（SEQ  ID  NO：12）扩增约2.1kb的PCR片段之后得到的PCR产物;泳道3含分子量标准（分子量标记物Ⅱ，Boehringer  Mannheim）。

图6显示了包含部分Glc  NAc  T-V编码顺序的几种序列，此处命名为扩增物顺序（amplimer  sequence），有小鼠的（SEQ  ID  NO：17），大鼠的（SEQ  ID  NO：18），和人的（SEQ  ID  NO：19）。冒号（：）表示相同的碱基。在小鼠与大鼠之间有13处差别，在小鼠与人之间有2处差别，这是通过与已有顺序的比较而得出的。

总体上，正如分子生物学，生物化学，蛋白质化学和细胞生物学领域的一般熟练技术人员所知，此处使用的术语都是标准的。为了更加清楚起见，在此定义了一些术语。使用了标准的简写：这些简写与那些经该领域的科学杂志（如，Journal  of  Biological  Chemistry，Science，Nature，等）使用并赞同的简写是一致的。

此外用及的方法或者是特别参考的，或者是充分公知的，在几本易理解的已出版的方法学的专辑中的至少一本中是可以找到的。（参见，如Sambrook  et  al.（1989）Molecular  Cloning.A  Laboratory  Manual（2nd  ed.），Cold  Spring  Harbor  Laboratory，Cold  Spring  Harbor，New  York，Innis  et  al.（1990）PCR  Protocols：A  Guide  to  Methods  and  Applications，Academic  Press，New  York，New  York，以及此处提及的参考文献，全部结合参考而使用）。

互补DNA（cDNA）的合成涉及通过酶反向转录从供体（donor）细胞分离得到的mRNA而进行的双链DNA顺序的体外合成。在本发明中，聚腺苷酸化的RNA从大鼠1-EJ培养细胞制备（描述于Peles  et  al.（1992）Cell  69：205-216）。大鼠1-EJ细胞是用人EJ基因转染的大鼠1的成纤维细胞。人体EJ基因是活化的Harvey  ras基因，据信可以提高Glc  NAc  T-V的表达水平。cDNA分子和/或文库能用于分离编码被选择蛋白的DNA顺序，当还不知道该蛋白质的完整的氨基酸顺序时。当知道了至少一部分氨基酸顺序时，从cDNA文库中分离一个基因相当方便，当至少一物种的完整的编码顺序已知时，将更为便利。从反转录mRNA制备cDNA顺序质粒文库的步骤在本领域是公知的。

多聚酶链式反应（PCR）提供了另一种cDNA克隆的有力手段，可以扩增编码被选蛋白质的顺序，当被选蛋白质的至少一部分顺序已知时。根据编码部分氨基酸顺序的互补序列，制备简并的寡核苷酸。该简并的核苷酸（即，一个顺序族）作为引物，用于采用聚腺苷酸RNA  cDNA作为模板的PCR合成。其他作为PCR引物的寡核苷酸是从唯一的（即已知的）核苷酸顺序衍变而来的。

表达指结构基因（编码顺序）的转录和翻译，从而合成具有Glc  NAc  T-V生物活性的蛋白质。

术语“表达控制顺序”指控制和调节另一DNA顺序（即，编码顺序）的转录和翻译的DNA顺序。当表达控制顺序控制和调节编码顺序的转录和翻译时，该编码顺序是与此表达控制顺序操作性连锁的。术语“操作性连锁的”包括在被表达的DNA顺序前面具有一个适当的起始信号（如，ATG），以及维持正确的阅读框架，从而允许在表达控制顺序控制之下的DNA顺序的表达和由DNA顺序编码的所需的产物的生成。如果欲将一基因插入重组DNA分子，而该基因不含合适的起始信号，那么可以在该基因前插入这样的一个起始信号。

正如此处用到的那样，外源核苷酸顺序是一种在自然界并不与特定的核苷酸顺序，如Glc  NAc  T-V编码顺序共价连接的顺序。外源核苷酸顺序的例子包括，但并不于局限于，质粒载体顺序，并不与特定的Glc  NAc  T-V天然相关的表达控制顺序，和病毒载体顺序。

类似地，正如此处用到的那样，外源基因是在特定的重组宿主细胞中并不天然存在的，但用已有技术中公知的遗传工程技术导入的基因。此处用到的外源基因可以含有Glc  NAc  T-V编码顺序，该编码顺序在并不与之天然相关的表达控制顺序的控制下进行表达。

本发明的另一特征是编码Glc  NAc  T-V的顺序的表达。正如已有技术领域中公知的那样，DNA顺序的表达可以将它们与适当的表达载体中的表达控制顺序操作性连锁，然后用该表达载体转化适当的宿主细胞。

大量不同的宿主/表达载体组合可以用来表达本发明的DNA顺序。有用的表达载体，例如，可以包括染色体的、非染色体的和人工合成的DNA顺序的片段。合适的载体包括SV  40的衍生物和已知的细菌质粒，例如大肠杆菌（Escherichia  coli）的质粒ColE1，pCR1，pBR322，pMB9和它们的衍生物;RP4类质粒;噬菌体DNA，例如M13衍生物，噬菌体λ的大量衍生物，如λgt11，和其他噬菌体DNA;从2μ环衍生而得的酵母质粒;可用于真核细胞，如昆虫或哺乳动物细胞的载体;从质粒和噬菌体DNA组合得到的载体，例如经修饰可采用噬菌体DNA或其他表达控制顺序的质粒;杆状病毒衍生物;以及类似的载体。对于哺乳动物细胞，已有技术中有大量可用的公知的表达载体。

众多的表达控制顺序的任一个都可以用于这些载体以表达本发明的DNA顺序。这些有用的表达控制顺序包括，例如用于在哺乳动物细胞中表达的SV  40或者腺病毒的早期和晚期启动顺序，lac系统，trp系统，TAC或TRC系统，噬菌体λ的主操纵基因和启动子区域，fd外壳蛋白质的控制区域，磷酸酯酶的3-磷酸甘油酸激酶的启动子（如，pho  5），酵母α-接合因子的启动子，和其他已知的控制原核细胞或真核细胞或它们的病毒的基因的表达的顺序，以及它们的不同组合。熟练的技术人员都知道，那些表达控制顺序对于特定的载体和宿主细胞是合适的。

众多的单细胞宿主细胞同样能用于表达本发明的DNA顺序。这些宿主细胞包括公知的真核宿主和原核宿主，如E.coli，假单胞菌（Pseudomonas），芽孢杆菌（Bacillus），链霉菌（Streptomyces）的菌株，真菌如酵母，和动物细胞，如CHO，R1.1，B-W和L-M细胞，非洲绿猴肾细胞（如，COS1，COS-7，BSC1，BSC40和BMT10），昆虫细胞（如sf9）和人细胞和培养的植物细胞。

应当理解，并不是载体、表达控制顺序和宿主细胞的所有组合都能同样好地表达本发明的DNA顺序。但是，本技术领域的熟练技术人员能够选择合适的载体，表达控制顺序和宿主细胞的组合，而不会不导致实验完成所需的表达，这没有超出本发明的范围。

在选择适合的表达控制载体中通常要考虑大量的因素。这些因素包括，例如，启动子的相对强度，它的可控性，与被表达的特定的DNA顺序或基因的相容性，如考虑可能的二级结构的形成。合适的单细胞宿主可以通过考虑以下因素而选择出：与所述的载体的相容性，分泌特性，正确折叠蛋白质的能力，发酵条件，以及被表达的DNA顺序所编码的产物对宿主的毒性，表达产物的纯化方便与否。本领域的专家都能找到适合于特定目的的宿主细胞和表达机制。

N-乙酰氨基葡糖转移酶V.（Glc  NAc  T-V）表示酶UDP-N-乙酰葡糖胺：α-6-D-甘露糖苷β（1，6）-N-乙酰的氨基葡糖转移酶（EC2.4.1.155）。该酶负责在三天线和四天线的N-连接寡糖中发现的β（1，6）支链结构（-[Glc  NAc-β-（1，6）Man-α（1，6）-Man]-）的合成。

在重组宿主体系中表达之后，可以有多种方法分离和纯化重组Glc  NAc  T-V。一种方法包括：在细菌细胞中表达蛋白质，裂解细胞和用常规手段纯化蛋白质。此外，人们可以用工程方法构建用于从细胞中分泌所需的DNA顺序。参见实施例11和/或Colley  et  al.（1989）J.Biol.Chem.264：17619-17622，该文献描述了通过遗传工程将人的α-干扰素的可切除的信号肽加于转移酶DNA顺序，从而纯化唾液酸转移酶的方法。Larsen  et  al.（1990）Proc.Natl.A-cad.Sci.USA  87：6674-6678，提及将蛋白质A的DNA顺序与墨角藻糖基转移酶的氨基末端基因融合，然后以外分泌的融合蛋白形式表达。在这样的构建中，人们可以选择性地将跨膜区域从编码顺序的3’端附近除去。分泌之后，蛋白质从培养基中纯化出来。对细菌表达体系，有很多类似的方法是可行的。

本技术领域的熟练人员都知道，作为示范的大鼠Glc  NAc  T-V编码顺序，即在此提供的SEQ  ID  NO：15中从核苷酸299至核苷酸2521，是作为其他脊椎动物来源，尤其是哺乳动物（包括人）来源的Glc  NAc  T-V的代表。此处提供的大鼠Glc  NAc  T-V的编码顺序是适合用于制备或衍生PCR引物，从而鉴别和/或扩增编码人或其他动物Glc  NAc  T-V的顺序，还可以用作杂交探针用以在合适的基因组文库或cDNA文库中鉴别编码人或大鼠，其他哺乳动物或其他脊椎动物的Glc  NAc  T-V的克隆。

应当理解，此处公开的大鼠肾Glc  NAc  T-V的纯化技术是可以用于纯化人的或其他Glc  NAc  T-V并达到与大鼠肾Glc  NAc  T-V相应的水平。熟练的技术人员知道，在分离非示范的Glc  NAc  T-V酶时，此处公开的程序的常规改进可以提供更好的结果。

除了大鼠之外的物种，包括小鼠和人，含有编码象大鼠Glc  NAc  T-V一样催化同样酶促反应的蛋白质的基因。这些基因与大鼠编码Glc  NAc  T-V的顺序有显著的核酸顺序的同源性。在标准的杂交条件下，人们可以使用本发明的DNA顺序作为探针或引物，从而分离出这些同源的基因。本发明特别关注并包括这些顺序。

对有限的核苷酸顺序资料（“扩增物”顺序的约160-180个碱基），在大鼠（SEQ  ID  NO：17），小鼠（SEQ  ID  NO：18），和人（SEQ  ID  NO：19）的编码顺序（用以处公开的引物PCR扩增mRNA而得）内进行比较，揭示了显著的顺序保守性;在大鼠-小鼠以及大鼠-人比较中，观察到90%核苷酸顺序同源性（见图6）。因此，来源于脊椎动物的Glc  NAc  T-V编码顺序与此处公开的示范的大鼠Glc  NAc  T-V编码顺序将有显著的顺序同源性。普通熟练的技术人员能利用示范的顺序，或其部分，最好长度不少于25-30碱基，在杂交中作为探针从而鉴别编码Glc  NAc  T-V的cDNA（或基因组）的克隆。其中，使用合适的已有技术领域公知的杂交技术时，至少与探针顺序有70%的顺序同源性。熟练的技术人员知道，克隆的cDNA编码有功能的Glc  NAc  T-V酶的能力能方便地测试出，如此处提及的（见实施例11）。

适合于检测探针与靶顺序之间核苷酸顺序的同源性不同程度的杂交条件以及理论上的和实际操作上的考虑因素都已给出，例如参见B.D.Hames和S.J.Higgins（1985）Nucleic  Acid  Hybridization，IRL  Press，Oxford，和Sambrook  et  al.（1989）（见前）。在特定的杂交条件下，本发明DNA顺序可与其他具足够同源性的DNA顺序（包括来自不同物种的同源顺序）杂交。已有技术中公知，杂交条件的严紧程序是杂交所需的同源性程度中的一个影响因素。熟练的技术人员的知道如何操作杂交条件，从而使杂交的严紧程度处于所期望的水平（高，中，低）。如果使用高严紧程度条件时，鉴别和分离来自其他哺乳动物源的Glc  NAc  T-V基因的尝试失败了，那么熟练的技术人员知道如何降低杂交条件的严紧程度，从而使得具有较低同源程度的顺序可与用作探针的顺序杂交。选择探针的长度和顺序对于熟练技术人员而言是轻而易举的。

当使用一个cDNA文库作为Glc  NAc  T-V编码顺序的来源时，熟练的技术人员会采取步骤以保证文库的高质量，即稀有的mRNA有其克隆而大的mRNA（大于约3kb）以全长cDNA克隆形式存在。如果技术人员使用市售的或其他来源的cDNA文库的话，他可以选择一个符合此处提到的标准的文库。提供稀有的和/或大的信息代表是属于已有技术的。

本发明的RNA顺序指用重组DNA技术制备或分离的DNA顺序。包括，cDNA顺序，用PCR分离得到的顺序，从其天然的基因组分离得到的DNA顺序以及合成的DNA顺序。正如此处用到的那样，该术语并不包括天然存在的染色体或基因组。从Glc  NAc  T-V基因衍变而来的顺序能用于研究在正常细胞中，转化细胞中以及转移的肿瘤细胞中Glc  NAc  T-V表达的调控，也能用于设计抑制肿瘤细胞转移的机制，例如通过反义RNA或DNA。这些顺序还能用于指导Glc  NAc  T-V的重组合成。

根据本发明的重组DNA分子的表达可包括宿主细胞对产物多肽的翻译后修饰。例如，在哺乳动物细胞，表达可以包括：诸如，多肽的糖基化，脂化或磷酸化，信号肽顺序的蛋白酶能解切除从而产生“成熟的”蛋白质。相应的，正如此处用到的那样，术语“Glc  NAc  T-V”包括全长的多肽及其修饰或衍生物，如该多肽的糖基化形成，成熟的蛋白质，保留信号肽的多肽，具有类似的生物学活性的截短的多肽，以及类似物。在表达具生物活性糖蛋白的真核细胞系中的Glc  NAc  T-V的表达，如果需要的话，可以允许由Glc  NAc  T-V介导的支链结构的有效的引发。

大鼠肾是纯化Glc  NAc  T-V的有用的来源，因为能购得相对大量的该组织。大鼠肾Glc  NAc  T-V的纯化及有关技术在Shoreibah  et  al.（1992）（见前）和实施例1-5中有描述。对小鼠、仓鼠和大鼠的调查表明，肾是这些啮齿动物中该酶最丰富的来源之一。从大鼠肾得到的基本纯净的Glc  NAc  T-V，在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳时，占优势的为69  KDa和75KDa的双条带。该酶制剂在20%甘油中于4℃可稳定保存数月。

表1

大鼠肾N-乙酰氨基葡糖转移酶Ⅴ的纯化下列结果以从300克冰冻大鼠肾脏制备而得的酶为基础。

步骤  体积  蛋白质  总活性  比活性  产率  纯化

ml  mg  nmol/h  nmol/  %  倍

(mg·h)

大鼠肾丙酮粉  3,300  13,900  2,221  0.16  100  1

Triton  X-100

提取物

UDP-己醇胺-  96  38.0  889  23.2  40  145

Sepharose

抑制制-BSA-  6  0.0078  568  73,000  26  450,000

Sepharose

为了证实来自于两个柱纯化体系的两条主要SDS-PAGE条带（69和75KDa）含有Glc  NAc  T-V，将一份纯化的酶制剂在1ml  UDP-己醇胺-琼脂糖层析柱再次色谱层析。结合物用若干配体UDP的分段洗脱液进行洗脱，而不是用第一次色谱层析中使用的单一浓度的NaCl。在用10mM或20mM浓度UDP洗脱的组分中都几乎没有检测到任何活性。50mM  UDP将大部分Glc  NAc  T-V活性物从层析柱上置换下来。用50mM  UDP加150mMNaCl洗脱得到一个小的洗脱峰。正如通过银染所判断的那样，再以色谱层析并没有导致Glc  NAc  T-V的纯度的进一步增加。当从两个柱纯化体得到的样品材料在抑制剂-BSA亲合性层析柱上再次色谱层析时，也得到了类似的结果。

一旦Glc NAc T-V被基本纯化，分析的条件便可优化。酶活性在20%甘油和0.5mg/ml IgG中稳定化并有所增加。对大体纯化的Glc NAc T-V，最适pH范围为6.5-7.0;最适的Triton X-100的浓度范围在约1.0-1.5%之间。酶活性在约0.2M NaCl时最大，而在高盐浓度下被抑制。当加入诸如MnCl₂，CaCl₂和MgCl₂时，二价最离子对表观酶活性只有极小的影响。加入20mMEDTA并不表现抑制。

使用优化的分析条件，定出了基本纯净的Glc NAc T-V酶的动力学参数。对寡糖受体（βGlcNAc（1，2）αMan（1，6）βMan-O-（CH₂）₈COOCH₃）的表观Km为87μM.，对UDP-Glc NAc的表观Km为11.0mM。对糖核苷酸的表观Vmax为18.8μmol/（mg·min）。

对氨基酸顺序分析，酶通过制备性的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步纯化，使用Applied  Biosystems公司的高效电泳仪器（High  Performance  Electrophoresis  Apparatus）（Applied  Biosystems，Foster  City，California）。将含酶的组份合并浓缩。接着加入乙醇并降温至-20℃从而使酶蛋白沉淀。沉淀用离心收集，洗涤并干燥。

尝试进行NH₂-末端的氨基酸测序，但是结果表明蛋白质的N-末端被封闭。基本纯净的大鼠肾Glc NAc T-V的样品用固定化的胰蛋白酶消化，再与固定化的胰蛋白酶分离。然后消化液中的肽用反相HPLC，在2.1×150mm VYDAC C18层析柱上，并用梯度的乙腈洗脱，从而得以分离。选择了4个肽的峰作气相测序。结果如下：

峰  ＃34  AsnThrAspPhePheIleGlyLysProThrLeuArg

（SEQ  ID  NO：1）

峰  ＃49  AlaIleLeuAsnGlnLysIleGluProTyrMetProTyrGluPheThr

（SEQ  ID  NO：2）

峰  ＃28  ValLeuAspSerPheGlyThrGluProGluPheAsn

（SEQ  ID  NO：3）

峰  ＃61  SerAspPro[Cys]TyrAla[Asp]Tyr[Glu]Val

（SEQ  ID  NO：4）

括号内的氨基酸残基表示不太确定。从四个峰得到的氨基酸的顺序在瑞士蛋白质数据库（Swiss  Protein  Data  Bank）中进行检索，推导出的简并的编码顺序在Genbank  data  base中进行检索。没有发现有显著同源的顺序。

对Glc  NAc  T-V部分氨基酸顺序的确定可以得到几套简并的寡核苷酸探针或引物，这样便能克隆相应的cDNA和基因组克隆。这些寡核苷酸可以用来研究控制编码Glc  NAc  T-V的基因的表达水平的转录和/或翻译机制。

根据相应于峰34和身49的内部肽的氨基酸顺序，设计了相应的简并的寡核苷酸用作PCR扩增编码Glc  NAc  T-V的cDNA顺序的引物。在此使用的核苷酸的简写符号与IUPAC的惯例是一致的：A代表腺嘌呤;C代表胞嘧啶;G代表鸟嘌呤;T代表胸腺嘧啶;I为次黄嘌呤核苷;R为A或G;Y或为C或T;H为A或C或T;D为G或A或T;以及N为A或C或G或T。根据峰34肽的前十个氨基酸的顺序而设计出的简并的29碱基的寡核苷酸作为引物1（SEQ  ID  NO：5）。引物1的反义对应物（SEQ  ID  NO：6），此处命名为反引物1，能作为PCR扩增存在于聚腺苷酸化的mRNA群体中的编码Glc  NAc  T-V的顺序。该mRNA群体是从细胞制备而来的，这些细胞包括（但不仅局限于）大鼠肾，小鼠淋巴瘤BW5147细胞和腹水生长和大鼠乳腺肿瘤MAT  C1细胞。

引物1：AAYACIGAYTTYTTYATHGGIAARCCNAC（SEQ  ID  NO：5）

反引物1：GTIGGYTTICCDATRAARAARTCIGTRTT（SEQ  ID  NO：6）

（反义）

根据与峰49相应的肽的最后10个氨基酸的顺序，设计了第二简并的29碱基的寡核苷酸：

引物2：ATHGARCCITAYATGCCITAYGARTTYAC（SEQ  ID  NO：7）

反引物2：TCRTAIGGCATRTAIGGYTCDATYTTYTG（SEQ  ID  NO：8）

（反义）

上面给出的反义引物同样能用于PCR扩增编码Glc  NAc  T-V的mRNA。一个本领域的普通熟练人员能根据此处公开的肽顺序和/或Glc  NAc  T-V顺序而设计出其他的寡核苷酸引物和“反引物”，从而用于引发PCR合成Glc  NAc  T-V编码顺序。

反义引物的顺序（反引物1和2），即SEQ  ID  NO：6和SEQ  ID  NO：8）是分别与相应引物1和2的顺序（SEQ  ID  NO：5和SEQ  ID  NO：7）互补的。不论是有意义的或反义的引物，还是更佳的PCR扩增产物引物1和反引物2，都能作为杂交探针或作为PCR引物，用来在大鼠肾cDNA文库，大鼠基因组文库或小鼠文库筛选编码Glc  NAc  T-V的克隆。引物与反引物的适当组合能用来引发使用从诸如大鼠肾细胞聚腺苷酸RNA制备的cDNA的PCR反应。可用这些引物和反义引物在PCR反应中扩增的顺序是那些编码部分Glc  NAc  T-V的顺序。

为了PCR扩增编码Glc  NAc  T-V的顺序，引物1和反引物2被用来引发PCR指导的DNA合成。引物2（SEQ  ID  NO：7）和反引物1（SEQ  ID  NO：6）的组合从两细胞系中都不产生扩增产物。使用从大鼠乳房肿瘤细胞系MAT  C1或从小鼠淋巴瘤细胞系BW5147制备的聚腺苷酸RNA，用引物1和反引物2进行扩增时，得到了约200bp的扩增产物，如图1所示。大鼠的扩增物DNA顺序在图6中给出，即SEQ  ID  NO：18。PCR反应中通过使用55℃而不是50℃作为退火温度，可以大大降低背景信号。结果同样表明在小鼠和大鼠的Glc  NAc  T-V编码顺序之间有高度的同源性。因此，此处公开的引物/反引物顺序能用于鉴别除了大鼠之外的来源的Glc  NAc  T-V基因和编码顺序。

用从MAT  C1聚腺苷酸RNA制得的cDNA作为模板，用引物1（SEQ  ID  NO：5）中反引物2（SEQ  ID  NO：8）作为引物，通过PCR扩增得到的扩增物被³²P标记，用作杂交探针。大鼠MAT C1基因组DNA和大鼠肾基因组DNA在单独的核酸内切酶反应中被消化，片段经琼脂糖凝胶电脉平行分开，并印迹于支持物，然后在低严紧程度的标准杂交条件下进行DNA-DNA杂交。杂交模式与编码Glc NAc T-V的单遗传座位十分相符。图2显示了用大鼠乳房肿瘤细胞系MAT C1与大鼠肝脏基因组DNA的Southern杂交的放射性自显影图。用Bgl Ⅱ，Bam HI/Bgl Ⅱ和NcoI消化，单一的杂交基因组条带的大小在2kb-10kb之间。再NcoI/XhaI消化，杂交条带的大小大约在6-9kb之间。常规的实验方法能更精确地估计条带大小。在本实验中用到的约180bp的扩增能用于筛选cDNA或基因组文库以鉴别Glc NAc T-V顺序。能进行标准的“步行”（“Walking”）实验法以得到在杂交片段两侧的顺序（在克隆了该片段之后），从而分离完整的基因。

具有引物1和2（SEQ  ID  NO：5和7）或反引物1和2（SEQ  ID  NO：6和8）的顺序，或者较佳地用引物1和反引物2作为引物而得到的PCR扩增产物（即扩增物），标记后，能成功地作为杂交探针用于从不同来源制备而得的cDNA文库中筛选出编码Glc  NAc  T-V的顺序，这些来源包括小鼠淋巴瘤BW5147细胞，小鼠3T3细胞和腹水生长的大鼠乳腺MAT  C1细胞。

当来自于部分小鼠cDNA克隆的编码区域的Hind  Ⅲ/Bgl  Ⅱ限制性片段作为杂交探针，用于被琼脂糖凝胶电泳分开的大鼠肾mRNA的Northern印迹时，与明显的降解产物一起出现了一条约7kb的条带。因此，Glc  NAc  T-V  mRNA的尺寸是大的，在制备（或选择）cDNA文库（从该文库分离分全长的Glc  NAc  T-V编码顺序）时应格外小心。

实施例7-10描述了采用PCR-cDNA策略成功鉴别和克隆大鼠Glc  NAc  T-V编码顺序的各步骤。在其他实验中，通过PCR制得约170-200碱基的扩增物。该扩增物用来筛选小鼠cDNA文库，并分离到约1.7kb的部分克隆。顺序分析表明该长的开放阅读框架中并不含起始密码子，通过开放阅读框架决定了约300个氨基酸。从大鼠1-EJ细胞的mRNA制备cDNA文库，再从来自该cDNA文库的子集（subsets）的DNA克隆的培养物中制备质粒DNA，使用该质粒DNA进行了一系列的PCR扩增和筛选步骤（见实施例7-8）。

带有全长Glc  NAc  T-V编码顺序的约4.8kb的大鼠cDNA克隆被分离出。一部分cDNA被测序，得出的DNA顺序显示于SEQ  ID  NO：15。编码顺序从位于核苷酸299开始的ATG起始密码子一直延伸至核苷酸2521处的终止密码子。6个潜在的N-糖基化位点在天冬酰胺残基处，即氨基酸编号109，114，117，333，430和446。推定的跨膜区域包括氨基酸14-30。大约有300  bp  5′不翻译顺序，在其后为2220  bp的编码顺序和约100  bp  3′不翻译区域。

推导出的氨基酸顺序（84，561）给出于SEQ  ID  NO：16。预计的编码Glc  NAc  T-V的分子量比在SDS-PAGE凝胶电泳中观察到的蛋白质条带的分子量要大。当在大量过量的混合蛋白酶抑制剂的存在下从大鼠肾纯化Glc  NAc  T-V时，除了69  KDa和75  KDa的条带之外，还观察到一绦约95  KDa的条带。当使用具放射活性的光亲和（photoaffinity）活性位点标记物标记活性酶时，所有的三条带都被标记。这些观察结果暗示着，75  KDa和69KDa条带代表了更大的蛋白质的蛋白酶水解片段。95  KDa条带似乎代表了SEQ  ID  NO：15编码的多肽的糖基化的形式。鉴定了6个潜在N-连接糖基化位点：即位于SEQ  ID  NO：16中氨基酸顺序109，114，117，333，432和446位于的天冬酰胺残基。通过使用kyte和Doolittle的方法而进行的疏水性分析鉴别出一个可能的跨膜区域，即从氨基酸14-30，这个提出的跨膜区域具有Ⅱ型膜蛋白的特征，并且与高尔基体腔的其他酶相似。

在推导出的大鼠Glc  NAc  T-V的氨基酸顺序（SEQ  ID  NO：16）中，与峰＃S34，49和28相对应的顺序分别为氨基酸546-557，592-607和375-386。峰＃61的氨基酸顺序（SEQ  ID  NO：4）位于SEQ  ID  NO：16中的氨基酸168-177。肯定了半胱氨酸和谷氨酰胺残基的位置。以SEQ  ID  NO：15为基础，在SEQ  ID  NO：4中第九位的氨基酸被推导为甘氨酸，而不是谷氨酸。

在生物学领域，有一点是公知的，即在一个蛋白质内的某些氨基酸可被取代而不影响该蛋白质的功能。最后这样的取代是大小和/或电荷特性相似的氨基酸。例如，Dayhoff  et  al.（1978）在Atlas  of  Protein  Sequence  and  Structure，第5卷，补充3，第22章，345-352页中（该内容在此作为参考结合使用）提供了氨基酸取代的频率表，能用作氨基酸相似性的衡量标准。Dayheff  et  al的频率表是根据大量进化上不同来源但却有同样的功能的蛋白质的氨基酸顺序的比较得出的。

两个小鼠Glc  NAc  T-V部分克隆被顺序。将推导出的小鼠编码顺序与SEQ  ID  NO：15和16中的相应的大鼠Glc  NAc  T-V氨基酸387-740进行比较。从初步测得的比较中，得到的小鼠顺序的推导的氨基酸唯一的差别在对应于大鼠氨基酸679处。推导的大鼠的氨基酸为异亮氨酸，而小鼠的氨基酸为苏氨酸。对得到的核苷酸顺序的编码区域的比较表明，约有95%的顺序同源性。将得到大鼠的103个碱基顺序与小鼠的3′非编码区域的比较表明约有88%的顺序同源性。因此，小鼠和大鼠的编码和非编码顺序（3′端的）是高度保守的，尤其编码区域，（其核苷酸的差别）除一外之处，所有的核苷酸差别都是同义突变。

由部分DNA顺序分析确定的含有表现全长Glc  NAc  T-V编码顺序的4.8  kb  cDNA插入片段被亚克隆入pJT-2表达载体并用电穿孔法导入COS-7细胞（见实施例11）。在电穿孔法导入后培养3或4天，收获转染的细胞，冰冻，随后测定Glc  NAc  T-V活性。用pJT-2但不插入DNA的平行制备的转染细胞作为对照。估计约3%的细胞被有效地用电穿孔法导入。表2中的数据表明，克隆的大鼠cDNA片段编码有功能的Glc  NAc  T-V酶。

表2：在瞬间表达分析中的Glc  NAc  T-V的活性

样品  电穿孔导入后的培养小时  比活性

(pmol/mg^*hr)

COS-7(pJT-2)  68  38

92  65

COS-7(pJT-2-TV)  68  624

92  499

对于普通熟练的技术人员而言，出于所需目的而使用此处提供的DNA顺序信息优化Glc  NAc  T-V在特定的表达载体和细胞系中的表达，将只是常规实验而已。通过遗传工程从而含有并稳定表达Glc  NAc  T-V编码顺序的细胞系能用于重组表达具有（依赖于Glc  NAc  T-V的糖蛋白修饰的）糖基化特征的蛋白质产物。任何该领域公知的手段都能用于将可表达的Glc  NAc  T-V编码顺序引入细胞，从而产生重组宿主细胞，即通过遗传工程构建一个这样的宿主细胞。可高水平表达Glc  NAc  T-V的重组宿主细胞能用作纯化Glc  NAc  T-V的来源，比如，用于研究Glc  NAc  T-V活性的抑制剂，从而防止或减缓肿瘤的转移。Glc  NAc  T-V的编码顺序能用于制备与Glc  NAc  T-V特异的反义结构，从而在所需要的地方例如，在转移中的肿瘤中抑制Glc  NAc  T-V的表达。

出于阐述和实现发明的目的提供以下实施例。这些实施例并不用来限定本发明的范围。实施例中用到许多公知的，而且对分子生物学和生物化学领域的熟练技术人员来说是可以理解的技术。对于熟练的技术工人来说，有一点是十分明显的，即能对此处公开的方法进行修改，并且能对DNA顺序进行修改，并保留所期望得到的结果。对于本领域的普通熟练技术人员而言，有一点很明显，即在此公开的核苷酸顺序及氨基酸顺序使得重复实施例来实施本发明变得没有必要了。所有在此说明书中提及的参考文献在此以参考形式一起表述。

实施例1  UDP-己醇胺琼脂糖的制备

按Barker  et  al.（1972）J.Biol.Chem.247：7135-7147所述方法制备UDP-己醇胺并将其偶联到CNBr激活的琼脂糖凝胶4B（SEPHAROSE  4B）上。SEPHAROSE（Pharmacia，Piscataway，N.J.）的取代以每毫升沉降的凝胶14μmol  UDP-己醇胺的水平为临界点，每毫升6μmol和9μmol的取代水平只得到明显低活性产量。

实施例2  从大鼠肾脏提纯GlcNAc  T-V

冰冻的大鼠肾脏购自Pel冷冻生物有限公司（Rogers  Arkansas）。

在4℃下，在Waring混合器中，将300g冰冻大鼠肾脏用3升冷丙酮制成匀浆。除非另指，以后的步骤均在4℃下进行。在Whatman  4号滤纸上收集丙酮不溶物。将丙酮不溶物在丙酮中再匀浆，再过滤。所得粉末在1.8升缓冲液A〔0.1M乙酸钠（pH6.0），0.2M  Nacl，0.01m  EDTA〕中搅拌30分钟。在7100×g下离心15分钟收集存留物。沉淀用缓冲液A再提取并再离心。

然后将所得沉淀在2升水中搅拌，并离心收集。在洗涤过的存留物中加入如下蛋白酶抑制剂：0.1mM  PMSF、0.05mM/ml抑蛋白酶肽（apzotonin）、0.5mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂、0.5μg/ml亮抑蛋白酶肽（leupaptin）和1μg/ml胃蛋白酶抑制剂（pepstatin）。然后将此混合物在1升缓冲液B〔0.01M  Tris-HCl（pH7.8），0.4M  KCl〕中制匀浆。

将所得匀浆在1%TritonX-100（W/V）中搅拌30分钟。悬浮液在7100xg下离心20分钟，得第一提取液（上清液）。将颗粒再匀浆两次，用TritonX-100溶解，用离心法使其澄清，得到第二和第三提取液。

合并三次提取液，用20升缓冲液C〔50mM  MES（pH6.5），0.2%（W/V）TritonX-100，5mM  EDTA，0.05%叠氮钠〕透析72小时以上，透析缓冲液换一次。所得透析物经离心达到澄清，然后测定蛋白质浓度和酶活性。

在第一步亲和层析中，将3升丙酮粉末Triton提取液加到用缓冲液C预平衡的1.2×7cm  UDP-己醇胺琼脂糖（Sepharase）柱上。用约400ml缓冲液C洗柱，然后用缓冲液C+0.5M  Nacl洗脱。收集各级份，测定GlcNAc  T-V活性。

将从UDP-己醇胺琼脂糖柱上洗脱下来的活性级份合并（约100ml），用缓冲液C透析。将透析物转到1mM  UDP-GlcNAc和20%甘油中，加到用缓冲液D（50mM  MES，pH6.5;0.1%Triton  X-100;20%甘油;0.05%叠氮钠）预平衡的1.2×3cm抑制剂-BSA-琼脂糖（Sepharose）柱上，再用无UDP-ClcNAc的20ml缓冲液D洗柱。最后停柱，回至室温中，然后用pH已调至8.0的含500mM  NaCl的缓冲液D洗脱。收集各级份，测定GlcNAc  T-V活性。

将从抑制剂-BSA亲和层析柱上得到的活性级份合并，取其中1份（0.1ml）用缓冲液C透析，并加到用缓冲液D预平衡的0.4×8cm  UDP-己醇胺琼脂糖柱上。然后将柱用在缓冲液D中UDP含量渐增（10mM  UDP，20mM  UDP，50mM  UDP+120mM  NaCl，最后是100mM  UDP+150mM  NaCl）的缓冲液进行洗脱。收集各级份，测定GlcNAc  T-V活性。（在这一提纯步骤中，既可用缓冲液D洗脱，也可用如下洗脱液洗脱：50mM卡可酸钠，pH6.5;0.1%Triton  X-100;20%甘油;0.05%叠氮钠，其中含有如上缓冲液D洗脱液中那样增大的NaCl浓度。）

用真空离心蒸发浓缩器（Speed  Vac.）（快速真空干燥器）将等量的每一级份通过减压、升温浓缩。将浓缩的样品在一倍凝胶样品缓冲液中煮沸使蛋白质还原及变性后，在10%SDS-丙烯酰胺凝胶上将各种级份进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Laemmli（1970）Nature  227：680-685）。按Morrisey（1981）Anal.Biochem.117：307-310所描述的方法，将凝胶作银染，以显现物质。

实施例3  GlcNAc  T-V活性测定

在提纯过程中测定活性的典型放射化学测定法包括如下试剂，它们在1.5ml锥形离心管中真空干燥：2mM ADP（焦磷酸酶抑制剂），2.5mM β-甲基GlcNAc（β-（氨基己糖苷酶）抑制剂），10⁶cpm UDP-〔6-³H〕-GlcNAc（10cpm/pmol）和1mM合成的受体（β-D-GlcNAc）-（1，2）-α-D-Man-（1，6）-β-D-Man-O-（CH₂）₈CO₂Me，总体积为10μl。

为了启动反应，将0.01ml样品〔在含50mM  MES（pH6.0），0.1%Surfact-Amps（Triton）X-100（pierce，Rockford，Illinois）的缓冲液中〕加到干试剂中，于37℃下温育几小时。

加0.5ml水到每一管中，充分混旋，以终止反应，将管中的内容物离心。然后将上清液加到用甲醇活化并用水预平衡的C18  Sep-Pak薄膜柱（Millipore，Bedford，Massachusetts）上。用200ml水洗柱以除去来自未反应底物和降解产物的水溶性放射活性物质。然后用0-100%甲醇梯度洗脱GlcNAc  T-V反应的放射标记产物，用液体闪烁计数对放射活性进行定量。所有测定试验均采用双管法，结果求平均值。为了制作表1，至少进行两次单独实验，结果加以平均。从双管法得到的数值或单独实验得到的数值之间的差值不超过±10%，典型地为小于平均值的±2%。

然后，借助疏水基团，用C-18层析将放射标记产物从未反应的受体和放射标记的UDP-GlcNAc中分离出来。

一旦GlcNAc  T-V蛋白被提纯，测定中的以下参数为最佳：20%甘油，近生理水平的NaCl（约200mM），0.5mg/ml  IgG，pH约6.5-7.0，Triton  X-100浓度约1.0-1.5%。

用Crawely et al.（1990）Analytical Biochem.185：112-117所描述的酶联免疫吸附试验（ELISA）测定GlcNAc T-V蛋白。该ELESA使用未标记的UDP-GlcNAc和连结于BSA的三糖受体（β-D-GlcNAc）-（1，2）-α-D-Man-（1，6）-β-O-Man-D-（CH₂）₈CO₂Me。本试验依赖于使用对GlcNAc T-V反应的四糖-BSA产物有特异性的多克隆抗体。由于ELISA的高度敏感性，例如，含抑制量NaCl的柱级份可以不经预先透析而采用简单地稀释样品的方法进行试验。在每一试验中作出标准校正曲线，通过与放射化学试验测得的已知GlcNAc活性的样品所得到的数值进行比较，将吸附（或相应的活性）与比活性相关连。

实施例4  小量蛋白质的测定

采用BCA蛋白测定法（Pierce，Rockford，Illinois），以采用标准聚苯乙烯96孔板（Pierce，Rockford，Illinois）的微量滴定板形式，测定提纯过程中柱级份的蛋白质含量。以BSA为标准蛋白质。

实施例5  抑制剂、受体、底物和亲和吸附剂的制备

按Barker  et  al.（1972）J.Biol.Chem.247：7135-7147所描述，合成UDP己醇胺并偶联于CNBr活化的琼脂糖支持物（SEPHAROSE  4B）上。相对于支持物的配体浓度为每毫升沉降凝胶14μmol。

按Palcic  et  al.（1990）J.Biol.Chem.265：6759-6769所述，合成GlcNAc  T-V活性的去氧寡糖抑制剂n-辛基-6-0-〔2-0-（2-乙酰氨基-2-去氧-β-D-吡喃葡萄糖基）-6-去氧-α-D-吡喃甘露糖基〕-β-D-吡喃葡萄糖苷，并用于试验中。

按Pinto et al.（1983）Carbohydr.Res.124：313-318的方法，将类似的GlcNAc T-V寡糖抑制剂βGlc NAc-（1，2）-6-去氧-α-Man-（1，6）-β-Man-O-（CH₂）₈COOCH₃连结到BSA上，用作亲和层析配体。在柱上的配体是模拟GlcNAc T-V天然寡糖受体的活性部位抑制剂，但含一代替反应性6′-羟基的氢原子。在-15℃下，将该抑制剂寡糖（4.1mg）转移到酰基叠氮上，成为25mM DMF（二甲基甲酰胺）溶液。然后加入222.2mg BSA（Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri）〔在2ml 0.35M KHCO₃和0.07M Na₂B₄O₇（pH9.0）中〕。将所得溶液在4℃下保持24小时，然后在Amicon PM-10超滤膜（Amicon，Inc.，Division of WR Grace，Danvers，Massachusetts）上用蒸馏水充分地透析。将透析物冻干，再溶解。用Bradford测定法（Bradford（1976）Analyt.Biochem.72：248-254），以BSA为标准品，测定蛋白质含量。用苯酚-硫酸法（Dubois et al.（1956）Analyt.Chem.28：350-356）测定糖类含量。结果表明，每分子BSA掺入了13个寡糖分子（67%偶联度）。

按Stults et.al.（1989）Analyt.Biochem.180：114-119所述，用NH₂（CH₂）OH-HCl为最终阻断剂，将3.6mg抑制剂-蛋白质复合物偶联到3ml高碘酸氧化的琼脂糖（SEPHADEX CL-6B，Pharmacia，Piscataway，New Jersey）上。如Bradford蛋白质测定结构法所测出的，34%寡糖-BSA复合物偶联到琼脂糖上，使每毫升沉降的凝胶上最终掺入0.07μmol配体寡糖。

关于三糖寡糖受体及其合成的描述见Palcic  et  al.（1990）supra;Pierce  et  al.（1987）Biochem.Biophys.Res.Commun.146：679-684;Arango  et  al.（1988）J.Cell.Biochem.37：225-231;and  Srivastava  et  al.（1988）Carbohydr.Res.179：137-161.

实施例6  GlcNAc  T-V特异性抗体的产生

加入3倍体积无水乙醇将GlcNAc  T-V从贮备缓冲液中沉淀出来，使其在4℃下静置30分钟。离心收集沉淀的蛋白质（10，000×g，10分钟0，再悬浮于0.3ml缓冲液D中，与1.0ml福氏完全佐剂混合。将所得乳剂经背部皮内注射2只家兔，剂量为50-75ml/部位或约75μg蛋白质/部位。在首剂后14天，每只家兔接受每剂150μg的加强注射，在首次注射后21、34、57和64天，每只家兔接受75μg。每周一次从每只家兔的耳静脉采血10-20ml，制备血清，贮于-20℃。评估GlcNAc特异性抗体的相对水平，通过测定用人造底物作为受体的试验中抑制50%活性所需的血清量来进行。合并具有最高活性的血清样品。

用纯化的大鼠肾脏GlcNAc  T-V免疫小鼠后，按标准方法制备对大鼠肾脏GlcNAc  T-V特异性的单克隆抗体（例如，Campbell（1984）Monoclonal  Antibody  Technoloqy：Laboratory  Techniques  in  Biochemistry  and  Molecular  Biology（Burdon  and  van  Knippenberg，eds.）Vol.13，Elsevier，Amsterdam;Harolw  and  Lane（1988）Antibodies：A  Laboratory  Manual，Cold  Spring  Harbor  Laboratory，Cold  Spring  Habor，New  York）.

实施例7  含大鼠GlcNAc  T-V序列的PCR片段的分离

A.大鼠1-EJ  cDNA文库构建

大鼠1-EJ  cDNA文库以前已构建。用标准方法（Maniatis  et  al.，1982）从转染了人EJ基因，一种活性的Harvey  ras基因，（Peles  et  al.（1992）Cell  69：205-216）的大鼠1细胞分离出信使RNA。用mRNA分离试剂盒（Clontech  Lab，Inc.，PaJo  Alto，CA）选择聚腺苷酸mRNA，用Superscript盒（BRL  Life  Technologies，Inc.，Bethesda，MD）合成cDNA。将柱分级的双链cDNA连接到SalI和NotI消化的pSPORT-1质粒载体（BRL  Life  Technologies，Inc.，Bethesda，MD）中，并用电穿孔法转化到Escherichia  coli  DH10B细胞中（Dower  et  al.（1988）Nucl.Acids  Res.16：6127-6145）。SalI位点在每个克隆cDNA序列的5′端，NotI位点在3′端。将转化的E.coli  DH10B细胞增殖为43个各自独立的小库，从每个小库分离出质粒DNA。

B.寡核苷酸的设计和构建

分析来自小鼠、大鼠和人的大约180bp  PCR扩增物（amplimer）序列，设计复盖小鼠、大鼠和人序列相同区域的特异寡核苷酸。

引物A：474-14  GGGCCATGAAGACTTCTGCG

（SEQ  ID  NO：9）

（反义）

引物B：474-16  GGGCTACTTCCTCTCGGTTATTGAG

（SEQ  ID  NO：10）

（反义）

此外，用克隆载体pSPORT-1的T7启动子序列设计寡核苷酸。

引物T7：476-30  GCTCTAATACGACTCACTATAGG

（SEQ  ID  NO：11）

（有意义）

C.大鼠1-EJ  cDNA文库的PCR扩增

将来自大鼠1-EJ  cDNA文库的每一小库的一份质粒DNA合并，形成大鼠1-EJ  cDNA文库DNA混合物（大鼠1-EJ  cDNA库）。用引物T7：476-30（SEQ  ID  NO：11）和B：474-16（SEQ  ID  NO：10），在大鼠1-EJ  cDNA库上进行PCR。pSPORT-1的T7序列位于cDNA合成中所用的5′SalI克隆位点的上游。因此，用寡核苷酸T7：476-30（SEQ  ID  NO：11）引发PCR，合成复盖cDNA5′顶端并在编码序列的3′端方向上延伸的扩增物。PCR产物延伸编码序列到引物B：474-16（SEQ  ID  NO：10）中，它位于约200bp扩增物中。

PCR是采用GeneAmp  DNA扩增盒（Perkin  Elmer  Cetus，Norwalk，CT），按制造商的说明进行的。简言之，100μl反应液组成如下：

8μl Mgcl₂25mM

10μl  10xPCR  缓冲液

70.8μl  灭菌水

2μl  dGTP  10mM

2μl  dATP  10mM

2μl  dTTP  10mM

2μl  dCTP  10mM

1μl  dCTP  10mM

1μl  T7:476-30引物  15μM

1μl  B:474-16引物  15μM

500ng  大鼠1-EJ  cDNA  文库DNA

用矿物油（Sigma，St.Louis，MO）复盖反应混合物，将其放在DNA温控循环仪（Perkin  Elmer  Cetus）中。在加热起始步骤中加入Taq多聚酶（0.5μl，2.5U），温控循环进行如下：

用琼脂糖凝胶电泳分析一份反应产物（0.8%琼脂糖，在含溴化乙锭的Tris硼酸盐EDTA缓冲液（TBE）中），将凝胶照相（图7）。在溴化乙锭染色的凝胶上可见在约1200bp处的一个主要区带，还有一些较小的次要区带。

D.PCR产物的Southern杂交

在PCR后，将实施例7C的产物用琼脂糖凝胶电泳法分离，并用标准的Southern印迹法进行分析。简言之，通过在1.5MNaCl、0.5N  NaOH中浸泡30分钟使凝胶变性。然后通过在1.5M  NaCl、0.5M  Tris-HCl（pH7.5）中浸泡30分钟来中和凝胶。将凝胶上的DNA在10x  SSC中过夜，通过毛细管作用转移到硝基纤维素上。转移后，将硝基纤维素用6x  SSC漂洗，空气中干燥，并在UV  stratalinker（Strategene，La  Jolla，CA）中交联。

用增强的化学发光3′寡聚标记和检测系统盒（Amersham，Arlington  Heights，IL），按制造商的说明将硝基纤维素预杂交、杂交和标记。预杂交在50℃进行30分钟。杂交在50℃进行约1.5小时，用约8ng/ml寡核苷酸探针A：474-14（SEQ  ID  NO：9）。

杂交后，将硝酸纤维素用5x  SSC、0.1%SDS在室温下洗两次，每次5分钟，然后用1x  SSC、0.1%SDS在50℃下洗两次，每次15分钟。然后按试剂盒说明书进行辣根过氧化酶抗体显色和ECL检测。

将硝酸纤维素在室温下使X光片曝光20分钟。硝酸纤维素的放射自显影显示约2.1kb的单一区带（图8）。这一特异但罕见的PCR产物在溴化乙锭染色的凝胶上是看不见的。

E.特异PCR产物的扩增

因为实施例7D描述的特异性2.1kb  PCR产物的是如此之少，以致只能用放射自显影检测，便将它通过PCR进行扩增。先切下琼脂糖凝胶区域，在该凝胶上特异性DNA预期已发生迁移。用S  &  S  Elu-Quik  DNA纯化盒（Schleicher  &  Schuell，Keene，NH），按制造商的说明从凝胶上洗脱DNA。在一份洗脱的DNA上进行PCR反应。5′端使用引物T7：476-30（SEQ  ID  NO：11），3′引物为：

485-26  GGGTACGTGTGAATGATATCCAGGTAG

（SEQ  ID  NO：12）

（反义）

此寡核苷酸序列位于2.1kb  PCR片段的3′端上游约350bp。此序列是通过部分由小鼠cDNA顺序测定阐明的，该部分小鼠cDNA是通过用约200bpPCR扩增物序列筛选小鼠淋巴瘤BW5147库而分离得到的。

用洗脱的2.1kb  PCR片段为模板的100μlPCR反应液配制如下：

8μl Mgcl₂25mM

10μl  10xPCR缓冲液

61.5μl  灭菌水

2μl  dGTP10mM

2μl  dATP10mM

2μl  dTTP10mM

2μl  dCTP10mM

1μl  T7:476-30引物15μm

1μl  485-26引物15μm

10μl  洗脱的2.1kbPCR片段

按实施例7C所述，处理反应混合物，温控循环安排如下：

用琼脂糖凝胶电泳分析一份反应产物（0.8%琼脂糖，在含溴化乙锭的TBE中），将凝胶照相（图4）。溴化乙锭染色的凝胶的分析显示约1.8kb的单一DNA区带。

F.DNA序列分析

用Taq染料双脱氧末端终止循环测序盒（Taq  DyeDioxy  Terminator  cycle  sequencing  kit）（Applied  Biosystems，Inc.，Foster  City，CA）和自动DNA序列仪（Applied  Biosystems  373A），按制造商的说明，将实施例7E所描述的约1.8kb  PCR产物进行序列分析。在通过Centricon-100  unit（Amicon，Beverly，MA）和用灭菌水洗涤后，进行PCR片段序列分析。在某些情况下，将PCR片段亚克隆进pUC13载体（Promega，Madison，WI）后再测定。用合成的寡核苷酸为引物进行核苷酸序列分析。

PCR片段约1750bp的序列分析和所有可能的阅读框架的分析显示与部分小鼠BW5147  cDNA序列重叠。部分小鼠cDNA含未翻译的3′序列及可编码约295个氨基酸的约885个碱基的开放阅读框架，但无起始密码子。PCR片段的序列分析通过外加约445个氨基酸残基而延伸了开放阅读框架编码区域，并定位甲硫氨酸ATG超始密码子。此外，在PCR片段上鉴定了未翻译的5′区域的300bp。

或者，用下面的方法可分离编码GlcNAc  T-V的cDNA克隆。

在按标准方法从大鼠肾脏组织及按Sambrook  et  al.，（eds）（1989）（见前）所述从小鼠淋巴瘤BW5147细胞和从腹水生成的大鼠乳腺MAT-C1细胞的平行分离中制备了总RNA。ATCC  T1B47是适应于培养物的BW5147细胞系的一个克隆（BW5147.3）（J.Natl.Cancer  Inst.（1973）51：883;J.Immunol.（1973）110：1470）。MAT  C1细胞的描述见Carraway  et  al.（1976）J.Biol.Chem.251：6173-6178。总RNA的聚腺苷酸部分按Sam-brook  et  al.（eds）（1989）（见前）所述用寡（dt）纤维素层析法加以制备。编码GlcNAc  T-V的聚腺苷酸mRNA包括在这样制成的聚腺苷酸RNA中。

按Sambrook  et  al.（eds）（1989）（见前）的方法，用从大鼠肾脏、小鼠淋巴瘤BW5147细胞和MAT-B1细胞总RNA制得的聚腺苷酸RNA可制备cDNA文库。将cDNA群体克隆进合适的载体（如入gt11）按标准方案进行（例如见Huynh  et  al.（1985）in  DNA  Cloning  a  Practical  Approach  Vol.1（Glover，D，M.，ed），IRL  Rress，Washington，D.C.，PP.49-78）。

商业上可得到的cDNA文库（例如，大鼠肾脏cDNA文库Clontech  Laboratories，Palo  Alto，California）也可用来筛选Glc-NAc  T-V克隆。

使用如Sambrook  et  al.，（eds.）（1989）（见前）所述用随机六聚物标记物作放射标记的约200bp扩增物，在不太严紧的条件下进行空斑杂交，从cDNA文库筛选编码GlcNAc  T-V的序列。选择与扩增物序列特异性杂交的克隆作进一步分析（限制性内切核酸酶消化，核苷酸序列测定）。

用诸如引物1（SEQ  ID  NO：5）或引物2（SEQ  ID  NO：7）或合用引物1和2，可从大鼠（或小鼠或其他哺乳动物）鉴定编码GlcNAc  T-V的基固组克隆，或用引物1（SEQ  ID  NO：5）和反引物2（SEQ  ID  NO：8）可引发如上所述PCR合成于其上的扩增物以鉴定适当的基因组序列。

从所分析的克隆可重建GlcNAc  T-V的完全编码序列。如果不能重建全长编码序列，可按Frohman  et  al.（1988）Proc.Natl.SCi.USA  85：8998-9002所述，用靠近已分析序列区域末端的序列，设计进一步的引物，用于RACE程序（cDNA末端的快速扩增）。在需要完整基固时，可筛选基因组文库，并用现有技术中已知的“步查”方法，向两个方向延伸。

实施例8  编码GlcNAc  T-V的大鼠cDNA序列的克隆

A.大鼠1-EJ文库的Southern杂交

将含有从43个独立的大鼠1-EJ  cDNA文库的小库中所得的NotI-直链化质粒DNA的硝基纤维素滤膜进行标记检测，以鉴定哪些小库含有全长GlcNAc  T-V  cDNA。cDNA探针来自部分小鼠cDNA编码区，并以HindⅢ/PsyⅠ片段得到，该片段从大鼠1-EJPCR片段ATG序列的下游约855bp开始，向序列的3′末端延伸约650bp。

按Sambrook et al.，（eds.）（1989）（见前）所述，在42℃下将硝基纤维素滤膜与预杂交溶液一起培养。然后，用多重引发DNA标记系统盒（Amersham）以〔α³²P〕-dCTP标记的约650bp小鼠cDNA探针培养过夜，进行杂交。将硝基纤维素滤膜洗涤，并于-80℃下与带增感屏的X光片曝光过夜。滤膜的放射自显影揭示，在所筛选的43个小库中有4个是阳性的。

B.大鼠1-EJ文库小库的PCR分析

用从实施例8A鉴定出的4个阳性大鼠1-EJ  cDNA文库小库的每一个所得到的模板DNA进行PCR，以确定哪个小库含有全长cDNA。除了使用如下引物外，反应按实施例7C所述进行：

引物  501-16  CCCGTCGACGAGAGCCAAGGGAATGGTAC

（SEQ  ID  NO：13）

（有意义）

引物496-2  CCCAGCAGGTACAGAGATGTG

（SEQ  ID  NO：14）

（反义）

通过大鼠1-EJ  PCR片段序列分析确定引物501-16（SEQ  ID  NO：13），以在ATG起始密码子上游约15-35个碱基的5′未翻译区进行杂交。经序列分析确定引物496-2（SEQ  ID  NO：14，以在ATG超始密码子下游约900个碱基的编码区内进行杂交。因此，用这两个引物进行PCR得到复盖编码区5′端的长度约900bp的预期的产物。温控循环进行如下：

按实施例7C所述，用琼脂糖凝胶电泳分离出一份反应混合物。溴化乙锭染色分析表明，4个小库中2个有大小正确的区带（约900bp）。这一信息，连同用大鼠1-EJ  cDNA文库的Southern杂交（实施例8A）所得到的区带大小，揭示了一个小库可含有全长GlcNAc  T-VcDNA。

C.用菌落杂交方法筛选大鼠1-EJ  cDNA的文库

将从上述实施例8B鉴定的大鼠1-EJ  cDNA文库之一的甘油贮存物中得到的转化E.coli以每10×10cm平板约4，500克隆的密度涂布于含50μg/ml氨苄青霉素的营养物平板上。用硝基纤维素滤膜使克隆从平板上分离下来。将滤膜（克隆化的一面向上）依次放在一片用如下溶液饱和的Whatman  3MM滤纸上进行处理：

1.1.5M  NaCl，0.5N  NaOH，10分钟

2.1.5M  NaCl，0.5M  Tris-HCl（pH7.5），5分钟

3.2x  SSC，5分钟

然后将滤纸在空气中干燥，用紫外照射法进行交联。再在含0.2%SDS、100mM  Tris-HCl（pH8.5）、50mM  NaCl、10mM  EDTA（pH8）和50μg/ml蛋白酶K的溶液中在55℃下培养30分钟，用蛋白酶K进行消化。再将滤纸转移到含5x  SSC、0.5%SDS和1mMEDTA（pH8）的溶液中，在55℃下培养30分钟。用ECL  3′寡聚标记和检测系统盒（Amersham）在如下条件下进行预杂交、杂交和随后的处理：

1.在53℃下进行预杂交约2小时;

2.用引物501-16（SEQ  ID  NO：13）约7ng/ml，在50℃下培养过夜，进行杂交。

在杂交后，按实施例7D所述洗涤滤膜。经ECL检测后，将滤膜在室温下X光片曝光4分钟。

在所筛选的36，000个克隆中，挑出24个克隆及克隆的混合物用于进一步的PCR分析。除了用20μl反应液和将吸管尖端接触细菌平板然后将吸管尖端浸入PCR混合液以得到模板外，按实施例8B所述的方法进行PCR。用矿物油复盖后，将PCR管在温控循环仪中在94℃下培养4分钟，然后加入0.2μl  Taq聚合酶。采用以下温度控制方式：

如实施例7C所述，用琼脂糖凝胶电泳分离一份反应混合物。溴化乙锭染色的凝胶的分析揭示，在24个受试混合物中有3个为阳性。

如上所述，将3个阳性混合物再制板并用引物496-2（SEQ  ID  NO：14）为探针检测，按ECL  3′标记和检测试剂盒的说明书，在53℃下进行预杂交和杂交分别为30分钟和约2小时。如上所述进行洗涤，并在室温下放射自显影20分钟。X光片分析揭示，在所筛选的约600个克隆中有1个为阳性。除了反应液体积为50μl外，如上所述，以501-16（SEQ  ID  NO：13）和496-2（SEQ  ID  NO：14）为引物，用PCR分析确认这一克隆。

除了预杂交和杂交在55℃下进行之外，如上所述，将从上面得到的这一阳性克隆混合物以低密度再制板，并用引物496-2（SEQ  ID  NO：14）为探针检测。将滤膜X光片曝光2分钟，显示在所筛选的约300个克隆中有7个为阳性。

D.大鼠1-EJ  cDNA序列分析

从实施例8C描述的最终阳性的克隆中的4个克隆分离出质粒DNA。限制性酶分析揭示，这些质粒每个都含有约4.8kb的cDNA插入物。用实施例7F所述方法对这些质粒之一进行核苷酸序列分析。结果见于SEQ  ID  NO：15。

图8中，起始DNA序列标明约300个碱基的有意义链，其中看来包含位于大鼠GlcNAc  T-V  cDNA的翻译部分与之前的5′未翻译区域。紧跟着的序列被认为是编码大鼠GlcNAc  T-V的氨基酸序列的。这一区域跨越2220个碱基，编码740个氨基酸和一个终止密码子（TAG）。相继的序列似乎是大鼠GlcNAc  T-V  cDNA的未翻译的3′区。根据质粒DNA的限制性酶谱分析，这一cDNA的3′未翻译区似乎长度为约2300个碱基。只有这3′未翻译区的前面约100个碱基存在于SEQ  ID  NO：15中。

SEQ  ID  NO：16从而提供大鼠GlcNAc  T-V的一级结构（氨基酸序列），包含740个特异的氨基酸残基（估测的M.W.＝84，561）。成熟大鼠GlcNAc  T-V多肽可能发生N-偶联糖基化作用的六个部位用星号标在图10中。

实施例9  Southern杂交

在用限制酶（BglⅡ、NcoⅠ及NcoⅠ/XhaⅠ和BamHⅠ/BglⅡ）按提供者说明书进行的平行反应中，将适量大鼠乳房瘤基因组DNA和大鼠肝脏基因组DNA进行消化。然后用琼脂糖凝胶电泳分离限制性片段（1.0%琼脂糖，Tris-乙酸盐-EDTA缓冲液）。

然后，将凝胶用溴化乙锭染色，浸泡于TAE缓冲液中除去过量染料，将凝胶照相。将凝胶浸泡在0.25N  HCl中搅拌10分钟，使凝胶上的DNA发生脱嘌呤作用。

在转移到硝基纤维素上之前，将凝胶浸泡在0.5N  NaOH、1.5M  NaCl中30分钟，使DNA变性。将硝基纤维素浸泡在重蒸馏水中20-30分钟，再浸泡在10x  SSC中20-30分钟。用重蒸馏水漂洗凝胶，再将凝胶浸泡在0.5M  Tris-HCl（pH7.4）、3M  NaCl中30分钟，使碱基被中和。

在室温中，在10x SSC中，通过毛细管传输过液，使处理过的凝胶上的DNA区带被吸到硝基纤维素上。用^＃1铅笔将孔的位置和凝胶的方向标在硝基纤维素上。

用4x  SSC漂洗硝基纤维素片，在空气中干燥30分钟，在真空烘箱中于80℃下烘2小时（直到完全干燥）。

在42℃下，用预杂交溶液将硝基纤维素洗4小时。用约200bp扩增物探针培养过夜进行杂交，该扩增物探针是用〔^α-32P〕-CTP标记的随机六聚体（见Sambrook et al.（eds.）（1989）（见前）。如上文所述，该约200bp的扩增物是在用引物1（SEQ ID NO：5）和抗引物2（SEQ ID NO：8）进行的Taq聚合酶反应中判备的。再将硝基纤维素用2x SSC、0.2%SDS于50℃下洗两次，每次30分钟。

然后，将杂交的硝基纤维素放在带增感屏的X光片上，于-80℃下过夜，使X光片曝光。

实施例10  用PCR分离部分小鼠和人GlcNAc  T-V序列

按标准方法进行PCR以测定引物1和2能否扩增来自两个细胞系（小鼠淋巴瘤BW5147和大鼠乳房瘤Mat  Cl细胞）的特异产物。

从每个细胞系分离出总RNA和聚腺苷酸RNA，并用来用逆转录酶产生cDNA。这些cDNA制备在如下平行PCR反应中作为模板：

10-50ng  模板cDNA

5μl  10xTaq缓冲液(无Mg)

3μl 25mM MgCl₂

1μl  dNTP混合液(各10mM)

1μl  30μM引物1

1μl  30μM引物2

38μl  灭菌水

0.5μl  Taq聚合酶

每份反应液用油复盖，再放入温控循环仪中，采用以下温度控制方式：

用琼脂糖凝胶电泳（2%琼脂糖）分离反应产物。

实施例11

A.大鼠GlcNAc  T-V在COS-7细胞中的瞬时表达

将来自实施例8D所述一个大鼠GlcNAc T-V克隆的约4.8kb完整cDNA插入物连结到SalI和NotI消化的pJT-2质粒表达载体中（Wen et al.（1992）Cell 69：559-572）。用单一pJT-2质粒或用含大鼠GlcNAc T-V cDNA的pJT-2质粒借助如下电穿孔法转染COS-7细胞（CRL 1651，American Type Culture Collection，Rockville，MD）：将4×10⁶个细胞（在0.8ml DMEM中）（Dulbecco′s Modified Minimal Medium，Gibco，Grand Island，NY）和7.5%  FBS（胎牛血清，Bocknek，Ltd.）转移到0.4cm小试管中，与10μg质粒DNA（在10μl水中）混合。电穿孔在室温下进行，1600伏特，25μF，用基因脉冲仪（Bio-Rad  Laboratories，Hercules，CA）脉冲控制单元调节在200欧姆（Wen  et  al.（1988）（见前））。然后将细胞稀释到约40ml  DMEM、7.5%  FBS中，并转移到100mm培养皿中。在37℃下培养17小时后，更换培养基，继续培养51小时或75小时。

B.制备COS细胞，用于GlcNAc  T-V活性试验

从每个转染COS-7质粒的培养皿中除去培养基，用磷酸盐缓冲的生理盐水（PBS）洗细胞。用细胞刮刀收集细胞，放在试管中，用PBS稀释，并离心使细胞成沉淀。吸去PBS后，将试管浸入液氮，使细胞沉淀快速冷冻。将细胞在干冰上冷冻保存直至在作放射化学试验和ELISA分析时再悬浮于缓冲液中。

C.GlcNAc  T-V活性试验

将细胞沉淀再悬浮于20μl  MES（pH6.0）150μM  NaCl缓冲液，并用声波破碎。按实施例4所述测定每一提取物的蛋白质含量。然后用放射化学和ELISA试验测定GlcNAc  T-V活性。

放射化学试验使用合成的三糖受体分子（Srivastava  etal.（1988）（见前）;Pierce  et  al.（1987）supra;Arango  and  Pierce（1988）supra;Palcic  et  al.（1988）Glycoconjugate  J.5：49-63;Pierce  and  Arango（1986）J.Biol.Chem.261：10772-10277;Crawely  et  al.（1990）Anal.Biochem.185：112-117）。

典型的试验混合物含有如下试剂，它们在1.5ml离心管中真空干燥：10⁶cpm UDP-〔³H〕-GlcNAc（25cpm/pmol）和1mM合成受体，总容积为0.01ml。为启动反应，将0.01ml细胞提取物，典型地含约30μg蛋白质，〔在含50mM MES（pH6.0）和1% Surfact-Amps（Triton）X-100的缓冲液中〕加入到试管中，在37℃下培养几小时（例如，约7小时）。为终止反应，将0.5ml水加到每管中，混旋，使混合完全，再将试管内容物离心。借助产物的疏水基团，用C-18层析法将放射标记的产物从未掺入的底物中分离出来。然后，将每份上清液加到用甲醇事先活化并用水预平衡的薄膜C-18Sep  Pak柱上。用200ml水洗柱以除去来自未反应底物和降解产物的水溶性放射活性物质。用100%甲醇洗脱放射标记产物，用液体闪烁计数测定放射活性。所有试验至少就两个时间点作双管试验，将结果平均。双管试验的数值之差不超过±5%，典型地为小于平均值的±2%。

GlcNAc T-V活性的ELISA试验可检出fmol量的受试产物，测定范围复盖GlcNAc T-V活性的10⁶倍范围。该试验利用未标记的糖核苷酸、连于牛血清的蛋白（BSA）的三糖受体和对本反应的四糖-BSA产物特异的家兔多克隆抗体。为了测定GlcNAc T-V活性，每次试验必须用放射化学试验中测得的已知量的GlcNAc T-V作标准校正曲线，然后通过与标准曲线比较，将受试样品的吸光率与特定的比活性关联。

证明所分离出的全长cDNA克隆的确编码GlcNAc  T-V的另一个方法是按Larsen  et  al.（1989）Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：8227-8231所述，将编码序列融合到N-未端蛋白质A编码序列上。然后，将得到的重组质粒导入哺乳动物细胞，使掺入cDNA序列的细胞在培养物中存活。因为融合蛋白质含有蛋白质A的N-末端序列，因此融合蛋白质的质被导向分泌途径并从细胞中释放出来。离心除去细胞后，如上所述，测试培养基的GlcNAc  T-V活性。将一部分无细胞培养基加到IgG柱上作层析，N-末端蛋白质A序列结合到柱上，使GlcNAc  T-V活性被保留在柱上。

确证分离出的cDNA编码GlcNAc  T-V的第二个方法是将完整cDNA插入载体中，该载体在调控序列的控制下，从而可在选择的哺乳动物宿主细胞中进行表达。所选择的宿主细胞是小鼠淋巴瘤BW5147细胞系的缺GlcNAc  T-V变异株，PHA2.1;该变异细胞在Cummings  et  al.（1982）J.Biol.Chem.257：13421-13427中有描述。另一缺GlcNAc  T-V细胞株为CHO细胞的Lec  4变异株，在Stanley，P.（1983）Methods  Enzymol.96：157-184中有描述。这两株变异细胞株均在细胞毒外源凝集素L-植物血球凝集素的存在下进行选择生长，该凝集素结合于GlcNAc  T-V半乳糖基化产物。编码GlcNAc  T-V的cDNA序列的表达回复GlcNAc  T-V活性和这些变异细胞株的外源凝集素敏感性。

上述一种或一种以上方法的使用确认了GlcNAc  T-V被克隆作为cDNA形式存在。

序列表

（1）一般信息：

（ⅰ）发明人：皮尔斯，J.M.

肖雷勃，M.G.

阿德勒，B.

弗雷琴，N.L.

（ⅱ）发明名称：N-乙酰氨基葡糖转移酶Ⅴ编码序列

（ⅲ）序列数：19

（ⅳ）通信地址：

（A）收件人：格林利和温纳，P.C.

（B）街：5370  Manhattan  Circle  Suite  201

（C）城市：博尔德

（D）州：科罗拉多

（E）国家：美国

（F）邮政编码：80303

（ⅴ）计算机可读形式：

（A）中型：松盘

（B）计算机：IBM  PC兼容制

（C）操作系统：PC-DOS/MS-DOS

（D）软件：PatentIn  Release  ＃1.0，Version  ＃1.25

（ⅵ）本申请资料：

（A）申请号：

（B）申请日：

（C）分类：

（ⅶ）在先申请资料：

（A）申请号：US07/905，795

（B）申请日：1992.6.29

（ⅶ）在先申请资料：

（A）申请号：US  08/016，863

（B）申请日：1993.2.10

（ⅷ）代理人信息：

（A）姓名：费伯，D.M.

（B）注册号：33，878

（C）案子编号：34-92B

（ⅸ）电信信息：

（A）电话：（303）499-8080

（B）电传：（303）499-8089

（2）SEQ  ID  NO：1信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：12个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（D）拓扑学：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅲ）假设的：非

（ⅳ）反意义：非

（ⅴ）片段类型：内部

（ⅹⅰ）序列图说：SEQ  ID  NO：1：

Asn  Thr  Asp  Phe  Ile  Gly  Lys  Pro  Thr  Leu  Arg

1  5  10

（2）SEQ  ID  NO：2信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：16个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（D）拓扑学：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅲ）假设的：非

（Ⅴ）片段类型：内部

（ⅹⅰ）序列图说：SEQ  ID  NO：2

Ala  Ile  Leu  Asn  Gln  Lys  Ile  Glu  Pro  Tyr  Met  Pro  Tyr  Glu  Phe  Thr

1  5  10  15

（2）SEQ  ID  NO：3信息

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：12个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（D）拓扑学：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅲ）假设的：非

（Ⅴ）片段类型：内部

（ⅹⅰ）序列图说：SEQ  ID  NO：3：

Val  Leu  Asp  Ser  Phe  Gly  Thr  Glu  Pro  Glu  Phe  Asn

1  5  10

（2）SEQ  ID  NO：4信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：10个氨基酸

（B）类型：氨基酸

（C）链：单股

（D）拓扑学：线性

（ⅱ）分子类型：肽

（ⅲ）假设的：非

（Ⅴ）片段类型：内部

（ⅸ）特征：

（A）名称/链：区域

（B）定位：1..10

（D）其他信息：/标记＝不确定

/注＝4，7和9位上氨基酸的鉴定是不确定的

（ⅹⅰ）序列图说：SEQ  ID  NO：4：

Ser  Asp  Pro  Cys  Tyr  Ala  Asp  Tyr  Glu  Val

1  5  10

（2）SEQ  ID  NO：5信息

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：27个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单股

（D）拓扑学：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（其他核酸）

（ⅲ）假设的：非

（ⅸ）特征：

（A）名称/键：混合物-差异

（B）定位：6位和21位

（D）其他信息：/标准名称＝“N是6位和21位上的次黄嘌呤核苷”

（ⅹⅰ）序列图说：SEQ  ID  NO：5：

AAYACNGAYT  TYTTYATHGG  NAARCCNAC  29

（2）SEQ  ID  NO：6信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：29个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单股

（D）拓扑学：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（其他核酸）

（ⅲ）假设的：非

（ⅸ）特征：

（A）名称/键：混合物-差异

（B）定位：3位、9位和24位

（D）其他信息：/标准名称＝“N是3位、9位和24位上的次黄嘌呤核苷”

（ⅹⅰ）序列图说：SEQ  ID  NO：6：

GTNGGYTTNC  CDATRAARAA  RTCNGTRTT  29

（2）SEQ  ID  NO：7信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：29个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单股

（D）拓扑学：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（其他核酸）

（ⅲ）假设的：非

（ⅸ）特征：

（A）名称/键：混合物-差异

（B）定位：9位和18位

（D）其他信息：/标准名称＝“N是9位和18位上的次黄嘌呤核苷”

（ⅹⅰ）序列图说：SEQ  ID  NO：7：

ATHGARCCNT  AYATGCCNTA  YGARTTYAC  29

（2）SEQ  ID  NO：8信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：29个碱基材

（B）类型：核酸

（C）链：单股

（D）拓扑学：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（其他核酸）

（ⅲ）假设的：非

（ⅸ）特征：

（A）名称/键：混合物-差异

（B）定位：3位和15位

（D）其他信息：/标准名称＝“N是3位和15位上的次黄嘌呤核苷”

（ⅹⅰ）序列图说：SEQ  ID  NO：8：

TCRTANGGCA  TRTANGGYTC  DATYTTYTG  29

（2）SEQ  ID  NO：9信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：21个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单股

（D）拓扑学：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（其他核酸）

（ⅲ）假设的：非

（ⅹⅰ）序列图说：SEQ  ID  NO：9：

GGGCCGATGA  AGACTTCTGCG  21

（2）SEQ  ID  NO：10信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：25个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单股

（D）拓扑学：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（其他核酸）

（ⅲ）假设的：非

（ⅹⅰ）序列图说：SEQ  ID  NO：10：

GGGCTACTTC  CTCTCGGTTA  TTGAG  25

（2）SEQ  ID  NO：11信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：23个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单股

（D）拓扑学：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（其他核酸）

（ⅲ）假设的：非

（ⅹⅰ）序列图说：SEQ  ID  NO：11：

GCTCTAATAC  GACTCACTAT  AGG  23

（2）SEQ  ID  NO：12信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：27个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单股

（D）拓扑学：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（其他核酸）

（ⅲ）假设的：非

（ⅹⅰ）序列图说：SEQ  ID  NO：12：

GGGTACGTGT  GAATGATATC  CAGGTAG  27

（2）SEQ  ID  NO：13信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：30个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单股

（D）拓扑学：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（其他核酸）

（ⅲ）假设的：不

（ⅹⅰ）序列图说：SEQ  ID  NO：13：

CCCGTCGACG  AGAGCCAAG  GGAATGGTAC  30

（2）SEQ  ID  NO：14信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：20个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单股

（D）拓扑学：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（其他核酸）

（ⅲ）假设的：非

（ⅹⅰ）序列图说：SEQ  ID  NO：14：

CCCAGCAGGT  ACAGAGATGTG  20

（2）SEQ  ID  NO：15信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：2624个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：单股

（D）拓扑学：线性

（ⅱ）分子类型：mRNA之cDNA

（ⅲ）假设的：非

（ⅳ）反意义：非

（ⅸ）特征：

（A）名称/键：CDS

（B）定位：299..2521

（ⅹⅰ）序列图说：SEQ  ID  NO：15：

（2）SEQ  ID  NO：16信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：740个氨基对

（B）类型：氨基酸

（D）拓扑学：线性

（ⅱ）分子类型：蛋白质

（ⅹⅰ）序列图说：SEQ  ID  NO：16：

（2）SEQ  ID  NO：17信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：178个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：双股

（D）拓扑学：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（其他核酸）

（ⅲ）假设的：非

（ⅹⅰ）序列图说：SEQ  ID  NO：17：

（2）SEQ  ID  NO：18信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：179个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：双股

（D）拓扑学：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（其他核酸）

（ⅲ）假设的：非

（ⅹⅰ）序列图说：SEQ  ID  NO：18：

（2）SEQ  ID  NO：19信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：166个碱基对

（B）类型：核酸

（C）链：双股

（D）拓扑学：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（其他核酸）

（ⅲ）假设的：非

（ⅹⅰ）序列图说：SEQ  ID  NO：19：

Claims (26)

1、一种分离出的DNA分子，其特征在于，主要包括编码具N-乙酰氨基葡糖转移酶V活性的多肽的核苷酸顺序，所述的核苷酸顺序与SEQ  ID  NO∶15中给出，从核苷酸299至核苷酸2521的核苷酸顺序有不少于70%的同源性。

2、如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的顺序编码哺乳动物的Glc  NAc  T-V。

3、如权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，所述的核苷酸顺序编码大鼠的Glc  NAc  T-V。

4、如权利要求3所述的DNA分子，其特征在于，所述的核苷酸顺序编码多肽，该多肽具有SEQ  ID  NO：16给出的氨基酸顺序。

5、如权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，所述的核苷酸顺序如SEQ  ID  NO：15给出的那样，从核苷酸299至核苷酸2521。

6、一种含有如权利要求1所述的DNA顺序的DNA分子，其特征在于，还包括外源核苷酸顺序。

7、如权利要求6所述的DNA分子，其特征在于，所述的外源核苷酸顺序是表达载体。

8、一种重组宿主细胞，其特征在于，含有如权利要求1所述的DNA顺序。

9、如权利要求8所述的重组细胞，其特征在于，所述的细胞是细菌细胞。

10、如权利要求9所述的重组细胞，其特征在于，所述的细菌细胞是大肠杆菌（Escherichia  coli）。

11、如权利要求8所述的重组细胞，其特征在于，所述的细胞是哺乳动物细胞。

12、如权利要求8所述的重组细胞，其特征在于，所述的核苷酸编码大鼠Glc  NAc  T-V。

13、如权利要求12所述的重组细胞，其特征在于，所述的核苷酸顺序编码在SEQ  ID  NO：16中给出的氨基酸顺序。

14、如权利要求13所述的重组细胞，其特征在于，所述的核苷酸顺序为在SEQ  ID  NO：15中给出，从核苷酸299至核苷酸2521之间的顺序。

15、如权利要求14所述的重组细胞，其特征在于，所述的哺乳动物细胞从COS-7细胞系衍变而来。

16、一种具N-乙酰氨基葡糖转移酶V活性的多肽，其特征在于，是如权利要求1所述的核苷酸顺序的表达产物。

17、如权利要求16所述的多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸顺序如SEQ  ID  NO：1，2，3或16所示。

18、如权利要求16所述的多肽，其特征在于，所述的多肽由如权利要求12所述的DNA顺序产生。

19、如权利要求18所述的多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸顺序如SEQ  ID  NO：16给出的那样。

20、如权利要求19所述的多肽，其特征在于，所述的氨基酸顺序由SEQ  ID  NO：15中从核苷酸299至核苷酸2521给出的核苷酸顺序编码。

21、一种产生具N-乙酰氨基葡糖转移酶V活性的多肽的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

（a）将编码具Glc  NAc  T-V活性的多肽的核苷酸与表达控制顺序操作性连锁，形成Glc  NAc  T-V表达盒（cassette），所述的核苷酸顺序与SEQ  ID  NO：15中，从核苷酸299至核苷酸2521给出的顺序具有不少于70%的顺序同源性;

（b）通过遗传工程使细胞含有步骤（a）的Glc  NAc  T-V表达盒，从而形成Glc  NAc  T-V重组细胞;

（c）在适合表达所述的Glc  NAc  T-V表达盒的条件下，培养步骤（b）的Glc  NAc  T-V重组细胞，由所述的核苷酸顺序指导具有Glc  NAc  T-V活性的多肽的表达。

22、如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述的核苷酸顺序编码哺乳动物的Glc  NAc  T-V。

23、如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述的核苷酸顺序编码大鼠的Glc  NAc  T-V。

24、如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述的核苷酸顺序编码多肽，该多肽具Glc  NAc  T-V活性并有SEQ  ID  NO：16所示的氨基酸顺序。

25、如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述的核苷酸顺序如SED  ID  NO：15中给出的那样，从核苷酸299至核苷酸2521。

26、一种用于产生具Glc  NAc  T-V活性的多肽的DNA顺序，其特征在于，所述的顺序主要含有：

（a）编码如SEQ  ID  NO：1，2，3或16所示的氨基酸的多肽的DNA顺序;

（b）能与（a）中的DNA顺序杂交的DNA顺序，该DNA顺序编码具Glc  NAc  T-V活性的多肽。

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