CN1181196C

CN1181196C - 来自真菌的α－1，4－葡聚糖裂解酶，其纯化，基因克隆和在微生物中的表达

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Publication number: CN1181196C
Application number: CNB941937941A
Authority: CN
Inventors: K��ɭ; K·波森; 于书坤; I��E��˹��ɭ; K·M·克拉; ��ɭ; T·M·I·E·克里斯滕森; J·马库森
Original assignee: Danisco AS
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1993-10-15
Filing date: 1994-10-15
Publication date: 2004-12-22
Anticipated expiration: 2014-10-15
Also published as: US5908760A; JP2007312790A; CA2174117A1; KR100376748B1; JP2005034156A; EP0723591B1; WO1995010617A3; EP0723591A1; NZ274508A; DE69435050T2; GB2296243A; GB9321302D0; JP4028595B2; JPH09505989A; CA2174117C; ATE380874T1; DE69435050D1; AU693116B2; GB2296243B; CN1133069A

Abstract

本发明描述了一种制备α-1，4-葡聚糖裂解酶的方法，该方法包含从真菌培养物中分离该酶。其中该培养物基本上不含任何其它生物体。也描述了该酶的氨基酸序列及其编码序列。

Description

来自真菌的α-1，4-葡聚糖裂解酶，其纯化，基因克隆和在微生物中的表达

本发明涉及一种酶，特别是α-1，4-葡聚糖裂解酶(“GL”)。本发明还涉及提取该酶的方法。

FR-A-2617502和Baute等在Phytochemistry[1988]Vol.27No.11 pp3401-3403中报道了以明显的酶促反应在普通羊肚菌(Morchella vulgaris)中生产1，5-D-脱水果糖(“AF”)。AF的产量相当低。尽管提及了可能的酶促反应，但这两份文献都没有提供任何酶的任何氨基酸序列资料，更不用说任何核苷酸序列资料。这些文献说到AF可作为制备抗生素羟基羟甲基吡喃酮的前体。

Yu等在Biochimica et Biophysica Acta[1993]Vol.1156 pp313-320中报道了从红海藻中制备GL和其降解α-1，4-葡聚糖以生产AF的用途。 AF的产量相当低。尽管该文献提及了GL酶，但未提供该酶的任何氨基酸序列，更不用说编码该酶的任何核苷酸序列资料。该文献还建议GL的来源就是藻类。

根据本发明，提供了一种制备α-1，4-葡聚糖裂解酶的方法，包含从真菌培养物中分离该酶，其中，该培养基本上不含任何其它生物体。

优选使用不会被该酶降解的凝胶分离和/或进一步纯化该酶。

优选的是凝胶以糊精或其衍生物为基础，优选环糊精，更优选β-环糊精。

根据本发明，还提供了一种以本发明的方法制备的GL酶。

优选的真菌是Morchella costata或普通羊肚菌(Morchellavulgaris)。

优选该酶包含氨基酸序列SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.2，或其任意变异体。

术语“其任意变异体”指在使所得的酶具有裂解酶活性的前提下对该序列一个氨基酸的任意取代，改变，修饰，置换，缺失或增加。

根据本发明，还提供了编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的核苷酸序列，优选其中的序列不存在于其天然环境中(即不构成表达该酶的细胞生物体天然基因组的一部分)。

优选的核苷酸序列是DNA序列。

优选的DNA序列包含与SEQ.ID.No.3或SEQ.ID.No.4中任意一个相同，或互补，或基本上同源或含任意合适的密码子取代的序列。

“基本上同源”的表达包含有关结构和/或核苷酸成份和/或生物活性的同源性。

“含任意合适的密码子取代”的表达包含用另一编码相同氨基酸的密码子进行的任何密码子置换或取代或在使所得的酶具有裂解酶活性的前提下对其进行的任何增加或删除。

换句话来说，本发明也包含修饰的DNA序列，其中至少一个核苷酸已缺失，取代或修饰，或者其中至少插入了一个额外的核苷酸以编码具有葡聚糖裂解酶活性的多肽，优选酶具有增强的裂解酶活性。

根据本发明，还提供了制备α-1，4-葡聚糖裂解酶的方法，包含表达本发明的核苷酸序列。

根据本发明，还提供了使用β-环糊精来纯化酶，优选GL。

根据本发明还提供了一种核苷酸序列，其中的DNA序列由至少一种与SEQ.ID.No.3或SEQ.ID.No.4中任意一个相同，或互补，或基本上同源，或含任意合适的密码子取代的序列构成，优选其中的序列是一种分离的形式。

因此，本发明涉及从真菌中分离α-1，4-葡聚糖裂解酶。例如，真菌可以是Discina perlata，Discina parma，Gyromitra gigas，Gyromitra infula，Mitrophora hybrida，尖顶羊肚菌，Morchellacostata，弹丝羊肚菌，Morchella hortensis，Morchella rotunda，普通羊肚菌，疣孢褐盘菌，Sarcosphaera eximia，Disciotisvenosa，Gyromitra esculenta，卷曲马鞍菌，空隙马鞍菌，Leptopodia elastica，指状钟菌，和羊肚菌属的其它形式之任一。优选的真菌是Morchella costata或普通羊肚菌。

可用Yu等(出处同上)描述的方法进行酶的初步纯化。

然而，优选的酶初步纯化包括一种最优化的程序，其中使用在纯化步骤中不会分解的固相支持物。这种凝胶支持物还具有与标准实验室蛋白质纯化装置相匹配的优点。

这种最优化的纯化方法的详情在下文给出。以已知的蛋白质纯化标准技术终止纯化。

使用互补电泳技术可易于测定酶的纯度。

根据pI，温度和pH最适值鉴定了纯化的裂解酶GL。

关于这点，通过pH梯度为从3至9的凝胶等电聚焦电泳测定真菌裂解酶表现出pI大约为5.4。经在8-25％梯度凝胶上进行SDS-PAGE测定分子量为110KDa。酶表现出pH最适范围为pH 5-7。发现最适温度位于30℃至45℃之间。

GL来源最适pH 最适pH范围最适温度

M.costata 6.5 5.5-7.5 37℃；40℃

普通羊肚菌 6.4 5.9-7.6 43℃；48℃

使用糖原作底物测定参数，其它参数的测定使用支链淀粉作底物。

在优选的实施方案中，经过在β-环糊精Sepharose上亲和层析，在Mono Q HR 5/5中离子交换和在Superose 1 2柱上凝胶过滤从真菌Morchella costata中纯化α-1，4-葡聚糖裂解酶。

PAS染色表明真菌裂解酶不发生糖基化。在无细胞真菌提取物中，经在电泳凝胶上进行活性凝胶染色只检测到α-1，4-葡聚糖裂解酶的一种形式。

优选该酶为外泌型的以简便其纯化。为此，将编码成熟酶的DNA与选定宿主的信号序列，启动子和终止子融合。

为了在黑色曲霉(Aspergillus niger)中表达，将gpdA(来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因)启动子和信号序列与编码成熟裂解酶的DNA(例如SEQ.I.D.No.3或SEQ.ID.No.4)的5′端融合。将黑色曲霉trpC基因的终止子序列置于该基因的3′端(Punt.P.J.et al(1991)：J.Biotech.17，19-34)。将该构建体插入含E.coli复制起点和选择起点及黑色曲霉选择标记的载体中。黑色曲霉选择标记的例子是用于选择转化子的amdS基因，argB基因，pyrG基因，hygB基因，BmlR基因。可将该质粒转化进黑色曲霉并可从转化子培养基中回收成熟的裂解酶。

可将构建体转化进蛋白酶缺陷型菌株中以减少培养基中对裂解酶的蛋白裂解性降低(Archer D.B.et al(1992)：Biotechnol.Lett.14，357-362)。

根据Barholt和Jensen的方法(Anal Biochem[1989]Vol 177pp318-322)可确定氨基酸的组成。用于纯化酶氨基酸分析的样品可含69μg/ml的蛋白质。

根据本发明的GL酶的氨基酸序列如SEQ.I.D.No.1和SEQ.I.D.No.2所示。

根据布达佩斯条约，下列样品于1994年10月3日保藏于认可的保藏单位(The National Collections of Industrial andMarine Bacteria Limited(NCIMB)at 23 St.Machar Drive，Aberdeen，Scotland，United Kingdom，AB2 1 RY)：含质粒pMC(NCIMB 40687)的大肠杆菌-[参考DH5α-pMC]；含质粒pMVl(NCIMB 40688)的大肠杆菌-[参考DH5α-pMV1]；和含质粒pMV2(NCIMB 40689)的大肠杆菌-[参考DH5α-pMV2]。

质粒pMC是含有从Morchella costata构建的基因组文库中分离的4.1kb片段的pBluescript II KS。该片段含有编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因。

质粒pMV1是含有从普通羊肚菌构建的基因组文库中分离的2.45kb片段的pBluescript II KS。该片段含有编码α-1，4-葡聚糖裂解酶基因的5′端。

质粒MV2是含有从普通羊肚菌构建的基因组文库中分离的3.1kb片段的pPUC19。该片段含有编码α-1，4-葡聚糖裂解酶基因的3′端。

在下面讨论中，MC代表Morchella costata，MV代表普通羊肚菌。

如上所述，在两个质粒中含有普通羊肚菌的GL编码序列。参考图5(下文讨论)，pMV1含有454位至2902位的核苷酸；pMV2含有从2897位(包括该位置)起的下游核苷酸。参考图2和3(下文讨论)，为了连接编码序列，可用限制性酶EcoRI和BamHI消化pMV2，然后将有关片段插入用限制性酶EcoRI和BamHI消化的pMV1中。

因此，本发明高度优选的实施方案包括由存在于质粒中的GL编码序列的表达来获得GL酶，该质粒是保藏品NCIMB 40687或者保藏品NCIMB 40688和保藏品NCIMB 40689的主体。

现在本发明将仅以实施例的方式进行描述。

在下面实施例中以附图作为参考，其中：

图1显示了pMC的质粒图谱：

图2显示了pMV1的质粒图谱；

图3显示了pMV2的质粒图谱：

图4显示了从Morchella costata获得的基因组DNA的GL编码序列和部分5′和3′非翻译区；

图5显示了从普通羊肚菌获得的基因组DNA的GL编码序列和部分5′和3′非翻译区：

图6显示了Morchella costata和普通羊肚菌GL编码序列和非翻译区的比较；

图7显示SEQ.I.D.No.1代表的氨基酸序列，显示了测序的肽片段的位置：和

图8显示了SEQ.I.D.No.2代表的氨基酸序列，显示了测序的肽片段的位置。

更详细地说，在图4中，碱基总数是4726个，DNA序列组成是：1336A；1070C；1051G；1269T。ATG起始密码子以粗体字显示。在内含子下划线。终止密码子以斜体字表示。

在图5中，碱基总数是4670，DNA序列组成是：1253A；1072C；1080G；1265T。ATG起始密码子以黑体字显示。在内含子下面划线。终止密码子以斜体字表示。

图6中，两个对比的序列是从MC(残基总数1066)和MV(残基总数1070)获得的序列。所用的比较模型是遗传结构模型(打开缺口失去：10；连接缺口失去：2)。在该图中，表示两个比较的残基相同的符号是“：”。表示两个比较的残基相似的符号是“.”。说成是‘相似’的氨基酸有：A，S，T：D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。总体上是相同；920(86.30％)；相似：51(4.78％)。在MC中插入的空缺数量是1，在MV中插入的空缺数是1。

在所附的序列表中：SEQ.I.D.No.1是从Morchella costata中获得的GL的氨基酸序列；SEQ.I.D.No.2是从普通羊肚菌中获得的GL的氨基酸序列；SEQ.I.D.No.3是从Morchella costata获得的GL的核苷酸编码序列；SEQ.I.D.No.4是从普通羊肚菌中获得的GL的核苷酸编码序列。

在SEQ.I.D.No.1中，残基总数是1066。GL酶的氨基酸组成为：

46 Ala 13 Cys 25 His 18 Met 73 Thr

50 Arg 37 Gln 54 Ile 43 Phe 23 Trp

56 Asn 55 Glu 70 Leu 56 Pro 71 Tyr

75 Asp 89 Gly 71 Lys 63 Ser 78 Val

在SEQ.I.D.No.2中，残基总数是1070。GL酶的氨基酸组成为：

51 Ala 13 Cys 22 His 17 Met 71 Thr

50 Arg 40 Gln 57 Ile 45 Phe 24 Trp

62 Asn 58 Glu 74 Leu 62 Pro 69 Tyr

74 Asp 87 Gly 61 Lys 55 Ser 78 Val1. 来自真菌Morchella costata的α-1，4-葡聚糖裂解酶的酶纯化和特征鉴定

1.1材料和方法

真菌Morchella costata得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。使用ATCC推荐的培养基在摇瓶中25℃下培养真菌。经过滤收集菌丝体并用0.9％NaCl洗涤。

经匀浆破碎真菌细胞，接着在冰上在50mM柠檬酸盐-NaOH pH6.2(缓冲液A)中超声处理6×3分钟。经在25,000×g下离心40分钟去掉细胞碎片。在该程序中获得的上清液当作是无细胞提取物，在8-25％梯度凝胶中分离后用于活性染色和Western印迹。

1.2用β-环糊精Sepharose凝胶分离

将无细胞提取物直接上样到用缓冲液A预先平衡的β-环糊精Sepharose凝胶4B柱(2.6×18cm)上。用3体积缓冲液A与2体积的含1M NaCl的缓冲液A洗柱。用含2％糊精的缓冲液A洗脱α-1，4-葡聚糖裂解酶。集中活性组分并将缓冲液变为20mM Bis-tris丙烷-HCl(pH7.0，缓冲液B)。

将活性组分上样到用缓冲液B预先平衡的Mono Q HR 5/5柱上。于0.3M NaCl缓冲液B线性洗脱真菌裂解酶。

另一种途径是，将经过β-环糊精Sepharose层析后获得的裂解酶制品浓缩到150μl并上样到在FPLC条件下操作的Superose 12柱上。1.3α-1，4-葡聚糖裂解酶活性分析和测定底物特异性，最适pH和温度条件

用于分析α-1，4-葡聚糖裂解酶活性的反应混合物含10mgml^-1支链淀粉和25mM Mes-NaOH(pH 6.0)。

反应在30℃下进行30分钟并经加入3，5-二硝基水杨酸试剂终止反应。在室温静置10分钟后，在550nm下测量光密度。当使用无细胞提取物时，向试验混合物中加入10mM EDTA。

试验混合物中的底物支链淀粉可用其它底物取代，反应温度可按本文限定的范围变动。

在最适pH研究中，反应混合物含以10mg ml^-1溶于40mM缓冲液中的支链淀粉或麦芽四糖。所用的缓冲液是甘氨酸-NaOH(pH 2.0-3.5)，HoAc-NaoAc(pH3.5-5.5)，Mes-NaOH(pH5.5-6.7)，Mops-NaOH(6.0-8.0)和N-二[羟乙基]甘氨酸-NaOH(7.6-9.0)。反应在30℃进行30分钟。在温度最适值研究中的反应条件与上述相同，除了在全部实验中使用缓冲液Mops-NaOH(pH6.0)。反应温度按本文所述变化。

分别使用8-25％梯度凝胶和3-9pH梯度的凝胶在PhastSystem上进行SDS-PAGE，Native PAGE和等电聚焦。电泳后，根据厂商(Pharmacia)推荐的方法以银染染色凝胶。以使适于PhastSystem的PAS可染色糖蛋白。为进行活性染色，电泳在6℃自然条件下进行。

电泳后，在1％可溶性淀粉存在的条件下将凝胶在30℃下培养过夜。经过用I₂/KI溶液染色显示真菌裂解酶的活性带。

1.4结果：

1.4.1α-1，4-葡聚糖裂解酶的纯化，分子量和等电点

发现真菌裂解酶吸附到装有β-环糊精Sepharose，淀粉和RedSepharose的柱上。装有β-环糊精Sepharose 4B凝胶和淀粉的柱子可用于纯化目的。

以该步骤获得的裂解酶制品仅含少量分子量比真菌裂解酶高的污染蛋白质。经在Mono Q HR 5/5上进行离子交换层析或更有效地经过在Superose12上进行凝胶过滤来除去杂质。

纯化的酶外观无色并在可见光区无光吸收。以SDS-PAGE估测分子量为110KDa 。

经过3-9的pH梯度凝胶等电聚焦，测定纯化的真菌裂解酶表现出pI5.4的等电点。在天然电泳凝胶中，酶表现为一条单一带。经活性染色检测该带表现出淀粉降解活性。取决于用于提取酶的培养物的时期，经天然和等电聚焦凝胶的酶显示出具有相同迁移率和pI的清晰带或弥散的带。

1.4.2真菌裂解酶催化反应的pH和温度最适值

发现真菌裂解酶催化反应的最适pH的pH范围在pH5和pH7之间。

1.4.3底物特异性

纯化的真菌裂解酶降解以麦芽糖到麦芽七糖的麦芽糖类。然而，降解率不同。对麦芽四糖具有最高活性(活性为100％)，其次为麦芽六糖(97％)，麦芽七糖(76％)，麦芽三糖(56％)，用麦芽糖观察到最低活性(2％)。

真菌裂解酶也降解支链淀粉，直链淀粉和糖原(可确定其百分数)。真菌裂解酶是一种外切裂解酶，不是内切裂解酶，因为它降解对硝基苯α-D-麦芽七糖，但不降解还原末端封闭的对硝基苯α-D-麦芽七糖。

1.5普通羊肚菌

从普通羊肚菌获得的α-1，4-葡聚糖裂解酶的酶纯化和鉴定方法与上面Morchella costata所用的方法相同(结果相似-见上述结果)。

2. 真菌α-1，4-葡聚糖裂解酶的氨基酸测序

2.1裂解酶的氨基酸测序

使用来自溶组织梭状芽孢杆菌(Clostridium histolyticum)的内蛋白酶Arg-C或来自Lysobacter enzymogenes的内蛋白酶Lys-C消化裂解酶，两者都是测序级，购自德国Boehringer Mannheim。为了用内蛋白酶Arg-C进行消化，将冻干的裂解酶(0.1mg)溶于50μl10M尿素，50mM甲胺，0.1M Tris-HCl，pH7.6的溶液中，充入N₂并加入10μl 50mM DTT和5mM EDTA后使蛋白质变性并在N₂下50℃还原10分钟。接着，加入1μg溶于10μl 50mM Tris-HCl，pH8.0的内蛋白酶Arg-C，充入N₂并在37℃下消化6小时。

为了随后衍生半胱氨酸，加入12.5μl 100mM碘乙酰胺，将溶液在N₂中避光室温保温15分钟。

为了用内蛋白酶Lys-C消化，可将冻干的裂解酶(0.1mg)溶于50μl 8M尿素，0.4M NH₄HCO₃，pH8.4中。充入N₂并加入5μl 45mM DTT后，蛋白质在50℃N₂中变性和还原15分钟。冷却到室温后，加入5μl 100mM碘乙酰胺在N₂中避光室温处理15分钟以衍生形成半胱氨酸。随后，加入90μl水和溶于50μl 50mM麦黄酮和10mM EDTA pH8.0中的5μg内蛋白酶Lys-C并在37℃N₂存在下消化24小时。

使用溶剂A：0.1％TFA水溶液和溶剂B：0.1％TFA乙腈溶液经在VYDAC C18柱(0.46×15cm；10μm；The Separations Groap：California)上经反向HPLC分离所得的多肽。在使用脉冲液体快速循环在Applied Biosystems476A测序仪上测序前，使用相同的溶剂系统将所选的肽类在Develosil C18柱(0.46×10cm；3μm；Dr.Ole Schon，Novo Nordisk，Denmark)上再层析。

来自真菌Morchella costata的酶的氨基酸序列资料在图7中显示。

来自真菌普通羊肚菌的酶的氨基酸序列资料在图8中显示。

3.编码真菌α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因的DNA测序

3.1分子生物学方法

按Dellaporte等(1983-Plant Mol Biol Rep vol.1 pp19-21)所述分离DNA。

3.2PCR

使用Gene Amp DNA扩增试剂盒(Perkin Elmer Cetus，美国)并按照厂商说明书制备有关DNA分子，不同的是Taq聚合酶较晚加入(见PCR循环)并将温度循环变成如下方式：

PCR循环：

循环次数 C 时间(分)

1 98 5

60 5

加入Taq聚合酶和油：

35 94 1

47 2

72 3

1 72 20

3.3PCR片段的克隆：

按照提供者的说明将PCR片段克隆进pT7 Blue(来自Novagen)。

3.4DNA测序：

基本上按照Sanger等(1979)的双脱氧法使用自动阅读测序试剂盒(Pharmacia)和Pharmacia LKB A.L.F.DNA序列仪测序双链DNA.(参见：Sanger，F.，Nicklen，S.and Coulson，A.R.(1979)。DNA sequencing with chain-determinatinginhibitors.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463-5467.)。

3.5文库的筛选：

除了预杂交和杂交在2×SSC，0.1％SDS，10×Denhardt′s和100μg/ml变性鲑精DNA中进行外，按照厂商说明书对来自Stratagene的λZap文库进行筛选。

向杂交溶液中加入32P标记的变性探针。在55℃进行杂交过夜。滤膜在2×SSC，0.1％SDS中洗两次，在1×SSC，0.1％SDS中洗两次。

3.6探针

经过用合适的限制性酶消化从pT7 blue载体中分离已克隆的PCR片段。经琼脂糖凝胶电泳从载体中分离片段并用Agarase(BoehringerMannheim)从琼脂糖中纯化片段。由于片段仅为90-240bp长，因此在使用Prime-It随机引物试剂盒(Stratagene)或Ready to GoDNA标记试剂盒(Pharmacia)以32P-dCTP标记前要对分离的片段进行连接反应。

3.7结果：

3.7.1编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的PCR DNA片段的产生：

使用α-1，4-葡聚糖裂解酶的三个重叠的胰酶肽氨基酸序列(下面显示，制备混合的可用作PCR引物的寡核苷酸以扩增从MC和MV分离的DNA。

Lys Asn Leu His Pro Gln His Lys Met Leu Lys Asp Thr Val Leu Asp Ile Val Lys

Pro Gly His Gly Glu Tyr Val Gly Trp Gly Glu Met Gly Gly Ile Gln Phe Met Lys

Glu Pro Thr Phe Met Asn Tyr Phe Asn Phe Asp Asn Met Gln Tyr Gln Gln Val Tyr

Ala Gln Gly Ala Leu Asp Ser Arg Glu Pro Leu Tyr His Ser Asp Pro Phe Tyr

在第一次PCR扩增中，引物A1/A2(见下面)用作上游引物，

引物B1/B2(见下面)用作下游引物。

引物A1：CA(GA)CA(CT)AA(GA)ATGCT(GATC)AA(GA)GA(CT)AC

引物A2：CA(GA)CA(CT)AA(GA)ATGTT(GA)AA(GA)GA(CT)AC，

引物B1：TA(GA)AA(GATC)GG(GA)TC(GA)CT(GA)TG(GA)TA

引物B2：TA(GA)AA(GATC)GG(GA)TC(GATC)GA(GA)TG(GA)TA

在2％LMT琼脂糖凝胶上分析PCR产物，从凝胶上切下预期大小的片段并用Agarase(Boehringer Manheim)处理，克隆进pT7blue载体(Novagen)并测序。

PCR扩增的克隆片段编码与测序肽(见上面)相对应的氨基酸并且在每例中增加了两个内含子序列。对于MC，PCR扩增的DNA序列与参照图4位置1202到位置1522所示的序列相对应。对于MV，PCR扩增的DNA序列与参照图5位置1218至位置1535所示的序列相对应。

3.7.2用克隆的PCR片段筛选基因组文库

对每种来源使用上述克隆筛选文库产生了两个克隆。对于MC，结合两个克隆形成了图4所示的序列(见下面)。对于MV，以上面所述的方式结合两个克隆形成了图5所示的序列。

使用下面所示的寡核苷酸作为上游引物进行再次PCR以补充紧接ATG起始密码子之前具有PstI，Pvu II，AscI和NcoI限制性位点的MC克隆：AAACTGCAGCTGGCGCGCCATGGCAGGATTTTCTGAT含有图4中bp1297-1318互补序列的引物用作下游引物。

经过将该基因的5′端以一个基因组克隆(第一克隆)的BglII-EcoRI片段的形式克隆进Stratagene pBluescriptII KS+载体的BamHI-EcoRI位点来制备MC的完整序列。在用EcoRI和EcoRV消化经修饰的pBluescript II KS+载体后经过连接另一基因组克隆(第二克隆)的NspV(使用Amersham International DNA钝端试剂盒钝端化)-EcoRI片段将该基因的3′端克隆进修饰的pBluescriptIIKS+载体中。然后将该基因的中介片段以第一个克隆的E.coRI片段的形式，和经E.coRI酶切的进一步修饰的pBluescsiptII KS+载体连接起来，这样，该基因的中介片段就克隆进修饰的pBluescript II KS+载体。

4.GL基因在微生物中的表达

可将编码GL的DNA序列导入微生物中以生产高比活和高产量的酶。

为做到这点，将MC基因(图4)以XbaI-XhoI钝端化(使用Amersham International的DNA钝端化试剂盒)片段的形式克隆进用EcoRI消化并钝端化(使用Amersham International的DNA钝端化试剂盒)的毕赤氏酵母属表达载体pHIL-D₂(含AOX1启动子)中以便在Pichia pastoris中表达(根据Invitrogen提供的毕赤氏酵母属表达试剂盒中所述的方案)。

在另一实施方案中，将MC基因1(与图4相同，除了如上所述经PCR修饰导入了限制性位点)以PvuII-XhoI钝端化片段的形式(使用Amersham International的DNA钝端形成试剂盒)克隆进用SmaI消化的曲霉属表达载体pBARMTE1(含有来自Neuropera crassa的甲基色氨酸抗性启动子)中以便在黑色曲霉中表达(Pall et al(1993)Fungal Genet Newslett.Vol 40 Page 59-62)。根据Daboussi等(Curr Genet(1989)vol.15 pp453-456)的方法使用溶胞酶Sigma L-2773和溶胞酶Sigma L-8012制备原生质体。随后根据Buxton等(Gene(1985)Vol.37pp207-214)所述的方案进行原生质体的转化，除了涂布经转化的原生质体时，使用了Punt等(Methods in Enzymology(1992)Vol 216pp447-457)描述的方案并使用0.6％渗透稳定的上层琼脂糖。

结果表明在转化的Pichia pastoris和黑色曲霉中观察到裂解酶活性。现在描述这些实验。

毕赤氏酵母属裂解酶转化子和曲霉属裂解酶转化子的分析一般方法：

无细胞提取物的制备。

以9000rpm离心5分钟收获细胞，用0.9％NaCl洗涤并重悬于破碎缓冲液(50mM K-磷酸盐，pH7.5，含1mM EDTA和5％甘油)中。使用玻璃珠和涡旋处理破碎细胞。破碎缓冲液含1mM PMSF(蛋白酶抑制剂)。以9000rpm离心5分钟后接着以20,000×g离心5分钟获得裂解酶提取物(上清)。

以碱性3，5-二硝基水杨酸试剂(DNS)试验裂解酶的活性。

将1体积的裂解酶提取物与等体积4％的支链淀粉溶液混合。然后在控制的温度下保温反应混合物，以特定的间隔取样并分析AF。

也使用放射活性方法分析了裂解酶活性。

反应混合物含10μl ¹⁴C-淀粉溶液(1μCi；Sigma ChemicalsCo.)和10μl裂解酶提取物。反应混合物在25℃放置过夜，然后在常规TLC系统中分析。使用Instant Imager(Pachard InstrumentCo.，Inc.，Meriden，CT)检测产生的放射活性AF。

电泳和Western印迹

使用8-25％梯度凝胶和Phast System(Pharmacia)进行SDS-PAGE。也在PhastSystem的Semidry转移单位上进行Western印迹。以1∶100的稀释度使用抗裂解酶的第一抗体，此抗体是针对纯化的从青岛(中国)收集的红海藻的。与碱性磷酸酶连接的猪抗兔IgG(Dako A/S，Glostrup，Denmark)用作第二抗体并以1∶1000的稀释度被使用。

I部分，含上述构建体的毕赤氏酵母属转化子的分析

MC裂解酶在Pichia pastoris细胞内的表达：

培养物名称比活^*

A18 10

A20 32

A21 8

A22 8

A24 6

^*比活定义为在25℃下每mg蛋白质每分钟产生的AFnmol值。II部分。曲霉属转化子

结果：

I.培养(含0.2％酪蛋白的酶水解产物的基础培养基)5天后以碱性3，5-二硝基水杨酸试剂分析测定裂解酶活性

在无细胞提取物中分析裂解酶活性

培养物名称比活^*

8.13 11

8.16 538

8.19 37

^*比活定义为在25C下每mg蛋白质每分钟产生的AFnmol值。

结果表明MC-裂解酶在黑色曲霉细胞内表达。

除了用黑色曲霉作宿主外，也可使用其它已知具有良好表达系统的工业上重要微生物，如：米曲霉，曲霉属种类，木霉属种类，啤酒糖酵母，克鲁维氏酵母属种类，汉逊氏酵母属种类，毕赤氏酵母属种类，枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，芽孢杆菌属种类，链霉菌属种类或大肠杆菌。

本发明其它优选的实施方案包括下列任意一个：一种由于导入本文所述的DNA序列而具有产生AF能力的转化的宿主生物体；这种转化的宿主生物体是一种微生物，其中优选宿主生物体选自由细菌，霉菌，真菌和酵母组成的组中；优选宿主生物体选自由糖酵母属，克鲁维氏酵母属，曲霉属，汉逊氏酵母属，毕赤氏酵母属，芽孢杆菌属，链霉菌属，大肠杆菌属组成的组中，如米曲霉，啤酒糖酵母，枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，大肠杆菌；一种制备1，5-D-脱水果糖的方法，包含将α-1，4-葡聚糖(例如淀粉)与转化宿主生物体表达的α-1，4-葡聚糖裂解酶接触该生物体含有编码该酶的核苷酸序列，其中优选核苷酸序列是DNA序列，优选其中的DNA序列是上文所述的序列之一；一种插入了上文所述核苷酸序列的载体，优选其中载体是一种复制载体，优选其中的载体是含有在启动子序列下游的核苷酸序列的表达载体，该载体优选含有一个标记(如抗性标记)；用该载体转化的细胞生物体，或细胞系；一种产生α-1，4-葡聚糖裂解酶或编码该酶的任意核苷酸序列或其部分之产物的方法，包含培养用该载体转染的该生物体(或来自细胞系的细胞)并回收该产物。

不偏离本发明的范围对本发明进行的其它修改对本领域的技术人员而言将是显而易见的。

序列描述

(1)一般资料：

(i)申请人：

(A)名称：Danisco A/S

(B)街道：Langebrogade 1

(C)城市：Copenhagen

(D)州：Copenhagen K

(E)国家：丹麦

(F)邮编(编码)：DK-1001

(ii)发明题目：酶

(iii)序列号：10

(iv)计算机可读形式：

(A)媒体类型：Floppy盘

(B)计算机：IBM PC兼容性

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)

(v)最近申请资料：

申请号：WO PCT/EP94/03398

(2)SEQ ID NO：1资料：

(i)序列特征：

(A)长度：1066个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

Met Ala Gly Phe Ser Asp Pro Leu Asn Phe Cys Lys Ala Glu Asp Tyr

1 5 10 15

Tyr Ser Val Ala Leu Asp Trp Lys Gly Pro Gln Lys Ile Ile Gly Val

20 25 30

Asp Thr Thr Pro Pro Lys Ser Thr Lys Phe Pro Lys Asn Trp His Gly

35 40 45

Val Asn Leu Arg Phe Asp Asp Gly Thr Leu Gly Val Val Gln Phe Ile

50 55 60

Arg Pro Cys Val Trp Arg Val Arg Tyr Asp Pro Gly Phe Lys Thr Ser

65 70 75 80

Asp Glu Tyr Gly Asp Glu Asn Thr Arg Thr Ile Val Gln Asp Tyr Met

85 90 95

Ser Thr Leu Ser Asn Lys Leu Asp Thr Tyr Arg Gly Leu Thr Trp Glu

100 105 110

Thr Lys Cys Glu Asp Ser Gly Asp Phe Phe Thr Phe Ser Ser Lys Val

115 120 125

Thr Ala Val Glu Lys Ser Glu Arg Thr Arg Asn Lys Val Gly Asp Gly

130 135 140

Leu Arg Ile His Leu Trp Lys Ser Pro Phe Arg Ile Gln Val Val Arg

145 150 155 160

Thr Leu Thr Pro Leu Lys Asp Pro Tyr Pro Ile Pro Asn Val Ala Ala

165 170 175

Ala Glu Ala Arg Val Ser Asp Lys Val Val Trp Gln Thr Ser Pro Lys

180 185 190

Thr Phe Arg Lys Asn Leu His Pro Gln His Lys Met Leu Lys Asp Thr

195 200 205

Val Leu Asp Ile Val Lys Pro Gly His Gly Glu Tyr Val Gly Trp Gly

210 215 220

Glu Met Gly Gly Ile Gln Phe Met Lys Glu Pro Thr Phe Met Asn Tyr

225 230 235 240

Phe Asn Phe Asp Asn Met Gln Tyr Gln Gln Val Tyr Ala Gln Gly Ala

245 250 255

Leu Asp Ser Arg Glu Pro Leu Tyr His Ser Asp Pro Phe Tyr Leu Asp

260 265 270

Val Asn Ser Asn Pro Glu His Lys Asn Ile Thr Ala Thr Phe Ile Asp

275 280 285

Asn Tyr Ser Gln Ile Ala Ile Asp Phe Gly Lys Thr Asn Ser Gly Tyr

290 295 300

Ile Lys Leu Gly Thr Arg Tyr Gly Gly Ile Asp Cys Tyr Gly Ile Ser

305 310 315 320

Ala Asp Thr Val Pro Glu Ile Val Arg Leu Tyr Thr Gly Leu Val Gly

325 330 335

Arg Ser Lys Leu Lys Pro Arg Tyr Ile Leu Gly Ala His Gln Ala Cys

340 345 350

Tyr Gly Tyr Gln Gln Glu Ser Asp Leu Tyr Ser Val Val Gln Gln Tyr

355 360 365

Arg Asp Cys Lys Phe Pro Leu Asp Gly Ile His Val Asp Val Asp Val

370 375 380

Gln Asp Gly Phe Arg Thr Phe Thr Thr Asn Pro His Thr Phe Pro Asn

385 390 395 400

Pro Lys Glu Met Phe Thr Asn Leu Arg Asn Asn Gly Ile Lys Cys Ser

405 410 415

Thr Asn Ile Thr Pro Val Ile Ser Ile Asn Asn Arg Glu Gly Gly Tyr

420 425 430

Ser Thr Leu Leu Glu Gly Val Asp Lys Lys Tyr Phe Ile Met Asp Asp

435 440 445

Arg Tyr Thr Glu Gly Thr Ser Gly Asn Ala Lys Asp Val Arg Tyr Met

450 455 460

Tyr Tyr Gly Gly Gly Asn Lys Val Glu Val Asp Pro Asn Asp Val Asn

465 470 475 480

Gly Arg Pro Asp Phe Lys Asp Asn Tyr Asp Phe Pro Ala Asn Phe Asn

485 490 495

Ser Lys Gln Tyr Pro Tyr His Gly Gly Val Ser Tyr Gly Tyr Gly Asn

500 505 510

Gly Ser Ala Gly Phe Tyr Pro Asp Leu Asn Arg Lys Glu Val Arg Ile

515 520 525

Trp Trp Gly Met Gln Tyr Lys Tyr Leu Phe Asp Met Gly Leu Glu Phe

530 535 540

Val Trp Gln Asp Met Thr Thr Pro Ala Ile His Thr Ser Tyr Gly Asp

545 550 555 560

Met Lys Gly Leu Pro Thr Arg Leu Leu Val Thr Ser Asp Ser Val Thr

565 570 575

Asn Ala Ser Glu Lys Lys Leu Ala Ile Glu Thr Trp Ala Leu Tyr Ser

580 585 590

Tyr Asn Leu His Lys Ala Thr Trp His Gly Leu Ser Arg Leu Glu Ser

595 600 605

Arg Lys Asn Lys Arg Asn Phe Ile Leu Gly Arg Gly Ser Tyr Ala Gly

610 615 620

Ala Tyr Arg Phe Ala Gly Leu Trp Thr Gly Asp Asn Ala Ser Asn Trp

625 630 635 640

Glu Phe Trp Lys Ile Ser Val Ser Gln Val Leu Ser Leu Gly Leu Asn

645 650 655

Gly Val Cys Ile Ala Gly Ser Asp Thr Gly Gly Phe Glu Pro Tyr Arg

660 665 670

Asp Ala Asn Gly Val Glu Glu Lys Tyr Cys Ser Pro Glu Leu Leu Ile

675 680 685

Arg Trp Tyr Thr Gly Ser Phe Leu Leu Pro Trp Leu Arg Asn His Tyr

690 695 700

Val Lys Lys Asp Arg Lys Trp Phe Gln Glu Pro Tyr Ser Tyr Pro Lys

705 710 715 720

His Leu Glu Thr His Pro Glu Leu Ala Asp Gln Ala Trp Leu Tyr Lys

725 730 735

Ser Val Leu Glu Ile Cys Arg Tyr Tyr Val Glu Leu Arg Tyr Ser Leu

740 745 750

Ile Gln Leu Leu Tyr Asp Cys Met Phe Gln Asn Val Val Asp Gly Met

755 760 765

Pro Ile Thr Arg Ser Met Leu Leu Thr Asp Thr Glu Asp Thr Thr Phe

770 775 780

Phe Asn Glu Ser Gln Lys Phe Leu Asp Asn Gln Tyr Met Ala Gly Asp

785 790 795 800

Asp Ile Leu Val Ala Pro Ile Leu His Ser Arg Lys Glu Ile Pro Gly

805 810 815

Glu Asn Arg Asp Val Tyr Leu Pro Leu Tyr His Thr Trp Tyr Pro Ser

820 825 830

Asn Leu Arg Pro Trp Asp Asp Gln Gly Val Ala Leu Gly Asn Pro Val

835 840 845

Glu Gly Gly Ser Val Ile Asn Tyr Thr Ala Arg Ile Val Ala Pro Glu

850 855 860

Asp Tyr Asn Leu Phe His Ser Val Val Pro Val Tyr Val Arg Glu Gly

865 870 875 880

Ala Ile Ile Pro Gln Ile Glu Val Arg Gln Trp Thr Gly Gln Gly Gly

885 890 895

Ala Asn Arg Ile Lys Phe Asn Ile Tyr Pro Gly Lys Asp Lys Glu Tyr

900 905 910

Cys Thr Tyr Leu Asp Asp Gly Val Ser Arg Asp Ser Ala Pro Glu Asp

915 920 925

Leu Pro Gln Tyr Lys Glu Thr His Glu Gln Ser Lys Val Glu Gly Ala

930 935 940

Glu Ile Ala Lys Gln Ile Gly Lys Lys Thr Gly Tyr Asn Ile Ser Gly

945 950 955 960

Thr Asp Pro Glu Ala Lys Gly Tyr His Arg Lys Val Ala Val Thr Gln

965 970 975

Thr Ser Lys Asp Lys Thr Arg Thr Val Thr Ile Glu Pro Lys His Asn

980 985 990

Gly Tyr Asp Pro Ser Lys Glu Val Gly Asp Tyr Tyr Thr Ile Ile Leu

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Trp Tyr Ala Pro Gly Phe Asp Gly Ser Ile Val Asp Val Ser Lys Thr

1010 1015 1020

Thr Val Asn Val Glu Gly Gly Val Glu His Gln Val Tyr Lys Asn Ser

1025 1030 1035 1040

Asp Leu His Thr Val Val Ile Asp Val Lys Glu Val Ile Gly Thr Thr

1045 1050 1055

Lys Ser Val Lys Ile Thr Cys Thr Ala Ala

1060 1065

(2)SEQ ID NO：2资料：

(i)序列特征：

(A)长度：1070个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

Met Ala Gly Leu Ser Asp Pro Leu Asn Phe Cys Lys Ala Glu Asp Tyr

1 5 10 15

Tyr Ala Ala Ala Lys Gly Trp Ser Gly Pro Gln Lys Ile Ile Arg Tyr

20 25 30

Asp Gln Thr Pro Pro Gln Gly Thr Lys Asp Pro Lys Ser Trp His Ala

35 40 45

Val Asn Leu Pro Phe Asp Asp Gly Thr Met Cys Val Val Gln Phe Val

50 55 60

Arg Pro Cys Val Trp Arg Val Arg Tyr Asp Pro Ser Val Lys Thr Ser

65 70 75 80

Asp Glu Tyr Gly Asp Glu Asn Thr Arg Thr Ile Val Gln Asp Tyr Met

85 90 95

Thr Thr Leu Val Gly Asn Leu Asp Ile Phe Arg Gly Leu Thr Trp Val

100 105 110

Ser Thr Leu Glu Asp Ser Gly Glu Tyr Tyr Thr Phe Lys Ser Glu Val

115 120 125

Thr Ala Val Asp Glu Thr Glu Arg Thr Arg Asn Lys Val Gly Asp Gly

130 135 140

Leu Lys Ile Tyr Leu Trp Lys Asn Pro Phe Arg Ile Gln Val Val Arg

145 150 155 160

Leu Leu Thr Pro Leu Val Asp Pro Phe Pro Ile Pro Asn Val Ala Asn

165 170 175

Ala Thr Ala Arg Val Ala Asp Lys Val Val Trp Gln Thr Ser Pro Lys

180 185 190

Thr Phe Arg Lys Asn Leu His Pro Gln His Lys Met Leu Lys Asp Thr

195 200 205

Val Leu Asp Ile Ile Lys Pro Gly His Gly Glu Tyr Val Gly Trp Gly

210 215 220

Glu Met Gly Gly Ile Glu Phe Met Lys Glu Pro Thr Phe Met Asn Tyr

225 230 235 240

Phe Asn Phe Asp Asn Met Gln Tyr Gln Gln Val Tyr Ala Gln Gly Ala

245 250 255

Leu Asp Ser Arg Glu Pro Leu Tyr His Ser Asp Pro Phe Tyr Leu Asp

260 255 270

Val Asn Ser Asn Pro Glu His Lys Asn Ile Thr Ala Thr Phe Ile Asp

275 280 285

Asn Tyr Ser Gln Ile Ala Ile Asp Phe Gly Lys Thr Asn Ser Gly Tyr

290 295 300

Ile Lys Leu Gly Thr Arg Tyr Gly Gly Ile Asp Cys Tyr Gly Ile Ser

305 310 315 320

Ala Asp Thr Val Pro Glu Ile Val Arg Leu Tyr Thr Gly Leu Val Gly

325 330 335

Arg Ser Lys Leu Lys Pro Arg Tyr Ile Leu Gly Ala His Gln Ala Cys

340 345 350

Tyr Gly Tyr Gln Gln Glu Ser Asp Leu His Ala Val Val Gln Gln Tyr

355 360 365

Arg Asp Thr Lys Phe Pro Leu Asp Gly Leu His Val Asp Val Asp Phe

370 375 380

Gln Asp Asn Phe Arg Thr Phe Thr Thr Asn Pro Ile Thr Phe Pro Asn

385 390 395 400

Pro Lys Glu Met Phe Thr Asn Leu Arg Asn Asn Gly Ile Lys Cys Ser

405 410 415

Thr Asn Ile Thr Pro Val Ile Ser Ile Arg Asp Arg Pro Asn Gly Tyr

420 425 430

Ser Thr Leu Asn Glu Gly Tyr Asp Lys Lys Tyr Phe Ile Met Asp Asp

435 440 445

Arg Tyr Thr Glu Gly Thr Ser Gly Asp Pro Gln Asn Val Arg Tyr Ser

450 455 460

Phe Tyr Gly Gly Gly Asn Pro Val Glu Val Asn Pro Asn Asp Val Trp

465 470 475 480

Ala Arg Pro Asp Phe Gly Asp Asn Tyr Asp Phe Pro Thr Asn Phe Asn

485 490 495

Cys Lys Asp Tyr Pro Tyr His Gly Gly Val Ser Tyr Gly Tyr Gly Asn

500 505 510

Gly Thr Pro Gly Tyr Tyr Pro Asp Leu Asn Arg Glu Glu Val Arg Ile

515 520 525

Trp Trp Gly Leu Gln Tyr Glu Tyr Leu Phe Asn Met Gly Leu Glu Phe

530 535 540

Val Trp Gln Asp Met Thr Thr Pro Ala Ile His Ser Ser Tyr Gly Asp

545 550 555 560

Met Lys Gly Leu Pro Thr Arg Leu Leu Val Thr Ala Asp Ser Val Thr

565 570 575

Asn Ala Ser Glu Lys Lys Leu Ala Ile Glu Ser Trp Ala Leu Tyr Ser

580 585 590

Tyr Asn Leu His Lys Ala Thr Phe His Gly Leu Gly Arg Leu Glu Ser

595 600 605

Arg Lys Asn Lys Arg Asn Phe Ile Leu Gly Arg Gly Ser Tyr Ala Gly

610 615 620

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625 630 635 640

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645 650 655

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660 665 670

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675 680 685

Trp Tyr Thr Gly Ser Phe Leu Leu Pro Trp Leu Arg Asn His Tyr Val

690 695 700

Lys Lys Asp Arg Lys Trp Phe Gln Glu Pro Tyr Ala Tyr Pro Lys His

705 710 715 720

Leu Glu Thr His Pro Glu Leu Ala Asp Gln Ala Trp Leu Tyr Lys Ser

725 730 735

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740 745 750

Gln Leu Leu Tyr Asp Cys Met Phe Gln Asn Val Val Asp Gly Met Pro

755 760 765

Leu Ala Arg Ser Met Leu Leu Thr Asp Thr Glu Asp Thr Thr Phe Phe

770 775 780

Asn Glu Ser Gln Lys Phe Leu Asp Asn Gln Tyr Met Ala Gly Asp Asp

785 790 795 800

Ile Leu Val Ala Pro Ile Leu His Ser Arg Asn Glu Val Pro Gly Glu

805 810 815

Asn Arg Asp Val Tyr Leu Pro Leu Phe His Thr Trp Tyr Pro Ser Asn

820 825 830

Leu Arg Pro Trp Asp Asp Gln Gly Val Ala Leu Gly Asn Pro Val Glu

835 840 845

Gly Gly Ser Val Ile Asn Tyr Thr Ala Arg Ile Val Ala Pro Glu Asp

850 855 860

Tyr Asn Leu Phe His Asn Val Val Pro Val Tyr Ile Arg Glu Gly Ala

865 870 875 880

Ile Ile Pro Gln Ile Gln Val Arg Gln Trp Ile Gly Glu Gly Gly Pro

885 890 895

Asn Pro Ile Lys Phe Asn Ile Tyr Pro Gly Lys Asp Lys Glu Tyr Val

900 905 910

Thr Tyr Leu Asp Asp Gly Val Ser Arg Asp Ser Ala Pro Asp Asp Leu

915 920 925

Pro Gln Tyr Arg Glu Ala Tyr Glu Gln Ala Lys Val Glu Gly Lys Asp

930 935 940

Val Gln Lys Gln Leu Ala Val Ile Gln Gly Asn Lys Thr Asn Asp Phe

945 950 955 960

Ser Ala Ser Gly Ile Asp Lys Glu Ala Lys Gly Tyr His Arg Lys Val

965 970 975

Ser Ile Lys Gln Glu Ser Lys Asp Lys Thr Arg Thr Val Thr Ile Glu

980 985 990

Pro Lys His Asn Gly Tyr Asp Pro Ser Lys Glu Val Gly Asn Tyr Tyr

995 1000 1005

Thr Ile Ile Leu Trp Tyr Ala Pro Gly Phe Asp Gly Ser Ile Val Asp

1010 1015 1020

Val Ser Gln Ala Thr Val Asn Ile Glu Gly Gly Val Glu Cys Glu Ile

1025 1030 1035 1040

Phe Lys Asn Thr Gly Leu His Thr Val Val Val Asn Val Lys Glu Val

1045 1050 1055

Ile Gly Thr Thr Lys Ser Val Lys Ile Thr Cys Thr Thr Ala

1060 1065 1070

(2)SEQ ID NO：3资料：

(i)序列特征：

(A)长度：3201个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

ATGGCAGGAT TTTCTGATCC TCTCAACTTT TGCAAAGCAG AAGACTACTA CAGTGTTGCG 60

CTAGACTGGA AGGGCCCTCA AAAAATCATT GGAGTAGACA CTACTCCTCC AAAGAGCACC 120

AAGTTCCCCA AAAACTGGCA TGGAGTGAAC TTGAGATTCG ATGATGGGAC TTTAGGTGTG 180

GTTCAGTTCA TTAGGCCGTG CGTTTGGAGG GTTAGATACG ACCCTGGTTT CAAGACCTCT 240

GACGAGTATG GTGATGAGAA TACGAGGACA ATTGTGCAAG ATTATATGAG TACTCTGAGT 300

AATAAATTGG ATACTTATAG AGGTCTTACG TGGGAAACCA AGTGTGAGGA TTCGGGAGAT 360

TTCTTTACCT TCTCATCCAA GGTCACCGCC GTTGAAAAAT CCGAGCGGAC CCGCAACAAG 420

GTCGGCGATG GCCTCAGAAT TCACCTATGG AAAAGCCCTT TCCGCATCCA AGTAGTGCGC 480

ACCTTGACCC CTTTGAAGGA TCCTTACCCC ATTCCAAATG TAGCCGCAGC CGAAGCCCGT 540

GTGTCCGACA AGGTCGTTTG GCAAACGTCT CCCAAGACAT TCAGAAAGAA CCTGCATCCG 600

CAACACAAGA TGCTAAAGGA TACAGTTCTT GACATTGTCA AACCTGGACA TGGCGAGTAT 660

GTGGGGTGGG GAGAGATGGG AGGTATCCAG TTTATGAAGG AGCCAACATT CATGAACTAT 720

TTTAACTTCG ACAATATGCA ATACCAGCAA GTCTATGCCC AAGGTGCTCT CGATTCTCGC 780

GAGCCACTGT ACCACTCGGA TCCCTTCTAT CTTGATGTGA ACTCCAACCC GGAGCACAAG 840

AATATCACGG CAACCTTTAT CGATAACTAC TCTCAAATTG CCATCGACTT TGGAAAGACC 900

AACTCAGGCT ACATCAAGCT GGGAACCAGG TATGGTGGTA TCGATTGTTA CGGTATCAGT 960

GCGGATACGG TCCCGGAAAT TGTACGACTT TATACAGGTC TTGTTGGACG TTCAAAGTTG 1020

AAGCCCAGAT ATATTCTCGG GGCCCATCAA GCCTGTTATG GATACCAACA GGAAAGTGAC 1080

TTGTATTCTG TGGTCCAGCA GTACCGTGAC TGTAAATTTC CACTTGACGG GATTCACGTC 1140

GATGTCGATG TTCAGGACGG CTTCAGAACT TTCACCACCA ACCCACACAC TTTCCCTAAC 1200

CCCAAAGAGA TGTTTACTAA CTTGAGGAAT AATGGAATCA AGTGCTCCAC CAATATCACT 1260

CCTGTTATCA GCATTAACAA CAGAGAGGGT GGATACAGTA CCCTCCTTGA GGGAGTTGAC 1320

AAAAAATACT TTATCATGGA CGACAGATAT ACCGAGGGAA CAAGTGGGAA TGCGAAGGAT 1380

GTTCGGTACA TGTACTACGG TGGTGGTAAT AAGGTTGAGG TCGATCCTAA TGATGTTAAT 1440

GGTCGGCCAG ACTTTAAAGA CAACTATGAC TTCCCCGCGA ACTTCAACAG CAAACAATAC 1500

CCCTATCATG GTGGTGTGAG CTACGGTTAT GGGAACGGTA GTGCAGGTTT TTACCCGGAC 1560

CTCAACAGAA AGGAGGTTCG TATCTGGTGG GGAATGCAGT ACAAGTATCT CTTCGATATG 1620

GGACTGGAAT TTGTGTGGCA AGACATGACT ACCCCAGCAA TCCACACATC ATATGGAGAC 1680

ATGAAAGGGT TGCCCACCCG TCTACTCGTC ACCTCAGACT CCGTCACCAA TGCCTCTGAG 1740

AAAAAGCTCG CAATTGAAAC TTGGGCTCTC TACTCCTACA ATCTCCACAA AGCAACTTGG 1800

CATGGTCTTA GTCGTCTCGA ATCTCGTAAG AACAAACGAA ACTTCATCCT CGGGCGTGGA 1860

AGTTATGCCG GAGCCTATCG TTTTGCTGGT CTCTGGACTG GGGATAATGC AAGTAACTGG 1920

GAATTCTGGA AGATATCGGT CTCTCAAGTT CTTTCTCTGG GCCTCAATGG TGTGTGCATC 1980

GCGGGGTCTG ATACGGGTGG TTTTGAACCC TACCGTGATG CAAATGGGGT CGAGGAGAAA 2040

TACTGTAGCC CAGAGCTACT CATCAGGTGG TATACTGGTT CATTCCTCTT GCCGTGGCTC 2100

AGGAACCATT ATGTCAAAAA GGACAGGAAA TGGTTCCAGG AACCATACTC GTACCCCAAG 2160

CATCTTGAAA CCCATCCAGA ACTCGCAGAC CAAGCATGGC TCTATAAATC CGTTTTGGAG 2220

ATCTGTAGGT ACTATGTGGA GCTTAGATAC TCCCTCATCC AACTACTTTA CGACTGCATG 2280

TTTCAAAACG TAGTCGACGG TATGCCAATC ACCAGATCTA TGCTCTTGAC CGATACTGAG 2340

GATACCACCT TCTTCAACGA GAGCCAAAAG TTCCTCGACA ACCAATATAT GGCTGGTGAC 2400

GACATTCTTG TTGCACCCAT CCTCCACAGT CGCAAAGAAA TTCCAGGCGA AAACAGAGAT 2460

GTCTATCTCC CTCTTTACCA CACCTGGTAC CCCTCAAATT TGAGACCATG GGACGATCAA 2520

GGAGTCGCTT TGGGGAATCC TGTCGAAGGT GGTAGTGTCA TCAATTATAC TGCTAGGATT 2580

GTTGCACCCG AGGATTATAA TCTCTTCCAC AGCGTGGTAC CAGTCTACGT TAGAGAGGGT 2640

GCCATCATCC CGCAAATCGA AGTACGCCAA TGGACTGGCC AGGGGGGAGC CAACCGCATC 2700

AAGTTCAACA TCTACCCTGG AAAGGATAAG GAGTACTGTA CCTATCTTGA TGATGGTGTT 2760

AGCCGTGATA GTGCGCCGGA AGACCTCCCA CAGTACAAAG AGACCCACGA ACAGTCGAAG 2820

GTTGAAGGCG CGGAAATCGC AAAGCAGATT GGAAAGAAGA CGGGTTACAA CATCTCAGGA 2880

ACCGACCCAG AAGCAAAGGG TTATCACCGC AAAGTTGCTG TCACACAAAC GTCAAAAGAC 2940

AAGACGCGTA CTGTCACTAT TGAGCCAAAA CACAATGGAT ACGACCCTTC CAAAGAGGTG 3000

GGTGATTATT ATACCATCAT TCTTTGGTAC GCACCAGGTT TCGATGGCAG CATCGTCGAT 3060

GTGAGCAAGA CGACTGTGAA TGTTGAGGGT GGGGTGGAGC ACCAAGTTTA TAAGAACTCC 3120

GATTTACATA CGGTTGTTAT CGACGTGAAG GAGGTGATCG GTACCACAAA GAGCGTCAAG 3180

ATCACATGTA CTGCCGCTTA A 3201

(2)SEQ ID NO：4资料：

(i)序列特征：

(A)长度：3213个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

ATGGCAGGAT TATCCGACCC TCTCAATTTC TGCAAAGCAG AGGACTACTA CGCTGCTGCC 60

AAAGGCTGGA GTGGCCCTCA GAAGATCATT CGCTATGACC AGACCCCTCC TCAGGGTACA 120

AAAGATCCGA AAAGCTGGCA TGCGGTAAAC CTTCCTTTCG ATGACGGGAC TATGTGTGTA 180

GTGCAATTCG TCAGACCCTG TGTTTGGAGG GTTAGATATG ACCCCAGTGT CAAGACTTCT 240

GATGAGTACG GCGATGAGAA TACGAGGACT ATTGTACAAG ACTACATGAC TACTCTGGTT 300

GGAAACTTGG ACATTTTCAG AGGTCTTACG TGGGTTTCTA CGTTGGAGGA TTCGGGCGAG 360

TACTACACCT TCAAGTCCGA AGTCACTGCC GTGGACGAAA CCGAACGGAC TCGAAACAAG 420

GTCGGCGACG GCCTCAAGAT TTACCTATGG AAAAATCCCT TTCGCATCCA GGTAGTGCGT 480

CTCTTGACCC CCCTGGTGGA CCCTTTCCCC ATTCCCAACG TAGCCAATGC CACAGCCCGT 540

GTGGCCGACA AGGTTGTTTG GCAGACGTCC CCGAAGACGT TCAGGAAAAA CTTGCATCCG 600

CAGCATAAGA TGTTGAAGGA TACAGTTCTT GATATTATCA AGCCGGGGCA CGGAGAGTAT 660

GTGGGTTGGG GAGAGATGGG AGGCATCGAG TTTATGAAGG AGCCAACATT CATGAATTAT 720

TTCAACTTTG ACAATATGCA ATATCAGCAG GTCTATGCAC AAGGCGCTCT TGATAGTCGT 780

GAGCCGTTGT ATCACTCTGA TCCCTTCTAT CTCGACGTGA ACTCCAACCC AGAGCACAAG 840

AACATTACGG CAACCTTTAT CGATAACTAC TCTCAGATTG CCATCGACTT TGGGAAGACC 900

AACTCAGGCT ACATCAAGCT GGGTACCAGG TATGGCGGTA TCGATTGTTA CGGTATCAGC 960

GCGGATACGG TCCCGGAGAT TGTGCGACTT TATACTGGAC TTGTTGGGCG TTCGAAGTTG 1020

AAGCCCAGGT ATATTCTCGG AGCCCACCAA GCTTGTTATG GATACCAGCA GGAAAGTGAC 1080

TTGCATGCTG TTGTTCAGCA GTACCGTGAC ACCAAGTTTC CGCTTGATGG GTTGCATGTC 1140

GATGTCGACT TTCAGGACAA TTTCAGAACG TTTACCACTA ACCCGATTAC GTTCCCTAAT 1200

CCCAAAGAAA TGTTTACCAA TCTAAGGAAC AATGGAATCA AGTGTTCCAC CAACATCACC 1260

CCTGTTATCA GTATCAGAGA TCGCCCGAAT GGGTACAGTA CCCTCAATGA GGGATATGAT 1320

AAAAAGTACT TCATCATGGA TGACAGATAT ACCGAGGGGA CAAGTGGGGA CCCGCAAAAT 1380

GTTCGATACT CTTTTTACGG CGGTGGGAAC CCGGTTGAGG TTAACCCTAA TGATGTTTGG 1440

GCTCGGCCAG ACTTTGGAGA CAATTATGAC TTCCCTACGA ACTTCAACTG CAAAGACTAC 1500

CCCTATCATG GTGGTGTGAG TTACGGATAT GGGAATGGCA CTCCAGGTTA CTACCCTGAC 1560

CTTAACAGAG AGGAGGTTCG TATCTGGTGG GGATTGCAGT ACGAGTATCT CTTCAATATG 1620

GGACTAGAGT TTGTATGGCA AGATATGACA ACCCCAGCGA TCCATTCATC ATATGGAGAC 1680

ATGAAAGGGT TGCCCACCCG TCTGCTCGTC ACCGCCGACT CAGTTACCAA TGCCTCTGAG 1740

AAAAAGCTCG CAATTGAAAG TTGGGCTCTT TACTCCTACA ACCTCCATAA AGCAACCTTC 1800

CACGGTCTTG GTCGTCTTGA GTCTCGTAAG AACAAACGTA ACTTCATCCT CGGACGTGGT 1860

AGTTACGCCG GTGCCTATCG TTTTGCTGGT CTCTGGACTG GAGATAACGC AAGTACGTGG 1920

GAATTCTGGA AGATTTCGGT CTCCCAAGTT CTTTCTCTAG GTCTCAATGG TGTGTGTATA 1980

GCGGGGTCTG ATACGGGTGG TTTTGAGCCC GCACGTACTG AGATTGGGGA GGAGAAATAT 2040

TGCAGTCCGG AGCTACTCAT CAGGTGGTAT ACTGGATCAT TCCTTTTGCC ATGGCTTAGA 2100

AACCACTACG TCAAGAAGGA CAGGAAATGG TTCCAGGAAC CATACGCGTA CCCCAAGCAT 2160

CTTGAAACCC ATCCAGAGCT CGCAGATCAA GCATGGCTTT ACAAATCTGT TCTAGAAATT 2220

TGCAGATACT GGGTAGAGCT AAGATATTCC CTCATCCAGC TCCTTTACGA CTGCATGTTC 2280

CAAAACGTGG TCGATGGTAT GCCACTTGCC AGATCTATGC TCTTGACCGA TACTGAGGAT 2340

ACGACCTTCT TCAATGAGAG CCAAAAGTTC CTCGATAACC AATATATGGC TGGTGACGAC 2400

ATCCTTGTAG CACCCATCCT CCACAGCCGT AACGAGGTTC CGGGAGAGAA CAGAGATGTC 2460

TATCTCCCTC TATTCCACAC CTGGTACCCC TCAAACTTGA GACCGTGGGA CGATCAGGGA 2520

GTCGCTTTAG GGAATCCTGT CGAAGGTGGC AGCGTTATCA ACTACACTGC CAGGATTGTT 2580

GCCCCAGAGG ATTATAATCT CTTCCACAAC GTGGTGCCGG TCTACATCAG AGAGGGTGCC 2640

ATCATTCCGC AAATTCAGGT ACGCCAGTGG ATTGGCGAAG GAGGGCCTAA TCCCATCAAG 2700

TTCAATATCT ACCCTGGAAA GGACAAGGAG TATGTGACGT ACCTTGATGA TGGTGTTAGC 2760

CGCGATAGTG CACCAGATGA CCTCCCGCAG TACCGCGAGG CCTATGAGCA AGCGAAGGTC 2820

GAAGGCAAAG ACGTCCAGAA GCAACTTGCG GTCATTCAAG GGAATAAGAC TAATGACTTC 2880

TCCGCCTCCG GGATTGATAA GGAGGCAAAG GGTTATCACC GCAAAGTTTC TATCAAACAG 2940

GAGTCAAAAG ACAAGACCCG TACTGTCACC ATTGAGCCAA AACACAACGG ATACGACCCC 3000

TCTAAGGAAG TTGGTAATTA TTATACCATC ATTCTTTGGT ACGCACCGGG CTTTGACGGC 3060

AGCATCGTCG ATGTGAGCCA GGCGACCGTG AACATCGAGG GCGGGGTGGA ATGCGAAATT 3120

TTCAAGAACA CCGGCTTGCA TACGGTTGTA GTCAACGTGA AAGAGGTGAT CGGTACCACA 3180

AAGTCCGTCA AGATCACTTG CACTACCGCT TAG 3213

(2)SEQ ID NO：5资料：

(i)序列特征：

(A)长度：75个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

Lys Asn Leu His Pro Gln His Lys Met Leu Lys Asp Thr Val Leu Asp

1 5 10 15

Ile Val Lys Pro Gly His Gly Glu Tyr Val Gly Trp Gly Glu Met Gly

20 25 30

Gly Ile Gln Phe Met Lys Glu Pro Thr Phe Met Asn Tyr Phe Asn Phe

35 40 45

Asp Asn Met Gln Tyr Gln Gln Val Tyr Ala Gln Gly Ala Leu Asp Ser

50 55 60

Arg Glu Pro Leu Tyr His Ser Asp Pro Phe Tyr

65 70 75

(2)SEQ ID NO：6资料：

(i)序列特征：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(3，″″)

(D)其它资料：/标准名称＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(6，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是C或T”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(3，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(9，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(15，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(18，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(21，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是C或T”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

CANCANAANA TGCTNAANGA NAC 23

(2)SEQ ID NO：7资料：

(i)序列特征：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(3，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(6，″″)

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(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(9，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(15，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(18，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(21，″ ″)

(D)其它资料：/注＝“N是C或T”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

CANCANAANA TGTTNAANGA NAC 23

(2)SEQ ID NO：8：资料：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(3，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(6，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(9，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(12，″″)

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(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(15，″″)

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(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(18，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：

TANAANGGNT CNCTNTGNTA 20

(2)SEQ ID NO：9：资料：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(3，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(6，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(9，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(12，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(15，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：取代(18，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：

TANAANGGNT CNGANTGNTA 20

(2)SEQ ID NO：10：资料：

(i)序列特征：

(A)长度：37个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：

AAACTGCAGC TGGCGCGCCA TGGCAGGATT TTCTGAT 37

Claims

1.一种制备α-1，4-葡聚糖裂解酶的方法，该方法包含从真菌培养物中分离该酶，其中的培养物不含任何其它生物体。

2.根据权利要求1的方法，其中使用不会被该酶降解的凝胶分离和/或进一步纯化该酶。

3.根据权利要求2的方法，其中的凝胶以糊精或其衍生物为基础。

4.根据权利要求3的方法，其中的糊精是环糊精。

5.根据权利要求4的方法，其中的环糊精是β-环糊精。

6.一种根据权利要求5的方法，其中的真菌是Morchella costata或普通羊肚菌。

7.一种以根据权利要求1至6中任意一项的方法制备的α-1，4-葡聚糖裂解酶。

8.一种酶，它由氨基酸序列SEQ.ID.No.1或SEQ.I.D.No.2组成。

9.一种能编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的核苷酸序列，其中的序列包含与SEQ.ID.No.3或SEQ.ID.No.4相同或互补的序列。

10.根据权利要求9的核苷酸序列，其中的序列是DNA序列。

11.一种制备α-1，4-葡聚糖裂解酶的方法，该方法包含表达权利要求10的核苷酸序列。