KR100376748B1

KR100376748B1 - 효소알파-1,4-글루칸리아제제조방법,이로부터제조된물및그용도

Info

Publication number: KR100376748B1
Application number: KR1019960701939A
Authority: KR
Inventors: 보센 커스텐; 유 슈쿤; 마티아스 크라프 카스텐; 마르텔 아이다 엘사 크리스텐센 토브; 마르쿠센 잰
Original assignee: 대니스코 에이/에스
Priority date: 1993-10-15
Filing date: 1994-10-15
Publication date: 2003-06-19
Also published as: EP0723591A1; AU693116B2; GB2296243A; CA2174117A1; DE69435050D1; JP2007312790A; JP4028595B2; JPH09505989A; WO1995010617A3; DE69435050T2; JP2005034156A; EP0723591B1; GB2296243B; CN1133069A; GB9321302D0; AU7856294A; US5908760A; ATE380874T1; GB9605354D0; NZ274508A

Abstract

α-1,4-글루칸 리아제 효소 제조방법이 제공된다.

이방법은 실질적으로 다른 유기체를 함유하지 않은 균배양을로 부터 분리시킴을 포함한다.

상기 효소에 대한 아미노산 배열및 그 코딩배열 또한 제공된다.

Description

효소 알파-1,4-글루칸리아제 제조방법, 이로부터 제조된 물 및 그용도

제 1도는 pMC의 플라스미드 지도

제 2도는 pMV1의 플라스미드 지도

제 3도는 pMV2의 플라스미드 지도

제 4도는 모르첼라 코스타타(Morchella Costata)로부터 얻은 게놈 DNA에 대한 GL 코딩배열과 5' 및 3' 번역되지 않은 영역부위를 나타내며,

제 5도는 모르첼라 불가리스(Morchella vulgaris)로부터 얻은 게놈 DNA의 GL 코딩배열과 5' 및 3' 번역되지 않은 영역부위를 나타내며,

제 6도는 모르첼라 코스타타와 모르첼라 불가리스로부터의 GL코딩배열과 비-번역 부위의 비교를 보여주며,

제 7도는 배열된 펩티드 분획의 위치를 보여주는 SEQ. I.D. No. 5로 나타낸 아미노산 배열,

제 8도는 배열된 펩티드 분획의 위치를 보여주는 SEQ. I.D. No. 6로 나타낸 아미노산 배열.

본 발명은 효소, 특히 α-1,4-글루칸리아제(glucan lyase: 글루칸절단효소)(이하 "GL"이라한다)에 관한 것이다.

또한 본 발명을 이를 추출하는 방법에 관한 것이다.

FR -A -2617502와 Baute등의 Phytochemistry[1988] Vol. 27 No. 11 pp 3401-3403에는 효소반응에 의해 모첼라 불가리스(Morchella vulgaris)에서 AF(1,5-D-안하이드로푸르토스)를 제조하는 것이 보고되어 있다.

그러나 가능한 효소반응을 참조하더라도 이들 문헌어디에도 뉴클레오티드 배열정보를 부여하는 어떠한 효소에 대한 아미노산 배열 데이타를 제시하고 있지 않는 것이다. 이들 문헌은 AF가 항생물질 피론 마이크로테신 제조를 위한 전구체 일수 있다고 설명하고 있다.

Yu등은 Biochimica et Biophysica Acta[1993] Vol 1156 pp313-320에서 붉은 해초로부터 GL을 제조하고 AF 제조를 위하여 α-1,4-글루칸을 분해시키는데 이를 사용하는 것을 보고하고 있다.

그러나 이 문헌 역시 어떠한 뉴클레오티드 배열정보를 제공하는 아미노산 배열 데이타를 제공하고 있지 않는 것이다. 이 문헌은 또한 GL의 소스가 단지 해조류라는 것을 제시하고 있다.

본 발명에 의하면 본질적으로 다른 유기체가 없는 균류 배양물로 부터 효소를 분리시킴을 포함하는 효소 α-1,4-클루칸 리아제 제조방법이 제공된다.

바람직하게는 상기 효소를 효소에 의해 분해되지 않는 겔을 이용하여 분리하고 그리고/혹은 나아가 정제하는 것이다.

바람직하게는 상기 겔은 덱스트린 혹은 그 유도체를 기초로하는 것이 좋으며, 바람직한것은 시클로덱스트린 보다 바람직한 것은 β-시클로덱스트린이다.

본 발명에 의하면 상기 본 발명의 방법에 의해 제조된 GL효소가 또한 제공된다.

바람직하게는, 상기 균류는 모르첼라 코스타타 혹은 모드첼라불가리스이다.

바람직하게 상기 효소는 아미노산 배열 SEQ. I.D. No. 1 혹은 아미노산 배열 SEQ. I.D No. 2 혹은 이들의 변종을 포함한다.

여기서 "변종(variant)"이란 결과물인 효소가 절단 활성을 제공하는 배열로부터 혹은 배열로 아미노산의 치환, 변형, 변화, 대체, 삭제 또는 부가함을 의미한다.

본 발명에 의하면, 효소 α-1,4-클루칸 리아제를 코딩하는 뉴클레오티드 배열이 또한 제공되며, 상기 배열은 그 천연 환경에 있지 않다(즉, 효소를 발현시키는 세포 유기체의 천연게놈부분을 형성하지 않는다).

바람직하게는 상기 뉴클레오티드 배열은 DNA 배열이다.

바람직하계는, 상기 DNA 배열은 SEQ. I.D. No. 3 혹은 SEQ. I.D. No. 4 와 같거나 상보적인 배열을 포함하여 구성되며, 혹은 이들과 본질적인 상동성(相同性)을 갖거나, 혹은 이들 어느것에 대한 적절한 코돈 치환체를 함유한다.

"본질적인 상동성(suhstantial homology)"이란 표현은 구조 및/또는 뉴클레오티드 성분 및/또는 생물학적 활성에 관하여 동질성이 있다는 것을 의미한다.

여기서 "적절한 코돈 치환체를 포함한다(contains any suitable codon substitutions)"란 표현은 동일한 아미노산을 코딩하는 다른 코돈과 코돈 교체 또는 치환 하거나 혹은 부가 또는 삭제하여 그 결과물인 효소가 리아제활성(lyaseactivity)를 갖는 것을 의미한다.

다시말해서, 본 발명은 최소하나의 뉴클레오티드가 삭제, 치환 또는 변형되었거나, 또는 글루칸 리아제 활성을 갖는, 바람직하게는 리아제활성이 증대된, 폴리펩티드를 엔코드하도록 최소하나의 부가적인 뉴클레오티드가 삽입된 변형 DNA 배열을 또한 포함한다.

본 발명에 의하면 본 발명의 뉴클레오티드 배열을 발현시킴을 포함하는 효소 α-1,4-글루칸 리아제 제조방법이 또한 제공된다.

또한 본 발명에 의하면 효소, 바람직하게는 GL 을 정제시키기 위해 β-시클로덱스트린을 사용하는 것이 제공된다.

본발명에 의하면, 상기 DNA 배열이 SEQ, I.D No. 3 또는 SEQ. I.D. No. 4,와 같거나, 상보적이거나 혹은 이들과 본질적 상동성을 갖거나 또는 이들중 어느것에 대한 적절한 코돈 치환을 함유하는 최소 하나의 배열로 만들어지고, 그 배열은 분리된 형태인, 뉴클레오티드 배열이 또한 제공된다.

따라서 본발명은 균류로부터 효소 α-1,4-클루칸리아제를 분리시키는 것에 관한 것이다. 예를들어 이 균류는 디스시나 페르라타(Discina perlata), 디스시나 파르마(Discina Parma), 지로미트라 기가스(Gyromitra gigas), 지로미트라 인퓨라(Gyromitra infula), 미트로포라 하이브리다(Mitrophora hybrida), 모르첼라 코니카(Morchella conica), 모르첼라 코스타타(Morchella costata), 모르첼라 에라타(Morchella elata), 모르첼라 호르텐시스(Morchella hortensis), 모르첼라 로툰다(Morchella rotunda), 모르첼라 불가리스(Morchella vulgaris), 페지자바디아(Peziza badia), 사르코스 폐라 엑시미아(Sarcosphaera eximia), 디스시오티스 베노사(Disciotis venosa), 지로미트라 에스컬렌타(Gyromitra esculenta), 헬벨라 크리스파(Helvella crispa), 헬벨라 라쿠노사(Helvella lacunosa), 레프토포디아 에라스티카(Leptopodia elastica), 베르파 디지타리 포르미스(Verpa digitaliformis) 및 기타 형태의 모르첼라 중 어느것일수 있다.

바람직하게는 상기 균류가 모르첼라 코스타타 혹은 모르첼라 불가리스인것이 좋다.

최초의 효소정제는 Yu등이 기술한 방법에 따라 수행된다.

그러나, 바람직하게는 상기 최초의 효소정제는 정제 단계에서 분해하지 않는 고체 지지물을 사용하는 최적화된 절차를 포함하는 것이 좋다.

이 겔 지지물은 나아가 표준 실험실 단백질 정제장치와 호환성이 있다는 잇점을 갖는다.

이 최적화된 정제방법은 후출한다. 정제는 단백질 정제를 위한 공지의 표준 기술에 의해 종결된다.

효소 순도는 보상 전기영동기술을 이용하여 쉽게 얻을수 있다.

정제된 리아제 GL은 pI, 온도 및 pH 최적치에 따라 성상확인 되었다.

이와 관련하여, 균리아제는 pH 3-9 로써 겔상에 등전 포커스로 측정시 약 5.4의 pI를 보인다.

8-25% 겔상에서 SDS-PAGE로 측정된 분자량은 110kDa 였다.

이 효소는 pH 5-7의 pH 최적값을 나타낸다.

온도 최적값은 30-45℃ 인것으로 밝혀졌다.

* 기질로써 글리코겐을 사용하여 측정한 파라메터임;

다른 파라메터는 기질로써 아미로펙틴을 사용하여 측정하였음.

바람직한 실시예에 있어서, α-1,4-글루칸 리아제는 β-시클로덱스트린 세파로즈상의 친화도 크로마토그래피, Mono Q HR 5/5상의 이온교환 및 세파로즈 12컬럼상의 겔여과에 의해 균 모르첼라 코스타타로부터 정제된다.

PAS 착색은 상기 균리아제가 글리코실화되지 않았다는 것을 가르킨다.

세포를 함유하지 않고 균추출물에서, 오직 한가지 형태의 α-1,4-글루칸리아제만이 전기 영동겔상에 활성겔착색에 의해 검출되었다.

상기 효소는 그 정제를 용이하게 하기 위해 분비되어야 하는 것이 좋다.

이를 위해 효소를 엔코딩하는 DNA 는 선택된 숙주로 부터의 신호배열, 촉진물(promoter) 및 터미네이터에 융합된다.

아스페르질러스 니제르(Aspergillus niger)에의 발현을 위하여 gpdA(Aspergillus nidulans 의 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 유전자로 부터 얻음) 촉진물 및 신호배열은 성숙 리아제를 인코딩하는 DNA (SEQ I.D. No. 3 또는 SEQ. I.D. No. 4와 같은) 의 5' 말단에 융합된다.

A. niger trp C 유전자로 부터의 터미네이터 배열은 상기 유전자에 3' 위치한다 (Punt, P.J. et al 1991-(1991); J. Biotech 17, 19-34).

이 구조는 E. coli 에 대한 복제 오리진과 선택 오리진 및 A. niger 를 위한 선택 마커를 함유한 벡터내에 삽입된다.

A. niger 를 위한 선택 마커의 예로서는 amdS 유전자, argB 유전자, pyrG 유전자, hygB 유전자, Bm1R 유전자를 들 수 있으며 이들 모두는 형질 전환체 선택용으로 사용된 것들이다.

이 플라스미드는 A. niger 로 전환될 수 있으며 상기 성숙 리아제는 전환체의 배지로 부터 회수될 수 있다.

결국 상기 구조는 배지내의 리아제의 단백질 분해를 감소시키기 위하여 프로티아제 결핍 균주(protease deficient strain) 로 전환될 수 있다(Archer D.B 등 1992-Biotechnol Lett, 14, 357-362).

상기 아미노산 조성은 Barholt 및 Jensen의 방법(Anal Biochm[1989] Vol 177 pp 318-322)에 따라 얻을수 있다. 정제된 효소의 아미노산 분석시료는 59 μg/ml 단백질을 함유할수 있다.

본 발명에 의한 GL 효소의 아미노산 배열이 SEQ. ID. No. 1 및 SEQ. ID. No. 2로 나타나 있다.

다음 시료들을 부다페스트조약에 따라 23 st. Machar Prive, Aberdeen, Scotland, U.K. AB 1 1RY 에 소재하는 The National Collections of Industrial ana Marine Bacteria Limited(NCIMB)에 1994. 10. 3. 기탁하였다.

플라스미드 pMC 를 함유한 E. Coli(NCIMB 40687)-[ref. DH 5 α-pMC],

플라스미드 pMV₁을 함유한 E. Coli(NCIMB 40687)-[ref. DH 5 α-pMV₁]; 및

플라스미드 pMV₂을 함유한 E. Coli(NCIMB 40687)-[ref. DH 5 α-pMV₂]

플라스미드 pMC 는 모르첼라 코스타xk(Morchella costata)로 부터 구성된 유전자 도서관으로 부터 분리한 4.1kb 단편을 함유한 pBluescript II KS 이다.

상기 단편은 α-1,4-글루칸 리아제를 코딩하는 유전자를 함유한다.

플라스미드 pMV₁은 모르첼라 불가리스(Morchella vulgaris)로 부터 구성된 유전자 도서관으로 부터 분리한 2.45kb 단편을 함유한 pBluescript II KS 이다.

상기 분획은 α-1,4-글루칸 리아제를 코딩하는 유전과의 5' 말단을 함유한다.

플라스미드 pMV₂는 모르첼라 불가리스로 부터 구성된 유전자 도서관으로 부터 분리한 3.1kb 단편을 함유한 pPUC 19 이다.

상기 분획은 α-1,4-클루칸 리아제를 코딩하는 유전자의 5' 말단을 함유한다.

이하 기술된 내용에서 MC 는 모르첼라 코스타타(Morchella costata)를 의미하며, MV 는 모르첼라 불가리스(Morchella vulgaris)를 의미한다.

언급한 바와같이, MV 로 부터의 GL 코딩배열을 2개의 플라스미드에 함유시켰다.

제5도를 참조하면, pMV₁은 부위 454 부터 부위 2902 까지 뉴클레오티드를함유하며; pMV₂는 부위 2897 부터 아래쪽으로의 뉴클레오티드를 함유한다.

후술되는 제2 및 3 도를 참조하면, 코딩 배열을 결찰(ligation)하기 위하여, 제한 효소 Eco RI 와 Bam HI 로써 pMV₂를 침지시킨 다음, 관련 단편을 제한 효소 Eco RI 와 Bam HI 로 침지된 pMV₁내에 삽입시킬 수 있다.

이같이 본 발명의 아주 바람직한 실시예는 기탁번호 NCIMB 40687 또는 기탁번호 NCIMB 40688 그리고 기탁번호 NCIMB 40689 의 주제인 플라스미드에 존재하는 GL 코딩 배열을 발현하여 얻을 수 있는 GL 효소를 포함한다.

이하, 본 발명을 실시예를 첨부도면에 따라 상세히 설명한다.

제4도를 보다 상세히 설명하면, 전체 염기수는 4726이며, DNA 배열조성은 1336A; 1070C; 1051G; 1269T이다.

ATG 개시 코돈은 두텁게 나타내었으며, 인트론배열은 밑줄을 그었으며, 상부 코돈을 이탤릭체로 나타내었다.

제5도에서, 염기의 전체수는 4670 이며, DNA 배열조성은 1253A; 1072C; 1080G; 1265T 이다.

ATG 개시 코돈을 두텁게 나타내었다.

인트론배열은 밑줄을 그었으며, 중단코돈은 이탤릭체로 나타내었다.

제 6도에서, 2개의 정렬된 배열은 MC(전체 장기수 : 1066)와 MV(전체 잔기수 : 1070) 로 부터 얻은 것들이다.

사용된 비교 매트릭스는 구조-유전자 매트릭스였다(오픈 갭 코스트 : 10; 유니트 갭 코스트 : 2).

이 도면에서, 2개의 배열 잔기가 동일함을 나타내는 문자는 ":" 이며, 2개의 배열잔기가 비슷함을 나타내는 문자는 "." 이다.

비슷한 아미노산은 A,S,T; D,E; N,Q; R,K; I,L,M,V; F,Y,W 들이다.

전체적으로 동일한 것:920(86.3%); 비슷한 것 51(4.78%)가 있다.

MC 내에 삽입된 갭의 수는 1 이며, 40MV 에 삽입된 갭의 수는 1 이다.

첨부된 배열 리스트에서:

SEQ. I.D. No. 5는 모르첼라 코스타타로 부터 얻은 GL 에 대한 아미노산 배열이며;

SEQ. I.D. No. 6는 모르첼라 불가리스로 부터 얻은 GL 에 대한 아미노산이며;

SEQ. I.D. No. 7은 모르첼라 코스타타로 부터 얻은 GL 에 대한 뉴클레오티드코딩 배열이며;

SEQ. 1.D. No. 8은 모르첼라 불가리스로 부터 얻은 GL 에 대한 뉴클레오티드코딩 배열이다.

SEQ. I.D. No. 1에서 전체 잔기수는 1066 이다.

GL 효소의 아미노산 조성은 다음과 같다.

SEQ. I.D. No. 2 에서 전체 잔기수는 1070 이다.

GL 효소의 아미노산 조성은 다음과 같다.

1. 균 모르첼라 코스타타(Morchella costata)로 부터 얻은α-1,4-글루칸리아제의 성상확인 및 효소정제

1.1 원료및 방법

American Type Culture Collection(ATCC)로부터 균류 모르첼라 코스타타를 얻었다.

이 균류를 ATCC가 추천한 배지를 이용하여 진탕기(shaker)상에서 25℃로 성장시켰다.

여과에 의해 근사를 얻고 0.9% NaCl로 세척하였다.

균류 세포를 동질화시킨 다음 50mM 시트레이트-NaOH pH 6.2(완충액 A)내에서 6 × 3분간 얼음위에서 초음파분쇄하여 파괴하였다.

25000 × g에서 40분간 원심분리하여 세포조직파편을 제거하였다.

이렇게 하여 얻은 상등액을 세포를 함유하지 않은 추출물(cell -free extract)로 간주하고 8-25% 겔에서 분리후 착색활성및 웨스턴 블롯팅에 사용하였다.

1.2. β-시클로덱즈트린 세파로즈 겔에 의한 분리

완충액 A로 사전 평형화한 β-시클로덱스트린 세파로즈 겔 4B 컬럼(2.6 × 18cm)에 상기 세포를 함유하지 않은 추출물을 직접 인가하였다. 상기 컬럼을 완충액 A 3체적과 1MNaCl을 함유한 완충액 2체적으로 세척하였다.

완충액 A내의 2% 덱스트린으로 α-1,4-글루칸 리아제를 용출시켰다.

활성 분획을 모으고, 상기 완충액을 2mM 비스-트리스 프로판-HCl(pH 7.0, 완충액 B)로 변경하였다.

활성분획을 완충액 B로 사전 평형화원 Mono Q HR 5/5 컬럼상에 인가하였다.

균 리아제를 선형기울기의 0.3M NaCl 내의 완충액 B 로 용출시켰다.

β-시클로덱스트린 세파로즈 크로마토그래피후 얻은 리아제를 150 ㎕로 선택적으로 농축시키고 FPLC 조건하에 조작되는 Superose 12 컬럼상에 인가하였다.

1.3 α-1,4-글루칸리아제 활성검정및 기질특이성, pH와 최적온도의 측정조건

α-1,4-글루칸리아제 활성 검정을 위한 반응 혼합물은 10mg ml^-4아밀로펙틴과 25 mM Mes-NaOH(pH 6.0)을 포함하였다.

반응은 30℃에서 30분간 수행되었으며 3.5-디니트로살리실산시약을 첨가하여 중단시켰다.

실온에서 10분간 방치한후 550nm에서의 흡광도를 측정하였다.

상기 세포를 함유하지 않은 추출물을 사용시 상기 검정혼합물에 10mM EDTA를 첨가하였다.

상기 검정혼합물내의 기질 아밀로펙틴은 다른 기질로 교체시킬수 있으며, 텍스트에 규정된 바에 따라 반응온도를 변화시킬수 있다.

최적 pH 조사에서, 상기 반응혼합물은 40mM 완충액내의 아밀로펙틴 또는 말토테트라오즈 10mg ml^-1을 함유하였다.

사용된 완충액은 글리신-NaOH(pH 2.0 - 3.5), HoAc-NaoAc(pH 3.5-5.5), Mes-NaOH(pH 5.5 - 6.7), Mops-NaOH(pH 6.0 - 8.0) 및 비신(bicine)-NaOH(pH 7.6 - 9.0)였다.

반응은 30℃에서 30분간 수행되었다.

온도최적 조사에서 반응조건은 모든 실험에서 완충액 Mops-NaOH(pH 6.0)을 사용한 것을 제외하고는 상기한 바와같았다. 반응온도는 텍스트에 가르키는 바에 따라 변화시켰다.

8-25% 겔과 pH 3-9인 겔을 각각 사용하여 Phast System(Pharmacia, 스웨덴)에서 SDS-PAGE, Native-PAGE 및 등전포커싱을 수행하였다.

전기영동을 따라, 상기 겔은 제조업자(Phamacia)가 추천한 순서에 따라 은색으로 착색시켰다.

Phast System에 채택된 PAS 로써 당단백질을 착색하였다.

활성착색을 위하여, 전기이동은 6℃에서 자연조건하에 수행하였다.

전기이동을 따라, 상기 겔을 1% 가용성 녹말 존재하에 30℃에서 밤새 배양하였다. I₂/KI용액으로 착색시킨 결과 균리아제의 활성 밴드가 나타났다.

1.4. 결과

1.4.1 α-1,4-글루칸리아제의 정제, 분자량 및 등전점

균 리아제는 β-시클로덱스트린, 세파로즈, 녹말 및 레드 세파로즈(Red Sepharose)로 채워진 컬럼상에 흡착되는 것으로 발견되었다.

정제목적을 위하여 β-시클로덱스트린 세파로즈-4B 겔 및 녹말로 채운 컬럼을 이용하였다.

이 단계로 얻어진 리아제 조제율은 균리아제보다 큰 분자량을 갖는 오직 소량의 오염 단백질 만을 함유하였다.

상기 불순물은 Mono Q HR 5/5 상에서의 이온교환 크로마토그래피 혹은 보다 효율적으로는 Superose 12상에의 겔여과로 제거하였다.

정제된 효소는 무색으로 나타났으며 가시광선 영역에서 흡수를 보이지 않았다. SDS-PAGE에 추정된 바와같이 분자량은 110 KDa로 측정되었다.

상기 정제된 균리아제는 pH 3-9의 겔상에서 등전포커싱으로 측정시 pI 5.4의 등전점을 나타내었다.

천연전기 영동겔에 있어서, 효소는 하나의 단일밴드로 나타났다.

이 밴드는 활성착색으로 검출시 녹말-분해 활성을 나타내었다.

효소가 추출된 배양물의 시간경과에 따라, 천연 및 등전포커싱겔상의 효소는 동일한 이동속도및 pI에서 샤프밴드(sharp band) 혹은 보다 확산된 밴드로 나타났다.

1.4.2 균 리아제 촉매반응의 pH및 온도최적

균리아제 촉매 반응에 대한 pH 최적 pH 범위는 pH 5- pH 7 범위인 것으로 밝혀졌다.

1.4.3 기질특이성

정제된 균리아제가 말토 당류를 말토즈로부터 말토헵타오즈까지 분해 시켰다. 그러나 그 분해속도는 달리하였다.

가장 활성이 큰 것은 말토테트라오즈에서 였고(활성도 100%), 그다음이 말토헥사오조(97%), 말토헵타오즈(76%), 말토트리오즈(56%) 였으며, 가장 활성이 낮은 것은 말토즈(2%)에서 관찰되었다.

아밀로펙틴, 아밀로즈 및 글리코겐을 또한 균리아제에 의해 분해되었다(%가 측정된 것이다).

균리아제는 외-리아제(exo-lyase)였으며, p-니트로페닐 α-D-말토헵타오즈는 분해시키나 환원성 말단 차단된 p-니트로페닐 α-D-말토헵타오즈를 분해시킬수는 없기 때문에 내리아제(endolyase)는 아니었다.

1.5 모르첼라 불가리스(Morchella Vulgaris)

모르첼라 불가리스로 부터 얻은 α-1,4- 글루칸 리아제의 효소정제와 특상활인용 프로토콜은 상기 모르첼라 코스타타에 대한 것과 동일하였으며 비슷한 결과를 보였다.

2. 균류로 부터 얻은 α-1,4-글루칸 리아제의 아미노산 배열

2.1. 리아제의 아미노산 배열

리아제를 클로스트리디움 히스토리티쿰(Clostridium histolyticum)로 부터 얻은 엔도프로테이나제 Arg-C 혹은 리소박테르 엔지모겐즈(Lysobacterenzymogenes)로부터 얻은 엔도프로테이나제 Lys-C로써 침지시켰으며, 이들 모두는 독일의 Boehringer Mamheim로부터 구입한 배열등급이었다.

엔도프로테이나제 Arg-C 로서의 소화를 위하며, 동결건조된 리아제(0.1mg)를 50㎕ 10M우레아, 50 mM 메틸아민, 0.1M 트리스 -HCl, pH 7.6에 용해시켰다.

N₂통과 및 10㎕ 50mM DTT 와 5mM EDTA 첨가후 상기 단백질을 변성시키고 N₂하의 50℃에서 10분간 환원시켰다.

이어서, 50m 트리스-HCl 10㎕, pH 8.0, 내에 용해시킨 엔도프로테이나제 Arg-C 1㎕ 을 첨가하고, N₂를 통과시키고 37℃에서 6시간 동안 소화를 수행하였다.

연이은 시스테인 유도화를 위하여, 100mM 요오도아세트아미드 12.5㎕를 첨가하였으며, 그 용액을 N₂하의 어둠속에서 실온에서 15분간 배양하였다.

엔도프로테이나제 Lys-C로서의 침지를 위하여, 동결건조된 리아제(0.1mg)를 50㎕ 8M 우레아, 0.4M NH₄HCO₃, pH 8.4내에 용해시켰다. N₂통과 및 45mM DTT 5㎕첨가후, 상기 단백질을 변성시키고 N₂하에 50℃에서 15분간 환원시켰다. 실온으로 냉각시킨 다음 유도화되는 시스테인을 위하여 100mM 요오도아세트아미드 5㎕를 N₂하의 어둠에서 실온에서 15분간 첨가하였다.

이어서 90㎕물과, 50㎕ 50mM 트리신 및 10mM EDTA, pH 8.0에 용해시킨 엔도프로테이나제 Lys-C 5㎍를 첨가하고 N₂하에 37℃에서 24시간동안 소화를 수행하였다.

그 결과물인 펩티드를 용매 A : 물에 용해시킨 0.1% TFA 및 용매 B : 아세토니트릴에 용해시킨 0.1% TFA 를 이용하여 VYDAC C 18 컬럼(0.46 × 15cm; 10μm; The Separations Group: 캘리포니아)상에 역상 HPLC 로 분리하였다.

선택된 펩티드는 펄스-액체 신속 사이클을 이용하여 Applied Biosystems 476A 배열기상에서 배열하기 전에 동일한 용매시스템을 사용하여 Develosil C18 컬럼(0.46 × 10cm; 3μm; Dr. Ole Schou, Novo Nordisk, 덴마크)상에서 재크로마토그래피하였다.

균 모르첼라 코스타타로 부터 유도된 효소로 부터 얻은 아미노산 배열정보를 제7도에 나타내었다.

균 모르첼라 불가리스로 부터 유도된 효소로 부터 얻은 아미노산 배열 정보를 제8도에 나타내었다.

3. 균류로 부터 얻은 α-1,4-글루칸 리아제를 코딩하는 유전자의 DNA 배열

3.1. 분자생물학적 방법

Pellaporte 등이 기술한 방법(1983-Plant Mol Biol Rep vol 1, pp 19-21)에 따라 DNA 를 분리하였다.

3.2. PCR

Taq 중합효소를 나중에 첨가하고 온도사이클을 하기와 같이 변화시킨 것을 제외하고는 Gena Amp DNA Amplification Kit(Perkin Elmer Cetus, USA)를 사용하고그 제조자 사양에 따라 관련 DNA 분자의 제조를 행하였다.

3.3. PCR 단편의 클로닝

공급자의 사양에 따라 PCR 단편을 pT 7 Blue(Novagen 으로 부터 얻음)내로 클로닝하였다.

3.4. DNA 배열

Auto Read Sequencing 키트(Phamacia)와 Pharmacia LKB A.L.F DNA 배열기를 이용하여 Sanger 등의 디데옥시방법에 따라 이중 스트랜드 DNA 를 배열하였다(참고 : Sanger, F., Nicklen, Sand Coulson, A.R.(1979); DNA sequencing with chaindetermining inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74; 5463-5467).

3.5 도서관의 선별(Screening)

스트라타진(Stratagene)으로 부터 얻은 Lambda Zap 도서관의 선별작업을 제조자의 사양에 따라 수정하였다.

다만, 예비 하이브리드 형성과 하이브리드 형성은 2 × SSC, 0.1% SDS, 10 × Denhardt's 및 100μg/ml 변성 연어정자 DNA를 이용해 수행하였다.

하이브리드 형성용액에³²P-표지 변성프로브를 첨가하였다.

하이브리드 형성은 55℃ 에서 밤새 수행되었다.

필터를 2 × SSC, 0.1% SDS 내에서 2번 그리고 1 × SSC, 0.1% SDS 에서 2번 세척하였다.

3.6. 프로브(Probe, 탐색자)

클로닝한 PCR 단편을 적절한 제한효소로써 침지시켜 pT 7 blue 벡터로 부터 분리하였다.

상기 단편을 아가로즈 겔 전기영동으로 벡터로 부터 분리하고 Agarase(Boehringer Mannheim)를 이용해 아가로즈로 부터 정제하였다.

상기 단편은 오직 90-240bp 의 길이만을 가졌기 때문에 Prime-It 불규칙 시발물질 키트(Stratagene) 혹은 Ready to Go DNA 표지키트(Pharmacia)를 이용하여³²p-d CTP로 표지하기 전에 상기 분리된 단편을 결찰반응에 노출시켰다.

3.7. 결과

3,7.1 α-1,4-글루칸 리아제를 코딩하는 PCR DNA 단편의 생성

α-1,4-글루칸 리아제로 부터 얻은 3개의 중첩하는 트립신 펩티드의 아미노산 배열(하기됨)을 이용하여 혼합된 올리고 뉴클레오티드를 생성하였으며, 이는 MC 와 MV 모두로 부터 분리된 DNA 증폭용 PCR 시발물질로 사용할 수 있다.

제1 PCR 증폭 시발물질에 있어서, 상부 시발물질로는 하기 A1/A2 를 사용하였으며 하부 시발 물질로는 하기 B1/B2 를 사용하였다.

상기 PCR 산물을 2% LMT 아가로즈에서 분석하고, 상기 겔로 부터 필요한 크기로 단편을 절단하고 나서 Agarase(Boehringer Manheim)로 처리한 후 pT 7 blue 벡터(Novagen)내로 클로닝하고 나서 배열하였다.

상기 PCR 증폭으로 부터 얻은 클로닝된 단편은 상기 배열된 펩티드에 해당하고 각각의 경우에 2개의 인트론배열에 부가하여 아미노산을 코딩하였다.

MC 에 대하여 상기 PCR 증폭 DNA 배열은 제4도의 위치 1202 부터 1522 까지 나타낸 배열에 해당한다.

MV 에 대하여 상기 PCR 증폭 DNA 배열은 제5도의 위치 1218 부터 1535 까지 나타낸 배열에 해당한다.

3.7.2. 클로닝된 PCR 단편으로 게놈 도서관의 선별

상기 클론으로 도서관을 선별하여 각 소스에 대하여 2개의 클론을 얻었다.

MC 에 대하여 상기 2개의 클론을 결합하여 제4도에 도시된 배열을 형성하였다.

MV에 대하여 상기 2개의 클론을 결합하여 상기 방법으로 제5도에 나타낸 배열을 형성할 수 있을 것이다.

상부 시발물질로써 하기 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 ATG 바로 앞에서 PstI, PvuII, AscI 및 NcoI 제한부위를 갖는 MC 클론을 보충하기 위하여 부가적인 PCR을 수행하였으며 제4도에서 bp 1297-1318 의 상보 배열을 갖는 시발물질을 하부 시발물질로 사용하였다.

게놈 클론중 하나(제1 클론)으로 부터 얻은 Bg1 II-EcoR I 단편으로써 유전자의 5' 말단을 스트라타진으로 부터 얻은 pBluescript II KS + 벡터의 BamHI-EcoRI 부위에 클로닝하여 MC 용의 완전한 배열을 생성하였다.

변형된 pBluescriptII KS + 벡터가 EcoRI 와 EcoRV 로 침지된 후 다른 게놈 클론(제2 클론)으로 부터 얻은 NspV(블런트 말단의, Amersham International 로 부터 구입한 DNA 블런팅 키트를 이용한)-EcoRI 단편을 결찰하여 상기 유전자의 3' 말단을 변형된 pBluescript II KS + 벡터에 클로닝하였다.

그후 상기 단편을 EcoRI 로 침지되고 변형된 pBluescript II KS + 벡터에 결찰하여 제1 클론으로 부터의 EcoRI 단편으로써 상기 유전자의 중간 부위를 변형된 pBluescript II KS + 벡터에 클로닝하였다.

4. 미생물내의 GL 유전자 발현

GL 을 코딩하는 DNA 배열은 미생물내에 도입하여 특이활성이 높은 효소를 다량으로 제조할 수가 있다.

이에 관하여, Xba I-Xho I 블런트 말단의(Amersham International) 로 부터구입한 DNA 블런팅 키트를 이용) 단편으로써 EcoRI 로 침지되고 그리고 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)(Invitrogen 에 의해 제공되는 Pchia Expresion Kit 에 언급된 프로토콜에 따라)내에 발현시키기 위한 브런트 말단을 갖는(Amersham Intermational 로 부터 구입한 DNA 블런팅 키트를 이용) 피치아 발현 벡터 pHIL-D2(AOX 1 촉진물을 함유)내로 상기 MC 유전자(제4도)를 클로닝하였다.

다른 실시예에 있어서, Aspergillus niger(Pall et al(1973)) Fungal Genet Newslet, vol 40 page 59-62)에서의 발현을 위해 Sma I 으로 침지된 아스페르질러스 발현 벡터 pBARME1(Neuropera crassa 로 부터 얻은 메틸 트립토판 저항 촉진물을 함유)에 PvuII-Xho I 블런트 말단 단편(Amersham International 로 부터 구입한 DNA 블런팅 키트를 이용)으로써 상기 MC 유전자 1(상기한 바와같이 제한 부위를 도입하기 위하여 PCR로 변형시킨 것을 제외하고는 제4도와 같음)을 클로닝하였다.

리싱 효소 Sigma L-2773 과 리티카제 Sigma L-8012 를 이용하여 Daboussi 등(Curr Genet (1989) vol 15 pp 453-456)에 따라 원형질체(proto plast)를 제조하였다.

상기 원형질체의 전환은, 전환된 프로토 플라스트를 플레이팅하기 위하여 0.6% 삼투 안정화된 아가로즈를 사용하여 punt 등의 프로토콜(Methoa in Enzymology(1992) vol 216 pp 447-457)을 따른 것을 제의하고는, Buxton 등의 프로토콜(Gene (1985) vol 37 pp 207-214)을 따랐다.

그 결과 전환된 피차 파스토리스(Pichia pastoris) 및 아세페르질러스 니제르(Aspergillus niger)에서 리아제 활성을 나타내었다.

피치아 리아제 형질전환체 및 아스페르질러스 리아제 형질전환체의 분석

일반적 방법

세포를 함유하지 않은 추출물의 제조

9000rpm 으로 5분간 원심불리하여 세포를 수집하고 0.9% NaCl 로 세척한 다음 용균 완충액(50mM K-포스페이트, pH 7.5, EDTA 1mM 및 5% 글리세롤 함유)내에 재부유하였다.

유리비드 및 교반 처리하여 세포를 파괴하였다.

이 용균 완충액은 1mM PMSF(프로테아제 억제제)를 함유하였다.

9000rpm 에서 5분간 원심분리한 후 20000 × g 에서 5분간 원심분리하여 리아제 추출물(상등액)을 얻었다.

알카리성 3,5-디니트로 살리실산 시약(DNS)에 의한 리아제 활성의 검정

리아제 추출물 1체적을 동일체적의 4% 아미로펙틴 용액과 혼합하였다. 그 반응 혼합물을 제어된 온도에서 배양하고 시료를 특정간격으로 회수한 다음 AF 에 대한 분석을 하였다.

방사선법을 이용하여 리아제 활성을 또한 분석하였다.

상기 반응혼합물을 10㎕¹⁴C-녹말용액(1μCi ; Sigma Chemicals Co.,) 및 10㎕ 리아제 추출물을 함유하였다.

상기 반응혼합물을 25℃ 에서 밤새 방치한 다음 통상의 TLC 시스템으로 분석하였다.

생성된 방사성 AF 를 Instant Imager(Pachard Instrument Co., Inc., Meriden, CT)를 이용하여 검출하였다.

전기영동 및 웨스턴 블롯팅

8-25% 겔 및 PhastSystem(Pharmacia)를 이용하여 SDS-PAGE 를 수행하였다. PhastSystem 의 세미드라이 트랜스퍼 유니트(Semidry transfer unit)에서 웨스턴 블롯팅을 또한 행하였다.

Qingdao(중국)에서 채취한 붉은 바닷말로 부터 정제된 리아제에 대한 제1차 항체를 1:100으로 희석하여 사용하였다. 제2차 항체로써 알칼리성 포스페타제(Dako A/S, Glostrup, 덴마크)에 접합된 돼지 항토끼 IgG(Pig antirabbit Ig G)를 1:1000 으로 희석한 것을 사용하였다.

파트 I, 상기 구조를 갖는 Pichia 형질전환체의 분석

* 상기 특이활성은 25℃에서 단백질 1mg당 1분간 생산된 AF 의 nmol 로 정이된다.

파트 II. 아스페르질러스 형질전환체

결과

I. 5일간 배양후(알칼리성 3,5-디니트로살리실산 시약으로 0.2% 카제인 효소가수 분해물 분석을 포함하는 최소배지) 리아제 활성을 측정하였다.

세포를 함유하지 않은 추출물에서의 리아제 활성분석

* 특이활성은 25℃에서 단백질 1mg당 1분간 제조된 AF의 nmol로써 정의된다.

상기결과는 MC-리이제가 아스페르질러스 니제르 내에 세포내 발현된 것을 나타낸다.

숙주로써 아스페르질러스 니제르(Aspergillus niger) 대신, 양호한 발현 시스템이 알려져 있는 아스페르질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스페르질러스 SP., 트리코데르마(Trichoderma) SP., 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 크루이 베로마이세스(Kluyveromyces) SP., 한세룰라(Hansenula) SP., 피치아(Pichia) SP., 바실러스 서브티리스(Bacillus subtilis), B. 아밀로리크파시엔스(amyloliquefaciens), 바실러스(Bacillus) SP., 스트립토마이세스(Streptomyces) SP. 혹은 E. 콜리(Coli)와 같은 다른 미생물을 이용할수 있다.

본발명의 다른 바람직한 실시예는 다음중 어느하나를 포함한다.

여기에 기술된 바와같은 DNA 배열을 도입한 결과 AF 생성 능력을 갖는 전환된 숙주 유기체;

바람직하게는 박테리아, 곰팡이, 균(fungi)류 및 이스트로 구성되는 그룹에서 선택되는 미생물인 전환된 숙주 유기체;

상기 숙주 유기체가 사카로마이세스(Saccharomyces), 크루이베로마이세스(Kluyveromyces), 아스페르질러스(Aspergillus), 트리코데르마 한세눌라(Trichoderma Hansenula), 피치아(Pichia), 바실러스 스트렙토마이세스(Bacillus Streptomyces), 아스페르질러스 오리자에 같은 에스케리시아(Eschericia), 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 바실러스 서브리리스(Bacillus sublilis), 바실러스 아미로리크파시엔(Bacillus amyloliquefascien), 에스케리시아 콜리(Eschericia coli), 로 구성되는 그룹에서 선택된 숙주 유기체;

α-1,4-글루칸(예를들어 녹말)을, 엔코딩하는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 전환된 숙주 유기체로 발현시킨 효소 α-1,4-클루칸 리아제로 접촉시킴을 포함하고, 바람직하게는 상기 뉴클레오티드 배열은 DNA 배열이고, 바람직하게는 상기 DNA 배열은 앞서 기술된 배열중 하나인, 당류 1,5-D-안하이프로 프럭토즈 제조방법;

앞서 기술된 뉴클레오티드 배열을 편입하고, 바람직하게는 복제 벡터이며, 바람직하게는 촉진물 배열로부터의 하부에 뉴클레오티드 배열을 함유하는 발현벡터이며, 바람직하게는 마커(저항 마커등과 같은)를 함유하는, 벡터;

이같은 벡터로 전환된 세포유기체, 또는 세포라인;

이같은 벡터로 전환된 유기체(효소 세포라인에서의 세포)를 배양하고, 그 산물을 회수함을 포함하는 산물 α-1,4-글루칸리아제 또는 이를 코딩하는 뉴클레오티드 배열이나 그 부분, 제조방법;

상기한바를 기초로 이분야에서 숙련된자는 본발명의 범위를 벗어남이 없이 그 변형이 가능할 것이다.

시퀀스 리스트(Sequence Listing)

(1) 일반정보

(i) 출원인 :

(A) 성명: 대니스코 에이/에스

(B) 번지: 랑게브로가드 1

(C) 도시: 코펜하겐

(D) 주: 코펜하겐 케이

(E) 국가: 덴마크

(F) 우편번호: 디케이-1001

(ii) 발명의 명칭: 효소의 이용

(iii) 배열번호: 10

(iv) 컴퓨터 판독가능형태

(A) 매질종류: 프로피 디스크

(B) 컴퓨터; IPM PC 호환성

(C) 작동시스템: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, 버젼 #1.25(EPO)

(v) 출원데이타: 출원번호(WO PCT/EP 94/03398)

(2) SEQ 식별 번호정보: 1:

(i) 시퀀스 특징

(A) 길이: 1066 아미노산

(B) 종류: 아미노산

(D) 위상수학: 선형

(ii) 분자종류: 단백질

(xi) 시퀀스 개요: SEQ ID NO: 1

(2) SEQ 식별번호정보: 2

(i) SEQ 특성:

(A) 길이: 1070 아미노산

(B) 종류: 아미노산

(D) 위상수학: 선형

(ii) 분자종류 : 단백질

(xi) SEQ 개요: SEQ ID NO: 2:

(2) SEQ 식별번호 정보: 3

(i) SEQ특성

(A) 길이 : 3201 염기 쌍

(B) 종류 : 핵산

(C) 스트랜드 : 이중

(D) 위상수학 : 선형

(ii) 분자종류 : DNA ( 게놈 )

(xi) SEQ 개요: SEQ ID NO: 3:

(2) SEQ 식별번호정보: 4

(i) SEQ 특성

(A) 길이 : 3213 염기쌍

(B) 종류 : 핵산

(C) 스트랜드 : 이중

(D)위상수학 : 선형

(ii) 분자종류 : DNA ( 게놈 )

(xi) SEQ 개요: SEQ ID NO: 4:

(2) SEQ 식별전호 정보: 5

(1) SEQ 특성

(A) 길이 : 75 아미노산

(B) 종류 : 아미노산

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자종류 : 펩티드

(xi) SEQ 개요: SEQ ID NO: 5:

(2) SEQ 식별번호 정보: 6

(i) SEQ 특성 :

(A) 길이 : 23 염기쌍

(B) 종류 : 핵산

(C) 스트랜드 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자종류 : DNA(게놈)

(ix) 특징:

(A) 명칭/키 : misc difference

(B) 위치 : 교체(3, " ")

(D) 기타정보 : N 은 G 또는 A 이다.

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : misc difference

(B) 위치 : 교체(6, " ")

(D) 기타정보 : N 은 C 또는 T 이다.

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : misc difference

(B) 위치 : 교체(9, " ")

(D) 기타정보 : N 은 G 또는 A 이다.

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : misc difference

(B) 위치 : 교체(15, " ")

(D) 기타정보 : N 은 G 또는 A 또는 T 또는 C 이다.

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : misc difference

(B) 위치 : 교체(18, " ")

(D) 기타정보 : N 은 G 또는 A 이다.

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : misc difference

(B) 위치 : 교체(21, " ")

(D) 기타정보 : N 은 C 또는 T 이다.

(xi) SEQ 개요 SEQ ID NO:6:

(2) SEQ 식별변호 정보 : 7

(i) SEQ 특성

(A) 길이 : 23 염기쌍

(B) 종류 : 핵산

(C) 스트랜드 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자종류 : DNA (게놈)

(ix) 특징:

(A) 명칭/키 : misc difference

(B) 위치 : 교체(3, " ")

(D) 기타정보 : N 은 G 또는 A 이다.

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : misc difference

(B) 위치 : 교체(6, " ")

(D) 기타정보 : N 은 C 또는 T 이다.

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : misc difference

(B) 위치 : 교체(9, " ")

(D) 기타정보 : N 은 G 또는 A 이다.

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : misc difference

(B) 위치 : 교체(15, " ")

(D) 기타정보 : N 은 G 또는 A 이다.

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : misc difference

(B) 위치 : 교체(18, " ")

(D) 기타정보 : N 은 G 또는 A 이다.

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : misc difference

(B) 위치 : 교체(21, " ")

(D) 기타정보 : N 은 C 또는 T 이다.

(xi) SEQ 개요: SEQ ID NO: 7:

(2) SEQ 식별번호 정보 : 8

(i) SEQ 특성

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 종류 : 핵산

(C) 스트랜드 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자종류 : DNA (게놈)

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : misc difference

(B) 위치 : 교체(3, " ")

(D) 기타정보 : N 은 G 또는 A 이다.

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : misc difference

(B) 위치 : 교체(6, " ")

(D) 기타정보 : N 은 G 또는 A 또는 T 또는 C 이다.

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : misc difference

(B) 위치 : 교체(9, " ")

(D) 기타정보 : N 은 G 또는 A 이다.

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : misc difference

(B) 위치 : 교체(12, " ")

(D) 기타정보 : N 은 G 또는 A 이다.

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : misc difference

(B) 위치 : 교체(15, " ")

(D) 기타정보 : N 은 G 또는 A 이다.

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : misc difference

(B) 위치 : 교체(18, " ")

(D) 기타정보 : N 은 G 또는 A 이다.

(xi) SEQ 개요: SEQ ID NO: 8:

(2) SEQ 식별번호 정보 : 9

(i) SEQ 특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 종류 : 핵산

(C) 스트랜드 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자종류 : DNA (게놈)

(ix) 특징:

(A) 명칭/키 : misc difference

(B) 위치 : 교체(3, " ")

(D) 기타정보 : N 은 G 또는 A 이다.

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : misc difference

(B) 위치 : 교체(6, " ")

(D) 기타정보 : N 은 6 또는 A 또는 T 또는 C 이다.

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : misc difference

(B) 위치 : 교체(9, " ")

(D) 기타정보 : N 은 G 또는 A 이다.

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : misc difference

(B) 위치 : 교체(12, " ")

(D) 기타정보 : N 은 G 또는 A 또는 T 또는 C 이다.

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : misc difference

(B) 위치 : 교체(15, " ")

(D) 기타정보 : N 은 G 또는 A 이다.

(ix) 특징 :

(A) 명칭/키 : misc difference

(B) 위치 : 교체(18, " ")

(D) 기타정보 : N 은 G 또는 A 이다.

(xi) SEQ 개요 : SEQ ID No: 9 :

(2) SEQ 식별번호 정보 : 10

(i) SEQ 특성:

(A) 길이 : 37 염기쌍

(B) 종류 : 핵산

(C) 스트랜드 : 단일

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자종류 : DNA (게놈)

(xi) SEQ 개요: SEQ ID NO: 10:

Claims

본질적으로 어떠한 다른 유기체가 없는 균류 배양물로부터 α-1,4-글루칸 리아제를 분리함을 포함하는 방법에 의해 제조된, 아미노산 배열 SEQ. ID. No. 1 및 SEQ. ID. No. 2로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 배열을 포함하는 분리된 균류의 α-1,4-글루칸 리아제 효소.
균류 배양물로부터 획득가능하며, 아미노산 배열 SEQ. ID. No. 1 및 SEQ. ID. No. 2로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 배열을 포함하는 분리된 균류의 α-1,4-글루칸 리아제 효소.
제 1항 또는 제 2항에 따른 균류의 효소 α-1,4-글루칸 리아제를 코딩하는 뉴클레오티드 배열(nucleotide sequence).
제 3항에 있어서, 상기 배열은 DNA 배열임을 특징으로 하는 뉴클레오티드 배열.
제 4항에 있어서, 상기 DNA 배열은 SEQ. ID. No. 3 및 SEQ. ID. No. 4로 구성되는 그룹으부터 선택된 뉴클레오티드 배열과 같은 배열을 포함함을 특징으로 하는 뉴클레오티드 배열.
청구범위 제5항의 뉴클레오티드 배열을 발현(expressing)시킴을 포함하는 효소 α-1,4-글루칸 리아제 제조방법.
DNA 배열이, SEQ. ID. No. 3 및 SEQ. ID. No. 4로 구성되는 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 배열과 같은 최소 하나의 배열을 포함하는 균류의 α-1,4-글루칸 리아제 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 배열.
재 1항에 있어서, 상기 α-1,4-글루칸 리아제는 분리되고 및/또는 그 효소에 의해 분해되지 않는 겔을 이용하여 정제됨을 특징으로 하는 분리된 균류의 α-1,4-글루칸 리아제 효소.
제 8항에 있어서, 상기 겔은 덱스트린 또는 그 유도체를 기초로 함을 특징으로 하는 분리된 균류의 α-1,4-글루칸 리아제 효소.
제 8항에 있어서, 상기 겔은 시클로덱스트린임을 특징으로 하는 분리된 균류의 α-1,4-글루칸 리아제 효소.
제 8항에 있어서, 상기 겔은 베타-시클로덱스트린임을 특징으로 하는 분리된 균류의 α-1,4-글루칸 리아제 효소.
제 1항, 제 8항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 균류는 모르첼라 코스타타(Morchella costata) 또는 모르첼라 불가리스(Morchella vulgaris)임을 특징으로 하는 분리된 균류의 α-1,4-글루칸 리아제 효소.